Determinacin de la capacidad antioxidante y compuestos bioactivos de frutas nativas peruanasDetermination of antioxidant capacity and bioactive compounds in native peruvian fruitsRitva Repo de Carrasco1, Christian Ren Encina Zelada11 Facultad de Industrias Alimentarias, Universidad Nacional Agraria La Molina. Av. LA Molina s/n, Lima 12, Per. Telf.: 9962-14357,ritva@hotmail.com

RESUMENEn el tomate de rbol se destac el contenido relativamente alto de fibra cruda 4,5 g/100 g de fruta. El tomate de rbol ( y el aguaymanto ( ) tuvieron mayor contenido de protenas (1,9 g/100 g para ambos frutos) que las otras frutas estudiadas. En cuanto a compuestos fenlicos, la papaya de monte es la fruta que present mayor contenido de estos compuestos (167 mg de equivalente cido glico/g de fruto). El contenido de betalanas en tuna roja ( ) fue de 68,95 mg/1000 mL. El aguaymanto tuvo el mayor contenido de cido ascrbico (43,3 mg/100g), seguido por la papaya de monte (31,41 mg/100g) y el tomate de rbol seguida por la tuna roja 16,09 mg/100g y 22,75 mg/100g, respectivamente. El contenido de carotenoides fue mayor en el tomate de rbol (4 mg -caroteno/100 g) seguido por el aguaymanto con 2,64 mg - caroteno/100 g. La tuna roja present una capacidad de inhibicin del radical DPPH mucho mayor que las otras tunas estudiadas (77,65 %). Comparando las diferentes frutas en cuanto a capacidad antioxidante medido por el mtodo del DPPH, fue el de la papaya de monte (1936 228 g equivalente trolox/g de fruto); seguido por el tomate de rbol (853 52 g equivalente trolox/g de tejido); y la mayor capacidad antioxidante medida por el mtodo del ABTS fue el de la papaya de monte (2141 71 g equivalente trolox/g de fruto); seguido por el aguaymanto (1066 28 g equivalente trolox/g de fruto). Finalmente, se concluy que el estado de madurez influye en forma directamente proporcional al contenido de compuestos bioactivos en el aguaymanto, los que a su vez generan una mayor capacidad antioxidante en el fruto mientras ms maduro est.Palabras clave:Frutas nativas peruanas, Physalis peruviana, Cyphomandra betacea, Carica pubescens, Opuntia ficus indica, capacidad antioxidante, compuestos bioactivos.

ABSTRACTIn the case of the tree tomato ( ) the relatively high crude fibre content stood out (4,5 g/100 g of fruit). The tree tomato and golden berry had higher protein content (1,9 g/100 g for both fruits) than the other fruits. Regarding to the mineral analysis, the prickle pears are very good sources of phosphorus as well as calcium. On the other hand, the tree tomato is an excellent potassium source followed by golden berry and papaya( ). In addition golden berry is a relatively good source of iron and zinc. The mountain papaya is a very important source of phosphorus surpassing to the other fruits. All the samples presented significant difference asfar as the content of total phenolic compounds, but mountain papaya is the fruit that presented the highest content of these compounds (167 mg of gallic acid equivalent/g of fruit). The content of betalains in red prickle pear was of 68,95 mg/1000 mL. Golden berry had the highest vitamin C content (43,3 mg/100g) followed by mountain papaya (31,41 mg/100g). The lowest content of this vitamin was in the tree tomato followed by red prickle pear, 16,09 mg/100g and 22,75 mg/100g, respectively. The content of carotenoids was the highest in the tree tomato, (4 mg -carotene/100 g) followed by golden berry with 2,64 mg -carotene/100 g. Red prickle pear presented much greater capacity of inhibition of radical DPPH than the other varieties (77,65%). Comparing the different fruits regarding to the measurement of the antioxidant capacity, the mountain papaya (2141 71 g equivalent trolox/g of fruit) had the highest value followed by golden berry (1066 28 g equivalent trolox/g of fruit), tree tomato and red prickle pear. Finally, it was found that the grade of maturity had a direct effect to the antioxidant capacity.Key words:Peruvian native fruits, Physalis peruviana, Cyphomandra betacea, Carica pubescens, Opuntia ficus indica, antioxidant capacity, bioactive compounds.

INTRODUCCINEn el rea andina se cultivan muchas frutas poco conocidas en otras regiones, como son el tomate de rbol o sacha tomate, aguaymanto, tuna y papaya de monte. Estas frutas se consumen principalmente en forma natural sin mayor grado de procesamiento; no existe tampoco mucha informacin sobre su composicin qumica. La revalorizacin de frutas nativas, poco conocidas o desconocidas fuera de sus regiones de origen, sera de gran beneficio para el poblador rural del interior del Per que se encuentra entre los grupos poblacionales ms pobres de Latinoamrica. Entre estas frutas nativas existen fuentes importantes de vitaminas, azcares, materias gelificantes (pectinas), materias antioxidantes, cidos, aromas y sabores que esperan su identificacin y posterior explotacin por la industria para elaborar productos novedosos y competitivos en el mercado.El aguaymanto es originaria del Per y existen diversas referencias histricas que indican que fue domesticado, cultivado y muy apreciado por los antiguos peruanos. La Physalis peruviana posee diferentes nombres comunes, dependiendo de la regin: capul, aguaymanto, awaymanto, bolsa de amor, cereza del Per, uchuva, etc. El fruto es una baya carnosa, jugosa, en forma de globo con un dimetro entre 1,25 - 2,5 cm y contiene numerosas semillas1.La tuna, originaria de Amrica, fue llevada por los espaoles a Europa y desde all distribuida hacia otros pases del mundo. Esta gran dispersin geogrfica dio origen a muchos ecotipos con caractersticas locales propias. Su produccin, cultivo y/o crianza es altamente rentable, as como la de su husped, la cochinilla. Se ha realizado la caracterizacin qumica de la tuna italiana y un estudio de almacenamiento de jugo de tuna; trabajaron con tres variedades: roja, amarilla y blanca y encontraron que las tunas tienen una acidez baja y un relativamente alto contenido de azcar y vitamina C2.El tomate de rbol es originario de la vertiente oriental de los Andes, especficamente Per, Ecuador y Colombia. Pertenece al grupo de las frutas semicidas, siendo conocida con diversos nombres en distintas regiones. Es una baya aromtica de forma ovoide, punteada en su extremo inferior y con un cliz cnico, que mide alrededor de 8 cm de largo y 5 cm de dimetro. Los colores de la pulpa varan entre naranja, rojo y amarillo; dicha pulpa es ligeramente firme, suave y jugosa, con un sabor agridulce. La pulpa cercana a la cscara es firme, mientras que la pulpa interna es suave y jugosa con un sabor agridulce1.Carica pubescens, llamada tambin papaya de la sierra, papayita arequipea o papaya de monte. Requiere de climas templado - clido. El fruto es una baya, de pericarpio delgado, jugoso, de color amarillo (pulpa y piel), pasando por color verde durante la madurez. El centro es hueco y se encuentra totalmente ocupado por las semillas envueltas en un tejido mucilaginoso; presenta una forma oblongo - ovoide de 5 a 10 centmetros de largo por 3 a 6 centmetros de ancho y tiende a ser ovalada, con los extremos aguzados1.La presente investigacin tiene los siguientes objetivos:- Determinar el contenido de fibra cruda de las siguientes frutas nativas: tuna, aguaymanto, tomate de rbol y papaya de monte.- Determinar el contenido de compuestos bioactivos y capacidad antioxidante en las frutas nativas antes mencionadas.- Determinar cmo el estado de madurez del aguaymanto influye en el contenido de sus compuestos bioactivos y capacidad antioxidante, y determinar el estado de madurez que conlleva un mayor contenido de compuestos bioactivos.PARTE EXPERIMENTALLugar de ejecucinEl presente trabajo de investigacin se realiz en los laboratorios de Fsico-Qumica, Instrumentacin y Biotecnologa, Microbiologa y Planta Piloto de Alimentos, de la Facultad de Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional Agraria La Molina.Materiales y reactivosMuestras:aguaymanto procedente del valle del Mantaro (Huancayo); papaya de monte procedente de Arequipa; tuna de tres colores: roja, verde y anaranjada, procedentes de Ayacucho; tomate de rbol, procedente de Junn.Reactivos:ABTS (2,2'-azino-bis(3-thylbenzthiozoline-6-sulphonic acid) adquirido de Sigma Chemical Co., DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazil) de Aldrich Chemical Co., persulfato de potasio de grado analtico de Harleco 7574, etanol absoluto y hexano de J.T. Baker, metanol de Mallinckrodt, acetona, folin-ciocalteu, carbonato de sodio anhidro al 1 N, 2,6 diclorofenol indofenol de Ferak 33095, cido l(+)-ascrbico para anlisis de Riedel-di Han 33034, cido metafsforico, cido actico glacial 100% de Merck, cido ctrico anhidro extra puro de Schardau y alcohol de 96GLMtodos de anlisis- Anlisis proximal: humedad, protenas, lpidos, fibra cruda, cenizas4.- Contenido de minerales (Fe, Ca, Zn y P)3.- pH3.- Acidez titulable3.- Contenido de slidos solubles3.- Capacidad antioxidante4,5.- Compuestos fenlicos totales6.- Carotenos7, expresado como mg -caroteno/100 g de muestra- Betalanas8, los resultados se expresaron como mg de betalanas/1000 ml- cido ascrbico, determinado por el mtodo de titulacin con 2,6 diclorofenol indofenol (James9) expresado como mg cido ascrbico/100 g muestra.Metodologa experimentalPreparacin de las muestras: Se trabaj con frutas sanas y firmes que fueron lavadas con agua destilada; el aguaymanto entero fue licuado durante 30 segundos; la papaya de monte se cort en mitades para eliminar el muclago interno y se procedi a licuar durante 1 minuto; las tunas fueron peladas y licuadas durante 30 segundos; el tomate de rbol fue separado en cscara, pulpa y pepas; cada uno de stos fue licuado durante 1 minuto; todas las frutas fueron inmediatamente usadas para la preparacin de extractos.Preparacin de los extractos:A. Fenoles totales y capacidad antioxidante con los mtodos DPPH y ABTS:Para todas las muestras se pes 2,5 gramos de muestra y se aadi 12,5 mL de metanol; se homogeniz la muestra con un agitador magntico durante 15 minutos y se almacen el extracto durante 24 horas a 4C en oscuridad; luego, se procedi a centrifugar el homogenizado durante 20 minutos a 5000 rpm; el sobrenadante se guard para anlisis posteriores y el precipitado fue eliminado.Para los ensayos con DPPH, se tom alcuotas del extracto obtenido: para aguaymanto, tomate de rbol y tuna se tom 150 mL y para papaya de monte 50 mL.Para los ensayos de ABTS, se tom 50 mL del extracto de aguaymanto y papaya de monte y 150 mL del extracto de tuna y tomate de rbol .B. Vitamina C:Los extractos para la determinacin de vitamina C en frutas se prepar segn Luximon-Ramma10.C. Betalanas:Para obtener el extracto de tuna roja para el anlisis de betalanas, se sigui el mtodo indicado por Osborne11; primero se realiz una inactivacin enzimtica a 100C por 5 minutos; luego se pel y se cort en rodajas y se someti a una extraccin con agua acidulada (cido ctrico al 0,2%) relacin 1:2; se procedi a la precipitacin de la goma con alcohol a 96GL (1:2), y se filtr; la solucin filtrada se guard para posteriores anlisis.D. Determinacin del estado de madurez en el contenido de compuestos bioactivos:Para tal fin, se trabaj con el aguaymanto y segn la norma tcnica Colombiana 458012, en la cual se indica una clasificacin objetiva relacionando el contenido de grados brix y la acidez en la materia prima, tal como se indica en el Anexo 1, indicndose los estados de madurez cero, uno, dos-tres, cuatro, cinco y seis y poder conocer cmo el estado de madurez influye en el contenido de los compuestos bioactivos; se trabaj con el estado de madurez dos-tres junto, dado que fue el estado de madurez utilizado para la determinacin de un estado de madurez intermedio, necesario para la elaboracin de frutas en almbar (objetivo de otra investigacin), dado que para la elaboracin de ese producto no se puede trabajar con un fruto inmaduro (estado de madurez cero y uno) ya que no tiene desarrollada las caractersticas sensoriales para ser agradable al consumidor, como tampoco se puede trabajar con un fruto sobremaduro (estado de madurez cuatro, cinco y seis) dado que estos frutos no resisten el tratamiento trmico necesario para la pasteurizacin de la conserva.Anlisis estadsticoLos resultados fueron procesados por un Anlisis de Variancia (ANOVA) y la significancia estadstica por la Prueba de Tukey. Las diferencias en p < 0,05 fueron consideradas significativas. El programa empleado fue SAS System V8.RESULTADOS Y DISCUSINAnlisis proximal y qumicoEn latabla 1, se puede apreciar la caracterizacin de las frutas en cuanto a su pH y grados brix. En el cuadro se aprecia el porcentaje de slidos solubles promedio para cada uno de los frutos evaluados. Se menciona que la cantidad de slidos solubles que contiene el jugo de una fruta ctrica es tambin un ndice del grado de madurez de la misma18. La norma tcnica de Colombia12 del aguaymanto establece como un grado brix mnimo para el estado de madurez intermedia (dos y tres, Anexo 1) de entre 13,2 y 14,1; mostrando as que nuestro fruto tiene un menor contenido de slidos solubles, lo que posiblemente se deba a las diferencias entre el aguaymanto producido en Colombia y con el proveniente del valle del Mantaro.En lastablas 2,3y4se presentan los resultados de anlisis proximal, del contenido de minerales, as como el contenido de compuestos bioactivos y capacidad antioxidante, respectivamente. Todas las frutas tienen alto contenido de agua, entre 78,4 y 93,7% destacando la papaya de monte con el mayor contenido de agua y la tuna roja con el menor contenido. En cuanto al contenido de protena en frutas, el tomate de rbol y aguaymanto, tenan mayor proporcin (1,9 g/100 g).

Entre las tres variedades de tuna, la tuna verde tiene el mayor contenido de protenas (1,5 g/100 g), mientras que la tuna roja y anaranjada presentaron 0,9 g/100 g. Al respecto, se sealan que los frutos, en especial los que poseen caractersticas ctricas, tienen un bajo contenido de protena y de grasa, dentro de los cuales se puede considerar al aguaymanto13. El tomate de rbol tiene un alto contenido de fibra cruda (4,5 g/100 g). Todas estas frutas, como las frutas en general, son fuentes insignificantes de grasas, pero son fuentes importantes de carbohidratos. Los principales carbohidratos de las frutas son los azcares. Se seala que los carbohidratos en los frutos, especialmente los que poseen caractersticas ctricas, estn conformados por monosacridos (glucosa y fructosa), oligosacridos (sacarosa) y polisacridos (celulosa, almidn, hemicelulosas y pectinas)3.El tomate de rbol y las tunas tienen alto contenido de fibra y podran ser utilizados en alimentos nutraceticos ricos en fibra. Este es un aspecto muy interesante, porque la fibra alimentaria tiene propiedades positivas para la salud: reduccin del nivel de colesterol en sangre, proteccin contra diferentes enfermedades, como los cardiovasculares y diferentes tipos de cncer, etc.En cuanto al contenido de minerales en las frutas, se puede observar que las tunas son fuentes importantes de fsforo, destacando en este aspecto la tuna verde (332 mg/100 g). Estas frutas son tambin fuentes, relativamente buenas, de calcio. Asimismo, cabe destacar el alto contenido de potasio que presentan el tomate de rbol y el aguaymanto. Las frutas nativas son fuentes importantes de nutrientes, como vitaminas (vitamina C, betacarotenos) y minerales (fsforo, potasio). El aguaymanto present un alto contenido de carotenoides (2,64 mg - caroteno/100 gramos muestra). Las tunas rojas y anaranjadas son ricas en pigmentos, que fueron identificados como betalanas. Los investigadores franceses encontraron que la cscara de tuna era rica en calcio y potasio 2,09 % y 3,4 % b.s.14.Todas las muestras presentaron diferencia significativa en el contenido de compuestos fenlicos, pero la papaya de monte es la fruta que present el mayor contenido, como se puede apreciar en latabla 4, donde tambin se muestra la relacin que tiene el contenido de compuestos fenlicos y la capacidad antioxidante, segn la materia prima evaluada. Las frutas, aparte de ser fuentes importantes de ciertas vitaminas, contienen otros componentes, principalmente pigmentados, como son los compuestos fenlicos, los que poseen capacidad antioxidante; son capaces de inhibir los radicales libres.El contenido de compuestos fenlicos es mayor que el contenido en frutas ctricas y meln, pero menor que en uvas y grosellas encontradas por Vinson15. Segn estudios se hall que los tallos de tuna contenan 3,7 mg de compuestos fenlicos totales/g como cido glico16. En el caso de la papaya de monte se encontr una mayor cantidad de compuestos fenlicos (167 mg/100g) que en la papaya tropical (57,6 mg/100g)11. El contenido de betalanas en tuna roja fue de 68,95 mg/1000 ml. Se encontr que la tuna venezolana (Opuntia boldinghii) tena 0,59 mg/100ml de betalanas18. El contenido de vitamina C en la tuna peruana fue tambin mayor que en la tuna venezolana. La papaya de monte tena menor cantidad de vitamina C que la papaya tropical (31,41 mg/100g y 92,9 mg/100g), respectivamente10.En latabla 4se presenta la comparacin de los contenidos de carotenoides en tomate de rbol, aguaymanto y papaya de monte. El tomate de rbol es la fruta que presenta mayor contenido de carotenos. Otros estudios presentan diferentes contenidos de carotenoides en diversas frutas y hortalizas hallados por varios autores en todo el mundo; as tenemos al camote (de 0,02 a 21,8 mg de -caroteno/100 g), mango (de 0,6 a 2,9 mg de -caroteno/100 g), meln (de 1,6 a 12,6 mg de -caroteno/100 g), mangos brasileos (157 g/g de -caroteno), papaya (de 0,4 a 10 g/g) y naranja brasilea y papaya roja fueron de 1,2 a 6,1 g/g y 2,1 a 10 g/g, respectivamente18.

Datos expresados como promedio desviacin estndar (n = 3)ag equivalente trolox / g de tejidobmg de equivalente cido glico / 100 g muestracmg cido ascrbico / 100 g muestradmg -caroteno / 100 gramos muestraemg de betalanas / 1000 ml- valor no determinadoLa misma letra en la misma columna indica que no hay diferencia signicativa (p2)--L ramnopiranosil y de cido (1>4)- D-galactopiranosilurnico, con cadenas laterales de fucosa y galactosa. El componente principal del polmero neutro es la xilosa (62,8%) y el del polmero cido es la ramnosa (54,5%), por lo que la relacin ramnosa/xilosa se usa frecuentemente para estimar la relacin entre polisacridos cidos/neutros. Esta relacin flucta entre 0,3 y 2,2. Los estudios realizados acerca de la composicin del muclago de linaza indican que la composicin de monosacridos del muclago vara significativamente entre diferentes cultivares de linaza. Los cultivares con mayor contenido de polisacridos neutros muestran mayor viscosidad aparente y formacin de geles ms firmes. Pero, el muclago de la linaza es un hidrocoloide complejo polidisperso y los diferentes comportamientos reolgicos observados en los cultivares est causado tanto por las diferencias en la proporcin entre polmeros neutros y cidos como por el peso molecular y la conformacin estructural de los polisacridos (Daunet al.,2003; Gohet al.,2006; Hallet al.,2006).LignanosLos lignanos de las plantas son compuestos fenlicos con un esqueleto de 2,3-dibencilbutano (Thompson, 2003a). La linaza es la fuente alimenticia ms rica en los precursores de lignanos, diglucsido de secoisolariciresinol (SDG) y materesinol, los cuales son fitoestrgenos que por accin del cido gstricoy de la glucosidasa bacteriana (de aerbicos facultativos del gneroClostridia) del tracto digestivo, se transforman en enterolactona y enterodiol, respectivamente, conocidos como lignanos de los mamferos. Estos ltimos poseen mayor capacidad antioxidante que sus precursores. Tambin se encuentran presentes en la linaza otros lignanos, como el lariciresinol, hinoquinina, arctigenina, cido divainillin tetrahidrofurano nordihidroguayartico, isolariciresinol y pinoresinol, pero el ms abundante es el SDG en cantidades entre 1410 y 2590 mg/100g de semilla seca. El contenido de lignanos en la linaza est muy influenciado por factores genticos y en menos grado por las condiciones ambientales (Meagheret al.,1999; Metzler, 2003; Thompson, 2003b; Zimmermanet al., 2006; Huet al., 2007).Los beneficios para la salud de los lignanos de la linaza residen en su capacidad antioxidante como secuestradores de radicales hidroxilos, y como compuestos estrognicos y anti-estrognicos por su similitud estructural con el 17--estradiol. La actividad antioxidante del lignano de la linaza (SDG) est relacionada con la supresin de las condiciones oxidantes de las especies reactivas de oxgeno. El diglucsido de secoisolariciresinol y su aglucona secoisolariciresinol muestran una muy alta capacidad antioxidante y efectos protectores del dao al ADN y a los liposomas especialmente en las clulas epiteliales del colon expuestas a estos compuestos, durante el metabolismo de las bacterias del colon que los transforman en lignanos de mamferos (Rajeshaet al.,2006; Huet al., 2007). De este modo, la incorporacin de linaza en alimentos y en dietas para animales tiene grandes ventajas, ya que ayuda en la inhibicin de enfermedades y en la promocin de la salud. Debido a que estas sustancias han mostrado tener efectos anti-cncer, se sugiere que el consumo de linaza reducira el riesgo de desarrollar cncer de pecho y de prstata y su accin antioxidante reducira el riesgo de las enfermedades coronarias (Metzler, 2003; Stavroet al., 2003; Thompson, 2003b; Hallet al., 2006; Hyvrinenet al.,2006a; Rajeshaet al.,2006). Sin embargo, todava no se establece completamente la cantidad y frecuencia de consumo de linaza que asegure los beneficiossealados. Esto se debe en parte, a que no hay informacin completa respecto de la bio-disponibilidad de los lignanos, incluyendo su absorcin, distribucin, metabolismo y excrecin debido a las dificultades existentes en los anlisis de lignanos en las semillas, en los fluidos y tejidos corporales (Thompson, 2003a).Dado el gran nmero de investigaciones realizadas respecto de los beneficios para la salud en conjunto con la seguridad del consumo de linaza, se puede decir que esta semilla puede ser un ingrediente alimentario efectivo en el mejoramiento del estado de salud de las personas. La recomendacin ms frecuente es de 1 a 3 cucharadas por da de grano molido, teniendo en cuenta que una cucharada (aproximadamente 8 g) entrega 3,3 g de lpidos; 1,8 g de ALA; 1,6 g de protena; y 2,2 g de fibra diettica total. Sin embargo, sera deseable que la recomendacin de cantidades diarias de consumo la hiciera un organismo autorizado (Morris y Vaisey-Genserb, 2003; Hallet al., 2006).Procesamiento de la linazaHasta hace poco tiempo, los nicos ingredientes derivados de la linaza disponibles para la industria de alimentos eran el aceite de linaza, y la semilla entera o molida, principalmente porque la estructura fsica de la semilla hace difcil la separacin de las fracciones y los componentes qumicos, por lo cual es necesario contar con operaciones que mejoren sus propiedades tecnolgicas y nutricionales (Daunet al., 2003). Para la elaboracin de nuevos productos derivados de linaza es muy importante la seleccin adecuada de la variedad, ya que se requiere contar con una alta estabilidad oxidativa (Oomah, 2003).MoliendaSe recomienda que la semilla de linaza se consuma molida ya en este estado, la digestibilidad y biodisponibilidad de sus componentes son mayores. No existen estudios clnicos acerca de la digestibilidad ni de la contribucin nutricional de la semilla entera de linaza a la dieta. En general, se acepta que las semillas enteras tienden a pasar por el tractogastrointestinal sin ser digeridas debido a que la cubierta de la semilla es resistente a la accin de las enzimas digestivas. La masticacin destruye en un cierto grado la cubierta de la semilla y expone los nutrientes del interior a la accin digestiva; sin embargo, es difcil evaluar el grado de masticacin necesario para una buena digestin. Aunque por lo anterior, se recomienda el consumo habitual de linaza molida, la semilla entera proporciona una textura crocante a productos de repostera, cereales de desayuno, barras de cereales y ensaladas (Morris y Vaisey-Genserb, 2003).La molienda de semilla de linaza conlleva dificultades, especialmente si se utilizan molinos de rodillo, debido al alto contenido de aceite del grano lo que causa adherencia del material en la superficie del rodillo. Se ha utilizado con xito, a nivel experimental, para producir harina integral, molinos cortadores centrfugos y molinos de martillos (Wiesenbornet al., 2003).DescascaradoLa cscara y los cotiledones de la semilla se pueden utilizar en forma separada como ingredientes funcionales para el desarrollo de alimentos. Se han intentado diversos procesos comerciales para la separacin de la cscara y los cotiledones, con rendimientos de alrededor de 40 % de cada fraccin, con un 20% de material no separado(Daunet al.,2003), sin embargo todava ninguno de ellos se aplica a nivel industrial. Uno de los procesos ms exitosos se basa en el descascarado abrasivo de la semilla que permite obtener una fraccin rica en cscara. El equipo de abrasin consiste en molinos de piedra semejantes a los equipos de pulido de arroz. Para mejorar el rendimiento del descascarado es necesario acondicionar el grano mediante un secado previo de la semilla hasta 2,7% de humedad, ya sea en horno caliente (52 C por 72 horas), por microondas o en lecho fluidizado, lo que produce mejores rendimientos de proceso. Las fracciones de cscara pueden usarse como una muy buena fuente de secoisolariciresinol (SDG), ya que adems de ser ricas en fibra diettica, son ricas en lignanos y medianas en protenas y lpidos (Oomahet al., 1996; Oomah y Mazza, 1997; Oomah and Mazza, 1998; Madhusudhanet al., 2000;Wiesenbornet al., 2003; Hallet al.,2006). Los cotiledones que se obtienen se pueden usar para la extraccin de aceite. Esta fraccin tiene una mucho menor capacidad de absorcin de agua y viscosidad que la harina integral de linaza (Wiesenbornet al., 2003; Hallet al.,2006).Extraccin de la gomaLas investigaciones ms recientes sobre goma de linaza, se refieren a las condiciones de extraccin y su efecto en la composicin y propiedades reolgicas de la suspensin, as como al efecto de la variedad sobre sus propiedades. La fibra insoluble est constituida por lo polmeros estructurales de la pared celular (Daunet al., 2003; Hallet al., 2006).El muclago de linaza es un material semejante a una goma, est asociado a la cscara del grano y est constituido por polisacridos cidos y neutros. Las condiciones ptimas para la extraccin de la goma son: agua entre 85 y 90 C a pH 6,5 a 7,0 y con una relacin agua: semilla de 13:1. La suspensin se liofiliza o se seca por atomizacin, obtenindose rendimientos de 13 a 14 %. La goma de linaza tiene buena capacidad espumante, estabilidad, resistencia a la presencia de sales y viscosidad estable en un amplio rango de pH (Hallet al., 2006)Propiedades tecnolgicasEl uso potencial de ingredientes provenientes de plantas depende de la versatilidad de sus propiedades tecnolgicas que se definen como cualquier propiedad de un ingrediente que tenga impacto en su utilizacin. Estn influenciadas, tanto por diversos factores intrnsecos tales como la composicin del alimento o matriz del cual se extraen, como por factores ambientales como la composicin del alimento en que se incorporan. Estas propiedades afectan las condiciones de proceso, la aplicabilidad del ingrediente, el uso en la formulacin o diseo de alimentos y la calidad y aceptabilidad del alimento elaborado (Martnez-Floreset al.,2006).En los ltimos aos ha habido un creciente inters por conocer las propiedades tecnolgicas de las harinas de plantas las que estn determinadas por las caractersticas fsicas y qumicas y la interaccin entre componentes (protenas, hidratos de carbono, pectinas,gomas). Estas propiedades son uno de los criterios principales utilizados para decidir el uso, utilidad y aceptabilidad de las harinas en los sistemas alimenticios. Las propiedades de hidratacin, dispersabilidad, densidad aparente, absorcin de agua y aceite, capacidad de ligazn, hinchamiento, emulsificacin, formacin de espuma, gelificacin y viscosidad afectan directamente las caractersticas finales del sistema alimenticio. El desempeo exitoso de una harina vegetal depende de sus caractersticas tecnolgicas y de la calidad sensorial que ella imparte al producto final (Kaur y Singh, 2005; Kauret al., 2007).La semilla de linaza tiene potencial para ser usada para la extraccin de goma y para la produccin de harina rica en protenas y fibra. Las propiedades tecnolgicas de la goma de linaza se relacionan con su alta capacidad espesante, espumante, de hinchamiento, de ligazn y emulsificante. Estas capacidades estn afectadas por el tamao y orientacin molecular, la asociacin entre molculas, el tamao de partcula, la concentracin y el grado de dispersin. La goma tiene propiedades que se asemejan mucho a las de la goma arbica y adems presenta la capacidad de formar geles dbiles termo-reversibles de establecimiento en fro a pH entre 6,0 y 9,0, por lo cual puede mostrar algunas propiedades de flujo al someterla a suficiente presin. La mxima estabilidad de la espuma se logra con concentraciones de 1%. La pureza de la goma afecta la viscosidad de la suspensin en forma significativa. Las gomas con mayor viscosidad intrnseca muestran mayor potencial para la estabilizacin de emulsiones aceite en agua. Se ha encontrado una alta variabilidad gentica, as como tambin un marcado efecto de las condiciones ambientales y de cultivo en la propiedades reolgicas de la goma de linaza (Daunet al., 2003; Chenet al., 2006; Hallet al., 2006).La harina de linaza tiene agradables caractersticas sensoriales como sabor a nuez, color dorado, buena textura que la hacen atractiva como ingrediente de diversos alimentos. Durante la elaboracin de la harina se generan compuestos voltiles y se liberan algunos compuestos fenlicos que le dan unsuave amargor. Sin embargo, no existe informacin disponible de sus propiedades tecnolgicas y su comportamiento en un sistema alimenticio complejo (Hallet al., 2006; Gohet al.,2006; Hyvrinenet al.,2006a)Uso de la linaza en la elaboracin de productosLa semilla de linaza entera se puede tostar, extruir, dilatar o laminar para mejorar su aplicabilidad en diversos alimentos. El tostado a altas temperaturas, cercanas a 180 C cambia las propiedades organolpticas de la semilla; se desarrollan nuevos aromas y sabores, disminuye su brillo, se oscurece su color ya que aumenta la participacin del rojo y disminuye la del amarillo. El tostado, adems, puede ayudar a la remocin de algunos compuestos antinu-tricionales. Sin embargo el contenido de perxidos, propanal y hexanal aumenta durante el almacenamiento en mayor grado en las semillas tostadas que en las semillas naturales (Hallet al., 2006; Martnez-Floreset al., 2006; Oomah, 2006).La harina de linaza se puede usar en diversos tipos de alimentos, como productos de repostera, cereales de desayuno, snack, barras nutritivas, bebidas nutricionales, helados y postres (Pszczola, 2002; Babu y Wiesenfeld, 2003; Morris y Vaisey-Genserb, 2003; Gohet al.,2006; Hyvrinenet al.,2006a). El nivel de harina de linaza que se puede incorporar en la elaboracin de alimentos est determinado por los cambios organolpticos y tecnolgicos que ocurran en ellos. El xito en el fraccionamiento de la semilla en sus diferentes componentes, puede aumentar los niveles de incorporacin en los alimentos. Todava no hay suficiente informacin acerca de las condiciones de proceso que mejoren las caractersticas de las harinas y su impacto en la calidad de los productos elaborados (Hyvrinenet al.,2006a; Oomah, 2006). En experiencias realizadas en panificacin se encontr que al agregar 5 % de harina de linaza, la firmeza de la masa se mantiene, aumenta la absorcin de agua y la curva del farinograma se debilita. La firmeza del pan aumenta y disminuye la calidad de la miga y la corteza, pero su volumen es mayor y tienemayor vida til; por otra parte no se observaron cambios en el contenido de lignanos. En el caso de muffins, con 10 % de harina de linaza, se logran productos con buena apariencia, color, sabor, textura y aceptabilidad (Ramcharitaret al., 2005; Hallet al.,2006). Considerando las temperatura interna de los productos horneados, es esperable que no ocurra un dao significativo en los componentes de mayor valor nutricional de la linaza tales como ALA, lignanos, goma, fibra y protena, lo cual se ha confirmado parcialmente en forma experimental (Morris y Vaisey-Genserb, 2003 Hyvrinenet al., 2006a).Por su parte, Mantheyet al. (2008) estudiaron el efecto del uso de harina de linaza en la elaboracin de pasta refrigerada, encontrando que las pastas resultantes eran menos firmes durante la coccin, pero que sin embargo, tenan un menor desarrollo de hongos, levaduras y bacterias durante el almacenamiento refrigerado de 7 semanas, debido aparentemente a un efecto bacteriosttico y fungisttico de los componentes de la linaza.Al introducir harina de linaza en yogurt, el contenido de lignanos se mantiene y no se afecta negativamente la fermentacin ni el almacenamiento durante 21 das a 4 C. En queso Edam, los liganos se mantienen estables durante la maduracin por 6 semanas a 9 C (Hallet al., 2006; Hyvrinenet al.,2006b).ConclusionesLa linaza, a pesar de ser una semilla conocida desde hace mucho, no se usa ampliamente en la formulacin de alimentos. Esta semilla posee importantes cantidades de compuestos bioactivos, como cido alfa-linolnico, lignanos y fibra diettica, los cuales tienen efectos potenciales en la prevencin de algunas enfermedades crnicas no transmisibles. Estas caractersticas convierten a la semilla de lino en una atractiva fuente de ingredientes para ser usados en la elaboracin de diferentes alimentos funcionales.

Liberacin de pptidos bioactivos por bacterias lcticas en leches fermentadas comercialesBioactive peptides released by lactic acid bacteria in commercial fermented milksL.G. GonzlezOlivares, J. JimnezGuzmn, A. CruzGuerrero*, G. RodrguezSerrano, L. GmezRuiz y M. GarcaGaribayDepartamento de Biotecnologa Universidad Autnoma MetropolitanaIztapalapa, Av. San Rafael Atlixco No. 186. Col. Vicentina, Mxico D.F. 09340, Mxico. CP 09340, Mxico, D.F. *Autora para la correspondencia. Email:aec@xanum.uam.mxTel: (55) 58 04 47 20; Fax: (55) 58 04 47 12Recibido 16 de Marzo 2011.Aceptado 13 de Abril 2011.ResumenEl objetivo de este estudio fue determinar la concentracin y el perfil de pesos moleculares de los pptidos bioactivos encriptados en las protenas de la leche y liberados por la actividad proteoltica de bacterias lcticas en leches fermentadas comerciales, durante su almacenamiento refrigerado. La concentracin de pptidos vari de 0.05 mg/ml en LF3(Lactobacillus casei)y LF4(Lactobacillus acidophilus),a 0.227 mg/ml en LF5(Lact obacillus caseiyS. thermophilus)y LF1(Lactobacillus casei)en el dcimo da de almacenamiento, en el cual se present el mximo de concentracin. Durante el almacenamiento refrigerado de todas las muestras, se encontraron pptidos de peso molecular menor a 14.4 kDa. La leche fermentada conLactobacillus acidophilusyStreptococcus thermophilus(LF2) present la mayor diversidad de pptidos, y en sta seencontraron fragmentos an menores a 1.4 kDa, algunos de ellos con aminocidos aromticos, presentes en la estructura primaria de pptidos antihipertensivos. Estos resultados sugieren que la concentracin y diversidad de pptidos depende del microorganismo que fermenta la leche. El peso molecular de los pptidos encontrados se compar con los reportados en la literatura como pptidos bioactivos, y se encontraron semejanzas, lo que incrementa la probabilidad de tener pptidos de importancia fisiolgica en leches fermentadas.Palabras clave:leches fermentadas, pptidos bioactivos, efecto antihipertensivo, bacterias cido lcticas.AbstractThe aim of this study was to evaluate the release of bioactive peptides encrypted in milk proteins by proteolytic activity of lactic acid bacteria in commercial fermented milks in refrigerated storage. Peptide concentration varied from 0.05 mg / ml in LF3(Lactobacillus casei)and LF4(Lactobacillus acidophilus)to 0.227 mg/ml in LF5(Lactobacillus caseiandS. thermophilus)and LF1(Lactobacillus casei)after 10 days of storage, when the maximum concentration was reached. During refrigerated storage, all samples presented peptides with molecular weight lower than 14.4 kDa. The fermented milk LF2(Lactobacillus acidophilu syStreptococcus thermophilus)had the highest variety of peptides, and even peptides lower than 1.4 kDa were found, some of them with aromatic amino acids, which are present in the primary structure of antihypertensive peptides. These results suggest that the concentration and diversity of peptides depends on microorganism in the fermented milk. Peptides molecular weights were compared with those reported in literature for bioactive peptides, finding similarities, thus increasing the expectations to have peptides with physiological importance in fermented milks.Keywords:fermented milks, bioactive peptides, antihypertensive effect, lactic acid bacteria.1 IntroduccinDurante dcadas las leches fermentadas se han considerado productos benficos para la salud, esto se ha atribuido a los microorganismos involucrados en la fermentacin. Estudios recientes han comprobado que estos beneficios tambin se deben a los diferentes productos liberados durante el proceso de fermentacin, tales como metabolitos y otras molculas biolgicamente activas (Leroy y De Vuyst, 2004; FigueroaGonzlezy col.,2010).Los probiticos se han definido como organismos vivos que al ingerirse afectan benficamente al husped mejorando el balance intestinal (Simmering y Blaut, 2001). Al modificar la microflora intestinal, los probiticos influyen directa e indirectamente en el estado de la salud a travs de produccin de vitaminas y cidos grasos de cadena corta, degradacin de sustancias alimenticias no digeridas, estimulacin de la respuesta inmune y proteccin frente a microorganismos enteropatgenos (Senoky col.,2005). Una gran variedad de especies y gneros pueden ser considerados como probiticos potenciales; sin embargo, comercialmente, las bacterias cido lcticas (BAL) son las ms importantes (Vasiljevic y Shah, 2008).La capacidad proteoltica de las BAL juega un papel muy importante durante la fermentacin de la leche, principalmente en el fraccionamiento de protenas a pptidos y aminocidos libres; algunos de estos pptidos presentan actividad biolgica por lo que son considerados pptidos bioactivos. A partir de leches fermentadas se han aislado numerosos pptidos con diversas actividades biolgicas. Se han descrito fracciones pptidicas con actividad inmunomodulante (LeBlancy col.,2002), anticancergena (LeBlancy col.,2005), hipocolesterolmica (Kawasey col.,2000), antimicrobiana (Hernndezy col.,2005), acarreadora de minerales (Lorenzen and Meisel, 2005), reguladora de actividad intestinal y del sistema nervioso (Rokkay col.,1997) y antioxidante (HernndezLedezmay col.2005). Los pptidos bioactivos ms estudiados hasta el momento son aquellos implicados en el control de la presin arterial (Fitzgerald y Murray, 2006).El primer reporte de una leche fermentada, con actividad antihipertensiva comprobada, fue producida con una combinacin deLactobacillus helveticus y Saccharomyces cerevisiae;sta contena dos tripptidos inhibidores de enzima la convertidora de angiotensina (VPP e IPP) (Contrerasy col.,2009). Se ha reportado en varios estudios la existencia de pptidos bioactivos en diferentes leches fermentadas: pptidos moduladores de la motilidad intestinal en una leche fermentada conLactobacillus caseissp.rhamnosus;pptidos antihipertensivos en yogurt y kfir (Korhonen, 2009). En este mismo contexto se ha demostrado que diferentes bacterias lcticas(Lactobacillus, LactococcusyStreptococcus)son capaces de producir pptidos bioactivos durante el proceso de fermentacin y durante el almacenamiento en refrigeracin (Phelany col.,2009).La presencia de estos pptidos bioactivos en productos alimenticios comerciales podra aportar beneficios adicionales para el consumidor. El objetivo de este trabajo fue determinar la concentracin y el perfil de pesos moleculares de los pptidos liberados durante el almacenamiento en fro de leches fermentadas comerciales conteniendo diferentes bacterias lcticas.2 Materiales y mtodos2.1 Leches fermentadas comercialesSe emplearon 7 leches fermentadas comerciales identificadas en laTabla 1. Los productos se seleccionaron en base a los microorganismos utilizados para la fermentacin, considerando aquellas que tuvieran microorganismos probiticos (siendo el caso de las leches LF1 a LF6) mientras que la LF7 se seleccion por tener exclusivamente los microorganismos del yogurt. Los productos se compraron en supermercados en las condiciones que llegan al consumidor asegurndose que tuvieran 15 das antes de la fecha de caducidad.2.2 Separacin de los pptidos presentes en las leches fermentadas almacenadas en refrigeracinLas leches fermentadas se almacenaron a 4C durante 15 d, tomando muestras en los das 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15. Se tomaron 5 ml de muestra y se mezclaron con el mismo volumen de una solucin de cido tricloroactico (TCA J.T. Baker, Mxico) al 12% (p/v) para precipitar protenas (JimnezGuzmny col.,2002). Se centrifugaron a 18000 rpm durante 15 min a 4C (centrifuga Beckman J2MI, EUA). El sobrenadante se refriger a 4C y se utiliz para las determinaciones posteriores.2.3 Cuantificacin de pptidos solubles en las leches fermentadasLa liberacin de pptidos solubles en las leches fermentadas se realiz mediante la tcnica reportada por Lowry y col., (1951), esto se hizo en los sobrenadantes obtenidos previamente. Se adicion 1 mL del sobrenadante de la leche fermentada a 5 mL de una solucin de carbonato de sodio al 2%, sulfato de cobre al 1% y tartrato de sodio y potasio al 2% en NaOH 0.1N; se dej reposar 10 min en la oscuridad. Posteriormente se adicionaron 0.5 mL del reactivo de Folin diluido 1:1 con agua destilada (preparado al momento de utilizarse), y se dej reposar 30 min en la oscuridad. Se midi la absorbencia en el espectrofotmetro Shimadzu UV160 (Japn) a una longitud de onda de 590 nm.2.4 Electroforesis desnaturalizante de las leches fermentadasSe realiz la electroforesis desnaturalizante de acuerdo a Laemmli (1970), con una concentracin de acrilamida de 15% (p/v). Se us un estndar de pesos moleculares de amplio rango (BioRad, EUA): miosina (200,000 Da);galactosidasa (116,250 Da); fosforilasa B (97,400 Da); seroalbmina (66,200 Da); ovoalbmina (45,000 Da); anhidrasa carbnica (31,000 Da); inhibidor de tripsina (21,500 Da); lisozima (14,400 Da) y aprotinina (6,500 Da). Los geles se tieron con Sypro Flamingo (BioRad, EUA). Se generaron los perfiles electroforticos para cada producto analizado a partir de los geles de electroforesis, y la altura de los picos en la grfica corresponde a la concentracin de cada pptido.2.5 Electroforesis desnaturalizante de pptidos de LF2Se utiliz el mtodo de Schgger y von Jagow (1987) modificado para la mejor resolucin de pptidos de peso molecular menor de 10 kDa. Con el objetivo de concentrar los pptidos, los sobrenadantes se liofilizaron (liofilizadora Labconco DrySystem/Freezone 4.5). Los liofilizados se resuspendieron en 100l de agua desionizada, se tom una alcuota de 40l y se agregaron 20l de solucin amortiguadora de corrida (Tris basetricina 0.1M), se incubaron por 30 min a 40C. La electroforesis se realiz en un gel con 20% (p/v) de acrilamida y 6% (p/v) de bisacrilamida, se inici con 30 V por 90 min, siguiendo con 95 V por 7 h. La fijacin de pptidos en el gel, se hizo con una solucin de 50% (p/v) metanol y 10% (p/v) cido actico por una hora. La tincin se hizo en una solucin de Sypro Flamingo (BioRad, EUA) por 30 min, se enjuag el gel con agua desionizada, para tomar posteriormente la imagen en GelDoc 100 (BioRad, EUA).Para determinar los pesos moleculares, se utiliz el estndar de polipptidos (BioRad, EUA): triosafosfato isomerasa (26,625 Da); mioglobina (16,950 Da); alactoalbmina (14,437 Da); aprotinina (6,512 Da); insulina B oxidada (3,496 Da) y bacitracina (1,423 Da). Para la determinacin de la concentracin de pptidos, se tom como referencia lalactoglobulina (BLG) a una concentracin de 1 mg/ml.2.6 Separacin de pptidos por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) de exclusin molecularLos sobrenadantes de las leches fermentadas fueron inyectados en un HPLC (Lab Alliance, EUA) en una columna de exclusin molecular (BiosepSEC 2000, Phenomenex, tamao de partcula 5m,tamao de poro 145 , 300 x 7.8 mm). Se utiliz como fase mvil una solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.8, se inyectaron 20l de muestra. Se corri a temperatura ambiente, con una tasa de flujo de 1 ml/min durante 60 min. La deteccin se realiz a 210, 257 y 280 nm en un detector de arreglo de diodos (Spectra System UV 6000 LP). Las dos ltimas son las longitudes de onda donde los aminocidos aromticos tienen su mxima absorcin de luz, a 257 nm fenilalanina (Phe) y 280 nm para tirosina (Tyr) y triptfano (Trp), mientras que a 210 nm absorben los enlaces peptdicos (Creighton, 1990).2.7 Anlisis estadsticoTodos los experimentos se realizaron por triplicado y los datos experimentales se sometieron a un anlisis de varianza (ANOVA), se hizo la comparacin de medias por el mtodo de Tukey's con un nivel de significancia de 0.05. Se utiliz el programa SPSS Statistics 17.0 (19932007 Polar Engineering and Consulting).3 Resultados y discusin3.1 Concentracin de pptidos solubles producidos en las leches fermentadas durante el almacenamientoAl realizar la determinacin de pptidos solubles (Fig. 1), se encontr que la concentracin se increment hasta el da diez, a partir del cual se mantuvo constante hasta el final del estudio (p> 0.05) excepto para la LF4 y LF5 en donde se observ una disminucin en la concentracin de pptidos. Se observ que la mayora de las leches fermentadas (exceptuando LF4 y LF5) alcanzaron un mximo entre 1300 y 1600g/ml, mientras que LF4 alcanz una concentracin de 2500g/ml y LF5 por arriba de los 3000g/ml; esta ltima corresponde a la combinacinS. thermophilusyL. caseiShirota. Por otra parte, se observ que todas las leches fermentadas siguieron la misma tendencia, lo cual sugiere una formacin y acumulacin constante durante los primeros das del almacenamiento, no importando la bacteria lctica utilizada en la elaboracin. Estos resultados coinciden con los reportados por Nielseny col.(2009) quienes estudiaron la produccin de pptidos durante el almacenamiento en refrigeracin de leches fermentadas conLactococcus lactis y Lactobacillus helveticusy en cultivos combinados deLactobacillus acidophilusyStreptococcus thermophilus.

En laFig. 2se muestra el gel de electroforesis de las leches fermentadas almacenadas durante 10 d en refrigeracin. Se observ que en cada una de las muestras se encontraron bandas con pesos moleculares menores a 14.4 kDa incluso menores a 6.6 kDa, que corresponden al tamao de varios pptidos reportados como bioactivos (Schanbachery col.,1997; Meisel y Bockelmann, 1999; Korhonen y Philanto 2006; Phelany col.,2009).

A partir del gel de electroforesis se calcul la concentracin de pptidos y se encontr que los productos que presentaron la mayor concentracin no mostraron la mayor diversidad de ellos. En LF1 y LF5, que tenan la mayor concentracin (0.205 y 0.227 mg/ml), slo se encontraron 9 y 10 bandas de pptidos respectivamente. En el caso de LF7 y LF4, 11 y 12 bandas respectivamente; en LF2 a pesar de haber tenido una concentracin de pptidos menor (0.073 mg/ml) present la mayor diversidad de ellos (15 bandas) por debajo de los 14.4 kDa, adems de que exhibi uno de los pptidos de menor peso molecular, que son los de mayor inters por ser de los pptidos ms reportados en la bibliografa como bioactivos entre los que se encuentran: antitrombticos, antihipertensivos, inmunomoduladores, acarreadores de minerales entre otros (Clare y Swaisgood, 2000). Otros autores han descrito la capacidad de las proteinasas de las BAL para hidrolizar ms del 40% de los enlaces peptdicos de las casenas (Juillardy col.,1995; Kunjiy col.,1996; Mierauy col.,1997) generando un gran nmero de pptidos, que podran ser degradados por peptidasas para liberar algunos con propiedades bioactivas.Se compar el perfil de pptidos de las leches fermentadas y se observaron picos que coinciden entre ellas. En el caso de LF2, LF5 y LF7 que tienen en comn la presencia deStreptococcus thermophilus,se encontraron cinco picos que coinciden entre los tres productos. Lo mismo se observa entre los perfiles de LF3 y LF5, fermentadas con la misma cepa deL. casei,donde se encontraron ocho picos que coinciden. Por otro lado, en el caso de LF4 y LF2 fermentadas conL. acidophilus(Fig. 3), se encontr la mayor cantidad de picos comunes (10 picos) lo que coincide con lo reportado por Vinderola y col. (2002) quienes observaron que en almacenamiento a 4C, la produccin de pptidos fue mayor en una leche fermentada con L. acidophilus y S. thermophilus comparada con leches fermentadas con otros probiticos solos o en otras combinaciones. Es importante destacar que es posible relacionar el tipo de pptido encontrado con el sistema proteoltico de la bacteria o del consorcio bacteriano utilizado en la fermentacin de la leche (LeBlanc, y col., 2002). En leches fermentadas en refrigeracin, se ha observado que algunos consorcios bacterianos generan mayor produccin de pptidos y aminocidos libres que cuando se tiene una sola bacteria (Shihata y Shah, 2000).

3.2 Determinacin de pptidos solubles en LF2 elaborada con Lactobacillus acidophilus y Streptococcus thermophilusA partir de los resultados obtenidos se trabaj con LF2 debido a la variedad de pptidos generados comparado con el resto de los productos analizados. Con el fin de determinar si la concentracin de pptidos era igual para cualquier lote de leche LF2, se analizaron dos muestras con diferentes tiempos de elaboracin 15 y 10 das antes de caducar y no se encontr diferencia en la concentracin de pptidos en ambos productos (p> 0.05).Al realizar la electroforsis para pptidos de las muestras de LF2 en almacenamiento refrigerado, se encontraron bandas correspondientes a pptidos menores a 14.4 kDa (Fig. 4), se observ que en todos los carriles hubo aparicin de estas bandas, pero existen dos bandas en particular bien definidas una de 1.4 kDa (a) y otra menor a 1.4 kDa (b), que aparecieron en el da 1 y permanecieron hasta el da 13, estos resultados confirman la existencia de pptidos de bajo peso molecular que se haban encontrado en el anlisis por electroforsis desnaturalizante de las leches fermentadas. Esta formacin de pptidos puede deberse, en gran medida, a que existen an en el medio endopeptidasas pertenecientes a bacterias vivas o a enzimas liberadas por lisis celular (Nighswongery col.,1996). Nielseny col.(2009) encontraron, en estudios hechos durante el almacenamiento refrigerado en leches fermentadas, que la actividad proteoltica se mantuvo en refrigeracin a 4C y que an cuando no hubo un aumento considerable de la poblacin de BAL, la actividad proteoltica no se detuvo, permitiendo un aumento en la concentracin de pptidos de distintos pesos moleculares.

Los resultados obtenidos de la separacin e identificacin de las fracciones peptdicas de la leche LF2 por HPLC se muestran en laTabla 2. En el primer da de monitoreo se identificaron 7 pptidos menores a 14.4 kDa y se observ que la concentracin total de pptidos permaneci constante (p> 0.05) hasta el da 5 a pesar de que s hubo un aumento en el nmero de pptidos. Se observ un aumento en la concentracin de pptidos en el da 7 y otro hasta el da 13 siendo ste el mximo obtenido (p< 0.05). Los pptidos generados pueden provenir de la hidrlisis de protenas o pptidos de peso molecular superior a 10 kDa por las enzimas del sistema proteoltico de las BAL (Ramchandran y Shah, 2008; Nighswongery col.,1996). Los pptidos 7 y 11 fueron los que se encontraron en mayor concentracin al final del estudio, con pesos moleculares de 2.68 y 0.87 kDa respectivamente. Los pptidos encontrados menores a 2 kDa pueden estar relacionados con pptidos antihipertensivos, debido solamente a su peso molecular. Muchos autores han reportado pptidos de menos de 2 kDa biolgicamente activos (Meisel, 1998; Meisel, 2001; Clare y Swaisgood, 2000; Rokkaycol.,1997).Comparando los cromatogramas del sobrenadante de la LF2 a las tres longitudes de onda (Fig. 5), slo se observaron cuatro pptidos con presencia de aminocidos aromticos. Dado que diferentes autores reportaron que los pptidos antihipertensivos, tienen en sus estructuras aminocidos aromticos (Rokkay col.,1997) se incrementa la posibilidad de encontrar pptidos antihipertensivos. Se ha visto que los aminocidos Trp, Tyr y Phe favorecen la unin y consecuente inhibicin de la enzima convertidora de angiotensina (ACEI) (Cheungy col.,1980). De igual manera se sabe que el sistema proteoltico de las BAL est ntimamente ligado a la acumulacin de pptidos de diferentes tamaos y tipos, dependiendo de las necesidades nutricionales de cada BAL, haciendo que las diferencias funcionales del aparato proteoltico entreL. acidophilusyS. thermophilus,sea una de las causas de encontrar esta diversificacin en las fracciones peptdicas (Poolmany col.,1995). An cuando la temperatura ptima de las proteinasas y peptidasas de las BAL se encuentra entre 25 y 37C (Juilley col.,2005) la actividad contina en refrigeracin, tanto en el rompimiento de protenas como de pptidos (Nighswongery col.,1996; Nielseny col.,2009). Ms an se ha reportado (Matsumuray col.,1993; Miyoshiy col.,1991; Fujitay col.,2000) la importancia de la presencia de aminocidos aromticos, principalmente Phe, junto con prolina en pptidos con alta actividad inhibitoria de la ACE, en el extremo Cterminal. Debido a los requerimientos nutricionales de las BAL, se tiene una acumulacin de pptidos de cadena corta (2 a 6 aminocidos) (Dave y Shah 1998; Gomesy col.,1998). Aunque los requerimientos nutricionales del estreptococo son diferentes (Letorty col.,2002) y tienen un sistema muy avanzado a manera de opern de produccin de aminocidos (leucina, isoleucina y valina) (Garaulty col.,2000) tambin genera pptidos de bajo peso molecular en leches fermentadas, adems de que la nula necesidad de pptidos aromticos permite la acumulacin de estos en el medio de fermentacin (Akpemado y Bracquart 1983; Letort y Julliard 2001) a diferencia del lactobacilo, el cual tiene necesidades de fenilalanina y triptfano (Morishitay col.,1981). De igual manera la acumulacin constante de pptidos con aminocidos aromticos, se puede deber a una peptidasa intracelular especfica del estreptococo, que libera de manera constante pptidos con fenilalanina (FernndezEspa y Rui 1999) cuyo sistema de transporte de oligopptidos tiene afinidad por pptidos de hasta 23 aminocidos, adems de poseer tres enzimas ligadoras en el sistema de transporte de oligopptidos (amiAl, amiA2 y amiA3) en lugar de una como en las dems BAL (OppA) (Garaulty col.,2001; FernndezEspla y Rul 1999, Juilley col.,2005) que le permite excretar al medio pptidos de dos y tres aminocidos generados por la accin de dipeptidasas intracelulares (Rui y Monnet 1997; FernndezEspla y Rul, 1999).3.3 Relacin de pptidos encontrados con pptidos bioactivos reportadosSe pudo hacer una relacin de los pptidos encontrados en el estudio (con aminocidos aromticos en su estructura) con pptidos bioactivos reportados, tal y como lo hicieron Rokkay col.(1997); de esta forma se identificaron tres pptidos que podran tener actividad biolgica, principalmente antihipertensiva, ya que los pesos moleculares reportados son muy similares a los pesos moleculares determinados y en ellos hay presencia de Tyr, Phe y Trp (verTabla 3).ConclusionesEn todas las leches fermentadas estudiadas se observ la generacin de pptidos solubles durante el almacenamiento en refrigeracin independientemente del microorganismo utilizado en su elaboracin, y se observ que sigui un mismo patrn, con un mximo de concentracin en el da 10 que se mantuvo constante hasta el final del estudio, exceptuando la de las leches LF4(Lactobacillus acidophilus) yLF5(Lactobacillus caseiShirota yStreptococcus thermophilus),en las que se present un descenso despus del da 10 hasta el da 15.El anlisis de pptidos por electroforesis desnaturalizante de todas las leches comerciales, revel que las leches que presentaron la mayor concentracin de pptidos fueron las que tenanLactobacillus casei(LFly LF5). Mientras que, las leches que tenanLactobacillus acidophilus(LF2 y LF4) presentaron la mayor diversidad de pptidos. La comparacin del perfil de pptidos permiti comprobar que los pptidos generados dependen del microorganismo utilizado en la fermentacin.