Diagnóstico Laboratorial VIH
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VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA (V.I.H.)
DIAGNOSTICO LABORATORIAL
PRUEBAS LABORATORIALES
• Diagnóstico de la Infección del VIH– Screening (tamizaje)– Confirmatorio
• Pruebas complementarias para el seguimiento de paciente con la infección– Recuento de de Linfocitos CD4/CD8– Carga Viral
• Pruebas de Rutina– Hemograma– Orina– Baciloscopia– Parasitológico– Otros
leucopenia
linfopenia
trombocitopenia
VSG elevada
DIAGNOSTICO DE LA INFECCION POR EL VIH
METODOS• METODOS DIRECTOS
- Aislamiento viral: Cultivo viral H9
- PCR : Detección de fracciones antigénicas
del virus ó genoma viral
• METODOS INDIRECTOS
- Detectan la presencia de anticuerpos específicos contra el VIH por medio de técnicas serológicas.
* TEST RAPIDOS * IFI * ELISA
* WESTERN BLOT * LIA
La técnica mas utilizada actualmente para el screening serológico es el test de ELISA y en menor proporción los Test Rápidos (OMS)
TAMIZAJE SEROLOGICOELISA
Negativo Positivo/Indeterminado Repetidamente
Correr una nueva muestra
Repetidamente POSITIVO
Etapa
(1)
WESTERN BLOT
Negativo Indeterminado Positivo
Correr una nueva muestra 30 a 60 días después
Repetir etapas 1 y 2
Etapa
(2)
PRUEBAS RAPIDAS
Buena sensibilidad
Económicas y rápidas
Baja Especificidad
CULTIVOS CULTIVOS VIRALES VIRALES
Buena especificidadLentas, baja sensibilidad
Complicado. Costo
ELISAELISA
Buena Sensibilidad y Especificidad
Sencillo y rápido
Periodo de Ventana
Costo
WESTERN WESTERN BLOTBLOT
Confirmatorio, alta Sensibilidad y Especificidad.
Seguro
Elevado Costo
Contaminación
Especificidad
Costo
GenotipificaciónPeriodo de Ventana PCRPCR
TEST TEST VENTAJAS VENTAJAS DESVENTAJAS DESVENTAJAS
PRUEBA RAPIDA PARA VIH
(INMUNOCROMATOGRAFIA)
Gaby Fabiola Mamani V.
BIOQUIMICA
PRUEBA RAPIDA PARA VIH (INMUNOCROMATOGRAFIA)• ObjetivoObjetivo
“ Detectar anticuerpos anti-VIH ½ y no componentes virales ”• Fundamento
- - Método cualitativo indirecto basado en
el principio de adsorción selectiva de
inmunoglobulinas.
Prueba rápida para VIH
Prueba rápida para VIH
Prueba rápida para VIH
8. Coloque la muestra de sangre completa colectada en el capilar en la
superficie absorbente, y espere un minuto
Prueba rápida para VIH
Prueba in Vitro
Tarjetas de ensayo recubiertas de antígeno recombinante del VIH 1 y VIH 2 y de
péptidos sintéticos.
Laboratorios Abbott
ENZIMOINMUNOENSAYO
(ELISA)
TEST DE ENZIMOINMUNOENSAYO (ELISA)
• ObjetivoObjetivo
“ Detectar anticuerpos anti-VIH ½ y no componentes virales ”• Fundamento
- - Método enzimático, cualitativo indirecto
basado en el principio de “Sandwich” en un
solo paso
FUNDAMENTO
Antígenos VIH1/2
Anticuerpos Suero o Plasma
ConjugadoAntígenos
HIV1/2 marcado con Enzima HPR
ConjugadoAntígenos
HIV1/2 marcado con Enzima HPR
Sustrato(Sustrato
Enzimático + Cromógeno)
H2SO4
POSITIVO Presencia de anticuerpos HIV
1/2 (color amarillo)
PLACA DE ELISAPLACA DE ELISANEGATIVO Ausencia de Anticuerpos
para VIH1/2 (Sin color)
L EC T OR D E E
L I S A
Se lee a 450/630 nm
Lectura de la reacción final
INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBACALCULOS (Organón Teknika)
Validación del Test
* CN < 0.250 (Control Negativo)
* CP1 - CNx > 0.400 (Control Positivo)
* El CP2 - CNx > 0.400
* El Cutt Off = CNx + 0.100 = valor “x”
Valores mayores al Cutt Off, son Positivos Valores menores al Cutt Off, son Negativos Valores +/- 10% del Cutt Off, Indeterminados
WESTERN BLOT
(TEST CONFIRMATORIO)
TEST DE WESTERN BLOT
• Objetivo- Detectar anticuerpos específicos
contra el VIH1/2
• Fundamento• Test Inmunolineal o ELISA en banda, que detecta anticuerpos
• Lisado viral de células infectadas, sometidos a electroforésis en gel de poliacrilamida y transferido a hojas de nitrocelulosa
• POSITIVO- Si dos bandas presentan intensidad >1+ en relación
al control , - Una banda de envoltura y la p24- Presencia de bandas gp120, gp41, p31, p24 y p17
para HIV1- Proteínas gp105 y gp36 para HIV2
Criterios de interpretación
gp120 gp41 p31 p24 p17
3+ 1+ +/-
Control
gp105 gp36
• INDETERMINADO- Si dos o mas bandas presentan intensidad +/-- Si una banda presente intensidad <1+ y el resto son negativos en relación al control
Criterios de interpretación
• NEGATIVO• Si todas las bandas presentan valoración <+/-• Ausencia de proteínas
3+ 1+ +/-
Control
3+ 1+ +/-
Control Gp120 p24
PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PARA EL SEGUIMIENTO DE PARA EL SEGUIMIENTO DE
PACIENTES POSITIVOSPACIENTES POSITIVOS
PRUEBAS COMPLEMENTARIAS
• Test para el seguimiento de pacientes VIH Positivos
– Recuento de Linfocitos CD4/CD8
– Carga Viral
RECUENTO DE LINFOCITOS CD4/CD8
• Citometría de flujo– Tamaño celular – Complejidad interna o gránulos internos– Intensidad relativa de la Fluorescencia
• ELISA (Enzimoinmunoensayo)
• Inmunofluorescencia (IFI)
CITOMETRO DE FLUJO EPICS XL PECKMAN COULTER
Fundamento del Citómetro de Flujo
• El Recuento de CD4/CD8, tiene como finalidad de evaluar el estado inmunológico de la persona infectada
• Valores de referencia:– Células CD4+ varían entre 600 a 1500 células
por mm3 de sangre– Células CD8+ varia entre 300 a 800 células
por mm3 de sangre– Relación de células CD4+ vs. CD8+ es de 2:1
PARAMETROS DEL RECUENTO DE CELULAS CD4/CD8
– Superiores a 500 celulas CD4+ (Buen estado de salud)– Entre 200 y 500 celulas CD4+
• Incrementa riesgo de Herpes, Aftas, Infecciones en piel, Infecciones pulmonares, TB
• Enfermedades Oportunistas Pneumonia por Pneumocistis Carini, Citomegalovirus
– Entre 50 y 200 células CD4+• Se incrementa el riesgo por PCP y otras enfermedades oportunistas• Se recomienda ya el tratamiento preventivo• Inferiores a 100, considerar el tratamiento preventivo para
enfermedades oportunistas e infecciones masivas por hongos.
– Inferiores a 50 células CD4+• Se incrementa riesgo de enfermedades oportunistas• Continuar con terapias preventivas
VALORES ABSOLUTOS
CARGA VIRALCARGA VIRAL
DETECCIÓN DE RNA VIRAL
• AMPLICOR HIV MONITORTM Test
(Roche Diagnostic Systems)
• QuantiplexTM HIV RNA Assay
(Chiron Corporation)
• NASBA HIV-1 RNA QT
(Organon Teknika)
CARGA VIRALCARGA VIRAL
• La carga viral nos indica la actividad del virus
• Herramientas
– Niveles de RNA Viral
– Nivel de riesgo del desarrollo de la enfermedad
– Reacción a la terapia antirretroviral:
• Iniciar, modificar o incrementar medicamentos
– Si la droga o medicamento esta dando o no resultado y cuando empieza a perder su efectividad
CARGA VIRALCARGA VIRAL
• Muestra de sangre (plasma sanguíneo)• Múltiples copias del virus presente en la
muestra• Proceso matemático se da el número estimado
de las partículas virales presentes en la muestra(200 –1.000.000 copias/ml)
• Margen de error del 20%• Utilizar el mismo laboratorio y examen para el
seguimiento y los cambios de la carga viral
CARGA VIRALCARGA VIRAL
• Los niveles altos de RNA Viral se correlacionan con bajos recuentos de Linfocitos CD4+
• Niveles superiores a 100.000 copias/ml propensas a desarrollar la enfermedad SIDA
• Niveles inferiores a 10.000 copias/ml disminuye el riesgo a la enfermedad
CARGA VIRALCARGA VIRAL
CARGA VIRALCARGA VIRAL
METODO AMPLICOR (Roche) RT-PCR
NASBA HIV-1 RNA QT Amplificación isotérmica de RNA
QUANTIPLEX HIV-1 RNA
Rango de detección
200-750.000 400-10.000.000 500-800.000
Nivel de detección mínimo (Sensibilidad copias/ml)
200 400 240
Volumen de plasma
200 ul 1000 ul 2000 ul
DIAGNOSTICO
PEDIATRICO
• La presencia de IgG materna en el recién nacido dificulta el diagnóstico.
• Seguimiento durante 15 a 18 meses con WB en forma seriada.
• Detección de antígeno, aislamiento viral y la PCR son de utilida, pero debe ser evaluado con:– Clínico
– Inmunológico
Factores que pueden influir en los resultados:
– Laboratorio– Reactivos– Tiempo de procesamiento – Horario de la toma de muestra– Presencia de infecciones– Falta de sueño– Estrés– Otros factores biológicos
• Para el diagnóstico de la Infección por el VIH– PRUEBA RAPIDA, nos permite realizar el tamizaje
serológico, mediante la detección de anticuerpos Anti -VIH1/2, con buena sensibilidad.
– ELISA, nos permite detectar los anticuerpos Anti-VIH1/2, con una alta sensibilidad y especificidad
– Es importante realizar el Test Confirmatorio de Western Blot, para dar un resultado final
CONCLUSIONES
• Para el seguimiento de pacientes con la infección, es importante:– El Recuento de Linfocitos CD4/CD8, debe ir paralelo a la
prueba Carga Viral– Evaluar el estado clínico del paciente
• Realizar seguimiento al paciente VIH positivo, en coordinación de:– Médico-Clínico, – Laboratorio y– Consejería– Adherencia permanente
CONCLUSIONES
PREVENCIÓN
• Promoción a todo nivel social del uso del preservativo
• Tratamiento y prevención de otras enfermedades de transmisión sexual
• Programa de reparto de jeringas para drogadictos
BIOSEGURIDAD
TODO MATERIAL BIOLOGICO DEBE SER
CONSIDERADO Y MANIPULADO COMO POTENCIALMENTE
INFECCIOSO