DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU PRIRODNO – … · Dinamika rasta ćelija respiratornih izolata...

UNIVERZITET U NIŠUPRIRODNO – MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

MASTER RAD

Uticaj etarskog ulja Inula helenium L. na rast odabranih sojeva respiratornih izolata

Mentor:dr Zorica Stojanović Radić

Kandidat:Kristina Lj. Stanković

Niš, 2018

2

Kristina Lj. Stanković Master rad

UNIVERSITY OF NIŠFACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICSDEPARTMENT OF BIOLOGY AND EKOLOGY

MASTER THESIS

The influence of Inula helenium L. essential oil on the growth of selected strains of respiratory isolates

Mentor:PhD Zorica Stojanović Radić

Candidate:Kristina Lj. Stanković

Niš, 2018

SADRŽAJ

1. Uvod 8 1.1. Lekovito bilje 8 1.2. Opšte karakteristike - familija Asteraceae 9 1.3. Opšte karakteristike - rod Inula 11 1.4. Opšte karakteristike - vrsta Inula helenium L. 11 1.4.1. Hemijski sastav Inula helenium L. 13 1.4.2. Biološke aktivnosti vrste Inula helenium L. 19 1.4.2.1. Antioksidativna aktivnost 20 1.4.2.2. Antimikrobna aktivnost 21 1.4.2.3. Antineoplastična/ Citotoksična/ Antitumorska aktivnost 25 1.4.2.4. Imunomodulatorna aktivnost/ potencijal 27 1.4.2.5. Efekat na nervni sistem 27 1.5. Osobine ispitivanih mikroorganizama 28 1.5.1. Gram negativne bakterije 28 1.5.1.1. Rod Escherichia, vrsta Escherichia coli 28 1.5.1.2. Rod Moraxella, vrsta Moraxella catarrhalis 29 1.5.2. Gram pozitivne bakterije 31 1.5.2.1. Rod Staphylococcus, vrsta Staphylococcus aureus 312. Ciljevi rada 333. Materijal i metode 34 3.1. Izolovanje etarskog ulja 34 3.2. Gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC-MS) 34 3.3. Identifikacija sastojaka 35 3.4. Antimikrobne analize 35 3.4.1. Testiranje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja na respiratorne

izolate 35

3.4.1.1. Bakterijski izolati 35 3.4.1.2. Mikrodiluciona metoda 36 3.4.2. Metode za određivanje mehanizma delovanja etarskih ulja 37 3.4.2.1. Kinetika (dinamika) rasta tretiranih bakterija 37 3.4.2.2. Metoda detekcije oslobađanja nukleinskih kiselina 374. Rezultati i diskusija 385. Zaključak 53

6. Literatura 54

4


Hvala.

ZAHVALNICA

Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru, dr Zorici Stojanović-Radić koja mi

je dala ideju za ovaj rad i pružila veliku pomoć tokom laboratorijskih

istraživanja. Zahvaljujem joj se na razumevanju, strpljenju, nesebičnoj pomoći i

savetima koje mi je pružila tokom izrade master rada.

Zahvaljujem se i doktorantkinji Marini Dimitrijević, koja je uložila veliki deo

svog vremena i pružila mi pomoć u toku izvođenja eksperimentalnog dela rada.

Na kraju, svoju neizmernu zahvanost dugujem dragim ljudima oko sebe, bez

kojih ne bih mogla da ostvarim svoje zamisli, a posebno mojim roditeljima koji

su mi omogućili školovanje i motivisali me tokom istog, i bratu bez čije ljubavi i

razumevanja ne bih istrajala do kraja.

Iskreno Vam hvala.

.

BIOGRAFIJA

Kristina Lj. Stanković, rođena je 26.02.1994. godine u Nišu. Osnovnu školu

“Ivan Goran Kovačić” završava 2009. godine, nakon čega upisuje Medicinsku

školu “Dr Milenko Hadžić” u Nišu, smer fizioterapeutski tehničar, koju

završava 2013. godine. Iste godine upisuje Prirodno-matematički fakultet u

Nišu, Odsek za biologiju i ekologiju. Osnovne akademske studije završava

2016. godine sa zvanjem “biolog”. Iste godine upisuje master akademske

studije, smer Biologija na istom fakultetu.

6


SAŽETAK

Ciljevi ovog master rada su bili ispitivanje hemijskog sastava etarskog ulja korena Inula

helenium L., kao i određivanje antimikrobne aktivnosti ovog etarskog ulja u odnosu na odabrane

sojeve respiratornih izolata humanog porekla. Ujedno je izvršeno i ispitivanje mehanizma dejstva

etarskog ulja omana metodom detekcije oštećenja membrane i praćenja dinamike rasta ćelijskih

kultura tretiranih uljem. Destilacijom biljnog materijala omana, dobijeno je etarsko ulje čije su

glavne komponente bile alantolakton (65,75%) i izoalantolakton (25,53), a ove dve komponente

su sačinjavale 91,3% ukupnog sastava ispitivanog etarskog ulja. Aktivnost etarskog ulja omana

se kretala u opsegu koncentracija 0,07-10,0 mg/ml. Ulje je bilo efikasno na sve testirane izolate

pri čemu su MIK varirale od 0,07-2,50 mg/ml, dok su se MBK kretale 0,15-10 mg/ml. Najveću

osetljivost na ulje je pokazao izolat S. aureus 3, dok su najveću rezistenciju pokazali dva soja, i to

S. aureus 1 i E. coli. Na osnovu dobijenih rezultata, spektrofotometrijskim merenjem izlaska

nukleinskih kiselina iz ćelija respiratornih izolata tretiranih etarskim uljem omana, može se

zaključiti da ni kod jednog soja nije detektovano masivno oštećenje membrane koje bi izazvalo

smrt ćelije u periodu od 4 h nakon aplikacije ulja. Dinamika rasta ćelija respiratornih izolata

tretiranih etarskim uljem omana je pokazala različite aktivnosti ovog ulja, pri čemu je kod vrsta

M. catarrhalis i S. aureus 2 uočen mikrobicidni efekat, s obzirom da je ulje ispoljilo inhibitornu i

mikrobicidnu aktivnost pri istoj koncentraciji u oba slučaja. Kod ostalih izolata S. aureus su se

ispoljili različiti intenziteti inhibicije, koja je počinjala nakon 12 h inkubacije i dovela je do

razlike od 0,27 (izolat 1), 0,16 (izolat 3) i 0,21 (izolat 4) jedinica apsorbance. Escherichia coli je

imala manju redukciju u odnosu na S. aureus, ali je zato efekat bio nešto brži, jer se redukcija

apsorbance uočila pre perioda inkubacije od 12 h.

Ključne reči: antimikrobna aktivnost, etarsko ulje, Inula helenium L., respiratorni izolati.

7


ABSTRACT

The objectives of this master study were to examine the chemical composition of the

etheric oil of the root of Inula helenium L., and to determine the antimicrobial activity of this

etheric oil in relation to selected strains of respiratory isolates of human origin. At the same time,

the mechanism of the effect of etheric oil of the canopies was investigated by the method of

detecting the damage of the membrane and monitoring the growth dynamics of oil-cell cultures.

By distillation of the plant material of oman, etheric oil was obtained, the main components of

which were alantolactone (65,75%) and isoalantolactone (25,53), and these two components

comprised 91,3% of the total composition of the test etheric oil. The activity of the etheric oman

oil was within the concentration range of 0,07-10,0 mg / ml. The oil was effective on all tested

isolates, with MIC varied from 0,07 to 2,50 mg / ml, while MBC ranged 0,15-10 mg / ml. The

highest sensitivity to oil was demonstrated by S. aureus 3 isolates, while the highest resistance

was shown by two strains, S. aureus 1 and E. coli. Based on the obtained results, the

spectrophotometric measurement of the release of nucleic acids from the cells of the respiratory

isolates treated with etheric oman oil, it can be concluded that no massive damage to the

membrane was detected in a single strain that would cause cell death in the 4 hours after

application of the oil. The growth dynamics of the cells of respiratory isolates treated with ethane

oman oil revealed various activities of this oil, with the microbicidal effect observed in the

species M. catarrhalis and S. aureus 2, as the oil exhibited inhibitory and microbicidal activity at

the same concentration in both cases. In the other S. aureus isolates, different intensities of

inhibition began, which began after 12 hours of incubation and resulted in a difference of 0,27

(isolate 1), 0,16 (isolate 3) and 0,21 (isolate 4) units apsorbance. Escherichia coli had a lower

reduction compared to S. aureus, but the effect was therefore somewhat faster, since the

reduction in absorbance was observed before the incubation period of 12 h.

Keywords: antimicrobial activity, essential oil, Inula helenium L., respiratory isolates.

8


1. Uvod

1.1 Lekovite biljke

Tokom čitave istorije čovečanstva, ljudi su zavisili od biljaka koje su oduvek bile sastavni deo

njihovog životnog staništa. Čovek je taj biljni svet svojim iskustvom sve bolje upoznavao i

koristio ga na razne načine za svoj opstanak. Bilje je čoveku predstavljalo izvor hrane, a sa većim

iskustvom je shvatio da mu može poslužiti za lečenje raznih bolesti, te je tako sve više sticao

znanje o lekovitosti pojedinih vrsta iz biljnog carstva (Videk, 1960). Ljudi su koristili lekovito

bilje za mnoštvo potreba: imale su ulogu u ceremonijama i ritualima, dok su se druge koristile za

bojenje i čišćenje tkanina, a mnoge su se upotrebljavale u svakodnevnom životu kao začini za

hranu i piće, za poboljšanje opšteg zdravlja i lečenje bolesti. Lekovitim biljem se smatra ono bilje

koje se koristi za konkretne svrhe zbog svojih medicinskih, aromatičnih i drugih svojstava.

Kako navode Stanković i Stanojević (2014), prema definiciji Svetske zdravstvene

organizacije, u lekovito bilje se ubrajaju one biljne vrste čiji jedan deo ili više delova sadrže

biološki aktivne supstance koje se mogu iskoristiti u terapijske svrhe ili za farmaceutsko-

hemijske sinteze. U narodnoj medicini lekovite biljke se koriste za lečenje bolesti ili očuvanje

zdravlja ljudi. Posvećuje im se velika pažnja u cilju pronalaženja boljih lekova koji bi po

organizam čoveka bili što je moguće manje štetni.

Lekovite biljke je, prema farmakološkom dejstvu, moguće podeliti u dve grupe:

1) lekovite biljke blagog dejstva, koje su u širokoj i skoro svakodnevnoj upotrebi u domaćim

uslovima (nana, kamilica, lipa)

2) lekovite biljke jakog dejstva, toksične vrste od kojih se proizvode vrlo jaki otrovi poput

heroina, morfina i čija je upotreba i rukovanje propisana zakonom o otrovnom bilju.

Istraživanja lekovitog bilja u savremenoj medicini su intezivna tokom poslednjih nekoliko

decenija. Pokazalo se da većina lekova biljnog porekla ima manje neželjenih dejstava od

sintetskih lekova. Iskustva tradicionalne medicine, kao i rezultati bioloških, hemijskih i

farmakoloških ispitivanja ukazali su na značajnu biološku aktivnost biljnih ekstrakata i omogućili

izolovanje i karakterizaciju aktivnih komponenti, od kojih se mnoge primenjuju u savremenoj

farmakoterapiji. Određivanje biološke aktivnosti i hemijska identifikacija do sada neispitanih

biljnih vrsta vode ka otkrivanju novih prirodnih proizvoda sa potencijalom za primenu u

9


prevenciji i terapiji različitih oboljenja (Simin, 2014). Dokazano je da fenolna jedinjenja biljaka

ispoljavaju antiinflamatornu, antiproliferativnu, antimutagenu, antigenotoksičnu, antialergenu,

antimikrobnu, antioksidativnu i druge aktivnosti. Posebna pažnja se posvećuje njihovom

potencijalu u zaštiti i prevenciji od kardiovaskularnih i kancerogenih bolesti, s obzirom da

epidemiološke studije ukazuju da poseduju protektivni efekat u odnosu na razvoj ovih bolesti

(Basile et al., 2000; Croft, 1999; Keli et al., 1996; Lea i Leegod, 1999). Antimikrobna i

antioksidativna aktivnost učestvuju u inhibiciji oksidacije i vrše zaštitu organizma (Kähkönen et

al., 1999). Biljke su neicrpan izvor biološki aktivnih jedinjenja, pa su njihova fitohemijska i

biohemijska istraživanja veoma značajna (Simin, 2014).

Jedna biljna vrsta, koja se zbog svog blagotvornog efekta na zdravlje ljudi koristi u narodnoj

medicini je oman – Inula helenium L. (rod Inula, fam. Asteraceae). Ona se primenjuje za

suzbijanje repiratornih infekcija i zbog toga su mnoga istraživanja bila usmerena na istraživanje

bioloških aktivnosti njenih sekundarnih metabolita. Pošto se za tradicionalne tretmane koristi

osušen koren ove biljke, za koji se pokazalo da etarsko ulje izolovano iz njega poseduje značajnu

antimikrobnu aktivnost, cilj ovog rada bio je da se po prvi put ovo ulje testira na humane kliničke

izolate iz respiratornog sistema. U nastavku istraživanja, ispitan je potencijalni uticaj ovog ulja na

ćelijsku membranu ovih izolata.

1.2. Opšte karakteristike porodice (familia) Asteraceae

Asteraceae su pretežno zeljaste jednogodišnje i višegodišnje biljke (Blečić, 1970).

Porodica obuhvata više od 1600 rodova i oko 23 000 vrsta (Sabljak, 2015). Listovi su pretežno

naizmenični, ređe naspramni (Blečić, 1970). Pojedinačni cvetovi su uglavnom složeni u

glavičaste cvasti. U glavičastim cvastima postoje dva tipa pojedinačnih cvetova, to su jezičasti i

cevasti cvetovi. Jezičasti cvetovi koji nose latice i raspoređeni su po obodu glavice ili diska,

najčešće su sterilni, dok su cevasti cvetovi raspoređeni od periferije prema središnjem delu diska i

najčešće su fertilni (Sabljak, 2015). Mnogi predstavnici familije Asteraceae sadrže polisaharid

inulin kao rezervnu materiju (Josifović, 1975). Imaju i šizogene smone hodnike i člankovite

mlečne cevi. Pripadnici ove familije su brojni i pripadaju kosmopolitskim vrstama. Najstariji

fosilni ostaci poznati su od oligocena. Pored ogromne opširnosti i raznolikog izgleda,

predstavljaju jednu prirodnu celinu, pa je zbog toga veoma teško deliti ih ne samo u više familija

10


već ni u pojedine podfamilije. Na osnovu građe glavičaste cvasti kao i nekih drugih osobina sve

Asteraceae se mogu podeliti u dve podfamilije: Asteroideae i Cichorioideae (Blečić, 1970).

Koren je izuzetno krtolasto zadebljao. Stabljika je jednostavna ili granata, katkad u obliku

skapusa ili okriljena. Čašica nije nikada u obliku listova, nedostaje ili postoji u obliku

jednostavnih ili perastih dlaka, čekinjica, ljuspica ili u obliku kožastog ruba, dok u vreme

plodonošenja najčešće ostaje i služi kao organ za letenje zrelih plodova. Krunica je ili pravilna,

cevasta, po obodu sa 4-5 zubaca ili je zigomorfna sa kratkom cevi, a obod produžen u linearni

jezičak, koji na vrhu ima 5 zubaca (od 5 ili samo 3 spojena krunična listića), retko sa 5 ili 2

režnja. Prašnika ima 5, prirasli su na krunicu, prašnice su pri osnovi često strelaste ili sa

nastavkom, sa dva okca, prema unutra se otvaraju, međusobno su srasle u cev, koja opkoljava

stubić. Tučak je potcvetan od dve karpele, dok je plodnik sa jednim anatropnim semenim

zametkom i jednim integumentom. Stubić je sa dva žiga, ovi na unutrašnjoj strani sa papilama, a

na spoljašnjoj strani i na vrhu sa uspravno štrčećim kratkim čekinjama. Plod je suv, ahenija, sa

jednim semenom, najčešće sa papusom, ponekad i sa kljunom. Hranljivo tkivo nedostaje.

Najveći broj vrsta iz familije Asteraceae, poput Eupatorium cannabinum L., Solidago

virgaurea L., Inula helenium L., Matricaria chamomilla L., Achillea millefolium L. koriste se kao

lekovite biljke. Neke se koriste za dobijanje jestivog ulja – npr. Helianthus annuus L., neke služe

za ishranu u svežem stanju – npr. Taraxacum officinale Web., dok određene vrste služe kao

insekticidna sredstva – npr. Chrysanthemum cinerariifolium (Triv.) Vis. Veliki broj vrsta koje

pripadaju ovoj familiji koristi se u dekorativne svrhe (vrste iz rodova Calendula L., Bellis L.,

Zinnia L. i druge).

Familija Asteraceae deli se na dve podfamilije:

1) Podfamilija Tubuliflorae DC. – Cvetovi cevasti, obodni cvetovi katkad jezičasti ili

dvousnati. Mlečni sok nedostaje. Šizogeni uljani kanali postoje.

2) Podfamilija Liguliflorae DC. – Svi cvetovi nepravilni, jezičasti. Mlečni sok postoji. Uljani

kanali najčešće nedostaju (Josifović, 1975).

11


1.3. Opšte karakteristike roda (Genus) Inula

Vrste roda Inula pripadaju zeljastim, najčešće višegodišnjim biljkama. Listovi su

naizmenični i celi. Glavice su pojedinačne ili u gronjastim ili metličastim cvastima, najčešće

velike, heterogamne, sa mnogo cvetova i sa poluloptastim involukrumom. Listići involukruma

poređani su gusto kao crepovi na krovu, u mnogo redova, a spoljni su često slični listovima.

Cvetna loža je ravna i gola. Središni cvetovi (cvetovi diska) su hermafroditni, sa cevasto

levkastim krunicama i 5 zubaca. Obodni cvetovi su ženski, jezičasti, na vrhu sa 3-5 zubaca, žuti i

u jednom redu. Papus je sastavljen od čekinjastih, skoro jednakih dlačica, u jednom ili više reda.

Ahenija je gola ili sa dlakama, okruglasta ili sa 4-5 ivica.

Rod obuhvata oko 120 vrsta koje su rasprostranjene u umerenim i toplijim oblastima Evrope

i Azije. Razlikujemo tri centra formiranja. Jedan se nalazi u području severne Španije i južne

Francuske, drugi centar se nalazi u predelu Kavkaza i Armenije, a treći leži u zapadnom delu

Himalaja. U Evropi se nalaze 35 vrsta, a u Srbiji 11 vrsta (Josifović, 1975).

1.4. Opšte karakteristike omana (Inula helenium L.)

Inula helenium L. (Asteraceae) (slika 1) je višegodišnja

biljka široko rasprostranjena u Evropi i Istočnoj Aziji. Oman

je visine 60 – 150 (200) cm visine, sa granatim i krtolasto

zadebljalim rizomom. Stabljika je sa štrčećim grubim

dlakama, u gornjem delu vunasto prstenasto dlakava, kruta,

uspravna, jednostavna ili u gornjem delu granata. Listovi su

sa gornje strane zeleni, razređeno kratko dlakavi, sa donje

strane prileglo sivo prstenasto dlakavi, po obodu nejednako

urezani ili tupo nazubljeni. Prizemni listovi postepeno su

suženi u dugačku vrstu, jajasti do eliptični, šiljati.

Slika 1. Inula helenium (L.)http://lekarstven-travi.ru

12


Listovi stabljike su sa srcastom osnovom, koji

opkoljavaju stabljiku, sedeći ili se kratko spuštaju niz

stabljiku, šiljati. Glavice su prečnika 6-7 cm u razređenim

gronjastim cvastima ili pojedinačne. Cvetna loža je skoro

gola, a listići involukruma u više redova. Spoljni listići su

dlakavi, sa srcasto proširenim i unazad savijenim vrhom,

a unutrašnji suvokožičasti, linearni. Jezičasti cvetovi su

dvostruko duži od listića omotača, uski, mnogobrojni,

široki 1,5 mm. Ahenija je gola, sa uzdužnim rebrima,

dužine 5 mm. Stanište omana su vlažne livade i osenčana

područja, kao i pored potoka u šumama.

Koren omana se tradicionalno koristi za lečenje

različitih bolesti kao što su emezija, bol u gornjem delu tela, bronhitis, dijareja i paraziti (Kina),

razne plućne bolesti i tuberkuloza (Amerika) (Konishi et al., 2002; Huo et al., 2008). U Evropi,

zvanično je naveden u farmakopeji kao diuretik, dijaforetik i ekspektorant, kao i antihelmintik

(Stojakowska et al., 2005). U istočnoj Evropi ova biljka se uglavnom koristi za lečenje

respiratornih stanja kao što su astma ili veliki kašalj, urinarne infekcije, poremećaji digestivnog

sistema kao i bolesti kože (Stojanović-Radić et al., 2012). Prema Ghedira et al. (2011), koren se

koristi za različite preparate - infuzija, prah, vino, sirup sa sledećim terapeutskim indikacijama:

antiseptik kod egzantema, bakterijskog i gljivičnog dermatitisa; antipruritik kod suvih pečata na

koži; za poboljšanje urinarne i digestivne funkcije; za lečenje simptomatskog kašlja i bronhitisa;

za lečenje poremećaja dispeptične hepatobilijarne ili bilijarne diskinezije; kao dodatak u lečenju

hiperglikemije i gojaznosti.

Iako se samo ograničeni broj studija bavio antimikrobnom aktivnošću etarskog ulja korena I.

helenium, utvrđeno je da je ono aktivno protiv nekih Gram-pozitivnih i Gram-negativnih

bakterija i vrste Candida albicans (Stojanović-Radić et al., 2012). Aktivne komponente iz omana

uglavnom pripadaju klasi seskviterpenskih laktona-eudesmanolidi (alantolakton, izoalantolakton,

4α,5α-epoksialantolakton, diplofilin) i germakranolidi (izokostunolid) (Seca et al., 2014) koji se

koriste kao antiinflamatorni, antimikrobni i antikancerogeni agensi.

Tabela 1. Sistematika vrste Inula

helenium L.

Carstvo: Plantae

Razdeo: Magnoliophyta

Класа: Magnoliopsida

Red: Asterales

Porodica: Asteraceae

Rod: Inula

13


1.4.1. Hemijski sastav Inula helenium L.

Prethodne studije I. helenium su pokazale da su dominantne isparljive materije korena

eudezmanski seskviterpenski laktoni i to alantolakton i izoalantolakton. Koren sadrži do 5%

etarskog ulja, derivata timola, triterpena, sterola i do 44% polisaharida inulina (Stojanović-Radić

et al., 2012).

Istraživanje Bohlmann et al. (1978) je prvo istraživalo hemijski sastav pripadnika roda Inula

i to Inula helenium, I. royleana, I. salicina i I. bifrons, gde je u korenu, kao i u nadzemnim

delovima vrste I. helenium utvrđeno dominantno prisustvo alantolaktona i izoalantolaktona uz

ostala jedinjenja, koja su uglavnom pripadala seskviterpenima (Tabela 2).

U nešto kasnijem istraživanju Vajs et al. (1989), istraživanja seskviterpenskih laktona iz I.

helenium po prvi put su utvrdila prisustvo 11(13)-dehidrokriolina, 2α-hidroksialantolaktona,

4α,5α-epoksi-10α-14-H-inuviskolida i karabrona.

U heksanskoj frakciji metanolnog ekstrakta korena I. helenium, koji je pokazao izuzetnu

antiproliferativnu aktivnost, utvrđeno je prisustvo sedam seskviterpena i to jednog germakrana

(4β,5α-epoksi-1(10),11(13)-germakradien-8,12-olid), jednog elemana (igalan) i pet eudezmana

(alantolakton, izoalantolakton, 11α,13-dihidroalantolakton, 11α,13-dihidro-izoalantolakton i 5-

epoksialantolakton) (Konishi et al., 2002).

U radu Cantrell et al. (1999), gde je testiran antimikobakterijski efekat ekstrakta iz korena I.

helenium, utvrđeno je da izuzetno aktivna hromatografska frakcija sadrži alantolakton,

izoalantolakton i 11αH,13-dihidroizoalantolakton.

Lim et al. (2007) su dodatno frakcionisali metanolni ekstrakt na heksansku,

dihlorometansku, butanolnu i vodenu frakciju. Ustanovljeno je da su seskviterpeni iz heksanske

frakcije i to alantolakton, izoalantolakton i 5α-epoksialantolakton odgovorni za indukciju enzima

kinon reduktaze, ali su pored njih u njoj pronađeni i jedinjenja igalan, 4β,5α-epoksi-1(10),11(13)-

germakradien-8,12-olid, 11α,13-dihidroalantolakton i 11α,13-dihidro-izoalantolakton.

Petkova et al. (2015) vršili su ispitivanje antioksidativne aktivnosti i sadržaja fruktana u

etanolnim i vodenim ekstraktima korena omana (Inula helenium L.). Sadržaji ukupnih fruktana i

šećera određeni su spektrofotometrijskom, TLC i HPLC-RID metodom. Nivo fruktana u

ekstraktima etanola iznosio je 14,1 g/100 g suve mase, gde su nistoza i 1-kestoza činile samo 0,3

g/100 g odnosno 0,5 g/100 g suve mase. Utvrđeno je odsustvo fruktooligosaharida i šećera u

14


vodenim ekstraktima nakon predtretmana etanolom. Procenjen je sadržaj inulina koji iznosi 32

g/100 g suve mase.

Nan et al. (2012) vršili su ispitivanje čiji je cilj bio da odrede profil i sastav karotenoida u

nadzemnom delu (cvetovi i listovi) ove biljne vrste. Separaciju i kvantifikaciju karotenoida vršili

su pomoću tečne hromatografije visokih performansi (HPLC). Nakon ekstrakcije organskim

rastvaračima i saponifikacije, sadržaj karotenoida Inula helenium L. je određen u ekstraktima

listova, cvasti, cevastih cvetova i ligula. Sadržaj karotenoida varirao je od 4,87% u listovima do

47,7% u ligulama. U ligulama je glavno jedinjenje bio lutein-5,6-epoksid, koji čini 73,8%

ukupnih karotenoida. Cevasti cvetovi sadrže veće količine anteraksantina (36,9%) i luteina

(28,4%), dok u listovima β-karoten i lutein zajedno čine više od 72% ukupnih karotenoida. Svi

nadzemni delovi biljke sadrže male količine neoksantina i violaksantina.

Tri nova seskviterpenoida, nov dimerni eudezmanolid, bialantolakton, nov noreudezmanolid,

trinoralantolakton i novi seko-gvajen 7S,1(10)Z-4,5-seko-gvaja-1(10),11-dien4,5-diokso,

izolovani su iz korena Inula helenium zajedno sa 13 poznatih seskviterpenoida (Jiang et al.,

2011).

U istraživanju alkoholno vodenog ekstrakta iz korena omana, HPLC analiza potvrdila je

prisustvo fenolnih jedinjenja (polifenolne karboksilne kiseline kao što su kofeinska, hlorogenska,

rozmarinska, galna, protokatehuična i gentizinska kiselina i flavonoidi kao što su rutin, kvercetin,

kempferol), ali i alantolaktona kao glavnog seskviterpenskog laktona u proučavanom

hidroalkoholnom ekstraktu (Grigore et al., 2016).

Studije o hemijskom sastavu etarskog ulja korena I. helenium (Tabela 3), gde je hemijski

sastav ispitivan korišćenjem GC i GC/MS-a (gasne hromatografije i gasne hromatografije sa

masenom spektrometrijom), pokazale su da su osnovni sastojci koji se javljaju u ovom ulju

alantolakton, izoalantolakton, dihidroalantolakton i diplofilin (Bourrel et al., 1993; Deriu et al.,

2008; Stojanović-Radić et al., 2012). Pored već poznatih alantolaktona (alantolakton (52,4%) i

izoalantolakton (33,0%), u ulju je identifikovano do 45 komponenti (Stojanović-Radić et al.,

2012), koje su manje zastupljene u njegovom sastavu (Tabela 3). Helenin je fitohemijska

mešavina koja se nalazi u mnogim biljnim vrstama, uključujući oman. To je mešavina dva

izomerna seskviterpenska laktona, alantolaktona i izolantantolaktona (slika 2). Nemački naučnici

Julius Bredt i Wilhelm Posh su 1895. godine ekstrahovali helenin iz I. helenium i utvrdili njegove

15


fizičke i hemijske osobine. Alantolakton se javlja kao sastavni deo korena biljne vrste I. helenium

i drugih vrsta roda Inula (Hoffmann, 2003).

Jedinjenja Izvor Referenca

Eudezmanolidi (Seskviterpeni)

1 Alantolakton I. helenium Bohlmann et al. 1978

2 Izoalantolakton I. helenium Bohlmann et al. 1978

3 Aloantolakton I. helenium Bohlmann et al. 1978

4 2α-Hidroksi alantolakton I. helenium Vajs et al. 1989

5 11αH,13-Dihidroizoalantolakton I. helenium Cantrell et al. 1999

6 11αH,13-Dihidroalantolakton I. helenium Konishi et al. 2002

7 Izokostunolidi I. helenium Chen et al. 2007

Elemanolidi (Seskviterpeni)

8 1,3,11(13)-Elematrien-8β,12-olide I. helenium Konishi et al. 2002

Germakranolidi (Seskviterpeni)

9 1(10),4(15),5(6),11(13)-Germakratetraen-8, 12-olid I. helenium Bohlmann et al. 1978

10 4β, 5α-epoksi-1(10),11(13)-Germakradien-8, 12-olid I. helenium Konishi et al. 2002

11 11(13)-Dehidroeriolin I. helenium Bohlmann et al. 1978

Seskvikaranolidi (Seskviterpeni)

12 Karabron I. helenium Vajs et al. 1989

Gvajanolidi (Seskviterpeni)

13 4α,5α-Epoksi-10α-14H-inuvizkolidi I. helenium Vajs et al. 1989

Humuleni (Seskviterpeni)

14 Izohumulen I. helenium Bohlmann et al. 1978

Druge komponente

15 Damadienol acetat I. helenium Bohlmann et al. 1978

Tabela 2: Hemijska jedinjenja izolovana iz korena I. helenium

16


Koren omana (Inula helenium) može se ekstrahovati korišćenjem alkohola ili drugih

nepolarnih rastvarača za proizvodnju helenina sa sastavom od oko 40% alantolaktona i 60%

izoalantolaktona (Xu, 2014).

Slika 2. Alantolakton, dihidroalantolakton i izoalantolakton

17


Rt/min Klasa jedinjenja Jedinjenje

Bourell et al., 1993

Deriu et al., 2008

Stojanović – Radić et al., 2012

2,63 o Heksanal - - tr

2,7 o 2-metiltetrahidrofuran-3-on - - tr

2,9 o 3-metilbutanska kiselina - - tr

3,52 o 1-Nonen - - tr

4,22 m α-Pinen - - tr

4,52 m Camfen - - tr

4,87 m Sabinen - - tr

5 m β-Pinen - - tr

5,11 o 1-Decen - - tr

5,15 o 2-Pentil furan - - tr

5,18 m Dehidro-1,8-cineol - - tr

5,88 m p-Cimen - - tr

5,98 m Limonen - - tr

6,04 m 1,8-Cineol - - tr

6,84 m cis-Linalol oksid (furanoid) - - tr

7,24 o 1-Undecen - - tr

7,47 m Linalol - - tr

7,71 m α-Tujon - - tr

7,98 m β-Tujon - - tr

8,74 m Kamfor - - tr

8,92 m Menton - - tr

9,06 s Alben - - tr

9,15 m izo-Menton - - tr

Longifolen 0,2 -

9,55 m Terpinen-4-ol - - tr

m Aromadendren 0,2 -

9,92 m α-Terpineol - - tr

12,13 m Izobornil acetat - - tr

12,25 o 1-Tridecen - - tr

13,74 m Citronelil acetat - - tr

13,87 s α-Longipinen - - tr

14,32 m Neril acetat - - tr

14,83 s β-Elemen 1,2 1,5 0,1

15,08 s Petaziten - - tr15,63 s β-Karioflen - - 0,1

Tabela 3. Uporedni prikaz rezultata istraživanja sastava etarskog ulja korena biljne vrste

Inula helenium L.

18


15,9 s cis-α-Ambrinol - - tr

16,26 s epi-β-Santalen - 0,1 tr

16,86 s 4,5-Di-epi-aristolohen - - 0,2

16,92 s Selina-4,11-dien - - 0,3

16,99 m Citronelol izobutanoat - - Tr

17,1 m Neril izobutanoat - - Tr

17,18 s γ-Humulen - - Tr

17,29 s Eremofilen - - 0,3

17,34 s β-Selinen 0,5 0,1

17,51 s α-Selinen - 0,4 0,1

17,67 m Geranil izobutanoat - - 0,1

17,71 s Eremofila-1(10),8,11-trien - - Tr

17,77 s Germakren A - - 0,3

s Germakren B - 0,2 -

19,17 m Neril izovalerat - - Tr

19,57 s Kariofilen oksid 0,7 - 0,1

19,79 m Geranil 2-metilbutirat - - Tr

20 s Rozifoliol - - Tr

20,86 s Eudezm-3,11-dien-5-ol - - Tr

20,93 s Epi- α-Kadinol - - 0,2

21,17 s β-Eudezmol - 0,5 0,1

Eudezma-5,7(11)-dien-8β-12 olid 1,3 - -

Eudezma-4(15), 7(11)-dien-8β-12 olid 0,9 - -

21,33 s Selin-11-en-4-ol - 0,4 0,4

22,11 o 2-Pentadekanon - - Tr

Akorenon - 0,4 -

22,18 s (E)-Kariofilen - 0,2 -

23,22 s α-Ciperon - - Tr

24,33 s Drima-7,9(11)-diene - 0,2 -

24,54 s γ-Gurjunen - 0,4 -

24,67 s Kalitrin - - 0,1

s Ledol - 0,2 -

24,85 s γ-Himahalen - 0,2 -

24,94 s Dihidroinunolid - Tr

25,09 s Valencen - 1,0 -

25,82 s Dihidroizoalantolakton - Tr

26,49 s Alantolakton 52,4 51,3 55,8

26,99 s Dihidroalantolakton 0,4 0,5

27,31 s Diplofilin - 5,1

27,55 s Izoalantolakton 33 36,9 26,3

28,59 m 10-Acetoksi-8,9-epoksithimolizobutirat - - 0,1

19


miristinska kiselina 0,6 - -

palmitinska kiselina 0,3 - -

30,77 o Linolenska kiselina - - 0,3

30,89 o Oleinska kiselina - - 0,9

31,36 o Stearinska kiselina - - tr

Ukupno 91,7 93,9 91,5 tr – trag (< 0,05%); s – seskviterpen; m – monoterpen; o – ostalo

1.4.2. Biološke ativnosti vrste Inula helenium L.

Prethodno je utvrđeno da alantolakton i izoalantolakton imaju niz bioloških aktivnosti,

uključujući antiproliferativno, antikancerogeno, antiinflamatorno, antioksidativno, kao i aktivnost

indukcije enzima za detoksikaciju (Lawrence et al., 2001; Konishi et al., 2002; Spiridonov et al.,

2005; Lim et al., 2007; Petkova et al., 2015).

Alantolakton (ATL) je prirodni seskviterpenski lakton koji poseduje širok spektar bioloških

aktivnosti, kao što su antibakterijska, antifungalna, antiinflamatorna i hepatoprotektivna aktivnost

(Cantrell et al., 1999). Ovo jedinjenje je jak kontaktni alergen (Wichtl, 2004; Huo et al., 2008), a

utvrđeno je sa poseduje i antihelmintnu aktivnost (Konishi et al., 2002). Alantolakton izolovan iz

korena I. helenium je pokazao antiinflamatornu (Rao i Mishra, 1997), antifungalnu (Wahab et al.,

1979; Bourell et al., 1993, Barrero, 2000), antibakterijsku (Cantrell et al., 1999; Tosun et al.,

2005) i antitumorsku aktivnost (Wang et al., 2017). Utvrđeno je da alantolakton ima razne in

vitro biološke aktivnosti, uključujući indukciju apoptoze i zaustavljanje ćelijskog ciklusa u

plućnim skvamoznim ćelijama karcinoma (Zhao, 2015), suzbija aktivaciju STAT3 (Chun, 2015),

kao i da ima antiinflamatorne efekte inhibicijom proizvodnje hemokina i STAT1 fosforilacije

(Lim et al., 2015).

Antitumorska svojstva ATL-a pokazana su u perifernim tumorima, uključujući rak pluća, rak

jetre, rak debelog creva i leukemiju (Pal et al., 2010; Lei et al., 2012; Yang et al., 2013; Shen et

al., 2013; Ding et al., 2016). Međutim, do danas nisu detaljno opisani detaljni antikancerski

mehanizmi pomoću kojih ATL vrši svoje efekte.

Izoalantolakton je takođe potvrđen kao efikasno antimikrobno jedinjenje, aktivno protiv

gljivica (Tan et al., 1998) i bakterija (Cantrell et al., 1999; Liu et al., 2001).

20


1.4.2.1. Antioksidativna aktivnost

Pošto je prethodno utvrđeno da metanolni ekstrakt biljke I. helenium ima potencijal da

indukuje detoksikujuće enzime poput kinon reduktaze (Quinone reductase - QR) i glutation-S-

transferaze (Kwon et al., 2002), u narednoj studiji iste grupe autora ovaj ekstrakt je frakcionisan i

ispitivana ista aktivnost za svaku frakciju (Lim et al., 2007). Heksanska frakcija pokazala je

najveću aktivnost indukcije QR-a i takođe je indukovala glutation-S-transferazu na dozno-zavisni

način. Seskviterpeni, izolovani iz frakcije heksana, bili su glavne komponente odgovorne za QR

indukciju. Među sedam jedinjenja testiranih u ovoj studiji, alantolakton, izoalantolakton i 5-

epoksialantolakton značajno su indukovali QR aktivnost kako u Hepa1c1c7 tako i u BPRc1

ćelijama. Iz tog razloga, seskviterpeni prisutni u I. helenium, uključujući alantolakton,

izoalantolakton i 5-epoksialantolakton, predstavljaju potencijalne hemopreventivne agense (Lim

et al., 2007).

Gökbulut et al. (2013) istraživali su antioksidativnu aktivnost i fenolni sadržaj vodenih,

metanolnih i etil acetatnih ekstrakata tri vrste roda Inula (I. viscosa, I. helenium ssp.

turcoracemosa i I. montbretiana), sakupljanih na raznim lokacijama u Anatoliji. Antioksidantni

kapacitet ispitivan je korišćenjem DPPH i ABTS metode. Fenolni sadržaj utvrđen Folin-

Ciocalteu metodom varirao je u različitim delovima ispitivanih vrsta, krećući se od 21.1 ± 0.8 do

190.9 ± 6.1 mg GAE/g ekstrakta. U vrsti I. helenium utvrđeno je veće prisustvo u nadzemnim

delovima u poređenju sa sadržajem fenola u korenu iste vrste. U metanolnim ekstraktima Inula

vrsta HPLC-DAD metodom utvrđeno je prisustvo hlorogene kiseline, kafeinske kiseline, rutina,

miricetina, kvercetina, luteolina i kempferola. Antioksidativna aktivnost je utvrđena za sve tri

vrste, pri čemu je metanolni ekstrakt cvetova I. helenium pokazao najznačajniji antioksidativni

efekat (IC50: 0.14 ± 0.06 mg/mL, DPPH metodom i (IC50: 0.05 ± 0.02 mg/mL, ABTS

metodom).

Vršena su ispitivanja antioksidativnog potencijala metanolnih (ME), etanolnih (EE),

vodenih (WE) i etil acetantnih (EAE) ekstrakata 4 taksona Inula helenium L. (I. helenium ssp.

orygalis (Boiss.) Grierson, I. helenium ssp. pseudohelenium Grierson, I. helenium ssp.

turcarasemosa Grierson and I. helenium ssp. vanensis Grierson). Korišćeni su fosfomolibdenski

test, β-karotenska metoda i DPPH test kako bi se ocenio antioksidativni kapacitet. Ukupni

fenolni sadržaji određeni Folin-Ciocalteu metodom kretali su se od 4.18 do 102.91 mg

21


ekvivalenta galične kiseline (GAE)/g suvog ekstrakta. Ekstrakti su pokazali značajan efekat na

smanjenje oksidacije β-karotena. Najviša antioksidativna aktivnost dobijena je kod ME I.

helenium ssp. orygalis pri DPPH testiranju (Albayrak et al., 2015).

Petkova et al. (2015) vršili su ispitivanje antioksidativne aktivnosti i sadržaja fruktana u

etanolnim i vodenim ekstraktima korena omana (Inula helenium L.). Postupak ekstrakcije je

uključivao ekstrakciju 95% (v/v) etanolom i naknadni tretman vodom. Antioksidativna aktivnost,

kao i sadržaj ukupnih fenola, procenjeni su pomoću nekoliko metoda i to DPPH, ABTS, FRAP i

CUPRAC testovi. Profil metabolita korena je otkrio njihovu potencijalnu primenu kao hvatača

slobodnih radikala zbog prisustva polifenola. Prema tome, za ekstrakte korena omana može se

pretpostaviti da su bogat izvor biološki aktivne supstance, naročito dijetetskih vlakana sa

potencijalnim prebiotskim efektom, zbog prisustva polisaharida inulina, kao i fruktooligosaharida

(Petkova et al., 2015).

Rezultati istraživanja Grigore et al. (2016) ukazala su na značajan antioksidativni potencijal

alkoholno vodenog ekstrakta korena biljke I. helenium. Ekstrakt je na DPPH testu pokazao

antioksidativnu aktivnost od preko 80% na 50-100 μg/mL, verovatno zbog visokog sadržaja

fenolnih kiselina koje su u njemu utvrđene HPLC analizom.

1.4.2.2. Antimikrobna aktivnost

Jedno od prvih istraživanja bioloških efekata alantolaktona pokazalo je izuzetnu fungistatsku

aktivnost ovog jedinjenja pri koncentraciji od 100 i 200 µg/ml na rast gljive Fusarium solani

izolovanog iz pacijanta sa mikotičnim keratitisom (Wahab et al., 1979).

Uzorak etarskog ulja i heksanski ekstrakt su podvrgnuti antimikrobnom testiranju u odnosu

na pet bakterija i sedam gljivica (Bourrel et al., 1993). Ulje je pokazalo antibakterijsku aktivnost

u opsegu koncentracija od 62,5-4000 µg/ml, gde je najosetljivija bakterija bila S. aureus, a

najveću otpornost pokazala je Gram-negativna bakterija Pseudomonas aeruginosa. Među

testiranim gljivama, humani patogeni su bili osetljiviji u poređenju sa fitopatogenim gljivama, a

najosetljivija je bila C. albicans, gde je MIK iznosila 62,50 µg/ml.

U istraživanju Tan et al. (1998), izoalantolakton izolovan iz korena I. racemosa pokazao je

antimikrobnu aktivnost inhibirajući rast Aspergillus flavus, A. niger, Geotrichum candidum,

22


Candida tropicalis i Candida albicans pri inhibitornim koncentracijama od 49, 49, 14, 14 i 14

mg/ml.

Cantrell et al. (1999) su ispitivali antimikobakterijski efekat heksanskih, dihlorometanskih i

metanolnih ekstrakata korena omana, kao i njihovih hromatografskih frakcija. Utvrđeno je da su

alantolakton, izoalantolakton, 1,2-dehidro-3-epi-izotelekin i aloalantolakton pokazali inhibiciju

mikrobakterije pri koncentraciji od svega 32 µg/ml.

Testiranje antimikrobne aktivnosti izoalatolaktona u odnosu na pet bakterija, šest humanih i

šest biljnih patogenih gljiva pokazalo je apsolutnu toksičnost pri koncentraciji od 500 µg/ml na

tri zemljišne fitopatogene gljive (Gaeumannomyces graminis var. tritici, Rhizoctonia cerealis and

Phytophthora capsici). Utvrđeno je da pri MIK koncentracijama ovo jedinjenje ima fungistatski

efekat, dok su MFK (minimalne fungicidne koncentracije) bile 150, 150 i 350 µg/ml. Pored

ovoga, izoalantolakton je pokazao slabu antibakterijsku aktivnost na Bacillus subtilis,

Escherichia coli, Pseudomonas fluorecense, Sarcina lentus i Staphylococcus aureus pri MIK

koncentracijama od 125, 425, 150, 150 i 100 µg/mL (Liu et al., 2001).

U istraživanju Tosun et al. (2005), ekstrakti pripremljeni od biljnog materijala ukupno 107

vrsta testirani su u odnosu na Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294). Od testiranih

biljnih vrsta, svega pet, među kojima je bila i I. helenium subsp. turcoracemosa, je pokazalo više

od 90% inhibicije mikobakterije pri koncentracijama nižim od 100 mg/ml. U daljem radu,

testiranje čistog alantolaktona u odnosu na istu bakteriju pokazalo je minimalnu inhibitornu

aktivnost pri 3,125 mg/ml.

Stojakowska et al. (2005) utvrdili su da je 10-izobutiriloksi-8,9-epoksitimol glavni sastojak

kultura korena Inula helenium i Inula royleana. Jedinjenje je pokazalo antimikrobnu aktivnost u

delovanju na Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherischia coli, Pseudomonas

aeruginosa i Candida albicans. Ispitivano jedinjenje je pokazalo umerenu antimikrobnu

aktivnost, sličnu onoj koja je utvrđena kod izoalantolaktona. Etil acetatna frakcija ekstrakta

korena I. helenium koji je ispitivao Gorecki (2001) pokazao je jaču antibakterijsku aktivnost od

10-izobutiriloksi-8,9-epoksitimola u odnosu na S. aureus FDA 209 P (MIK < 10 µg/ml). Studija

koju je sproveo Kowalewski et al. (1976), opisuje antimikrobnu aktivnost helenina, kristalnu

mešavinu eudezmanolida iz korena I. helenium. MIK za helenin kretao se od 10 do 100 µg/ml za

različite organizme, uključujući nekoliko sojeva S. aureus (10–400 µg/ml), E. coli, P. aeruginosa

(200–750 µg/ml) i C. albicans (200–750 µg/ml). Jedinjenje 10-izobutiriloksi-8,9-epoksitimol

23


pokazalo je sličan obim aktivnosti prema testiranim mikroorganizmima. Uzimajući u obzir da

kultivisano korenje sadrži veoma male količine eudezmanolida, ukoliko ih uopšte i sadrže,

derivati timola su izgleda glavni antimikrobni agensi u mladom korenju. Pošto su jedinjenja

zajednički konstituenti korenja mnogobrojnih vrsta Asteraceae, autori su predložili dalja

ispitivanja antimikrobne aktivnosti i drugih derivata timola.

O’Shea et al. (2009) su ispitivali ekstrakte omana i utvrdili 100% inhibiciju ukupno 200

kliničkih izolata stafilokoke (uključujući meticilin rezistentnu S. aureus, meticilin senzitivnu S.

aureus i koagulaza negativne stafilokoke). Minimalna baktericidna koncentracija varirala je od

0.9-9 mg/ml, pri čemu je ekstrakt pokazao istu efikasnost i na meticilin senzitivne i meticilin

rezistentne sojeve stafilokoka.

Žugić et al. (2013) su vršili testiranje etarskog ulja dobijenog hidrodestilacijom (IH-HD),

kao i Sohxlet ekstrakata i to etarske (IH-SOX-E) i etanolne (IH-SOX-Et) frakcije. Ekstrakti su

rastvarani u DMSO u koncentracijama od 2560 do 0,625 µg/mL. Antimikrobna aktivnost

ispitivana je mikrodilucionom metodom u bujonu na referentnim bakterijskim sojevima i

kliničkim izolatima iz briseva kože. IH-SOX-E ispoljila je najbolju antimikrobnu aktivnost prema

svim testiranim mikroorganizmima (MIK=<1,25-160 mg/ml), IH-HD je bilo aktivno ali pri višim

koncentracijama (40-1280), dok je IH-SOX-Et jaku aktivnost pokazala je jedino prema kliničkom

izolatu Candida albicans. Rezultati su pokazali da se izolati korena omana mogu koristiti za

inkorporiranje u fitopreparate namenjene za spoljašnju primenu kod kožnih infekcija, naročito

gljivičnih infekcija izazvanih C. albicans.

Tokom istraživanja u kome su izolovana nova jedinjenja iz korena omana, Jiang et al. (2011)

su testirali aktivnost ukupno 16 jedinjenja na Bacillus cereus, Escherichia coli, Erwinia

carotovora, S. aureus i P. aeruginosa. Utvrđeno je da je 4α,15α-epoksialantolakton pokazao jaču

efikasnost na B. cereus (MIK=15,5 µg/ml) nego pozitivna kontrola ampicillin, dok je

izoalantolakton pokazao aktivnost pri 31,3 µg/ml na istu bakteriju. Izoalantolakton, 4α,15α-

epoksialantolakton, makrofililakton, telekin i 3α-hidroksieudezm-4,11-dien-12,8β-olid pokazali

su slabu aktivnost na E. coli (MIK=62,5-125 µg/ml). Jedinjenje 3α-hidroksieudezm-4,11-dien-

12,8β-olid pokazalu je slabu inhibiciju B. cereus, kao i izoalantolakton na S. aureus, dok su

izoalantolakton, makrofililakton, telekin i 3α-hidroksieudezm-4,11-dien-12,8β-olid inhibirali E.

carotovora. Sva ostala testirana jedinjenja nisu pokazala antimikrobni efekat.

24


Ekstrakti izolovani iz tri vrste roda Inula i to I. viscosa, I. helenium ssp. turcoracemosa i I.

montbretiana sakupljanih na raznim lokacijama u Anatoliji, istraživane su u smislu antimikrobne

aktivnosti. Antimikrobni potencijal metanolnih ekstrakata navedenih vrsta ispitivan je u odnosu

na vrste Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Candida albicans i Candida tropicalis. Svi ekstrakti pokazali su bolju aktivnost na

Gram-pozitivne bakterije i na kvasce u poređenju sa Gram-negativnim bakterijama, a aktivnost je

utvrđena pri koncentracijama od 50-800 µg/ml (Gökbulut et al., 2013).

Diguta et al. (2014) sproveli su studiju kako bi se procenile in vitro antimikrobne aktivnosti

korenja populacije Inula helenium L. sa prostora Rumunije. Ekstrahovan je prah suvog korena

biljke u etanolu (30%, 50% and 70% v/v). Antimikrobna aktivnost je testirana na 5 potencijalno

patogenih vrsta bakterija (Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Escherichia

coli, Staphylococcus aureus) i 4 vrste gljivica (Candida albicans, C. parapsilosis, C. lipolytica

and Aspergillus niger). Antimikrobno dejstvo je ispitivano metodom disk difuzije, a rezultati

studije pokazali su da su etanolni ekstrakti (50% i 70%) iz korena rumunske kultivirane I.

helenium L., pokazali značajno antimikrobno dejstvo na sve testirane mikroorganizme, osim na

patogenu filamentoznu gljivu A. niger. Na vrste roda Candida inhibitorski efekti 50% i 70% -

nih ekstrakata bili su veoma slični. Zbog izuzetno dobrog antimikrobnog efekta, autori su kao

zaključak predložili upotrebu ove biljke u kreiranju novog veterinarskog proizvoda sa

antimikrobnim efektom.

Vodeni ekstrakti izolovani iz nekoliko vrsta roda Inula nisu imali nijedan inhibitorni efekat

na testirane bakterije osim kod I. helenium ssp. orygalis. EE I. helenium ssp. orygalis jedino je

bio efikasan kod C. albicans. U ovoj studiji korišćeni su mikroorganizmi Aeromonas hydrophila

ATCC 7965, Bacillus brevis FMC 3, Bacillus cereus RSKK 863, Bacillus subtilis ATCC 6633,

Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 27736, Listeria monocytogenes

1/2B, Morganella morganii, Proteus mirabilis BC 3624, Pseudomonas aeruginosa ATCC

27853, Salmonella typhimurium NRRLE 4463, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Yersinia

enterocolitica ATCC 1501 (Albayrak et al., 2015).

U istraživanju Ginovyan et al. (2017) koji su pored heksanskih, metanolnih, hloroformnih i

acetonskih ekstrakata više biljnih vrsta, lekovitih u Jermeniji, ispitivali navedene ekstrakte i vrste

I. helenium. Sva četiri ekstrakta pokazala su aktivnost samo na P. aeruginosa, dok su S. aureus i

25


Bacillus subtilis pokazale osetljivost samo na heksanski ekstrakt, koji se samim tim pokazao kao

najaktivniji.

Iako postoji samo nekoliko studija na temu antimikrobne aktivnosti etarskog ulja korena I.

helenium, dobijene aktivnosti variraju među studijama i kreću se od 62.50-4000.0 µg/ml (Bourrel

et al., 1993), 9.0-14000.0 µg/ml (Deriu et al., 2008), 13.00 µg/ml (Stojanović-Radić et al., 2012) i

40.0-1280.0 µg/ml (Žugić et al., 2013).

U istraživanju Deriu et al. (2008), utvrđeno je etarsko ulje izolovano iz korena omana deluje

na bakterije Enterococcus faecium, E. faecalis, S. aureus, S. epidermidis, B. cereus, E. coli,

Acinetobacter baumannii, Serratia marcescens, Salmonella typhimurium, Aeromonas sobria i

Pseudomonas aeruginosa, kao i na više vrsta gljiva iz roda Candida (C. albicans, C. glabrata, C.

parapsilosis i C. tropicalis). Bolji antimikrobni efekat utvrđen je na kvasce iz roda Candida, gde

se raspon MIK vrednosti kretao od 0,009-0,6 mg/ml, za razliku od bakterija, kod kojih su se ove

vrednosti kretale od 0,017-14,80 mg/ml. Znatno niža aktivnost utvrđena je za ekstrakt dobije

superkritičnom fluidnom ekstrakcijom, koji je ispoljio aktivnost na samo neke vrste bakterija i

gljiva pri višim koncentracijama u odnosu na etarsko ulje dobijeno vodenom destilacijom.

Pored visokog antimikrobnog potencijala, navedene studije ukazuju na veću aktivnost

etarskog ulja korena I. helenium prema Gram-pozitivnim bakterijama, kao i na mehanizam

delovanja usmeren na ćelijsku membranu S. aureus (Stojanović-Radić et al., 2012).

1.4.2.3. Antineoplastična/ Citotoksična/Antitumorska aktivnost

U radu Konishi et al. (2002) utvrđeno je da metanolni ekstrakt korena omana pokazuje visoku

inhibiciju rasta tumorskih ćelija i to MK-1, HeLa i B16F10. U heksanskoj frakciji ovog ekstrakta,

identifikovano je sedam seskviterpena, među kojima su posebno aktivni bili 1,3,11(13)-

elematrien-8β,12-olid, alantolakton i 5α-epoksialantolakton.

Cilj istraživanja Dorn et al. (2006) bila je identifikacija botaničkog ekstrakta sa

antineoplastičnom aktivnošću. U tom smislu ekstrakti pripremljeni iz korena I. helenium pokazali

su značajno delovanje. Kao što je utvrđeno MTT testom, ekstrakti I. helenium otkrili su visoko

selektivnu toksičnost prema različitim vrstama tumorskih ćelija (HT-29, MCF-7, Capan-2 and

G1), ali mnogo nižu toksičnost prema zdravim ljudskim perifernim krvnim limfocitima (PBL)

kod dva donora. Dodatno je proučavano (elektronskim mikroskopom) umiranje tumorskih ćelija

26


indukovano ekstraktom. Postojala je značajna sličnost morfoloških izmena posmatranih kod četiri

ćelijska tipa: nejednaka kondenzacija hromatina, citoplazmatska vezikulacija, oticanje i ruptura

mitohondrija. Morfologija ćelijskog izumiranja više je podsećala na nekrotično nego na

apoptotično ćelijsko umiranje, što je potkrepljeno neuspešnim označavanjem ranog apoptoničkog

odvijanja Annexin V. Ukazano je, nedavno, da jedinjenja koja indukuju ćelijsku smrt sa

morfologijom poput nekrotične mogu veoma biti od koristi u slučajevima gde su kancerogene

ćelije stekle rezistenciju prema apoptozi. U ovom kontekstu, značajna razlika u citotoksičnosti

uzrokovana ekstraktom I. helenium, a koja je bila više od 100 puta veća u redovima tumorskih

ćelija nego u PBL, čini da je ekstrakt odličan kandidat za dalja antikancerogena istraživanja,

naročito zato što ekstrakt I. helenium nije bio mutageničan prilikom Ames-ovog testa.

Citotoksično dejstvo sirovih ekstrakata etanola iz 61 biljne vrste koje se koriste u ruskoj

narodnoj medicini za ublažavanje simptoma bolesti kod obolelih od raka, proučavano je na

kulturama humanih limfoblastičnih Raji ćelija. Ekstrakti Chelidonium majus, Potentilla erecta,

Chamaenerium angustifolium, Filipendula ulmaria i Inula helenium, imali su značajnu

citotoksičnost, sprečavali su rast ćelija pri koncentracijama od 10 i 50 µg/ml. Citotoksičnost

prečišćenih aktivnih jedinjenja odabranih biljnih vrsta ocenjivana je zajedno sa farmaceutskim

antineoplastičnim lekovima metotreksat, fluorouracil, citofosfamid i vinblastin. Seskviterpenski

laktoni helenin, telekin i artemisinin, aromatični poliacetilen kapilin i alkaloidni preparat

sangviritin suzbili su rast ćelija pri koncentracijama od 1–2 µg/mL, što premašuje citotoksičnost

ciklofosfamida i fluorouracila (Spiridonov et al., 2005).

Antitumorski potencijal ekstrakta omana, ispitivan na ćelijskoj liniji raka dojke BT-20 nije

potvrđen u istraživanju Grigore et al. (2016), gde je samo pri veoma visokoj dozi (500 μg/mL)

ekstrakt indukovao citotoksični efekat na 50% tretiranih ćelija.

27


1.4.2.4. Imunomodulatorna aktivnost/potencijal

Grigore et al. (2016) vršili su istraživanja koja se bave imunomodulatornim potencijalom

alkoholno vodenog ekstrakta korena biljke Inula helenium. In vitro testovi izvedeni na

makrofagima, jednog od najvažnijih tipova ćelija koji su uključeni u imunološki odgovor,

potvrdili su imunostimulatorni potencijal ekstrakta. Manje doze ekstrakta (25-50 μg/mL) pojačale

su stopu proliferacije alveolarnih makrofaga bolje od levamizola. Istovremena primena ekstrakta

omana i LPS-a i izloženost ćelija ovoj kombinaciji tokom 21 sata održale su ćelijsku vitalnost na

preko 50%. Trebalo bi nastaviti studije kako bi se istražilo jedinjenje(a) odgovorno za ovu

aktivnost i objasnio mehanizam aktivnosti.

1.4.2.5. Efekat na nervni sistem

Pored mnogih aktivnosti ulja, nedavno istraživanje o efektu inhalacije etarskog ulja I.

helenium je pokazalo da ovaj proces može pozitivno uticati na psihofiziološke poremećaje

poboljšanjem stanja budnosti mozga (Sowndhararajan et al., 2016). Sowndhararajan et al. (2016)

su istraživali efekat inhalacije esencijalnog ulja iz korena biljke I. helenium na

elektroencefalografsku (EEG) aktivnost ljudskog mozga. Rezultati pokazuju da je inhalacija

esencijalnog ulja biljke I. helenium uzrokovala značajne promene u vrednostima spektra jačine

EEG-a. Tokom inhalacije su zabeležena smanjenja apsolutnih teta (svi regioni osim T3), beta

(Fp1) i srednjih beta (P4) i relativnih teta (Fp1, Fp2, F3 i F4) talasa. Sa druge strane, odnos SMR

i teta (Fp1 i P4), SMR ~ srednjeg beta i teta (Fp1) i SEF 50% alfe (P4) značajno su se povećali

tokom inhalacije esencijalnog ulja biljke I. helenium. Promene u vrednostima EEG-a usled

inhalacije esencijalnog ulja korena biljke I. helenium poboljšava stanje budnosti mozga i može se

koristiti za lečenje psihofizioloških poremećaja.

28


1.5. Osobine ispitivanih mikroorganizama

1.5.1. Gram negativne bakterije

1.5.1.1. Rod Escherichia, vrsta Escherichia coli

Rod Escherichia obuhvata 5 vrsta, od kojih je u medicini najvažnija E. coli. Ova vrsta je

uslovno patogena bakterija koja ulazi u sastav normalne mikrobne flore digestivnog trakta

čoveka, a predstavlja jednu od najčešće izolovanih bakterija iz uzoraka u kliničkim

mikrobiološkim laboratorijama.

Escherichia coli (slika 3) je Gram-negativna pokretna, asporogena i fakultativno anaerobna

bakterija štapićastog oblika koja pripada oportunističkim patogenima. Optimalna temperatura za

njen rast je 37 °C, a nepatogeni sojevi uspevaju i na nižoj temperaturi. Poseduju kapsulu oko

ćelije, kao i flagele.

Morfološke i biohemijske karakteristike. Vrsta je pozitivna na indol, lizin dekarboksilazu,

manitol i formira gas iz glukoze. Oksidaza su negativne. Karakteristični su po fermentaciji

laktoze i specifičnom metalik sjaju na selektivnim podlogama poput Endo ili EMB agara. Na

Endo agaru posle inkubacije od 24 sata kolonije ovih bakterija su prilično velike, konveksne,

glatke i sjajne površine, ravnih ivica i crvene boje, s metalnim sjajem od istaloženog fuksina.

Posle duže inkubacije, kolonije postaju pljosnatije, ivice su im neravnije, a površina im je nešto

izbrazdana. Na dezoksiholat-citratnom agaru rastu oskudnije u vidu manjih, neprozračnih

narandžastih do narandžastocrvenih kolonija. Na krvnom agaru rastu u vidu velikih, konveksnih,

glatkih, sjajnih i prilično velikih mutno sivkastih kolonija. Neki sojevi luče termostabilni

hemolizin i izazivaju beta-hemolizu. Hemolizin ovih sojeva najintenzivnije hemolizira eritocite

pasa, slabije kunića, goveda i konja, a najslabije ovna, zamorca i čoveka (Karakašević et al.,

1967).

Escherichia coli je čest izazivač i intestinalnih i ekstraintestinalnih infekcija kao što su urinarne

infekcije, infekcije rana, meningitis novorođenčadi, pneumonija i sepsa. U smislu respiratornih

oboljenja, ova bakterija se ređe izoluje ali se može naći u uzorcima briseva grla i sputuma, a

najčešće se javlja kao intrahospitalna infekcija (pneumonija asocirana sa mehaničkom

ventilacijom u jedinicama intenzivne nege) (Sutherland et al., 2016). Do pluća može dospeti

29


putem krvi iz gastrointestinalnog ili urinarnog trakta, ali je znatno češći slučaj aspiracije ove

bakterije iz orofaringealnog trakta.

Slika 3. Escherichia coli(a. http://www.starweekly.com.au, b. https://news.wisc.edu,c. https://www.foodsafetynews.com, d. https://news.unl.edu)

1.5.1.2. Rod Moraxella, vrsta Moraxella catarrhalis

Moraxella catarrhalis (slika 4) je Gram-negativna, aerobna, nepokretna, nekapsulirana

diplokoka veličine 1,0-2,5 µm, koja je deo normalne orofaringealne flore, ali i važan

oportunistički patogen (Chen et al., 1996). Na preparatu, ova Gram-negativna koka podseća na

Neisseria sp., ali se može lako razlikovati pomoću rutinskih biohemijskih testova nakon što se

izoluje iz uzoraka inficiranih telesnih tečnosti ili tkiva.

Morfološke i biohemijske karakteristike. Kolonije na hranljivom agaru su veličine oko 2 mm

nakon 48 h kultivacije, mat i konveksne, a glavna karakteristika je da se ne adheriraju na agar.

Optimalna temperature za njihov rast je 37 °C, a mogu rasti u rasponu od 22-42 °C. Vrsta je

oksidaza, esteraza, ekstracelularna dezoksiribonukleaza, lipaza i katalaza pozitivna i vrši

30


hidrolizu tributirina. Ne produkuje kiselinu iz glukoze, maltoze, fruktoze i saharoze; negativna je

na indol, citrat, vodonik sulfid i ne razlaže želatin.

Prisustvo ove bakterije u gornjem delu respiratornog sistema zabeleženo je kod 1 do 5%

zdravih odraslih osoba. Kolonizacija nazofarinksa česta je u detinjstvu, u zimskim mesecima je

učestalija i predstavlja faktor rizika za akutnu upalu srednjeg uva (otitis). Pored pomenutog

otitisa, kao posledica efekta ove bakterije mogu se javiti i sinuzitis, konjuktivitis, bronhitis i

bronhopneumonija, najčešće kod male dece. Veliki broj sojeva je izuzetno otporan na antibiotike

(Murray et al., 1994). Svi sojevi M. catarrhalis proizvode β-laktamaze, a osetljivi su na β–

laktamske antibiotike u kombinaciji s inhibitorima β–laktamaza.

Slika 4. Moraxella catarrhalis(a. https://fineartamerica.com, b. https://www.pinterest.com, c. http://microbe-canvas.com)

31


1.5.2. Gram pozitivne bakterije

1.5.2.1. Rod Staphylococcus, vrsta Staphylococcus aureus

Rod Staphylococcus predstavlja Gram-pozitivne, nepokretne, asporogene koke, koje su

specifično grupisane u grozdove zbog deobe koja se odvija u više ravni. Ćelije su veličine 0,5-1,0

µm i ponekad su inkapsulirane. U okviru roda Staphylococcus najznačajniji humani agens je

Staphylococcus aureus (slika 8), koji ima veći patogeni potencijal od drugih pripadnika ovog

roda. Široko je rasprostranjen u prirodi, a vrlo često se može naći u nazofarinksu, kao i

perineumu, aksili i vagini zdravih ljudi (Jovanović, 2000). Stafilokoke su izuzetno otporne na

fizičke i hemijske agense, pa mogu dugo da opstanu van tela domaćina i široko su rasprostranjene

u prirodi.

Staphylococcus aureus (zlatni stafilokok) (slika 5) je dobio ime po karakterističnom

pigmentu koji kolonijama ove bakterije daje zlatno-žutu boju. Zlatni stafilokok je oportunistički

patogen i izaziva mnošto različitih infekcija i intoksikacija počev od manjih infekcija kože do

teških bolesti poput sepse, zapaljenja pluća i sindroma toksičnog šoka. Poseduje veliku otpornost

na antibiotike. Najznačajnije morfološke karakteristike S. aureus su: ćelijski zid, peptidoglikan,

protein A, tejhojna kiselina i klamping (clumping) faktor. Određeni sojevi S. aureus sintetišu

egzotoksine a određeni procenat sojeva produkuje eksfolijatin. Ova bakterija ima sposobnost

produkcije i pet različitih citotoksina: α, β, γ, δ i leukocidin (Karakašević, 1987).

Morfološke i biohemijske karakteristike. Ova vrsta raste na velikom broju podloga opšte

namene u vidu mat, okruglih kolonija ravnih ivica i promera oko 2 mm. Na preparatu se mogu

uočiti ljubičasto obojene grozdaste formacije sačinjene od okruglih ćelija. Ne poseduju kapsulu

niti strukture za kretanje. Biohemijski testovi pokazuju katalaza, citrat, koagulaza, MR i VP

pozitivnu reakciju, kao i beta hemolizu na krvnom agaru. Vrše hidrolizu želatina i redukciju

nitrata. Prema sposobnosti produkcije enzima koagulaze, sve stafilokoke se dele u dve grupe:

koagulaza pozitivne i koagulaza negativne. U laboratoriji se, na osnovu ispitivanja sposobnosti

produkcije koagulaze može diferentovati koagulaza pozitivan stafilokok (patogeni) od koagulaza

negativnih – uslovno patogenih (oportunističkih) stafilokoka.

32


Vrsta S. aureus izaziva veoma širok spektar oboljenja, uključujući razne kožne infekcije,

oboljenja unutrašnjih organa (endokarditis), ali i respiratorna oboljenja, koja su najčešća kao

sekundarna infekcija nakon viroze, najčešće gripa.

Slika 5. Staphylococcus aureus(a. https://sk.wikipedia.org, b. http://www.pinsdaddy.com)

33


2. Ciljevi rada

izolovati etarsko ulje iz biljnog materijala korena vrste I. helenium metodom

hidrodestilacije

ispitati hemijski sastav etarskog ulja

odrediti antimikrobni potencijal etarskog ulja u odnosu na respiratorne izolate vrsta

Staphylococcus aureus, Escherichia coli i Moraxella catarrhalis

ispitati mehanizam dejstva etarskog ulja omana metodom detekcije oštećenja

membrane i praćenja dinamike rasta ćelijskih kultura tretiranih uljem

34


3. Materijal i metode

3.1. Izolovanje etarskog ulja

Etarsko ulje biljne vrste Inula helenium je izolovano hidrodestilacijom u aparaturi po

Klevendžeru (Clevenger). Suvi biljni materijal je nakon usitnjavanja i odmeravanja

hidrodestilovan tokom 2,5 h. Dobijeno etarsko ulje tamno plave boje je ekstrahovano dietil-

etrom, a zatim je ekstrakt sušen preko anhidrovanog magnezijum-sulfata. Prinos ulja je određen

odmah nakon odvajanja sredstva za sušenje filtriranjem, odnosno uparavanja dietil-etra na

rotacionom vakuum uparivaču. Dobiveno etarsko ulje je, odmah nakon obrade, analizirano

korišćenjem metoda GC i GC-MS.

3.2. Gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC-MS)

Gasno-hromatografska analiza (GC-MS) etarskog ulja i „dry flash” frakcija etarskog ulja

je izvršena na gasnom hromatografu tipa HP 6890N, sa DB-5MS kapilarnom kolonom (5%

fenilmetilsiloksan, dimenzije 30 m × 0,25 mm, debljina filma 0,25 μm, Agilent Technologies,

SAD). Gasni hromatograf je bio direktno povezan sa masenim detektorom MSD 5975B iste

kompanije. Uslovi analize: radna temperatura injektora 250 °C, odnosno detektora 320 °C;

linearni temperaturni program zagrevanja kolone u opsegu od 70 °C do 290 °C sa brzinom

povećanja temperature od 5 °C/min, nakon čega je postojao izotermalni period na 290 °C u

trajanju od 10 minuta. Injektiran je rastvor uzorka u etru (1 μl rastvora koncentracije 1 mg u 1 ml

dietil-etra), u pulsnom „split” modu (40:1), pri protoku od 1,5 ml/min helijuma za prvih 30

sekundi, a zatim je protok održavan na 1,0 ml/min do kraja analize. Jonizacija je vršena

elektronima energije 70 eV, sa akvizicijom m/z vrednosti opsegu od 35 do 650 i brzinom

skeniranja na 0,32 s po skenu. Procentualni sastav pojedinih sastojaka je određen na osnovu

odnosa površina pikova, bez korišćenja korekcionih faktora.

35


3.3. Identifikacija sastojaka

Obrada rezultata je vršena pomoću MSD ChemStation softvera (ver. D.03.00.611,

Agilent Technologies, SAD) u kombinaciji sa AMDIS (ver. 2.68) i NIST MS Search

programskim paketima (ver. 2.0d, Nacionalni institut za standarde i tehnologiju (NIST), SAD).

AMDIS je korišćen za dekonvoluciju masenog skena, tj. ekstrakciju masenih spektara iz skenova

preklopljenih pikova, dok je NIST MS Search obezbedio algoritam za pretragu biblioteka

masenih spektara. Linearni retencioni indeksi svih sastojaka analiziranih uzoraka su određeni

koinjekcijom uzorka sa homologom serijom n-alkana od C9-C29 (Den Dool i Kratz, 1963).

Hemijski sastav uzoraka ulja i frakcija ulja je određen upoređivanjem linearnih retencionih

indeksa sastojaka sa literaturnim vrednostima (Adams, 2007), kao i na osnovu poređenja

masenih spektara jedinjenja sa spektrima jedinjenja iz biblioteka Wiley Registry of Mass

Spectral Data 11th Edition, NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library 07, MassFinder 2.3, Adams

(Adams, 2007) i biblioteke masenih spektara laboratorije za organsku analizu i sintezu, PMF-a u

Nišu. Gde god je bilo moguće, vršena je i analiza uzorka sa koinjektiranim odgovarajućim

standardom.

3.4. Antimikrobne analize

3.4.1. Testiranje antimikrobne aktivnosti etarskih ulja na respiratorne izolate

3.4.1.1. Bakterijski izolati

Za određivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja korišćeni su sledeći izolati: 4 izolata

Staphylococcus aureus (bris nosa), jedan izolat Escherichia coli (bris grla) i jedan izolat vrste

Moraxella catarrhalis (bris nosa). Respiratorni izolati su poreklom od pacijenata poliklinike

''Human'' u Nišu. Izolati su kultivisani na hranljivom agaru i inkubirani na 37 °C, nakon čega su

održavani i skladišteni u laboratoriji Prirodno-matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu.

36


Slika 6. Mikrotitar pločahttp://www.ibz.ethz.ch

3.4.1.2. Mikrodiluciona metoda

Antimikrobna aktivnost etarskog ulja I. helenium testirana je mikrodilucionom metodom

na mikrotitar pločama. Od prekonoćnih kultura testiranih sojeva mikroorganizama uzgajanih na

hranljivom ili krvnom agaru, napravljene su suspenzije bakterija u sterilnom fiziološkom

rastvoru i podešene na turbiditet od 0.5 McFarland-a, što odgovara koncentraciji bakterija od 1-5

x 108 CFU/ml (CLSI –Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008). Rastvor etarskog ulja

(100% DMSO) ubačen je u bunariće mikrotitar ploče i napravljena serija od 12 duplih

razblaženja (finalni raspon koncentracija iznosio je 0,004-10 mg/ml), nakon čega je svaki

bunarčić inokulisan prethodno podešenom suspenzijom odgovarajuće vrste bakterije. Ovako

pripremljene mikrotitar ploče inkubirane su na 37 °C u trajanju od 24 h. Nakon tog perioda,

minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) očitavane su nakon 1 h inkubacije na 37 °C sa

dodatkom 0,05% TTC-a (trifenil-tetrazolijum hlorid). Koncentracija prvog bunarića u kojoj nije

bilo crvenog obojenja predstavlja MIK, a bujon iz svih neobojenih bunarića je prenet

automatskom pipetom na petri ploče sa sterilnom Miler-Hinton podlogom. Nakon inkubacije

tokom 24 h na 37 °C, brojane su izrasle kolonije i određene minimalne baktericidne

koncentracije (MBK) testiranog etarskog ulja. MBK se definiše kao ona koncentracija

antimikrobne supstance pri kojoj se uništi 99.99% bakterijskih ćelija. Metoda dilucije je izvedena

u tri ponavljanja, a kao pozitivna kontrola korišćen je antibiotik hloramfenikol početne

koncentracije 0,1 mg/ml.

37


3.4.2. Metode za određivanje mehanizama delovanja etarskih ulja

3.4.2.1. Kinetika (dinamika) rasta tretiranih bakterija

Za merenje kinetike rasta tretiranih bakterija, sterilni bujon sa dodatkom etarskog ulja I.

helenium (u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji) zasejan je suspenzijom napravljenom iz

prekonoćne kulture odgovarajućeg bakterijskog soja, prethodno standardizovanog na 0.5

MacFarland turbiditet. Nakon inokulacije, odmah je uzet uzorak čija je apsorbanca izmerena na

600 nm (vreme 0), a zatim su uzorci uzimani nakon 1, 2, 6, 12 i 24 h. Pored ovoga, eksperiment

je obuhvatao i sledeće kontrolne uzorke: bujon sa rastvaračem (DMSO), bujon koji je sadržao

samo dodato etarsko ulje, kao i bujon koji je sadržao samo bakterije (inokulum).

3.4.2.2. Metoda detekcije oslobađanja nukleinskih kiselina

Prekonoćne kulture bakterija u Miler Hinton bujonu (30 ml) su centrifugirane 5 min na

4000 rpm (4 °C), dva puta isprane fosfatnim puferom (PBS-Phosphate Buffer Saline) i

resuspendovane u PBS-u, tako da je finalna gustina suspenzija iznosila 1010 ćelija/ml. Suspenzija

je zatim podeljena na jednake volumene, koji su zatim centrifugirani 10 minuta na 10 000 x g,

(20 °C). Nakon odlivanja supernatanta i dodavanja rastvorenih etarskih ulja u istom volumenu,

suspenzije su ponovo centrifugirane, nakon čega je dobijeni supernatant sniman na 260 nm

talasne dužine. Merenja su vršena u vremenskim intervalima od 0 minuta, 30 minuta, 1 h, 2 h i 4

h od momenta dodavanja ulja. Uz pomenute uzorke, snimana je i apsorbanca rastvora etarskog

ulja bez ćelija, koji je služio kao kontrola koja je pri analizi podataka oduzimana od apsorbance

uzoraka.

38


4. Rezultati i diskusija

Destilacijom biljnog materijala korena omana dobijeno je etarsko ulje, čijom je analizom

tehnikama GC i GC-MS utvrđeno prisustvo 25 komponenti, što predstavlja 96,2%

ukupnog masenog udela. Od prisutnih 25 komponenti identifikovano je 21, što

predstavlja 93,3% masenog udela. Pregled učestalosti pojedinačnih komponenti prikazan

je u Tabeli 4 i na Grafikonu 1.

RI1 Sastojci [%] ID800 Heksanal 0,1 RI, MS, CoI806 Butil acetat 0,1 RI, MS, CoI907 Ciklofenhen tr MS, CoI966 β-Pinen 0,1 RI, MS, CoI1030 Eukaliptol tr RI, MS, CoI1148 Camfor tr RI, MS, CoI1159 Alben 0,1 MS, CoI1394 β-Elemen 0,3 MS, CoI1422 (E)-Kariofilen 0,1 RI, MS, CoI1440 Dihidro-β-jonon tr MS, CoI1449 epi-β-Santalen tr MS, CoI1462 β-Santalen tr MS, CoI1472 4,5-di-epi-Aristolohen 0,2 MS, CoI1489 β-Selinen 0,5 MS, CoI1498 α-Selinen tr MS, CoI1508 Germakren A 0,1 MS, CoI1580 Elemenal 0,2 RI, MS, CoI1586 Kariofilen oksid 0,2 RI, MS, CoI1649 3-Metiltetradekan-2-on tr RI, MS, CoI

1901 Seskviterpenski lakton 1 (C15H22O2)a tr /

1915 Alantolakton 65,8 RI, MS, CoI

1931 Seskviterpenski lakton 2 (C15H22O2)b 0,4 /

1954 Izoalantolakton 25,5 RI, MS, CoI

1957 Seskviterpenski lakton 3 (C15H22O2)c 1,9 /

Tabela 4. Hemijski sastav etarskog ulja izolovanog iz korena biljne vrste Inula helenium

39


1967 Seskviterpenski lakton 4 (C15H20O2)d 0,6 /

Ukupno 96.2 (25)j

Monoterpenoidi (M) 0.2 (4)Seskviterpenoidi (S) 92.8 (12)Seskviterpenski laktoni 91.3 (2)Ostalo (O) 0.2 (5)Neidentifikovana jedinjenja 2.9 (4)

Ukupno (%) 96.2 (25)j

RI1 = eksperimentalno određeni retencioni indeksi na DB-5MS koloni koinjekcijom homologe serije n-alkana C7-C30. tr = trag (< 0.05%); ID = Identifikacija; Identitet jedinjenja je potvrđen poređenjem njihovih masenih spektara sa spektrima iz Wiley 6, Nist 02, MassFinder 2.3 (MS), izračunatih retencionih indeksa (RI) sa literaturnim vrednostima (Adams, 2007) i koinjekcijom (CoI) sa odgovarajućim standardom.a MS(EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 234 (12.8), 219 (21.5), 178 (23.2), 161 (16.6), 145 (100), 131 (20.5), 119 (26.7), 105 (56.3), 91 (69.1), 77 (36.9), 67 (18.8), 55 (26), 41 (40.6).b MS(EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 234 (12.5), 219 (42.9), 173 (14.6), 161 (10.3), 145 (100), 131 (26.4), 119 (15.4), 105 (33.1), 91 (51.3), 77 (31.3), 67 (14.5), 55 (19.7), 41 (30).c MS(EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 234 (6.8), 219 (16.4), 192 (29.8), 178 (16.9), 161 (43.4), 145 (53.5), 133 (26.4), 119 (57.8), 105 (65.8), 91 (100), 79 (81.8), 77 (65.1), 67 (49.2), 55 (56.9), 41 (73.3).d MS(EI, 70 eV), m/z (rel. int, %): 232 (9.6), 217 (9.6), 203 (3.1), 189 (4.4), 175 (9), 161 (8.3), 145 (14.1), 135 (15), 121 (22.1), 108 (39.7), 105 (31.5), 91 (70.3), 79 (44.2), 77 (43.4), 68 (100), 53 (66.4), 41 (52.8).j broj u zagradi predstavlja broj jedinjenja koja pripadaju datoj klasi klasi.

Rezultati su izraženi kao relativni udeo (%) komponente u etarskom ulju. Etarsko ulje

koje je dobijeno hidrodestilacijom korena omana pokazuje visok sadržaj seskviterpenoida

92,8% (12 komponenti), gde seskviterpenski laktoni čine 91,3% (2 komponente) i nizak

sadržaj monoterpenoida 0,2% (4 komponente). Od znatno manje zastupljenih komponenti

ispitivanog ulja, kao najdominantnije izdvojile su se:

1. neidentifikovani seskviterpenski lakton 1 (tr), 2 (0,4%), 3 (1,9%), 4 (0,6%)

(C15H22O2) što čini ukupno 2,9%,

2. β-selinen (0,5),

40


3. β-elemen (0,3%).

Prisustvo alantolaktona i izoalantolaktona, kao glavnih komponenti ovog ulja,

dokumentovano je u svim radovima na ovu temu, gde su ova dva seskviterpenska laktona

uglavnom zauzimala više od 80% njegovog sastava (Bourrel et al., 1993; Deriu et al.,

2008; Stojanović-Radić et al., 2012). U ovom radu ispitivano ulje (Tabela 4), u odnosu na

prethodne rezultate (Tabela 3), pokazuje da seskviterpenski laktoni čine 91,3% udela

komponenti etarskog ulja - alantolakton (65,8%) i izoalantolakton (25,5%).

Grafik 1. Prikaz sastava etarskog ulja izolovanog iz korena biljne vrste I. helenium (L.)

41


U radu Bourrel et al. (1993), seskviterpenski laktoni čine 85,4%, što je za 5,9%

manje, od toga alantolakton iznosi 52,4%, što je za 13,4% više i izoalantolakton 33% što

je za 7,5% više nego u ovde ispitivanom ulju. Takođe, kod Deriu et al. (2008),

procentualna zastupljenost helenina (alantolakton + izoalantolakton) iznosila je 88,2%,

što je za 3,1% manje negó u našem ulju. Od toga, alantolakton je bio zastupljen sa 51,3%,

(14,5% manje), a izoalantolakton sa 36,9% (11,4% više nego u našem istraživanju).

U studiji Stojanović-Radić et al. (2012), helenin je bio zastupljen sa 82,1% (9,2%

manje), a od toga je bilo 55,8% alantolaktona (za 10% manje) i 26,3% više

izoalantolakton, što je za 0,8 više nego u ovom radu. Srednja vrednost za alantolakton, u

pomenuta 3 rada, iznosi 53,17%, a za izoalantolakton iznosi 32,07% (za helenin 85,24%).

Upoređujući sa našim radom, srednja vrednost za alantolakton je manja za 12,63%, a za

izoalantolakton veća za 6,57% nego u prethodnim istraživanjima. Interesantna je

činjenica da u našoj analizi nije pronađena komponenta diplofilin, koja je bila prisutna u

etarskom ulju omana sakupljenog u Srbiji, a koja se pokazala kao jedan od glavnih

nosioca antimikrobne aktivnosti ovog ulja (Stojanović-Radić et al., 2012).

Na osnovu daljeg upoređivanja ovog rada (Tabela 4) sa tri pomenuta (Tabela 3),

može se videti da je u ovom radu identifikovano prisustvo 25 komponenti (96,2%

masenog udela), dok su Bourrel et al. (1993) utvrdili prisustvo 12 (što čini 91,7%

masenog udela), Deriu et al. (2008) 15 (93,9%) i Stojanović-Radić et al. (2012) 67

komponenti (91,5% masenog udela) u hemijskom sastavu ulja izolovanog iz korena

omana.

U odnosu na ova tri rada, u našem ulju se pojavljuju tri komponente koje nisu

zabeležene ili su u tragovima kod njih, a to su heksanal (sa 0,1%), β-pinen (sa 0,1%) i

alben (sa 0,1%) - (kod Bourrel et al. (1993) i Deriu et al. (2008) nisu zabeleženi, dok je

kod Stojanovi-Radić et al. (2012) u tragovima).

Pet jedinjenja koja se pojavljuju u ovom radu (iznose 0,1% i više), u ostala tri

rada se ne pojavljuju čak ni u tragovima, ili se pojavljuju u minimalnim procentima, su:

1. β-elemen 0,3% (Bourrel et al. (1993) 1,2%, Deriu et al. (2008) 1,2%, Stojanović-

Radić et al. (2012) 0,1%),

42


2. 4,5-di-epi-aristolohen 0,2% (Bourrel et al. (1993) 0%, Deriu et al. (2008) 0%,

Stojanovi-Radić et al. (2012) 0,2%),

3. β-selinen 0,5% (Bourrel et al. (1993) 0,5%, Deriu et al. (2008) 0%, Stojanović-

Radić et al. (2012) 0,1%),

4. Germakren A 0,1% (Bourrel et al. (1993) 0%, Deriu et al. (2008) 0%, Stojanović-

Radić et al. (2012) 0,3%),

5. (E)-Kariofilen 0,1% (Bourrel et al. (1993) 0%, Deriu et al. (2008) 0,2%,

Stojanović-Radić et al. (2012) 0%).

Četiri komponente koje su se u našem ulju javila u jako niskom procentu (eukaliptol,

kamfor, epi-β-santalen i α-selinen) u ostala tri rada nisu zabeležene kao prisutne, ili su

takođe detektovane u minimalnim procentima. Eukaliptol i kamfor se kod nas i ulja

takođe izolovanog iz materijala poreklom iz Srbije (Stojanović-Radić et al., 2012)

pojavljuju u tragovima, dok u ostalim radovima nisu detektovane kao komponente ulja

omana. Epi-β-santalen se u ovom radu i studiji Stojanović-Radić et al. (2012) pojavljuje u

tragovima, kod Deriu et al. (2008) njegovo učešće bilo je 0,1% ukupnog sadržaja ulja,

dok kod Bourrel et al. (1993) ova komponenta nije detektovana. Slična situacija uočena

je za jedinjenje α-selinen, koja je u ovde ispitivanom ulju bila prisutna u tragovima, u

istraživanju Stojanović-Radić et al. (2012) imala je učešće od 0,1%, kod Deriu et al.

(2008) 0,4%, dok kod Bourrel et al. (1993) ni ona nije detektovana. Takođe, četiri

minornih komponenti našeg ulja i to ciklofenhen, dihidro-β-jonon, β-santalen i 3-

metiltetra-dekan-2-on nisu do sada zabeležene kao komponente ulja omana. Pored ovih,

nešto više zastupljene komponente (0,1% i više), koje do sada nisu zabeležene u ulju

omana bile su butil acetat (0,1%), elemen (0,2%) i kariofilen oksid (0,2%). Na osnovu

navedenog, ukupno je 7 komponenti (koje su u tragovima ili iznose 0,1% i više u ovom

radu) po prvi put zabeleženo u etarskom ulju omana. Kod ispitivanja hemijskog sastava

korena i nadzemnih delova vrste Inula helenium od strane Bolhman et al. (1978),

utvrđeno je da su, pored dominantnog prisustva alantolaktona i izoalantolaktona, prisutna

i jedinjenja koja pripadaju uglavnom seskviterpenima i to aloalantolakton

(eudezmanolid/seskviterpen), 1(10),4(15),5(6),11(13)-germakrateaen-8,12-olid, 11(13)-

dehidroeriolin (germakranolidi/seskviterpeni), izohumulen (humulen/seskviterpen) i

43


damadienol acetat (druge komponente). Navedene komponente u ovom radu nisu

pronađene prilikom hemijske analize etarskog ulja I. helenium. Takođe, nešto kasnije,

Vajs et al. (1989) istraživanja seskviterpenskih laktona iz I. helenium po prvi put su

utvrdila prisustvo 11(13)-dehidrokriolina, 2α-hidroksialantolaktona, 4α,5α-epoksi-

10α,14-H-inuviskolida i karabrona, koji takođe nisu zabeleženi u ovom radu prilikom

hemijske analize etarskog ulja I. helenium. Rezultati drugih istraživanja, koji su

pomenuti, kao i rezultati dobijeni u okviru istraživanja u ovom radu, ukazuju nam na

velike razlike u kvalitativnom i kvantitativnom sastavu terpenoidnih jedinjenja. Mnoge

komponente se pojavljuju u jednim istraživanjima, dok se u drugim ne pojavljuju čak ni u

tragovima. Ovo je najverovatnije rezultat uticaja staništa, različitih genetičkih, ekoloških

i drugih faktora na biosintezu sekundarnih metabolita. Poznato je da vrste i količine

pojedinih jedinjenja u organima i tkivima biljaka su upravo uslovljene pomenutim

faktorima. Komponente koja se pojavljuju u svim istraživačkim radovima i koja su

dominantna, jesu seskviterpenski laktoni i njihov udeo je veći od 80% u etarskom ulju I.

helenium.

U ovom radu vršeno je ispitivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja I.

helenium (omana) u odnosu na odabrane sojeve mikroorganizama (Tabela 5).

Mikrodilucionom metodom određene su minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) i

minimalna baktericidna koncentracija (MBK). Ova metoda, korišćena u ovom

istraživanju, pokazala je aktivnost etarskog ulja omana u opsegu koncentracija od 0,07 do

10,0 mg/ml (Tabela 5, Grafik 2). Ispitivano etarsko ulje bilo je efikasno na sve testirane

izolate, pri čemu su minimalne inhibitorne koncentracije varirale od 0,07-2,50 mg/ml,

dok su se minimalne baktericidne koncentracije kretale od 0,15-10,0 mg/ml.

44


Redni broj Izolati Poreklo MIK MBK

1 Staphylococcus aureus bris nosa 2,50 10,0




5 Escherichia coli bris grla 2,50 10,0

6 Moraxella catarrhalis bris nosa 1,25 1,25

Tabela 5. Antimikrobna aktivnost (MIK/MBK) etarskog ulja I. helenium protiv respiratornih izolata

Grafik 2. Antimikrobna aktivnost (MIK/MBK) etarskog ulja I. helenium protiv respiratornih izolata

45


Dosadašnje studije na temu antimikrobne aktivnosti etarskog ulja korena I.

helenium, pokazuju da dobijene aktivnosti variraju među njima i kreću se od 0,01 mg/ml

do 14,8 mg/ml (0,06-4,00 mg/ml (Bourrel et al., 1993), 0,02-14.80 mg/ml (Deriu et al.,

2008), 0,01 mg/ml (Stojanović-Radić et al., 2012) i 0,04-1,28 mg/ml (Žugić et al., 2013)),

što se poklapa sa rezultatima dobijenim u ovom istraživačkom radu gde je opseg

koncentracija od 0,07 mg/ml do 10 mg/ml.

Bourrel et al. (1993) izvršili su antimikrobno testiranje uzoraka etarskog ulja i

heksanskih ekstrakata u odnosu na pet bakterija i sedam gljivica. Ulje je pokazalo

antibakterijsku aktivnost u opsegu koncentracija od 0,06-4 mg/ml, gde je najosetljivija

bakterija bila S. aureus, a najveću rezistentnost pokazala je Gram-negativna bakterija

Pseudomonas aeruginosa. Pored toga, Stojanović-Radić et al. (2012) su pored visokog

antimikrobnog potencijala, ukazali takođe na veću aktivnost etarskog ulja korena I.

helenium prema Gram-pozitivnim bakterijama, kao i na mehanizam delovanja usmeren

na ćelijsku membranu S. aureus. Godinu dana kasnije, Gökbulut et al., (2013) ispitivali

su antimikrobni potencijal metanolnih ekstrakata, izolovanih iz tri vrste roda Inula i to I.

viscosa, I. helenium ssp. turcoracemosa i I. montbretiana, u odnosu na vrste

Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Candida albicans. Svi ekstrakti pokazali su, kao i u prethodnim

istraživanjima, bolju aktivnost na Gram-pozitivne bakterije u poređenju sa Gram-

negativnim bakterijama, a aktivnost je utvrđena pri koncentracijama od 0,05-0,8 mg/ml.

U ovom, kao i u dosadašnjim istraživanjima, najveću osetljivost na dejstvo ulja

pokazao je (Tabela 5) izolat S. aureus 3 (MIK 0,07 mg/ml i MBK 0,15 mg/ml), dok su

najveću rezistenciju pokazala dva soja i to S. aureus 1 i E. coli, koji su imali iste

vrednosti inhibitornih i baktericidnih koncentracija (MIK 2,50 mg/ml i MBK 10 mg/ml).

U ostalim radovima vršeno je i ispitivanje drugih ekstrakata, kao i pojedinačnih

komponenti ekstrakata I. helenium, kao što je i studija koju je sproveo Kowalewski et al.

(1976), gde opisuje antimikrobnu aktivnost helenina, kristalnu mešavinu eudezmanolida

iz korena I. helenium. MIK za helenin kretao se od 10 do 100 µg/ml za različite

organizme, uključujući nekoliko sojeva S. aureus (10–400 µg/ml), E. coli, P. aeruginosa

(200–750 µg/ml) i C. albicans (200–750 µg/ml). Jedinjenje 10-izobutiriloksi-8,9-

46


epoksitimol pokazalo je sličan obim aktivnosti prema testiranim mikroorganizmima.

Uzimajući u obzir da kultivisano korenje sadrži veoma male količine eudezmanolida,

ukoliko ih uopšte i sadrže, derivati timola su izgleda glavni antimikrobni agensi u

mladom korenju. Pošto su jedinjenja zajednički konstituenti korenja mnogobrojnih vrsta

Asteraceae, autori su predložili dalja ispitivanja antimikrobne aktivnosti i drugih derivara

timola (Stojanowska et al., 2005).

Istraživanja Cantrell et al. (1999), koja su vršena za ispitivanje antimikobakterijskih

efekata heksanskih, dihlorometanskih i metanolnih ekstrakata korena omana, kao i

njihovih hromatografskih frakcija pokazala su da pojedinačne komponente kao što su

alantolakton, izoalantolakton, 1,2-dehidro-3-epi-izotelekin i aloalantolakton pokazuju

inhibiciju mikrobakterije pri koncentraciji od svega 0,03 mg/ml. Testiranje koje su

sproveli Liu et al. (2001) o antimikrobnoj aktivnosti izoalatolaktona u odnosu na Bacillus

subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorecense, Sarcina lentus i Staphylococcus

aureus utvrdilo je MIK koncentracije od 0,13 mg/ml, 0,43 mg/ml, 0,15 mg/ml, 0,15

mg/ml i 0,1 mg/ml, respektivno, što ukazuje na umerenu antibakterijsku aktivnost. U

istraživanju Tosun et al. (2005), ekstrakti pripremljeni od biljnog materijala ukupno 107

vrsta testirani su u odnosu na Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294). Od

testiranih biljnih vrsta, svega pet, među kojima je bila i I. helenium subsp.

turcoracemosa, je pokazalo više od 90% inhibicije mikobakterije pri koncentracijama

nižim od 100 mg/ml. U daljem radu, testiranje čistog alantolaktona u odnosu na istu

bakteriju pokazalo je minimalnu inhibitornu aktivnost pri 3,125 mg/ml.

Zbog svega navedenog, dalja istraživanja treba fokusirati ka detaljnijim

ispitivanjima hemijskog sastava i antimikrobnog potencijala pojedinačnih komponenti

etarskog ulja I. helenium. Treba detaljno ispitati i efekat ovog ulja na normalnu floru,

kako bi se procenila eventualna selektivnost na patogene vrste, čime bi ovo ulje dobilo

na značaju kao terapeutski agens.

Rezultati dobijeni spektrofotometrijskim merenjem izlaska nukleinskih kiselina iz

ćelija respiratornih izolata tretiranih etarskim uljem omana pokazali su različite efekte

nakon finalnog perioda od 4 h (Grafik 3). U odnosu na jedini tretirani soj vrste E. coli,

vidi se postupni rast koncentracije nukleinskih kiselina van ćelije, koji je bio najveći

47


nakon 4 h. Međutim, pošto je kontrolni uzorak pokazao slične rezultate, efekat ulja je

verovatno nije usmeren na ćelijsku membranu.

U odnosu na izolat M. catarrhalis, uočen je povećan izlazak nukleinskih kiselina

kada su ćelije tretirane etarskim uljem u poređenju sa kontrolnim uzorcima. Izolati S.

aureus su pokazali različite efekte ispitivanog etarskog ulja, pri čemu je na nekim

sojevima uočljiva povećana propustljivost ćelijske membrane (sojevi 3 i 4), dok je kod

drugih taj efekat izostao u prvih 4 h inkubacije u prisustvu etarskog ulja u minimalnoj

inhibitornoj koncentraciji. Generalno se na osnovu dobijenih rezultata može reći da ni

kod jednog soja nije detektovano masivno oštećenje membrane koje bi rezultovalo smrću

ćelije u periodu do 4 h nakon aplikacije ulja. Samim tim, može se zaključiti da

mehanizam delovanja etarskog ulja omana nije usmeren samo na ćelijsku membranu, već

verovatno na neke od regulatornih ćelijskih procesa.

Curenje citoplazminog materijala smatra se indikativnim za grubo i nepovratno

oštećenje citoplazmine membrane. Zato, mnoga antimikrobna jedinjenja izazivaju

gubitak materijala delujući na bakterijsku membranu. Materijal koji se apsorbuje na 260

nm su nukleinske kiseline, dok su na 280 nm proteini (Carson et al., 2002). Suspenzija E.

coli K1.1, koja je tretirana etarskim uljem biljne vrste Kaempferia pandurata, izgubila je

značajne količine 260 i 280 nm apsorbujućeg materijala upoređujući vrednosti sa

kontrolnim uzorkom koga su sačinjavale samo bakterijske kulture, što ukazuje na to da su

nukleinske kiseline i određeni protein izgubljeni kroz oštećenu citoplazminu membranu.

Značajno povećanje apsorpcije na 260 nm dogodilo se posle tretmana MIK (0,11%) i

2xMIK (0,22%) koncentracijom etarskog ulja u etanolu (P˂0,005; F vrednosti = 249,58)

(Miksusanti et al., 2008). U poređenju sa našim istraživanjem, gde su kontrolni uzorak i

tretirani uzorak imali slične rezultate, može se zaključiti da je etarsko ulje K. pandurata

efikasnije delovalo na soj E. coli u odnosu na etarsko ulje I. helenium.

U radu Yang et al. (2018) ispitivan je uticaj etarskog ulja Kaempferia galanga na

odabrane sojeve bakterija (E. coli, S. typhimurium, S. aureus) merenjem količine

oslobođenog nukleinskog mareijala u supernatantu. Nukleinske kiseline i proteini su

oslobođeni u supernatantu, na nivoima koji se značajno povećavaju vremenom posle

izlaganja etarskom ulju K. galanga. Uzorci su mereni 1, 2, 6 h nakon početka

48


eksperimenta. Utvrđena je pozitivna korelacija oštećenja sa vremenom trajanja tretmana

etarskim uljem. Koncentracije nukleinskih kiselina i proteina u ekstracelularnom prostoru

značajno su se povećale u prvom satu tretmana. I u narednih 5 sati, ovaj trend se nastavio

u različitim stepenima. U međuvremenu, kontrolni uzorci nisu pokazali skoro nikakav

porast. U našem radu prisutan je postupni rast koncentracije nukleinskih kiselina van

ćelije (E. coli), ali je i kontrolni uzorak pokazao slične rezultate, pa verovatno efekat ulja

nije usmeren na ćelijsku membranu, za razliku od rezultata koji su dobijeni u radu Yang

et al. (2018). U navedenom radu, takođe je bio prisutan postupni rast koncentracije

nukleinskih kiselina van ćelije (E. coli), ali za razliku od naših rezultata, kontrolni uzorci

nisu pokazali skoro nikakav porast, pa se može zaključiti da je efekat etarskog ulja K.

galanga usmeren na ćelijsku membranu. Izolati S. aureus su u našem radu pokazali

različite efekte ispitivanog etarskog ulja, pri čemu je na nekim sojevima uočljiva

propustljivost ćelijske membrane (sojevi 3 i 4), dok je kod drugih taj efekat izostao u

prvih 4 h eksperimenta, za razliku od rezultata koji su dobijeni u radu Yang et al. (2018)

gde takvih varijacija nije bilo, već se koncentracija nukleinskih kiselina postupno

povećavala van ćelije u toku vremena dok je porast nukleinskih kiselina u kontrolnim

uzorcima izostao.

Ispitivanje uticaja ulja semena biljne vrste Caesalpina bonducella na odabrane

sojeve bakterija (L. monocytogenes i E. coli) vršeno je merenjem količine izolovanih

nukleinskih kiselina od strane Shukla et al. (2016). Ulje semena C. bonducella pokazalo

je značajan potencijal za oslobađanje 260 nm materijala (DNK i RNK) iz ćelija testiranih

bakterija kada su izložene minimalnoj inhibitornoj koncentraciji. Tokom studije nije

primećen rast koncentracije nukleinskih kiselina van ćelije tokom vremena u kontrolnim

uzorcima. Merenja su vršena na 0, 30 i 60 minuta od početka tretmana. Poređenjem našeg

eksperimenta i eksperimenta vršenog od strane Shukla et al. (2016) konstatujemo da je u

našem radu došlo do povećanja koncentracije nukleinskih kiselina van ćelije i u

tretiranim i u kontrolnim uzorcima (E. coli), dok se u radu Shukla et al. (2016) javilo

povećanje koncentracije nukleinskih kiselina van ćelije u tretiranim uzorcima, dok tog

povećanja nije bilo u kontrolnim uzorcima.

49


Zbog toga, zaključuje se da je uticaj semenog ulja C. bonducella usmeren na ćelijsku

membranu, dok etarsko ulje I. helenium verovatno nije.

Grafik 3. Prikaz spektrofotometrijskog merenja izlaska nukleinskih kiselina iz ćelija

respiratornih izolata tretiranih etarskim uljem omana(Staphylococcus aureus 1, Staphylococcus aureus 2, Staphylococcus aureus 3, Staphylococcus aureus

4, Moraxella catarrhalis i Escherichia coli)

50


Dinamika rasta ćelija respiratornih izolata tretiranih etarskim uljem omana (Grafik

4) pokazala je različite vrste inhibitorne aktivnosti ovog ulja, pri čemu je uočen

mikrobicidni efekat kod vrsta M. catarrhalis i S. aureus 2. Ovo je i bilo očekivano, s

obzirom na činjenicu da je ulje ispoljilo inhibitorni i mikrobicidni efekat pri istoj

koncentraciji u oba slučaja. Ostali izolati S. aureus pokazivali su različit intenzitet

inhibicije, koja je počinjala nakon 12 h inkubacije i dovodila do razlike od 0,27 (izolat 1),

0,16 (izolat 3) i 0,21 (izolat 4) jedinica apsorbance. U odnosu na E. coli, redukcija je bila

znatno veća pri poređenju sa kontrolnim uzorkom. Pored navedenog, za razliku od vrsta

S. aureus, ovaj efekat je bio nešto brži jer se redukcija apsorbance mogla uočiti i pre

perioda inkubacije od 12 h. Poređenjem rezultata dinamike rasta sa rezultatima dobijenim

za oštećenje (povećanu propustljivost) ćelijske membrane, uočava se uklapanje i to u

smislu da su na krivama rasta vidljive sličnosti između kontrolnih i tretiranih uzoraka u

periodu do 12 h, nakon čega dolazi do dejstva ulja u smislu manje ili veće inhibicije rasta.

Jedini izuzeci su bili izolati kod kojih su inhibitorne i baktericidne koncentracije bile iste,

a kod kojih je dejstvo bilo trenutno. Na osnovu koncentracija DNK detektovanih u

ekstracelularnom prostoru ovih izolata, ne može se zaključiti da je ovo ulje značajno

oštetilo njihovu ćelijsku membranu.

Ginoiseau et al. (2010) su ispitivali uticaj etarskih ulja biljnih vrsta Inula

graveolens i Santolina corsica na odabrani soj Gram-pozitivne bakterije S. aureus tokom

24 h. Tretirani uzorci su sadržali etarska ulja (I. graveolensis ili S. corsica) u

koncentraciji koja je odgovarala njihovoj MIK, dok kontrolni uzorci nisu imali dodato

etarsko ulje. Merenja su vršena tokom 2 h, i to na 0, 10, 30, 60, 120 min od početka

tretmana. Rezultati su pokazali da su etarska ulja I. graveolens i S. corsica pri MIK imala

baktericidni efekat nakon 2 i 4 h. Etarsko ulje I. graveolens u MIK delovalo je veoma

brzo, gde je utvrđeno da je tokom prvih 10 min, broj jedinki je pao za 1 log10, a za 1 h je

postignut prag detekcije. Poređenjem našeg rada i istraživanja sprovedenog od strane

Ginoiseau et al. (2010), možemo zaključiti da se rezultati eksperimenata delimično slični,

ali samo u odnosu na određene sojeve iz ispitivanog spektra izolata. U našem radu,

etarsko ulje I. helenium je na soj S. aureus 2 delovalo skoro trenutno, pa su ovi rezultati

slični sa onim koji su dobijeni u radu Ginoiseau et al. (2010), gde se već prva inhibicija

51


javila za 10 min. Interesantno je da ovo ne važi za ostale sojeve S. aureus 1, 3, 4, gde se

inhibicija javila mnogo kasnije (nešto malo pre 12 h od početka tretmana), što je

verovatno povezano sa većim stepenom rezistencije na antimikrobne agense koje su

pomenuti sojevi eksprimirali.

Ispitivanje uticaja ulja biljne vrste Salvia sclarea, prebrojavanjem broja kolonija

tokom vremena (0, 0,5, 1, 2, 4 i 8 h nakon početka tretmana), koje su sproveli Cui et al.

(2015) na odabrane sojeve bakterija (E. coli i S. aureus) pokazalo je visok efekat ovog

ulja. Posle 2 h tretmana, postignuta je redukcija broja jedinki E. coli i S. aureus od

99,99% ukupnog broja tretiranih ćelija. Zbog ovih rezultata, može se reći da ulje S.

sclarea može delovati kao dobar antimikrobni proizvod zbog svog kratkog

antimikrobnog vremena. U poređenju sa našim radom, ulje S. sclarea ima brži inhibitorni

efekat na soj E. coli (nakon 1 h je primećena inhibicija), dok je ulju I. helenium trebalo

više vremena za inhibiciju (nešto malo pre 12 h od početka tretmana). Deo eksperimenta

koji se odnosi na uticaj ulja S. sclarea na soj S. aureus se delimično potvrđuje sa našim

rezultatima (soj S. aureus 2), gde je uticaj oba ulja na bakteriju bio jako brz. Jedino sojevi

1, 3 i 4 u našem radu se ne uklapaju sa ovim rezultatima, jer je za prve efekte bilo

potrebno 12 h od početka tretmana.

52


Grafik 4. Prikaz dinamike rasta ćelija respiratornih izolata tretiranih etarskim uljem omana

(Staphylococcus aureus 1, Staphylococcus aureus 2, Staphylococcus aureus 3, Staphylococcus aureus 4, Moraxella catarrhalis i Escherichia coli)

53


5. Zaključak

1. Etarsko ulje dobijeno destilacijom biljnog materijala omana imalo je kao glavne

komponente alantolakton (65,75%) i izoalantolakton (25,53), koje su sačinjavale

91,4% ukupnog sastava ispitivanog etarskog ulja.

2. Ispitivano etarsko ulje omana imalo je aktivnost u opsegu koncentracija 0,07-10,0

mg/ml, pri čemu je efikasnost ispoljena u odnosu na sve testirane izolate.

Minimalne inhibitorne koncentracije su bile u opsegu koncentracija 0,07-2,50

mg/ml, dok je baktericidni efekat ispoljen pri koncentracijama od 0,31-10 mg/ml.

3. Metodom merenja izlaska nukleinskih kiselina iz ćelija, ni kod jednog soja nije

detektovano masivno oštećenje membrane koje bi izazvalo smrt ćelije u periodu

do 4 h nakon aplikacije ulja.

4. Praćenjem dinamike rasta ćelija respiratornih izolata tretiranih etarskim uljem

omana uočene su različite aktivnosti ovog ulja, od inhibicije koja je počinjala tek

nakon 12 h inkubacije do mikrobicidnog efekta (M. catarrhalis i S. aureus 2).

Različiti efekti ulja na sojeve iste vrste (S. aureus) mogu se povezati sa većim

stepenom rezistencije na antimikrobne agense koje su ovi sojevi eksprimirali.

5. U poređenju sa prethodnim istraživanjem etarskog ulja omana sakupljanog u

Srbiji, manja antimikrobna efikasnost uočena kod ovde ispitivanog ulja može se

povezati sa nedostatkom diplofilina u njegovom sastavu, koji je ranije

identifikovan kao glavni nosilac njegove antibakterijske aktivnosti.

54


6. Literatura

Adams, R. P., 2007. Identification of essential oil components by gas

chromatography/mass spectrometry. Allured Publishing Corporation, Carol

Stream.

Albayrak S., Korkmaz Cinar A. E., Paksoy M. Y., Aksoy A., 2015. An investigation

on antioxidant and antimicrobial activities of four Inula helenium L. taxa. Iranian

Journal of Science & Technology, 39A4: 473-483, Turkey.

Barrero A. F., Oltra J. E., Alvarez M., Raslan D. S., Saude D. A., Akssira M., 2000.

New sources and antifungal activity of sesquiterpene lactones; Fitoterapia, 71:60-

64, Spain.

Basile A., Sorbo S., Giordano S., Ricciardi L., Ferrara S., Montesano D., Castaldo

Cobianci R., Vuotto M. L., Ferrara L., 2000. Antibacterial and allelopathic

activity of extract from Castanea sativa leaves, Fitoterapia 71, Suppl. 1:110-116.

Blečić V., 1970. Sistematika viših biljaka. Zavod za izdavanje udžbenika

socijalističke Republike Srbije, Beograd.

Bohlmann F., Mahanta P. K., Jakupovic J., Rastogi R. C., Natu A. A., 1978. New

sesquiterpene lactones from Inula species. Phytochemistry, Volume 17, Issue 7,

Pages 1165-1172.

Bourrel C., Vilarem G., Perineau F., 1993. Chemical analysis, bacteriostatic and

fungistatic properties of the essential oil of Elecampane (Inula helenium L.).

Journal of Essential Oil Research 5, 411‒417.

Cantrell C. L., Abate L, Fronczek F. R., Franzblau S. G., Quijano L, Fischer N. H.,

1999. Antimycobacterial eudesmanolides from Inula helenium and Rudbeckia

subtomentosa. Planta Medica 65:351–5.

Carson C. F., Mee B. J., Riley T. V., 2002. Mechanism of action of Melaleuca

alternifolia (tea tree) oil on Staphylococcus aureus determined by timen-kill,

lysis, leakage, and salt tolerance assays and electron microscopy. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy, Vol. 46, 6:1914-1920.

55


Chen C. N., Huang H. H., Wu C. L., Lin C. P. C., Hsu John T.A., Hsieh H. P.,

Chuang S. E., Lai G. M., 2007. Isocostunolide, a sesquiterpene lactone, induces

mitochondrial membrane depolarization and caspase-dependent apoptosis in

human melanoma cells. Cancer Letters 246: 237–252.

Chen D., McMichael J. C., Vandermeid K. R., Hahn D., Mininni T., Cowell J.,

Eldridge J., 1996. Evaluation of purified UspA from Moraxella catarrhalis as a

vaccine in a murine model after active immunization. Infection and Immunity,

Vol. 64, No. 6, p. 1900–1905.

Chun J., 2015. Alantolactone selectively suppresses STAT3 activaction and exhibits

potent anticancer activity in MDA-MB-231 cells.; Cancer Letters. 357: 393-403.

Croft K. D., 1999. Antioxidant effects of plant phenolic compounds. Department of

Medicine, University of Western Australia, Perth, Australia, 109-123.

Cui H., Zhang X., Zhou H., Zhao C., Lin L., 2015. Antimicrobial activity and

mechanisms of Salvia sclarea essential oil; Botanical Studies An International

Journal, 56:16.

Deriu, A., Zanetti, S., Sechi, L.A., Marongiu, B., Piras, A., Porcedda, S., Tuveri, E.,

2008. Antimicrobial activity of Inula helenium L. essential oil against Gram-

positive and Gram-negative bacteria and Candida spp. International Journal of

Antimicrobial Agents 31, 588‒590.

Diguță C., Cornea C. P., Ioniță L., Brînduşe, E., Farcaş, N., Bobit D., Matei F., 2014.

Studies on antimicrobial activity of Inula helenium L Romanian cultivar.

Romanian Biotechnological Letters. Vol. 19, No. 5

Ding Y., Wang H., Niu J., Luo M., Gou Y., Miao L., Zou Z., Cheng Y., 2016.

Induction of ROS overload by Alantolactone prompts oxidative DNA damage and

apoptosis in colorectal cancer cells. International Journal of Molecular Sciences,

17:558.

Van Den Dool H., Kratz P.D., 1963. A generalization of the retention index system

including linear temperature programmed gas–liquid partition chromatography.

Journal of Chromatography A, 11, 463–471.

56


Dorn D. C., Alexenizer M., Hengstler J. G., Dorn A., 2006. Tumor Cell Specific

Toxicity of Inula helenium Extracts. Phytotherapy Research, 20, 970–980.

Ghedira K., Goetz P., Jeune R., 2011. Inula helenium L. (Asteraceae): aunée.

Phytothérapie. 9: 176-179.

Ginovyan M., Petrosyan M., Trchounian A., 2017. Antimicrobial activity of some

plant materials used in Armenian traditional medicine. BMC Complementary and

Alternative Medicine, 17:50.

Gökbulut A., Günal S., Arer E., 2013. Antioxidant and antimicrobial activities, and

phenolic compounds of Inula thapsoides ssp. thapsoides. Planta Medica 79: PJ19.

Grigore A., Neagu G., Dobre N., Ionita C., Ionita L., Bobit D., 2016.

Immunomodulatory potential of Inula helenium L. Analele Ştiinţifice ale

Universităţii „Al. I. Cuza” Iaşi s. II a. Biologie vegetală 62, 2: 29-33.

Guinoiseau E., Luciani A., Rossi P. G., Quilichini Y., Ternengo S., Bradesi P., Berti

L., 2010. Cellular effects induced by Inula graveolens and Santolina corsica

essential oils on Staphylococcus aureus; European Journal of Clinical

Microbiology & Infectious Diseases, 29:873–879.

Hoffmann D., 2003. Medical Herbalism: The Science and Practice of Herbal

Medicine. Healing Arts Press. Rochester, Vermont, 69-70.

Huo Y., Shi H. M., Wang M. Y., Li X. B., 2008. Chemical constituents and

pharmacological properties of Radix Inulae. Pharmazie 63: 699–703.

Jiang H. L., Chen J., Jin X. J., Yang J. L., Li Y., Yao X. J., Wu Q. X., 2011.

Sesquiterpenoids, alantolactone analogues, and seco-guaiene from the roots of

Inula helenium. Tetrahedron 67(47): 9193–8.

Josifović M., 1975. Flora SR Srbije, VII tom, Beograd.

Jovanović T., 2000. Praktikum iz mikrobiologije i imunologije. Savremena

administracija, Beograd.

Kähkönen M. P., Hopia A. I., Vuorela H. J., Rauha J. P., Pihlaja K., Kujala T. S.,

Heinonen M., 1999. Antioxidant activity of plant extract containing phenolic

compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47: 3954-3962.

57


Karakašević B., 1967. Priručnik standardnih metoda za mikrobiološki rutinski rad (lll

prerađeno izdanje). Savezni zavod za zdravstvenu zaštitu, Beograd-Zagreb.

Karakašević B. 1987. Mikrobiologija i parazitologija - Medicinska knjiga, 677-683,

Beograd - Zagreb.

Keli S. O., Hertog M. G., Feskens E. J., Kromhout D., 1996. Dietary flavonoids,

antioxidant vitamins, and incidence of stroke: the Zutphen study. Archives of

Internal Medicine, 156:637-642.

Konishi T., Shimada Y., Nagao T., Okabe H., Konoshima T., 2002. Antiproliferative

sesquiterpene lactones from the roots of Inula helenium. Biological and

Pharmaceutical Bulletin 25(10): 1370–1372.

Kowalewski Z., Kedzia W., Koniar H., 1976. Action of helenin on microorganisms.

Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 24(1):121-5.

Kwon C. S., Kim J. H., Son K. H., Kim Y. K., Lee J. S., Lim J. K., Kim J. S., 2002.

Induction of quinone reductase, an anticarcinogenic marker enzyme, by medicinal

herb extracts. Nutraceuticals and Food 74: 358-366.

Lawrence N. J., McGown A. T., Nduka J., Hadfield J. A., Pritchard R. G., 2001.

Cytotoxic Michael – type amine adducts of α – methylene lactones alantolactones

and isoalantolactone. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 11: 429 – 431.

Lea P. J., Leegood R. C., 1999. Plant Biochemistry and Molecular Biology, 2end ed.,

John Wiley & Sons, Chichester.

Lei J. C., Yu J. Q., Yin Y., Liu Y. W., Zou G.L,. 2012. Alantolactone induces

activation of apoptosis in human hepatoma cells. Food and Chemical Toxicology,

50:3313–9.

Lim S. S., Kim J. R., Lim H. A., Jang C. H., Kim Y. K., Konishi T., Kim E. J., Park J.

H. Y., Kim j. S., 2007. Induction of Detoxifying Enzyme by Sesquiterpenes

Present in Inula helenium. Journal of medicinal food 10 (3): 503–510, Republic of

Korea.

Lim H. S., Jin S. E., Kim O. S., Shin H. K., Jeong S. J., 2015. Alantolactones from

Saussurea lappa exerts antiinflammatory effects by inhibitinh chemokine

58


production and STAT1 phosphorylation in TNF-α and IFN-γ-innduced in HaCat

cells. Phytotherapy Research. 29 (7): 1088-1096.

Liu C., Mishra A. K., He B., Tan R., 2001. Antimicrobial activities of

isoalantolactone, a major sesquiterpene lactone of Inula racemosa; Chinese

Science Bulletin, Vol. 46 No. 6.

Miksusanti, Jenie B. S. L., Priosoeryanto B. P., Syarief R., Rekso G. T., 2008. Mode

of action Temu kunci (Kaempferia pandurata) essential oil on E. coli K1.1 cell

determined by leakage of material cell and salt tolerance assays; Hayati Journal of

Biosciences, p 56-60; Vol. 15, No. 2

Murray P. R., 1994. Medical Microbiology (second edition). United States of

America.

Nan M., Pintea A., Bunea A., Eşianu S., Tămaş M., 2012. HPLC Analysis od

carotenoids from Inula helenium L. flowers and leaves. Farmacia, Vol. 60, 4.

Romania.

O'Shea, S., 2009. In vitro activity of Inula helenium against clinical Staphylococcus

aureus strains including MRSA. British Journal od Medical Science. 66 (4): 186-

9.

Pal H. C., Sehar I., Bhushan S., Gupta B. D., Saxena A. K., 2010. Activation of

caspases and poly (ADP-ribose) polymerase cleavage to induce apoptosis in

leukemia HL-60 cells by Inula Racemosa. Toxicology in Vitro. 24:1599–609.

Petkova N., Vrancheva R., Mihaylova D., Ivanov I., Pavlov A., Denev P., 2015.

Antioxidant activity and fructan content in root extracts from elecampane (Inula

helenium L.). Journal of BioScience and Biotechnology 4(1): 101-107.

Rao K. S., Mishra S. H., 1997. Screening of anti – inflammatory and hepatoprotective

activities of alantolactone, istolated from the roots of Inula racemosa. Indian

Drugs 34(10):571-575.

Sabljak A., 2015. Najznačajnije biljke za proizvodnju eteričnih ulja u Republici

Hrvatskoj (Završni rad). Osijek.

59


Seca, A., Grigore, A., Pinto, D., Silva, A. 2014. The genus Inula and their

metabolites: From ethnopharmacological to medicinal uses. Journal of

Ethnopharmacology 154: 286-310.

Shen T., Yang W. S., Yi Y. S., Sung G. H., Rhee M. H , Poo H., Kim M. Y., Kim K.

W., Kim J. H., Cho J.Y., 2013. AP-1/IRF-3 targeted anti-inflammatory activity of

Andrographolide isolated from Andrographis paniculata. Evidence-Based

Complementary and Alternative Medicine 2013:210736.

Shukla S., Majumder R., Ahirwal L., Mehta A., 2016. Proposed mechanism of

antibacterial mode of action of Caesalpinia bonducella seed oil against food-

borne pathogens; Bangladesh Journal of Pharmacology, 11: 257-263.

Simin N. 2014: Doktorska disertacija - Sekundarni biomolekuli u vrstama Allium

sect. codonoprasium rchb. – biološke aktivnosti, fitohemijski i hemotaksonomski

aspekti.

Sowndhararajan K., Cho H., Yu B., Song J., Kim S., 2016. Effect of inhalation of

essential oil from Inula helenium L. root on electroencephalographic (EEG)

activity of human. European Journal of Integrative Medicine, Volume 8, Issue 4,

Pages 453-457.

Spiridonov N. A., Konovalov D. A., Arkhipov V. V., 2005. Cytotoxicity of some

Russian ethnomedicinal plants and plant compounds; Phytotherapy Research 19,

428–432.

Stanković, M., Stanojević, Lj., 2014. Tehnologija lekovitog začinskog i aromatičnog

bilja. Tehnološki fakultet, Leskovac.

Stojakowska A., Kędzia B., Kisiel W., 2005. Antimicrobial activity of 10-

Isobutyryloxy-8,9-epoxythymol isobutyrate; Fitoterapia 76: 687–690, Poland.

Stojanović-Radić, Z., Čomić, Lj., Radulović, N., Blagojević, P., Denić, M.,

Miltojević, A., Rajković, J., Mihajilov-Krstev, T., 2012. Antistaphylococcal

activity of Inula helenium L. root essential oil: eudesmane sesquiterpene lactones

induce cell membrane damage. European Journal of Clinical Microbiology 31:

1015‒1025.

60


Sutherland C. A. , Verastegui J. E., Nicolau D. P., 2016. In vitro potency of

amikacin and comparators against E. coli, K. pneumoniae and P. aeruginosa

respiratory and blood isolates. Annals of Clinical Microbiology and

Antimicrobials 15:39.

Tan R. X., Tang H. Q., Hut J., Shuai B., 1998. Lignans and sesquiterpene lactones

from Artemisia sieversiana and Inula racemosa. Phytochemistry Vol. 49, No. 1,

pp. 157-161, China.

Tosun F., Kizilay C. A., Sener B., Vural M., 2005. The Evaluation of plants from

Turkey for in vitro antimycobacterial activity. Pharmaceutical Biology Vol. 43,

No. 1, pp. 58–63, Turkey.

Vajs V., Jeremic D., Milosavljevic S., 1989. Sesquiterpene lactones from Inula

helenium. Phytochemistry 28: 1763–1764.

Videk V., 1960. Ljekovito bilje Jugoslavije. Poljoprivredni nakladni zavod, Zagreb.

Wahab S., Lal B., Jacob Z., Pandey V. C., Srivastava O. P., 1979. Studies on a strain

of Fusarium solani (Mart.) sacc. isolated from a case of mycotic keratitis.

Mycopathologia, Volume 68, Issue 1, Pages 31-38, India.

Wang X., Yu Z., Wang C., Cheng W., Tian X., Huo X., Wang Y., Sun C., Feng L.,

Xing J., Lan Y., Sun D., Hou Q., Zhang B., Ma X., Zhang B., 2017.

Alantolactone, a natural sesquiterpene lactone, has potent antitumor activity

against glioblastoma by targeting IKKβ kinase activity and interrupting NF–

kB/COX-2-mediated signaling cascades. Journal of Experimental & Clinical

Cancer Research 36:93.

Wichtl M., 2004. Herbal drugs and phytopharmaceuticals: a handbook for practice on

a scientific basis. Medpharm GmbH Scientific Publishers, Stuttgart.

Xu R., 2014. Pharmacokinetic comparison of isoalantolactone and alantolactone in

rars after administration separately by optimization of an UPLC-MS2 method.;

Journal of Chemistry. 2014: 8.

Yang C., Yang J., Sun M., Yan J., Meng X., Ma T., 2013. Alantolactone inhibits

growth of K562/adriamycin cells by downregulating Bcr/Abl and P-glycoprotein

61


expression. International Union of Biochemistry and Molecular Biology Journals,

65:435–44.

Yang Y., Tian S., Wang F., Li Z., Liu L., Yang X., Bao Y., Wu Y., Huang Y., Sun L.,

Yu C., Li Y., 2018. Chemical composition and antibacterial activity of

Kaempferia galanga essential oil; International Journal of Agriculture & Biology,

Vol. 20, No. 2.

Zhao P., 2015. Alantolactone induces apoptosis and cell cycle arrest on lung

squamous cancer SK-MES-1 cells. Journal of Biochemical and Molecular

Toxicology. 29: 199-226.

Žugić A. R., Đorđević S. M., Tadić V. M., Arsić I. A., Mišić D. R., 2013

Antimikrobna aktivnost izolata korena omana, 54-58. Srbija.

62

Kristina Lj. Stanković Master radПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска документација

Тип записа, ТЗ: Текстуални / графички штампани материјал

Врста рада, ВР: Мастер рад Аутор, АУ: Кристина Љ. Станковић

Ментор, МН: Зорица Стојановић-Радић

Наслов рада, НР: Утицај етарског уља Inula helenium L. на раст одабраних сојева респираторних изолата

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2018.Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: поглавља (6), страна (63), слика (6), табела (5), графика (4), литературних навода (72)

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Микробилологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Антимикробна активност, етарско уље, Inula helenium L., респираторни изолати

УДК 547.913:982.998.12Чува се, ЧУ: Библиотека ПМФ-a, НишВажна напомена, ВН: HемаИзвод, ИЗ: Циљеви овог мастер рада су били испитивање хемијског састава етарског уља корена Inula helenium

L., као и одређивање антимикробне активности овог етарског уља у односу на одабране сојеве респираторних изолата хуманог порекла. Уједно је извршено и испитивање механизма дејства етарског уља омана методом детекције оштећења мембране и праћења динамике раста ћелијских култура третираних уљем. Дестилацијом биљног материјала омана, добијено је етарско уље чије су главне компоненте биле алантолактон (65,75%) и изоалантолактон (25,53%), а ове две компоненте су сачињавале 91,4% укупног састава испитаног етарског уља. Активност етарског уља омана се кретала у опсегу концентрација 0,07-10,0 mg/ml. Уље је било ефикасно на све тестиране изолате при чему су МИК варирале од 0,07-2,50 mg/ml, док се МБК кретале 0,15-10 mg/ml. Највећу осетљивост на уље је показао изолат S. aureus 3, док су највећу резистенцију показали два соја, и то S. aureus 1 и E. coli. На основу добијених резултата, спектрофотометријским мерењем изласка нуклеинских киселина из ћелија респираторних изолата третираних етарским уљем омана, може се закључити да ни код једног соја није детектовано масивно оштећење мембране које би изазвало смрт ћелије у периоду од 4 сата након апликације уља. Динамика раста ћелија респираторних изолата третираних етарским уљем омана је показала различите активности овог уља, при чему је код врста M. catarrhalis и S. aureus 2 уочен микробицидни ефекат, с обзиром да је уље испољило инхибиторну и микробицидну активност при истој концентрацији у оба случаја. Код осталих изолата S. aureus су се испољили различити интензитети инхибиције, која је почињала након 12 сати инкубације и довела је до разлике од 0,27 (изолат 1), 0,16 (изолат 3), 0,21 (изолат 4) јединица апсорбанце. E. coli је имала мању редукцију у односу на S. aureus, али је зато ефекат био нешто бржи, јер се редукција апсорбанце уочила пре периода инкубације од 12 сати.

Датум прихватања теме, ДП:Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник:

Члан:

Члан, ментор:

63

Kristina Lj. Stanković Master radUNIVERSITY OF NIŠ - FACULTY OF SCIENCE

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: Monograph

Type of record, TR: Textual / graphic printed material

Contents code, CC: University degree thesis

Author, AU: Kristina Lj. Stanković

Mentor, MN: Zorica Stojanović-Radić

Title, TI: The influence of Inula helenium L. essential oil on the growth of selected strains of respiratory isolates

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2018.

Publisher, PB: Author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: chapters (6), pages (63), puctures (6), tables (5), graphics (4), references (72)

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: Microbiology

Subject/Key words, S/KW: Antimicrobial activity, essential oil, Inula helenium L., respiratory isolates

UC 547.913:982.998.12

Holding data, HD: The Library of Faculty of Sciences, University of Niš

Note, N: NoAbstract, AB:

The objectives of this master study were to examine the chemical composition of the etheric oil of the root of Inula helenium L., and to determine the antimicrobial activity of this etheric oil in relation to selected strains of respiratory isolates of human origin. At the same time, the mechanism of the effect of etheric oil of the canopies was investigated by the method of detecting the damage of the membrane and monitoring the growth dynamics of oil-cell cultures. By distillation of the plant material of oman, etheric oil was obtained, the main components of which were alantolactone (65,75%) and isoalantolactone (25,53), and these two components comprised 91,4% of the total composition of the test etheric oil. The activity of the etheric oman oil was within the concentration range of 0,07-10,0 mg / ml. The oil was effective on all tested isolates, with MIC varied from 0,07 to 2,50 mg / ml, while MBC ranged 0,15-10 mg / ml. The highest sensitivity to oil was demonstrated by S. aureus 3 isolates, while the highest resistance was shown by two strains, S. aureus 1 and E. coli. Based on the obtained results, the spectrophotometric measurement of the release of nucleic acids from the cells of the respiratory isolates treated with etheric oman oil, it can be concluded that no massive damage to the membrane was detected in a single strain that would cause cell death in the 4 hours after application of the oil. The growth dynamics of the cells of respiratory isolates treated with ethane oman oil revealed various activities of this oil, with the microbicidal effect observed in the species M. catarrhalis and S. aureus 2, as the oil exhibited inhibitory and microbicidal activity at the same concentration in both cases. In the other S. aureus isolates, different intensities of inhibition began, which began after 12 hours of incubation and resulted in a difference of 0,27 (isolate 1), 0,16 (isolate 3) and 0,21 (isolate 4) units apsorbance. Escherichia coli had a lower reduction compared to S. aureus, but the effect was therefore somewhat faster, since the reduction in absorbance was observed before the incubation period of 12 h.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor:

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU PRIRODNO – … · Dinamika rasta ćelija respiratornih izolata...

Documents

Transcript of DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU PRIRODNO – … · Dinamika rasta ćelija respiratornih izolata...