Scientia Chromatographica 2015; 7(1):53-63Instituto Internacional de Cromatografiahttp://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.016ISSN 1984-4433

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA

Scientia Chromatographica 2015; 7(1) 53

ResumoO crescimento significativo na produção e consumo de sucos demanda métodos de

controle, capazes de mensurar a proporção da fruta e de açúcares, em cada tipo de

produto. Pelos direitos básicos dos consumidores, informações sobre a composição e

riscos, devem estar claras e adequadas nas embalagens. Apesar disto, frequentemente

o brasileiro é confundido, á começar pela nomenclatura dos sucos. Pela legislação,

os sucos - integral e concentrado devem conter 100% da fruta sem qualquer adição.

Já, o néctar, bebida pronta para o consumo, deve ser elaborado com um mínimo de

50% da fruta, adicionado de água, sacarose, acidulantes e conservantes. Portanto,

este estudo objetivou verificar se as quantidades de açúcares totais dos sucos de uva

- concentrado e néctar são comparáveis e concordantes, quando determinadas por

3 técnicas/métodos distintos – refratometria, espectrofotometria e cromatografia,

verificando a sua aplicabilidade. A refratometria (RF), a mais aplicada no controle

industrial, emprega a leitura direta do oBrix em refratômetro. A espectrofotometria

mede glicose em 490 nm pelo método convencional fenol-sulfúrico (ESP-FS).

Enquanto, a cromatografia líquida de alta eficiência determina os teores de frutose,

glicose e sacarose empregando detector por índice de refração (HPLC-RID). Para

fins de comparação direta, a concentração dos açúcares totais por HPLC-RID foi

obtida pela soma dos teores individuais dos carboidratos. A quantidade de açúcares

totais média empregando RF, ESP-FS e HPLC-RID foi considerada semelhante

(Tukey p<0,05) para o néctar (14,85±0,44 g 100 mL-1) e para o suco concentrado

de uva (61,74±2,60 g 100 mL-1), excetuando o concentrado analisado por ESP-FS

(80,47±8,6 g 100 mL-1). A menor variação dos teores foi observada por RF (0,5-3,0%),

seguida por HPLC-RID (3,4-6,3%), com ESP-FS (8,4-17,2%) apresentando a maior

dispersão. Desta forma, a RF provou ser adequada para a determinação rotineira

dos açúcares totais, considerando sua precisão, praticidade e simplicidade de uso.

Entretanto, o HPLC-RID apresenta um diferencial adicional, além de fornecer o teor

dos açúcares totais. Baseado no perfil cromatográfico possibilita distinguir entre

sucos - integral ou concentrado, elaborados só com a fruta, pelas proporções de

frutose e glicose encontradas naturalmente na própria uva, de produtos adicionado

de sacarose, como o néctar. Este método consiste, portanto, em uma ferramenta

alternativa que poderia ser utilizada em caso de suspeita de fraudes, para atestar a

autenticidade e o cumprimento da legislação.

Palavras-chave: carboidratos, frutose, glicose, autenticidade, HPLC-RID.

Bárbara Sthéfani Caldas Leonel Vinicius Constantino Cyntia Helena Gomes Alves Silva Tiago Bervelieri Madeira Suzana Lucy Nixdorf*

Laboratório DIA, Depto. de Química, Universidade Estadual de Londrina (UEL), Rodovia Celso Garcia Cid - Pr 445 Km 380, s/n, 86057-970, Londrina-PR, Brasil*e-mail: snixdorf@uel.br

Recebido: 02/07/2015Aceito: 31/07/2015

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva: comparativo empregando refratometria, espectrofotometria e cromatografia líquidaComparative assessment of sugar in concentrated and nectar grape juices by refractometry, spectrophotometry and chromatography

Caldas BS et al. Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

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AbstractSignificant growth in juices production and consumption demand control methods, capable to measure fruit and sugars proportions for each kind of product. Basic consumer rights, require clear and appropriate composition and risks information’s on packaging. Despite this, Brazilians are often misleader, starting with juice’s nomenclature. By law, whole and concentrate juices must contain 100% of fruit without any addition. On the other hand, nectar, beverage ready for consumption, should be elaborated with a minimum of 50% of fruit, by adding water, sucrose, acidifiers and preservatives. Therefore, this study aimed to verify whether total sugars amounts of concentrate and nectar grape juices are comparable and consistent, as determined by 3 different techniques/methods - refractometry, spectrophotometry and chromatography, checking their applicability. Refraction (RF), the most applied in industrial control, employs oBrix direct reading in refractometer. Spectrophotometry measures glucose at 490 nm by conventional phenol-sulfuric method (FS-ESP). While, high-performance liquid chromatography determines fructose, glucose and sucrose levels using a refractive index detector (RID-HPLC). For purposes of total sugars concentration direct comparison, HPLC-RID levels were obtained by the sum of individual carbohydrates. The average of total sugars amount employing RF, ESP-FS, HPLC-RID was considered similar (Tukey p <0.05) for nectar (14.85±0.44 g 100 mL-1) and concentrate grape juice (61.74±2.60 g 100 mL-1), except for concentrate analyzed by ESP-FS (80.47±8.6 g 100 mL-1). The smallest variation levels was observed by RF (0.5 to 3.0%), followed by HPLC-RID (3.4 to 6.3%), with ESP-FS (8.4 to 17.2%) presenting the greatest dispersion. Thus, RF proved to be suitable for routine determination of total sugars, considering the precision, practicality and simplicity of use. HPLC-RID however has an additional differential besides providing total sugars content. Based on the chromatographic profile allows distinguishing between whole and concentrating juices, made only by fruit within fructose and glucose proportions naturally found in grape itself, from products added sucrose as nectar. This method consists therefore in an alternative tool that could be use in case of counterfeit suspected, to attest for authenticity and legislation compliance. Keywords: carbohydrates, fructose, glucose, authenticity, HPLC-RID.

1. IntroduçãoA uva é considerada uma excelente fonte

de vitaminas e minerais, conhecida como um dos

melhores agentes naturais para prevenção do câncer[1].

Seus compostos bioativos, pela sua capacidade

antioxidante atribuída aos flavonoides, reduzem os

radicais livres protegendo contra o estresse oxidativo

e doenças crônicas[2,3], cujo consumo da fruta e seus

derivados garantem uma melhor qualidade de vida[4].

Já, as antocianinas (delfinidina, cianidina, petunidina,

peonidina, malvidina) determinadas por LC-MS[5] e

estabilizadas por ácidos orgânicos[6], além de auxiliarem

na autenticidade varietal[7,8] constituem os principais

responsáveis pela cor[9,10], atributo decisivo no consumo

do suco[6].

No cenário brasileiro, os sucos de uva são de

grande importância pelo volume comercializado. Os

sucos elaborados com uvas finas de origem europeia

(Vitis viniferas) como ‘Chardonnay’, ‘Riesling’,

‘Merlot’ e ‘Cabernet Sauvignon’, não apresentam as

características da casta, sendo neutros e sem graça,

segundo Lona[11]. Já, os elaborados a partir de uvas

americanas (Vitis labrusca L.) de cultivares como Isabel,

Concord, Bordô e Seibel, normalmente utilizadas em

cortes para garantir cor intensa, são extremamente ricos

em aromas e gosto de uva. Por essa razão, o suco brasileiro

é muito apreciado, porém raro, já que na grande maioria

dos países produtores de uvas, o cultivo das espécies

americanas é proibido. No entanto, o patrimônio vitícola

da Serra Gaúcha é formado por 80% de uvas V. labrusca

e 20% de V. viniferas[11]. Segundo a avaliação setorial de

2013 foram processados 536,7 milhões de quilos de uvas

V. labrusca contra apenas 73,8 de V. viniferas no Rio

Grande do Sul[12].

As exportações de suco de uva concentrado em

2013 tiveram expansão de 110,4% em valor e 84%

em volume, com a remessa de 1,78 milhões de quilos

frente ao mesmo período de 2012. O Japão se manteve

como principal destino do produto, representando 87,4%

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva Caldas BS et al.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):53-63 55

Nas vinícolas, costuma-se controlar a concen-tração de açúcar, o pH e a acidez total do suco[19]. A quantidade de sólidos solúveis (%/volume de mosto) pode ser determinada por métodos físicos não seletivos, como a refratometria medida em graus Brix[20]; ou pelo grau glucométrico medido em graus Babo, que determina a quantidade de açúcar em peso em 100 g de mosto (caldo da uva)[21]. Os poucos dados encontrados para sucos de uva elaborados com Vitis labrusca[22] seguem os protocolos analíticos estabelecidos no COMPENDIUM OF INTERNATIONAL METHODS OF ANALYSIS – International Organization of Vine and Wine[23]. A quantificação de açúcares redutores e totais em diferentes tipos de matrizes[24-26], por sua vez, pode ser mensurada por métodos químicos clássicos, fundamentados na redução dos íons cobre em meio alcalino (Somogyi-Nelson), ou na desidratação dos açúcares em ácido concentrado (fenol-sulfúrico), através da coloração de compostos orgânicos por espectrofotometria[20,27].

Sabe-se que nas frutas, os principais açúcares presentes são a frutose e a glicose, normalmente em partes iguais. No entanto, os açúcares diferem significantemente em doçura, influenciando diretamente no sabor e aroma da fruta e dos derivados[6]. Desta forma, um conhecimento da composição de açúcar (tipo e quantidade) possibilita a escolha mais adequada do cultivar de uva a ser empregada na elaboração dos sucos, dependendo dos atributos requeridos, como sabor, doçura e cor. A informação sobre a adição de sacarose, assim como os teores de glicose são cruciais para os diabéticos[6]. Desta forma, a determinação do tipo e concentração dos carboidratos nos alimentos é importante, visando fornecer as informações nutricionais e calóricas que são requeridas impressas nas embalagens; para o controle de qualidade de forma que assegure o cumprimento da legislação, identificando possíveis produtos adulterados[28]. Dentro da questão da rotulagem de alimentos, prevalece o princípio da “plena informação adequada e clara sobre os diferentes produtos e serviços, com especificação correta de quantidade, características, composição, qualidade, tributos incidentes e preço, bem

do volume total comercializado pelo Brasil, com alta de 79% frente á 2012. Apesar da menor proporção de crescimento para o suco de uva pronto para consumo, este vem ganhando espaço no mercado internacional. De janeiro a junho de 2013, foram exportados 139,5 mil quilos, alta de 883% em volume ou 9,8 vezes, um incremento de 1.102% ou 12 vezes em relação á 2012. Três destinos concentraram 99,5% do volume exportado, sendo eles Venezuela, Líbia e Paraguai[12].

A comercialização de sucos de uva no mercado interno vem mantendo o desempenho positivo. O maior destaque ficou com os sucos prontos para consumo – os néctares que ampliaram a comercialização em 42,94%, um incremento de 9,97 milhões de litros em relação ao 1º sem/2012. O mercado do suco concentrado também registrou crescimento de 17,22%, com a venda de 2,5 milhões de quilos a mais que 2012[12]. Em 2014, os sucos de uva apresentaram incremento de produção de 10,85%, cabendo o maior aumento ao suco de uva integral (28,68%), enquanto o suco de uva concentrado teve aumento de 7%[13].

Entretanto, as denominações nos rótulos para os diferentes tipos de sucos comercializados no mercado interno, frequentemente induzem o consumidor á inferências errôneas, quanto á sua qualidade. Neste sentido, o Decreto 6.871[14] e a Instrução Normativa nº 12[15] definem o suco como a bebida não fermentada, obtida por processamento tecnológico a partir da fruta sã e madura. O suco integral deve ser composto de 100% da fruta; já, o suco concentrado é o produto parcialmente desidratado; enquanto, o suco denominado de adoçado, pode conter um máximo de 10% de adição de açúcar. O néctar, por sua vez, é a bebida pronta para consumo, preparada pela adição de água e açúcar[14], elaborada com no mínimo 50% de suco ou polpa da fruta, segundo a IN nº 24/2012 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento[16]. Portanto, faz-se necessário um controle dos produtos, a fim de cumprir a legislação, que exige cerca de 65 ºBrix de sólidos solúveis totais para o suco concentrado[17] e 14 ºBrix para o néctar[18].

Caldas BS et al. Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

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como sobre os riscos que apresentem” (Redação dada pela Lei nº 12.741, de 2012) previsto no art. 3º o inciso III do art. 6º do Código de Defesa do Consumidor[29].

Uma técnica mais seletiva que representa um diferencial na quantificação de sacarose (açúcar não-redutor), glicose e frutose (açúcares redutores), baseia-se na cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), a qual foi empregada em análises de maça[6] e batata[30]. Para sucos de frutas, inclusive de uva, dois sistemas foram propostos por Zhang et al. (2015)[28]. Um primeiro utiliza coluna aniônica em meio básico com eletrodo de ouro e detecção pulso amperométrico (HPLC-HPAE-PAD) efetuando-se apenas: diluição, filtração da amostra e injeção direta. E, um segundo que emprega coluna de interações hidrofílicas com detecção por aerossol carregado (HPLC-HILIC-CAD), detector universal para analitos não voláteis e semi-voláteis, que não exige derivatização.

Assim, devido à importância do comércio de sucos no cenário econômico brasileiro e mundial, este trabalho propõe a comparação entre técnicas que permitem determinar açúcares em matrizes alimentares - refratometria, espectrofotometria e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE do inglês HPLC), aplicada á sucos comerciais concentrados e néctares de uva, visando encontrar técnica confiável e versátil para uso rotineiro no controle de qualidade e, que possibilite ainda fazer a distinção de produtos com açúcares naturais elaborados só com a fruta, dos adicionados.

2. Parte Experimental

2.1. MateriaisDoze amostras comerciais foram analisadas em

duplicata. Destas, oito amostras eram de duas marcas distintas (4 do mesmo lote) de néctares comercias de uva, adquiridas em supermercado da cidade de Londrina (PR), e 4 amostras de suco de uva concentrado, foram cedidas por uma Cooperativa da região (PR). As amostras foram mantidas congeladas em freezer a - 12oC, visando manter as características do produto.

2.2. ReagentesForam utilizados padrões de sacarose (Synth,

Diadema, Brasil), D(+) glicose e D(-) frutose (Merck, Darmstadt, Alemanha) com teores de pureza de 98,90 %, 99,50 % e 99,90 %, respectivamente. Devido à alta higroscopicidade dos carboidratos, os padrões foram mantidos em dessecador de vidro, com vácuo e pentóxido de fósforo (Merck, Darmstadt, Alemanha) tendo sido utilizados, somente depois de uma semana de dessecamento.

Os reagentes p.a. utilizados adquiridos da Prolab (São Paulo, Brasil) foram: ácido sulfúrico (Quimex, 97 %), fenol (Synth, 99 %), molibdato de amônio (Nuclear, 83 %), arseniato de sódio (Vetec, 98 %), carbonato de sódio (Synth, 99,5 %), tartarato de sódio e potássio (Merck, 99 %), sulfato de sódio (Vetec, 99 %), bicarbonato de sódio (Synth, 99,7 %) e sulfato de cobre pentaidratado (Nuclear, 98 %). A acetonitrila grau HPLC foi adquirida da J.T. Baker (Xalostoc, México).

A água ultrapura utilizada no preparo das soluções padrão e na extração foi produzida pelo Sistema Milli-Q® (Simplicity 185, Millipore, MA, EUA).

2.3. Determinação de açúcares

2.3.1. RefratometriaForam realizadas leituras, em ºBrix, em

refratômetro digital (ATAGO, Fukaya-shi, Japão, 0° a 93° Brix), colocando as amostras diretamente na célula do equipamento, após calibração com água. Os valores dados representam o teor de sólidos solúveis totais na amostra mensurados de acordo com a OIV (2012)[23].

2.3.2. EspectrofotometriaAs análises espectrofotométricas foram realizadas

em Espectrofotômetro (UVMini 1240 – Shimadzu, Quioto, Japão). A metodologia utilizada foi adaptada de Fournier (2001). O padrão estoque utilizado para construção da curva analítica, do método fenol-sulfúrico, foi feito com glicose nas concentrações de 20,0 a 100,0 µg L-1. A leitura foi feita em 490 nm.

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva Caldas BS et al.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):53-63 57

2.3.3. CromatografiaPara a análise cromatográfica, os sucos

concentrados e os néctares de uva foram diluídos em 50000 e 5000 vezes respectivamente, em água ultrapura. As soluções foram filtradas em membrana de acetato de celulose 0,2 µm (φ13 mm, Sartorius Stedim Biotech, Alemanha) e injetadas no sistema cromatográfico em condições otimizadas.

Foi utilizado um sistema para cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC Série 10, Shimadzu, Quioto, Japão). As condições cromatográficas foram adaptadas de Druzian (2005). O sistema cromatográfico consistiu de uma bomba (LC-10 AT VP) com gerenciador de solventes quaternário (FCV-10AL VP), comandado pela interface (SCL-10A VP) e módulo de desgaseificação (DGU-14A). A fase móvel usada foi uma mistura de acetonitrila: água 75:25 (v/v), na vazão de 1,0 mL min-1 empregando uma coluna Shim-pack CLC-NH

2 (M) (4,6 x 250 mm, 5 µm,

Shimadzu), mantida a 30 oC (CTO-10AS VP). O injetor manual Rheodyne 7125 continha alça de amostragem de 20,0 µL. A detecção foi feita em detector por índice de refração (RID-10A, Shimadzu) e a aquisição e integração dos picos utilizando software Class-VP.

A identificação foi realizada baseando-se nos tempos de retenção e adição de padrões á amostra. A quantificação foi feita por padronização externa utilizando-se curvas de calibração analíticas construídas a partir das áreas dos picos cromatográficos, empregando-se 6 concentrações da mistura dos padrões. As curvas de calibração mostraram-se lineares (coeficiente de determinação R2 ≥ 0,99, para p < 0,001), em intervalos de concentração (faixas dinâmicas de trabalho) de 0,25 a 2,50 % (m/v) para frutose, glicose e sacarose. A concentração dos açúcares totais foi dada somando-se as áreas individuais de cada pico da corrida cromatográfica.

2.4. Análise estatísticaOs resultados foram comparados dentro de cada

categoria (sucos concentrados e néctares) e calculados os erros relativos. Para os néctares, também foi possível comparar os teores de açúcares totais encontrados com as

informações nutricionais impressas nas embalagens dos produtos. Os resultados dos teores de açúcares totais obtidos pelas 3 técnicas/métodos (RF, ESP-FS e HPLC-RID) foram submetidos à análise de variância (ANOVA), considerando-se a amostra como causa de variação, e teste de Tukey em nível de 5% de significância (p ≤ 0,05), utilizando o Statistica 8.0 (Statsoft, EUA). Os tipos distintos de sucos de uva – concentrado e néctar, foram separados em grupos pela Análise de Agrupamento Hierárquico, enquanto os resultados similares e diferentes obtido pelos 3 métodos foram agrupados através da Análise de Componentes Principais, também feitas com o uso do Statistica.

3. Resultados e Discussão

3.1. RefratometriaAs concentrações de açúcares totais por leitura

em refratômetro estão apresentadas na Tabela 1. Estes valores foram corrigidos conforme a temperatura por Tabelas de conversão da OIV (2012)[23]. Os resultados obtidos para o total de sólidos solúveis dos sucos concentrados e néctares de uva concordaram com os obtidos na Literatura. Segundo, Santana et al. (2011)[17]

para o suco integral o valor foi de 13,50 ºBrix. De acordo com Rizzon e Miele (2012)[31], o néctar de uva apresentou 14,25±1,26 ºBrix e 12,54±0,67 g 100 mL-1 de açúcares totais; e o suco integral 16,50±1,10 ºBrix e 15,48±1,20 g 100 mL-1 de açúcares totais. Já, Toaldo et al. (2015)[22] encontraram para o suco orgânico um valor de 15,03±0,06 ºBrix e de 15,24±0,27 g 100 g-1 para açúcares totais; e para o suco de uva convencional 16,73±0,06 ºBrix e 16,70±0,16 g 100 g-1 para os açúcares totais. Os teores obtidos pelas determinações deste trabalho apresentaram valores próximos á esses e superiores ao mínimo exigido pela legislação de 14 ºBrix para néctares, considerando os desvios padrão para as 3 técnicas RF, ESP-FS e HPLC-RID. Os teores dos açúcares totais concordaram com os valores atestados nas embalagens de néctar de uva de 29 g de carboidratos por copo de 200 mL, equivalente aos calculados neste trabalho em gramas por 100 mL. O valor para o total de sólidos solúveis pela RF para o suco concentrado foi em média de 60,08 ºBrix, um pouco menor considerando-se as variações do desvio-padrão

Caldas BS et al. Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

58 Scientia Chromatographica 2015; 7(1):53-63

para cada método, do que o conteúdo mencionado de

cerca de 65 ºBrix[17].

3.2. Espectrofotometria

Na espectrofotometria, a concordância nos

resultados das absorbâncias é resultante da qualidade

na homogeneização das soluções, antes da leitura em

espectrofotômetro, com o auxílio de um vórtex.

O método mostrou-se linear com coeficiente de

correlação superior a 0,99 para a curva de calibração,

obtida em função da concentração de glicose. A faixa

dinâmica de trabalho foi de 8,0 a 40,0 µg mL-1.

Os teores dos açúcares solúveis determinados

por espectrofotometria UV-Vis utilizando a curva

de calibração para o método fenol-sulfúrico estão na

Tabela 2.

Os resultados por este método foram os que sofreram maiores variações com coeficientes de variação de 8,4 e 17,2 % para os néctares das marcas comerciais A e B. Entretanto, foi à única técnica que se diferenciou em relação à RF e HPLC-RID apresentando valores significativamente maiores em nível de 5 %, com um CV de 14,8% para o suco de uva concentrado. Portanto, a técnica não foi considerada indicada para o controle de qualidade para determinação dos açúcares totais para este tipo de amostra.

3.3. CromatografiaA Figura 1 mostra um cromatograma típico de

um padrão de frutose, glicose e sacarose utilizando o HPLC-RID, nas condições analíticas estabelecidas. A quantificação dos carboidratos das amostras de néctares e suco concentrado de uva foi feita por calibração externa na faixa dinâmica de trabalho de 0,25 a 2,5 g 100 mL-1

Tabela 1. Concentração de açúcares livres totais em amostras de sucos de uva determinadas por Refratometria (oBrix).

Suco de Uva

RefratometriaoBrix

(g 100 mL-1)Babo*

Média± DP

CV(%)

Média± DP

NéctarA

15,29

15,12A

±0,130,8

13,15

13,00±0,11

15,09 12,98

14,99 12,89

15,09 12,98

NéctarB

15,22

15,48A

±0,473,0

13,09

13,31±0,41

15,82 13,42

15,92 13,69

14,94 12,85

Concentrado

60,03

60,08B

±0,300,5

51,63

51,67±0,25

60,40 51,94

60,20 51,77

59,70 51,34

*1 oBrix = 0,86 Babo. DP: Desvio padrão. CV: Coeficiente de variação. Letras maiúsculas diferentes na mesma linha, na comparação feita entre a média dos açúcares totais utilizando refratometria (Tabela 1), espectrofotometria UV-Vis (Tabela 2) e HPLC-RID (Tabela 3), representam diferença significativa (p<0,05) entre métodos pelo teste de Tukey.

Tabela 2. Concentração de açúcares livres totais em amostras de sucos de uva determinadas por Espectrofotometria UV-Vis (fenol-sulfúrico).

Suco de Uva

EspectrofotometriaUV-Vis

Fenol Sulfúrico[Açúcares Totais]

(g 100 mL-1)

Média± DP

CV(%)

NéctarA

13,56

13,78 A

±2,3717,2

15,45

13,81

12,30

NéctarB

14,19

15,07 A

±1,268,4

14,40

14,86

16,82

Concentrado

75,74

80,47 A

±11,9114,8

86,24

89,04

70,84

DP: Desvio padrão. CV: Coeficiente de variação. Letras maiúsculas diferentes na mesma linha, na comparação feita entre a média dos açúcares totais utilizando refratometria (Tabela 1), espectrofotometria UV-Vis (Tabela 2) e HPLC-RID (Tabela 3), representam diferença significativa (p<0,05) entre métodos pelo teste de Tukey.

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva Caldas BS et al.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):53-63 59

e os resultados para as concentrações dos açúcares individuais e totais estão apresentados na Tabela 3.

Observa-se que o suco concentrado apresenta somente os açúcares naturais da própria uva, frutose e glicose, praticamente em concentrações iguais, concordando com a Figura 1c. Observa-se que o suco concentrado de uva está de acordo com a legislação, tendo sido elaborado com 100 % da fruta pura, sem adições de outros açúcares, mostrando aumento na concentração da frutose e glicose pela desidratação em cerca de 6 vezes comparando-se aos néctares.

Não foram encontrados muitos trabalhos analisando açúcares por HPLC do suco de uva, para efeito comparativo entre os teores. Em trabalho recente,

Zhang et al. (2015)[28] embora utilizando HPLC-HPAE-PAD e HPLC-HILIC-CAD não forneceram valores quantitativos, observa-se a presença de glicose e frutose e, ausência de sacarose para o suco de uva analisado, concordando com o perfil de cromatogramas obtidos neste trabalho por HPLC-RID.

3.4. Análise estatísticaA análise estatística de tendências e dispersões,

bem como a comparação das médias dos valores obtidos para açúcares totais em cada amostra por RF, ESP-FS e HPLC-RID estão apresentadas nas Tabelas 1, 2 e 3.

Segundo ANOVA considerando 5% de significância, a quantidade média dos açúcares totais foi semelhante para as amostras de néctares de uva empregando os 3 métodos, independente da marca comercial. Já, para o suco de uva concentrado os teores de açúcares foram semelhantes por RF e HPLC-RID, sendo significativamente diferente para a ESP-FS (Tabelas 1, 2 e 3). Estes resultados concordam com a separação em 3 grupos – néctares (a e b) pertencendo ao grupo I; concentrado por RF (ºBrix(co)) e HPLC-RID (HPLC(co)) pertencendo ao grupo II; e ESP-FS (UV-Vis) pertencendo ao grupo III, na maior distância Euclidiana (seta) dada pela Análise de Agrupamento Hierárquica (Figura 2) igualmente observada pela Análise de Componentes Principais na Figura 3, onde CP1 e CP2 explicam juntas 100 % da variância dos dados.

A técnica ESP-FS que apresentou maiores valores de dispersão dos dados também para o néctar (Tabela 2). Por outro lado, a técnica com menores valores de dispersão foi a RF (Tabela 1), que não exige equipamento sofisticado e nem preparo da amostra, como diluição e filtração, os quais adicionam erros aleatórios e sistemáticos na quantificação do analito. Esta se baseia em uma medida física relativamente simples e, portanto, é indicada para o controle do processo. Apesar da concordância entre os dados em termos de açúcares totais, a cromatografia líquida pode tornar-se interessante quando o propósito for o de avaliar a adição de proporções da fruta e de açúcar,

Figura 1. Cromatograma típico de padrão de frutose, glicose e sacarose a 2,5 g 100 mL-1 (a); néctar de uva (b) e suco concentrado de uva (c) por HPLC-RID. Pico: (1) Frutose; (2) Glicose; (3) Sacarose.

(a)

(b)

(c)

Caldas BS et al. Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

60 Scientia Chromatographica 2015; 7(1):53-63

Tabela 3. Concentração de açúcares livres individuais e totais em amostras de sucos de uva determinados por Cromatografia Líquida (HPLC-RID).

Suco de Uva

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Índice de RefraçãoHPLC-RID

[Açúcares Livres](g 100 mL-1)

[Fru] Média± DP

CV(%) [Gli] Média

± DPCV(%) [Sac] Média

± DPCV(%) [Tot] Média

± DPCV(%)

Néctar A

5,94

5,45±0,45

8,3

5,65

5,10±0,41

8,0

3,77

3,62±0,17

4,8

15,36

14,16A

±0,906,3

5,28 4,91 3,43 13,61

5,67 5,15 3,52 14,33

4,91 4,70 3,75 13,36

NéctarB

5,34

5,20±0,18

3,4

4,32

4,59±0,43

9,3

5,86

5,69±0,25

4,5

15,52

15,48A

±0523,4

5,36 5,19 5,67 16,21

4,99 4,25 5,89 15,13

5,12 4,61 5,34 15,07

Concentrado

35,44

32,58±1,92

5,9

31,34

30,38±1,89

6,2

N.D.

N.D. –

66,78

63,40B

±2,884,5

31,41 29,34 N.D. 60,75

31,94 29,35 N.D. 61,29

31,51 33,28 N.D. 64,79

DP: Desvio padrão. CV: Coeficiente de variação. N.D.: Não detectado. [Fru]: Concentração de frutose. [Gli]: Concentração de glicose. [Sac]: Concentração de sacarose. [Tot]: Concentração de açúcares totais obtida pela soma das concentrações de frutose, glicose e sacarose. Letras maiúsculas diferentes na mesma linha, na comparação feita entre a média dos açúcares totais utilizando refratometria (Tabela 1), espectrofotometria UV-Vis (Tabela 2) e HPLC-RID (Tabela 3), representam diferença significativa (p<0,05) entre métodos pelo teste de Tukey.

Figura 2. Análise de Agrupamento Hierárquico para as amostras de suco concentrado (co) de uva e néctares das marcas A (a) e B (b) determinados por RF (oBrix); ESP-FS (UV-Vis) e HPLC-RID.

Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva Caldas BS et al.

Scientia Chromatographica 2015; 7(1):53-63 61

de acordo com o exigido pela legislação. Neste quesito, o

HPLC-RID possibilita reconhecer facilmente quando se

utilizou somente a própria fruta na elaboração do suco,

atestado pela presença somente de frutose e a glicose

(Figura 1c), diferentemente dos néctares, que apresentam

um pico adicional de açúcar advindo da adição de sacarose

(pico 3, Figura 1b).

Espera-se, que este estudo possa introduzir os

açúcares como marcadores naturais da própria uva,

auxiliando com ferramentas analíticas para verificação

da autenticidade, conjuntamente com outros compostos

fenólicos já empregados por alguns trabalhos, como as

antocianinas[5,9] e ácidos hidroxicinâmicos. Desta forma,

pretende-se contribuir para que de fato se assegure ao

consumidor o seu direito em saber o que está consumindo,

por meio de métodos capazes de fornecer informações

constantes no rótulo, que apresentam implicações maiores

ainda á intolerantes ao açúcar como os diabéticos.

4. Conclusão

A refratometria se mostrou a técnica mais

adequada em rotina de processo para a determinação

de açúcares totais em suco concentrados e néctares de

uva, dada a sua precisão com menores erros relativos

calculados, praticidade sem preparo de amostra e

simplicidade do equipamento e da técnica. Entretanto, a

RF mede o total de sólidos solúveis sem discriminação

e seletividade em termos de açúcares e tipo de produto.

Por outro lado, a cromatografia além de resultados

concordantes em termos de açúcares totais, é a melhor

técnica para quantificá-los separadamente, propiciando

através do teor de frutose e glicose verificar se o

suco foi feito a partir de 100% da fruta uva, ou se

foi adicionado sacarose, assegurando o acesso do

consumidor à informação adequada de composição, e

auxiliando no cumprimento a legislação e na coibição

de adulterações.

Figura 3. Análise de Componentes Principais para as amostras de suco concentrado (co) de uva e néctares de uva das marcas A (a) e B (b) determinados por RF (oBrix); ESP-FS (UV-Vis) e HPLC-RID.

Caldas BS et al. Determinação de açúcares em suco concentrado e néctar de uva

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AgradecimentosOs autores agradecem a CAPES, CNPq, Fundação

Araucária e a UEL pelas bolsas de Iniciação Científica e Mestrado. Ao FINEP e ao Laboratório de Apoio a

Pesquisa Agropecuária (LAPA) da Central Multiusuária da UEL pelo uso do HPLC-RID. A Cooperativa por ceder os sucos concentrados.

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