Determinación de la concentración letal media CL50-48 de ...

Universidad de La Salle Universidad de La Salle

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Ingeniería Ambiental y Sanitaria Facultad de Ingeniería

1-1-2011

Determinación de la concentración letal media CL50-48 de Determinación de la concentración letal media CL50-48 de

arsénico y litio mediante bioensayos de toxicidad sobre el arsénico y litio mediante bioensayos de toxicidad sobre el

organismo acuático Daphnia pulex organismo acuático Daphnia pulex

Leonardo Arturo Valero Sandoval Universidad de La Salle, Bogotá

Angie Julieth Bustos González Universidad de La Salle, Bogotá

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Citación recomendada Citación recomendada Valero Sandoval, L. A., & Bustos González, A. J. (2011). Determinación de la concentración letal media CL50-48 de arsénico y litio mediante bioensayos de toxicidad sobre el organismo acuático Daphnia pulex. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/ing_ambiental_sanitaria/43

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DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA DE ARSÉNICO Y

LITIO MEDIANTE BIOENSAYOS DE TOXICIDAD SOBRE EL ORGANISMO

ACUÁTICO DAPHNIA pulex.

LEONARDO ARTURO VALERO SANDOVAL

ANGIE JULIETH BUSTOS GONZALEZ

UNIVERSIDAD DE LA SALLE

FACULTAD DE INGENIERÍA

PROGRAMA DE INGENIERÍA AMBIENTAL Y SANITARIA

BOGOTÁ

2011

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA DE ARSÉNICO Y

LITIO MEDIANTE BIOENSAYOS DE TOXICIDAD SOBRE EL ORGANISMO

ACUÁTICO DAPHNIA pulex.


ANGIE JULIETH BUSTOS GONZALEZ

Trabajo de grado para optar al título de Ingeniero Ambiental y Sanitario

Director PEDRO MIGUEL ESCOBAR MALAVER

Químico Industrial Licenciado en Química y Biología



PROGRAMA DE INGENIERÍA AMBIENTAL Y SANITARIA

BOGOTÁ

2011

Determinación de la concentración letal media de Arsénico y Litio mediante bioensayos

de toxicidad sobre el organismo acuático Daphnia Pulex

1



2



3

Nota de aceptación

___________________________________

___________________________________

___________________________________

___________________________________

___________________________________

Firma Director

___________________________________

Firma Jurado 1

___________________________________

Firma Jurado 2

Bogotá, 2011



4

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan sus agradecimientos a:

Nuestro Director de tesis, Químico Industrial. Pedro Miguel Escobar Malaver, quien además

de brindarnos todos sus conocimientos nos apoyó incondicionalmente durante el desarrollo de

nuestro trabajo de grado logrando que los resultados fueran los mejores. Además de esto con

sus buenos consejos y el mayor de los esfuerzos construyo un excelente grupo de

investigación en el área de bioensayos dando lugar al desarrollo de este y otros trabajos de

grado.

A Oscar Fernando Contento, Coordinador del Laboratorio del programad de ingeniería

ambiental y sanitaria por su colaboración durante el desarrollo de nuestro trabajo de

investigación.

A nuestros padres quienes vivieron como suya esta investigación, gracias a su apoyo

logramos culminar esta meta.



5

DEDICATORIA

A mis padres por el apoyo recibido durante este proceso para realizarme

Como profesional y ser una persona competente para

mis metas y proyectos futuros

Este proyecto de Grado está dedicado al grupo de monitores del laboratorio

De Ingeniería Ambiental y Sanitaria, al grupo de bioensayos por su

Colaboración y prestación de servicios durante nuestra estadía

en el laboratorio de bioensayos.

A mi director de tesis Pedro Miguel Escobar ya que gracias a su acompañamiento se lograron

los objetivos propuestos.

.


.



6

DEDICATORIA

El proyecto de grado para mi formación como profesional lo dedico a mi familia, mi padre, mi

madre quienes me apoyaron durante todo mi proceso estudiantil.

Lo dedico a l grupo de laboratorio de bioensayos quienes fueron una parte fundamental en el

proceso de este proyecto gracias a la colaboración de ellos.

ANGIE JULIETH BUSTOS



7

TABLA DE CONTENIDO

1. OBJETIVOS .......................................................................................................................................................19

1.1 OBJETIVO GENERAL ..........................................................................................................................19

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................19

2. MARCO TEÓRICO ...........................................................................................................................................20

2.1 DAPHNIA pulex ......................................................................................................................................20

2.1.1 Morfología .......................................................................................................................................21

2.1.2 Hábitat .............................................................................................................................................21

2.1.3 Alimentación .......................................................................................................................................22

2.1.4 Reproducción .................................................................................................................................22

2.1.5 Desarrollo ............................................................................................................................................23

2.1.6 Condiciones ambientales .................................................................................................................23

2.2 BIOENSAYO...........................................................................................................................................24

2.2.1 Tipos de bioensayo .......................................................................................................................26

2.2.2 Toxicidad .........................................................................................................................................27

2.2.3 Pruebas de toxicidad .....................................................................................................................28

2.2.4 Tóxicos de referencia ....................................................................................................................28

2.3 SUSTANCIAS DE PRUEBA ................................................................................................................28

2.3.1 Arsénico (As) ..................................................................................................................................28

2.3.2 Litio (Li) ............................................................................................................................................31

2.4 MÉTODOS ESTADÍSTICOS PARA ANÁLISIS DE PRUEBAS DE TOXICIDAD ......................34

2.4.1 Método Probit (Paramétrico) ........................................................................................................34

2.4.5 Análisis de varianza (ANOVA) .....................................................................................................36

2.5 INDUSTRIA.............................................................................................................................................37

3. METODOLOGÍA ............................................................................................................................................38

3.1 FASE I: PREPARACIÓN ...........................................................................................................................39

3.1.1 Preparación del agua reconstituida ..................................................................................................39

3.1.2 Preparación del medio Bristol y centrifugación de algas verdes ..................................................41



8

3.1.3 Conteo de algas verdes ......................................................................................................................44

3.2 FASE II: ACONDICIONAMIENTO ............................................................................................................46

3.2.1 Aclimatación de los organismos de prueba .....................................................................................46

3.2.2 Alimentación de los organismos de prueba .....................................................................................47

3.2.3 Mantenimiento del cultivo ...................................................................................................................47

3.2.4 Separación de los organismos de prueba .......................................................................................50

3.2.5 Limpieza y Recolección de neonatos ...............................................................................................50

3.3 FASE III: PRUEBAS DE TOXICIDAD ......................................................................................................50

3.3.1 Montaje del ensayo toxicológico ........................................................................................................50

3.3.2 Preparación de las soluciones con Dicromato de Potasio ............................................................52

3.3.3 Pruebas con Dicromato de Potasio ..................................................................................................52

3.3.4 Preparación de las soluciones con Arsénico y Litio .......................................................................53

3.3.5 Pruebas con Arsénico y Litio..............................................................................................................54

3.3.6 Determinaciones físico químicas del vertimiento ............................................................................54

3.4 FASE IV. RESULTADOS ...........................................................................................................................55

3.4.1 Aceptabilidad de los resultados .........................................................................................................55

4. OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS .........................................................................................56

4.1 PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DICROMATO DE POTASIO ................................................56

4.1.1 Análisis Probit para las pruebas de sensibilidad con Dicromato de potasio ........................56

4.1.2 Análisis ANOVA para las pruebas de sensibilidad con Dicromato de potasio .....................60

4.2 PRUEBAS DE TOXICIDAD CON ARSÉNICO ..................................................................................62

4.2.1 Análisis Probit para las pruebas de toxicidad con Arsénico (As) ...........................................62

4.2.2 Análisis ANOVA para las pruebas de toxicidad con Arsénico (As) .......................................67

4.3 PRUEBAS DE TOXICIDAD CON LITIO ............................................................................................68

4.3.1 Análisis Probit para las pruebas de toxicidad con Litio ............................................................68

4.3.2 Análisis ANOVA para las pruebas de toxicidad Litio (Li) .........................................................72

4.4 PRUEBAS DE TOXICIDAD CON EL VERTIMIENTO .....................................................................73

4.4.1 Análisis fisicoquímico del vertimiento .........................................................................................73

4.4.2 Análisis Probit para las pruebas de toxicidad con el vertimiento ...........................................74

4.4.4 Análisis ANOVA para las pruebas de toxicidad con el vertimiento ........................................78



9

5. OBTENCIÓN DE LA CARGA TÓXICA E ÍNDICE TOXICOLÓGICO ....................................................79

5.1 Obtención carga toxicológica del vertimiento ....................................................................................80

5.2 Obtención del índice toxicológico del vertimiento .............................................................................80

6. CONCLUSIONES ..........................................................................................................................................82

7. RECOMENDACIONES .................................................................................................................................84

8. BIBLIOGRAFÍA ..............................................................................................................................................86



10

TABLA DE ILUSTRACIONES

Ilustración 1: Daphnia pulex .................................................................................................................................20

Ilustración 2: Metodología para la determinación del CL50 .............................................................................39

Ilustración 3: Agua reconstituida .........................................................................................................................40

Ilustración 4: Preparación Medio Bristol .............................................................................................................43

Ilustración 5: Centrifugación .................................................................................................................................43

Ilustración 6: Cámara Neubauer .........................................................................................................................45

Ilustración 7: Baterías de ensayo ........................................................................................................................46

Ilustración 8: Mantenimiento del cultivo .............................................................................................................48

Ilustración 9: Separación y mantenimiento de organismos.............................................................................49

Ilustración 10: Montaje Toxicológico ...................................................................................................................51

Ilustración 11: Batería de ensayo cubierta ........................................................................................................51

Ilustración 12: Diagrama preparación de soluciones .......................................................................................53



11

TABLA DE TABLAS

Tabla 1: Taxonomía Daphnia pulex ....................................................................................................................20

Tabla 2: Condiciones ambientales ......................................................................................................................24

Tabla 3: Fuentes de exposición ...........................................................................................................................30

Tabla 4: Control de Parámetros ..........................................................................................................................41

Tabla 5: Compuestos para preparación de Medio Bristol ...............................................................................42

Tabla 6: Condiciones ideales del cultivo ............................................................................................................47

Tabla 7: Control pruebas con Dicromato de Potasio .......................................................................................57

Tabla 8: Resultados pruebas con Dicromato de Potasio ................................................................................58

Tabla 9: Resultados de sensibilidad en investigaciones anteriores ..............................................................58

Tabla 10: Resultados Análisis de varianza ANOVA para las pruebas de sensibilidad ..............................61

Tabla 11: Tabla de control pruebas definitivas con Arsénico (As) .................................................................64

Tabla 12: Resultados de pruebas con Arsénico ...............................................................................................65

Tabla 13: Antecedentes Internacionales ............................................................................................................65

Tabla 14: Resultados Análisis de varianza ANOVA para Arsénico ...............................................................68

Tabla 15: Tabla de control pruebas definitivas con Litio .................................................................................70

Tabla 16: Resultados pruebas con Litio .............................................................................................................71

Tabla 17: Resultados análisis Anova para Litio ................................................................................................72

Tabla 18: Resultados parámetros In situ ...........................................................................................................73

Tabla 19: Resultados de los análisis fisicoquímicos ........................................................................................74

Tabla 20: Carta de control pruebas definitivas con Vertimiento .....................................................................76

Tabla 21: Resultados pruebas con vertimiento .................................................................................................77

Tabla 22: Resultados análisis Anova con el vertimiento .................................................................................78

Tabla 23: Rangos Índice Toxicológico ...............................................................................................................81



12

TABLA DE GRAFICAS

Grafica 1: Concentración letal media de sensibilidad con Dicromato de potasio ........................................59

Grafica 2: Concentración Letal Media de Arsénico ..........................................................................................66

Grafica 3: Concentración Letal Media de Litio ..................................................................................................71

Grafica 4: Concentración Letal Media del Vertimiento ....................................................................................77



13

LISTA DE ANEXOS

ANEXO A. Cartas de control para las pruebas de sensibilidad con Dicromato de potasio.

ANEXO B. Obtención de la CL50‐48 con Dicromato de potasio (k2cr2o7) por el Método Probit.

ANEXO C. Análisis de varianza con Dicromato de potasio.

ANEXO D. Cartas de control para las pruebas de toxicidad con Arsénico

ANEXO E. Obtención de la CL50‐48 con Arsénico por el Método Probit.

ANEXO F. Análisis de varianza con Arsénico.

ANEXO G. Cartas de control para las pruebas de toxicidad con Litio

ANEXO H. Obtención de la CL50‐48 con Litio por el Método Probit.

ANEXO I. Análisis de varianza con Litio.

ANEXO J. Cartas de control para las pruebas de toxicidad con Vertimiento.

ANEXO K. Obtención de la CL50‐48 con Vertimiento por el Método Probit.

ANEXO L. Análisis de varianza con Vertimiento

ANEXO M. Protocolo Análisis de resultados, Método Probit

ANEXO N. Análisis de varianza, Método Anova

ANEXO O. Análisis de Laboratorio



14

GLOSARIO

ACLIMATACIÓN: Adaptación de un organismo de prueba a diversas condiciones

ambientales, tales como temperatura luz o diferentes cantidades de agua.

AGUA RECONSTITUIDA: agua preparada con reactivos establecidos, con el fin de generar

las condiciones ambientales presentes en los ecosistemas en los cultivos mantenidos en el

laboratorio.

CADENA TRÓFICA: también llamada cadena alimentaria, es la corriente de energía y

nutrientes que se establece entre las distintas especies de un ecosistema en relación con su

alimentación.

CONCENTRACIÓN LETAL (CL): es la concentración de tóxico estimada que produce la

muerte de una proporción específica de los organismos de prueba. Se define como la

concentración letal media (CL50), que corresponde a la concertación que mata al 50% de

los organismos expuestos en un determinado periodo de tiempo.

CONCENTRACIÓN DE UNA SUSTANCIA, ELEMENTO O COMPUESTO EN UN LÍQUIDO:

La relación existente entre su masa y el volumen del líquido que lo contiene.

CONTAMINANTE: sustancia introducida en el ambiente por actividades humanas, que

produce efectos adversos sobre organismos individuales vivos y en el ecosistema.

DOSIS: cantidad de sustancia administrada, expresada en términos de: unidad/peso corporal.

ECOSISTEMA ACUÁTICO: es la unidad funcional básica de interacción de los organismos

vivos entre sí y de estos con el ambiente acuático en un espacio y tiempo determinado.



15

EFECTO: cambio biológico, tanto en organismos individuales como a niveles superiores de

organización; se relaciona con la exposición a un xenobiótico.

ENSAYO DE TOXICIDAD: Determinación del efecto de un material o mezcla sobre un grupo

de organismos seleccionados bajo condiciones definidas. Mide las proporciones de

organismos afectados (efecto cuantal) o el grado de efecto (graduado) luego de la exposición

a la muestra.

ENSAYO PRELIMINAR (Screrning): Prueba para determinar si se produce un impacto.

Estas pruebas se diseñan utilizando una concentración, múltiples replicas y una exposición de

24 a 96 horas.

ENSAYO DEFINITIVO: Prueba diseñada para establecer la concentración a la cual se

presenta el efecto final establecido. Los periodos de exposición son mayores que las pruebas

preliminares y las de intervalo, se utilizan múltiples concentraciones a estrechos intervalos y

múltiples réplicas.

NUTRIENTE: Elemento requerido para el crecimiento de los organismos.

TIEMPO DE EXPOSICIÓN: Tiempo de contacto de los organismos de prueba con la solución

estudiada.

TOLERANCIA: Habilidad de un organismo a tolerar una condición dada por un periodo de

tiempo prolongado de exposición, sin que muera.

XENOBIÓTICO: Compuestos cuya estructura química en la naturaleza es poco frecuente o

inexistente debido a que son compuestos sintetizados por el hombre en el laboratorio.



16

TÓXICO: agente capaz de producir un efecto adverso, dañando la estructura y el

funcionamiento del ecosistema.

TOXICIDAD: La propiedad que tiene una sustancia, elemento o compuesto, de causar daños

en la salud humana o la muerte de un organismo vivo.

TOXICIDAD AGUDA: La propiedad de una sustancia, elemento, compuesto, desecho, o

factor ambiental, de causar efecto letal u otro efecto nocivo en cuatro (4) días o menos a los

organismos utilizados para el bioensayo acuático.

TOXICIDAD CRÓNICA: La propiedad de una sustancia, elemento, compuesto, desecho o

factor ambiental, de causar cambios en el apetito, crecimiento, metabolismo, reproducción,

movilidad o la muerte o producir mutaciones después de cuatro (4) días a los organismos

utilizados por el bioensayo acuático.



17

RESUMEN

Los bioensayos son experimentos en los cuales un tejido vivo, un organismo o grupo de ellos,

es empleado para determinar el potencial toxico de una sustancia cualquiera de actividad

desconocida. Los estudios toxicológicos constituyen uno de los elementos de juicio más

adecuados para la evaluación del riesgo potencial producido por contaminantes presentes en

el ambiente.

Para este proyecto nos centraremos en determinar la concentración letal media (CL50) de

contaminantes como Arsénico y Litio en ecosistemas acuáticos, ya que constituyen un peligro

para los seres vivos debido a que son sustancias de interés sanitario según el decreto 1594

de 1984.

El método utilizado para la investigación son bioensayos de toxicidad, sobre DAPHNIA pulex

con un periodo de exposición de 48 horas, a diferentes concentraciones y porcentajes de

dilución, permitiendo determinar la dosis letal de Arsénico (0,024 mg/L) y Litio (2,731 mg/L)

datos que fueron validados por medio del software Probit y el análisis de varianza (ANOVA),

siguiendo los protocolos ya establecidos.

Además, se determinó que porcentaje de vertimiento que causa la muerte al 50% de las

pulgas DAPHNIA pulex, en el cual el valor obtenido fue de 0.89 mg/L; lo que indica que el

índice de toxicidad es (4.17), el cual lo clasifica como una toxicidad considerable.



18

ABSTRACT

Bioassays are experiments in which tissue live, body or group of them, is used to determine

the potential toxicity of a substance any unknown activity. Studies is one of the toxicological

evidence more suitable for assessing the potential risk caused by contaminants in the

environment.

For this project we will focus on determining the median lethal concentration (LC50) of

pollutants such Arsenic and Lithium in aquatic ecosystems, as constitute a danger to living

things because are substances of sanitary interest according to the 1594 decree 1984.

The method used for research are bioassays of toxicity on Daphnia pulex with a period of

48 hour exposure to different concentrations and dilution rates by allowing the dose Lethal

Arsenic (0,024 mg/L) and Lithium (2,731 mg/L) data were validated using the Probit software

and analysis variance (ANOVA), following protocols and established.

In addition, we determined what percentage of shedding that kills 50% of the flea DAPHNIA

pulex, in which the value obtained was 0.89 mg/L, indicating that the toxicity index is (4,17),

which is classified as toxicity considerable.



19

1. OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GENERAL

Determinar la concentración letal media de Arsénico y Litio, mediante bioensayos de

toxicidad sobre el organismo acuático Daphnia pulex.

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Establecer la sensibilidad de la Daphnia pulex mediante su exposición a Dicromato de

potasio (K2Cr2O7).

Determinar la concentración letal media de Arsénico y Litio sobre Daphnia pulex

mediante soluciones estándar de estos metales.

Determinar la concentración letal media de Arsénico y/o Litio sobre Daphnia

pulex utilizando el vertimiento de la industria tipo.



20

2. MARCO TEÓRICO

2.1 DAPHNIA pulex

La DAPHNIA pulex es el organismo escogido y es un tipo de crustáceo del orden cladócero,

normalmente llamada pulga de agua, esto se debe a la forma en que se impulsa con las dos

antenas ubicadas en la cabeza. (Ver ilustración 1: Daphnia pulex)

Ilustración 1: Daphnia pulex

Fuente: [Disponible en internet] En línea: http://www.kralici.cz/.../files/Daphnia_pulex.png

Fuente: [Disponible en internet] En línea: http://www.dr-ralfwagner.de/Bilder/Daphnia_pulexobtusa.jpg

Tiene un tamaño que varía entre 0,2 y 0,5 milímetros, su cuerpo es transparente lo que facilita

la observación de sus órganos internos; habitan en medios acuáticos desde charcos hasta

ríos, se alimentan de plancton y organismos de menor tamaño tales como los protistas y

bacterias. (Ver tabla 1: Taxonomía Daphnia pulex)

Tabla 1: Taxonomía Daphnia pulex

Reino Animal

Filo Crustacea

Clase Branchiopoda

Orden Cladocera

Familia Daphniidae

Genero Daphnia

Fuente: Los autores. 2011

http://www.kralici.cz/.../files/Daphnia_pulex.png

http://www.dr-ralfwagner.de/Bilder/Daphnia_pulexobtusa.jpg



21

2.1.1 Morfología

La DAPHNIA pulex se caracterizan por poseer un cuerpo comprimido lateralmente y ovalado;

el alimento pasa al interior de una cámara sencilla por medio de una corriente de agua que es

aspirada al interior, el intestino anterior forma un esófago corto y el intestino medio forma un

estómago el cual, por ser tubular, no se diferencia de las otras partes del sistema digestivo,

presenta un vaso sanguíneo corto que conduce sangre desde el corazón a la parte anterior, el

vaso no se ramifica y la sangre pasa a través de senos y no de venas. Es un organismo

filtrador y los bordes de los apéndices presentan cerdas finas para realizar esta función.

Presentan dimorfismo sexual marcado y la hembra es más grande que el macho. Presentan

una caparazón de quitina transparente, las antenas o apéndices con numerosas setas; ojos

compuestos y simples (ojo nauplio). Una cavidad embriónica con huevos y embriones

situados en la parte dorsal, entre el caparazón y el dorso del cuerpo.

2.1.2 Hábitat

La DAPHNIA pulex en su ambiente natural, es un organismo que habita espacios acuáticos

de agua dulce ricas en nutrientes. Las mayores concentraciones se encuentran en lagos y

estanques, estos organismos permanecen suspendidos en sus patas y antenas, debido a esto

viven en una columna de agua y frecuentemente se mueven hacia arriba y hacia abajo debido

a los depredadores o durante ciertas épocas del año para adaptarse a las diferentes

condiciones. Las aguas donde se encuentran son aguas oxigenadas, con alto contenido de

Calcio y Magnesio, el rango de pH está entre 6.5 y 8.5.



22

2.1.3 Alimentación

Son normalmente fitófagos, alimentándose por filtración. Su dieta principalmente es a base de

plancton o detritos; filtran continuamente el agua en la cual viven, deteniendo las partículas

suspendidas en ésta a través de sedas situadas en los apéndices toráxicos; el tamaño

promedio de las partículas ingeridas se sitúa entre 0,5 y 50 μm.

2.1.4 Reproducción

La DAPHNIA pulex tiene dos maneras distintas de reproducción:

Reproducción asexual: se produce por partenogénesis, según la edad y el tipo de

alimentación de la pulga, puede llegar a dar entre 5-6 hasta los 100 ejemplares.

Reproducción sexual: la hembra produce óvulos que luego de ser fertilizados por el macho se

alojan en el epifio (saco que soporta los huevos) y estos son llamados epifios. Los huevos se

producen en grupos de 2 a varios cientos de ellos y una sola hembra es capaz de poner

varios grupos de huevos en cada proceso de muda. El número de huevos partenogenéticos

puede variar de 1 a 300 depende enormemente del tamaño de la hembra y la comida que

ingiera. El desarrollo embrionario de los individuos del suborden cladocera se da antes de

eclosionar, por lo que las larvas son miniaturas de los adultos, algunas veces la larva se

mantiene más tiempo en el interior y no se libera hasta más tarde. Estas variaciones están

ligadas a factores ambientales.



23

2.1.5 Desarrollo

El desarrollo de la DAPHNIA pulex depende de las condiciones ambientales en las que se

encuentren y no por la determinación cromosómica, ya que tanto machos como hembras son

diploides.

En condiciones normales: la población únicamente está formada por hembras que se

reproducen por huevos partenogéneticos (producidos por mitosis, sin fecundar) que

dan nuevas hembras. Los huevos son producidos en paquetes de 2 a cientos de

huevos y cada hembra puede producir varios paquetes ligados a las mudas.

En condiciones de estrés: las hembras producen huevos haploides por meiosis y a su

vez los huevos que hay en el medio en vez de reproducir hembras, reproducen

machos, posteriormente los machos forman esperma por meiosis el cual fecundara los

huevos, generando otra clase de huevos (efidios) que entran inmediatamente en un

estado de diapausa en el que pueden estar años.

2.1.6 Condiciones ambientales

Las condiciones ambientales son de vital importancia ya que hay que tener un estándar para

obtener veracidad en los resultados obtenidos. (Ver tabla 2: Condiciones ideales para la

evolución del cultivo de DAPHNIA pulex).



24

Tabla 2: Condiciones ambientales

Temperatura 20C 2C

Calidad de luz Fluorescente

Intensidad luminosa

600 – 1000 lux (luz blanca fría) en la superficie

Fotoperiodo 16 horas luz y 8 horas oscuridad

Alimentación Cultivos puros de Selenastrum Capricornutum.

Dosis de alimento

El alimento es diario y la cantidad suministrada se calcula de la siguiente manera: V = A*B / C Donde: V = volumen a ser adicionado A = número de organismos B = número de células por Daphnia C = densidad celular de la suspensión algar

Densidad poblacional

No mayor a 22 individuos / 2L

Limpieza

Diariamente se debe retirar las (mudas) y los restos que se encuentren en el fondo de los recipientes. Todos los viernes se cambia el agua de los acuarios los cuales deben lavarse con una esponja o un paño de tela, enjuagar varias veces con agua des ionizada. No se debe emplear jabón ni otros detergentes.

Recolección neonatos

Diariamente se retiran con una micro pipeta Pasteur de plástico, con una abertura lo suficientemente ancha para no ocasionar daños a los neonatos.


2.2 BIOENSAYO

Es una herramienta que se utiliza en eco-toxicología con la que se estudia el efecto y destino

de los contaminantes antropogénicos tóxicos en ecosistemas acuáticos y terrestres, a través

de mediciones experimentales en condiciones controladas en el laboratorio.



25

Los ensayos de toxicidad están definidos con el objeto de evaluar y reconocer la reacción que

puede producir sobre organismos vivos una sustancia altamente toxica en un periodo

determinado, permitiendo establecer la respuesta de un organismo a cambio específicos en

su hábitat, lo que hace de este método una opción para determinar los límites de tolerancia de

diferentes sustancias de interés sanitario y evaluar los efectos potenciales e impactos en los

cuerpos de agua, biota acuática y ecosistemas presentes.

Existen ciertas características de los ensayos de toxicidad con organismos. Según la EPA

(1999), son:

Suministran información sobre los posibles efectos y probable deterioro de los

ecosistemas acuáticos.

Su predicción es alta cuando en el ambiente acuático existen descargas con altas

magnitudes de toxicidad.

Se han entregado concentraciones confiables para muchas sustancias altamente

toxicas que causan efectos de bio-acumulación en ecosistemas acuáticos.

Proveen resultados confiables por estar altamente estandarizados con alta calidad y

específica, controles, réplicas y comparaciones con otros bioensayos.

Proporcionan una anticipada señal de alerta para minimizar impactos negativos y tomar

medidas sobre ella.

Al ser interpretados en forma rápida y a corto plazo, permiten la acumulación de dosis –

respuesta, caracterizando las aguas residuales o sistemas ambientales.

Al encontrar la relación dosis-respuesta, se puede establecer una curva de toxicidad que

permita un análisis estadístico de los resultados para así obtener la concentración letal media

(CL50) de los organismos prueba, expresada en parte por millón.



26

Cuando se implementan las pruebas de toxicidad, se debe realizar la estandarización de

estas, en la cual establece la sensibilidad de las especies y su secuencia de efectos frente a

un toxico de referencia, según las repeticiones del experimento. Con esto se certifica que la

respuesta de la población en estudio se debe al efecto del toxico de referencia y no a las

variaciones de sensibilidad de los organismos o a fallas operacionales en la aplicación del

método, lo que permite elaborar cartas de vigilancia, teniendo en cuenta la precisión y

exactitud qué se debe y puede obtenerse en los resultados generados por un determinado

bioensayo.

Este tóxico de referencia debe cumplir con las siguientes características:

Amplio espectro toxico

Facilidad de obtención en forma pura

Alta solubilidad e agua

Persistencia y estabilidad en solución

Facilidad de acumulación

2.2.1 Tipos de bioensayo

2.2.1.1 Según su duración

a) Agudos (Corto plazo: minutos, horas): efecto adverso (letal o subletal) inducido sobre

los organismos de ensayo en prueba durante un periodo de exposición del material de

ensayo, usualmente de pocos días.

b) Crónicos: efectos tóxicos a largo plazo (días, semanas), que pueden mantenerse en

alrededor de la décima parte de la vida media de la especie. Están relacionados con

cambios en el metabolismo, crecimiento o capacidad de supervivencia (muerte y

reducción de la capacidad reproductora).



27

2.2.1.2 Según su renovación del medio

a) Estáticos: Ensayo de toxicidad durante el cual no hay renovación de la solución de

ensayo (las soluciones no se renuevan durante todo el ensayo).

b) Semiestático: Ensayo sin renovación continua de la solución de ensayo, pero con

renovación periódica, de las soluciones de ensayo después de períodos prolongados

(por ejemplo, cada 48 horas).

c) Dinámico: Ensayo de toxicidad durante el cual se va renovando constantemente el

agua de los recipientes de ensayo.

2.2.1.3 Según su Escala / Lugar de realización

a) Ensayos de Laboratorio: se realiza con un número reducido de especies y en

condiciones estandarizadas que reproducen sólo en forma muy parcial las condiciones

naturales en el ambiente, basados en métodos y protocolos normalizados y con

organismos de ensayo.

b) Microcosmos: imita estructura y funciones del ecosistema, a escala de laboratorio.

c) Mesocosmos: aislamiento de una parte del espacio natural o réplica del mismo.

d) Estudios de Campo: son “encierros” sometidos a las condiciones del medio

(condiciones no controladas), mayor variabilidad.

2.2.2 Toxicidad

Capacidad o grado de efectividad de una sustancia para producir un efecto nocivo sobre los

organismos.



28

2.2.3 Pruebas de toxicidad

Involucra un agente o estimulo (un pesticida, un metal pesado o una muestra ambiental con

contaminantes químicos), el cual se aplica a un organismo o grupo de organismos. La

magnitud del estímulo o dosis puede medirse como un peso, un volumen o una

concentración.1

2.2.4 Tóxicos de referencia

Compuesto químico, orgánico o inorgánico utilizado en pruebas de toxicidad con fines de

control de calidad analítica de los organismos a utilizar en las pruebas. Algunos toxicos de

referencia son: Cloruro de sodio (NaCl), Cloruro de potasio (KCl). Cloruro de cadmio (CdCl2),

Sulfato de cobre (CuSO4), Dicromato de potasio (K2Cr2O7) entre otros, dependiendo de la

especie de prueba.

2.3 SUSTANCIAS DE PRUEBA

Las sustancias de prueba establecidas para este proyecto de investigación, fueron Arsénico y

Litio, sustancias de interés sanitario las cuales pueden causar daños, ser tóxicas para la salud

humana o cualquier forma de vida acuática.

2.3.1 Arsénico (As)

Elemento químico, cuyo símbolo es As y su número atómico, 33. El arsénico se encuentra

distribuido ampliamente en la naturaleza, se encuentra natural como mineral de cobalto,

aunque por lo general está en la superficie de las rocas combinado con azufre o metales

como Mn, Fe, Co, Ni, Ag o Sn.

1 CASTILLO, Gabriela. ENSAYOS TOXICOLÓGICOS Y MÉTODOS DE EVALUACIÓN DE CALIDAD DE AGUAS. Pág. 100, 101



29

El Arsénico es uno de los elementos más tóxicos que pueden ser encontrados, los enlaces

de Arsénico inorgánico ocurren en la tierra naturalmente en pequeñas cantidades.

Encontramos algunos usos como lo son:2

El arsénico se usa en grandes cantidades en la fabricación de vidrio para eliminar el

color verde causado por las impurezas de compuestos de hierro.

A veces se añade al plomo para endurecerlo.

Se usa en la fabricación de gases venenosos militares como la Lewisita y la Adamsita.

2.3.1.1 Efectos ambientales

El Arsénico es un componente que es extremadamente duro de convertir en productos

solubles en agua o volátil.

El Arsénico es mayoritariamente emitido por las industrias productoras de cobre, pero

también durante la producción de plomo y zinc y en la agricultura; este no puede ser

destruido una vez que este ha entrado en el Ambiente, así que las cantidades que

hemos añadido pueden esparcirse y causar efectos sobre la salud de los humanos y

los animales en muchas localizaciones sobre la tierra.

Las plantas absorben Arsénico bastante fácil, así que alto rango de concentraciones

pueden estar presentes en la comida.

Las concentraciones del Arsénico inorgánico que está actualmente presente en las

aguas superficiales aumentan las posibilidades de alterar el material genético de los

peces. (Ver Tabla3: Fuentes de exposición)

2 http://redescolar.ilce.edu.mx/redescolar/publicaciones/publi_rocas/arsenico.htm



30

Tabla 3: Fuentes de exposición

Compuestos Inorgánicos

Trivalentes Tricloruro de As Industria cerámica

Trióxido de As Purificación de gases sintéticos

Arsénico cálcico Insecticidas

Pentavalentes Acido As Fabricación de vidrio

Pentoxido de As Herbicida, conservante de madera

Arseniato cálcico Insecticidas

Compuestos Orgánicos

Ac. Cacodilico Herbicida y defoliante

Ac. Arsanilico Cebo para saltamontes

Gas Arsina Fundiciones, refinación y aleación de metales no ferrosos


2.3.1.2 Efectos en la salud

La exposición al Arsénico inorgánico puede causar varios efectos sobre la salud:

Irritación del estómago e intestinos.

Disminución en la producción de glóbulos rojos y blancos.

Cambios en la piel, e irritación de los pulmones.

Es sugerido que la toma de significantes cantidades de Arsénico inorgánico puede intensificar

las posibilidades de desarrollar cáncer, especialmente las posibilidades de desarrollo de

cáncer de piel, pulmón, hígado, linfa.

En situaciones de exposición aguda se produce un cuadro intestinal con gastroenteritis,

esofagitis, vómitos, diarrea, náuseas, dolor abdominal, pudiendo llegar al shock.



31

A exposiciones muy altas de Arsénico inorgánico puede causar infertilidad, abortos en

mujeres y puede causar perturbación de la piel, pérdida de la resistencia a infecciones,

perturbación en el corazón y daño del cerebro tanto en hombres como en mujeres.

Dosis letal:

As+5: 5 a 50 mg/Kg

As+3: <5 mg/Kg

As+3: Ingerido 10 a 300 mg.

Arsina: 250 ppm (instantanea)

Arsina: 25 a 50 ppm (30 min)

Arsina: 10 ppm (prolongada)

Compuestos organicos: 0,1 a 0,5 g/Kg

2.3.2 Litio (Li)

El litio es un metal alcalino, sólido, blando, bajo punto de fusión y reactivo. Entre las

propiedades físicas más notables está su alto calor específico (capacidad calorífica) y es

insoluble en los hidrocarburos.

Entre las propiedades químicas más importantes de este metal se resalta que es

electropositivo frente a los agentes químicos, tiene un alto poder polarizante con lo que tiende

a solvatarse.

El litio experimenta muchas reacciones ya sea con reactivos orgánicos y/o inorgánicos;

reacciona con el oxígeno para formar monóxido y peróxido. Es el único metal alcalino que

reacciona con el nitrógeno a temperatura ambiente para producir un nitruro, el cual es de color

negro.



32

El litio reacciona en forma directa con el carbono para producir el carburo. Se combina

fácilmente con los halógenos y forma halogenuros con emisión de luz; su calentamiento

provoca combustión violenta, vapores tóxicos y adquiere un color blanco brillante, igualmente

puede arder espontáneamente en contacto con al aire al dispersarse en finas partículas

además reacciona fuertemente con arena, cemento, asbestos, halógenos.

La reacción con el agua es violenta formando de los mismos vapores corrosivos y gas

hidrógeno altamente inflamable.

Encontramos algunos usos como lo son:

Espesante para grasas lubricantes.

El litio empezó hace 70 años como un experimento de laboratorio, utilizado en la

batería de acumulación inventada por Thomas Edison y posteriormente tuvo gran

empleo como ingrediente para dar sabor a bebidas gaseosas.

Aditivo para alargar la vida y el rendimiento en acumuladores alcalinos, en soldadura

autógena y soldadura para latón.

Los minerales de litio se usan en la fabricación de esmaltes, loza, porcelana, sanitarios,

vidrios y envases.

2.3.2.1 Efectos ambientales

El litio no supone amenaza para la fauna y la flora, ni los medios acuáticos; sin embargo las

plantas lo absorben fácilmente ya que el mismo estimula su crecimiento, pero en altas

concentraciones puede llegar a ser tóxico, de lo anterior se puede decir que las plantas se

convierten en un indicador de altas concentraciones de litio en el suelo.

El hidróxido de Litio representa un peligro potencialmente significativo debido a que es

extremadamente corrosivo y se debe prestar especial atención a los organismos acuáticos.



33

Debido a su baja adsorción, el Litio puede lixiviarse fácilmente a los acuíferos, por lo que se

ha encontrado en pequeñas cantidades en diferentes especies de peces; el Litio no es volátil y

por lo tanto sus compuestos se encuentran en el aire dispersos.

Eco toxicidad:

Test EC50 (mg/L): Peces (Li) = 100 mg/l (altamente toxico)

Crustáceos (Daphnia Magna) (Li) = 16 mg/l (extremadamente toxico)

Plantas (Li) = 0,2 mg/l (extremadamente toxico)

Otro efecto potencialmente alto es la inadecuada disposición de las baterías de litio, ya que

están compuestas por materiales altamente corrosivos, inflamables, radiactivos y tóxicos. Y

pueden generan graves dificultades al medio ambiente, afectando a especies animales así

como a cuerpos de agua cercanos que puedan ser afectados por la lixiviación de estos

compuestos.

2.3.2.2 Efectos en la salud

El litio no presenta uso biológico conocido, no es absorbido fácilmente por el cuerpo humano y

este contiene aproximadamente 7 mg. Aunque el litio no es un elemento esencial, influye en el

metabolismo; el consumo oral puede ser medianamente tóxico.

La tolerancia física difiere de un organismo a otro, en los años 40 algunos pacientes que

utilizaron cloruro de litio como sustituto de la sal, murieron.

El carbonato de litio se aplica en psiquiatría en dosis bastante próximas al máximo nivel de

ingestión; usando concentraciones de 10 mg/L en sangre se presenta un envenenamiento

parcial, con 15 mg/L aparecen síntomas como confusiones y debilitación de la capacidad de

expresión y a 20 mg/L aparece riesgo de muerte.



34

El contacto con el litio, como con otros metales alcalinos, da lugar a la formación de ampollas.

La ingestión causa calambres abdominales, sensación de quemadura, náuseas, shock, vómito

y mucha debilidad. La sustancia puede ser absorbida por el cuerpo por inhalación llegando a

causar edema pulmonar que se manifiesta después de unas horas y es agravado por el

esfuerzo físico, igualmente el litio es altamente corrosivo si es ingerido.

2.4 MÉTODOS ESTADÍSTICOS PARA ANÁLISIS DE PRUEBAS DE TOXICIDAD

La estadística es básica para la proyección, la ejecución, el análisis y la interpretación de los

resultados de las pruebas de toxicidad; sin embargo una parte primordial es la relación entre

la concentración de un compuesto químico a la cual se expone un organismo (Daphnia pulex)

y el efecto nocivo que le produce; esta relación, es llamada como la relación dosis-respuesta,

y el indicador más utilizado es la muerte del organismo de prueba.

2.4.1 Método Probit (Paramétrico)

Probit es un método que consiste en la aplicación de correlaciones estadísticas para estimar

las consecuencias desfavorables sobre una población.3

Está basado en la cuantificación probabilística de la vulnerabilidad ante efectos físicos de una

magnitud determinada; se expresa como el número de individuos que pueden resultar

afectados con un cierto nivel de daño. Para el cálculo de los CL50 generalmente se usa el

análisis Probit (con o sin ajuste), en pruebas de toxicidad aguda se tiene la siguiente situación:

= 100

3GRUPO DE INVESTIGACIÓN ANALÍTICA DE RIESGO. (Disponible en internet). En línea

<http://www.unizar.es/guiar/1/Accident/An_conse/Probit.htm>

http://www.unizar.es/guiar/1/Accident/An_conse/Probit.htm



35

Donde:

Concentración de la sustancia o dosis (d).

Número de individuos (n).

Número de organismos muertos o afectados (r).

Porcentaje de efecto (p).

La representación gráfica de p vs. d, (relación dosis-respuesta), genera una curva parabólica

que muchas veces presenta dificultades en la construcción de un modelo lineal. Una forma de

abordar este problema es transformando d a una escala logarítmica (X = log10 (d), lo cual

mostrará una relación dosis-respuesta de forma S o sigmoidea; de esta manera la distribución

de p vs. X será de tipo normal.

Posteriormente, mediante las tablas de Probit se transforma p (porcentaje de efecto) a

unidades Probit (buscando en una tabla de distribución normal el valor de z correspondiente a

una probabilidad acumulada igual a p y sumándole a continuación cinco unidades), se obtiene

una distribución de puntos en un sistema bivariado de tipo lineal, los cuales se procesan

según un análisis de regresión típico

Vale la pena enfatizar que el Probit es una transformación sobre la tasa de efecto (p), y la

ecuación generada es de la forma:

= a+ x

Donde:

(expresado en unidades Probit) = +5

= variable normal estándar = 0 tal que la Prob ≤ 0 =

(estimadores de los parámetros de la recta de regresión)

p = 50% entonces y = 5, por lo tanto:

X = log10 CL50, entonces CL50 = 10*5



36

El procedimiento Probit permite encontrar estimadores m-verosímiles de parámetros de

regresión y de tasas naturales (por ejemplo, tasas de mortalidad) de respuesta para ensayos

biológicos, analizando porcentajes de efecto vs dosis dentro del marco de la regresión.

2.4.5 Análisis de varianza (ANOVA)

Es una compilación de modelos estadísticos y procedimientos asociados; está diseñado para

comparar los resultados obtenidos contra un control (tratamiento con dosis cero).

Para este tipo de análisis se requiere que el número de réplicas por ensayo sea superior a

tres y que todos los ensayos tengan el mismo número de réplicas; de lo contrario no será

representativo. Se inicia postulando una hipótesis nula y una hipótesis alterna para la

realización, como se muestra a continuación:

Ho: Las diferentes concentraciones producen el mismo efecto en todos los organismos.

H1: Las diferentes concentraciones producen un diferente efecto en todos los organismos.

Para el análisis del resultado se debe tener en cuenta la siguiente condición:

Fc> Ft: se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alternativa.

Fc< Ft: se acepta la hipótesis nula y se rechaza la hipótesis alternativa.

Lo que pretende el Análisis de Varianza es obtener las estimaciones de los parámetros para

relacionar las variables y posteriormente utilizarlo para determinar los valores de la

concentración del tóxico que causa un grado de efecto sobre los organismos expuestos.



37

2.5 INDUSTRIA

Se realizó un muestreo puntual al vertimiento residual doméstico, el cual fue llevado al

laboratorio de bioensayos de la Universidad de la Salle, donde se adiciono una cantidad de

Arsénico para simular el vertimiento de una industria tipo.

Este vertimiento compartía los mismos controles del agua reconstituida, para verificar que el

agua tuviera los mismos parámetros estandarizados en cuanto a oxígeno disuelto,

temperatura y pH; posteriormente se empleó para determinar el porcentaje de organismos

muertos por la acción toxica del vertimiento el cual se transformó a unidades Probit, esta

transformación permitió el ajuste a una línea de regresión, en la cual la concentración

perteneciente al probit, corresponde a la cantidad de sustancia capaz de generar la muerte a

la mitad de la población en un tiempo de exposición de 48 horas.



38

3. METODOLOGÍA

En este proyecto de investigación se efectuó una metodología de diseño experimental basada

en la recolección de datos, en los resultados de los efectos tóxicos y en los cambios

producidos por sustancias de interés sanitario que causan una problemática ambiental en los

ecosistemas acuáticos.

La metodología está compuesta por cuatro (4) fases, la primera es la fase de preparación

donde se elaboran los medios para desarrollar la investigación, la segunda fase es donde se

aclimatan, se alimentan y se les realiza el mantenimiento al cultivo; la tercera fase es para

pruebas toxicológicas donde se realizan las pruebas de sensibilidad, las pruebas preliminares

y definitivas con Arsénico y Litio donde se exponen las Daphnia pulex a diferentes

concentraciones y la fase cuatro es la de resultados donde se determina la concentración letal

media (CL50-48).

A continuación se presenta el Diagrama 2: Metodología utilizada para la determinación de la

concentración letal media de Arsénico (As) y Litio (Li) sobre organismos Daphnia pulex.



39

Ilustración 2: Metodología para la determinación del CL50


3.1 FASE I: PREPARACIÓN

3.1.1 Preparación del agua reconstituida

El agua reconstituida se realizó según la metodología CETESB, protocolo L5.017 y Escobar

Malaver, simulando las condiciones de sales disueltas encontradas en el hábitat natural.

El agua fue preparada con los siguientes reactivos:



40

10g/L de NaHCO3,

13,5g/L de CaCL2,

10g/L de KCl,

20,5 g/L de MgSO4 7H2O.

Una vez preparada el agua reconstituida, se oxigeno por un período de 48 horas antes de

adicionar los organismos de prueba Daphnia pulex. (Ver ilustracion3: Agua reconstituida)

Ilustración 3: Agua reconstituida

Fuente: Los autores.2011

Los materiales que se emplearon durante la preparación de agua reconstituida fueron los

siguientes:

Probeta de 500 ml.

Acuario de 30 Litros.

Aireadores mecánicos de una salida.

Material de cubierta, para cubrir la parte superior de los acuarios con el fin de mantener

el agua libre de partículas.



41

Para garantizar estas condiciones se controlaron los siguientes parámetros (Ver tabla 4:

Control de Parámetros)

Tabla 4: Control de Parámetros

PARÁMETRO VALOR

Temperatura 20ºC +/- 2ºC

Oxígeno Disuelto > 6.0 mg/L

pH 7.0 – 8.0 unidades

Dureza 160- 180 mg/L (CaCO3 /L)


Ensayo de viabilidad: se pusieron algunos organismos en el agua reconstituida por un

tiempo de 24 horas, determinando el porcentaje de mortalidad menor al 10%, si se supera

este porcentaje se descarta el agua reconstituida y se procede a preparar una nueva con las

anteriores características.

3.1.2 Preparación del medio Bristol y centrifugación de algas verdes

Uno de los medios más utilizados para cultivar es el medio Bristol, el cual busca multiplicar las

algas verdes en condiciones estandarizadas por medio de la fotosíntesis, con ayuda de las

lámparas luminiscentes y nutrientes.

Para la preparación del medio Bristol se utilizaron las siguientes soluciones de macro y

micronutrientes. (Ver tabla 5: Compuestos para preparación de medio bristol).



42

Tabla 5: Compuestos para preparación de Medio Bristol

COMPUESTOS STOCK ml (stock) * L (agua)

NaNO3 25 gr/L 10

CaCl2 .2H2O 2.5 gr/L 10

MgSO4.7H2O 7.5 gr/L 10

K2HPO4 7.5 gr/L 10

NaCl 2.5 gr/L 10

KH2PO4 17.5 gr/L 10

KOH 15.5 gr/500 ml 1

EDTA 25.0 gr/500 ml 1

FeSO4. 7H2O 2.49 gr/500 ml 1

H2SO4 0.05 gr/500 ml 1

H3BO3 5.71 gr/500 ml 1

SOLUCIONES DE ELEMENTOS TRAZA

ZnSO4. 7H2O 4.41 gr/500ml

1 ml de stock combinado

MnCl2. 4H2O 0.72 gr/500ml

MoO3 0.355gr/500ml

CuSO4. 5H2O 0.785 gr/500ml

Co (NO3)2. 6H2O 0.245 gr/500ml

CoCl2. 6H2O 0.174 gr/500ml

Fuente: Escobar Malaver Pedro Miguel. Determinación de la toxicidad aguda de los detergentes mediante

sistemas estáticos, utilizando DAPHNIA pulex. Unisalle.

Para la preparación se siguieron las siguientes indicaciones:

a) Adicionar los volúmenes indicados en la tabla 5.

b) Completar el volumen de la probeta (1L).

c) Llevar la solución preparada a la autoclave a una presión de 15 PSI y 250 °F, por un

tiempo de quince (15) minutos.

d) Sacar de la autoclave y se dejar enfriar a temperatura ambiente.

e) Agregar dos (2) ml del alga concentrada. (Ver ilustración 4: Preparación medio Bristol)



43

Ilustración 4: Preparación Medio Bristol


f) Por un período de 15 días, dejar prendida una lámpara luminiscente durante 24 horas y

oxigenar para su constante movimiento y garantizar el proceso de fotosíntesis.

g) Centrifugar a 2000 rpm por un tiempo de diez (10) minutos, para evitar la ruptura de los

tubos de ensayo y asegurar el concentrado de las algas. (Ver ilustración 5:

Centrifugacion)

h) Refrigerar y rotular con la fecha de preparación y centrifugación

Ilustración 5: Centrifugación




44

3.1.3 Conteo de algas verdes

La cantidad de alimento necesaria se calcula, mediante una herramienta científica

denominada cámara de Neubauer, la cual se utiliza para realizar el conteo de células en una

cantidad fija de líquido, la cámara cuenta con una profundidad de 0.1 mm.

La cuadrícula de recuento muestra 9 cuadros grandes, cada uno de un (1) mm2; los cuatro

cuadrados grandes de las esquinas señalados con una L están en 16 cuadrados con aristas

de 0.25 mm y el cuadrado grande central está dividido en 25 cuadrados medianos; este

procedimiento se encuentra establecido en el protocolo LB03 “Conteo de Algas con la Cámara

Neubauer”, donde se describen los pasos a seguir para el desarrollo del mismo. (Ver

ilustración 6: Cámara Neubauer).

Este protocolo hace parte del proyecto de investigación de bioensayos y se encuentra en los

archivos del laboratorio de Bioensayos de la Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria,

para su consulta.



45

Ilustración 6: Cámara Neubauer

Fuente: CASTILLO, Gabriella. Ensayos Toxicológicos y Métodos de Evaluación de Calidad de Aguas.

Estandarización, Intercalibración, Resultados y Aplicaciones. pag. 91



46

3.2 FASE II: ACONDICIONAMIENTO

3.2.1 Aclimatación de los organismos de prueba

La aclimatación del medio para Daphnia pulex, se realizó con el fin de brindarle a los neonatos

las condiciones ambientales similares a su hábitat natural para evitar problemas en el

desarrollo y reproducción de la especie cultivada. (Ver ilustración 7: Baterías de ensayo)

Ilustración 7: Baterías de ensayo


Se introdujeron los organismos en cada pecera con agua reconstituida y se monitorearon las

condiciones ambientales ideales para conservar su aclimatación y posteriormente se inició la

frecuencia de alimentación. (Ver Tabla 6: Condiciones ideales de cultivo)



47

Tabla 6: Condiciones ideales del cultivo

Temperatura 20C 2C

pH 7.0 – 8.0 unidades

Dureza 160- 180 mg/L (CaCO3 /L)

Oxígeno disuelto > 6.0 mg/L

Calidad de luz Fluorescente

Intensidad luminosa Luz blanca fría (en la superficie)

Fotoperiodo 16 horas luz y 8 horas oscuridad

Densidad poblacional No mayor a 22 individuos / 2L

Fuente: los autores. 2011

3.2.2 Alimentación de los organismos de prueba

El cultivo de Daphnia pulex se alimentó con un concentrado de algas verdes, compuesto por

Scenedesmus y Chlorella, las cuales fueron cultivadas en el laboratorio mediante el montaje

del medio Bristol descrito anteriormente. La frecuencia de alimentación son los días lunes,

miércoles y viernes de cada semana.

3.2.3 Mantenimiento del cultivo

El mantenimiento del cultivo de los organismos Daphnia Pulex, se realizó según la

metodología CETESB (L5.018), para conservar un cultivo masivo de 4 edades. Los cultivos se

mantuvieron en peceras de 2 litros de agua reconstituida con 20 individuos en cada una de

ellas, manejando la relación de 1/100 (1 individuo por cada 100ml de agua), con el fin de

establecer el escenario óptimo para el crecimiento, alimentación y reproducción de los

individuos. (Ver ilustración 8: Mantenimiento de cultivo)



48

Ilustración 8: Mantenimiento del cultivo


El cultivo se renovaba de acuerdo al ciclo reproductivo conservándose en las etapas óptimas

de reproducción, manteniéndolas en peceras separados por edad desde 0 – 1 semana hasta

cuatro semanas, manteniendo la posibilidad de usar neonatos del primero al cuarto parto,

donde su etapa reproductiva es la más alta y eliminando cualquier alteración como:

Falta de oxígeno

Presencia de efipidos (machos)

Residuos que puedan causar mortandad

Falta de alimentación

El cultivo se manejó en 4 peceras por semana obteniendo 16 peceras en el mes con un total

de 320 organismos cultivados. Hasta obtener organismos de quinta generación. (Ver

ilustración 9: Separación y mantenimiento de organismos)



49

Ilustración 9: Separación y mantenimiento de organismos

Fuente: Escobar Malaver Pedro Miguel.

Para el mantenimiento del Cultivo se usó el protocolo LB004, este documento hace parte del

proyecto de investigación de los profesores Pedro Miguel Escobar Malaver, Yanneth Parra y

Rubén Darío Londoño y se encuentra en los archivos del laboratorio de Bioensayos de la

Facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria, para su consulta.



50

3.2.4 Separación de los organismos de prueba

La separación de los organismos se realizó todos los días, con ayuda de una pipeta Pasteur

de plástico de 3 mililitros, con ella se extraían los neonatos de 6 a 24 horas de nacidos.

La obtención de neonatos se utilizaba para la nueva generación de los cultivos, pruebas de

viabilidad, pruebas de sensibilidad, pruebas preliminares y definitivas de toxicidad con

Arsénico y Litio.

3.2.5 Limpieza y Recolección de neonatos

Diariamente se retiran las (mudas) y los restos que se encuentren en el fondo de los

recipientes. Todos los viernes se cambia el agua reconstituida de los acuarios los cuales

deben lavarse con una esponja o un paño de tela, enjuagar varias veces con agua des

ionizada; sin usar ningún tipo de jabón ni otros detergentes.

Diariamente se retiran con una micro pipeta Pasteur de plástico, con una abertura lo

suficientemente ancha para no ocasionar daños a los neonatos.

3.3 FASE III: PRUEBAS DE TOXICIDAD

3.3.1 Montaje del ensayo toxicológico

En las pruebas de toxicidad se emplearon organismos Daphnia pulex, con un tamaño

aproximado entre 0,2 y 0,5 milímetros.

Se usaron 24 copas plásticas; distribuidas por filas de 4 copas; la primera fila de la batería fue

utilizada para el blanco o control y cada una de las filas restantes representaba una

concentración diferente de menor a mayor, expresada en ppm con Dicromato de potasio

(K2Cr2O7), Arsénico (As) y Litio (Li), con el fin de determinar el rango de la (CL50-48). (Ver

ilustración 10: Montaje Toxicológico)



51

Ilustración 10: Montaje Toxicológico

Fuente; Los autores.2011

Teniendo lista la batería de ensayos se procedió adicionando 10 mililitros de cada una de las

concentraciones a evaluar en cada copa plástica y sus respectivos controles.

La batería de ensayo se cubre totalmente con un plástico negro y papel craff, y se guarda en

el área de mantenimiento de cultivos a una temperatura de 20± 2 °C, sin luz y por un periodo

de 48 horas. (Ver ilustración 11: Batería de ensayo cubierta)

Posteriormente con una lámpara, se realizó la lectura de los organismos muertos en cada

copa.

Ilustración 11: Batería de ensayo cubierta




52

3.3.2 Preparación de las soluciones con Dicromato de Potasio

Las soluciones para todas las pruebas de toxicidad fueron preparadas con agua reconstituida,

cada una con un volumen de 500 ml, las cuales se mantuvieron preservadas en refrigerador.

Antes de la realización de los ensayos de toxicidad, las soluciones preparadas fueron

aclimatadas durante un período de 3 horas, para evitar la mortalidad de los organismos de

prueba Daphnia pulex debido a un cambio brusco de temperatura.

Posteriormente se realizaron 20 ensayos con Dicromato de potasio (toxico de referencia)

donde se obtuvo el intervalo de concentración intermedio entre los valores del 0 y 100% de

mortalidad.

3.3.3 Pruebas con Dicromato de Potasio

Para la realización de las pruebas de sensibilidad se preparó la solución madre, esta solución

fue preparada tomando 1 gr de dicromato de potasio en 1L de agua destilada, lo que nos llevó

a una concentración de 1000 ppm.

Posteriormente se prepararon cinco concentraciones (0,1 - 0,2 - 0,3 - 0,4 y 0,5) ppm y un

blanco o control (agua reconstituida), cada uno de ellos por cuadruplicado.

La prueba se inició en el momento de agregar 20 organismos Daphnia pulex por

concentración distribuidos cada uno en cinco (5) neonatos por cada una de las copas,

utilizándose un total de 120 organismos por batería de ensayo, en un tiempo de exposición de

48 horas.

Esta prueba tiene el propósito de garantizar la veracidad y confiabilidad de los datos

obtenidos, en relación a la capacidad de respuesta de los organismos de prueba.



53

3.3.4 Preparación de las soluciones con Arsénico y Litio

Para la preparación de las soluciones madre se utilizó el ARSÉNICO y el LITIO, para

preparar una solución de 1000 ppm se tuvo en cuenta el peso molecular y se calculó cuánto

compuesto se necesitaba respectivamente.

Las concentraciones preliminares fueron preparadas teniendo en cuenta investigaciones

anteriores y la normatividad vigente Decreto 3930 de 2010, se realizan las pruebas por

cuadruplicado, se determina el % de mortalidad y de acuerdo a los resultados se procede a

aumentar o disminuir dichas concentraciones.

Posteriormente se determinó el volumen de la solución necesaria para obtener las

concentraciones. (Ver ilustración 12: Preparación de soluciones).

Ilustración 12: Diagrama preparación de soluciones




54

3.3.5 Pruebas con Arsénico y Litio

Para la determinación de la CL50-48 se realizaron 20 pruebas para cada sustancia a prueba

divididas en 10 pruebas preliminares y 10 pruebas definitivas.

Para la realización de las pruebas toxicológicas se preparó la solución madre, esta solución

fue preparada tomando 1 gr de Arsénico / Litio respectivamente en 1L de agua destilada, lo

que nos llevó a una concentración de 1000 ppm; posteriormente se prepararon cinco

concentraciones (ppm) y un blanco o control (agua reconstituida), cada uno de ellos por

cuadruplicado.

La prueba se inició en el momento de agregar 20 organismos Daphnia pulex por

concentración distribuidos cada uno en cinco (5) neonatos por cada una de las copas,

utilizándose un total de 120 organismos por batería de ensayo, en un tiempo de exposición de

48 horas.

Esta prueba tiene el propósito de garantizar la veracidad y confiabilidad de los datos

obtenidos, en relación a la capacidad de respuesta de los organismos de prueba.

Para la obtención de la CL50-48 del Arsénico y el Litio en los organismos Daphnia pulex se

tuvieron en cuenta diferentes concentraciones de los contaminantes para finalmente hallar en

las que se mueren la mitad de los mismos; los datos obtenidos fueron tabulados en el formato

establecido y graficados para su análisis.

3.3.6 Determinaciones físico químicas del vertimiento

Se efectuaron cinco pruebas fisicoquímicas del vertimiento determinando: oxígeno disuelto,

dureza, conductividad, pH, temperatura, DQO y Arsénico, efectuadas en una sola línea de

concentración con sus cuatro replicas y un control.



55

3.4 FASE IV. RESULTADOS

Una vez finalizada cada prueba se analiza la confiabilidad de los resultados, teniendo en

cuenta que a medida que aumenta la concentración debe aumentar el porcentaje de

mortalidad, si no es así, se descarta la prueba y se realiza nuevamente, para verificar que las

condiciones son normales y no se hayan sido afectadas por factores externos.

3.4.1 Aceptabilidad de los resultados

Los resultados de las pruebas definitivas fueron considerados válidos dentro de las siguientes

condiciones:

La concentración de oxígeno disuelto en las soluciones debe ser mayor o igual al 60%.

La sensibilidad del grupo ensayado se hallará dentro de +/- 2DS respecto del valor

medio para el tóxico de referencia para la misma especie test.



56

4. OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

Para el desarrollo y análisis de las pruebas de toxicidad con Dicromato de Potasio (tóxico de

referencia), Arsénico y Litio sobre organismos Daphnia pulex, se implementó la metodología

ya establecida CETESB (Brasil), la cual se ha venido trabajando por los grupos de

investigación de Bioensayos del Programa de Ingeniería Ambiental y Sanitaria de la

Universidad de La Salle.

A continuación se muestran los resultados obtenidos, utilizando los métodos de análisis

estadísticos: Probit y ANOVA, de acuerdo a la metodología anteriormente descrita.

4.1 PRUEBAS TOXICOLÓGICAS CON DICROMATO DE POTASIO

4.1.1 Análisis Probit para las pruebas de sensibilidad con Dicromato de potasio

Con el fin de determinar la Concentración Letal Media CL50-48 de la prueba de sensibilidad con

Dicromato de Potasio K2Cr2O7 para Daphnia pulex, se utilizó el programa estadístico Probit,

(Ver Anexo M) el cual nos muestra el límite superior y el límite inferior para cada prueba de

toxicidad, con un límite de confianza de 95%.

Las concentraciones utilizadas en las pruebas de toxicidad iniciaron en 0.1 y finalizaron en 0.5

ppm. (Ver anexo A y B): el cual contiene las cartas de control donde se hizo seguimiento a las

muertes de los organismos.

Posteriormente con los valores de la Concentración Letal Media (CL50-48) se elaboró una

tabla de control con las 20 pruebas realizadas, cada una con el valor promedio y los

respectivos límites de confianza. (Ver tabla 7: Control con Dicromato de potasio)



57

Tabla 7: Control pruebas con Dicromato de Potasio

Numero de prueba

CL50-48 mg/L

L. inferior mg/L

L. superior mg/L

1 0,21 0,17 0,24

2 0,20 0,16 0,23

3 0,20 0,16 0,24

4 0,20 0,16 0,24

5 0,19 0,16 0,23

6 0,18 0,14 0,21

7 0,21 0,17 0,24

8 0,19 0,16 0,23

9 0,18 0,14 0,21

10 0,21 0,17 0,25

11 0,21 0,18 0,24

12 0,21 0,17 0,25

13 0,19 0,16 0,22

14 0,20 0,16 0,23

15 0,21 0,17 0,25

16 0,21 0,17 0,25

17 0,19 0,16 0,22

18 0,21 0,17 0,25

19 0,19 0,15 0,22

20 0,22 0,14 0,25


Observando la tabla 7: podemos analizar que los valores de CL50-48 se encuentran en un

rango de (0.18 – 0.22) mg/L y que ningún valor estuvo por debajo del límite inferior ni por

encima del límite superior, dando así veracidad a los resultados obtenidos y demostrando que

los organismos Daphnia pulex siempre presentaron capacidad de respuesta dentro del rango

establecido.



58

Como resultado promedio de las pruebas de sensibilidad sobre organismos Daphnia pulex

con el toxico de referencia (Dicromato de potasio) se determinó. (Ver tabla 8: Resultados de

pruebas con Dicromato de Potasio)

Tabla 8: Resultados pruebas con Dicromato de Potasio

Límite superior 0.24 mg/L

CL50-48 0.20 mg/L

Límite inferior 0.16 mg/L

Fuente: Los autores 2011

El resultado obtenido en esta investigación se comparó con resultados anteriores realizados

por estudiantes de la Universidad de la Salle para contrastar la veracidad de los mismos. (Ver

tabla 9: Resultados de sensibilidad)

Tabla 9: Resultados de sensibilidad con Dicromato de Potasio en investigaciones anteriores

AÑO REFERENCIA CL50-48

2007

Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del Cromo y el Cobre por medio de bioensayos de toxicidad acuática sobre Daphnia pulex.

0.29 mg/L

2007

Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del

Mercurio por medio de bioensayos de toxicidad acuática sobre Daphnia pulex.

0.39 mg/L

2008

Determinación de la concentración letal media (CL50) del Glifosato Roundup 747, por medio de bioensayos de toxicidad acuática sobre Daphnia pulex.

0.29 mg/L

2010 Determinación de CL50-48 de Hierro y Manganeso sobre Daphnia pulex mediante bioensayos de toxicidad acuática.

0.20 mg/L

2011 Determinación de la concentración letal media de Arsénico y

Litio mediante bioensayos de toxicidad sobre el organismo acuático Daphnia Pulex

0.20 mg/L




59

Como se observó en la anterior tabla el resultado arrojado en la presente investigación fue de

(CL50-48= 0.20mg/L) al igual que en la investigación con Hierro y Manganeso; lo que nos indica

que los organismos Daphnia pulex son altamente sensibles a estas sustancias contaminantes.

Sin embargo en otras investigaciónes se pudo observar que el valor más alto fue de 0.39

mg/L utilizando Mercurio, seguido del 0.29 mg/L utilizando Cromo, Cobre y Glifosato Round.

A continuación la gráfica 1 representa la distribución de las sensibilidades de la tabla de

control obtenidas durante el tiempo de las pruebas con Dicromato de Potasio.

Grafica 1: Concentración letal media de sensibilidad con Dicromato de potasio




60

En la gráfica 1 se puede observar la varianza de los resultados de las pruebas de sensibilidad

con el toxico de referencia Dicromato de potasio. Los organismos mostraron una sensibilidad

promedio, sin embrago en la prueba número 20 se puede observar el punto más alto con un

valor de 0,22 mg/L, sin sobrepasar el límite superior, lo que verifica la veracidad de los

resultados obtenidos.

4.1.2 Análisis ANOVA para las pruebas de sensibilidad con Dicromato de potasio

Luego de obtener la concentración letal media (CL50-48) en las pruebas definitivas de

sensibilidad con Dicromato de Potasio, se realizó el análisis de varianza con el fin de validar

los resultados obtenidos por el programa Probit; por lo que se siguió el protocolo LBP04 (Ver

anexo N) “Análisis de varianza”, el cual se encuentra en el laboratorio de bioensayos de la

facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria de la Universidad de la Salle.

A continuación se presenta un ejemplo para realizar el análisis de varianza; en el anexo C se

encuentran las pruebas restantes con el análisis de varianza ANOVA.

.



61

Posteriormente se presentan los resultados del análisis de varianza para las veinte (20)

pruebas con Dicromato de potasio el toxico de referencia. (Ver tabla 10: Resultados análisis

de varianza ANOVA)

Tabla 10: Resultados Análisis de varianza ANOVA para las pruebas de sensibilidad

No. PRUEBA

F CALCULADO

F TEÓRICO

1 41,75

2,77

2 22,36

3 17,14

4 34,63

5 22,84

6 23,42

7 41,75

8 28,07

9 35,93

10 74,57

11 23,64

12 16,37

13 90,44

14 15,48

15 20,62

16 16,91

17 46,96

18 18,10

19 32,97

20 14,30




62

Se puede observar en la tabla 10, que el F calculado es mayor al F teórico, por lo cual se

rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna; es decir que las diferentes

concentraciones producen efectos diferentes en los organismos Daphnia pulex y que a mayor

concentración mayor tasa de mortalidad.

4.2 PRUEBAS DE TOXICIDAD CON ARSÉNICO

4.2.1 Análisis Probit para las pruebas de toxicidad con Arsénico (As)

Para la realización de las pruebas de toxicidad con Arsénico se utilizaron organismos Daphnia

pulex, los cuales fueron expuestos a diferentes concentraciones durante un periodo de 48

horas, ya que está demostrado que en este tiempo la mortalidad se da por la acción del tóxico.

Para demostrar la capacidad de respuesta de los organismos Daphnia pulex al Arsénico se

determinó concentración letal media (CL50-48), primero se usaron cartas de control en las

pruebas preliminares y definitivas y posteriormente se realizó el cálculo por medio del

programa estadístico Probit. (Ver Anexo D y E)

A continuación se presenta las cartas de control utilizadas en las pruebas:

Pruebas preliminares: para estas pruebas se utilizaron concentraciones en los siguientes

rangos (0.001 – 0.01 – 0.1 – 10 – 100 ppm); arrojando un 40% de mortalidad en la

concentración de 0.01, por lo cual las concentraciones definitivas se hicieron con valores

cercanos a este rango.



63

Pruebas definitivas: para estas pruebas se utilizaron concentraciones en los siguientes rangos

(0.01 – 0.03 – 0.05 – 0.07 – 0.1 ppm); arrojando un 50% de mortalidad en la concentración de

0.03, lo cual indica que la concentración letal media corresponde o está muy cerca a este

valor.



64

Posteriormente se presentan los resultados de la concentración letal media (CL50-48) de las

pruebas definitivas con Arsénico. (Ver Tabla11: Tabla de control pruebas definitivas con

Arsénico)

Tabla 11: Tabla de control pruebas definitivas con Arsénico (As)

PRUEBA CL 50-48 mg/L

Límite Inferior

Limite Superior

1 0,022 0,010 0,033

2 0,022 0,011 0,032

3 0,025 0,017 0,033

4 0,025 0,014 0,036

5 0,026 0,016 0,035

6 0,025 0,017 0,033

7 0,024 0,015 0,033

8 0,025 0,016 0,034

9 0,024 0,014 0,034

10 0,025 0,014 0,036


Observando la tabla 11: podemos ver que los valores de CL50-48 se encuentran en un rango de

(0.022 – 0.025) mg/L, sin superar los límites de confianza, confirmando que las pruebas no

presentaron fallas, que los parámetros se controlaron de forma correcta y dando veracidad a

los resultados obtenidos.



65

Como resultado promedio de las pruebas definitivas con arsénico sobre los organismos

Daphnia pulex se determinó. (Ver tabla 12: Resultados de pruebas con Arsenico)

Tabla 12: Resultados de pruebas con Arsénico


CL50-48 0.024 mg/L



El resultado obtenido en esta investigación se comparó con otras investigaciones

internacionales realizadas con los organismos Daphnia pulex. (Ver tabla 13: Antecedentes

internacionales).

Tabla 13: Antecedentes Internacionales

ANTECEDENTES INTERNACIONALES

Bioacumulación y toxicidad de los metales pesados Cr, Cu, Zn, Cd y Hg en Daphnia

pulex de la presa Jose Antonio Alzate, estado de México. Universidad Autónoma del

estado de MEXICO. Facultad De Ingeniería, Centro Interamericano De Recursos Del

Agua. Toluca, México. 2000

Daphnia exilis HERRICK, 1895 (Crustacea: Cladocera). Una especie zooplanctónica

potencialmente utilizable como organismo de prueba en bioensayos de toxicidad aguda

en ambientes tropicales y subtropicales. Fernando Martínez Jerónimo, Jesús Rodríguez

Estrada y Laura Martínez Jerónimo. Laboratorio de Hidrobiología Experimental. Escuela

Nacional de Ciencias Biológicas México 2008.

Determinación de la concentración letal media (CL50-48) del cromo y el cobre por medio

de bioensayos de toxicidad acuática sobre Daphnia Pulex. Orosco Holguin Juliana, Toro

Barbier Angela Maria. Universidad autónoma de Mexico 2007.



66

Bioensayo de toxicidad aguda con Daphnia Pulex (microcrustáceo) y el Bioensayo de

inhibición de crecimiento con Selenastrum Capricornutum (microalga clorófita unicelular),

usando un toxico de referencia. Silva, Jeannette; Torrejón, Guillermo; Bay-Schmith,

Enrique; Larrain, Alberto. Laboratorio de Bioensayos, Depto. de Zoología, Fac. Ciencias

Naturales y Oceanográficas, Universidad de Concepción; Concepción, Chile.2003.


A continuación la gráfica 2 representa la distribución de los resultados obtenidos durante el

tiempo de las pruebas con Arsénico.

Grafica 2: Concentración Letal Media de Arsénico




67

En la gráfica 2 se observa que los valores de concentración letal media de las diez (10)

pruebas definitivas con Arsénico se encuentran dentro del rango de los límites de confianza

(límite inferior de 0.014mg As/L y límite superior de 0.034 mg As/L) determinados con Probit,

lo que permite la validación de los datos y verifica la veracidad de los resultados obtenidos.

4.2.2 Análisis ANOVA para las pruebas de toxicidad con Arsénico (As)

Luego de obtener la concentración letal media (CL50-48) en las pruebas definitivas con

Arsénico, se realizó el análisis de varianza con el fin validar los resultados obtenidos por el

programa Probit; por lo que se siguió el protocolo LBP04 (Ver anexo N) “Análisis de varianza”,

el cual se encuentra en el laboratorio de bioensayos de la facultad de Ingeniería Ambiental y

Sanitaria de la Universidad de la Salle.

A continuación se presentan los resultados del análisis de varianza. (Ver tabla 14: Resultados

análisis de varianza ANOVA) y en el Anexo F se encuentran las pruebas restantes con

ANOVA.



68

Tabla 14: Resultados Análisis de varianza ANOVA para Arsénico

PRUEBA

F CALCULADO

F TEÓRICO

1 16.85

2,77

2 26.57

3 22.95

4 14.35

5 33.53

6 22.95

7 29.11

8 22.23

9 18.73

10 44.73


Debido a que el F calculado es mayor que el F teórico, se rechaza la hipótesis nula (Ho) y se

toma la hipótesis alterna (H1); lo que quiere decir que a diferentes concentraciones se

producen efectos diferentes en los organismos de prueba.

4.3 PRUEBAS DE TOXICIDAD CON LITIO

4.3.1 Análisis Probit para las pruebas de toxicidad con Litio

Para la realización de las pruebas de toxicidad con Litio se utilizaron organismos Daphnia

pulex, los cuales fueron expuestos a diferentes concentraciones durante un periodo de 48

horas, ya que está demostrado que en este tiempo la mortalidad se da por la acción del tóxico.



69

Para demostrar la capacidad de respuesta de los organismos Daphnia pulex al Litio se


pruebas preliminares y definitivas y posteriormente se realizó el cálculo por medio del

programa estadístico Probit (Ver Anexo G y H).

A continuación se presentan las cartas de control utilizadas en las pruebas:

Pruebas preliminares: para estas pruebas se utilizaron concentraciones en los siguientes

rangos (2.0 – 4.0 – 6.0 – 8.0 – 10 ppm); arrojando un 45% de mortalidad en la concentración

de 2.0, por lo cual las concentraciones definitivas se hicieron con valores cercanos a este

rango.

Pruebas definitivas: para estas pruebas se utilizaron concentraciones en los siguientes rangos

(2.0 – 2.5 – 3.0 – 3.5 – 4.0 ppm); arrojando un 50% de mortalidad en la concentración de 3.0

lo cual indica que la concentración letal media corresponde o está muy cerca a este valor.



70

Posteriormente se presentan los resultados de la concentración letal media (CL50-48) de las

pruebas definitivas con Litio. (Ver Tabla 15: Control pruebas definitivas con Litio)

Tabla 15: Tabla de control pruebas definitivas con Litio

Numero pruebas

CL50-96 mg/L

Límite Inferior

Límite Superior

1 2,628 2,202 2,960

2 2,744 2,377 3,075

3 2,632 2,289 2,913

4 2,663 2,314 2,956

5 2,684 2,219 3,060

6 2,819 2,480 3,151

7 2,813 2,466 3,152

8 2,922 2,590 3,287

9 2,695 2,368 2,980

10 2,713 2,344 3,034




71

Como resultado promedio de las pruebas definitivas con Litio sobre los organismos Daphnia

pulex se determinó. (Ver tabla 16: resultados pruebas con Litio)

Tabla 16: Resultados pruebas con Litio


CL50-48 2.731 mg/L




tiempo de las pruebas con Litio.

Grafica 3: Concentración Letal Media de Litio




72

En la gráfica 3 se observa que los valores de concentración letal media de las diez (10)

pruebas definitivas con Litio se encuentran dentro del rango de los límites de confianza (límite

inferior de 2.365 mg Li/L y límite superior de 3.057mg Li/L) determinados con Probit, lo que

permite la validación de los datos y verifica la veracidad de los resultados obtenidos.

4.3.2 Análisis ANOVA para las pruebas de toxicidad Litio (Li)

Luego de obtener la concentración letal media (CL50-48) en las pruebas definitivas con Litio, se

realizó el análisis de varianza con el fin validar los resultados obtenidos por el programa

Probit; por lo que se siguió el protocolo LBP04 (Ver anexo N) “Análisis de varianza”, el cual se

encuentra en el laboratorio de bioensayos de la facultad de Ingeniería Ambiental y Sanitaria

de la Universidad de la Salle.

A continuación se presentan los resultados del análisis de varianza (Ver tabla17: Resultados

análisis ANOVA para Litio) y en el anexo I se encuentran las pruebas restantes con ANOVA.

Tabla 17: Resultados análisis Anova para Litio

PRUEBA F Calculado

F Teórico

1 14.35

2,77

2 15.27

3 14.86

4 18.28

5 19.50

6 20.82

7 20.82

8 7.96

9 21.16

10 20.68




73




4.4 PRUEBAS DE TOXICIDAD CON EL VERTIMIENTO

El vertimiento utilizado en la investigación de este proyecto está compuesto por una muestra

de agua residual doméstica tomada de la Planta de Tratamiento de la Universidad de la Salle

y la adición de una sustancia química para convertirla en una agua residual sintética.

El agua contiene solamente Arsénico ya que este contaminante es de interés sanitario y se ha

determinado que algunas empresas lo usan como materia prima de sus procesos y por lo

tanto puede ser vertido alterando asi las condiciones físico – químicas del agua causando la

muerte de muchos organismos acuáticos; sin embargo el Litio también siendo una sustancia

de interés sanitario no se utilizó ya que no hay reportes de que empresas ubicadas en Bogotá

usen este contaminante como materia prima. El vertimiento es sintético debido a que las

Industrias que manejan estos contaminantes no permitieron la toma de muestras.

Los resultados de los ensayos para las pruebas de toxicidad del vertimiento se obtuvieron de

los datos que arrojaron las pruebas definitivas de toxicidad sobre los organismos Daphnia

pulex.

4.4.1 Análisis fisicoquímico del vertimiento

En el momento de realizar el muestreo se realizó un análisis in situ del agua residual. (Ver

tabla 18: resultados parámetros In situ)

Tabla 18: Resultados parámetros In situ


PARÁMETRO IN SITU VALOR

Temperatura 18 °C

Ph 6.9 unidades



74

Posteriormente se transportó la muestra del vertimiento al laboratorio certificado DAPNHIA

ltda, donde se realizaron los análisis fisicoquímicos. (Ver Anexo O) “Resultados parámetros de

laboratorio” (Ver tabla 19: resultados de los análisis fisicoquimicos)

Tabla 19: Resultados de los análisis fisicoquímicos


Los análisis fisicoquímicos del vertimiento arrojan valores considerables y por estas

características los organismos Daphnia pulex se ven más afectados; además de la alta

concentración del Arsénico con un valor de 1,91 mgAs/L superando los niveles permitidos por

la norma.

4.4.2 Análisis Probit para las pruebas de toxicidad con el vertimiento

Para la realización de las pruebas de toxicidad con el vertimiento se utilizaron organismos

Daphnia pulex, los cuales fueron expuestos a diferentes diluciones durante un periodo de 48

horas, ya que está demostrado que en este tiempo la mortalidad se da por la acción del

tóxico.

Para demostrar la capacidad de respuesta de los organismos Daphnia pulex al vertimiento se


pruebas preliminares y definitivas y posteriormente se realizó el cálculo por medio del del

programa estadístico Probit. (Ver Anexo J y K)

PARÁMETRO

DQO 1129 mg/L O2

SST 2,3 mg/L

Arsenico 1,91 mg As/L

Temperatura 21,2 °C

pH 4,49 Unidades



75

A continuación se presenta las cartas de control utilizadas en las pruebas:

Pruebas preliminares: Se realizó una prueba preliminar con el vertimiento, pero esta fue

descartada ya que en todos los rangos (20, 40, 60, 80 100%) se presentó la mortalidad total

de los organismos expuestos.

A B C D OD pH

20 5 5 5 5 6.4 7.00 20 100

40 5 5 5 5 6.4 7.00 20 100

60 5 5 5 5 6.4 7.00 20 100

80 5 5 5 5 6.4 7.00 20 100

100 5 5 5 5 6.4 7.00 20 100

Blanco 0 0 0 0 6.4 7.00 0 0

Vertimiento N°1

Medidas finales% MortalidadN° Total(%)

N° de organismos muertos

Test estatico preliminar con: Vertimiento

Posteriormente se realizó una nueva prueba preliminar con el vertimiento y esta fue

nuevamente descartada ya que en todos los rangos (2, 4, 6, 8, 10%) se presentó la

mortalidad total de los organismos expuestos.

A B C D OD pH

2 3 4 5 3 6.20 7.02 15 75

4 5 5 5 5 6.20 7.02 20 100

6 5 5 5 5 6.20 7.02 20 100

8 5 5 5 5 6.20 7.02 20 100

10 5 5 5 5 6.20 7.02 20 100

Blanco 0 0 0 0 6.20 7.02 0 0

Vertimiento N°1



Test estatico preliminar con: Vertimiento



76

Pruebas definitivas: partiendo de los resultados de la últimas pruebas preliminares, para estas

pruebas se utilizaron concentraciones en los siguientes rangos (0.1 – 0.5 – 1 – 2.5 – 5 %);

arrojando un 50% de mortalidad en los rangos de concentración 0.5 y 1% lo cual indica que la

concentración letal media corresponde o está muy cerca a este valor.

A B C D OD pH

0.1 0 0 1 0 6.20 7.00 1 5

0.5 1 2 1 1 6.20 7.00 5 25

1.0 2 4 2 3 6.20 7.00 11 55

2.5 3 4 4 4 6.20 7.00 15 75

5.0 5 5 5 5 6.20 7.00 20 100

Blanco 0 0 0 0 6.20 7.00 0 0



Inicio de la prueba: 25/10/2011

Fin de la prueba: 27/10/2011

Test estatico definitivo con: Vertimiento

A continuación se presentan los resultados de la concentración letal media (CL50-48) de las

pruebas definitivas con el Vertimiento. (Ver tabla 20: Control pruebas con vertimiento)

Tabla 20: Carta de control pruebas definitivas con Vertimiento

Numero pruebas

CL50-48 mg/L

Límite Inferior

Límite Superior

1 0,9074 0,6261 1,2645

2 1,0390 0,7694 1,3622

3 0,8260 0,5597 1,1651

4 0,8641 0,5955 1,2009

5 0,8199 0,5224 1,1599




77

Como resultado promedio de las pruebas definitivas con el vertimiento sobre los organismos

Daphnia pulex se determinó. (Ver tabla 21: Resultados pruebas con vertimiento)

Tabla 21: Resultados pruebas con vertimiento

Límite superior 1,23 mg/L

CL50-48 0,89 mg/L

Límite inferior 0,61 mg/L



tiempo de las pruebas con el vertimiento.

Grafica 4: Concentración Letal Media del vertimiento




78

En la gráfica 4 se observa que los valores de concentración letal media de las cinco (5)

pruebas definitivas con el vertimiento se encuentran dentro del rango de los límites de

confianza (límite inferior de 0,61 mg/L y límite superior de 1,23 mg/L) determinados con Probit,

lo que permite la validación de los datos y verifica la veracidad de los resultados obtenidos.

4.4.4 Análisis ANOVA para las pruebas de toxicidad con el vertimiento

Luego de obtener la concentración letal media (CL50-48) en las pruebas definitivas con el

vertimiento, se realizó el análisis de varianza con el fin validar los resultados obtenidos por el

programa Probit; por lo que se siguió el protocolo LBP04 (Ver anexo N) “Análisis de varianza”,

el cual se encuentra en el laboratorio de bioensayos de la facultad de Ingeniería Ambiental y

Sanitaria de la Universidad de la Salle.

A continuación se presentan los resultados del análisis de varianza; en el Anexo L se

encuentran las pruebas restantes con ANOVA. (Ver tabla 22: Resultados análisis ANOVA)

Tabla 22: Resultados análisis Anova con el vertimiento

PRUEBA F Calculado

F Teórico

1 57,84

2,77

2 24,60

3 23,12

4 14,09

5 31,00







79

5. OBTENCIÓN DE LA CARGA TÓXICA E ÍNDICE TOXICOLÓGICO

La carga e índice toxicológico se determinó con el fin de evaluar y clasificar el vertimiento que

contiene Arsénico.

Para el cálculo del índice toxicológico se tuvo en cuenta el caudal del vertimiento industrial, la

concentración letal media del vertimiento y carga tóxica del efluente. Una vez conocida la

toxicidad de los efluentes, es posible la estimación de su carga tóxica; por lo tanto, se puede

estimar la contribución de cada una de las muestras del efluente con respecto a su cuerpo

receptor.4

Esta evaluación es una herramienta útil para establecer prioridades para el control y

tratamiento de los efluentes y por tanto la adopción de estrategias y decisiones sobre las

acciones de control en el vertimiento.

Para el cálculo de la carga toxicológica se utiliza la siguiente ecuación:

De la ecuación se tiene que:

La carga tóxica se expresa en Unidades Tóxicas (UT).

CL50-48 = Concentración Letal Media del vertimiento que produjo la muerte del 50% de

los organismos expuestos en un periodo de 48 horas.

Q = Caudal promedio del efluente. (m3/día).

4ESCOBAR, MALAVER; Pedro Miguel. Implementación de un sistema de alerta de riesgo toxicológico utilizando Daphnia pulex para la

evaluación de muestras ambientales.



80

Con el cálculo y transformación logarítmica en base 10 de la carga tóxica se obtiene el índice

toxicológico de la siguiente manera:

5.1 Obtención carga toxicológica del vertimiento

Para poder determinar la carga toxicológica del vertimiento se tuvo en cuenta el caudal

promedio de la industria 133,08(m3/día)

5.2 Obtención del índice toxicológico del vertimiento

Con los valores obtenidos anteriormente se clasifico el vertimiento con carga toxica

considerable ya que el valor obtenido se encuentra dentro del rango de (4 – 4.99), basándose

en la escala establecida en la tesis “Implementación de un sistema de alerta de riesgo

toxicológico utilizando Daphnia pulex para la evaluación de muestras ambientales”. (Ver tabla

23: Rangos índice toxicológico).



81

Tabla 23: Rangos Índice Toxicológico

CARGA TOXICA

RANGOS

Despreciable 1-1,99

Reducida 2-2,99

Moderada 3-3,99

Considerable 4-4,99

Elevada >5

Fuente: Escobar Malaver Pedro Miguel.

El vertimiento fue clasificado como considerable, lo que indica que la muestra de agua

residual contenia un alto índice toxicológico, por esta razón se debe mejorar la calidad del

agua antes de ser vertida, ya que los vertimientos industriales están causando alteración en

las fuentes de agua y están reduciendo los ecosistemas acuáticos.



82

6. CONCLUSIONES

El resultado de la (CL50-48) obtenido en las pruebas de sensibilidad con Dicromato de

Potasio es de 0,20 mg/L, manejando un límite superior e inferior de 0,24 y 0,16 mg/L

estos valores se encuentran muy cerca a los obtenidos en investigaciones anteriores

con este toxico de referencia, lo que nos indica que estos organismos son altamente

sensibles a sustancias químicas como lo es este toxico de referencia.

La concentración letal media (CL50-48) para el Arsénico en los organismos Daphnia

pulex con un periodo de exposición de 48 horas es de 0,024mg/L, manejando un límite

superior e inferior de 0,034 y 0,014 mg/L; este valor aunque siendo muy bajo es

altamente toxico para estos organismos y demuestra la importancia del estudio de este

contaminante de interés sanitario.

La concentración letal (CL50-48) para el Litio en los organismos Daphnia pulex en un

tiempo de exposición de 48 horas es 2,731 mg/L, con un límite superior de 3,057 mg/L

y un límite inferior de 2,365 mg/L; este contaminante aunque es toxico es un poco más

tolerable por los organismos que el Arsénico, sin embargo hay que tener las

precauciones necesarias para que este contaminante no afecte los cuerpos de agua.

La concentración letal (CL50-48) para el vertimiento en el cual se muere el 50% de la

población de los organismo Daphnia pulex es de 0,89 mg/L, manejando unos límites de

confianza en un rango de 0,61 mg/L y 1,23 mg/L; este valor es relativamente bajo pero

debido a que la muestra de agua contiene sólidos y otras características los

organismos son más vulnerables.



83

Según el análisis de varianza (ANOVA) tanto para las pruebas de sensibilidad como

para las pruebas definitivas con Arsénico, Litio y el Vertimiento , se rechaza la hipótesis

nula y se acepta la hipótesis alterna, afirmando que a diferentes concentraciones de los

tóxicos, se producen efectos diferentes en los organismos Daphnia pulex.

El vertimiento tiene una carga toxica de 14952,80 y un índice de toxicidad de 4,17 por lo

tanto se clasifica en toxicidad considerable, según lo establecido en las investigaciones

realizadas por el químico Pedro Miguel Malaver; lo que indica que la muestra de agua

residual contiene un alto índice toxicológico, por esta razón se debe mejorar la calidad

del agua antes de ser vertida, ya que los vertimientos industriales están causando

alteración en las fuentes de agua y están reduciendo los ecosistemas acuáticos.

Con base a los metales estudiados en este trabajo de investigación, se pudo establecer

que la actividad toxicológica del Litio es mucho mayor que la de Arsénico, creando con

ello una mayor precaución para el uso y eventuales vertimientos para el ecosistema

acuático.

Los resultados obtenidos demuestran que la especie Dapnhia Pulex posee una menor

resistencia y menor tiempo de relación dosis-respuesta frente a la especia Daphia

Magna.



84

7. RECOMENDACIONES

Seguir los protocolos establecidos y cumplir con los requisitos exigidos en el

laboratorio, para obtener resultados confiables y verídicos que sirvan de base para

próximas investigaciones.

Realizar el mantenimiento de las peceras sin ningún tipo de detergente, para evitar que

factores externos incidan en los resultados de las pruebas.

Determinar la concentración letal media para las sustancias de interés sanitario,

faltantes con organismos Daphnia pulex.

Llevar un control de los parámetros requeridos (pH, temperatura y oxígeno disuelto)

para que las variables sean siempre las mismas y los resultados sean verídicos.

Realizar mantenimientos y revisiones diarias con el propósito de evitar factores

externos que pueden alterar los resultados.

Con los resultados de la presente tesis se debe generar una propuesta para reformar la

normatividad en materia de los tóxicos, con el fin de hacerla más restrictiva.

Es conveniente controlar factores externos frente a la realización de las pruebas, esto

con el fin de que agentes ajenos a la investigación modifiquen o alteren el resultado

esperado, o que los resultados obtenidos sean poco confiables.

En la medida que se obtengan los resultados mediante bioensayos, se recomienda usar

los estudios para proponer normatividad de carácter ambiental, que proteja

ecosistemas y especies sensibles a metales pesados como el Arsénico y Litio.



85

Medidas como planes de Gestión Ambiental o políticas de producción más limpia

pueden ser alternativas de objeto de estudio para futuras investigaciones, con el fin de

permitir comparar los resultados.

Se recomienda generar alianzas entre la academia y las industrias con el fin de facilitar

los estudios y generar colaboración mutua frente a la contaminación de acuíferos.

La universidad como institución al profundizar en estos aspectos de la toxicología

permite facilitar a las autoridades y entidades interesadas, los conocimientos

necesarios para proponer y desarrollar los programas de prevención, control y

seguimiento y adoptar medidas de medicina ocupacional e higiene industrial, que

mejoren las condiciones de los trabajadores de las industrias.



86

8. BIBLIOGRAFÍA

COLOMBIA, Decreto 3930 del 25 de octubre del 2010, De los usos del recurso hídrico y

vertimientos; Capítulo 2., artículo 3.

DÍAZ BÁEZ, María Consuelo; BUSTOS LÓPEZ, Martha Cristina; ESPINOSA RAMÍREZ,

Adriana Janneth. Pruebas De Toxicidad Acuática: Fundamentos Y Métodos. Ingeniería

e Investigación. Universidad Nacional. 2009.

ESCOBAR, Pedro Miguel, LONDOÑO Rubén Darío. Manual práctico de ensayos de

toxicidad en medio acuático con organismos del género Daphnia.

ESCOBAR MALAVER Pedro Miguel (Enero- Junio 2009), Implementación de un

sistema de alerta de riesgo toxicológico utilizando Daphnia Pulex para la evaluación de

muestras ambientales. Revista Epsilon 12. 115-133.

INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TÉCNICAS Y CERTIFICACIÓN, ICONTEC.

Gestión ambiental: agua. Guía para la realización de ensayos de toxicidad en

organismos acuáticos (Bioensayos). Bogotá D.C. 2000.

MORENO Grau, María Dolores, Toxicología ambiental: evaluación de riesgo para la

salud humana, Madrid: McGraw-Hill, 2003.

TOXICOLOGÍA AMBIENTAL. (Disponible en internet). En línea<

http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/toxamb.pdf>.[Citado el 10 de junio].

VALLEJO, María del Carmen, BAENA, Carlos Alberto. Toxicología ambiental, Bogotá :

Wills Ltda , 2007



87

CIBERGRAFÍA

ARSÉNICO. (Disponible en internet). En línea

<http://www.lenntech.es/periodica/elementos/se.htm#ixzz0yQhIPhTc> [citado el 18

Noviembre]

ATSDR. Agencia para sustancias toxicas y el registro de enfermedades. P 2010.

(Disponible en internet). En línea < http://www.atsdr.cdc.gov/es/phs/es_phs26.pdf>

ECOSISTEMAS ACUÁTICOS. (Disponible en internet). En línea<

http://www.botanical-online.com/ecosistemasacuaticos.htm> [Citado el 13 Junio].

NEUSTON. (Disponible en internet). En línea<

http://www.drpez.com/diccionario/term/afad5ca55eacaeaa60,,xhtml> [Citado el 30

octubre].

NOCIONES BÁSICAS DE TOXICOLOGÍA. (Disponible en internet). En línea

http://www.cepis.ops-oms.org/acrobat/nocio.pdf> [Citado el 10 Junio].

TOXICOLOGÍA AMBIENTAL. (Disponible en internet). En línea<

http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/toxamb.pdf>.[Citado el 10 de

septiembre].

http://www.lenntech.es/periodica/elementos/se.htm

http://www.atsdr.cdc.gov/es/phs/es_phs26.pdf

http://www.botanical-online.com/ecosistemasacuaticos.htm

http://www.drpez.com/diccionario/term/afad5ca55eacaeaa60,,xhtml

http://www.cepis.ops-oms.org/acrobat/nocio.pdf



88

ANEXOS



89

ANEXO A:

CARTAS DE CONTROL PARA LAS PRUEBAS DE SENSIBILIDAD CON DICROMATO DE

POTASIO (K2Cr2O7)



90



91



92



93



94



95



96



97



98



99



100



101

ANEXO B:

OBTENCIÓN DE LA CL50‐48 CON DICROMATO DE POTASIO (K2Cr2O7) POR EL MÉTODO PROBIT.



102



103



104



105



106



107

ANEXO C:

CARTAS DE CONTROL CON DICROMATO DE

POTASIO (K2Cr2O7) POR EL MÉTODO ANOVA.



108



109



110



111



112



113



114



115



116



117



118

ANEXO D:

CARTAS DE CONTROL PARA LAS PRUEBAS DE

TOXICIDAD CON ARSÉNICO.



119



120



121



122



123



124

ANEXO E:

OBTENCIÓN DE LA CL50‐48 CON ARSÉNICO POR EL

MÉTODO PROBIT.



125



126



127



128

ANEXO F:

CARTAS DE CONTROL CON ARSÉNICO (As) POR

EL MÉTODO ANOVA.



129



130



131



132



133



134

ANEXO G:

CARTAS DE CONTROL PARA LAS PRUEBAS DE

TOXICIDAD CON LITIO (Li)



135



136



137



138



139



140

ANEXO H:

OBTENCIÓN DE LA CL50‐48 CON LITIO POR EL

MÉTODO PROBIT.



141



142



143



144

ANEXO I

OBTENCIÓN DE LA CL50‐48 CON LITIO

POR ANOVA.



145



146



147



148



149



150

ANEXO J:

CARTAS DE CONTROL PARA LAS PRUEBAS DE TOXICIDAD CON VERTIMIENTO



151

Vertimiento N°1

Test estatico definitivo con: Vertimiento Inicio de la prueba: 25/10/2011 Fin de la prueba: 27/10/2011

(%)

N° de organismos muertos Medidas finales N° Total % Mortalidad

A B C D OD pH

0.1 0 0 1 0 6.20 7.00 1 5

0.5 1 2 1 1 6.20 7.00 5 25

1.0 2 4 2 3 6.20 7.00 11 55

2.5 3 4 4 4 6.20 7.00 15 75

5.0 5 5 5 5 6.20 7.00 20 100

Blanco 0 0 0 0 6.20 7.00 0 0

Limite superior: 1,2645 mg/L CL50-48: 0.9074 mg/L

Limite inferior: 0,6261 mg/L

RESPONSABLE: Leonardo Arturo Valero Sandoval – Angie Julieth Bustos Gonzalez

Vertimiento N°2


(%)


A B C D OD pH

0.1 0 0 0 0 6.20 7.00 0 0

0.5 0 2 0 2 6.20 7.00 4 20

1.0 0 3 4 3 6.20 7.00 10 50

2.5 4 4 4 4 6.20 7.00 16 80

5.0 5 5 5 5 6.20 7.00 20 100

Blanco 0 0 0 0 6.20 7.00 0 0

Limite superior: 1,3622 mg/L CL50-48: 1,0390 mg/L





152

Vertimiento N°3


Concentracion (%)


A B C D OD pH

0.1 1 0 0 0 6.20 7.00 1 5

0.5 0 3 0 2 6.20 7.00 5 25

1.0 3 4 2 3 6.20 7.00 12 60

2.5 4 5 5 3 6.20 7.00 17 85

5.0 5 4 5 5 6.20 7.00 19 95

Blanco 0 0 0 0 6.20 7.00 0 0




Vertimiento N°4


Concentracion (%)


A B C D OD pH

0.1 0 0 0 1 6.20 7.00 1 5

0.5 0 3 3 0 6.20 7.00 6 30

1.0 3 4 3 0 6.20 7.00 10 50

2.5 3 4 5 4 6.20 7.00 16 80

5.0 5 5 5 5 6.20 7.00 20 100

Blanco 0 0 0 0 6.20 7.00 0 0






153

Vertimiento N°5


(%)


A B C D OD pH

0.1 0 0 1 0 6.20 7.00 1 5

0.5 0 2 3 2 6.20 7.00 7 35

1.0 3 3 2 3 6.20 7.00 11 55

2.5 3 3 5 4 6.20 7.00 15 75

5.0 5 5 5 5 6.20 7.00 20 100

Blanco 0 0 0 0 6.20 7.00 0 0






154

ANEXO K: OBTENCIÓN DE LA CL50‐48 CON VERTIMIENTO

POR EL MÉTODO PROBIT



155



156



157

ANEXO L: OBTENCIÓN DE LA CL50‐48 CON VERTIMIENTO

POR ANOVA.



158

VERTIMIENTO N°1

R1 R2 R3 R4

0.1 0 0 1 0 1 0,25

0.5 1 2 1 1 5 1,25

1.0 2 4 2 3 11 2,75

2.5 3 4 4 4 15 3,75

5.0 5 5 5 5 20 5

Blanco 0 0 0 0 0 0

TOTAL 52 13

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio

cuadrados

F

Calculado

F

Teórico

Entre grupos 80,3333333 5 16,0666667

Dentro de Grupos 5 18 0,28

Total 85,3333333 23

PROMEDIO

ANÁLISIS DE VARIANZA

57,84 2,77

%NUMERO DE REPLICAS

TOTAL

VERTIMIENTO N°2

R1 R2 R3 R4

0.1 0 0 0 0 0 0

0.5 0 2 0 2 4 1,25

1.0 0 3 4 3 10 2,5

2.5 4 4 4 4 16 4

5.0 5 5 5 5 20 5

Blanco 0 0 0 0 0 0

TOTAL 50 12,75

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio

cuadrados

F

Calculado

F

Teórico

Entre grupos 88,83 5 17,77

Dentro de Grupos 13,00 18 0,72

Total 101,83 23

PROMEDIO


24,60 2,77

%NUMERO DE REPLICAS

TOTAL



159

VERTIMIENTO N°3

R1 R2 R3 R4

0.1 1 0 0 0 1 0,25

0.5 0 3 0 2 5 1,25

1.0 3 4 2 3 12 3

2.5 4 5 5 3 17 4,25

5.0 5 4 5 5 19 4,75

Blanco 0 0 0 0 0 0

TOTAL 54 13,5

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio

cuadrados

F

Calculado

F

Teórico



Total 96,50 23

%NUMERO DE REPLICAS

TOTAL PROMEDIO


23,12 2,77

VERTIMIENTO N°4

R1 R2 R3 R4

0.1 0 0 0 1 1 0,25

0.5 0 3 3 0 6 1,25

1.0 3 4 3 0 10 2,5

2.5 3 4 5 4 16 4

5.0 5 5 5 5 20 5

Blanco 0 0 0 0 0 0

TOTAL 53 13

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio

cuadrados

F

Calculado

F

Teórico



Total 101,96 23

%NUMERO DE REPLICAS

TOTAL PROMEDIO


14,09 2,77



160

VERTIMIENTO N°5

R1 R2 R3 R4

0.1 0 0 1 0 1 0,25

0.5 0 2 3 2 7 1,25

1.0 3 3 2 3 11 2,75

2.5 3 3 5 4 15 3,75

5.0 5 5 5 5 20 5

Blanco 0 0 0 0 0 0

TOTAL 54 13

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio

cuadrados

F

Calculado

F

Teórico


Dentro de Grupos 9 18 0,50

Total 86,50 23

%NUMERO DE REPLICAS

TOTAL PROMEDIO


31,00 2,77



161

ANEXO M: PROTOCOLO. ANALISIS DE RESULTADOS,

METODO PROBIT



162

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ANÁLISIS DE RESULTADOS MEDIANTE EL

MÉTODO PROBIT

Página 1 de 12

Versión 0

CONTENIDO

1. Objetivo

2. Definiciones

3. Principio del modelo matemático

4. Procedimiento

5. Bibliografía

6. Anexo 1: Relación entre el Probit empírico y el porcentaje de mortalidad

Anexo 2: Representación grafica del cálculo de la CL50

Anexo 3: Determinación del Chi-cuadrado (X2).

Anexo 4: Factor (p) para el Probit calculado (Y).



163

1. OBJETIVO

Evaluar los resultados de los ensayos por medio de un modelo estadístico

2. DEFINICIONES

Concentración: Magnitud física que expresa la cantidad de un elemento o un compuesto por

unidad de volumen.

Dosis: Contenido de principio activo, expresado en cantidad por unidad de toma, por unidad de

volumen o de peso en función de la presentación, que se administrara de una vez.

Efecto: Consecuencia positiva o negativa, de la ocurrencia de un evento.

Modelo: Conceptualización de un evento, un proyecto, una hipótesis, el estado de una cuestión,

que se representa como un esquema con símbolos descriptivos de características y relaciones

más importantes con un fin: ser sometido a modelización como un diseño flexible, que emerge y

se desarrolla durante el inicio de la investigación como una evaluación de su relevancia.

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MÉTODO PROBIT

Página 2 de 12

Versión 0

Toxicidad aguda: La toxicidad aguda tiene por objeto determinar los efectos de una dosis única y



164

muy elevada de una sustancia. Usualmente, el punto final del estudio es la muerte del animal y la

toxicidad aguda se expresa por la dosis letal 50, que viene a representar más o menos la dosis de

la sustancia que produce la muerte en el 50% de los animales.

Probit: Modelo estadístico que analiza las pruebas de toxicidad. El método consiste en la

aplicación de correlaciones estadísticas para estimar las consecuencias desfavorables sobre una

población a los fenómenos físicos peligrosos; nos da una relación entre la función de probabilidad

y una determinada carga de exposición.

3. PRINCIPIO DEL MODELO MATEMÁTICO

En un experimento típico de pruebas de toxicidad se tiene la siguiente situación:

a) Concentración de la sustancia o dosis (d).

b) Número de individuos (n).

c) Numero de organismos muertos o afectados (r).

d) Porcentaje de efecto (p).

La representación grafica de p vs. d, o relación dosis-respuesta, genera una curva parabólica que muchas

veces presenta dificultades en la construcción de un modelo lineal.

Una forma de abordar este problema es transformando d a una escala logarítmica (X=log10 (d)), lo cual

mostrara una relación dosis-respuesta de forma S o sigmoidea normal, como se muestra en la figura 1; de

esta manera la distribución de p vs. X será de tipo normal.



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MÉTODO PROBIT

Página 3 de 12

Versión 0

Figura 1. Relación dosis-respuesta



166

Posteriormente, mediante las tablas de Probit se transforma p (porcentaje de efecto) a unidades Probit

(buscando en una tabla de distribución normal el valor de z correspondiente a una probabilidad

acumulada igual a p y sumándole a continuación cinco unidades), se obtiene una distribución de puntos

en un sistema bi-variado de tipo lineal, los cuales se procesan según un análisis de regresión típico. Vale

la pena enfatizar que el Probit es una transformación sobre la tasa de efecto (p), y la ecuación generada

es de la forma:

Donde:

y (expresado en unidades Probit) = z + 5

z= Variable normal estándar = zO tal que la Prob (z ≤ zO) = p

a y b son los estimadores de los parámetros de la recta de regresión

Así, cuando p= 50% entonces y = 5, por lo tanto:

X5= log10 CL50, entonces CL50 = 105

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MÉTODO PROBIT

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Versión 0

Para facilitar los cálculos, simplemente se puede usar un software como el suministrado por la US

Environmental Protection Agency (US EPA): Probit Analysis Program. El procedimiento Probit permite

encontrar estimadores m-verosimiles de parámetros de regresión y de tasas naturales (por ejemplo, tasas

de mortalidad) de respuesta para ensayos biológicos, analizando porcentajes de efecto vs. Dosis dentro

del marco de la regresión

.

4. PROCEDIMIENTO

Para el cálculo de la CL50 por este método es necesario contar, por lo menos, con dos porcentajes

intermedios del efecto esperado (valores entre 0 y 100%). Con los resultados obtenidos en los ensayos

de toxicidad aguda con Oncorhynchus Mykiss se debe construir una tabla que contenga los siguientes

datos:

Concentración de la sustancia ensayada en %

Logaritmo en base 10 de las concentraciones (x)

Numero de organismos en cada concentración

Numero de organismos muertos en cada concentración (r).

Porcentaje de mortalidad en cada concentración (P).

Probit empírico (PE).

Probit esperado o calculado (Y).

Los cinco primeros resultados corresponden a datos experimentales; el Probit empírico se obtiene de la

tabla 4 del Anexo 1 con el porcentaje de mortalidad observada en cada una de las concentraciones y se

tabula en la tabla 1.



168

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MÉTODO PROBIT

Página 5 de 12

Versión 0

A partir de estos datos se elabora una grafica en papel cuadriculado, colocando en el eje X el logaritmo

de las concentraciones y en el eje Y el Probit empírico (Figura 1 Anexo 2), y se ajusta la recta a través de

estos puntos. En el grafico se traza una línea a partir del Probit 5,0 hasta cortar la línea trazada; el valor

correspondiente en el eje X se denomina m y el antilogaritmo de este valor corresponderá a la CE50 o

CL50.

Para el cálculo del Probit esperado o calculado, debe hallarse el valor de S correspondiente a la tasa de

incremento del log de la concentración (x) por unidad de incremento del Probit.



169

En la recta trazada se calcula la pendiente, tomando el porcentaje donde se hallo el mayor y el menor

efecto, así como los probits correspondientes a estos valores, remplazando en la siguiente fórmula:

Donde:

X: Mayor concentración

x: Menor concentración

PE: Probit empírico correspondiente a la mayor concentración

Pe: Probit empírico correspondiente a la menor concentración





CL50.

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MÉTODO PROBIT

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Versión 0

Así, los valores del Probit esperado o calculado (Y) para cada concentración podrán ser calculados

utilizando la siguiente expresión:

Una vez calculados se colocan en la columna correspondiente de la tabla 2.

La prueba de hipótesis utilizada para establecer la asociación entre la concentración de la sustancia

tóxica y la respuesta en unidades probit es la prueba de CHI-cuadrado (X2). Los datos para el cálculo de

este valor se colocan en una tabla 5 (Anexo 3) de la siguiente forma:

Concentración de la sustancia estudiada en %

Logaritmo decimal de la concentracion (x).

Probit calculado o esperado (Y).

Numero de organismos (N)

Mortalidad observada (r)

Porcentaje de efecto esperado (P).

La mortalidad esperada (NP') se calcula multiplicando (N) por (P').



171

El cálculo de la desviación de la mortalidad se obtiene hallando la diferencia entre la mortalidad

observada y la esperada. La contribución al Chi cuadrado de cada uno de los valores se calcula:

Y para el cálculo de los grados de libertad (n):

donde K es el numero de concentraciones utilizadas

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MÉTODO PROBIT

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Versión 0

Con los datos obtenidos se diligencia la Tabla 2 para el cálculo del intervalo de confianza:



172

Para el cálculo de los límites es necesario establecer el error estándar. El error estándar del log de la

concentración letal para el 50% de los organismos se obtiene a través de la siguiente expresión:

Inicialmente, se construye una tabla en la cual se incorporen los siguientes datos:

Logaritmo decimal de las concentraciones (x).

Numero de organismos por concentración (N).


Factor p, el cual se obtiene de la tabla 5 del Anexo 3 con el valor Y.

Productos Np, Npx y Npx2, obtenidos de los datos de la misma tabla

Sumatoria de los productos correspondientes a los valores SNp, SNpx y S Npx2

Factor p debe ser obtenido en la tabla entrando el valor de Probit calculado

Producto Np resultante de la multiplicación de los valores de numero de organismos por el factor p

y su respectiva sumatoria.

Producto Npx resultante de la multiplicación del producto anterior por el logaritmo de las

concentraciones con su respectiva sumatoria.

Producto Npx2 resultante de la multiplicación del producto anterior por el logaritmo de la

concentración con su respectiva sumatoria.



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Con todos los datos anteriores, se diligencia la Tabla 3:

Al tener la CL50 y no olvidando que el intervalo de confianza es 95% tendremos la concentración letal con

sus límites inferior y superior respectivamente.

Para el desarrollo de esta investigación se adquirió el Software de Probit, el cual determinar la CL50-96 y

los limites de confianza mas rápido, y su procedimiento es el siguiente:

Se instala el programa en un computador que cuente con un software de Windows 98 en adelante,

creándose una carpeta de Probit en el escritorio.

Dentro de esta carpeta quedaran registrados varios archivos; se dirige al archivo con nombre



174

PROBFIS2 y se da doble clic donde se abre una ventana de la siguiente manera:

Da dos opciones para manejar el programa, la (1) es para introducir los datos con el teclado, la (2) para

introducirlos en fila. Es este paso se escribe (1), y sale:

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Ahora se le da un nombre al archivo que se crea con los resultados que determina el programa, así

:

Ahora el programa pide que se inserten el numero de concentraciones, sin el control, numero de



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muertes en el control, numero de organismos en el control, así:

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Ahora se procede a ingresar los datos de las concentraciones comenzando por la concentración menor, el



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número de muertes en cada una y el numero de tratamientos, así

:

Así sucesivamente hasta completar los datos de las 5 concentraciones. Al terminar este paso se da enter

y se cierra esta ventana; en la carpeta de probit aparece un archivo con el nombre que se le designo a

esa batería donde dará los resultaos de la CL50 con los limites de confianza.

5. BIBLIOGRAFÍA

http://www.metodologia probit.htm




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6. ANEXOS

Anexo1: Relación entre el Probit empírico y el porcentaje de mortalidad




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CONTENIDO

1. Objetivo

2. Definiciones

3. Principio del modelo matemático

4. Procedimiento

5. Bibliografía

6. Anexo 1: Relación entre el Probit empírico y el porcentaje de mortalidad


Anexo 3: Determinación del Chi-cuadrado (X2).

Anexo 4: Factor (p) para el Probit calculado (Y).

7. OBJETIVO

Evaluar los resultados de los ensayos por medio de un modelo estadístico

8. DEFINICIONES

Concentración: Magnitud física que expresa la cantidad de un elemento o un compuesto por

unidad de volumen.

Dosis: Contenido de principio activo, expresado en cantidad por unidad de toma, por unidad de



181

volumen o de peso en función de la presentación, que se administrara de una vez.

Efecto: Consecuencia positiva o negativa, de la ocurrencia de un evento.

Modelo: Conceptualización de un evento, un proyecto, una hipótesis, el estado de una cuestión,

que se representa como un esquema con símbolos descriptivos de características y relaciones

más importantes con un fin: ser sometido a modelización como un diseño flexible, que emerge y

se desarrolla durante el inicio de la investigación como una evaluación de su relevancia.

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Toxicidad aguda: La toxicidad aguda tiene por objeto determinar los efectos de una dosis única y

muy elevada de una sustancia. Usualmente, el punto final del estudio es la muerte del animal y la

toxicidad aguda se expresa por la dosis letal 50, que viene a representar más o menos la dosis de

la sustancia que produce la muerte en el 50% de los animales.

Probit: Modelo estadístico que analiza las pruebas de toxicidad. El método consiste en la

aplicación de correlaciones estadísticas para estimar las consecuencias desfavorables sobre una

población a los fenómenos físicos peligrosos; nos da una relación entre la función de probabilidad

y una determinada carga de exposición.



182

9. PRINCIPIO DEL MODELO MATEMÁTICO

En un experimento típico de pruebas de toxicidad se tiene la siguiente situación:

e) Concentración de la sustancia o dosis (d).

f) Número de individuos (n).

g) Numero de organismos muertos o afectados (r).

h) Porcentaje de efecto (p).

La representación grafica de p vs. d, o relación dosis-respuesta, genera una curva parabólica que muchas

veces presenta dificultades en la construcción de un modelo lineal.

Una forma de abordar este problema es transformando d a una escala logarítmica (X=log10 (d)), lo cual

mostrara una relación dosis-respuesta de forma S o sigmoidea normal, como se muestra en la figura 1; de

esta manera la distribución de p vs. X será de tipo normal.

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Figura 1. Relación dosis-respuesta

Posteriormente, mediante las tablas de Probit se transforma p (porcentaje de efecto) a unidades Probit

(buscando en una tabla de distribución normal el valor de z correspondiente a una probabilidad

acumulada igual a p y sumándole a continuación cinco unidades), se obtiene una distribución de puntos

en un sistema bi-variado de tipo lineal, los cuales se procesan según un análisis de regresión típico. Vale

la pena enfatizar que el Probit es una transformación sobre la tasa de efecto (p), y la ecuación generada

es de la forma:



184

Donde:

y (expresado en unidades Probit) = z + 5

z= Variable normal estándar = zO tal que la Prob (z ≤ zO) = p

a y b son los estimadores de los parámetros de la recta de regresión

Así, cuando p= 50% entonces y = 5, por lo tanto:

X5= log10 CL50, entonces CL50 = 105

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Para facilitar los cálculos, simplemente se puede usar un software como el suministrado por la US

Environmental Protection Agency (US EPA): Probit Analysis Program. El procedimiento Probit permite

encontrar estimadores m-verosimiles de parámetros de regresión y de tasas naturales (por ejemplo, tasas

de mortalidad) de respuesta para ensayos biológicos, analizando porcentajes de efecto vs. Dosis dentro

del marco de la regresión



185

.

10. PROCEDIMIENTO

Para el cálculo de la CL50 por este método es necesario contar, por lo menos, con dos porcentajes

intermedios del efecto esperado (valores entre 0 y 100%). Con los resultados obtenidos en los ensayos

de toxicidad aguda con Oncorhynchus Mykiss se debe construir una tabla que contenga los siguientes

datos:

Concentración de la sustancia ensayada en %

Logaritmo en base 10 de las concentraciones (x)

Numero de organismos en cada concentración

Numero de organismos muertos en cada concentración (r).

Porcentaje de mortalidad en cada concentración (P).

Probit empírico (PE).


Los cinco primeros resultados corresponden a datos experimentales; el Probit empírico se obtiene de la

tabla 4 del Anexo 1 con el porcentaje de mortalidad observada en cada una de las concentraciones y se

tabula en la tabla 1.

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CL50.

Para el cálculo del Probit esperado o calculado, debe hallarse el valor de S correspondiente a la tasa de

incremento del log de la concentración (x) por unidad de incremento del Probit.

En la recta trazada se calcula la pendiente, tomando el porcentaje donde se hallo el mayor y el menor

efecto, así como los probits correspondientes a estos valores, remplazando en la siguiente fórmula:

Donde:

X: Mayor concentración



187

x: Menor concentración

PE: Probit empírico correspondiente a la mayor concentración

Pe: Probit empírico correspondiente a la menor concentración





CL50.

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Así, los valores del Probit esperado o calculado (Y) para cada concentración podrán ser calculados

utilizando la siguiente expresión:



188

Una vez calculados se colocan en la columna correspondiente de la tabla 2.

La prueba de hipótesis utilizada para establecer la asociación entre la concentración de la sustancia

tóxica y la respuesta en unidades probit es la prueba de CHI-cuadrado (X2). Los datos para el cálculo de

este valor se colocan en una tabla 5 (Anexo 3) de la siguiente forma:

Concentración de la sustancia estudiada en %

Logaritmo decimal de la concentracion (x).

Probit calculado o esperado (Y).

Numero de organismos (N)

Mortalidad observada (r)

Porcentaje de efecto esperado (P).

La mortalidad esperada (NP') se calcula multiplicando (N) por (P').

El cálculo de la desviación de la mortalidad se obtiene hallando la diferencia entre la mortalidad

observada y la esperada. La contribución al Chi cuadrado de cada uno de los valores se calcula:

Y para el cálculo de los grados de libertad (n):

donde K es el numero de concentraciones utilizadas



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Con los datos obtenidos se diligencia la Tabla 2 para el cálculo del intervalo de confianza:

Para el cálculo de los límites es necesario establecer el error estándar. El error estándar del log de la

concentración letal para el 50% de los organismos se obtiene a través de la siguiente expresión:

Inicialmente, se construye una tabla en la cual se incorporen los siguientes datos:

Logaritmo decimal de las concentraciones (x).

Numero de organismos por concentración (N).



190


Factor p, el cual se obtiene de la tabla 5 del Anexo 3 con el valor Y.

Productos Np, Npx y Npx2, obtenidos de los datos de la misma tabla

Sumatoria de los productos correspondientes a los valores SNp, SNpx y S Npx2

Factor p debe ser obtenido en la tabla entrando el valor de Probit calculado

Producto Np resultante de la multiplicación de los valores de numero de organismos por el factor p

y su respectiva sumatoria.

Producto Npx resultante de la multiplicación del producto anterior por el logaritmo de las

concentraciones con su respectiva sumatoria.

Producto Npx2 resultante de la multiplicación del producto anterior por el logaritmo de la

concentración con su respectiva sumatoria.

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Con todos los datos anteriores, se diligencia la Tabla 3:



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Al tener la CL50 y no olvidando que el intervalo de confianza es 95% tendremos la concentración letal con

sus límites inferior y superior respectivamente.

Para el desarrollo de esta investigación se adquirió el Software de Probit, el cual determinar la CL50-96 y

los limites de confianza mas rápido, y su procedimiento es el siguiente:

Se instala el programa en un computador que cuente con un software de Windows 98 en adelante,

creándose una carpeta de Probit en el escritorio.

Dentro de esta carpeta quedaran registrados varios archivos; se dirige al archivo con nombre

PROBFIS2 y se da doble clic donde se abre una ventana de la siguiente manera:

Da dos opciones para manejar el programa, la (1) es para introducir los datos con el teclado, la (2) para

introducirlos en fila. Es este paso se escribe (1), y sale:



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Versión 0

Ahora se le da un nombre al archivo que se crea con los resultados que determina el programa, así

Ahora el programa pide que se inserten el numero de concentraciones, sin el control, numero de

muertes en el control, numero de organismos en el control, así:



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MÉTODO PROBIT

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Ahora se procede a ingresar los datos de las concentraciones comenzando por la concentración menor, el

número de muertes en cada una y el numero de tratamientos, así

:



194

Así sucesivamente hasta completar los datos de las 5 concentraciones. Al terminar este paso se da enter

y se cierra esta ventana; en la carpeta de probit aparece un archivo con el nombre que se le designo a

esa batería donde dará los resultaos de la CL50 con los limites de confianza.

11. BIBLIOGRAFÍA

http://www.metodologia probit.htm


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12. ANEXOS

Anexo1: Relación entre el Probit empírico y el porcentaje de mortalidad




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ANEXO N: PROTOCOLO. ANÁLISIS DE VARIANZA, MÉTODO

ANOVA



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CONTENIDO

1. Objetivo

2. Definiciones

3. Principio del modelo

4. Procedimiento

5. Bibliografía

1. OBJETIVO

Comparar si los valores de un conjunto de datos numéricos son significativamente distintos a los valores de

otro o más conjuntos de datos.

2. DEFINICIONES

Variable: Conceptos que forman enunciados de un tipo particular denominado hipótesis. Las

variables se refieren a propiedades de la realidad que varían, es decir, su idea contraria son las



199

propiedades constantes de cierto fenómeno.

Variable Dependiente: Características de la realidad que se ven determinadas o que dependen del

valor que asuman otros fenómenos o variables independientes.

Variables independientes: Los cambios en los valores de este tipo de variables determinan

cambios en los valores de otra (variable dependiente).

Grados de libertad: Número efectivo de observaciones que contribuyen a la suma de cuadrados en

un ANOVA, es decir, el número total de observaciones menos el número de datos que sean

combinación lineal de otros.

Hipótesis: Proposiciones provisionales y exploratorias sobre la veracidad o falsedad de un

concepto, una teoría o un modelo con un alcance de trabajo de investigación por simulación y con

métodos de campo o de laboratorio.




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3. PRINCIPIO DEL MODELO

El análisis de varianza parte de algunos supuestos que han de cumplirse:

La variable dependiente debe medirse al menos a nivel de intervalo.



200

Independencia de las observaciones.

La distribución de la variable dependiente debe ser normal.

Homogeneidad de las varianzas

Los modelos de efectos aleatorios asumen que en un factor se ha considerado tan sólo una muestra de los

posibles valores que éste puede tomar; estos modelos se usan para describir situaciones en que ocurren

diferencias incomparables en el material o grupo experimental. El ejemplo más simple es el de estimar la

media desconocida de una población compuesta de individuos diferentes y en el que esas diferencias se

mezclan con los errores del instrumento de medición.

La técnica fundamental consiste en la separación de la suma de cuadrados (SS, 'sum of squares') en

componentes relativos a los factores contemplados en el modelo. Como ejemplo, mostramos el modelo

para un ANOVA simplificado con un tipo de factores en diferentes niveles. (Si los niveles son cuantitativos y

los efectos son lineales, puede resultar apropiado un análisis de regresión lineal).

El número de grados de libertad (gl) puede separarse de forma similar y se corresponde con la forma en

que la distribución chi‐cuadrado describe la suma de cuadrados asociada.



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4. PROCEDIMIENTO

Al realizar una prueba de toxicidad, se pasan los datos correspondientes a la Tabla 1

Tabla 1. Formato de Datos de Prueba de Toxicidad

Se plantea la hipótesis nula y la hipótesis X

Ho: μ1 = μ2 = μ3 = μn

H1: μ1 ≠ μ2 , para algún par

El tratamiento de análisis de varianza se hace mediante la Tabla 2:



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Tabla 2. Análisis de Varianza

Donde:

N: Número total de observaciones; N: a * n

n: número de observaciones en cada grupo

a: número de tratamientos




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FV : Fuente de varianza

SS: Suma de cuadrados



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GL: Grados de libertad

Ms: Cuadrados medios

Fc: F calculado

Ft: F tabulado

V1: a – 1

V2: N – a

Para obtener el SSTTO, se debe reemplazar la siguiente formula:

Para obtener el SST, se debe reemplazar la siguiente formula:

Para obtener el SSE:

Al obtener el Fc lo comparamos el Ft, para refutar o aceptar alguna hipótesis, esto se hace así:

Fc > Ft Se rechaza la Ho

Fc < Ft Se acepta la Ho



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5. BIBLIOGRAFÍA

http://www.estadistico.com/arts.html?20011022

http://www.udc.es/dep/mate/estadistica2/sec3_7.html

http://es.wikipedia.org/wiki/An%C3%A1lisis_de_varianza



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Determinación de la concentración letal media CL50-48 de ...

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