d i a r i a Antoiiieríí Hicoy P o l i d w a

Matr i cui a: 7 7 327 3 8 7

L i c e n c i a t u r a : HIOLOUIA A t C . '

J Area de Cuiiceiitrac i ó n : BIOLW I A EXPERIMENTAL

Trimestre: Primavera 87

Horas - semana. : 3 0

Lugar duiide se I lev6 a cabo: Universldad Aiit6rioma lile t ropo 1 i t alia Un1 (1aG 1 ziapal apa CBC. Lab. S - 2 5 1 -C

4 Fecha de i n i c i o : 24. de Novit?mbt,e de i y 8 b

'Nombre d e l Culoi.: M a e s t r o H U I ~ ~ X I % ~ C I üoiizalez

/ T i t u l o del Proyecto : "i ;ultivo de c e l u l a s 111 V lC r ' o de Leucsens 1eucocephsls y ana1is:i.s c u a l i t a t i v o de

mimositia.

INDICE

I. ANTECEDENT E S

11. IN TJ! O DI1 CC I ON 1) Producción del Cultivo de 'Tejidos 2 ) Detección de Elimosina por Cromatografía en Capa Fina

1:II.. MATERIAL Y METODO 1) Producción del Cultivo de Tejidos

a) Preparación del Medio de Cultivo b ) Siembra de: Semilla

T a l l o s

Ha jas R a í z

Embriones 2 ) Detección de Mimosina

a ) Por Cromatografía en Capa Fina b) Por Fotocolorimetría %

3) Métodos de Extracción de Elimosina a) Extracción con Hidróxido de Sodio 0.1 N y 0.5N U) Extracción con Metano1 c) Extracción por Diálisis

i) De semillas maduras ii) De callo obtenido de embrión

d) Extracci6n por Centrifugación

IV.

V.

VI.

RES U LT A DO S

1) Obtencibn d e l Cultivo de Tejidos 2 ) Extracción de Mimosina 3) Detección de Mimosina 4 ) Obtención de los Espectros Infrarrojo y Ultravioleta

para rectificación de resultados.

CONCLUSIONES

I3 I UI, I OG R A F I A

r .

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ANTECEDENTES

Desde tiempos muy remotos el hombre se ha preocupado por e l cultivo

y mejoramiento de las plantas que utiliza para su alimentación y

para l a alimentación de su ganado.

De todas l a s plantas que e l hombre cultiva, las gramíneas

y l a s leguminosas son las más importantes. Nutricionalmente, la

semilla de l a s leguminosas contienen de dos a tres veces más proteín,

que los granos de los cereales (gramíneas) y, aoemás, crecen de

manera silvestre en todas l a s latitudes del planeta, especialmente

los cientos

nte las que

poco. Solamen

cales y subtropicales. Sin embargo, d en climas trop

de especies de

se usan extens

se cultivan en

e l cacahuate,

La famil

-Está dividida

Caesa 1 pi

leguminosas conocidas, son menos de ve

vamente, y u n a s cuantas se emplean muy %

gran escala, la alfalfa, el frijol, el

el

a

en

io -

ch 7 cha ro,

eguminosae

3 subfamil

deae con -1

a lenteja y el haba.

comprende 620 géneros

a s :

proximadamente 2 , 8 0 0

frijol de soya

18,000 especies.

ecies que son

principalmente árboles de savanas tropicales y bosques de Africa,

Sudamérica y Asia.

Himosoideae, con cerca de 2,800 especies de l a s cuales la

mayoría son árboles y arbustos de rigiones subtropicales, tropicales

semiáridas de Africa, Norte y Sudamérica y Australia.

Papilionoideae - (Faboideae) que comprende cerca de 12.00 especie

casi todas herbáceas distribuidas en todo el mundo.

Además de su alto valor nutritivo, l a s leguminosas tienen

muchas otras utilidades para el hombre; por ejemplo, algunas son

árboles de maderas muy preciadas, otras producen flores de ornato y

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otras más, producen colorantes que se usan en l a industria, como el

índigo. Mucho más importante aún, e s e l papel que desempeñan l a s

leguminosas en la ecología, en especial en el ciclo del nitrógeno.

La gran mayoría de las leguminosas están asociadas a bacterias

que tienen la capacidad de fijar el nitrógeno atmosférico. De ese

modo tanto ellas como otras plantas que crecen a su lado, asimilan

este nitrógeno para producir moléculas orgánicas nitrogenadas. E s t a

capacidad de las leguminosas e s vital para mentener la productividad

de los suelos por períodos largos. A l a larga, el cultivo de

leguminosas l e proporciona más nitrógeno a l suelo de lo que pueden

hacer los fertilizantes.

S I

Leucaena Leucocephala, la planta que es objeto de estudio del 4

presente trabajo, es una leguminosa perteneciente a l a subfamilia

Mimosoideae. Como le mayoría de las leguminosas, tiene l a capacidad

de fijar nitrógeno gracias a l a asociación simbiótica con bacterias

del género Rhizobium, que forman nódulos en las raíces. Por esta

característica, en ocasiones se utiliza a Leucaena como cultivo

colateral para crecer otras plantas que no pueden fijar nitrógeno.

Leucaena contribuye a abonar el suelo debido a que su follaje

puede compararse con el estiércol desde el punto de vista de su

contenido de nitrógeno. También se ha observado que la raíz y los

pelos absorbentes de Leucocephala, cuando crece silvestre, estan

infectados por un hongo, que forma micorrizas, cuyas hifas l e permitt

fijar fósforo y otros nutrientes.

La importancia económica de Leucocephala radica en que se utili.

-como forraje de ganado bovino, vacuno y caprino. Estos animales

han mostrado preferirla a otras plantas, por lo que se piensa que le‘

es agradable su sabor. E l ganado se come las hojas pequeñitas

(pínulas) y deja la rama desnuda que vuelve a regenerar hoJas al cab

de dos semanas.

Leucocephala contiene gran cantidad de aminoácidos de alta

calidad nutricional. Si crece en condiciones Óptimas de temperatura

y humedad, llega a producir de 800 a 4,300 Kg. de proteína por

hectárea por año. Además es una fuente importante de vitaminas y

carotenos; especialmente de vitamina A.

Leucaena leucocephala crece en casi toda l a República Mexicana,

abarcando parte de Sonora, Sinaloa, Tamaulipas, ,Jalisco, Morelos,

Veracruz, Oaxaca, Tabasco, Campeche y Yucatán. En Morelos y en

algunos otros estados se cultiva para utilizarla como forraje y l a

semilla verde y cruda es empleada como alimento humano, siendo ésta

una importante fuente de aminoácidos (tal vez la única para algunos

campesinos). En ciertas regiones del estado de Yucatan, Leucaena

puede crecer silvestre, o cultivada. El suelo en estas regiones es

de apenas algunos centímetros de espesor debajo del cual hay piedra

caliza por lo que las raíces de otras plantas no pueden penetrar l a

piedra y perecen por falta de humedad y nutrientes; sin embargo,

leucocephala posee una raíz principal que e s capaz d e penetrar la

piedra caliza hasta encontrar un manto acuífero, y así obtener agua

y sales minerales. Otro elemento favorable es que, las raíces

pequeñas que quedan en l a superficie, a nivel del suelo, evitan que

este se siga erosionando y se pierda por completo.

4

De todas las plantas leguminosas tropicales, probablemente sea

Leucaena la que ofrece mayor variedad de aplicaciones gracias a sus

numerosas variedades. Leucaena puede producir forraje nutritivo,

leña, madera para construcción y un buen fertilizante orgánico. Ent

sus mÚltiples utilidades figura la de ser una eficaz reconquistadora

de las laderas de los montes erosionados, sirve además para establecc

estructuras para cortar el viento o los incendios, dar sombra o,

simplemente, como planta de ornato. Sin embargo, el cultivo de

leucocephala ha sido muy descuidado y no s e han aprovechado plenamen

todas sus posibilidades como forraje debido, en gran medida a que

esta planta contiene una alta concentración (del 2 a l 5% del peso

seco) de un aminoácido tóxico llamado Mimosina.

Cuando el ganado consume Leucaena en una proporción mayor a l

50% del total de su dieta durante seis meses o más consecutivos, se

ha observado que pierde peso, se l e cae el pelo, y presentan salivac

excesiva. En el caso de l o s rumiantes después de la ingestión

prolongada de Leucaena, presentan bocio. E s t o se debe a que l a

Mimosina sufre una transformación química llevada a cabo por algunas

de las bacterias que se encuentran en el rumen. Esta molécula es

absorvida por el torrente sanguíneo de l o s animales y, a l parecer,

está relacionada con una baja en la producción de tirosina, la cua

repercute en l a atrofia de las glándulas tiroides, produci6ndose e

bocio.

* .

-.

desaparece al cabo de unos meses. Por

Leucaena se combina con otras plantas

de esta Última), no se presenta daño a

por el contrario, aumentan de peso rap

Estos efectos tóxicos producidos por l a mimosina son , sin embars

reversibles; es decir, s i se suspende l a ingestión de Leucaena el dab

otro lado, s i l a ingestión de

orrajeras (en más de un 5 0 %

gun0 en l o s animales y éstos

damente, alrededor de 0.88 Kg,

cabeza/día con Leucaena nardisetaria (pastizal).

En un experimento realizado en Kanai, una isla del Archipiélago

Hawaiano, se sembró leucaena y pasto guinea, en una tasa 1 : l y se

pusieron a pastar diariamente seis vacas por hectárea; cada atio se

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o b t u v i e r o n 9 ,700 l i t r o s de l e c h e y 4 0 0 Kg. de g a n a c i a en "peso v i v o "

p o r h e c t á r e a .

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INTROOUCCION

1 ) Producc ón del Cultivo de Tejidos

Debido por un lado a la gran cantidad de ventajas que tiene el

utilizar Lencaena leucocephala como planta forrajera y, por el otro,

a las desventajas que representa el que esta planta contenga grandes

concentraciones de mimosina, es importante y deseable producir

variedades que produzcan una baja concentración de mimosina.

Esto se ha tratado por medio de cruzas de leucocephala con otra'

plantas del mismo género. Existe y a un híbrido producto de la cruza

entre pulvuralenta y leucocephala que contiene una muy baja

concentración de mimosina comparada con la de todas las demás

especies y variedades. Sin embargo, esta nueva planta es estéril

pues no produce y carece de semilla.

+.

Este trabajo es la primera de una investigación más amplia con

la cual se pretende obtener una planta que contenga bajas

concentraciones de mimosina o no la contenga, usando como técnicas

de manipulación, el cultivo de tejidos vegetales y la fusión de

protoplastos.

E l cultivo de tejidos vegetales consiste en la producción de

un callo (células indiferenciadas) a partir del cual s e pueden obten

protoplastos (células libres en medio Iíouido), a las que resulta má

fácil modificar genéticamente y luego regresar a callo, y de éste

obtener de nuevo l a planta completa. Todo esto a través del manejo

de diferentes proporciones y concentraciones de hormonas vegetales ei

el medio de cultivo.

Un callo consiste en una masa amorfa de células que provienen

como resultado de heridas producidas en tallo raíz. S

observó que el estimulo que producía callos en las her

plantas era hormonas endógenas específicamente auxinas

Además encontró que los callos también pueden formarse

de la división del tejido paterno. Este callo se forma frecuentemen

nno

das

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deb

t en

de la

toc i n

do a

9 6 0

nas

a

invasión de ciertos microorganismos.como Agrobacterium tumefasien

o por la acción de insectos.

A través de las técnicas de cultivo de tejidos, se puede inducii

la formación de callo en muchas especies. Los tejidos vegetales

que se usan comúnmente para obtener callo son: cambium vascular,

parénquima de reserva, periciclo de raíz, cotiledones, mesófilo de

hoja, tejido provascular (antera y ambrión). Se ha observado que l a

, .

. facilidad de formacion del callo depende de la especie, el tejido

del que proviene y el medio de cultivo utilizado.

En el año de 1939, se obtuvieron por primera vez cultivos

prolongados de callos en los laboratorios: Gautherit en Paris,

Nobecourt en Grenoble y White en Princeton. Estos cultivos se

originaron de cambium de zanahoria y tabaco. E l término "cultivo de

tejidos" no es precisamente el m a s adecuado para denominar a estas

técnicas, ya que, las células en cultivo no conservan sus caracterís

cas originales (típicas de dicho tejido) sino que se transforman en

callo (se desdiferencían). Sin embargo este callo tiene

potencialidad de rediferenciarse nuevamente dando lugar a

tallos, y embriones que a su vez formaran plantulitas.

Las características generales de crecimiento del cal

principalmente de

para iniciar el ca

condiciones física

a

raíces,

o dependen

a relación entre el material vegetal que se usó

lo, la composición del medio de cultivo y las

del ambiente durante el período de incubación.

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P o r ejemplo, a l g u n o s c a l l o s e s t á n a l t a m e n t e lingnificados y s o n d e

t extura d u r a , m i e n t r a s q u e otros s e s e p a r a n f á c i l m e n t e en f r a g m e n t o s .

Los c a l l o s pueden ser d e c o l o r a marillento, blanco, v e r d e o pigmental

con antociaminas. La pigmentación p u e d e ser u n i f o r m e o p u e d e q u e

a l g u n a s regiones estén pigmentadas y o t r a s no.

U n p r o b l e m a que presenta el u s o de c u l t i v o s d e c a l l o para la

investigación es q u e s e pueden presentar a b e r r a c i o n e s c r o m o s ó m i c a s ,

m u t a c i o n e s y p o l i p l o i d í a e n un tejido cuyo cultivo haya sido muy prolongado.

La tasa d e c a m b i o s en el g e n o m a , d e p e n d e d e la edad del cultivo, la

c o m p o s i c i ó n del m e d i o y la e s p e c i e vegetal utilizada. S i n embargo

la poliploidía s e p u e d e presentar d e s d e la iniciación del c a l l o

d u r a n t e el primer trasplante.

,~

4.

Después de q u e un c a l l o s e ha f o r m a d o a partir del tejido

o r i g i n a l , es n e c e s a r i o replantarlo a un f r a s c o con m e d i o f r e s c o ya

queel c a l l o f o r m a d o va c o n s u m i e n d o el a g u a y los nutrientes del medii

y va e x c r e t a n d o toxinas en é l . G e n e r a l m e n t e los c a l l o s se trasplanta1

cada 20 días, s i n e m b a r g o e s t e t i e m p o varía un p o c o d e p e n d i e n d o d e

la tasa de c r e c i m i e n t o del callo. S e d e b e trasplantar sólo el t e j l d l

s a n o ; el t e j i d o n e c r o s a d o q u e n o r m a l m e n t e s e v e de c o l o r c a f é d e b e

retirarse. (Esto s e h a c e con un bisturí o con una espátula pero

p r o c u r a n d o no m a l t r a t a r el t e j i o sano). A l g o d e suma importancia

en el "cultivo d e tejidos" vegetales e s el m e d i o en el q u e ha d e

c r e c e r el callo. Debido a la d i v i s i ó n del t r a b a j o d e biosintesis de

los m e t a b o l i t o s e s e n c i a l e s e n los diferentes Ó r g a n o s d e la planta es

m u c h o m á s difícil c o n o c e r los requerimientos n u t r i c i o n a l e s de los

Ó r g a n o s y tejidos q u e de la planta completa.

U n t e j i d o d a do, además d e m i n e r a l e s e s e n c i a l e s y a g u a , t a mbién

requiere d e o t r o s c o m p u e s t o s orgánicos. E x p e r i m e n t a l m e n t e s e ha

encontrado que los requerimientos mínimos de un cultivo celular son:

sales inorgánicas, reguladores de crecimiento, vltaminas, aminoácido:

complejos orgánicos suplementarios, carbohidratos, agua y l a matriz

del medio. Sin embargo, los sistemas en cultivo pueden sufrir cambic

en sus vías metabólicas con el transcurso del tiempo.

Los reguladores de crecimiento que requieren la mayoría de los

callos en ultivo son auxinas y citoxininas. Las auxinas son

compuestos que estimulan l a elongación de las células de los brotes.

Las c tocininas con compuestos que promueven la división celular

en tejidos vegetales bajo ciertas condiciones de'bioensayo; regulan

también el crecimiento y el desarrollo. Las auxinas más frecuentes

empleadas son: lAA=ácido indol 3 acético, NAA (ácido-naftalenacético)

y 2 , 4 - D (ácido 2 , 4 - d i c l o r o f e n o x i a c é t i c o ) . Debido a que el ácido

indol-3- acético es fácilmente degradado por la luz y por oxidacionec

enzimáticas, es necesario administrarlo en alta concentración. E l

ácido-naftalenacético e s una auxina sintética por lo cual no es

fácilmente degradada por las enzimas vegetales y por ello hay que

suministrarla en mucho menor concentración que e l IAA.

14

E l 2 , 4 - D es una auxina mucho más potente que las otras dos y se

administra aproximadamente a una concentración de 0.1 mg/ml aunque

hay algunos tejidos que la requieren a una concentración entre 5 y

10 mg/ml para estimular la división celular.

Las citocininas más usadas en los medios de cultivo son: Kinetir

benziladenina, y zeatina. Entre ellas l a kinetina es l a más recurric

por lo regular se empieza administrando a una concentración de 0.1

mg/ml al buscar la inducción de callo. A veces el agua de coco se

utiliza como fuente de citocininas en una concentración de 10 a 15%

en los medios de cultivo para obtener callos.

Hay algunas excepciones en cuanto a l requerimiento de estos dos

tipos de hormonas (auxinas y citocininas). Algunos no requieren

auxinas en el medio y otros las requieren sólo al principio, ya que

aparentemente, después desarrollan l a vla biosintética. Se han

encontrado, también, cultivos que requieren de auxinas pero no de

citocininas.

Las vitaminas tienen funciones catalíticas; la mayoría son

cofactores de enzimas, por lo que e s necesario que estén pr,esentes

en el medio aunque en cantidades muy pequeiias ('',trazos"). Algunos

investigadores consideran que l a tiamina (vitamina E), es la Única

vitamina esencial para todos los tipos de cultivos de tejidos

vegetales y que e l ácido nicotínico (acina) y l a piridoxina (vitamin;

B ) sólo sirven para estimular el crecimiento y son prescindibles.

'r

6 Se ha visto sin embargo, que para cierto tipo de plantas s í

es necesario administrar tanto el ácido nicotinico como la piridoxin:

Sin embargo hay que tener en cuenta además, que algunas vitaminas so1

termolábiles y que en el cultivo de tejidos vegetales es necesario

mantener estéril tanto e l medio de cultivo como los frascos que los

contengan. Durante la vida del cultivo se l e debe mantener sin

contaminantes celulares, ya sea bacterias, hongos u otro tipo de

células vegetales. Para conseguir esto es necesario usar frascos

de vidrio y esterilizar el material (el medio y los frascos) en

autoclave. (El autoclave debe funcionar con vapor de agua a presión

y calentamiento. La presión del vapor de agua debe ser de 1 5 libras/

pg2 y la temperatura de aproximadamente 121°C (250°F) aplicada duran!

20 minutos.)

Cuando se siembran los tejidos en el medio e s necesario usar

una campana de flujo laminar, ya que ésta permite e l fluJo de aire

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i.

I.

estéri

proven

cuando

el CUI

en el área de trabalo con lo cual se prevee l a contaminación

ente de las partículas suspendidas en el aire, y dos mecheros

menos para mantener estéril el ambiente y que no se contamine

E l área de trabajo debe de ser limpiada con un algodón ivo.

empapado en

estériles e

trabaje. S

etanol al 70% V / V . También e s necesario mantener

bisturí, las pinzas y todo el material con el cual se

es posible hay que mantener l a campana de flujo laminar

en un cuarto aparte y con la puerta cerrada ya que l a s corrientes

d e aire aumentan las probabilidades de contaminación pues traen

consigo esporas de microorganismos.

Con la excepción de glicina (ácido aminoacético) no hay ningún

otro aminoácido que usualmente se requiera en el medio de cultivo. \

Con respecto a l a fuente de carbono, se usa e l disacárido

Sacarosa en concentraciones de 20,000 a 45,000 mg/lt. Casi todos lo'

cultivos presentan crecimiento Óptimo en presencia de sacarosa y

algunas veces el crecimiento disminuye en presencia de otros

disacáridos o monosacáridos. Cuando la sacarosa se agrega a l medio

y luego éste se pone en l a autoclave, l a sacarosa que es termolábil

se rompe en O-glucosa y D-fructuosa y entonces el medio resultante

en realidad contiene los 3 azúcares (sacarosa, glucosa y fructuosa).

Algunas veces se l e agrega a l medio de cultivo mio inositol corn<

factor de crecimiento, en una concentración de 1 0 0 mg/lt.

E l tipo de azúcares y la concentración agregados al medio

suelen encontrarse por ensayo y error; varían según el tipo de tejido

de la planta y del propósito del experimento.

E l agua utilizada en el medio de cultivo debe ser doblemente

destilada, o desmineralizada o destilada.

La mayoría de los cultivos de tejidos ya establecidos crecen en

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una base de agar en un rango de concentración que va de 0 . 6 a 1.0%.

Sin embargo, el agar comercial contiene muchas impurezas por lo cual

generalmente es lavado por filtración con agua destilada y/o con

etanol. Además, se pone en el medio antes de someterlo a la

autoclave ya que se ha reportado que e l "efecto inhibitorio" del

crecimiento del agar (posiblemente debido a la presencia de toxinas

enormemente después de ser sometido como contaminantes) se disminuye

a autoclave.

Para escoger e l medio de cu

es escoger por principio de cuen

tivo que se va a emplear lo mejor

as uno ya reportado en la Iiteratur.

y el que más se adecúe a la especie de la planta a trabajar, al tipo

de Órgano y al tejido y al propósito del experimento. Si la planta

ya se ha cultivado en otros laboratorios lo mejor es comenzar con e l

medio de cultivo ya publicado. Si no es el caso, es importante busc.

similitudes con cultivo ya reportados. Por ejemplo, como medio para

iniciar el cultivo de callos de plantas dicotiledoneas se usa e l

publicado por T . Murashinge y F. Skoorg. Llamando medio M S con

sacarosa y mio-inositol. Para la formación del callo se agrega

2,4-D y si se quiere alguna citocinina que puede ayudar a la induccir

cambio, responde1

debrandt que

enoxiacético y

+.

de la formac

mejor al med

contiene una

kinetina.

Ón del callo. Las monocotiledoneas en

o de cultivo reportado por Scherk y Hi

combinación de 2,4-D y ácido paracloro

Ahora bien, una parte! muy importante de este trabajo, consisten

en l a detección de mimosina en la planta y en los callos obtenidos

de la planta.

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2 ) Detección de Mimosina por Cromatografía en Capa Fina

E l método escogido en este trabajo para detectar mimosina es l a

Cromatografía en Capa Fina. Las cromatografías en general son

métodos de separación analíticos y preparativos en los que se pueden

separar sustancias con base en las diferencias en l a migración de

los componentes de la mezcla en un sistema que consta de dos fases:

una fija y otra móvil. La diferencia en la tasa de migración se

basa en diferencias en absorción, coeficiente de partición, intercam

ionico, peso molecular, etc. de cada una de las sustancias a separar

Sin embargo, en la mayoría de l o s casos cada una de estas caracterís

ticas no actúa por sí sola sino que se combinan entre s í para dar la

diferentes migraciones. Es decir, las fuerzas físicas como

interacciones electrostáticas entre iones, entre dipolos, entre ¡one

y dipolos, interacciones I I , fuerzas de Van der Waals, etc y fuerzas

quimicas con las que entran en juego en este tipo de separación.

‘r

La tase estacionaria es comúnmente, un absorbente sólido (un

polvo o un material poroso) o un líquido fijado a un acarreador.

A través de esta fase estacionaria fluye unaifase móvil l a cual pued

ser o bien un IIquido o un gas, de t a l manera que existen os

siguientes tipos de cromatografía: sólido-gas, sólido-líqu do,

líquido-gas, líquido-líquido.

Según el dispositivo experimental usado, los métodos cromatográ

ficos se clasifican en cromatograría en columna, y cromatografía en

matríz plana. La cromatografía de gases y l a cromatografía de

líquidos pertenece a l primer tipo de cromatografía; mientras que l a

cromatografía en papel y la en capa fina pertencen a l segunto tipo.

En las cromatografías en columna el soluto migra a través de

14 .

la columna.. Esta técnica s e basa e n las p r o p i e d a d e s

y a d s o r c i ó n. La f a s e estacionaria m á s

t i p o d e c r o m a t o g r a f í a es la a l ú m i n a o

n o r m a l m e n t e en forma vertical, d e s p u é s

f a s e móvil y una m e z c l a d e la f a s e móv

c o m ú n m e n t e u t

a s i l i c a gel.

de lo cual s e

1 con la m e z c

tal m a n e r a q u e r e c o r r a toda la columna. S e d i c e q u e

c o l u m n a o lleva a c a b o una "corrida", c u a n d o s e hace

el s o l v e n t e y la m e z c l a m á s s o l v e n t e por la c o l u m n a .

M i e n t r a s el s o l u t o y el s o l v e n t e pasan a través . .

d e solubilidad

Iizada para esti

La columna

le vierte la

a a s e p a rar de

s e "corre" la

pasar una vez

d e la c o l u m n a

s e e s t a b l e c e en e q u i l i b r i o e n t r e el a d s o r b e n t e , el s o l u t o y el

solvente. Este e q u i l i b r i o hace q u e los d i f e r e n t e s c o m p u e s t o s del

s o l u t o se m u e v a n a través d e la columna a diferentes v e l o c i d a d e s

d e p e n d i e n d o d e su afinidad relativa con el a d s o r b e n t e por un lado,

y p o r el o t r o de s u afinidad con el solvente. C o n f o r m e s e van separ:

do l o s c o m p o n e n t e s de la m e z c l a c o m i e n z a n a f o r m a r s e bandas o discos

o z o n a s , cada una d e las c u a l e s c o n t i e n e (idedlmente) un solo

componente. Si la c o l u m n a t i e n e el largo necesario, y los o t r o s

p a r á m e t r o s ( c o m o son: d i á m e t r o de la columna, a d s o r b e n t e , s o l v e n t e y

tasa de flujo) s o n los adecuados, las bandas s e separan una de otra

d e j a n d o z o n a s de s o l v e n t e puro e n t r e ellas. C u a n d o cada banda (que

consta de s o l v e n t e y s o l u t o ) pasa hacia el final d e la c o l u m n a , s e

p u e d e i r c o l e c t a n d o y a s í s e p a r a n d o una d e otra. Si l o s p a r á m e t r o s

a n t e s c i t a d o s no son los a d e c u a d o s , e n t o n c e s las bandas s e trasiaparr

y la s e p a r ación no será clara, o ni s i q u i e r a habrá una separación

q u í m i c a m e n t e utilizable. También existe un tipo d e c r o m a t o g r a f í a en

columna en l a q u e las sustancias a s e p a r a r s e s e q u e d a n a d h e r i d a s al

a b s o r b e n t e de l a c o l u m n a y d e s p u é s pueden s e r c o r t a d o s c o m o rebanada:

(esto s ó l o se p u e d e hacer con c i e r t o t i p o de c o l u m n a s d e un material

-,

I,"

,,

".".

I. . .

L..

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P

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,

.., .

*.,"

. . +..

., . c

I.

L_

característico).

El resultado de una "corrida" preparativa es un número de

fracciones aisladas que contienen las sustancias a separar; mientras

que e l resultado de una "corrida" analítica, s e registra el cambio

en las concentraciones del afluyente (solvente + mezcla) como función

del tiempo o en función del volumen. Cada sustancia se caracteriza

por un tiempo de eleccion o un volúmen dado a l que aparecen a máxima

concentración en el efluyente colectado a l final.

En las cromatografías de matriz plana las sustancias migran en

forma de manchas en el cromatograma y estas manchas se detectan por

métodos físicos, químicos o biológicos. En los cromatogramas

preparativos las sustancias migran en forma de zonas tan anchas como

sea necesario, que pueden separarse mecánicamente (cortando o raspandi

la zona donde apareció l a muestra) para luego ser analizadas cuantita-

tivamente. La ventaja de las cromatografías en matriz plana es que

además de la muestra a analizar, prácticamente cualquier número de

otras muestras se pueden someter a la misma cromatografía al mismo

tiempo para propósitos de identificación; por ejemplo, para compararle

con l a muestra problema, para confirmar similitudes, etc.

4

P o r cada compuesto, la posición de la mancha en el cromatograma

y su comportamiento durante l a detección, son característicos.

Entonces, el tamaño o la intensidad de l a mancha se relaciona con

l a cantidad de l a sustancia. Además, otra ventaja de este tipo de

cromatografía, es que se puede hacer una segunda "corrida" en ángulo

recto a la que ya se efectuó por primera vez y con un diferente

llamar cromatografía en solvente (fase móvil), a io que

2 dimensiones.

Las cromatografías en matr

se l e da en

z plana inc uyen a l a cromatografia

L.

c

i

.. C.

-.. r.

r. -. r.

.. r*

L..

C~.

i..

en papel, la cromatografía en gel y la cromatografía en capa fina.

Hablaré más extensamente de la Última ya que es la empleada en este

trabajo.

La cromatografía en capa fina es un proceso que se lleva a cabo

cuando una fase móvil se desplaza a través de una fase estacionaria

que en este caso consiste en un granulado muy fino, adsorbente, que

se coloca en un soporte. Este polvo fino puede estar bien fijo al

soporte o un tanto cuanto suelto (no bien adherido).

E l soporte puede ser de vidrio, (un portaobj,etos o una placa de

vidrio cualquiera), de aluminio o de plástico. Las placas se pueden

preparar en el laboratorio o se pueden comprar ya preparadas con el

granulado adsorbente. Las mezclas a separar se aplican a una distanc

tal de uno de los bordes de la placa, que no haga contacto con la

fase móvil a i ponerse la placa en la cámara. La muestra se aplica COI

una micropipeta o con un capilar de vidrio. E s importante apenas

tocar la placa con el capilar porque no debe hacerse un orificio

con éste. Cuando la pipeta toca la placa, por capilaridad la muestra

baja y forma una mancha. S i es necesario agregar más mate ial, el

procedimiento se repite. Debe evitarse aplicar mucha cant d a d de

muestra de una sola vez, ya que la mancha será muy grande la resolu.

ción de la placa será muy pobre.

%

Cuando se aplican las muestras, éstas deben estar previamente

disueltas en un solvente en el que s e diluyan completamente, y que ser

(más o menos) volátil.

Cuando el solvente se haya evaporado, después de la aplicación,

la placa se coloca en un recipíente que contenga la fase móvil, q u e

esté saturado de ella; se tapa y se deja correr la cromatografía.

Cuando la fase móvil haya llegado a una distancia suficiente como parc

1 P' -- 1 7 . . . .-.

I.

r.

.- e.

c

L.

C.

c

...

-. L.

r.

..

haber recorrido casi toda l a placa pero sin llegar al borde contrario

donde s e puso l a muestra; la placa se saca, se seca con una secadora

con aire caliente o se deja secar a temperatura ambiente. Si en este

momento aparecen manchas, éstas de deben delinear con lápiz. Luego

se somete a algún método de detección ya sea físico como luz

ultravioleta, químico como alguna sustancia o mezcla que se l e rocía

con aereosol o se pone en contacto con vapores de iodo, o biológico

como en el caso de algiln antibiótico a detectar.

La posición de cada mancha encontrada en el cromatograma corres-

ponde a las sustancias separadas y normalmente se expresa como e l

Rf de cada sustancia.

El mecanismo de la separación depende del material escogido

tanto para la placa como para l a fase móvil. El.material de l a placa

determina s i la separación es por adsorción, por partición, o por

intercambio de iones, etc. Los materiales más convenientemente usado,

para l a placa son Silica Gel y Alumina, sin embargo también se usan

otros materiales como sulfato de calcio, silicato de magnesio,

4

celulosa, celulosa aceti

como DEAE--celulosa y ge

Para preparar una p

necesario agregarle un f

ida, pliamidas, intercambiadores de iones

es como el Sefadex.

aca aparte del material adsorbente es

jador orgánico o inorgánico como almidón,

acrilonitrilo etc. Las placas comerciales ya lo contienen. Otro

componente de l a s placas comerciales es un indicador fluorescente que

permite y facilita la detección de las manchas con luz ultravioleta.

E s necesario escoger la fase móvil adecuada para correr l a

cromatografía. Esta decisión s e hace en base a l a polaridad de l a

muestra a separar y a varios ensayos con diferentes solventes o mezc

de solventes. Los ensayos se pueden hacer en placas pequeñas y cáma

1 8 . . .

pequefias de tal manera que no lleve mucho tiempo esta decisión (un

tanto empir ca). Un solvente que haga que el material puesto en la

muestra cor a a la par que la fase móvil (frente de la cromatografía)

es demasiado pal,ar. En cambio uno que no logre separar ninguna mancha

y que la muestra se quede en el lugar donde se colocó es muy poco

polar. La polaridad de los elementos (fase móvil) para cromatografía

se pueden clasificar como slgue:

€ter de petróleo aumento de PO

Ciclohexano aumento de PO

Tetracloruro de carbono aumento de PO

Benceno

Cloruro de metileno

C 1 orof ormo

Eter dietíl ico

Acetato de etilo

P i r idina

Acetona

Etanol

Metano1

Agua

Acido Acético

aumento

aumento

aumento

aumento

aumento

aumento

aumento

aumento

aumento

aumento

aumento

aridad

aridad

aridad

de polaridad

de polaridad

de poparidad

de polaridad

de polaridad

de polaridad

de polaridad

de polaridad

de polaridad

de polaridad

de polaridad

Algo que también es muy importante elegir correctamente es el

método de detección de 1 as sustancias ya separadas. Uno de los más

comúnes es el de los cristales de yodo, que se ponen en un frasco en

donde se mete la placa y se deja unos minutos. Las manchas comienzan

a aparecer. Se saca la placa y se delinean las manchas con lapíz ya

que después se corre el riesgo de que desaparezcan. Este método es mi

común ya que el iodo reacciona con la mayoría de los compuestos

orgánicos a excepción de los hidrocarburos saturados. La intensidad

de las manchas en este caso no necesariamente indica l a cantidad

material presente.

Otro método muy común y ya nombrado en este trabajo es el de

luz ultravioleta. Se usa una lámpara con la cual se ilumina l a p

en un cuarto obscuro; las manchas se ven brillosas o más obscuras

e l fondo. En el caso en el que se ven manchas brillantes se debe

e

la

aca

que

a

que el material que se separó es fluorescente. En el caso en el que

se ven manchas obscuras s e debe a que s e l e agregó un material

fluorescente a la placa y toda fluoresce menos el,material separado.

Otras sustancias químicas comúnmente usadas son: una solución

diluída de nitrato de plata usada para detectar halogenos de alqui O;

ácido sulfúrico usado para detectar l a mayoría de los grupos orgán C O L

funcionales; cloruro férreo que detecta ; verde de bromocr sol

que detecta ácidos carboxílicos; ninhidrina que detecta aminoácidos,

etc.

'r

Los valores de Rf para cada sustancia se establecen bajo las

siguientes condiciones:

1) Tipo de fase móvil (sistema de solventes)

2 ) Tipo de a solvente usado

3 ) E l grosor de l a capa de adsorbente

4 ) Cantidad relativa de muestra colocada

Dadas estas condiciones, un cpmpuesto específico siempre viajará

una distancia fija relativa a la distancia recorrida por l a fase móvil

E l

el compuesto entre la distancia que recorrió l a fase móvil. La

distancia que recorrió e l compuesto se toma desde e l punto de aplicaci

Rf es el cociente que resulta de dividir l a distancia que recorrió

".

I

.. r

-...

* .

8- . ._ L*

&...

r.

...

de la muestra hasta donde llegó (que se l e llama frente de la

cromatografia) a correr esta fase antes de sacar la cromatografia.

Por lo tanto el R siempre se expresa como un número mayor a cero y

menor que uno.

f

En condiciones muy precisas el valor del Rf es constante para un

compuesto dado y l e corresponde como una propiedad fisicoquímica del

compuesto.

identificar a un compuesto dado; sin embargo, como cualquier otra

identificación basada en un s o l o dato es mejor qu;e sea confirmado por

otros ya que como por ejemplo, el punto de fusión puede ser el mismo

para varios compuestos, puede suceder esto para el caso del Rf. Adem;

no siempre es posible reproducir con exactitud las condiciones en

que se obtuvo el R f de referencia.

Tan es a s í , que el valor de Rf fuede ser usado para

+.

Debido a que en la cromatografía en capa fina es posible correr

más de una muestra al mismo tiempo, se pueden establecer comparacioner

entre dos o más compuestos corridos en la misma placa por lo cual el

metodo nos puede servir para establecer que dos compuestos son

idZnticos.

También sirve para determinar el número de componentes en una

mezc 1 a.

Por otro lado, sirve también para determinar qué fase móvil

es la apropiada para usar en cromatografia en columna y/o para monito-

rear la separación en columna. Para checar la efectividad de una

separación en columna por cristalización y extracción. Por último,

puede servir para seguir el progreso de una reacción química.

En este trabajo, como se verá más adelante, la cromatografía en

capa fina se utilizó para identificar Mimosina comparándola siempre

can un estándar de Mimosina pura. Además se apoyaron l o s resultados

en trabajos de fotocolorimetría y en espectro de infrarrojo y de

ultravioleta cuando fue necesario.

Materiales y Métodos

I CULTIVO D E T E J I D O S

MATERIAL

frascos de vidrio Gerber (o

papel aluminio

1 ¡gas

bulbos y pipetas Pasteur

papel filtro

bomba de vacío

ibos d vid io on ;fondo p l 7 '

c

plumón marcador de vidrio indeleble

balanza grenataria

balanza analítica

espátulas

pinzas de metal

bisturís

campana de flujo laminar

mecheros

a 1 godón

embudos de filtración

papel filtro

piseta con agua destilada

piseta con etanol 9 6 " para esterilizar campana cajas de petri

au toc 1 ave

reloj

parrila eléctrica con agitador magnético

mezclador vortex

probreta de 1,000 ml

matraces aforados de 1,000 m l

22. * *

r

r

I.

matraces Erlenmeyer de 2,000 ml

pipetas de vidrio de 10 m l (termina

pipetas de vidrio de 5 m l (termina

pipetas de vidrio de 1 ml (termina

probetas de plástico de 25 ml

r..

I

IL'

... r.

i-

r.

L .

c-

L.

guantes de asbesto para manipular cosas calientes

~ o t e n c i ó m e t r o

SUSTANCIAS

Agua destilada estéril y no estéril

Etanol a l 96% en agua Hipoclorito de Na

NaOH 0.1 El para ajustar ph

HCI 0.1 N para ajustar ph

Sales minerales

V i tami nas

Reguladores de crecimiento

Sacarosa

MEDIO M S

Preparación

S o 1 uc i Ón "A"

Solución " B "

Solución " C "

Solución " D "

Solución "E" .-.

CACI2*2 H20

NH4N03

3 KNO

1: I

C o C I 2 - 6 H20

KH2 PO4

H3 B03 M A 2 Mo04.2 H20

MgS04.7 H20

g/et

4 4

16.5

19.0

O. 083

O. 0025

17.0

O. 62

O. 025

37. O

L.

Solución "F"

MnSo4.4 H20

(MnSOh 6 H20)

CUSO,,*S H 2 H

ZnSO4-7 H20

FeS04.7 H2)

NA2 EDTA

1.7

1.28

O. 0025

O. 86

5.57

7.45

Medio Murashige

',/ e t

Solución A

Solución B

Solución C

Solución D

Solución E

Solución F

G I icina

Inositol (Mio-Inositol)

Adido Nicotínico

Tiami na

Piridoxina

Hormonas: f

Kinetina

2 , 4 - 0 (Dicloro fenoxiacético)

Sacarosa

Ajustar p H de 5.6 4 5 . 8

Aforar con agua destilada

Agar 1.2% previamente lavado

* AIA (Acido Indolacético)

ANA (Acido Nepialenacético)

BAP (6-Bencilaminopurina)

10.0

100 .0

1a.o

10.0

10.0

5. O 2. o

10.0

5. O 1 .o 5 . 0

30 gr/et

I ) Producción del Medio de Cultivo

a ) PREPARACION DEL M E D I O DE C U L T I V O

a 5.6

HCI N

ester

Y se

Se prepara el medio M S hasta agregar Sacarosa. E l pH se ajusta

- 5.8 en un potenci6metro con las soluciones de NaOH 0.1

según se requiera. Se agregan los reguladores previamente

lizados por filtración a través de membranas de 2 5

a 11 con H20 destilada.

El agar se pesa y se lava primero con etanol y luego con ml %

de agua destilada en un embudo buchner. Mientras se vierte el medio

ya preparado y ajustando el pH en un matraz Erlenmayer de 2,000 ml

sobre una parrila eléctrica y con un agitador magnético. Se pone a

agitar y se calienta. El agar ya lavado se agrega a l medio de

cultivo caliente agitando hasta que se disuelva completamente. El

medio se retira de la parrilla tan pronto como empieza a hervir, se

deja enfriar un poco y se vierten 25 rnl en frascos Gerber utilizando

una probeta de plástico. Se van llenando así todos los frascos Gerbe

que se pueda hasta agotar e l medio. Se tapan los frascos con pedazos

de papel aluminio y se sellan con una liga. La concentración de

hormonas, el tipo de medio y la fecha se marcan con un plumón

indeleble.

Una vez tapados y sellados todos los frascos se esterilizan en

un autoclave. El autoclave se lava previamente y se le agrega agua

destilada hasta donde se indica. El autoclave se cierra herméticarner

dejando abierta la válvula hasta que salga vapor por ella, l a válvula

.

B

A

P

0 . 5

0 . 0 5

O. 0 0 5

Y-

-.~.

mantenimiento

I.

-. ..

L.

r-

s e cierra entonces y se espera a que la presfón suba a 20 Ib/in2 una

vez alcanzada esta presión, se esteriliza por 20 minutos después de

l o s cuales se apaga la autoclave y se espera a que baje la presión

totalmente. Se abre la válvula para verificar que ya no haya presión

en e l autoclave antes de abrirla y se dejan enfriar los medios de

cultivo. S i no se usan inmediatamente se pueden almacenar en el

cuarto frío para evitar que se contaminen o descompongan.

Las hormonas empleadas fueron:

L a s auxinas 2 , h - D y las citocininas, Kinetina y BAP en l a s combina-

ciones siguientes:

%

K 2 , 4 - D mg/l t

I

N

E T

I

N

A

,

26.. .

b ) SIEMBRA UEL MATERIAL

PREPAKACION DE LA CAMPANA DE FLUJO LAMINAR

El material se siembra en una campana de flujo laminar.

Previamente se prepara l a campana; se limpia con un algodón empapado

en etanol de 96% que se pasa por las paredes de l a campana. Se

prende l a campana para que fluya aire filtrado y se encienden

dos mecheros Bunsen dentro de l a campana. Se espera de 3 a 5 minuto:

antes de empezar a trabajar.

Los frascos con el medio de cultivo en donde s e va a sembrar e l

material s e limpian por fuera con algodón empapado en etanol 96% ante

de meterlos a la campana. Se limpia con algodón empapado en etanol .r

campana que además de los medic

oducen unas pinzas

co i is0 (que se

Se introduce

también algodón empapado en etanol para limpiar periódicamente l a

a l 96% todo lo que se introduzca a l a

es: una piseta con etanol al 96% en e

y un bisturi, una caja de Petri ester

utilizará como soporte para cortar el

que se int

1 o un mosa

material).

mesa de la campana. La persona que va a trabajar en l a campana se

lava las manos y se las empapa en etanol para poder introducirlas.

Setrabaja siempre entre los dos mecheros.

SIEMBRA DE L A S SEMILLAS

PREPARACION D E LAS SEMILLAS

Se usan semillas de Leucaena leucocephala maduras. Las semilla!

utilizadas las trajeron de Mérida, Yucatán.

”I I

Se seleccionaron las semillas que no estaban infectadas con

hongos y las que no presentaban un orificio que se encontró estaba

asociado a l a larva de un insecto que las infectaba. El número de

s iembrer semillas utilizadas depende de l a cantidad de frascos que s

S e colocan generalmente 4 semillas por frasco.

La esterilización se lleva a cabo en la campana de flu

Las semillas seleccionadas se colocan en un matraz con

o laminai

agua

caliente a 80°C (de tal manera que el agua cubra completamente

semillas) y se dejan durante dos minutos. Se escurre esta agua

se les vierte etanol en agua a l 70%. S e dejan en esta solución

minuto. Se enjuagan 4 veces con agua estéril después de lo cua

les vierte hipoclorito de sodio (disuelto en agua) a l 10%. S e +.

as

Y

un

se

esperan 1 5 minutos. Se vuelven a enjuagar 4 veces con agua estéril.

Después se colocan en agua estéril de tal manera que las cubra

completamente. Se tapan con pape

se dejan remojando durante 3 días

Se efectúa l a siembra dentro

S e escurre el agua de donde estuv

aluminio o con papel encerado y

de l a campana de flujo laminar.

eron las semillas. Se toma e l

frasco con el medio en donde se quieren sembrar las semillas y se

destapa. Con una mano se sostiene el frasco de l a parte de la base,

con la otra s e toma las pinzas que estan remojadas en etanol al 9 6 % ,

se flamean y con ellas se despega el papel aluminio del frasco,

acercando e l frasco a uno de los mecheros se quita l a tapa de alumin

y s e flamea.

La boca del frasco

aire que pueda entrar a

en alcohol y a flamear.

-agar. Se toma una semi

se acerca al mechero para esterilizar el

fresco. Se vuelve a mojar las pinzas en

Se enfrían poniéndolas en contacto con el

l a con las pinzas y se coloca sobre el agar

...

del frasco. Se procede igual para las otras 3 semillas que se coloc.

en el mismo frasco procurando colocarlas separadas una de la otra.

(en 4 extremos del frasco) Se vuelve a metar l a s pienzas en alcohol

y a flamear. Se flamea la tapa y se tapa e l frasco, se fija con la

mano y una liga.

Una vez sembrados todos l o s frascos, se marcan con plomón

indeleble con la fecha de sembrado en la tapa de papel aluminio.

Se colocan en una charola y se ponen en el cuarto de crecimiento o

en la incubadora a 2j"C.

SIEMBRA DE TALLOS, HOJAS Y RAlZ

'i

Se siembran semillas de Leucaena Leucocephala en condiciones

estériles en frascos Gerber con medio M S + hormonas. Aproximadamenti

a las dos semanas o semana y media de sembradas y a s e tiene una

plantulita. Cuando la plantulita tiene unos 3 o 4 cms. de altura,

se puede utilizar para sembrar y producir callos.

La siembra se hace en la campana de flujo laminar. Se destapa

el frasco con medio M S + hormonas como se indica anteriormente. Se

corta la plántula, ayudándose con las pinzas, en trozos pequeños

sobre una caja de Petri o un mozaico previamente esterilizado. E s t o

es, se separan l a s hojas cotiledonarias, las pequeñas hojitas (o

pínulas) del tallo; el tallo se corta en trozos de aproximadamente

1 cm, y se separa la raíz. En frascos con medio nuevo (recientementc

preparado) s e colocan. En frascos separados se siembran los trocito.

de tallo, las hojas cotiledonales, la raíz y las hojas jóvenes de la

planta.

Se ponen 4 a 5 porciones en cada frasco de manera tal que no

r-

._..

, ... 2 9 . . .

queden muy juntos. Se tapan los frascos con tapa d

Se cierran con la liga y se fija l a tapa aJustando

anota en la tapa e l tipo de tejido que se sembró y

s i em b ra .

papel aluminio.

os bordes se

a fecha de

SIEMBRA D E EMBRIONES

Las semillas maduras de Leucaena leucocephala s e abren con unas

pinzas de metal de punta redonda, tratando de no romper en pedacitos

la semilla y de no maltratar el embrión. Se saca e l embrión y se

guarda. Cuando se tienen un número de embriones suficientes como

para sembrar 4 Ó 5 en cada frasco Gerber (o en cada tubo de vidrio),

se procede a esterilizarlos para evitar contaminaciones por hongos o

bacterias provenientes de la semilla.

4

Se esteriliza en una campana de flujo laminar poniéndolos en un

matraz con etanol en agua a l 70% durante un minuto. Después se lava

4 veces con agua estéril. En seguida se les pone en una solución

de hipoclorito de sodio en agua a l 1 0 % durante dos minutos. Se

vuelven a enjuagar 4 veces con agua estéril después de lo cuál se

escurren. Se siembran los embriones en tubos de vidrio con medio M S

y hormonas o en frascos Gerber también con medio M S y hormonas. Se

debe cuidar que l a pinza con l a que se tomen los embriones esté

debidamente estéril y fría para no dañarlos. S e siembran 4 Ó 5

embriones por cada frasco Gerber o bien un embrión por cada tuvo de

vidrio.

2 OETECC I ON DE MIMOS I NA

3 0 . .

MATERIAL

Pre-Casted Merk T L C Plates Silica Gel 60 F-254

Placas de Silica Ge con indicador fluorescente marca Merk

DC- Fertigplatten K eselgel 60 de 20 x 20 cms.

Cámara de vidrio ch ca de 9 cms de alto x 4 a 5 cms de diámetro con tapa (para cromatografia)

Sellador de silicón

Cortador de vidrio

Pesas o cualquier cosa pesada para poner arriba de l a tapa de las

cámaras

Lápiz

Reg 1 a

Pinzas de metal

Parrilla eléctrica con agitador magnético

Agitadores magnéticos de varios tamaños recubie?tos de plástico

Lámpara de UV

Aspersor de vidrio

Gas para aspersor

Viales de vidrio fco. ampula pequeilos

Tapa de hule

Papel encerado

Ref r i gerado r

Balanza analítica Sartorius

Pipetas de vidrio de 5 m l

Pipetas de vidrio de 10 ml

Probeta de 25 m l Probeta de 100 ml

Planta completa Leucaena leucocephala seca

Semillas maduras de Leucaena leucocephala

Cámara de disecación

Probeta de 1,000 m l

Bolsas de diálisis de 3 cms de ancho x 45 cms de largo Bolsas de diálisis de 1 cms de ancho x 7 cms de largo

Probeta de 250 m l ancha Frascos Gerber Callos de Leucaena leucocephala

Papel aluminio Callos de Leucaena leucocephala

Matraz Erlenmeyer de 2 I t s

Piseta de plástico con agua destilada

Rotavapor

Matraz de bola para rotavapor para muestra

Matraz receptor de solvente para rotavapor

Bomba de vacío

Centrífuga Microfuga

Pinzas para diálisis chicas y grandes

Gradilla de metal

Tubos de ensaye de vidrio

Bortex

Masquin-tape

Pipetas de 5 m l terminales 5 pipetas de 2 m l terminales

Matraz Erlenmeyer de 250 ml

2 cubetas de 3 m l para fotocolorímetro

Fotocolorímetro marca Zeiss

Fotocolorímetro marca Bauch E. Lomb

Pipeta Ependorf de 1,000

Pipeta Ependorf de 200

Pipeta Ependorf de 20

Punta de plástico para pipetas Ependorf

Papel de baño

Charo a de Plástico

Servi letas de papel adsorbentes

Algodón

Secadora de pelo (aire caliente)

Tubos de vidrio capilares

Pipetas de tubos de vidrio aforados de I O I t

4

RESULTADO

6 fcos con callo

ME0 I O PROCEDENCIA

Tal los 2 , 4 - D Ing

BAP O . 5 mg

2,4-D Ing

BAP O. 5 mg

Raíces 2 fcos con callo

2,4-D Ing

Kinet 0.5 mg

Raíces

Semi I la

1 fco con callo ....

c

' 2 fcos con 1 plan

tula c/u y poco c,

Ilo en Tre. Raíz Tal lo

4

1 fco con 1 plánti

la con cal lo en ra

2 , 4 - D Ing

Kinet 0 . 5 mg ....

r.

- .. "". 2 , 4 - D Ing

BAP O . 5 mg Semi 1 la

- - I. ,.

2,4-D Ing

BAP 0.5 mg

Semilla

esterilizada

d e 4 sem. sólo 1 pl ántul a

..

2 , 4 - D Semilla de 4 sem. sólo 1

plántula en 2 fco' .̂ 2 , 4 - D Sem i 1 I a de 4 semillas 3

plántulas en 1 fc,

en 2 fcos de 4 se

millas 1 sóla p l á i

tula en 1 fco. de

4 semillas una 15

p 1 ántu la g randec i

Kinet. 0.05 mg/lt Semi 11 a c.-

r

2 , 4 - D Ing

Kinet 0.5 mg

S e m i 1 l a 3 fcos con 5 s e m i

llas y 1 fco. con

6 semillas ningun.

germ i no.

r

33. I

r .

r

r.

-.."

r.

.....

r .*

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SUSTANCIAS

Mimosina en polvo (estándar) marca Zigma

Cloruro Férrico (FeCI 6 H2D)

Acido Clorhídrico

Agua destilada

EDTA Na2 2 H20

Ninhidrina

Agua destilada

Etanol 96% en agua

Amonlaco (Hidróxido de Amonio)

N - butanol

Acido acético

Propanol

Metano1

Acido Clorhídrico 0.5 N

P i r idina

2-Propanol

Acetona industrial para bomba de vacío

Eter etílico

Hlpoclorito de Na

Hielo Seco

D L - Norleucina

DL- Met ion ina

D L - Asparagina

D L - Acido Aspártico

D L - Novalina

3

D L -

D L -

D L -

D L -

D L - D L -

D L -

DL-

DL-

DL-

DL-

Citrul ina

Cistina

Sarina

Triptófano

Acido Glutámico

Treon i na H i s t id ina

Pro1 ina

Fenilalanina

Ti ros i na

Arg inina

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METO00

a ) CROMATDGRAFIA EN CAPA FINA

S e cortan las placas de Silica Gel en plaquitas de 2.5 cms de

ancho x 6 cms de largo. Se prepararon las siguientes mezclas para

correr las cromatografías y observar en cuál de ellas corrla mejor

el standard de mimosina.

n-butanol, ácido acético, H20 (6: 1.5 : 2.5) tetracloruro de carbono, metanol, HCL 1% en H20 (5:4:1) * etanol, amoniaco, H20 (8: 2.5 : 7.5)

2 propanol, amoniaco, H20 (9:1:2) 2-propanol, HCL 0.5 N (8:2) n-propanol, HCL 0.05 N (4:l) y (3:Z) propanol, piridina, H20 (7:2:1) n-butanol, ácido acético H20 (12:3:5) metanol, HCL 0.5 N (9:l) metanol, HCL 0.5 N, H20 (9:1:3) metanol, propanol, H20 (4:3:3) propanol, amoníaco al 25% en H20 (7:3) propanol, butanol, ácido acético, H20 (3.5 : 3 :

..

1.5 : 2) L..

Se prepara el estándar de Mimosina en una concentración de 1 mg. L .

r .

i.

r.

L .

c-

i.

r-

L.

C.

..

disuelta en agua. Se marca un punto con lápiz a aproximadamente

0.5 cms del extremo inferior de la placa chica y en el centro.

Con un capilar de vidrio se tomó una muestra de a Mimosina estándar

en agua y se colocó una gotita en la marca en la placa. Se dejó

secar a temperatura ambiente o se seca con aire caliente. Se

impregna la cámara pequeña con la mezcla de solventes que se va a

utilizar y se pone una pequeña cantidad de la mezcla en el fondo de

35 . . .

l a cámara a una altura tal que no llegue a donde se colocó la muestr

de Mimosina en la placa. Después de impregnada la cámara se toma l a

placa de silica gel con unas pinzas de metal y se coloca en la cámar

se coloca la tapa y el peso. S e deja que el solvente suba por

capilaridad hasta aproximadamente 1 cm antes de llegar al otro extre

de l a plaquita. Se saca l a placa y se seca con aire caliente. Se

toma un trozo de algodón con las pinzas de metal, se impregna con

cloruro férrico y se le aplica a l a placa sin frotar l a capa de

sílica gel. Se seca el palo. Después de lo cue1 se verá una mancha

de color morado grisáceo tenue que corresponde a la mimosina.

Para determinar el Rf de l a mimosina es necesario antes de

secar la placa y en cuanto se saca de la cámara, marca con lápiz

hasta dónde llegó e l solvente (fase móvil). Se determ na el R f %

de l a siguiente manera.

distancia recorrida por solvente

DISTANCIA RECORRIDA P O R MANCHA Rf - Las dos distancias se toman a partir de donde se colocó la

muestra. La distancia recorrida por l a mancha se toma hasta e l

centro de l a mancha s i ésta es redonda.

Se repitió el procedimiento con todas las mezclas de solvente.

Se escogió l a mezcla de solvente con l a Mimosina.

3 METODOS DE EXTRACCION DE MlHOSlNA

a ) Extracción con Hidróxido de Sodio

Se tomaron hojas de Leucaena ieucocephala seca y se intentó

extraer Mimosina con el siguiente método:

.

1-1

.

.". -...

el-

-. .

Se pesaron las hojas, aproximadamente 0.25 g r m s .

Se colocaron en un matraz Erlenmeyer y se les agregó NaOH 0.1 N,

aproximadamente 200 ml.

Después se agregó agua destilada y s e calentó a 60 Ó 70°C.

Se filtró en caliente agregando poca agua destilada con papel filtro

del No. 42 (Marca Hattman),

Se filtró lentamente de 2 a 3 veces.

El filtrado se recibió en un matraz Erlenmeyer de 500 m l .

Se tomó una alícuota del filtrado y se agregaron unas gotas de HCI

para neutralizar la solución, luego se agregaron unas gotas de

cloruro férrico 0.05% en HCI 0.2 N.

Esto se hace con el objeto de determinar colorimétricamente s i hay

mimosina en la s01utiÓn. Con anterioridad se probó con l o s D I -

aminoácidos enlistados en el material, todos diluídos en agua a una

concentración de 1 mg/ml (incluyendo el estándar de Mlmosina) por

separado cada uno, s i daban alguna coloraciÓn al agregarles unas 2 Ó

3 gotas de cloruro férrico 0.05 % en HCI 0.2 N y se procedió a

observar s i había coloración rojo moradoso característica.

+.

S e repitió el método de extracción pero con NaOH 0.5 N y tomand(

350 ml de filtrado y agregando 100 ml de tanol al 96% en agua. Se

sometió a rotavapor y a liofilización. Con el liofilizado se volvió

a hacer una dilución de 1 mg/ml en agua y a correr cromatografías en

la cámara pequeña comparando con el estándar de Mimosina.

Se tomaron vainas verdes de Laucaena laucocephala y se les

sacaron las semillas. Se trituraron éstas en un mortero primero en

seco y luego con NaOH 0.05 N. Este machacado se puso en un matraz

e..

con NaOH 0.05 N y se siguió el mismo proceso de extracción de Mimosii

utilizado para las hojas, secas, sólo que esta vez s e usó papel

filtro del No. 41 y un poco de CELiTA, que es un mineral adsorvente,

a l momento de filtrar; revolviéndolo con el machacado de semilla.

b) Extracción con Metano1

P o r otro lado, se tomaron 300 ml del filtrado y s e l e agregaron

200 ml de metanol. S e dejó reposar la mezcla en, el refrigerador.

AI dia siguiente se volvió a filtrar la mezcla por partes con papel

filtro del No. 42. E l filtrado obtenido secolocó en un matraz de

bola y se procedió a separar el metanol en el rotavapor. %.

Después se sometió a liofilización previa congelación de la

solución con hielo seco en acetona hasta que quedara la solución

congelada y cubriendo l a mayor parte de la superficie interna del

matraz.

Del liofilizado obtenido se hizo una dilución de 1 mg/ml en

agua, se corrieron cromatografías en la cámara pequeiía comparando COI

el estándar de Mimosina tomando una alícuota igual de las 2 solucione

con un capilar de vidrio cada una y usando la fase móvil ya escogida

c ) Extracción por D i á l i s i s

Se pesaron 50 g r de semilla madura de Leucaena leucocephala,

se maceraron en una licuadora. Después se tamizaron 3 veces,

macerando en la licuadora cada vez. Se utilizó todo lo que pasara

hasta la tercera vez a través de una malla del No. 16 de abertura

1.13 mm, alambre No. 265. Lo que no pasó esta malla, se deshechó.

r.

L.

L

Se cortaron bolsas de diálisis de 3 cms de ancho por 40 cms de largo

Por otro lado se preparó EDTA Na2 2 milimolar en agua destilada.

S e pusieron en un matraz con EDTA ya preparado y un agitador magnéti

Se puso a hervir con agitación du'rante 33 minutos. Se esperó a que

enfrlara la solución. Se desechó el EDTA y se dejaron remojando las

bolsas de diálisis en agua destilada, previo lavado con agua

destilada. Se guardaron así en el refrigerador.

a ) Semillas maduras

Se tomó una de las bolsas de diálisis con las pinzas de metal.

Se le cerró un extremo con una pinza de plástico especial para

dializado. Se llenó la bolsa con las semillas maceradas y se le

agregó un poco de agua destilada adentro, se cerró el otro extremo

con otra pinza de diálisis de plástico. En una probeta de 2,000 ml

se colocó la bolsa de diálisis con el macerado y se llenó con agua

destilada la probeta hasta aproximadamente 1,000 ml de tal manera q u

el agua cubriera toda la bolsa de diálisis. Se puso dentro de la

probeta y ésta se colocó arriba de una parrilla agitador. Se tapó

con papel aluminio y se dejó dializando aproximadamente de 1 5 a 19

hrs. Despues de lo cual se l e sacó el agua a la probeta, que tenía

ya un color amarillento y se colocó en 2 matraces grandes de 5 0 0

ml y en uno de 250 ml, s e guardaron en el refrigerador. La probeta

volvió a llenar con agua destilada. Se l e sacó el aire a la bolsa

de dislisis pues estaba inflada, y se volvió a poner en la probeta

con el agitador sobre la parrilla agitador. Se volvió a dejar así

otras 15 horas; al t€rmino de las cuales se repitió la operación

anteriormente descrita. Los matraces contenidos el dializado,

%

.^ L

r-

-..

c

se guardaron en el refrigerador. Esta vez se desechó la bolsa de

diálisis con las semillas maceradas

E l dializado obtendio se concentró en el rotavapor con ayuda de

una bomba de vacío. E l concentrado que tenía un color anaranjado,

se guardó en el refrigerador en un tubo de ensaye de 2 0 ml. El

dializado obtenido cada día se concentró por separado (no se mezclarr

AI día siguiente, se observaron unos cristales precipitados en el

concentrado se filtró con eter etilico en papel filtro No. 42. Se

obtuvieron unos cristales color rosado tenue, qu;e se colocaron Junto

con el papel filtro en una cSmara desecadora al vacío. E l filtrado

se guard6 en el refrigerador de nuevo. AI dia siguiente se pesaron

los cristales y se guardaron en un frasco de vidrio con tapa de

rosca. S e repitió la operacion 3 veces con cada concentrado. Cada

vez se obtenían menos cristales y de un color menos rosado. Se

guardaron en frascos separados los obtenidos de cada filtrado.

.

Se mandó a hacer un espectro con ultravioleta y o t r o con

infrarrojo de una muestra de los cristales obtenidos en el primer

filtrado comparando con estándar de Mimosina.

Se repitió todo el proceso de obtención de cristales, con semillas

maduras de Leucaena leucocephala, fue hecho después de someter a l

siguiente tratamiento dichas semillas. Una vez pesadas, se pusieron

durante dos minutos en agua destilada a 80°C. Se escurrieron y se

colocaron en etanol al 70% en agua durante un minuto. Después se

enjuagaron 4 veces con agua destilada, A continuación se les agregó

hipoclorito de Na al 10% en agua y se mantuvieron en esta solución

durante 15 minutos. Se volvieron a enjuagar 4 veces con agua destil.

A continuación se pusieron a secar sobre toallas de papel absorvente

sobre una charola y en una estufa a aproximadamente 60°C. AI día

I

I

4 0 . . e I-

_. .

-.

L

I

...

r-

..

%..

siguiente se maceraron en la 1

b) De callo obtenido de embr

Con cal

leucocephala

proceso:

cuadora

ón

os obtenidos de embrión de semilla madura de Leucaena

de dos semanas y media, se llevó a cabo el siguiente

S e prepararon con EDTA Na2 2 milimolar en agua destilada, bols,

de diálisis de 1 cm de ancho por 10 cm de largo,, hirviéndolas con

agitación durante 30 minutos. Luego se dejaron enfriar, se enjuagar(

con agua destilada se dejaron en agua destilada y en el

hasta ser utilizadas. Se tomó una de estas bolsas de di5

las pinzas de metal, se l e colocó en un extremo una pinza

para d i á l i s i s , se llenó la bolsa con callos ya cortados y

4

ef igerador

i s i s con

de p l á s t i c ,

pesados, y

se cerró el otro extremo con otra pinza de plástico para dialisis.

Se colocÓ l a bolsa de diálisis así llenada en una probeta de 1 0 0 ml

ancha, llena con agua destilada hasta aproximadamente 80 m l . Se le

introdujo a la probeta un agitador magnético y se colocó sobre una

parrilla agitador. Se tapó con papel aluminio y se dejó dializando

I 9 horas aproximadamente. Este dializado no se concentró, se guardó

en el refrigerador para ser utilizado después. d

c ) Extracción por Centrifugación

4 1 g r . de callos de Leucaena Leucocephala obtenidos de embrión

de semilla madura pesados I O minutos después de haberlos cortado,

se maceraron en un mortero con 5 m l . de agua destilada; después se

centrifugó el homogeneizado a 3,500 r,p.m. durante 15 mintuos, se

_+ .̂ 1

4 1 . . .

separó el sobrenadante el cual se volvi6 a centrifugar durante

otros 10 minutos después se guardó en el refrigerador para ser utili

-zado m á s tarde. Se hizo lo mismo con las partes verdes (tallos

pequeños) que estaban unidos a l o s callos.

DETECCION DE MlMOSlNA

a ) CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

Se corrieron placas de aproximadamente 3.5 cm de ancho por 7 cm

de largo en las cuales se colocaron 3 muestras. Una de Mimosina

diluída en agua, l a otra de Mimosina diluída en NaOH 0 . 1 N y la

tercera de Mimosina diluída en H C I O.ON. Las tres a una concentraci

de 1 mg/ml. S e corrieron en Etanol, Amoniaco y Agua (8 :2 .5 :7 .5 ) .

4

También se corrieron placas chicas de 4 x 7 cm con l a misma fas

móvil pero con muestras de:

- Mimos

semi 1

- Mimos

na estándar, ler dializado de semilla, 20. dializado de

a , concentrado del ler dializado I

na estándar, l e r dial izado, concentrado y centrifugado

de callo.

- Mimosina esta'ndar, dializado, centrifugado de callo y centrifu-

gad0 de tallo.

Se corrieron placas de 10 cm de ancho por 20 cm de alto en las

que se pusieron, con pipetas tubo graduadas de 10 I t y usando en tod

l o s casos una concentración de 1 mg/ml, muestras de lo siguiente:

c

. P

.. c

c*

L

c

1 ) Mimosina estándar, dializado de semillas, concentrado de

dial izado, cristales obtenidos del concentrado.

2 ) Mimosina estándar, dializado de semillas, concentrado, centrifu

gado de callo, centrifugado de tallo.

3 ) Mimosina estándar, dializado de semillas, concentrado centrifug.

do de callo, centrifugado de tallo, ácido indolacético.

Las placas que se corrieron de 10 x 2 0 cm., se corrieron dobles

es decir, en realidad las muestras ocupaban solabente 5 cm del ancho

de la placa y se repitieron en l a otra mitad de tal manera que se

corriera como una sola placa y al final de l a "corrida", y a que estal

seca la placa, se cortaba a la mitad con el cortavidrios y una mitad

se reveló con Ninhidrina y la otra mitad con Cloruro Férrico. La fasc

móvil utilizada fue Etanol,, Amoniaco y Agua ( 8 . 0 : 2.5: 7.5).

b) FOTOCOLORIMETRIA

Se hizo una curva patrón (curva de calibración) de Mimosina

estándar para lo cual:

Primero se corroboró experimentalmente la longitud de onda a la

que adsorbia más el estándar de Mimosina. Esto se hizo a una

concentración de O. 1 mg/ml de Mimosina estándar y se leyó desde

360 manometros de 10 en 10 nm hasta 600 nm.

Después se trató de detectar qué tanto variaba la lectura en

Fotocolorímetro de la concentración del estándar de Mimosina con

respecto a variaciones en la concentración de Cloruro Férrico y de

EDTA de sodio. Para esto, se hicieron tres curvas con concentracioni

de Mimosina estándar de 0.1, 0.5 y 1.0 mg/ml y se leyeron a 535 nm.

En la primera n o s e a g r e g ó c l o r u r o f é r r i c o a l o s tubos y en l u g a r

d e é s t e se a g r e g ó a g u a ; en la segunda s e o m i t i ó el EDTA d e s o d i o e n

lugar del cual s e a g r e g ó a g u a ; y e n la t e rcera s e v a r i ó la concentra

c i ó n d e c l o r u r o f é r r i c o m a n t e n i é n d o s e c o n s t a n t e la c o n c e n t r a c i ó n d e

M i m o s i n a en 0.1 mg/ml. Para f i n a l i z a r s e h i z o una Última en l a q u e

s e a g r e g ó c l o r u r o f é r r i c o y EDTA d e s o d i o a t o d o s los tubos y lo q u e

s e o m i t i ó f u e Mimosina.

El m é t o d o u t ilizado para hacer la c u r v a patrón d e Mimosina f u e ,

siguiente: i

S e utilizaron e n t r e 15 y 20 t u b o s d e ensaye'de vidrio (el nÚmer(

d e p e n d e del n ú m e r o d e m u e s t r a s a leer). S e m a r c ó la c o n c e n t r a c i ó n d '

M i m o s i n a e s t á n d a r que le c o r r e s p o n d í a a cada tubo. Las c o n c e n t r a c i o

nes u t i l i z a d a s para hacer la c u r v a fueron: 0.001 mg/ml, 0.005 mg/ml,

0.01 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml. S e hicieroi

dos e s t i q u e t a s para cada c o n c e n t r a c i ó n (dos t u b o s para cada u n a ) y ut

4

t u b o blanco.

A cada t u b o s e le p u s o 1 ml d e M i m o s i n a e s t á n d a r a la concentra

c i 6 n q u e le c o r r e s p o n d í a s i e m p r e dilufda e n agua. P a r a preparar

las d i f e r e n t e s c o n c e n t r a c i o n e s lo q u e s e h i z o f u e preparar en u n

f r a s c o d e v i d r i o una c a n t i d a d d e a l r e d e d o r d e I O Ó 20 ml. d e mimosin,

estsndar a 1 mg/ml y d e e s a s o lución se tomó con pipetas E p e n d o r f ,

la c a n t l d a d necesaria para q u e al a g r e g a r una c a n t i d a d de agua

p r e v i a m e n t e c a l c u l a d a s e llegara a la c o n c e n t r a c i ó n deseada.

A I t u b o b l a n c o s e le a g r e g ó I ml d e la s o l u c i ó n a 1 m g/ml.

D e s p u é s se a g r e g ó a todos los tubos m e n o s al tubo blanco 0.5 ml d e

c l o r u r o f é r r i c o 0.05% en HCL 0.1 N y al t u b o b l a n c o s e le a g r e g ó agu.

destilada (.O5 m i ) . A c o n t i n u a c i ó n s e a g r e g ó a todos l o s tubos

incluyendo al blanco 2.5 ml de EDTA Na2 2H O a una c o n c e n t r a c i ó n de 2

1 gr. en 4 I t de agua destilada. AI terminar se taparon todos los

tubos con un trocito de papel encerado elástico y se agitaron en el

vortex. Se colocaron en l a gradilla y se dejaron reposando a l a

oscuridad durante 20 minutos. Pasado este tiempo s e comenzó a leer

en celdas de 3 ml en fotocolorfmetro marca Zeizz o celdas de 5 ml

para e l fotocolorímetro Bauch & Lomb. AI leer se tomaron l a s

adsorbancias y las transmitancias y siempre s e leyó contra el blanco

preparado.

S e leyeron también muestras de Mimosina est,ándar a 1 mg/ml de

concentración diluídas en agua en cuatro diferentes condiciones:

Luz y temperatura ambiente; oscuridad y temperatura ambiente; luz y

frío; oscuridad y frío. Estas lecturas se hicieron en las siguiente 4

fechas: 19/1/83. 20/1/a3. 24/1/83, 25/1/83, 26/1/83, 27/1/83,

30/1/a3, 3/ii/83, 4/11/83, 15/li/a3 y 21/11/a3.

KESULTADOS:

I) Cultivo de Tejidos de Leucaena leucocephala

Los resultados de esta parte del trabajo fueron sólo cua

vos. Con callos obtenidos de fragmento de tallo, hoja y raíz

observaron diferencias importantes en cuanto a l a s caracterís

itati-

no se

¡cas d,

callo y la velocidad de crecimiento en los distintos medios de

cultivo utilizados. En estos tejidos hubo un alto índice de

contaminación que determinó que eventualmente se abandonara el

trabajo con estos tejidos.

No se obtuvieron callos directamente de las semillas germinadas

Solamente en la plántula ya formada se origina un pequeño callo en I

unión entre la raíz y el tallo.

Los callos obtenidos de embrión de semilla madura son más

blancos y laxos que los otros y tardaban más tiempo en necrosarse.

El medio que contenía 2 mg/lt de 2 , 4 , - 0 y 0.1 m g / t de Kinetina

era el más adeucado para la inducción de callo en embr ón de semilla

madura puesto que los callos formados tenían un tamaño más homogéneo

y satisfactorio y su color y consistencia (blancos y laxos) se

mantenían durante más tiempo que en los otros medios utilizados.

Sin embargo, una vez alcanzado un tamaño de aproximadamente 1

cm. de diámetro, el callo cesaba s u crecimiento,'aGn cuando se

resembraba en medio de cultivo fresco con la misma concentración de

hormonas O conotra diferente. 8

La imposibilidad de obtener un medio de mantenimiento del callo

ido y a que no se

o s n i tampoco que

no impidió la detección de Mimosina en este te

requería mantener durante mucho tiempo los cal

creciera aceleradamente.

1 1 ) Detección de Mimosina

1 ) Cromatografía en Capa Fina

A pesar de que la bibliografía especializada reporta que la

mimosina corre bien en diversas mezclas, utilizadas como fase móvil,

la Única mezcla de solventes en la que se observó que el estándar de

Mimosina corría fue: etanol, amoníaco y agua (8:2.5:7.2). En las

demás el estándar de mimosina s e quedaba en el origen.

Aunque generalmente se utiliza la ninhidrina para reverlar

aminoácidos, el Cloruro FGrrico al 0.05% en H C L 0.1 N es más

~ -- 4 6 . . .

%

...

*..

-. . r-

i,

r.

específico para la mimosina, ya que produce manchas mucho más

definidas que con Ninhidrina. Sin embargo, en este trabajo se

utilizaron ambos reactivos en algunos casos.

Se emplearon dos tipos de placas de Sílica Gel: Precoated TLC

Plates Silica Gel 60 F-254 marca Merk y OC-Fertigplatten Kieselgel

60 marca Merk, sin que ésto afectara los resultados.

Se disolvieron muestras de 1 mg/ml de mimosina en agua, en NaOH

0.1 N y en HCL 0.1 N. Las muestras se aplican con un capilar de

vidrio, en placas de aproximadamente 3 x 6 cm.

determinaron están ilustrados e n l a tabla # 1

Los Rf que se

Mimosina + H O Mimosina + NaOH Mimosina + HCL \ 2

O . 8068

O. 81395

O. 7954

O . 8055

0.81281

0.79166

O . 80303

0.81344

O. 79070

En ninguna de los liofilizados de hoja seca (pínulas) o de semi

verde Leucaena leucocephala no s e detectó mimoslna cuando se corrió

en las placas pequeñas junto con e l estándar.

P o r lo anterior se decidió emplear el método de extracción

por diálisis de semillas maduras reportado por ( 1. AI

concentrar el dializado en un rotavapor y dejarlo reposar a 4°C

se obtienen cristales de color de rosa. Los cristales se filtraron

con éter. Del primer dializado se obtuvieron 0.3883 gr. de

cristales. Del segundo s e obtuvieron 0.2861 gr. Al repetir la

operación se obtuvieron: del primer dializado 0.4042 gr. de cristale

y del segundo 0.3215 gr.

Se corrieron placas de aproximadamente 4 x 7 cm con muestras

. . -- 4 7 . . .

r.

c .

.-

c .

.....

L..

r--

-.

r.

estándar de:

1) Mimos

ler d

2 ) Mimos

cal lo

na estándar, l e r dializaro, 2- dializado, concentrado del

a l izado.

na estándar, ler dializado, concentrado, centrifugado de

3 ) Mimosina estándar, dializado, centrifugado de callo, centrifugal

de tallo.

Los Rf's obtenidos por los corrimientos en placa chica fueron

los siguientes:

MIMOS I NA l e r DIALIZADO

o. 81 0 .8101

0 . 8 1 O . 8285

O . 83 o . 8222

o. 79 O. 79542

MlHOSlNA l e r DIALIZADO

O . 8237 O . 8250

o. 8082 O . 8068

0 .8143 0.8129

MIMOS I NA O I AL I LADO

O. 8390 O . 8402

o. 8228 0.8230

O. 8337 O . 8353

O . 8058 0 .8031

Z2 DIALIZADO \CONCENTRADO

0.8111

0 .8142

O . 8305

O. 79366

2 2 DIALIZADO

O . 8224

O . 8043

0.8140

CENTRIFUGADO CALLO

O . 8384

O . 8225

0 .8331

O. 7989

O. 80995

O . 1853

O . 8333 O . 7980

CONCENTRADO

0.8222

O . 8057

0.8150

CENTRIFUGADO TALLO

O. 8379

0.8210

0 .8327

O . 7985

Los espectros infrarrojo y ultravioleta de los cristales obtenidos

del l e r dializado son prácticamente idénticos a los del estándar de

mimosina.

Los homogenizados de Callo y d e Tallo se obtuvieron a partir

.- -

4 8 . . .

de 2.8215 g . de callo y de 1.2815 g . de tallos ambos de embrión de

semilla.

Se corrieron también placas de 10 x 20 cm en las cuales se

colocaron muestras de Mimosina estándar (1 mg/ml) dializado de semil

concentrado del dializado yhomogenizado de callo y de tallo ( 1 0 1 de

muestra), aplicados con aforada. Los Rf's resultantes fuerr

los siguientes:

La mitad de l a placa fue revelada con FeCL2

MlMOSlNA

O . 8604

0 .7903 o. 8000

0.8139

o. 8333 0.8378 O . 81 42 0.85714 O. 7600 0 .7903 0.815734

DIAL IZADO

0.83139 0.78419

0.79714 O . 8068

o. 8222

O . 8269 O . 79428 o. 8385 O . 74285 O . 7742 O . 801845

CONCENTRADO

O . 8372 0.78419 O. 7942 0.8139 O . 8226 O. 82558 0.8142 O . 8430 O. 75428 O . 7742 O . 806335

PLACAS CHICAS

MlMOSlNA + H20 MlMOSlNA + HCL

0.8192 O . 8068

0 .81395 O. 79545

O . 81 944 O . 80303 O . 81944 O . 79070

Revelado con Ninhidrina:

I

CENTRIFUGADO AIA

CALLO TP.LLO

0.8648 0 .8375 - 0.7905 0.7916 - 0.7957 0 .7942 - 0.8125 0 .8111 - 0.8333 0.8333 - 0.8370 0 .8385 No sal i¿ 0.8068 0 .8142 No sal¡¿

0.8375 0 .8375 No salt<

0.7571 0.74858 -

0.811688 0.81072 PROMEOI

MlMOSlNA + NaOH

0.81818 O . 8055 0.81081 O . 79166

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MIMOS I NA DI AL IZADO CONCENTRADO CENTRIFUGAOO

CALLO TALLO

O. 8488

0.7903

O. 7982

o. 8200 O. 8333

O. 83798

0.8142

O. 8430

O . 7605

O. 7903 O. 813648

0. 82558

0.78419

O. 7900 0.8182

O . 8288

O. 82558

O. 79428

O. 83798 0. 75428

O. 7742

O. 803309

O. 82558

O . 7 0 4 1 9

0.7952

0.8168

O . 8230

0.8255

10.8150 O. 83385 O. 75428

D . 7742

O. 80476

O. 8070

O. 7906

O. 7963 dos manchas

dos manchas

dos manchas

O. a072

O. 8379

0.8070

FOiOCOLOR IMETR IA: -.

Para confirmar los

se midió fotocolo

hicieron las sigu

1) Mimosina 0.1

2 ) Mimosina 0.1

imetr

entes

mg /m 1

mg/ml

3 ) FeCL2 + EDTA Na2

O. 8086

O. 7906

O. 7965

0.8160

O. 8372

O. 8488

0.8140

O. 8379

0.8187

AIA

- - - - -

O . 8628

O. 8492

O. 89385

O. 86865 PROMED Ií

Dia

O i a

Pat

Se h

izado

izado

resultados de las cromatogramas en capa fina

camente, en un aparato marza Zeizz. Se

curvas:

+ EDTA Na2 + FeCL2

+ EDTA Na2

4) Curva patrón de Himosina desde 0.001 mg/ml hasta 1.0 mg/ml

cieron lecturas de homogenizad de Callo, de Tallo, Primer

de semilla, Segundo Oializado y Cristales del Primer

y se leyeron l o s resultados comparándolos con la Curva

ón.

También se leyó en el fotoco

Optica contra Longitud de Onda de

concentración de 1 mg/ml en las s

orímetro y se graficó Densidad

Himosína diluida en agua a una

guientes condiciones: Luz y Fr

C .

e..

~ Luz y Temperatura ambiente, Oscuridad y frío, Oscuridad y Temperatur.

c.

ambiente; efectuadas en diferentes fechas. Se anexa también una ~

g r á f i c a con' estos resultados. L^

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C O N C L U S I O N E S Y DISCUSION:

Por ello, se partió de concentraciones de hormonas que anteriormente

se habían utilizado en el mismo laboratorio,por otra persona, para

ternifo producir callo en una planta dicotiledonea llamada Bouvardia

y que resultaron exitosas.

Se probaron varios tejidos a excepción de los órganos f

debido a que carecíamos de ellas. Se trabajó con semillas o

ora 1 e s ,

planta

seca traída de Mérida, Yucatán.

Los intentos por cultivar Leucaena leucocephala en invernadero r

fueron exitosos ya que nunca crecio más de 30 cm. por lo cual no dab<

flor, pues no llegaba a edad madura, n i fruto. 5

Finalmente se decidió trabajar con embrión y a que trabaJos

anteriores con Zea mais hechos

exitosos en cuanto a las carac

de ese tejido.

Es importante el hecho de

en el

erlst

que e

mismo departamento habían sido

cas del callo producido a partii

callo obtenido sea incoloro

o blanco, debido a que esa característica nos habla de su no

diferenciación al menos en cuanto a tejido fotosintético. También

es importante obtener cslulas lo menos diferenciadas posible para

que después, a partir de ellas se puedan diferenciar todos los demás

tejidos de la planta. Esto habla también de la ventaja de haber

obtenido callo del embrión ya que es éste el que da origen a toda

la planta en condiciones naturales.

También es importante que el callo sea laxo, es decir, con las

células que lo constituyen fácilmente separables unas de otras ya qu<

el método que después se utilizará para obtener la modificación

genética será a través de la obtención de protoplastos, lo cual se

1 ...

5 2 . . I I *

.. .

y,..

hace a partir de un cultivo en medio líquido de células no diferenci

das y disgregadas lo más posible dentro del medio de cultivo. Esto

último será hecho por otra persona en e l mismo departamente y será

objetivo de otro trabajo.

Cromatografía en Capa Fina

A pesar de que en la literatura se encontraron reportados vario

sistemas de solventes en l o s cuales una muestra de Himoslna era capa

de correr, en este trabajo sólo un sistema de so'lventes dio resultad

positivos a este respecto y fue: Etanol, Amoníaco y agua ( 8 . 0 : 2 . 5 : 7 .

Esto probablemente se debe a el tipo de placas de Sílica Gel utiliza

y a que en los casos reportados en la literatura las placas eran hech

en e l laboratorio y con un adsorbente especial llamado Pulpa Analíti

# 389 (Schleicher E Sckuelli a bien se corria l a cromatografía pero

en papel.

4

Por o t r a parte, el segundo tipo de placas que se utilizó fue

de la misma marca que el primero y con e l mismo adsorbente sólo

que no contenía fluor por lo que la Única alteración a los resultado

que se observó fue e l no detectar l a s manchas con luz ultravioleta.

Además, el primer tipo de placas sólo se utilizó para hacer las

pruebas de detection de la fase móvil con la cual corriera mejor e l

aminoácido Mimosina, y las pruebas para encontrar e l mejor revelador

que sirviera para este caso.

Se utiliz6 la cromatografía en capa fina debido en primer lugar

a que se contaba con e l material necesario disponible, y en segundo

lugar debido a la facilidad de manejo de las placas y a la rapidez

con que se obtienen l o s resultados. Una tercera razón es que para

los fines que perseguia este trabajo los resultados que se obtienen

con esta técnica (cualitativos) son confiables.

Se encontró un trabajo de Fujiya Hongo y Sadao Shiroma que nos

fue enviado directamente por los autores antes de su publicación

en el que se demostraba por medio de cromatografías en papel que

la Mimosina era rápidamente transformada a otros compuestos en

presencia de HCL 0.1 N. NaOH 0.1 El , entre otras sustancias. Por eso

se evitó extraer o tratar al aminoácido Mimosina con esos dos

compuestos a esa concentración o más alta.

Aunque los R encontrados, tanto en placa chica ( 4 x 7 cm) como

en placa grande (10 x 10 cm) para el estándar de Mimosina y para las

demás pruebas (Dial izado, Concentrado, Cristales diluídos, Centrifug,

do de callo y de tallo) no son constantes, s e puede observar que

varlan desde 0.80 hasta 0.83 a excepción de algunos casos que se

dispara hasta 0.79 Ó 0.84.

f

Se debe tener en consideración que los R no son muy constante' f

en cromatografía en placa fina debido a que intervienen muchos

facotores que están fuera de control del trabajador. En primer lugai

afecta l a temperatura del medio-ambiente, y sobre todo en este caso

ya que uno de l o s solventes de la fase móvil es hidróxico de amonio

el cual es muy volátil, lo que hacía que la composición de l a mezcla

de solventes no fuera de composición excatamente constante pues

cada vez que se abría la c:ámara de cromatografía se evaporaba este

compuesto lo que a su vez repercute en un corrimiento de la placa

diferente a lo esperado. Esto se observó con claridad en la placa

chica cuando se habia utilizado dos o tres veces l a misma mezcla

de solventes en la cámara ya que para la tercera vez se observaba qui

l a mancha correspondiente a l estándar de Mimosina se veía barrida

hacia abajo, es decir, como s i se hibiera arrastrado la muestra y

no claramente delimitada como la primera vez que se corría, é s t o

s i se hacia en el mismo dio.

P o r otro lado, la superficie en la que se trabajó (mesa) era

de Formica y muy probablemente no estaba lo suficientmente plana

en algunas regiones debido a que s e observó que e l frente, en l a s

placas grandes sobre todo, no corrió igual a todo lo largo de la

placa. O t r o factor que pudo afectar mucho y causar que las manchas

no corrieran exactamente la misma distancia es e;l hecho de que la

mezcla de solventes utilizada como fase móvil al contener hidróxido

de sodio en gran cantidad y este ser muy volátil e irritante p a r a

las mucosas fue muy dificil colocar las placas,,especialmente l a s

grandes, dentro de l a cámara. Algunas veces quedaban un poco más

inclinadas que otras y por tanto el ascenso del frente era diferente

También se puede observar que la variación en cuanto a Rf por

cada placa; es decir, de una mancha con respecto a otra corridas

en l a misma placa, en la mayoría de los casos es bastante pequeña,

de milésimas y en otros casos de centésimas.

Debe recordarse también que el Rf se calcula tomando como

distancia recorrida por la mancha el centro de ésta y aunque en la

mayoría de los casos l a mancha fue bien definida y de forma ovoide,

también hubo muchas en l a s que la mancha era un poco más borrosa y

por tanto más dificil de determinar e l centro.

Sin embargo, debido a las deficiencias en cuanto a la determina

cion de R f se apoyó este trabajo en determinaciones por fotocolorime

tría (para io cual se utilizó un aparato marca Zeizz). En primer

lugar se confirmó que la longitud de onda a la que adsorbe mejor el

aminoácido Mimosina es 535 nanómetros. Después se encontró que

55.. .

el EDTA agregado a l a mezcla a leer no afecta l a lectura de adsorban

de Mimosina en el rango de 360 a 580 nanómetros. Se encontró a la

vez que el Cloruro Férrico tampoco adsorbe a longitudes de onda

que van desde 4 8 0 hasta 580 nanómetors por lo que no afecta l a s

lecturas de adsorbancia de Himosina. Con ello se deduce que sólo

el complejo Mimosina-Cloruro Férrico es lo que adsorbe a 535

nanómetros con l o cual nos aseguramos que no haya problemas de

diferentes lecturas de adsorbancia debidas a EDTA.

Se hizo entonces l a curva "patrón" de Absor,bancia del aminoaiid(

Mimosina y se leyeron al mismo tiempo tubos con centrifugado de

callo, centrifugado de tallo, primer dializado, segundo dial zado y

cristales obtenidos del primer dializado diluidos en agua a mg/ml.

Como se puede observar claramente en la gráfica, todas estas lectura

cayeron dentro de la curva e incluso entre 0.1 y 0.5 m g / m l es

decir, dentro de la zona con comportamiento exponencial.

4

Con los resultados obtenidos de las interpolaciones de la

curva de adsorbancia contra concentración de Mimosina en agua, se

puede claramente observar que l o s cristales obtenidos a partir del

dializado diluídos en agua, dan la concentración más alta. E l

centrifugado obtenido de macerar tallo a los que alrededor les

creció callo es la siguiente, el primer dializado obtenido de h o j a s

a continuación, después el segundo dializado y por Último encontramo

que lo que menor concentración de Mimosiria presentó fue el

centrifugado de callo. Con esto podemos deducir que las células

que constituyen el callo obtenido de embrión de Leucaena leucocephal.

probablemente contienen menor cantidad de Mimosina que la planta

completa e incluso que los tallitos producidos por el embrión. E s t a

posibilidad habrá que confirmarla con experimentos cuantitativos

_, .-.- 56.

posteriores, pero puede ser tomado en consideración cuando se trate

de trabajar con callos ( s i esta consideración es cierta) para llevar

a cabo las modificaciones genéticas a la planta completa.

Por otro lado, el centrifugado de tallos obtenidos del cultivo

de tejidos presenta mayor concentración de Mimosina que el primero

y segundo dializados debido a que el centrifugado se hizo con l a

menor cantidad de agua posible y los dializados no se pudieron hacer

con poca agua. Estos Últimos se concentraron con rotavapor y bomba

de vacío pero no fue posible eliminar una gran cantidad de agua que 1

de todas maneras quedó, pues el proceso de concentración es muy

lento, por lo mismo lleva mucho tiempo, y difcílmente se elimina

toda el agua. -,

Con estos datos quedó concluído este trabajo que consistió,

como ya se dijo anteriormente, en encontrar y montar una técnica

que pudiera detectar Mimosina en l a planta de Leucaena leucocephala

y en los callos obtenidos de ella.

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