Desarrollo de un dispositivo portátil para la detection in ... . Lola... · microfluídica, capaz

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  • Desarrollo de un dispositivo porttil para la

    detection in situ de Legionella viable

    (PINVIALEG) FP7-SME-2010-2622561

    Aldamiz R.(1), Montero J.A.(1), Martn A.(2), Verdoy L.(2), Gurrutxaga P. (3)

    1 Ayuntamiento Bilbao - Sanidad Ambiental; 2 Gaiker-IK4; 3 Ondoan, S. Coop.

  • 1. PROBLEMTICA 2. INNOVACIN 3. OBJETIVO PROYECTO 4. RESULTADOS

  • 1. PROBLEMTICA 2. INNOVACIN 3. OBJETIVO PROYECTO 4. RESULTADOS

  • Problemtica

    v Brotes de Legionella: gran impacto sanitario y econmico, serias

    implicaciones sociales.

    v En Europa, las normativas control de Legionella en agua sufren constantes

    cambios, adems de presentar variaciones entre diferentes pases.

    v Vigilancia: recomendaciones para limitar el nmero de ufc de Legionella por

    litro en torres de refrigeracin.

    v El mtodo de deteccin actual (ISO 11731:1998) es el cultivo

    microbiolgico de las muestras, que identifica bacterias viables y cultivables

    mediante un proceso largo, laborioso y de baja sensibilidad.

  • 1. PROBLEMTICA 2. INNOVACIN 3. OBJETIVO PROYECTO 4. RESULTADOS

  • Dispositivo porttil para la deteccin rpida y

    fcil de interpretar de clulas viables de

    Legionella in situ de manera efectiva

    (requerimientos sensibilidad legislacin)

  • Herramientas biologa molecular (PCR y

    qPCR): esenciales en el anlisis gentico:

    alta sensibilidad, precisin y rapidez.

    Actualmente hay kits de deteccin de

    Legionella en el mercado basados en la

    identificacin especfica del ADN. La

    molcula de ADN es incapaz de

    discriminar entre bacterias viables e

    inviables.

    ARN es un marcador ampliamente utilizado como indicador de viabilidad.

  • Reciente desarrollo de sistemas microfludicos integrados y su

    utilizacin como equipos de diagnstico, ejemplos: Point of Care, Point of

    Test.

    Estos sistemas analizan de manera eficiente muestras reales, realizando

    todos los ensayos analticos necesarios (lab on chip).

    Ventajas: disminucin del tamao del equipo final (portabilidad) y menor

    tiempo de anlisis, menor consumo de reactivos y reduccin del coste

    total del mismo.

  • Sistema de lectura porttil y barato: Lateral Flow ImmunoAssay.

    Sistema de deteccin rpido, sencillo y fcil de utilizar por personal

    no cualificado.

  • 1. PROBLEMTICA 2. INNOVACIN 3. OBJETIVO PROYECTO 4. RESULTADOS

  • OBJETIVO DEL PROYECTO PINVIALEG

    Desarrollar un innovador dispositivo porttil, de base

    microfludica, capaz de identificar in situ y en menos de 3 horas,

    la presencia de clulas viables de Legionella en muestras

    ambientales.

    Biologa molecular para la deteccin de clulas viables: alta sensibilidad

    Evitar el pretratamiento de las muestras, previo al anlisis en el laboratorio.

    Rpida adquisicin de resultados

    Plan de accin para erradicar la bacteria en el menor tiempo posible.

  • DISPOSITIVO PINVIALEG

    El sistema de filtracin est integrado con la tarjeta microfludica

    desechable.

    Todo el procedimiento se realiza in situ.

    NASBA: reaccin isotrmica, facilita la portabilidad

    NALFIA como un sistema de lectura: fcil de usar por personal no

    cualificado, fcil de interpretar.

  • 1. PROBLEMTICA 2. INNOVACIN 3. OBJETIVO PROYECTO 4. RESULTADOS

  • Dispositivo PINVIALEG

    Aislamiento RNANASBA

    (amplificacin isotrmica de

    RNA)

    Paso INICIAL: Recogida de

    muestra

    Filtracin muestras

    Tarjeta microfludica

    Integracin en un dispositivo porttil: dispositivo PINVIALEG

    NALFIA

    1

    3 4

    2

    5

  • 1. DISEO DE UN PROTOTIPO PARA LA RECOGIDA DE MUESTRAS Y SISTEMA DE FILTRACIN

    Sistema de filtracin consiste en 2 3 componentes de fcil ensamblado Conexin del dispositivo de filtracin con la tarjeta microfludica (bombas,

    vlvulas, reactivos, etc.)

    Se va a seguir avanzando en el desarrollo del prototipo de filtracin. El sistema se evaluar para el anlisis directo de Legionella spp.

  • 2. PROCESOS BIOLGICOS

    Se ha puesto a punto un protocolo de extraccin de ARN rpido y sencillo, basado en partculas magnticas, compatible con el proceso simplificado a realizar en la tarjeta microfludica, capaz de extraer RNA de 102 ufc L. pneumophila

    Se ha diseado un protocolo NASBA especfico y sensible (RNA correspondiente a 50-100 ufc) para la deteccin de L. pneumophila, adaptado a los requerimientos de miniaturizacin

    Se ha desarrollado una tarjeta microfludica para realizar procesos biolgicos de extraccin de RNA y amplificacin por NASBA

    Se ha comprobado la compatibilidad de los procesos biolgicos en la tarjeta

  • 3. TARJETA MICROFLUDICA Se ha diseado y fabricado una tarjeta microfludica

    (PMMA) para la captura de ARN y la amplificacin por NASBA

    El proceso de extracin de ARN completo no es posible en el chip desarrollado, algunos de los reactivos degradan el material (PMMA).

    Sin embargo s que es posible la captura de las partculas magnticas y la elucin del ARN de las mismas, aunque se requiere mejorar la repoducibilidad

    La amplificacin por NASBA, la hibridacin de los sondas para la lectura por NALFIA es totalmente compatible y reproducible en el chip

  • 4. NALFIA PARA LA DETECCIN del producto de amplificacin de NASBA

    Condiciones de hibridacin optimizadas (T, buffer composicin y pH)) Control sin producto NASBA: OK Producto NASBA sin sondas es negativo: OK

    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 + 1+2 Legionella pneumophila 3+4 Escherichia coli5 Legionella worsleiensis6+7 Legionella quinlivanii8+9 Legionella sainthelensis10 Legionella micdadeii 11+12 Legionella anisa 13 Negative control (water)+ Positive control (NASBA DLO)

  • DISPOSITIVO

    NASBA: primera fase (mezcla de reactivos y molde, 65C 2 minutos) en poyata (tubo)

    NASBA: segunda fase (adicin de enzimas e incubacin a 41C en tarjeta microfludica):

    A. NASBA funciona en chip; banda de igual intensidad a la observada en el experimento en poyata (tubo)

    B. NASBA y la inyeccion de los reactivos para la deteccin de NALFIA funcionan en chip

    pc

    pc

    A B

  • FP7-SME-2010-2622561

  • Gracias!

    verdoy@gaiker.es