determinación cadmio (Cd) en muestras de

Guía para la determinación de cadmio (Cd) en muestras de cacao en grano y en polvo

Bióloga de la Universidad Nacional de San Agustín (Arequipa, Perú) y PhD en Biogeoquímica de la Universidad Paul Sabatier, Toulouse 3 (Francia).

Su investigación se centra en la transferencia de contaminantes metálicos dentro del sistema suelo-planta, así como también en el estudio de la calidad del aire.

Domina diferentes métodos de análisis en clean lab (i.e. digestiones ácidas, separación quí-mica) para la determinación de elementos traza y ultratraza mediante ICP-MS en matrices tanto orgánicas e inorgánicas.

Más de 4 años trabajando en proyectos en Sudamérica (Bolivia, Ecuador, y Guyana Francesa) sobre los impactos medioambientales y sanitarios de actividades extractivas -minería y pe-tróleo- así como también de la agricultura, coordinados por el Instituto de Investigación para el Desarrollo (IRD, Francia) y llevados a cabo en los laboratorios GET (Géosciences Environnement Toulouse) y MAGIC (MAss Spectrometry and Isotope Geochemistry, Imperial College London).

Actualmente es investigadora postdoctoral en el departamento de Recursos Renovables de la Universidad de Alberta en Edmonton trabajando en la caracterización del material particulado emitido por la extracción y refinamiento de arenas bituminosas en la provincia de Alberta, Canadá. Además, es investigadora principal del Instituto de Cultivos Tropicales (ICT) en Tarapoto, Perú, en un proyecto sobre la determinación de metales pesados en frutas y verduras consumidos en la región de San Martín y riesgos asociados por ingestión.

PhD. Fiorella Barraza Castelo

PrefacioEl presente manual sobre la determinación de Cd en cacao ha sido elaborado en base a la experiencia de investigadores nacionales e internacionales y como resultado del Semi-nario-Taller «Técnicas de Laboratorio para el análisis de metales pesados en especial del cadmio (Cd) en cacao y subproductos» dictado el 24 y 25 de abril del 2019, organizado por el Proyecto Cacao Seguro, la Agencia de los Estados Unidos para el Desarrollo Internacio-nal (USAID), el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y por la ONG Internacional TechnoServe.

Si bien es cierto los laboratorios de nuestro país tanto públicos como privados, dedicados a la investigación o a la calidad alimentaria, presentan una serie de limitaciones y dificul-tades, cuentan con profesionales altamente capacitados que realizan este tipo de análisis de forma rutinaria, siguiendo sus propios protocolos o siguiendo la norma de INACAL (Ins-tituto Nacional de Calidad del Perú, NTP 208.030:2015). Sin embargo, puede ocurrir que teniendo la misma muestra se obtengan resultados muy diferentes.

Frente a esta problemática, la uniformización de un protocolo para la determinación de Cd se presenta como una alternativa para garantizar la calidad del análisis. Pero esto implica-ría a la vez que muchos laboratorios tengan que renovar equipos o adquirir reactivos que no se encuentran al alcance de todos.

Es por esta razón que en el presente manual proponemos una serie de protocolos que pue-den ser adaptados de acuerdo de la situación actual de cada laboratorio además de una serie de recomendaciones a tener en cuenta para mejorar los procedimientos ya existentes.

ContenidoGlosario de términos 02 1. Introducción 04 1.1 El cultivo de cacao: algunos datos claves en Perú 04 1.2 Problemática del cadmio (Cd) 05 1.3 Normativa internacional sobre los niveles de cadmio (Cd)

en derivados del cacao 06 1.3.1 Unión Europea 06 1.3.2 Codex Alimentarius 07 1.3.3 Otros 07 2. Objetivos 09 3. Determinación de elementos traza en muestras vegetales 09 3.1 Tipos de digestión 10 3.1.1 Digestión seca 10 3.1.2 Digestión húmeda 11 3.2 Revisión bibliográfica de la digestión ácida en muestras de cacao 12 4. Metodología propuesta 13 4.1 Propuesta de protocolo de determinación de Cd en condiciones reales 13 4.1.1 Preparación de la muestra 14 4.1.2 Lavado del material 15 4.1.3 Recomendaciones sobre los reactivos 15 4.1.4 Descripción de los protocolos de digestión 16 a. Protocolo opción 1 16 b. Protocolo opción 2 18 4.2 Propuesta de protocolo de determinación de Cd en condiciones óptimas 20 4.2.1 Consideraciones 20 4.2.2 Descripción de una rutina de análisis clásica 21 a. Preparación de la muestra 21 b. Lavado del material de laboratorio 22 c. Digestión ácida en microondas o en hotplate 22 d. Análisis al ICP-MS 24 4.3 Procesamiento y validación de datos 26 5. Conclusiones y recomendaciones 30 6. Referencias bibliográficas 31

ANEXOS 35 Anexo 1. Flujograma de la elaboración del chocolate 35 Anexo 2. Revisión bibliográfica sobre los diferentes métodos utilizados

para la determinación de Cd en cacao en países o productos de Latinoamérica del año 2015 al 2019 publicados en revistas internacionales indexadas 36

Contactos útiles: 45

Índice de Tablas

Índice de Figuras

Tabla 1. Anteproyecto de niveles máximos para el Cd en productos derivados del cacao. 08

Tabla 2. Comparación entre digestión en sistema abierto y cerrado. 11

Tabla 3. Límites de detección y de cuantificación de ciertos metales pesados analizados en ICP-MS§ calculados a partir de 10 blancos de HNO3 2%. 27

Tabla 4. Ejemplos de límites de detección (MDL) de elementos traza para diferentes métodos de cuantificación de elementos traza y en diferentes tipos de muestras. 28

Tabla 5. Material de referencia utilizado en la digestión de muestras de cacao (chocolate, licor de cacao, granos en polvo, cascara y hojas). 29

Figura 1. Árbol de Theobroma cacao 04

Figura 2. Niveles máximos de Cd en productos derivados del cacao 07

Figura 3. Equipos para moler las muestras de cacao. 15

Figura 4. Material a utilizar en el protocolo de digestión opción 1. 16

Figura 5. Ejemplo del material a utilizar en el protocolo de digestión opción 2. 18

Figura 6. Clean lab del laboratorio MAGIC del Imperial College de Londres. 20

Figura 7. Etapas de la preparación de la muestra antes de la digestión ácida. 21

Figura 8. Tipos de reactores y equipos para digestión ácida. 23

Figura 9. Determinación de Cd mediante ICP-MS 25

Figura 10. Secuencia de análisis para ICP-MS 25

Figura 11. Curva de calibración para Cd 26

Glosario de términos

Ácido bidestilado: La contaminación del reactivo aumenta la concentración de fondo de los analitos presen-tes en una muestra. Cuando la masa de la muestra a analizar es pequeña, es fundamental mantener bajos los niveles de blanco para una buena reproducibilidad. Es por ello que muchos laboratorios destilan hasta dos veces ácidos de grado comercial o incluso los de grado analítico antes de ser utilizados para digerir muestras sólidas. Existen varios sistemas, sin embargo, la destilación convencional (por ebullición) genera partículas en aerosol, lo que resulta en la contaminación del destilado. En contraste, una evaporación suave de la superficie durante la destilación por debajo del punto de ebullición (de ahí el nombre en inglés: «sub-boiled acid») evita la formación de rocío o gotas, produciendo ácidos de alta pureza.

Agua bidestilada: Conocida también como agua deionizada, suprapura o Milli-Q® (en referencia al equipo comúnmente utilizado en laboratorio). Existen varios sistemas de purificación, pero por lo general para obtener el agua suprapura, el agua corriente es filtrada en una membrana de osmosis inversa, la cual es almacenada en un tanque de polietileno para minimizar los riesgos de contaminación. Luego, pasa a través de una lámpara UV de doble longitud de onda de larga duración, que garantiza la degradación de las moléculas orgánicas por fotooxidación. Y por último el agua pasa por cartucho de purificación para alcanzar una resistividad de 18.2 MΩ. cm (a 25 ° C) y un valor de carbono orgánico total por debajo de 5 ppb. El sistema de purificación se puede colocar dentro de una campana de flujo laminar localizada en un clean lab, garantizando que además de ser purificada esta no sea conta-minada por partículas presentes en el ambiente.

Blanco: Instrumental y de reactivo (o método de laboratorio). Los blancos instrumentales corres-ponden a la matriz en la cual se preparan las soluciones de calibración del instrumento analítico. Los blancos de reactivo son cantidades iguales de los reactivos que fueron usa-dos para la digestión de las muestras y que son tratados de la misma forma. Los blancos son excelentes indicadores de control de calidad, tanto desde el punto de vista analítico como de la competencia del analista de laboratorio. Además, nos permiten calcular los límites de detección y de cuantificación tanto del instrumento como del método.

Clean lab: O sala limpia, es un ambiente de laboratorio en el que se toman medidas para reducir la contaminación por partículas y controlar otros parámetros ambientales como la tempera-tura, la humedad y la presión. El componente clave es el filtro de aire de partículas de alta eficiencia (HEPA) que se usa para atrapar partículas de 0.3 micrones y más grandes. Todo el aire entregado a una sala limpia pasa a través de los filtros HEPA y, en algunos casos, se utilizan filtros de aire de partículas ultra bajas (ULPA). Estos laboratorios se clasifican de acuerdo a cuan limpio es el aire en términos del máximo de partículas (de diferentes diáme-tros) por m3. Por lo general este tipo de laboratorios se construyen con materiales libres de metales ya que la constante manipulación de ácidos concentrados termina por corroerlos.

02 Guía para la determinación de cadmio (Cd) en muestras de cacao en grano y en polvo

Digestión: O mineralización, es un método para disolver una muestra en solución, agregando ácidos (y otros reactivos) y calentando, hasta lograr la descomposición completa de la matriz para el análisis de elementos traza en ICP-MS, ICP-OES o AAS.

Hotplate: O placa caliente, es un dispositivo fabricado de preferencia en un material inerte como el grafito y en muchos casos sellados con un revestimiento de teflón. Es un dispositivo ideal para la digestión y evaporación de muestras en cualquier laboratorio de elementos traza. El hotplate alcanza una temperatura de hasta 150° C y se recomienda su uso dentro de una campana de extracción.

ICP-MS: «Inductively coupled plasma mass spectrometer», el espectrómetro de masas por plasma acoplado inductivamente es un instrumento altamente sensible capaz de determinar de forma cuantitativa casi todos los elementos de la tabla periódica que tengan un poten-cial de ionización menor que el potencial de ionización del argón a concentraciones muy bajas (del orden de ppt o ng/L). Se basa en el acoplamiento de un método para generar iones (plasma acoplado inductivamente) y un método para separar y detectar los iones (espectrómetro de masas). Las muestras son introducidas en forma líquida, es por ello que tienen que ser previamente mineralizadas o digeridas en laboratorio.

Reactivos de grado analítico: También conocidos como suprapuros, son reactivos con bajo contenido de impurezas. La pureza de los reactivos es fundamental para la exactitud de los análisis de elementos traza.

Rendimiento: («Recovery» en inglés) es la relación entre la concentración de analito encontrada y la in-dicada como presente en el material de referencia. Un rendimiento de entre el 80 y el 115% es considerado como válido.

Savillex: Marca de tubos de digestión, conocidos también como reactores o viales, en PFA (perfluoro-alkoxi-alkano) utilizados en análisis de elementos traza tanto para la preparación como para el almacenamiento de muestras. El fondo plano y la resistencia a altas temperaturas (hasta 260°C) los hace ideales para ser utilizados en digestión en hotplate. Moldeados a partir de PFA virgen de alta pureza, son químicamente inertes, con un contenido de trazas de metal ultra bajo. Estos viales son reutilizables, siguiendo un protocolo de limpieza especial.

SRM: Del inglés «standard reference material», también se conoce como «certified reference material, CRM». El material de referencia certificado (MRC) son materiales que se usan para verificar la calidad y trazabilidad metrológica de productos, para validar métodos de medición analíticos o para calibrar instrumentos analíticos. Por ejemplo, en el caso de metales pesados en una matriz vegetal, se reportan los valores determinados para estos elementos, así como la incertidumbre con un nivel de confianza declarado que refleja la dispersión de los valores medidos. Este material es lo suficientemente homogéneo y estable y se fabrica por lotes, además está acompañado de documentación emitida por un organismo autorizado, como es el caso del NIST (National Insitute of Standards and Technology) o de la JRC (European Commission’s Joint Research Centre).

Guía para la determinación de cadmio (Cd) en muestras de cacao en grano y en polvo 03

1.1 El cultivo de cacao: algunos datos claves en Perú

Theobroma cacao es un árbol o arbusto cuyo fruto es una baya grande (mazorca) y al interior se encuentran semillas (o granos) envueltos en una pulpa blanquecina (Figu-ra 1). El cacao es uno de los productos agrícolas de mayor importancia en el mundo, debido a que se obtienen una serie de productos como el chocolate. El proceso de elaboración del chocolate consiste en la fermentación, secado, tostado, molienda de granos de cacao, mezcla de todos los ingredientes (masa de cacao, azúcar, manteca de cacao, emulsionantes, aroma y componentes de la leche si es necesario), conchado y templado (Barišić et al., 2019) (Anexo 1).

Figura 1. Mazorcas de Theobroma cacao.

El cacao es un cultivo que se desarrolla básicamente en la selva peruana, entre los 300 y 900 m.s.n.m. En el Perú se producen tres variedades de cacao: Trinitario 53.3% (Ju-nín), forastero amazónico 37.3% (Cusco y Ayacucho) y criollo 9.4% (zona norte de San

Introducción1.

Fruto

Cáscara

Granos


Martín, Amazonas y Cajamarca). Además, Perú es considerado uno de los principales productores y proveedores de cacao fino y de aroma y el segundo productor de cacao orgánico a nivel mundial. Asimismo, el 60% de la biodiversidad existente de cacao (ma-terial genético) se encuentra en nuestro país (MINAGRI, 2020).

Las principales regiones productoras de cacao son San Martín (48.5 mil toneladas, 35.6% de participación), Junín (25.5 mil toneladas, 18.8% de participación), Ucayali (17 mil toneladas, 12.5% de participación), además de Huánuco y Cusco con 13 y 10 mil toneladas respectivamente. Estas 5 regiones representan cerca del 84% de la produc-ción total nacional (MINAGRI, 2020). Sin embargo, existen áreas cultivadas instaladas en los departamentos costeros de Tumbes y Piura, que en los últimos años han tenido un crecimiento importante destacando por la producción de cacao blanco (MINAGRI, comunicación personal).

La producción nacional de cacao en grano viene incrementándose sostenidamente desde hace 10 años, creciendo a una tasa de 12.6% promedio anual, alcanzando duran-te el 2019 las 135.9mil toneladas. Los principales países de destino de las exportaciones de cacao en grano son Holanda, Bélgica, Estados Unidos e Indonesia; participando con un 56% del total exportado (MINAGRI, 2020).

1.2 Problemática del cadmio (Cd)

El origen del Cd en el suelo puede ser producto de procesos tanto naturales (geogéni-cos) como adicionados por la actividad humana (antropogénicos). Dentro del primero se incluye la meteorización de las rocas, la actividad volcánica, los incendios forestales, la erosión y la deposición en los sedimentos de los ríos, mientras que en el segundo se incluyen las actividades mineras e industriales, así como prácticas agrícolas de riego y fertilización (Meter et al., 2019).

Como el Cd es móvil a pH ácido (entre 4.5 y 5.5) es fácilmente absorbido por las plan-tas, acumulado en diversas partes –como raíces, frutos y hojas- ingresando así a la cadena trófica (Kabata-Pendias and Szteke, 2015). El Cd al no ser esencial para el ser humano se almacena en los riñones y en hígado (ATSDR, 2012) y es clasificado como un compuesto cancerígeno por la Agencia Internacional de investigación en cáncer (IARC, 2017), teniendo además otros efectos tóxicos a nivel de huesos, riñones sistema inmunológico (Nordberg and Nordberg, 2016).

La alimentación constituye la principal vía de exposición (90%) al Cd en la población no fumadora. El otro 10% ocurre debido a la inhalación de partículas en el aire conte-niendo niveles muy bajo de Cd o a través del consumo de agua. Según lo reporta la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) altos niveles de Cd han sido re-portados en formulaciones de algas, productos a base de cacao, crustáceos, despojos comestibles, hongos, semillas oleaginosas, algas marinas y moluscos acuáticos (EFSA, 2012).


La concentración de Cd en los tejidos de una planta disminuye a partir de las raíces> tallos > hojas > cáscaras de las mazorcas > semillas. Una tendencia similar se observa en el cacao donde se ha reportado una disminución en la concentración de cadmio desde la hoja a la cáscara de la mazorca hasta el grano descascarado (Meter et al., 2019). Un estudio reciente que empleó LA-ICP-MS (ablación láser como sistema de introducción de muestra a la espectrometría de masas con fuente de plasma de aco-plamiento inductivo) confirmó que las concentraciones de Cd disminuyen de la testa a los cotiledones (nib); es similar en los cotiledones, placenta y la mazorca, y estos a su vez presentan una mayor concentración de Cd en comparación con el mucílago. Este estudio además señala que en los granos de cacao no fermentados el Cd está unido a ligandos O/N tanto en los cotiledones como en la testa y que la fermentación induce una migración externa de Cd en contra del gradiente de concentración total, es decir, de los cotiledones a la testa (Vanderschueren et al., 2020).

1.3 Normativa internacional sobre los niveles de cadmio (Cd) en derivados del cacao

1.3.1 Unión Europea

La Comisión Técnica de Contaminantes de la Cadena Alimentaria (Contam) de la EFSA dictaminó el 30 de enero del 2009 que los alimentos que contribuyen en mayor grado a la exposición alimentaria al Cd son los cereales, hortalizas, frutos secos, legumbres, raíces feculentas, papas, carne y sus derivados. Posteriormen-te se estableció una ingesta semanal tolerable (IST o PTWI en inglés) de Cd de 2.5 μg/kg por peso corporal (EFSA, 2012).

Sin embargo, también se observó otros productos alimenticios como el chocola-te y el cacao en polvo constituyen una importante fuente de exposición humana a este elemento. Puesto que los niveles de Cd en los productos de cacao están relacionados con su contenido de cacao, se acordó establecer distintos niveles máximos de Cd para los productos con diferentes porcentajes de cacao, como se observa en la Figura 2., de acuerdo al Reglamento (UE) N° 488/2014 de la Co-misión de la Unión Europea el 12 de mayo del 2014 (The European Commission, 2014) y que entró en vigencia el 1ro de enero del 2019.

La categoría «cacao en polvo» designa al producto obtenido a partir de granos de cacao que han sido limpiados, descascarados y tostados, que contienen no menos del 20% de manteca de cacao -calculado de acuerdo al peso de la mate-ria seca- y no más del 9% de agua. En este caso, la norma se refiere al producto vendido al consumidor final o como ingrediente en cacao en polvo edulcorado vendido al consumidor final (chocolate para beber). No aplica para el cacao en polvo vendido para el procesamiento de otros alimentos.


Por otro lado, no existe norma para el Cd en granos de cacao sin procesar.

Figura 2. Niveles máximos de Cd en productos derivados del cacao (modificado a partir de: The European Commission, 2017).

1.3.2 Codex Alimentarius

Desde el 2012 el comité del Codex sobre contaminantes de los alimentos -pro-grama conjunto de la FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Alimen-tación y la Agricultura) y la OMS (Organización Mundial de la Salud)- acordó incluir una propuesta de evaluación de la exposición al Cd a través del cacao y productos del cacao.

En años posteriores, se prepararon diversos documentos sobre los niveles máxi-mos en chocolate y otros, encontrándose varias dificultades como por ejemplo respecto a las categorías de derivados a ser considerados como: materia prima (granos de cacao enteros, sin cascara), productos intermedios (licor de cacao, cacao en polvo) y productos listos para el consumo. Luego de haber recabado más información y a pesar de no haber consenso entre los países participantes, se actualiza el anteproyecto en la última sesión de mayo del 2019 (Tabla 1).

1.3.3 Otros

De acuerdo a una publicación de Jiménez Tobón (2015), de la legislación revisada en 23 países -considerando a la Unión Europea como un solo país- el 22 % esta-blecen límites para el cadmio en el chocolate y/o sus derivados. Dentro de ellos, en Australia y Nueva Zelanda los valores máximos permitidos de Cd en chocolate

Cuanto más porcentaje de cacao, más alto es el nivel máximo de cadmio

0.10 mg/kg 0.30 mg/kg 0.80 mg/kg

Cacao en polvo

0.60 mg/kg

30% 30%

50%50%


y derivados del cacao es de 0.5 mg/kg. En Argentina el límite es de 0.2 y 0.3 mg/kg para productos con menos y más de 40% de cacao respectivamente.

Tabla 1. Anteproyecto de niveles máximos para el Cd en productos derivados del cacao.

Producto /Denominación del producto

Nivel máximo (NM) (mg/kg)

Observaciones

Productos del chocolate que contienen o declaran <30 % del total de sólidos de cacao sobre la base de materia seca.

0.3 – 0.4 Incluidos el chocolate con leche, el chocolate familiar, la cobertura de chocolate con leche, el chocolate gian-duja con leche, el chocolate de mesa, los vermicelli y las hojuelas de chocolate con leche.

Chocolate y productos del chocolate que contienen o declaran entre ≥30 % y <50 % del total de sólidos de cacao sobre la base de materia seca.

0.9 Incluidos el chocolate dulce, el chocolate gianduja, el chocolate semiamargo de mesa, el chocolate vermi-celli/las hojuelas de choco-late, el chocolate amargo de mesa y el chocolate de cobertura.

El cacao en polvo (100 % del total de sólidos de cacao sobre la base de la materia seca).

3.0 – 4.0 Producto a la venta para su consumo final.

Fuente: Comisión del Codex Alimentarius (OMS and FAO, 2019).

En Estados Unidos la ASTDR (Agency for Toxic Substances and Disease Regis-try) menciona que la exposición al Cd por ingestión se da a través de verduras, papas, cereales y ciertas semillas, sin mencionar al cacao (Jiménez Tobón, 2015). Sin embargo, el año pasado en la Corte Superior de California en San Francisco se aprobó un acuerdo para que se realice un estudio a fin de investigar e infor-mar sobre las principales fuentes de Pb (plomo) y Cd en el chocolate para de-cidir si finalmente estos niveles requieren de advertencias en las envolturas de dichos productos (Yu, 2018).


La definición de elemento traza nunca ha sido precisa: puede ser considerado como “traza” en materiales biológicos pero no si hablamos de su concentración en suelos (Kabata-Pendias, 2011). En muestras vegetales o alimenticias, un elemento traza es aquel que se encuentra en concentraciones inferiores a 0.01% (100 μg/g) (Gupta et al., 2019; Miano et al., 2014).

Desde el punto de vista analítico, los elementos traza se definen como aquellos que se encuentra por debajo de 1 ppm (μg/g) o en su defecto cuando la concentración del analito es lo suficientemente baja como para causar dificultades (Gaines, 2019).

Para cuantificar los elementos traza contenidos en una matriz sólida utilizando dife-rentes tecnologías de espectroscopia como el AAS (espectrometría de absorción ató-mica), GF-AAS (espectrometría de absorción atómica de horno de grafito), ICP-OES

Determinación de elementos traza en muestras vegetales

3.

Los objetivos del presente manual son:

� Revisar la metodología existente para la determinación de elementos traza en muestras vegetales, especialmente en cacao.

� Proponer 3 protocolos de determinación de Cd en cacao, tanto en condiciones reales como en condiciones óptimas.

� Proporcionar una serie de recomendaciones en cada etapa del protocolo para ga-rantizar la calidad del análisis efectuado.

� Dar pautas sobre el procesamiento y validación de datos obtenidos por espectro-metría para garantizar la calidad del análisis efectuado.

Objetivos 2.


(espectrometría de emisión óptica) o ICP-MS (espectrometría de masas) es necesario que la muestra en cuestión se encuentre en forma líquida. Este procedimiento se conoce como digestión o mineralización (conversión de la materia orgánica a un estado inor-gánico), cuyos objetivos son:

� La disolución completa de los elementos a analizar. � La descomposición completa de la matriz en la que se encuentran los elementos

a analizar. � Evitar pérdidas y/o la contaminación de las muestras. � Reducir el tiempo de manipulación y tratamiento de las muestras (Berghof, 2019;

Curdová et al., 1998).

Existen diversos métodos para la preparación y análisis de las muestras. La selección de uno de ellos depende en gran medida del elemento a analizar, del rango de con-centración del elemento, de la matriz, de la instrumentación disponible y del tamaño, cantidad o volumen disponible de la muestra y las potenciales fuentes de contamina-ción al preparar la muestra (Gaines, 2019).

3.1 Tipos de digestión

Dependiendo del sistema que se utilice para el análisis de elementos traza existen dos técnicas:

� Digestión de sistema abierto: como la digestión seca o de cenizas (calcinación), en beaker con sistema de reflujo.

� Digestión de sistema cerrado: se refiere a la digestión en microondas pero dentro de reactores cerrados herméticamente que soportan altas presiones y temperaturas.

Actualmente el primer método ha sido remplazado por la digestión en microondas que es mucho más rápida y eficiente. Mientras que la calcinación puede tomar varios días, el microondas -dependiendo del modelo- puede mineralizar un buen número de muestras en menos de una hora (Berghof, 2019; Mohamed et al., 2020).

Algunas ventajas y desventajas de los sistemas de digestión se muestran en la Tabla 2.

Desde el punto de vista del tipo de digestión, existen dos métodos que se describen a continuación.

3.1.1 Digestión seca

La ceniza en la química analítica se define como el calentamiento de una sustan-cia para dejar solo cenizas no combustibles, que son analizadas para determinar su composición elemental.

La ceniza en seco se obtiene colocando la muestra en un recipiente inerte y abierto donde se destruye la fracción orgánica (calcinación) a altas temperatu-ras (450-500°C), utilizando un horno de mufla (Gaines, 2019).


Luego de obtener la ceniza se procede a añadir ácidos (HNO3 y HCl), calentar, evaporar a seco y después filtrar para finalmente diluir antes de proceder a la lectura de la muestra (Pequerul et al., 1993).

El método de ceniza es muchas veces recomendado porque se utiliza menos cantidad de reactivos, hay menor riesgo al manipular y porque no se requieren de equipos complejos (Akinyele and Shokunbi, 2015; Gaines, 2019). Sin embargo también hay desventajas como pérdidas debido a la volatilización o debido a que parte de la muestra se queda adherida a los crisoles, contaminación por crisoles o por el horno, dificultad para disolver ciertos tipos de óxidos (Gaines, 2019).

Tabla 2. Comparación entre digestión en sistema abierto y cerrado.

Digestión en sistema abierto Digestión en sistema cerrado

� Temperatura máxima limitada por el punto de ebullición de la solución. Si se usan reactores de teflón de tipo Savillex® y la digestión se realiza en hotplate, la temperatura máxima es de 140°C.

� Máxima temperatura, dependiendo del equipo, de 260 a 300°C.

� Mayor riesgo de contaminación, in-cluyendo elementos mayores como Na, K, Ca, Mg.

� No hay riesgo de contaminación. Los blancos de reactivos presentan menos impurezas.

� Digestión frecuentemente incompleta. � Digestión completa.

� Pérdida de elementos volátiles (Hg, Pb).

� No hay pérdidas de elementos volátiles.

� Tiempo de digestión: hasta 24 horas. � De 20 a 60 min, dependiendo del equipo y del tipo de muestra.

� Menor cantidad de muestra lo cual puede no ser representativo cuando el cadmio está en concentraciones bajas, dependiendo de las condicio-nes en las que se realiza el análisis (clean lab vs laboratorio tradicional).

Cantidad de reactivos: depende del método y de la muestra.

Modificado a partir de Berghof (2019).

3.1.2 Digestión húmeda

La digestión húmeda se realiza a partir de la muestra debidamente molida a la cual se le añaden una serie de reactivos cuyo objetivo es, entre otros, destruir la materia orgánica:


� HNO3: ácido oxidante que forma nitratos solubles con casi todos los elementos. � HNO3 y H2O2: reoxida el NOx en NO3-, rompe enlaces peptídicos. � HCl: ácido no oxidante que forma cloruros con casi todos los elementos, di-

suelve sales de ácidos débiles (carbonatos, fosfatos, boratos). Se le usa para la descomposición de matrices inorgánicas.

� HNO3 y HCl: destruye sulfuros. � H2SO4: ácido no oxidante, fuerte agente deshidratante. � HClO4: por lo general se usa en combinación con otros ácidos, especialmente

el nítrico. Bastante apropiado para la digestión de matrices que contienen grasa, proteínas y lípidos ya que los percloratos que se forman son solubles en agua. Es altamente reactivo, hasta incluso explosivo y si está caliente jamás debe añadirse a una matriz orgánica.

� HCl+HNO3: mezcla altamente oxidante conocida como agua regia (1:3), se utiliza principalmente en suelos.

� HF: es un ácido débil pero bastante efectivo para la descomposición de ma-trices que contienen silicatos; utilizado principalmente en suelos y muestras geológicas.

Estos reactivos son utilizados en diferentes volúmenes y proporciones, calentados a diferentes temperaturas, por un cierto tiempo y en algunos casos evaporados a seco (Gaines, 2019; Mohammed et al., 2017; Müller et al., 2014).

Algunos autores señalan que el nivel de elementos traza en matrices como frutas y vegetales analizados por el método de cenizas son ligeramente más altos (Cd: 0.09±0.04 μg g-1, AAS) que cuando se efectúa una digestión húmeda ácida (Cd: 0.08±0.04 μg g-1, AAS), pero que en general no hay una diferencia significativa entre ambos (Akinyele and Shokunbi, 2015).

3.2 Revisión bibliográfica de la digestión ácida en muestra de cacao

Las muestras de cacao son complejas y difíciles de analizar debido a su alto conte-nido de grasa o a la presencia de otros constituyentes químicos como ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, fitosteroles, tocoferoles, azúcares, polifenoles, teobromina y cafeína (Mohamed et al., 2020). Es por ello que en la bibliografía se encuentran di-versos métodos para la cuantificación de Cd y otros elementos traza; sin embargo, en muchos casos se omite información sobre la validación de dichos métodos como lo son los límites de detección, cuantificación, rendimiento del material de referencia, precisión y reproducibilidad. En el Anexo 2 se presenta un resumen de algunos de es-tos métodos.

Es importante anotar que, aun cuando, la Unión Europea haya fijado un valor máximo para el contenido de Cd en el chocolate, aun no existe un protocolo a seguir para la determinación de este elemento.

En el caso de los certificados del material de referencia (SRM: standard reference ma-terial) como el NIST 2384 Baking chocolate, encontramos información sobre cuáles fueron las diferentes técnicas de espectrometría utilizadas para el análisis de cada


El desarrollo de un procedimiento de digestión es un paso importante antes de la in-troducción de muestras en equipos basados en técnicas de espectrometría atómica como se mencionó en el punto 3 y se deben considerar varios parámetros relaciona-dos con la matriz de las muestras, el analito en sí y las técnicas de determinación para lograr resultados confiables y garantizar la calidad del análisis.

En cuanto a las muestras, el rango de concentración del analito es sumamente impor-tante porque la masa de la muestra y la dilución final de la solución mineralizada afec-taran los límites de detección de la técnica utilizada (LD). En cuanto a las diluciones, la mayoría de elementos son solubles o estables en HNO3.

En el caso del HCl, que es el 2do ácido más utilizado en las digestiones, debido a que es corrosivo y volátil puede dañar el sistema eléctrico de equipos como el ICP-MS, por ello se recomienda reducir la exposición y de preferencia no preparar diluciones con este ácido (Gaines, 2019).

La correcta elección de reactivos también es una etapa clave. Por ejemplo, en algunos casos el uso de H2SO4 puede formar sulfatos con algunos elementos que conlleven a interferencias cuando se usa el ICP-MS o el GF-AAS. Del mismo modo, una digestión ineficiente o incompleta genera interferencias (efecto matriz) (Müller et al., 2014).

4.1 Propuesta de protocolo de determinación de Cd en condiciones reales

En Perú, se aprobó mediante Resolución Ministerial N° 0451-2018-MINAGRI un docu-mento denominado «lineamientos de muestreo para la determinación de niveles de cadmio en suelos, hojas, granos y productos derivados de cacao», a partir del cual

Metodología propuesta

4.

elemento: ICP-OES para elementos como el Ca, Cu, Fe, Zn e ICP-MS para el Pb y Cd; así como el tipo de digestión, en este caso en microondas con HNO3. Esto no quiere decir que esos sean los únicos métodos válidos para la determinación de dichos elementos.

En Perú existe una norma técnica del Instituto Nacional de Calidad (INACAL) para la determinación de Cd, Cu, Fe y Zn en chocolate y cacao (NTP 208.030:2015) donde primero se calcina la muestra antes de adicionar los ácidos (HNO3 y HCl) y finalmente se procede a la lectura por AAS o GF-AAS.


se desarrollaron protocolos aprobados con Resolución Ministerial N° 007-2019 para la determinación de niveles de cadmio en suelos, hoja, agua y granos de cacao. El objetivo de este documento es de establecer el procedimiento técnico para obtener muestras representativas del suelo, evaluar la contaminación de metales totales (inclu-yendo Cd) sobre la calidad de los recursos hídricos; y establecer el procedimiento para la adecuada obtención, acondicionamiento y envío de muestras de hojas y los granos de cacao (MINAGRI, 2018).

Teniendo en cuenta los alcances mencionados anteriormente además de las limitacio-nes de los laboratorios tanto públicos como privados en términos de reactivos y equi-pos (de ahí el término «condiciones reales»), así como también la bibliografía revisada en la sección 3.2, proponemos a continuación 2 protocolos que pueden ser adaptados.

Antes de empezar a trabajar, asegúrese que el laboratorio donde se realizarán cada una de las etapas se encuentre totalmente limpio. Se recomienda limpiar las mesas de trabajo con agua bidestilada para eliminar cualquier resto de muestras que pueden haber sido tratadas anteriormente.

4.1.1 Preparación de la muestra

Cuando la muestra es recibida en el laboratorio, esta debe mantenerse en un lugar seco, fresco y protegido de la luz natural. Además, debe permanecer sellada hasta que se proceda a realizar los análisis.

En caso los granos de cacao lleguen frescos, se debe proceder al secado ya sea en campana de flujo laminar, en estufa o combinando ambos métodos (Barraza et al., 2017) como se describe en la sección 4.2.2. El uso de un liofilizador puede ayudar a acelerar el proceso de secado de los granos de cacao siempre y cuando los granos frescos hayan sido congelados a -60°C. Cabe mencionar que el liofili-zador remueve el agua por volatilización y desorción, pero no reduce la materia grasa.

Para evitar que los granos frescos se descompongan, estos deben ser refrigera-dos o congelados si es que el secado no se hará de inmediato.

No existe ninguna publicación científica que mencione por cuanto tiempo y a que temperatura pueden ser conservadas las muestras de granos de cacao. En todo caso, desde el punto de vista analítico, cuando las muestras ya han sido procesadas se debe evitar que estén expuestas a la humedad para evitar errores al momento de pesarlas.

Los granos de cacao secos deben ser homogeneizados ya que es muy probable que no tengan el mismo contenido de Cd, por esta razón se recomienda moler la totalidad de la muestra recibida. Por homogenizado se entiende que la muestra obtenida luego de la molienda debe ser un polvo fino. Para información adicio-nal sobre los lineamientos de muestreo de granos de cacao de un mismo lote, consultar la Resolución Ministerial N° 0451-2018-MINAGRI (MINAGRI, 2018).

Algunos ejemplos de los equipos de molienda disponibles en el mercado se mues-tran en la Figura 3.


Figura 3. Equipos para moler las muestras de cacao.

Para facilitar la molienda en mortero o en mixer se puede utilizar nitrógeno líqui-do que se encuentra a una temperatura de -196°C. Tener en cuenta que el uso de este gas necesita de la protección adecuada (lentes y guantes térmicos), ade-más de un dewar criogénico para el transporte y almacenamiento. Congelar las muestras a -20 o -60°C no reemplaza el uso del nitrógeno líquido.

Es muy importante que los equipos sean debidamente limpiados entre muestra y muestra. Por ejemplo, en el caso del mortero se limpia primero con etanol y luego se enjuaga con agua bidestilada.

4.1.2 Lavado del material

Se deben realizar dos tipos de lavados dependiendo del material:

� Material de plástico (conos de pipetas, frascos, etc): en una solución de HCl comercial 1N (que puede ser reutilizado una vez) por al menos 2 horas, luego enjuagados 3 veces con agua bidestilada. Secar en campana con extracción de aire y almacenar en bolsas tipo ziploc.

� Material de vidrio (beakers o viales, lunas de reloj): detergente al 1% v/v (ej. Extran® MA 02), luego en una solución de HNO3 (o en HCl) al 5 o 10% v/v y finalmente enjuagados 3 veces con agua bidestilada. Secar en campana con extracción de aire. Si es posible se recomienda que el lavado se realice a una temperatura de 90-100°C, al menos de 2 horas por cada etapa.

4.1.3 Recomendaciones sobre los reactivos

Para evitar la contaminación de los reactivos de grado analítico se recomienda: � Nunca pipetear el volumen de ácido requerido directamente de la botella.

Transferir el ácido a una botella de teflón con tapa u otro contenedor donde se pueda almacenar temporalmente. Si quedase algún residuo, nunca devol-verlo a la botella y tampoco descartarlo. Se puede utilizar en un siguiente set de muestras.

MOLINO DE ANILLOS (O DISCOS) VIBRATORIOS

MORTERO EN ÁGATA MIXER


� Mantener los ácidos en un lugar fresco y manipular dentro de una campana con extracción de aire, siempre con guantes.

� En el caso de utilizar H2O2, guardar refrigerado y solo sacar cuando se vaya a utilizar. Del mismo modo que con los ácidos, transferir cierto volumen a una botella o frasco, pero de color oscuro.

4.1.4 Descripción de los protocolos de digestión

a. Protocolo opción 1

Este protocolo fue diseñado por la Dra. Laurence Maurice del IRD, al cual se le han hecho algunas modificaciones. La digestión se puede realizar en mate-rial de vidrio o de teflón (si está disponible, ver sección 4.2.2 para el lavado) y los reactivos son de grado analítico (ej. HNO3 al 65% de pureza)El material a utilizar se muestra en la Figura 4.

Figura 4. Material a utilizar en el protocolo de digestión opción 1.

HNO3 GRADO ANALÍTICO 65%

BEAKERS

FILTROS WHATMAN®

H2O2 GRADO ANALÍTICO 30%

LUNAS DE RELOJ

SISTEMA DE HOTPLATE+ RACK ANALAB®


El protocolo se describe a continuación:

1 Pesar 500 mg de muestra seca y molida en beakers de 25 ml.

2 Agregar 4 ml de HNO3 65% (~15M) y 1 ml de H2O2 30%.

3 Tapar los beakers con lunas de reloj.

4 Dejar a temperatura ambiente por 4 horas.

5 Agregar 5 ml de HNO3 65% y poner en hotplate a 80°C por 2 horas.

6 Aumentar la temperatura del hotplate (placa caliente o equivalente) a 120°C por 2 horas.

7 Dejar evaporar a seco a 90°C.

8 Resuspender el residuo en 0.5 ml de HNO3 65% y 19.5 ml de agua bidestilada (R≥18.2 M Ω.cm).

9 Mezclar bien la solución con una varilla de vidrio.

10 Filtrar la totalidad la solución con papel Whatman® grado 542 o con jeringa y acrodisco de 0.45 μm.

11 Almacenar la solución madre (o solución de digestión) a 5°C hasta el análisis.

12 Diluir la solución filtrada (en HNO3 2%) para el análisis de Cd en función de los límites de detección del equipo a utilizar (ICP-OES o AAS).

No olvidar incluir blancos de reactivos y material de referencia (SRM) por cada set de muestras digeridas.

Notas adicionales:

� No olvidar que todo el proceso se realiza en una campana de extracción.

� Pasos 5 y 6: no hay riesgo de evaporación a seco si la solución se deja por un poco más de 2 horas a 80°C. Sin embargo, es recomendable que no permanezca por más de 3 horas a 120°C.

� Paso 10: la filtración no se debe realizar con agua destilada caliente. La so-lución a filtrar corresponde al residuo seco que es resuspendido en un total de 20 ml HNO3 2% (ojo: 0.5 ml HNO3 65% en 20 ml es equivalente a una solución de HNO3 2%). Se recomienda filtrar esta solución en su totalidad, en caso no existiera más muestra solida disponible o en caso se requiera repetir los análisis.


b. Protocolo opción 2

Este protocolo se realiza de rutina en el laboratorio de Ecología funcional y medio ambiente (ECOLAB) de Toulouse. Fue tomado a partir de Barraza et al., (2017) y otras publicaciones (Mombo et al., 2016; Uzu et al., 2014, 2009). Para ello se necesita de un bloque de digestión de tipo Digiprep, como se muestra en la Figura 5 o en su defecto un hotplate tradicional (Figura 4). Del mismo modo, el material a utilizar puede ser en teflón o en vidrio.

La ventaja de usar Digitubes® en polipropileno, de grado ICP-MS de acuerdo a la norma ISO 17025 (SCP science), está en que no necesitan ser lavados. Sin embargo, no son reutilizables.

El ambiente donde se realizara la mineralización no tiene que ser de tipo «clean lab» (ver sección 4.2.1), basta con que este solo se destine al análisis de las muestras, se encuentre debidamente limpio y cuente con una campana con extracción de aire para controlar los vapores de ácidos que se producirán durante la digestión.

Figura 5. Ejemplo del material a utilizar en el protocolo de digestión opción 2.

HOTBLOCK DE TIPO DIGIPREP® Y CAMPANA DE EXTRACCIÓN DE AIRE

DIGITUBES® DE 50 ML, RACKS, JERINGAS Y FILTROS


El protocolo se detalla a continuación:

1 Pesar un tubo Digitub® vacío.

2 Pesar 0.125 g de muestra seca y molida.

3 Agregar 5ml de HNO3 65% (~15 M).

4 Colocar los tubos en el bloque de digestión y dejar toda la noche a frío.

5 Si el bloque de digestión tiene una sonda de temperatura, agregar HNO3 al tubo que contiene dicha sonda.

6 Abrir los tubos con cuidado y dejarlos ligeramente abiertos por 10 min para que los gases se liberen.

7 Cerrar los tubos antes de lanzar el programa* (1h30 a 80°C).

8 Dejar enfriar 1 hora y agregar con mucho cuidado 5 ml de H2O2 al 30%.

9 Lanzar el programa nuevamente*, pero esta vez en dos etapas: 25 min a 55°C y luego 3h a 80°C.

10 Destapar los tubos, pero sin quitar las tapas, para que se liberen los gases producidos.

11 Aforar a 20 ml con agua bidestilada y pesar la solución.

12 Filtrar los ml necesarios para el análisis con una jeringa y filtro de 0.45 μm en teflón (acrodisco) o en su defecto con filtro de 0.22 μm en acetato de celulosa. Pesar la solución filtrada.

13 Guardar la solución filtrada a 5°C hasta el análisis.

14 Diluir la muestra madre (en HNO3 2%) para el análisis de Cd en función de los límites de detección del equipo a utilizar (ICP-MS, ICP-OES, AAS).

*Los mismos parámetros se aplican si la digestión se realiza en hotplate.



4.2 Propuesta de protocolo de determinación de Cd en condiciones óptimas

4.2.1 Consideraciones

Se entiende por «condiciones óptimas» cuando el laboratorio que realizará el aná-lisis cuenta con las instalaciones, equipos, reactivos y personal comparable a la-boratorios internacionales de investigación o de seguridad y calidad alimentaria.

El protocolo que se presenta en la sección 4.2.2 se realiza de rutina en el Labo-ratorio de Geociencias Medioambientales de Toulouse (GET) en Francia, que ha sido adaptado para muestras de granos y licor de cacao y publicado -aunque no de manera detallada- en diversas revistas indexadas (Barraza et al., 2019, 2018, 2017). Las últimas modificaciones que se le hicieron al mencionado protocolo fue-ron adoptadas luego de una colaboración con el laboratorio de Espectrometría de Masas y Geoquímica de Isotopos (MAGIC) del Imperial College de Londres en Inglaterra.

El ambiente donde se realiza el lavado de material y la digestión ácida se denomi-na «clean lab» (Figura 6). Un clean lab es una sala que se mantiene permanente-mente en sobrepresión, en comparación con el exterior, a través de una entrada forzada de aire filtrado. La atmósfera es controlada y libre de polvo (menos del 1%) con la finalidad de minimizar la introducción, generación y retención de partículas al interior.

Figura 6. Clean lab del laboratorio MAGIC del Imperial College de Londres.

El clean lab del GET se clasifica de acuerdo a sus diferentes zonas de trabajo entre ISO 5 e ISO 7, según la norma europea UNE-EN ISO 14644-1:2016 (sobre salas limpias y ambientes controlados asociados). Tanto la circulación de objetos (productos y materiales) así como de personas al interior está sujeta a reglas


muy estrictas para evitar toda fuente de contaminación de las muestras a tratar. Como ejemplo, se prohíbe el uso de prendas de lana, joyas, maquillaje, protecto-res solares, perfumes; o el ingreso de plástico, cartón, papel aluminio o cualquier objeto metálico.

En sus instalaciones encontramos campanas a flujo laminar y de extracción para digestiones o separaciones, puestos de evaporación o mineralización con hotpla-tes metálicas o en teflón, sistemas de purificación de agua por osmosis inversa (tipo Millipore Milli-Q o Element) con resistividad superior a 18.2 M Ω.cm, baños de ultrasonidos, centrifuga, campana de extracción horizontal para manipulación de productos peligrosos y otra para preparación de las muestras, un sistema de desti-lación de ácidos y 2 microondas (Mars 5 System y Discover SP-D, ambos de CEM).

Cabe mencionar que todos los reactivos utilizados para la digestión son de gra-do analítico y en algunos casos son destilados dos veces en un sistema de tipo Duopur®, con la finalidad de reducir al máximo la presencia de elementos traza y así no contaminar la muestra.

4.2.2 Descripción de una rutina de análisis clásica

Debido a que el protocolo que será descrito a continuación no sólo se utilizó para la determinación de Cd (incluyendo análisis isotópicos) si no de una serie de ele-mentos químicos que en muchos casos se podían encontrar en concentraciones de ultra-traza (ppb o ng/g), se tomaron una serie de precauciones que alargan el tiempo de análisis pero que garantizan la calidad del mismo. Cabe destacar que este protocolo se utilizó con fines de investigación.

a. Preparación de la muestra

Esta etapa se realiza en un laboratorio de química convencional y en una sala de molienda. Antes de la manipulación se debe proceder a la limpieza del lugar don-de se va a trabajar.

Si las muestras de cacao (sobretodo granos) llegan congeladas al laboratorio, se procede a liofilizarlas, caso contrario son secadas en una campana de flujo laminar (extendidas en bandejas de teflón) o en estufa a temperaturas que pueden supe-rar los 70°C si solo se analiza el Cd (Figura 7).

Figura 7. Etapas de la preparación de la muestra antes de la digestión ácida.

SECADO MOLIENDA ALMACENAMIENTO

Liofilización x 24 horas

Secado en campana de flujo laminar x 2 a 3 días

Secado en estufa a 40-70°C

Manualmente: N2 líquido en mortero de ágata

En un molino (ej. anillos vibratorios en ágata,

contenedores en inox)

En frascos de polipropileno

En ambiente fresco y seco


La molienda se puede realizar de varias formas, ya sea a mano o en un molino. Si se usa un molino de anillos, la materia grasa presente en el cacao (granos, licor, choco-late) hará que se forme una pasta que después puede ser molida en un mortero.

Finalmente, la muestra homogeneizada se almacena en frascos de polipropileno debidamente rotulados y se coloca en un ambiente libre de humedad si no se van a realizar los análisis en el momento como se mencionó en la sección 4.1.1.

b. Lavado del material de laboratorio

Previo a la digestión ácida, se realiza el lavado de todo el material en el clean lab: tips de pipetas, envases para preparar las diluciones (tubos de polipropileno de 10 y de 30 ml) y material del microondas (en teflón, cuarzo, nylon, dependiendo del equipo).

El protocolo de lavado se puede ir modificando conforme a los objetivos del estudio y al tiempo disponible.

Se resume a continuación:

� El material de plástico se lava en HCl 1 N (comercial) por un día y luego en agua Milli-Q otro día más. Enjuagar 3 veces con agua Milli-Q.

� El material en teflón se lava en 4 etapas: � Un día en detergente al 1% v/v (ej. Extran® MA 02) sobre hotplate a 120°C. � Un día en agua regia inversa comercial (HNO3: HCl) sobre hotplate a 120°C. � Un día en HF diluido a 120°C (etapa que puede ser obviada). � Un día en agua Milli-Q a 120°C. � Enjuagar 3 veces con agua Milli-Q.

� El material en cuarzo y nylon (tapas y membranas de algunos tipos de microon-das) se lava en 2 etapas.

� Media mañana en HNO3 monodestilado al 10% (que puede ser reutilizado) a 120°C.

� Media mañana en agua Milli-Q a 120°C. � Enjuagar 3 veces en agua Milli-Q.

Todo el material se deja secar en las campanas de flujo laminar.

c. Digestión ácida en microondas o en hotplate

Sea que se opte por la digestión en placa (hotplate) o en microondas, el procedi-miento es similar y los resultados no difieren. Sin embargo, debido a que la materia orgánica es altamente reactiva se recomienda usar microondas ya que los reac-tores tienen por lo general mayor capacidad que los de teflón PFA tradicional de tipo Savillex® (30 ml) y además permite procesar un mayor número de muestras.

Cabe mencionar que conforme a la organización internacional Oficial de Metodos de Analisis (AOAC Official Method 2015.01) para la determinación de metales pe-sados en matrices vegetales por ICP-MS no se debe mineralizar un peso mayor de 0.25 g de muestra.

En el caso del microondas hay dos tipos de reactores de alta presión (Figura 8) :


los de teflón (para el microondas Mars) y los de quarzo o pirex (para el microondas Discover-SP). En el caso de usar HF, los reactores en cuarzo necesitan de liners protectores en teflón.

Recuerde que la manipulación durante todo el proceso se hace con guantes en ni-trilo y con doble par (nitrilo y vinilo) en caso se use HF. Si se usa este reactivo para la digestión entonces se dice que la digestión es total, por lo tanto, los resultados se reportan como concentraciones totales.

Figura 8. Tipos de reactores y equipos para digestión ácida.

Las etapas de la digestión se enumeran a continuación:

1 Pesar entre 0.15 y 0.20 g de muestra molida y seca en un reactor de teflón.

2 Añadir 5 ml de HNO3 bidestilado 15M y 1 ml de H2O2 30%.

3 Dejar reaccionar un par de horas.

4 Añadir 4 ml de HNO3 bidestilado 15M y 0.2 ml de HF 45%.

5 Asegurarse de tapar bien los reactores.

6 Lanzar el programa.

7 Dejar enfriar.

8 Transferir el contenido cuidadosamente a un tubo de digestión de tipo Savillex® y dejar evaporar a seco en hotplate (a 80-90 °C en el caso del Cd).

9 Retomar el residuo en 1 ml de HNO3 bidestilado 15 M.

10 Colocar 15 min en baño de ultrasonidos.

11 Recalentar a 130°C en hotplate (hasta que la solución sea de color transparente).

12 Evaporar nuevamente a seco.

13 Diluir el residuo en 20 ml de HNO3 2% (~0.37M).

14 Refrigerar a 5°C hasta análisis.

SAVILLEX® VIALS MARS CEM® DISCOVER-SP CEM®



El programa de mineralización depende del tipo de microondas. A continuación, se muestra el que se utiliza para el equipo Discover-SP:

Stage T (°C) Time(min) P (bar) Power

(W) Stirring

1 130 3 30 300 Med

2 160 1.5 30 300 Med

3 180 3 30 300 Med

El tiempo empleado es de 15 minutos, incluyendo el enfriamiento de los reactores, pero se le debe añadir unos 20 min adicionales con la finalidad de no inhalar los gases que emanan al abrir el reactor.

El número de muestras que puede mineralizarse por día y medio varia de 12 a 40, valor que seguramente es menor al número analizado por otros laboratorios. In-sistimos en el hecho de que este protocolo es utilizado con fines de investigación.

d. Análisis al ICP-MS

Previo al análisis hay que preparar las diluciones a partir de las soluciones madre. Para ello, debemos asegurarnos que las muestras estén bien mineralizadas para evitar desperfectos en el ICP-MS.

Es muy importante poder estimar la carga total de la muestra (en función a la masa digerida). Esta puede variar en función del modelo de ICP-MS, ya que la sensibilidad también puede ser ligeramente diferente. Por ejemplo, en el caso del ICP-MS Quadrupole Agilent 7500ce® (Figura 9) del laboratorio GET la solución no debe sobrepasar 0.1 g de residuo solido por L de solución de HNO3, es decir no más de 100 ppm. En otro laboratorio (HSM, Montpellier) equipado de un iCAP-Q-ICP-MS Thermo Scientific®, la concentración debe ser inferior a 0.5 g de residuo solido por L de solución (500 ppm).

Para el caso de las muestras de cacao, recomendamos tomar 1 ml de solución madre (15 min de sonicación antes de preparar la dilución) en 9 ml de HNO3 2% (o de acuerdo a la concentración que se usa en cada laboratorio), es decir que el volumen total será de 10 ml. Si se quiere ser preciso en los resultados, se debe pesar tanto el mililitro de solución madre (o solución de mineralización) como la solución final (o solución hija).


Figura 9. Determinación de Cd mediante ICP-MS.

La secuencia de análisis sugerida se muestra en la Figura 10.

Primero se pasan los ácidos de lavado, luego la solución multielemental para las curvas de calibración (5 diluciones mínimo, ej: de 0.020 a 1.976 ppb para el Cd), un ácido de lavado, un standard ICP-MS (STD, para validar el método de análisis), nuevamente los ácidos de lavado y recién pasan las muestras: primero los blancos de laboratorio (o reactivos usados en la digestión), luego un material de referencia (SRM, para validar el método de digestión), 9 muestras (incluyendo posibles repli-cas), un ácido de lavado y así sucesivamente.

Tanto el rendimiento (en términos del STD) como la precisión de las lecturas efec-tuadas en el ICP dependen de la técnica de calibración. El uso de curvas de ca-libración es la técnica más utilizada para cuantificar elementos químicos en el ICP-MS. Además de las soluciones de calibración se puede utilizar también un standard interno como el caso del In, Sc, Re o Bi o incluso diluciones isotópicas. En todos los casos, estas soluciones deben ser preparadas en la misma matriz que las muestras, es decir en HNO3 al 2%.

Figura 10. Secuencia de análisis para ICP-MS.

HNO3

1

HNO3

11

Blancosreactivos

12

Blancosreactivos

24

STDICP-MS

9

Set de 9 muestras

1422

Soluciones para curvas

de calibración

3 7

HNO3

2

HNO3

8

HNO3

23

HNO3

10

SRM

13

SRM

25

MUESTRAS DILUIDAS

(frascos de 10 ml)

ICP-MS QuadrupoleAgilent 7500ce®

ICP-MS en el laboratorio GETAUTOSAMPLER


En la Figura 11 se observa una curva de calibración para la concentración de Cd (de las soluciones de calibración) en función de la intensidad (counts per second, cps). La regresión lineal obtenida tiene un R2 de 1. Es entonces a partir de la ecua-ción mostrada en la figura que se calculara la concentración de las muestras, ex-presadas en ppb (μg/L solución ICP) y que luego serán transformadas siguiendo los pasos de la sección 4.3.

Figura 11. Curva de calibración para Cd. (Fuente : F. Barraza, información personal; ICP-MS Agilent 7500)

4.3 Procesamiento y validación de datos

Una vez que se obtienen los datos a partir de cualquier método de espectrometría, se realizan una serie de cálculos para determinar cuál es la concentración de Cd que se debe reportar en un informe final.

El primer paso es calcular los límites de detección (LD) y de cuantificación (LQ), así como el rendimiento del standard (STD) del instrumento analítico.

Los blancos instrumentales (HNO3 2% en el caso del ICP-MS) nos permiten determinar si los valores de fondo de cada instrumento están dentro de un rango aceptable, así mis-mo permiten identificar cualquier contaminación o posibles interferencias de matriz que se hayan producido luego de haber analizado muestras ajenas a nuestros fines.

Ambos parámetros son calculados de la siguiente forma:

10000

0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500

8000

6000

4000

2000

0

Inte

nsit

y (c

ps)

Cd(ppb)

y=4634.8x + 56.635R2 = 1

LD = 3 × SD blancos

LQ = 10 × SD blancos


Donde SD es la desviación estándar de los n blancos instrumentales analizados.

Cabe mencionar que si el ICP-MS se encuentra operando dentro de un clean lab y que el autosampler se encuentra al interior de una campana de flujo laminar, se pueden lograr límites de detección y de cuantificación realmente bajos como se muestran en la Tabla 3.

El rendimiento del standard instrumental se calcula se la siguiente forma:

Existen varias opciones en el mercado: � SRLS-5 (elementos traza en agua de río), con un valor certificado para Cd de 0.0060

± 0.0014 μg/kg. � SRM 1640a (elementos traza en agua natural) con un valor certificado para Cd de

3.961 ± 0.072 μg/kg. � SPS-SW2 (elementos en aguas superficiales), con un valor certificado para Cd de 2.50

± 0.2 μg/kg.

Si R es inferior a 80% o superior a 115%, entonces se tienen que volver a analizar las muestras.

Tabla 3. Límites de detección y de cuantificación de ciertos metales pesados analizados en ICP-MS§ calculados a partir de 10 blancos de HNO3 2%.

Elemento Límite de detecciónng/L

Límite de cuantificación ng/L

Cd 0.25 0.91

Cr 0.74 8.58

Co 0.15 0.69

Ni 0.89 7.13

Pb 0.18 1.32

Fuente: F. Barraza (información personal).§Análisis realizados en el laboratorio SWAMP (Universidad de Alberta, Canadá), ICAP Q®-ICP-MS y RQ®-ICP-MS, Thermo Fisher Scientific.

R(%) = x 100Conc. medidaConc. certificada


Luego de que la calidad del análisis en el instrumento ha sido verificada, pasamos a las muestras. Como hemos mencionado varias veces en el presente manual, es sumamente importante incluir en cada serie de muestras varios blancos de reactivos y material de referencia.

Con los blancos de reactivos se calculan los límites de detección del método de di-gestión (MDL) que se calculan de la misma forma que LD. No es muy común que se reporten los límites de cuantificación del método, queda a criterio de cada analista.

En la Tabla 4 se observan algunos estudios que reportan valores de LD para el Cd y otros elementos traza en diferentes matrices.

En cuanto al material de referencia para validar el método de digestión (que no es lo mismo que aquel que se use para validar el método de análisis), existen varias opcio-nes en el mercado distribuidas tanto por el NIST (National Institute of Standards and Technology) o de tipo ERM (European Reference Materials, European Commission’s Joint Research Centre).

Si no se cuenta con ninguno de ellos, cada laboratorio puede preparar su propio stan-dard interno, siempre y cuando la concentración de Cd sea constante y se trate de preferencia de alguna matriz alimenticia de origen vegetal.

Tabla 4. Ejemplos de límites de detección (MDL) de elementos traza para diferentes métodos de cuantificación de elementos traza y en diferentes tipos de muestras.

Autor Equipo / Modelo Digestión Tipo de

muestraLímite de

detección (MDL)

Uzu et al., (2014)

ICP-OES / IRIS Intrepid

II XXDL

Protocolo descrito en la sección 4.2.2

Lechuga y repollo

Pb: 0.024; Cd: 0.016; Sb: 0.016;

As: 0.016; Cu: 0.1 y Zn: 0.17 μg/g

Mrmošanin et al., (2018)

ICP-OES / iCAP 6300

Duo

3 ml HNO3 + 1.5 ml H2O2 en microondas

Chocolate negro

(70-75%)

Cd: 3.30; Cr: 10.1; Ni: 8.30; Pb: 31.7

ng/g

Garrido et al., (2013)

AAS / Philips, PU 9100X

Sonicacion con HNO3

Zanahoria y espinaca

Cd : 0.25 ; Cu : 0.5 ; Mn : 0.5 ; Ni : 0.8,

Pb : 1.1 μg/g

Villa et al., (2014)

AAS / Perkin Elmer

AAnalyst 600

1.5 mL deH2O2 and 6.5 mL de HNO3

Chocolate Cd: 0.5 Pb: 6.3 ng/g

Este rendimiento valida el método de digestión empleado, tal y como se muestra en la Tabla 5, es decir, demuestra que tan eficiente fue la mineralización para extraer el Cd de la matriz y ponerlo en solución.


Tabla 5. Material de referencia utilizado en la digestión de muestras de cacao (chocolate, licor de cacao, granos en polvo, cascara y hojas).

NIST SRM 2384 Baking chocolate ERM Dark chocolate BD512

Concentración certificada (mg/kg)

Concentración medida

(mg/kg)a,b

R (%)

Concentración certificada (mg/kg)

Concentración medida

(mg/kg)c

R (%)

Mn 20.8 ± 1.3 22.5±0.1 108 15.7 ± 0.6 15.0 ± 0.28 95

Ni -- -- 3.01 ± 0.23 2.8 ± 0.06 93

Cu 23.9 ± 1.0 24.8±0.1 104 14.3 ± 0.7 14 ± 0.37 99

Zn 37.6 ± 1.9 33.9±0.3 90 -- --

Cd 0.0734 ± 0.0077 0.0638±0.0004 91 0.302 ± 0.013 0.31 ± 0.02 102

Pb 0.036 ± 0.005 0.037±0.002 103 -- --

Método: digestión ácida, ICP-MS.a Barraza et al. (2019), b Barraza F. (2018): información personal.c Vanderschueren et al. (2019).

Por último, luego de haber calculado la concentración de Cd en función a las curvas de calibración, se procede a corregirla restando los blancos de análisis y luego multi-plicando por el factor de dilución (en masa y en volumen de ser el caso).

A continuación, mostramos una fórmula para datos obtenidos del ICP-MS:

Cabe mencionar que es muy importante reportar la incertidumbre de la medición para al momento de reportar los resultados finales del análisis efectuado. Para ello con-sultar la «Guía para la expresión de la incertidumbre de medida» (GUM) (Guidelines on the expresión of uncertainty in quantitative testing) y la guía «Cuantificación de la incertidumbre en medidas analíticas» (EURACHEM/CITAC).

[Cd]ppm = x x factor de diluciónxμg Cd Solución digerida (L) 1 kg

1L solución ICP - MS masa muestra (kg) 1000g


� Existe en la bibliografía una serie de métodos y técnicas para la determinación de Cd y de otros elementos traza en muestras de cacao. No existe una mejor que otra, sin embargo, hay varios indicadores que validan o no la técnica utilizada: blancos de re-activos que sean realmente «blancos» (idealmente concentraciones de Cd no detec-tadas por el equipo de espectrometría) y rendimientos del material de referencia (y también del standard) por encima del 80%. Además, existen otros parámetros como la veracidad, rango, linealidad, que se encuentran listados en la directriz DA-acr-20D publicada por INACAL para la validación de métodos de ensayo.

� Determinar el objetivo de nuestro análisis es una etapa clave para definir qué tipo de protocolo utilizar, es por ello que se han propuesto 3 protocolos diferentes. Para análisis de calidad y seguridad alimentaria, se entiende que debido al volu-men importante de muestras que se procesan cada día el protocolo de digestión debe ser corto. En el caso de investigación, donde por lo general se analizan otros elementos traza, el protocolo puede extenderse. En ambos casos, se deben tomar en cuenta una serie de precauciones para evitar la contaminación de la muestra y a su vez garantizar la calidad del análisis.

� En relación al último punto, algunas recomendaciones para reducir el riesgo de contaminación:

• Contaminación del ambiente: designar un área especial de preparación y mani-pulación de muestras dentro del laboratorio; sacar todos los objetos extraños del área de preparación que puedan constituir una fuente potencial de contamina-ción, limpiar el área de trabajo regularmente, así como lavar el material utilizado.

• Contaminación de los reactivos: usar reactivos de alta pureza, destilar los áci-dos, usar agua bidestilada, evitar el uso de agua del caño, almacenar los ácidos en contenedores resistentes.

• Contaminación por parte del técnico y de los equipos: mantener el volumen necesario de reactivos a utilizar en el área de trabajo, utilizar y cambiarse de guantes regularmente, usar la protección necesaria y limpiarla regularmente, lavarse bien las manos y enjuagarse la boca (si es que es fumador) antes de ma-nipular las muestras, brindar el mantenimiento adecuado a los equipos, usar el material adecuado (preferentemente teflón).

� Finalmente, para el procesamiento y la validación de datos se deben tener en cuenta varios parámetros que nos ayuden a identificar si efectivamente tanto el método como el equipo han sido eficaces. En este sentido el «control de calidad» de nuestros datos se realiza en diferentes puntos, empezando por una correcta curva de calibración (idealmente 5 puntos, mínimo 3), límites de detección y de cuantificación aceptables (reflejo de si hubo contaminación en alguna etapa del análisis) y rendimientos (validación de un método).

Conclusiones y recomendaciones

5.


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Cosecha

ANEXOSAnexo 1. Flujograma de la elaboración del chocolate.

Semillas de cacao

Etanol + CO2

H2O

1200C - 1500C CascarillaCacao nibs

Del árbol al chocolate

(Modificado a partir de: Kruszewski et al., 2018; https://www.c-spot.com/editorials/chocolate-processing-flowchart/)

2 - 10 días

Extracción

CO2 + H2O

Licor de cacao

Azúcar, lechey otros

0 - 72 hrs500C - 800C

450C - 280C - 320C

Fermen-tación

Secado

Tostado

Aventado

Molienda

Refinación y Conche

Manteca de cacao

Azúcar + polvo de

leche

Templado

Prensado

Barra de chocolate


Anexo 2. Revisión bibliográfica sobre los diferentes métodos utilizados para la determinación de Cd en cacao en países o productos de Latinoamérica del año 2015 al 2019 publicados en revistas internacionales indexadas.

Autores y ubicación geográfica del

estudioTipo de muestra Preparación de la

muestra Digestión ácida Material de referencia

Método de cuantificación

Chavez et al., (2015) Ecuador.

Hojas y frutos de cacao.

� Granos secados al aire y luego en estufa.

� Molienda: en mortero.

� 0.4 g en 6 ml de HNO3 por 180 min a 80 y 140°C.

� Dilución: en 25 ml en agua nano pura destilada.

� Filtración: 0.45 μm.

Standard interno enriquecido en Cd (Rendimiento: 90-110%).

ICP-OES Ultima, JY Horiba Group® (LD: 0.1 μg/L).

Ramtahal et al., (2016)Trinidad y Tobago.


� Granos lavados con agua deionizada.

� Secados en estufa a 105°C x 4-5 horas.

� Molienda: en morteros cerámicos.

� 0.5 g de muestra en 10 ml de HNO3.

� Pre-digestión a temperatura ambiente x 12 horas.

� Digestión en hotplate a 130°C x 6 horas.

� Dilución: en 5 ml de agua destilada.

� Filtración: Whatman No. 542

� Volumen final: 25 ml.

NIST SRM 1570a Spinach Leaves (Rendimiento: 95.5%).

FAAS (modelo no mencionado).

Gramlich et al., (2017) Bolivia.


� Granos fermentados x 8 días y luego secadas al sol x 6 días.

� Secadas en estufa 70°C x 72 horas.

� Molienda.

� Digestión con HNO3 concentrado en microondas (Multiwave 3000 Anton Paar®).

� Protocolo EPA 213.2.

No utilizado. AAS Erkin Elmer®.

continúa en la sgte. página







Arévalo-Gardini et al., (2017) Perú.


� Granos secados en estufa a 60°C.

� Molienda.

� 500 mg de muestra en 10 ml HNO3+HClO4 (4:1) en hotplate a 120°C x 3 horas.

� Filtración: Whatman No.42.

� Dilución.

No utilizado. AAS Varian model Spectra 55B® (LD*: 0.10 mg/L) *Com. Personal.

Barraza et al., (2017)Ecuador.

Hojas, frutos y licor de cacao.

� Granos secados al aire y luego en estufa a 40°C x 2 días.

� Molienda: en mortero de ágata con nitrógeno líquido.

� Digestión en bloque (Digripep®, SCP Science): 0.125 g de muestra en 5 ml HNO3 concentrado + 5 ml H202.

� Filtración: 0.22 μm acetato de celulosa.

� Dilución: en HNO3 0.37 N.

SRM1515 apple leaves (Rendimiento 90-110%).

Q-ICP-MS Agilent 7500® / Thermo Scientic iCAP® (LD: 0.08 μg/L, LQ: 0.25 μg/L).

Barraza et al., (2018) Ecuador.

� Digestión en microondas de alta presión (Mars 5®-CEM) : mismo procedimiento que en Barraza et al, 2019 (excepto por recalentamiento a 130°C).

Barraza et al., (2019)Ecuador.

� Digestión en microondas de alta presión (CEM Discover® SP): 0.2 g de muestra en 9 ml HNO3 15.6 M bi-destilado + 1 ml H2O2 suprapuro + 0.2 ml HF suprapuro, 130 a 180°C x 20 min.

� Evaporación a seco y luego añadir 1 ml HNO3 concentrado, recalentar a 130°C.

� Dilución: en 20 ml HNO3 0.37N.

SRM 2384 baking chocolate (Rendimiento 87%).

ICP-MS Thermo Scientic iCAP® / Nu Plasma-HR-MC-ICP-MS® (para isotopos, pero también para concentración)(*Blancos de 50 pg de Cd).






estudioTipo de muestra

Preparación de la muestra Digestión ácida Material de

referenciaMétodo de

cuantificación

Gramlich et al., (2018) Honduras.

Hojas y frutos. � Granos secados en estufa a 70°C x 72 horas, luego pelados.

� Molienda.

� Digestión: protocolo EPA3050.

No utilizado. GF-AAS Varian SpectraAA-200®.

Argüello et al., (2019)Ecuador.

Hojas y frutos. � Granos sumergidos x 60 segundos en 0.01 Na2-EDTA.

� Secados x 72 horas al aire y luego en estufa x 72 horas a 65 °C.

� Pelados antes de ser molidos con un molino para café. (Hamilton Beach® 80335).

� Digestión en bloque (abierto): 100 mg en 2ml HNO3 concentrado x 6 horas.

� NIST 1573a tomato leaves (Rendimiento: 91.2 ± 5.9%).

� NIST 2384 baking chocolate (Rendimiento: 100.0 ± 7.0%).

ICP-MS 7700x® (LD : 0.02 μg/L).

Zug et al., (2019) Perú.

Frutos de cacao: granos y cascara de semilla.

� Granos fermentados al sol.

� Secados por 48 horas a 40°C.

� Pelados antes de ser molidos.

� Molienda: mortero y luego en un molino de bolas (MM200) con 10 ml de n-hexano.

� Digestión en microondas (CEM Mars 5®): 0.5 g en 2 ml H2O destilada + 3 ml H2O2 + 5 ml HNO3 65% .

� Dilución 25 ml volumen final y centrifugación x 2 min.

No utilizado* *(muestras de harina para asegurar la no contaminación en Cd al preparar muestras).

GF-AAS Analytic Jena, ContrAA 700®.

Engbersen et al., (2019) Honduras.

Hojas, frutos, tallos, ramas y raíces de cacao.

� Granos secados en estufa a 70°C x 72 horas.

� Molienda: molino de anillos vibratorios Retsch Mill® (Vibratory Disc Mill RS1).

� Digestión en microondas (MLS-1200 MEGA ETHOS®) x 25 min a max 220°C: 50 mg en 2ml H2O2 + 1 ml HNO3 65%.

� Dilución: volumen final 10 ml con agua Nanopure™.

� IPE-180 oil palm leaf (Rendimiento: 88 ± 6%).

� IPE-199 wood pellets (Rendimiento: 105 ± 3%).

ICP-MS Agilent 7900®.







Vanderschueren et al., (2019) Colombia, Ecuador, México, Perú y otros.

Chocolate. � Rallado con rallador plástico.

� Digestión en bloque abierto: 100 mg en 3 ml HNO3 65% x 11 horas a 130°C.

� Dilución: 5 veces en agua Milli-Q.

� NIST 2384 baking chocolate (Rendimiento: 98%).

� ERM-BD512 dark chocolate (Rendimiento: 102%).

ICP-MS Agilent 7700x®.

Bertoldi et al., (2016)Cuba, Rep. Dominicana, Granada, México, Trinidad y Tobago, Brasil, Ecuador, Perú, Venezuela y otros.

Granos fermentados y secos.

Chocolate negro.

� Molienda de granos: mixer eléctrico (Type 6210®, Trisa electronics, Triengen).

� Chocolate rallado con rallador plástico.

� Digestión en microondas (Ultrawave Milestone®) con 4 ml HNO3 ultrapuro, en 3 rampas de temperatura.

� Dilución: 3 veces con agua ultrapura.

SRM 1584a typical diet (Rendimiento: 70-110%).

ICP-MS (modelo no mencionado) (LD: 0.1 μg/kg).



Dra. Fiorella BarrazaLaboratorio SWAMP. Departamento de Recursos Renovables. Universidad de Alberta. Edmonton, Canadá.https://swamp.ualberta.ca/Instituto de Cultivos Tropicales (ICT). Tarapoto, Perú.Email: [email protected] / [email protected]

Dra. Laurence MauriceInstituto de Investigación por el Desarrollo (IRD)Laboratorio de Geociencias Medioambientales de Toulouse (GET). FranciaEmail: [email protected]

Contactos útiles:


Cacao Seguro, es un proyecto financiado por USDA/ USAID y ejecutado por TECHNOSERVE, cuyo fin es Apoyar al Gobierno de Perú, a través del Ministerio de Agricultura y Riego (MINAGRI), en la implementación de medidas de mitigación a efectos de reducir el contenido de cadmio en las almendras de cacao.

determinación cadmio (Cd) en muestras de

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