DARJAN ANDREJC - ffa.uni-lj.si · pharmacological effects on proliferation in human B cell lymphoma...

Univerza v Ljubljani Fakulteta za farmacijo

DARJAN ANDREJC

INDUKCIJA APOPTOZE V HUMANIH CELIČNIH LINIJAH LIMFOCITOV B S STIMULACIJO RECEPTORJA EP4

EP4 RECEPTOR STIMULATION INDUCES APOPTOSIS IN

HUMAN B CELL LINES

DIPLOMSKA NALOGA

Ljubljana, 2010

Diplomsko delo sem opravljal na Fakulteti za farmacijo, na Katedri za klinično

biokemijo, pod mentorstvom izr. prof. dr. Irene Mlinarič-Raščan, mag. farm.

ZAHVALA

Za strokovno pomoč pri izdelavi diplomske naloge se iskreno zahvaljujem mentorici izr.

prof. dr. Ireni Mlinarič-Raščan, mag. farm.

Zahvaljujem se tudi mlademu raziskovalcu asist. Matevžu Prijatelju, mag. farm., ki me je

usmerjal in mi pomagal pri izvajanju laboratorijskega dela diplomske naloge.

Za vso prijaznost sem prav tako hvaležen vsem ostalim zaposlenim na Katedri za klinično

biokemijo.

Nenazadnje hvala tudi staršem, ki so mi omogočili študij, Katji, sestri ter vsem prijateljem,

ki so mi tekom študija stali ob strani.

IZJAVA

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal samostojno pod mentorstvom izr. prof. dr. Irene

Mlinarič-Raščan, mag. farm.

Darjan Andrejc Ljubljana, september 2010

Predsednik diplomske komisije: prof. dr. Slavko Pečar, mag. farm.

Član diplomske komisije: izr. prof. dr. Odon Planinšek, mag. farm.

KAZALO VSEBINE

KAZALO VSEBINE ............................................................................................................I

KAZALO SLIK .................................................................................................................IV

KAZALO PREGLEDNIC ................................................................................................VI

KAZALO ENAČB.............................................................................................................VI

POVZETEK..................................................................................................................... VII

SEZNAM OKRAJŠAV ...................................................................................................... X

1 UVOD ................................................................................................................................ 1

1.1 APOPTOZA ................................................................................................................ 1

1.1.1 Razvoj limfocitov B............................................................................................... 2

1.1.2 Negativna selekcija limfocitov B .......................................................................... 3

1.2 MALIGNE BOLEZNI LIMFOCITOV B .................................................................... 3

1.2.1 Levkemije .............................................................................................................. 4

1.2.2 Limfomi................................................................................................................. 5

1.2.3 Terapija B-limfocitnih malignih obolenj .............................................................. 6

1.2.4 Modulacija apoptoze kot terapevtski pristop........................................................ 7

1.3 EP4 RECEPTOR (PROSTAGLANDINSKI RECEPTOR TIPA E4).......................... 8

1.3.1 Vloga receptorja EP4 pri uravnavanju fizioloških in patofizioloških procesov ... 9

1.3.2 Vpliv EP4 stimulacije na apoptozo..................................................................... 10

1.3.3 Učinki agonistov in antagonistov receptorja EP4.............................................. 11

2 NAMEN DELA............................................................................................................... 13

3 MATERIALI IN METODE .......................................................................................... 14

3.1 MATERIALI ............................................................................................................. 14

3.1.1 Kemikalije........................................................................................................... 14

3.1.2 Kompleti za analize ............................................................................................ 14

3.1.3 Pufri in raztopine................................................................................................ 15

3.1.4 Protitelesa in fluorescenčna barvila .................................................................. 15

3.1.5 Gojišča................................................................................................................ 16

3.1.6 Laboratorijska oprema....................................................................................... 16

I

3.1.7 Humane celične linije ......................................................................................... 18

3.2 METODE DELA S CELICAMI ................................................................................ 20

3.2.1 Gojenje celic ....................................................................................................... 20

3.2.2 Subkultiviranje celičnih linij............................................................................... 20

3.2.3 Odmrzovanje celic .............................................................................................. 20

3.2.4 Štetje celic.......................................................................................................... 21

3.2.5 Priprava celičnih kultur za mikroskopiranje in pretočni citometer ................... 21

3.3 TEST ZA DOLOČANJE CELIČNE METABOLNE AKTIVNOSTI Z

REAGENTOM MTS ....................................................................................................... 23

3.4 FLUORESCENČNA MIKROSKOPIJA ................................................................... 23

3.4.1 Fluorescenca ...................................................................................................... 23

3.4.2 Epifluorescenčna mikroskopija .......................................................................... 25

3.5 PRETOČNA CITOMETRIJA ................................................................................... 28

3.5.1 Sipanje svetlobe .................................................................................................. 28

3.5.2 Imunofluorescenca ............................................................................................. 29

3.5.3 Metode za pripravo celic za pretočno citometrijo.............................................. 30

4 REZULTATI IN RAZPRAVA...................................................................................... 35

4.1 IZRAŽANJE RECEPTORJA EP4 V HUMANIH MALIGNIH LIMFOCITIH B..... 35

4.1.1 Določanje ekspresije EP4 receptorja na malignih limfocitih B s pretočno

citometrijo.................................................................................................................... 36

4.1.2 Določanje ekspresije EP4 receptorja na malignih limfocitih B s fluorescenčno

mikroskopijo ................................................................................................................ 38

4.1.3 Določanje ekspresije EP4 receptorja na nemalignih PBMC s pretočno

citometrijo.................................................................................................................... 40

4.2 PGE1-OH ZMANJŠA METABOLNO AKTIVNOST MALIGNIH

LIMFOCITOV B ............................................................................................................. 45

4.2.1 Ugotavljanje vpliva stimulacije receptorja EP4 na metabolno aktivnost celic z

MTS testom .................................................................................................................. 45

4.3 PGE1-OH INDUCIRA APOPTOZO V MALIGNIH LIMFOCITIH B..................... 48

4.3.1 Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V............................................................... 48

4.4 PGE1-OH INHIBIRA PROLIFERACIJO V MALIGNIH LIMFOCITIH B............. 53

II

4.4.1 Ugotavljanje vpliva stimulacije receptorja EP4 na celični cikel malignih

imfocitov B................................................................................................................... 53

4.4.2 Vrednotenje celične proliferacije malignih lifocitov B s postopkom CFSE

CellTrace™ ................................................................................................................. 58

5. SKLEP ............................................................................................................................ 62

6. LITERATURA .............................................................................................................. 63

7 PRILOGE........................................................................................................................ 68

III

KAZALO SLIK

Slika 1: Zaporedje stadijev pri zorenju celic B..................................................................... 3

Slika 2: Neselektivni agonist receptorja EP4 PGE2, selektivni agonist PGE1-OH. .......... 12

Slika 3: Jablonski-jev diagram............................................................................................ 24

Slika 4: Stokes-ov premik................................................................................................... 25

Slika 5: Shema epifluorescenčnega mikroskopa................................................................. 26

Slika 6: Shema pretočnega citometra.................................................................................. 28

Slika 7: Sipanje svetlobe v pretočni citometriji .................................................................. 29

Slika 8: Primer histograma iz analize s pretočnim citometrom. ......................................... 36

Slika 9: Ekspresija receptorja EP4 na celicah NALM-6..................................................... 37

Slika 10: Posnetki malignih limfocitov B pod fluorescenčnim mikroskopom. .................. 39

Slika 11: Ekspresija receptorja EP4 na zrelih limfocitih B iz periferne krvi zdravega

krvodajalca (CD19+). .......................................................................................................... 42

Slika 12: Primerjava relativne povprečne fluorescence označenega EP4 receptorja med

fiksiranimi in permeabiliziranimi preiskovanimi celicami in nemalignimi CD19+ celicami

iz periferne krvi zdravega krvodajalca (Ab Imgenex)......................................................... 43

Slika 13: Primerjava relativne povprečne fluorescence med fiksiranimi in

permeabiliziranimi preiskovanimi celicami RAMOS in NALM-6 ter nemalignimi CD19+

celicami iz periferne krvi zdravega krvodajalca (Ab Cayman)........................................... 44

Slika 14: Metabolna aktivnost celic RAMOS in MHH PREB stimuliranih s PGE1-OH... 46

Slika 15: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS, stimuliranih z 100

μM PGE1-OH (12h) ............................................................................................................ 49

Slika 16: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS na nestimulranih

celicah (12h) ........................................................................................................................ 50

Slika 17: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS. ............................. 51

Slika 18: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB........................ 52

Slika 19: Vpliv stimulacije receptorja EP4 na potek celične delitve celic RAMOS in

MHH-PREB ........................................................................................................................ 55

Slika 20: Vpliv stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic RAMOS........................ 56

Slika 21: Vpliv stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic MHH-PREB ................. 57

Slika 22: Vpliv stimulacije receptorja EP4 na vsebnost barvila cfse v celicah RAMOS. .. 58

Slika 23: Vsebnost barvila CFSE v nestimuliranih celicah RAMOS................................. 59

IV

Slika 24: Vpliv stimulacije receptorja EP4 na vsebnost barvila CFSE v celicah MHH-

PREB ................................................................................................................................... 59

Slika 25: Primerjava povprečne fluorescence CFSE med nestimuliranimi in stimuliranimi

celicami RAMOS in MHH-PREB....................................................................................... 60

Slika 26: Ekspresija receptorja EP4 na celicah RAMOS.................................................... 68

Slika 27: Ekspresija receptorja EP4 na celicah SU-DHL, KOPN-8 in MHH-PREB

(primarno protitelo Ab Imgenex). ....................................................................................... 69


(primarno protitelo Ab Cayman). ........................................................................................ 70


(primarno protitelo Ab Santa Cruz)..................................................................................... 71

Slika 30: Metabolna aktivnost celic NALM-6, KOPN-8 in SU-DHL stimuliranih s PGE1-

OH. ...................................................................................................................................... 72

Slika 31: Ekspresija receptorja EP4 na zrelih limfocitih B iz periferne krvi zdravega

krvodajalca (CD19+). .......................................................................................................... 73

Slika 32: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS (24h). ................... 74

Slika 33: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB (12h). ............. 75

Slika 34: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB (24h). ............. 76

V

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS..................... 51

Preglednica 2: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB. ............. 52

Preglednica 3: Numerični prikaz vpliva stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic

RAMOS............................................................................................................................... 56

Preglednica 4: Numerični prikaz vpliva stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic

MHH-PREB ........................................................................................................................ 57

Preglednica 5: Primerjava povprečne fluorescence CFSE med nestimuliranimi in

stimuliranimi celicami RAMOS in MHH-PREB ................................................................ 60

KAZALO ENAČB

Enačba 1: Računanje koncentracije celic s hemocitometrom ............................................ 21

VI

POVZETEK

Limfociti B so nosilci specifičnega imunskega odziva, za katerega je značilna imunska

toleranca, ki pomeni sposobnost razločevanja med tujimi in lastnimi antigeni.

Najpomembnejši mehanizem, ki omogoča zgodnjo odstranitev nezrelih celic B, ki izražajo

avtoreaktivni B-celični receptor (BCR), je negativna selekcija z apoptozo. Apoptoza je

normalen fiziološki proces, ki omogoča vzdrževanje homeostaze tkiv. Napake v

mehanizmih, ki zavirajo programirano celično smrt, doprinesejo k nenadzorovani razrasti

celic, česar posledica so lahko maligna obolenja ter avtoimunske bolezni. Indukcija

apoptoze po stimulaciji BCR nezrelih limfocitov B predstavlja eno izmed glavnih

funkcijskih razlik z zrelimi limfociti B, ki se po stimulaciji BCR aktivirajo in proliferirajo.

Raziskave diferencialne genske ekspresije so pokazale, da je na nivoju transkriptoma

statistično najbolj značilna razlika med zrelimi in nezrelimi celicami B po aktivaciji BCR v

ekspresiji gena Ptger4. Ptger4 je gen, ki kodira prostaglandiski receptor EP4, ki je povezan

z vrsto različnih patogenih in fizioloških učinkov odvisnih od tkiva, v katerem se nahaja. V

limfocitih B ima receptor EP4 proapoptotično/tumorsupresorsko funkcijo, saj njegova

stimulacija posreduje inhibitorne učinke na zdravih zrelih limfocitih B. Namen

diplomskega dela je bilo ugotoviti, kje in v kakšni meri humani maligni limfociti B

izražajo receptor EP4 in kakšne učinke posreduje stimulacija receptorja EP4 na

proliferacijo maligno spremenjenih modelnih linij B limfomov in levkemij.

V diplomskem delu smo najprej z imunofenotipizacijo in analizo na pretočnem citometru

ter fluorescenčnem mikroskopu dokazali, da humani maligni limfociti B izražajo receptor

EP4. Ekspresijo smo kvantitativno primerjali z zdravimi humanimi limfociti in ugotovili,

da celični liniji RAMOS in NALM-6 izražata znatno več receptorja kot primarni zreli

CD19+ B limfociti. Pri eksperimentalnem delu smo se poslužili farmakološkega pristopa,

saj smo izbrane celične linije stimulirali s specifičnim agonistom receptorja EP4, PGE1-

OH. Z merjenjem metabolne aktivnosti celic z reagentom MTS smo ugotovili, da

stimulacija receptorja EP4 s PGE1-OH, posreduje inhibitorne učinke na rast maligno

spremenjenih B celic. Z Annexinom V, ki označuje celice v zgodnjem stadiju apoptoze,

smo ugotovili, da celice po stimulaciji s selektivnim agonistom vstopijo v programirano

celično smrt. V nižjih koncentracijah pa selektivni agonist receptorja EP4, PGE1-OH, na

izbranih celicah povzroči zastoj v G0/G1 fazi cličnega cikla, ki se odraža v zmanjšanem

številu celičnih delitev stimuliranih celic. Zaradi povečanega izražanja receptorja EP4 na

VII

nekaterih celičnih linijah B limfomov in levkemij ter zaradi posredovanja inhibitornih

učinkov na rast maligno spremenjenih B celic predstavlja receptor EP4 potencialno tarčo

za zdravljenje oz. podporno terapijo nekaterih vrst B levkemij in limfomov.

VIII

ABSTRACT

B cells play a major role in adaptive immune response, which has the ability to distinguish

between self and non-self antigens. The most significant pathway for early removal of

immature auto-reactive B cells is the negative selection via apoptosis. Apoptosis is a

normal physiological process which maintains the tissue homeostasis. Errors in inhibition

of programmed cell death contribute to uncontrolled cell division which can lead to

malignancies and autoimmune disorders. B cell receptor (BCR) trigerred apoptosis is one

of the major functional differences when comparing immature to mature B cells, since

mature B cells succumb to rapid proliferation instead of apoptosis. Recent research has

identified Ptger4 as one of the genes, whose expression differs the most between mature

and immature B-cells upon BCR triggering. Ptger4 codes for the prostaglandin E receptor

type 4 (EP4) and has different physiological or pathological functions, depending on the

type of tissue it is expressed in. In B cells, EP4 has been identified as a negative feedback

regulator of proliferation in response to BCR signals. Its tumorsuppresive function

contributes to inhibition of growth in non-malignant mature murine B cells. The aim of our

research was to investigate the expression of EP4 receptor and estimate the

pharmacological effects on proliferation in human B cell lymphoma cells.

Using flow cytometry and fluorescence microscopy we showed that human B lymphoma

cells express abundant amounts of EP4 receptor. We compared the expression of EP4

receptor in malignant B cells with non-malignat B cells isolated from peripheral blood of a

healthy donor and determined that RAMOS and NALM-6 cells express significantly

higher amounts of EP4 receptor compared to healthy CD19+ B cells. To asses the

functional charateristics of EP4 receptor we used pharmacological aproach using EP4

receptor selective agonist PGE1-OH. Assesing the metabolic activity of PGE1-OH

stimulated cells with MTS showed that EP4 receptor conveys inhibitory effects on cell

growth. Annexin V assay which indicates early stages of apoptosis clearly showed that the

apoptotic pathway of cell death is initiated in PGE1-OH stimulated B cell lines. In lower

concetrations selective agonist PGE1-OH induced cell cyle G0/G1 arrest of treated cells,

which results in lower count of cell division cycles. Greater expression of EP4 receptor in

the human B lymphoma cells along with its function as a growth supressor of malignant B

cells makes EP4 receptor a new prommising target for therapy of some B lymphomas and

leukemias.

IX

SEZNAM OKRAJŠAV

ALL ..............................akutna limfocitna levkemija

angl...............................angleška beseda

AP-1 ............................. transkripcijski faktor

B-ALL ..........................B -celična akutna limfoblastna levkemija

Bcl-2 .............................produkt gena bcl-2, ki preprečuje apoptozo

Bcl-6 .............................produkt gena bcl-6, ki preprečuje diferenciacijo limfocitov

B-CLL ..........................B-celična kronična limfocitna levkemija

Bcl-XL..........................produkt gena bcl-xl, ki preprečuje apoptozo

BCR..............................B-celični receptor

BL .................................Burkittov limfom

BSA ..............................goveji serumski albumin (angl. bovine serum albumine)

CD ................................celični označevalec (angl. cluster of differentiation)

CD8+ ............................ limfociti T z markerjem CD8+ (citotoksični limfocit)

CFDA-SE .....................N-sukcinimidil 6-fluoresceinkarboksilat diacetat (“predbarvilo”

CFSE)

CFSE ............................N-sukcinimidil 6-fluoresceinkarboksilat (fluorescentno barvilo)

CLL ..............................kronična limfocitna levkemija

DAPI ............................diamidino-2-fenilindol; fluorescenčno barvilo za DNA

EP4 ...............................prostaglandinski receptor E tipa 4

EPV ..............................Epstein-Barr virus

Fas ................................površinska molekula celic TC, tarča za TNF

FITC............................. fluorescein izotiocianat; fluorescenčno barvilo

GPCR ........................... receptor sklopljen z G -proteinom (angl. G-protein coupled

receptor)

HS1...............................nuklearni transkripcijski faktor

HSV ..............................herpes simplex virus

IFN-γ (α/β) ................... interferon γ (α/β)

Ig................................... imunoglobulin

IgM ............................... imunoglobulin oz. protitelo tipa M

IL .................................. interlevkin

MAPK ..........................z mitogenom aktivirana proteinska kinaza

X

XI

M-CSF .........................makrofagne kolonije stimulirajoči faktor (angl. macrophage-

colony-stimulating fractor)

MHC II ........................poglavitni histokompatibilni kompleks tipa II (angl. class II major

histocompatibility complex)

MTS .............................zmes 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-

sulfofenil)-2H-tetrazola v obliki soli in fenazin etosulfata (reagent

za test metabolne aktivnosti celic)

NF-κB...........................nuklearni traskripcijski faktor κB

PAX5 ............................gen, ki kodira protein, ki zavira diferenciacijo celic

PBMC ..........................celice iz periferne krvi z okroglim jedrom (limfociti, monociti)

PBS ............................... fosfatni pufer s soljo

PFA ..............................paraformaldehid

PGE1-OH ....................hidroksiliran prostaglandin E1; selektivni agonist receptorja EP4

PGE2 ............................prostaglandin E2

PI ..................................propidijev jodid

Ptger4...........................gen, ki kodira receptor EP4

RANKL........................ ligand aktivatorja receptorja jedrnega faktorja NF-κB (angl.

receptor activator for NF-κB ligand)

PE ................................. fikoeritrin (angl. Phycoerythrin); fluorescentno barvilo

TNFR1 ......................... receptor za dejavnik tumorske nekroze tipa 1

TNF-α...........................dejavnik tumorske nekroze (angl. tumor necrosis factor)

TRAIL .........................apoptozo inducirajoči ligand, soroden TNF (angl. TNF related

apoptosis inducing ligand)

VEGF-A .......................vaskularni endotelijski rastni faktor A

1 UVOD

1.1 APOPTOZA

Apoptoza ali programirana celična smrt je kompleksen biokemični proces, ki se sproži kot

odziv celice na specifične dražljaje. Proces apoptoze je natančno programiran in kodiran v

celičnem genskem zapisu. Določeni fiziološki ali patofiziološki dejavniki so sposobni

aktivirati genski program, ki vodi v razgradnjo celičnih struktur in celično smrt (1).

Apoptoza je normalen fiziološki proces, ki omogoča vzdrževanje homeostaze tkiv.

Posledično se napake v uravnavanju apoptoze in nepravilnosti pri poteku apoptoze

odražajo kot razvojne nepravilnosti in kot bolezni (2). Bolezni, za katere je značilen

spremenjen potek apoptoze, lahko razdelimo na bolezni, pri katerih prihaja do

preobsežnega odmiranja celic, in bolezni, pri katerih je apoptoza zavrta. Preobsežna

apoptoza je prisotna pri nevrodegenerativnih boleznih (Alzheimerjeva, Parkinsonova,

Huntingtonova bolezen), akutnem miokardnem infarktu, poškodbah zaradi ishemije pri

kapi itd. Zaviranje celične smrti pa spremlja nenadzorovano razrast celic pri malignih

obolenjih ter avtoimunski bolezni (3).

Za apoptotično celico so značilne naslednje morfološke spremembe: izguba kontaktov s

sosednjimi celicami, kondenzacija citoplazme, kondenzacija kromatina, krčenje in gubanje

celične membrane, sprememba celične površine, fragmentacija jedra in celice (2).

Glavne efektorske molekule apoptotične smrti so kaspaze. To so visoko specifični

proteolizni encimi iz skupine cisteinskih proteaz, ki cepijo peptidno verigo za aspartatom.

V celici jih najdemo v obliki neaktivnega proencima, ki se aktivira po sprožitvi

apoptotskega dražljaja (4). Nekatere raziskave dokazujejo, da imajo poleg kaspaz

pomembno vlogo pri apoptozi tudi kalpaini, katepsini in drugi tipi proteaz, ki so udeleženi

predvsem pri alternativnih poteh prenosa apoptotskega signala (5).

Pri apoptozi poteče kaskada biokemijskih reakcij, ki privede do morfoloških sprememb,

vidnih tudi pod mikroskopom. Celica se skrči, na površini se pojavijo mehurčkasti izrastki,

jedro in mitohondriji se razgradijo, DNA pa se razreže na krajše fragmente. Celica se

razdeli na več apoptotskih telesc, ki jih fagocitirajo ostale celice imunskega sistema. V

nasprotju z nekrozo proces apoptoze ne škoduje sosednjim celic in ne povzroča vnetja.

Apoptozo lahko sprožijo zunanji dejavniki, ki se vežejo na membranske receptorje, ali pa

znotrajcelični signali, ki delujejo na mitohondrije. Za večino celičnih učinkov je ključno

delovanje proteinaz kaspaz.

1

Ločimo torej več vrst indukcije apoptoze:

Intrinzična pot indukcije (razkroj se začne v celici ob doseženi kritični

dolžini telomere na kromosomu, radiaciji, stresu ob stradanju, kemijski ali

virusni okužbi, signalih iz mitohodrija ...)

ekstrinzično pot indukcije (razkroj se začne od zunaj; signali so: »smrtni«

ligandi (Fas, TNFR1, DR3), virus …)

aktivacija sistema perforin/grancim (citotoksični limfociti T CD8+ ob

določenih dražljajih izločijo perforin, ki naluknja celično membrano, in

grancim, ki aktivira kaskado kaspaz) (1)

1.1.1 Razvoj limfocitov B

Limfociti B nastanejo v kostnem mozgu, kjer so zaščiteni pred eksogenimi antigeni.

Matična celica se razvije v progenični limfocit B (pro-B celica). Iz nje se razvije predhodni

limfocit B (pre-B celica), ki na svoji površini izrazi predhodni BCR receptor (pre-BCR).

Na težko verigo tega imunoglobulinskega receptorja se veže nadomestna oz. surogantna

lahka veriga, ki je po zgradbi homologna lahkim verigam, nima pa variabilne regije. Sledi

razvoj do nezrelega limfocita B, ki prične s sintezo lahkih verig, ki lahko prepoznajo

antigen. Sestavljena molekula IgM se izrazi na celični površini kot B-celični receptor

(BCR) (1,6). Nezreli limfociti B podležejo selekciji klonov. Če IgM receptor veže telesu

lastni antigen, ga mehanizmi negativne selekcije izločijo in ponavadi se inducira apoptoza.

Nezreli limfociti B nato zapustijo kostni mozeg in od tu naprej govorimo o zrelih

limfocitih B (6).

2

Slika 1: Zaporedje stadijev pri zorenju celic B.

Prve celice, ki jih lahko uvrstimo v B-celično vrsto, so progenični limfociti B ali pro-B celice. Ti izražajo

nekatere površinske proteine, ki so značilni za B-celično vrsto. Za naslednjo razvojno stopnjo je značilna

ekpresija težke verige µ, ki je sestavljena iz variabilne (V) in konstantne (C) regije. Te celice imenujemo

predhodni limfociti B ali pre-B celice. Težka veriga µ v povezavi z nadomestno lahko verigo tvori tako

imenovani predhodni B-celični receptor. V naslednjem stadiju zorenja celice B uspešno sintetizirajo lahke

verige κ ali λ in izražajo na celični površini sestavljeno posebno obliko molekule IgM ali B-celični receptor

(BCR). Tem celicam pravimo nezreli limfociti B. Takšna celica se sprosti iz kostnega mozga v krvni obtok,

kjer je še naivna, a zrela (se še ni srečala s tujim antigenom). V perifernem limfatičnem tkivu dokončno

dozori v zrel limfocit (6).

1.1.2 Negativna selekcija limfocitov B

Nezreli limfociti B so prve celice B, ki izražajo fenotipsko obliko B-celičnega receptorja

(BCR). Kot taki predstavljajo pomembno stopnjo v razvoju limfocitov B, ker se celice, ki

izražajo avtoreaktivne BCR, fizično odstranijo ali funkcijsko onesposobijo.

Najpomembnejši mehanizem, ki omogoči razvoj tolerance do lastnih antigenov na stopnji

nezrelih celic B, je apoptoza avtoreaktivnih limfocitov B ali tako imenovana negativna

selekcija. Indukcija apoptoze po aktivaciji BCR nezrelih limfocitov B predstavlja tudi

glavno funkcijsko razliko z zrelimi limfociti B, ki se po navzkrižnem povezovanju BCR

aktivirajo in proliferirajo (7).

1.2 MALIGNE BOLEZNI LIMFOCITOV B

Vsaka stopnja v procesu normalnega zorenja B limfocitov je potencialno podvržena

maligni preobrazbi z nenadzorovanim pomnoževanjem dominantnega subklona, ki vodi v

razvoj levkemije in limfoma. Najbolj rizične so faze v zorenju, v katerih se dogaja veliko

sprememb na DNA zapisih za težke in lahke verige imunoglubulina (6).

3

Kromosomske translokacije, ki zajemajo lokuse imunogobulinov, so znak večih vrst B

celičnih malignomov, vendar niso edini faktor v patogenezi limfocitov B. Preživetje večine

B limfomov in levkemij je odvisno od ekspresije BCR in njegovega proženja. Nedavne

raziskave o faktorjih iz mikrookolja limfocitov, ki povzročajo malignosti, ponujajo veliko

novih strategij zdravljenja (8).

1.2.1 Levkemije

Levkemije izvirajo iz kostnega mozga, od koder se prekomerno pomnožene celice selijo v

krvni obtok. Ta namnožitev malignih celic onemogoča nastajanje zdravih celic v kostnem

mozgu. Delimo jih na akutne in kronične ter, glede na vrsto levkocitov, na limfocitne oz.

limfoblastne in na mieloidne oz. nelimfocitne levkemije, ki prizadenejo ostale vrste krvnih

celic, razen limfocitov. Iz teh dveh delitev dobimo torej 4 glavne skupine levkemij. Večina

limfocitnih levkemij prizadene limfocite B (8).

Kot pri ostalih malignih boleznih so tudi levkemije posledica mutacije DNA. Določene

mutacije povzročajo levkemijo z deaktivacijo tumor supresorskih genov, aktivacijo

onkogenov, motnjo v regulaciji celičnega cikla ali nastankom fuzijskih genov iz katerih

nastanejo fuzijski proteini. Primer je fuzijski protein BCR-ABL, ki se translacira iz

fuzijskega gena t.i. Philadelphia kromosoma. Te mutacije so lahko spontane, posledica

sevanj, radikalov ali izpostavitve karcinogenim substancam.

Študije v zadnjih letih so potrdile, da levkemične celice posedujejo nepravilnosti v eni ali

več apoptotičnih poteh, kar jim daje prednost za preživetje v primerjavi z normalnimi

celicami. Poleg tega so nepravilnosti v apoptotičnem odzivu povezane s slabšim odzivom

na kemoterapijo, z odpornostjo na terapijo ter s tem povezanim krajšim preživetjem

bolnikov z levkemijo (9).

B-celična kronična limfocitna levkemija (B-CLL) je neozdravljiva bolezen, ki je dokaj

pogosta med starejšo kavkazijsko populacijo. Za B-CLL je značilno progresivno kopičenje

monoklonalnih B celic, kar je lahko posledica različnih dejavnikov, ki skupno vodijo v

povečano življenjsko dobo celic, povečano sposobnost proliferacije in zmanjšano celično

smrt (10). V zadnjih letih so pri B-CLL ugotovili pomembno vlogo receptorja BCR in

antigenov, ki jih prepoznava. Bolnike z B-CLL delimo na tiste, ki imajo prisotne mutacije

v genih IgVH, ki nosijo zapis za levkemični receptor BCR, ter na tiste brez mutacij BCR.

Kljub temu lahko pri obeh skupinah najdemo podobnosti v aminokislinskem zaporedju

4

receptorja BCR. Antigeni, ki jih mutirani BCR-ji prepoznavajo, so v nekaterih primerih

antigeni mikrobov, velikokrat pa so to avto-antigeni, saj približno polovica CLL limfocitov

B izloča avtoreaktivna protitelesa. Ta odkritja kažejo na to, da CLL B limfociti izvirajo iz

avto-reaktivnih B celičnih prekurzorjev, ki so kljub različnim mehanizmom negativne

selekcije ohranili neprimerno specifičnost za vezavo antigenov (11).

Akutna limfoblastna levkemija (B-ALL) je rak nezrelih B limfocitov, ki se pretirano

namnožijo v kostnem mozgu in tako onemogočajo zdravim celicam normalno rast. Če

bolezen ni pravočasno zdravljena, smrt lahko nastopi v nekaj tednih, saj hitro metastazira

po organizmu. Točen vzrok še ni poznan, največkrat pa je ALL pri otrocih povezana s

kromosomsko translokacijo t(12; 21)(p13; q22), ki kodira TEL-AML1 fuzijski protein.

Proteina TEL in AML1 naj bi imela regulatorsko vlogo v diferenciaciji limfocitov. Njuna

mutacija te poti poruši in nastane motnja v zgodnjih stopnjah limfocita B. Najpogostejši

vzrok pri odraslih je kromosomska translokacija t(9; 22) oz. že zgoraj omenjeni

Philadelphia kromosom, zaradi katere se sintetizira fuzijski protein BCR-ABL (9,12).

1.2.2 Limfomi

Limfom je maligni tumor, ki izvira iz limfocitov B, za katerega je značilna nenadzorovana

klonska ekspanzija v perifernih limfatičnih organih. Večina limfomov je B-celičnih in

predstavljajo različne razvojne stopnje v zorenju limfocitov B. Nastanek limfomov je

večstopenjski proces, h kateremu prispevajo številne genetske spremembe, dejavniki iz

okolja in okužbe. Za večino limfomov B z zrelim fenotipom so značilne recipročne

kromosomske translokacije, ki vključujejo enega izmed imunoglobulinskih genskih

segmentov in proto-onkogen (npr. c-myc). Translocirajo se tudi geni, vključeni v celični

cikel (npr. gen za ciklin D1), blokado diferenciacije (npr. bcl-6, PAX-5) ali preživetje celic

(npr. bcl-2). Posledica takih translokacij je, da aktivirani imonoglobulinski lokus nadzoruje

translocirani gen in povzroči njegovo nenadzorovano, konstitutivno ekspresijo (8). Poleg

tega so pogoste tudi mutacije, ki inaktivirajo tumor supresorske gene (p53, p16). Izražanje

večine teh genov normalno nadzorujejo signali, ki izvirajo iz receptorja BCR. Preživetje

večine B limfomov je tudi sicer odvisno od ekpresije BCR in aktivacija BCR preko

antigena je pomemben dejavnik pri patogenezi mnogih limfomov (8). Visoka pogostost

kroničnih bakterijskih ali virusnih okužb pri bolnikih z limfomom ter povišana incidenca

limfoma pri bolnikih z avtoimunskimi obolenji ali prejemniki presadkov kaže na možno

5

vpletenost eksogenih ali avto-antigenov pri patogenezi nekateri limfomov. Stimulatorni

signali iz reaktivnih limfocitov T, okoliških citokinov in rastnih faktorjev lahko tudi do

neke mere prispevajo k napredovanju limfomov.

Pozornost vzbuja tudi ugotovitev iz primerjalne analize, da je Ptger4 signifikantno manj

izražen v najbolj pogosti agresivni maligni bolezni limfocitov B, tj. difuznem

velikoceličnem limfomu B, kar nakazuje, da primanjkljaj negativne proliferativne funkcije

Ptger4 zagotovo prispeva k povečani rasti humanega limfoma B (13) .

Burkittov limfom (BL) je agresiven limfom zrelih limfocitov B, večinoma povezan s

kromosomsko translokacijo proto-onkogena c-myc iz 8. kromosoma k lokusu za težko

verigo IgH na 14. kromosomu. Kot zelo močan onkogen je c-myc tako v limfocitih B

neprekinjeno aktiven. Kodira zapis za transkripcijski faktor, ki poveča ekspresijo genov, ki

vplivajo na celično proliferacijo (ciklini), ter vpliva tudi na rast celice. Zavira apoptozo z

znižanjem izražanja genske družine bcl-2 in z zvišanjem ribosomske RNA in proteinov

(14).

Burkittov limfom je dolgo časa veljal za bolezen, ki jo povzroča Epstein-Barr virus (EPV),

saj se je BL pojavljal pri afriških EPV pozitivnih otrocih. Hipoteza je bila ovržena, ko so

drugje po svetu našli EPV negativen BL. Podrobnejše študije razkrivajo, da EPV ni pogoj

za razvoj BL, ampak le olajša preživetje limfocitom B s translociranim c-myc, iz katerih

se BL razraste (15,16).

Burkittov limfom ni edini limfom, pri katerem je translociran c-myc. C-myc translokacijo

so našli tudi v celicah velikoceličnega difuznega limfoma B. Ločevanje med njima je

nujno, saj je terapija precej drugačna in pri pacientih z lažno določenim Burkittovim

limfomom povzroča relaps. WHO zaenkrat nima dovolj izpopolnjenih smernic za

diagnozo, saj še ne temeljijo na genskem profiliranju. V raziskavi so z genskim

profiliranjem dokazali, da je mesto preloma na lokusu c-myc bistveno za ločevanje med

navedenima limfomoma ter za izzid zdravljenja bolezni (16).

1.2.3 Terapija B-limfocitnih malignih obolenj

Pri akutni limfoblastni levkemiji (ALL), ki je pogostejša pri otrocih, je zdravljenje

potrebno takoj, saj prekomerno namnožene maligne celice preprečujejo nastajanje

normalnih krvnih celic v kostnem mozgu. Simptomatsko zdravljenje se osredotoča na

6

bolezen kostnega mozga in preprečevanje širjenja metastaz v druga tkiva. Levkemije

zdravimo v prvi vrsti s kemoterapijo (alkilirajoči citostatiki, antimetaboliti, alkaloidi,

inhibitorji topoizomeraze …), smernice pa opisujejo tudi radioterapijo, presaditev kostnega

mozga, glukokortikoide (deksametazon, prednizolon), rastne faktorje ter kombinacijo teh

(17).

Kronična limfocitna levkemija (CLL) se pogosteje pojavlja pri starejši kavkazijski

populaciji in velja za neozdravljivo. Bolezen lahko zdravimo simptomatsko, a to v

zgodnjem stadiju ni potrebno. Paciente s slabšo klinično sliko v poznejših stadijih CLL

zdravijo s podobnimi pristopi kot ALL. (17,11). Imatinib kot selektivni inhibitor BCR-

ABL tirozin kinaze (produkt fuzijskega proteina pri Philadelphia kromosomu) se s pridom

uporablja v terapiji kroničnih levkemij (18). Novejši pristopi uporabljajo ciljane terapije z

monoklonskimi protitelesi proti membranskim markerjem limfocitov B. Alemtuzumab

proti CD52, rituxumab in ofatumumab proti CD20. Ofatumumab, ki je bil odobren za

zdravljenje CLL okrobra 2009, je usmerjen proti manjšemu epitopu na CD20 kot

rituximab, ki je bližje celični membrani. Sklepajo, da je ravno zato ofatumumab

učinkoveitejši, ker je delovanje komplementa bližje membrani močnejše in tako ubije več

tarčnih celic (19).

Odkrili so novega možnega kandidata za tarčo imunoterapije malignih bolezni limfocitov

B − celični marker CD74 oz. poglavitni histokompatibilni kompleks II (angl. major

histocompatibility complex II; MHC II). Humano protitelo Anti-CD74 (milatuzumab) že

kaže vzpodbudne učinke. Predvsem učinkoviti so konjugati z radioizotopi, toksini, RNA-

zami, saj CD74+ celice hitro internalizirajo anti-CD74 protitelo in ta učinkuje ciljano,

znotraj celice (20).

1.2.4 Modulacija apoptoze kot terapevtski pristop

Patogeneza mnogih bolezni je tesno povezana z napakami v regulaciji apoptoze.

Ocenjujejo, da sta prevelika ali premajhna celična smrt vzrok polovici bolezni in za mnoge

od teh še ni učinkovitega zdravljenja (3,21). Razjasnitev molekularnih mehanizmov

apoptoze ponuja širok nabor potencialnih terapevtskih tarč za modulacijo tega procesa,

tako v pro- kot antiapoptoznem smislu. Glede na molekularno tarčo so v razvoju različni

pristopi, med temi so (21):

7

- nizkomolekularne učinkovine, ki so inhibitorji ali stimulatorji encimov kaspaz in

drugih proteaz;

- rekombinantni proteini, protitelesa (agonistična ali antagonistična), ki so mimetiki

ali antagonisti signaliziranja preko receptorjev smrti (TNF, TRAIL, CD95) na

celični površini;

- microRNA (miRNA), ki utišajo izražanje neželenih proteinov (npr. proteini, ki

prispevajo k preživetju tumorskih celic);

- peptidi ali organske spojine, ki ovirajo pomembne interakcije med proteini (21).

1.3 EP4 RECEPTOR (PROSTAGLANDINSKI RECEPTOR TIPA E4)

Receptor EP4 oz. njegov gen Ptger4 je bil odkrit z diferencialno analizo mRNA med zrelo

in nezrelo populacijo limfocitov B po stimulaciji BCR receptorja. S tehnologijo mikromrež

so najprej odkrili vrsto genov, katerih prepisovanje se poveča po BCR stimulaciji. Le nekaj

je bilo takih, ki so specifično povezani z razmnoževalnim odzivom limfocitov B. Ugotovili

so, da se nezreli limfociti na stimulacijo BCR ne odzovejo s proliferacijo. S to

diferencialno analizo izražanja genov so največjo vlogo v razmnoževanju celic B pripisali

genu Ptger4, ki kodira EP4 podtip receptorja za prostaglandin E2 (PGE2) (13).

Receptor EP4 je eden od štirih prostaglandinskih receptorjev tipa E, ki se odzivajo na

prostaglandin E2. Prostaglandinske receptorje tipa E so na podtipe ločili najprej po

kvalitativnih kriterijih – določili so jih glede na odzivnost tkiva na določen ligand (22).

Kasneje so jih ločili tudi kvantitativno in pa določili njihove signalizacijske posebnosti.

Vsi podtipi receptorjev so izraženi na plazemski membrani, receptorja EP3 in EP4 pa tudi

na jedrni (23). EP3 in EP4 sta tudi najbolj razširjena saj so njuno mRNA našli v praktično

vseh tkivih. Izražanje receptorja EP1 je precej omejeno, njegovo mRNA so našli le v

nekaterih organih, npr. ledvicah, pljučih in želodcu. Najmanj pogost je receptor EP2,

vseeno pa je stopnja izražanja tega receptorja v prisotnosti stimulusa precej velika. V

mišjih limfocitih B so najprej določili izražanje receptorjev EP2 in EP4 (22). Izbijanje

gena Ptger4, ki kodira receptor EP4, je namreč v »knockout miškah« povzročilo popolno

neodzivnost limfocitov B na PGE2, ki je naravni ligand prostaglandinskih receptorjev tipa

E. Iz tega sklepajo, da je pomen receptorja EP2 pri signalizaciji zelo majhen oz. ničen (13).

8

Receptor EP4 je s proteinom G sklopljen receptor (angl. G protein coupled receptor −

GPCR), sestavljen iz 488 aminokislin. Na zunanjem delu celice je N-terminalni del, temu

sledi 7 transmembranskih hidrofobnih domen receptorja in nato dolg C-terminalni del iz

156 aminokislin. Slednji vsebuje 38 serinskih in treoninskih ostankov, ki so pomembni pri

internalizaciji receptorja. Pomemben je tudi cisteinski ostanek med prvimi 15 AK, saj

omogoča vezavo ligandov in sklapljanje z G proteinom (22,24).

Dolg C-terminalni rep ima veliko determinant za fosforilacijo, desenzibilizacijo in

internalizacijo. Odstranitev tega dela ni zmanjšala fiziološkega odziva celice na stimulacijo

receptorja, močno pa se je zmanjšala desenzibilizacija (24).

Potrdili pa so tudi, da Ptger4 preko negativne povratne zanke zakasnjeno vpliva na

robusten proliferativni odgovor limfocitov B, ki ga sproži aktivacija antigenskega

receptorja BCR. S stimulacijo BCR receptorja se v nekaj urah poveča ekspresija receptorja

v celici in tudi na plazemski membrani (13).

1.3.1 Vloga receptorja EP4 pri uravnavanju fizioloških in patofizioloških

procesov

PGE2 je edini naravni ligand prostaglandinskih receptorjev tipa E in vpliva na osnovne

fiziološke funkcije, kot so modulacija imunskega sistema, vnetje, tvorba kosti, nosečnost,

rojstvo, gastrointestinalni transportni procesi, ledvična hemodinamika ter številne druge

funkcije (25,26). PGE2 ima pomembno vlogo tudi pri tumorski rasti, celični proliferaciji in

apoptozi (27).

Osrednja vloga receptorja EP4 pri posredovanju učinkov PGE2 je dokazana pri številnih

fizioloških in patofizioloških spremembah.

Med drugim je bilo dokazano da PGE2 prek receptorja EP4:

ščiti celice želodčne sluznice pred apoptozo (28);

ohranja homeostazo tankega črevesja z ohranjanjem integritete sluznice in z

zmanjševanjem imunskega odziva (29);

pomembno vpliva na kancerogenezo tankega in debelega črevesja in na razvoj

adenomatosus polyposis coli, ker sodeluje pri tvorbi polipov (poleg EP1 receptorja)

(27);

ščiti hepatocite, tako da preprečuje apoptozo pri njihovi okvari, preko indukcije

antiapoptotičnih proteinov (Bcl-XL) iz družine Bcl-2 (30)

9

sodeluje pri nastanku proteinurije, saj vpliva na integriteto aktinskega citoskeleta

podocitov; pri povišanem glomerularnem pritisku stimulacija EP4 spremeni

dinamiko citoskeleta podocitov in s tem vpliva na filtracijsko sposobnost

glomerulov (31);

indukcija gena Ptger4 (poleg genov za ciklin D2, transkripcijski faktor AP-1,

MAPK,...) ima pomembno vlogo pri infekciji trigeminalnega ganglija z virusom

herpes simplex-1 (HSV-1) in pri njegovi reaktivaciji (32);

inducira tvorbo vaskularnega endotelijskega rastnega faktorja A (VEGF-A) v

gladkih mišicah dihalnega sistema (33);

poveča resorpcijo kosti (34)in inducira ekspresijo RANKL (angl. receptor activator

for NF-κB ligand) v osteoblastih ter sinergistično z RANKL in M-CSF (angl.

macrophage-colony-stimulating fractor) spodbuja diferenciacijo osteoklastov iz

prekurzorskih celic (35);

sodeluje pri patogenezi revmatoidnega artritisa (36);

vpliva na zapiranje ductusa arteriosusa; pomankanje EP4 receptorja vodi v

perinatalno smrt, ki je povezana s persistentnim odprtjem duktusa arteriosusa (angl.

patent ductus arteriosus-PDA) (37);

avtokrino inhibira aktivacijo makrofagov; inhibira tvorbo citokinov TNF-α, IL-1β

in IL-12; inhibira ekspresijo poglavitnega histokompatibilnega kompleksa tipa II in

s tem antigen predstavitveno vlogo makrofagov (38);

preusmeri celični imunski odziv iz fenotipa Th1 (angl. T-helper type 1) v fenotip

Th2 (angl. T-helper type 2) s spodbujanjem tvorbe IL-4, IL-5 in IL-10 in z

inhibicijo tvorbe IL-2, IFN-γ in IL-12 (25,39).

1.3.2 Vpliv EP4 stimulacije na apoptozo

Stimulacija receptorja EP4 ima različen fiziološki učinek, odvisen od tkiva, v katerem je

stimuliran. V zrelih limfocitih B skrbi za kontrolirano klonsko ekspanzijo po aktivaciji

določenega klona (13).

Murn in sodelavci so nedvoumno dokazali, da je EP4 poglavitni, verjetno pa tudi edini

receptor, ki je odgovoren za PGE2-posredovano zavoro razmnoževanja celic B. Rezultat so

uspeli potrditi s farmakološkim pristopom, kjer je imela stimulacija EP4 receptorja s

10

specifičnimi agonisti podoben učinek kot PGE2, stimulacija ostalih poznanih receptorjev

za PGE2 pa ni vplivala na razmnoževanje celic B (13).

EP4 receptor je torej v manjši meri vedno prisoten v limfocitih B, njegova ekspresija pa se

v zrelih limfocitih B signifikantno poveča. Ugotovili so, da se EP4 stimulira že v majhni

prisotnosti njegovega edinega do sedaj poznanega naravnega liganda PGE2. To v zrelih

limfocitih B povzroči zaustavitev proliferacije aktiviranega klona in preprečitev

nekontroliranega razmnoževanja. Ptger4 so tako v nasprotju s pričakovanji identificirali

kot negativni povratni regulator, ki bi celice B lahko ščitil pred prekomernim

razmnoževanjem (13).

1.3.3 Učinki agonistov in antagonistov receptorja EP4

Učinki prostaglandinov so zelo raznovrstni, saj delujejo v skoraj vseh tkivih in celicah.

Najbolj pogost učinek je relaksacija in kontrakcija različnih gladkih mišic. Velik pomen

imajo tudi v možganih in celotnem živčnem sistemu, saj modulirajo nevronsko aktivnost,

bodisi z inhibicijo ali stimulacijo sproščanja nevrotransmiterjev, senzibiliziranjem

senzoričnih vlaken ali z indukcijo centralnih učinkov (npr. vročina ali spanje).

Prostaglandini prav tako pozitivno ali negativno regulirajo aktivnost trombocitov in so

vpleteni v žilno hemostazo in homeostazo. Pomembno funkcijo pa imajo tudi v modulaciji

apoptoze (23).

Edini naravni agonist receptorja EP4 je PGE2, ki pa ni selektiven samo za EP4, ampak

deluje na vse prostaglandinske receptorje tipa E (13). Receptorja EP3 in EP4 imata

najvišjo afiniteto za PGE2 (Kd > 1 nM), medtem ko receptorja EP1 in EP2 vežeta PGE2 z

nekoliko nižjo afiniteto (Kd > 10 nM) (40).

V zadnjih letih so razvili novo serijo selektivnih ligandov za receptorje EP, in sicer

agoniste ONO-DI-004 (EP1), ONO-AE1-259 (EP2), ONO-AE-248 (EP3) in ONO-AE1-

329 (EP4) ter antagoniste ONO-8713 (EP1), ONO-AE3-240 (EP3) in ONO-AE-208 (EP4)

(41).

Učniki antagonistov in agonistov se razlikujejo glede na vrsto celice. Stimulacija z novimi

agonisti EP4 pospeši kostno remodelacijo (42), zavre kolitis in poškodbo sluznice v

črevesju (43), inducira angiogenezo in vivo (44).

Tudi inhibicija z antagonisti EP4 ima svoje učinke: zavre bolečino in vnetje pri artritisu

(45), inhibira metastaziranje raka na dojki (46), zavre osteolizo zaradi kostne metastaze

mišjih malignih melanoma celic (47).

11

Slika 2: Neselektivni agonist receptorja EP4 PGE2, selektivni agonist PGE1-OH.

PGE2 (dinoproston) (LogP = 2.79) levo in PGE1-OH (LogP = 1.64) desno

12

2 NAMEN DELA

Odziv limfocitov B na stimulacijo B-celičnega receptorja (BCR) je pogojen s stopnjo

razvoja. Zrele celice B se odzovejo z intenzivno proliferacijo, nezrele pa z apoptozo.

Signalni mehanizmi, ki pri zrelih celicah sprožijo proliferacijo preko BCR, so dobro

poznani, manj znani pa so mehanizmi, ki zaustavijo rast in sprožijo apoptozo pri nezrelih

limfocitih B. Predhodne raziskave diferencialne genske ekspresije s pomočjo mikromrež so

pokazale, da je na genskem nivoju največja razlika med zrelimi in nezrelimi celicami B po

stimulaciji BCR v ekspresiji gena Ptger4, ki kodira prostaglandinski receptor EP4 (13).

Namen diplomskega dela je ugotoviti, kje in v kakšni meri humani maligni limfociti B

izražajo receptor EP4 in ali stimulacija receptorja EP4 v humanih modelnih linijah B

levkemij in limfomov vodi v zastoj celične rasti in apoptozo. V predhodnih študijah je bilo

namreč ugotovljeno, da stimulacija prostaglandinskega receptorja EP4 v nezrelih mišjih

limfocitih (celična linija WEHI-231) zavre proliferacijo celic.

V prvem delu diplomske naloge bomo s pomočjo uporabe pretočne citometrije in

fluorescenčne mikroskopije ugotavljali prisotnost receptorja na izbranih celicah ter

poizkušali ovrednotiti razliko v njegovi ekspresiji med zdravimi in maligno spremenjenimi

limfociti B.

V drugem delu diplomske naloge bomo s pomočjo testov celične metabolne aktivnosti ter

uporabo specifičnih agonistov ugotavljali, kakšne učinke povzroči stimulacija receptorja

EP4 na izbrane celice. S pomočjo pretočne citometrije bomo ovrednotili vpliv stimulacije

receptorja EP4 na celični cikel in proliferacijo ter preučili morebitno indukcijo

programirane celične smrti preko receptorja EP4.

13

3 MATERIALI IN METODE

3.1 MATERIALI

3.1.1 Kemikalije

Kemikalija Proizvajalec

absolutni etanol (99 %) KEFO, Ljubljana, Slovenija

DMSO Merck Chemicals, Darmstadt, Nemčija

Triton-X 10 % Sigma – Aldrich, MO, ZDA

PFA 10 % Sigma – Aldrich, MO, ZDA

Goveji serumski albumin (BSA) Sigma – Aldrich, MO, ZDA

70 % etanol Merck Chemicals, Darmstadt, Nemčija

Cell Titer 96®AQueous One Solution Reagent (reagent MTS)

Promega, Madison, WI, ZDA

PGE1-OH Cayman chemical, MI, ZDA

Propidijev jodid

Raztopina tripanskega modrila (angl.

Trypan Blue solution)

Sigma – Aldrich, MO, ZDA

ProLong® Gold Antifade Reagent

Invitrogen

3.1.2 Kompleti za analize

Komplet Proizvajalec

FITC Annexin V - komplet za detekcijo

apoptoze (APOAF-50TST)

Sigma – Aldrich, MO, ZDA

CellTrace™ CFSE - komplet za

vrednotenje celične proliferacije

Invitrogen

PI/RNase Staining Buffer (550825) (komplet za vrednotenje celičnega cikla)

BD Pharmingen™

14

3.1.3 Pufri in raztopine

Pufri in raztopine Sestava

10 x PBS (10-kratni fosfatni pufer s soljo,

pH 7˙4)

NaCl 80 g

KCl 2 g

Na2HPO4*12H2O 36.3 g

KH2PO4 2.4 g

ultračista H2O dopolnimo do 1,0 L

Natehtamo sestavine, raztopimo v vodi, uravnamo pH in avtoklaviramo.

1xPBS 10 x PBS redčimo 1 : 10 z avtoklavirano

ultračisto H2O

3.1.4 Protitelesa in fluorescenčna barvila

Poliklonsko kunčje primarno protitelo proti

N-terminalnemu delu humanega EP4

receptorja: IMG-71758; 1 mg/ml

Imgenex


C-terminalnemu delu humanega EP4

receptorja: 101775; 1 mg/ml

Cayman chemical, MI, ZDA


C-terminalnemu delu humanega EP4

receptorja: (H-160): sc-20677; 200 µg/ml

Santa Cruz Biotechnology

Monoklonalno mišje protitelo proti

humanemu markerju CD3, konjugirano s

PE-Cy™7: 557851

BD Pharmingen™

Monoklonalno mišje protitelo proti

humanemu markerju CD19, konjugrano z

barvilom PE: 555413

BD Pharmingen™

Sekundarno kozje protitelo proti Fc regiji

kunčjega IgG, konjugirano z barvilom Alexa

Fluor® 488; A-11008 ; 2 mg⁄mL

Invitrogen

15

barvilo Hoechst 33342 (za obarvanje

celičnih jeder) c=1,66 mM

Invitrogen

3.1.5 Gojišča

Gojišče Sestava

Medij RPMI 500 ml RPMI-1640

50 ml FBS

5,125 ml 200 mM L-glutamin

5 ml antibiotik/antimikotik 100 x

0,5 ml 50 mM 2-merkaptoetanol

3.1.6 Laboratorijska oprema

Aparatura/material Proizvajalec

Avtoklav A-21, Kambič laboratorijska oprema,

Semič, Slovenija

Cell-quest ® software za obdelavo

podatkov na FACS

Becton Dickinson

Centrifuge Tehtnica CENTRIC 322A,Železniki, Slo

Tehtnica CENTRIC 150, Železniki, Slo

Eppendorf Centrifuge 5415 R, Hamburg,

Nemčija

centrifugirke (15 in 50 mL) Sarstedt, Nümbrecht, Nemčija

Cytofuge Statspin

Flow tubes Invitrogen

fluorescenčni mikroskopski sistem CellR :

fluorescenčni mikroskop IX81, svetlobni

vir MT-20, vrteči disk DSU

Olympus Optical Co. GmbH, Hamburg,

Nemčija

Hemocitometer Brand Neubauer (BNlau Brand)

hladilnik/zamrzovalnik Gorenje, Velenje, Slovenija

Inkubator Heraus Holding GmbH, Hanau Nemčija

16

invertni svetlobni mikroskop (Olympus

CK40)

Olympus Optical Co. GmbH, Hamburg,

Nemčija

komora z laminarnim pretokom zraka

(LAF)

Waldner Electronics FAZ 3, Wangen,

Nemčija

Krioviale TPP, Trasadingen Švica

krovna stekla Assistent, Sondheim, Nemčija

mikrocentrifugirke (0,5 mL; 1,5 mL in

2mL)

Sarstedt, Nümbrecht, Nemčija

mikrotitrske ploščice za gojenje celičnih

kultur (s 6, 12, 24 ali 96 vdolbinami)

TPP, Trasadingen Švica

mikrotitrski čitalec (Safire2TM Genios) Tecan, Genios, Zürich, Švica

multikanalne pipete (100, 300 μL) Eppendorf, Hamburg, Nemčija

nastavki za pipete (do 10, 200, 300 ali 1000

μL)

Sarstedt, Nümbrecht, Nemčija

Pipete 100 – 1000 μL (Biohit)

20 – 200 μL (Biohit)

0,5 – 10 μL (Biohit)

0,1 – 2,5 μL (Biohit)

plastične sterilne poliestrske ploščice za

gojenje celičnih kultur z različnim številom

vdolbinic − 6, 12, ali 24;

TPP® Techno Plastic Products, Trasadigen,

Švica

pretočni citometer FASC Calibur Becton Dickinson

programska oprema za Tecan Magellan V3.X IVD

računalniška programska oprema: CellR Olympus

serološke pipete za enkratno uporabo

(volumni 5, 10, 25, 50 mL)


stekleničke za gojenje celičnih kultur (s 25,

75 in 150 cm2 rastne površine)


Stresalnik Vibromix 314 EVT Tehtnica

ultrasonični homogenizator 4710 Call-Rarner Instrument Co., Chicago, ZDA

ultrazvočna sonda Ultrasonic Homogenizer 4710 series

vodna kopel Mikro+Polo, Maribor, Slovenija

17

Memmert, Schwabach, Nemčija

vorteks (Vortex GENIE 2) Scientific Industries, Orlando, Florida,

ZDA

zamrzovalnik -80 ºC Forma Scientific

Midland, ON, Kanada

3.1.7 Humane celične linije

Humane celične linije izvirajo iz malignih človeških tkiv. So ustaljene oz. nesmrtne, kar

pomeni, da so se sposobne deliti neštetokrat (48), za razliko od nemalignih celic, katerih

število delitev je odvisno od dolžine telomere na koncu vsakega kromosoma. Telomera se

ob vsaki delitvi skrajša in ko doseže kritično dolžino, se ne more več deliti. Doseže t.i.

Hayflick-ovo mejo. (49).

Predpostavljajo, da mora celica iz ustaljene celične linije za svojo »nesmrtnost«

izpolnjevati več pogojev. Aktivacija TERT (telomerazne reverzne transkriptaze), ki

neprestano podaljšuje telomere na koncu kromosov in skrbi, da se celica nikoli ne

»postara«. Za zmožnost neprestane delitve celice so potrebni še izguba tumorsupresorske

funkcije p53 in pRb, aktivacija Ras ali myc proto-onkogena in aberacija PP2A proteinske

fosfataze (50).

RAMOS (ACC 603)

Celična linija humanega Burkittovega limfoma, pridobljena iz peritonealne tekočine 3-

letnega dečka z Burkittovim limfomom leta 1972. Celice so bile EBV negativne in izražajo

nezreli fenotip limfocitov B.

Okrogle celice, ki rastejo v suspenziji. Optimalna koncentracija 0,5−1,5 x 106 celic/ml.

Podvojevalni čas je pribl. 48h.

Celični označevalci: CD3 -, CD10 +, CD13 -, CD19 +, CD20 +, CD34 -, CD37 +, CD38 +,

cyCD79a +, CD80 +, CD138 -, HLA-DR +, sm/cyIgG -, sm/cyIgM +, sm/cykappa -,

sm/cylambda + (48).

18

NALM 6 (ACC 128)

Celična linija levkemije (humani pre-B limfociti). Pridobljena iz perfirerne krvi 19-letnega

moškega z ALL leta 1976. Okrogle, majhne celice, ki rastejo v suspenziji. Optimalna

koncentracija 1−2 x 106 celic/ml. Podvojevalni čas je pribl. 36h.

Celični označevalci: CD3 -, CD10 +, CD19 +, CD37 -, cyCD79a +, CD80 -, CD138 +,

HLA-DR +, sm/cyIgG -, cyIgM +, smIgM -, sm/cykappa -, sm/cylambda - (48).

MHH-PREB-1 (ACC 354)

Celična linija humanega B-limfocitnega limfoma. Pridobljena iz bezgavk 5-letenega dečka

z B-limfoblastnim ne-Hodginovim limfomom leta 1994. Okrogle, ki rastejo v suspenziji.

Optimalna koncentracija 0,5−2 x 106 celic/ml. Podvojevalni čas je pribl. 20−24h.

Celični označevalci: CD3 -, CD10 +, CD13 -, CD19 +, CD20 +, CD37 +, CD38 +,

cyCD79a +, CD80 -, CD138 -, HLA-DR +, sm/cyIgG -, sm/cyIgM +, sm/cykappa -,

sm/cylambda + (48).

SU-DHL (ACC 571)

Celična linija humanega B-limfocitnega limfoma. Pridobljena iz bezgavk 17-letne ženske z

B-limfoblastnim ne-Hodginovim limfomom leta 1994. Okrogle do polimorfne celice, ki

rastejo v suspenziji v grudicah. Optimalna koncentracija 0,1−1 x 106 celic/ml. Podvojevalni

čas je pribl. 40h.

Celični označevalci: CD3 -, CD10 +, CD13 -, CD19 +, CD20 +, CD34 -, CD37 +, CD38 -,

cyCD79a +, CD80 -, HLA-DR +, sm/cyIgG -, sm/cyIgM +, sm/cykappa -, sm/cylambda

+(48).

KOPN-8 (ACC 552)

Celična linija levkemije (humani pre-B limfociti). Pridobljena iz perfirerne krvi 3-mesečne

deklice z preB-celično akutno limfoblastno levkemijo (BCP-ALL) v letu 1977. Okrogle,

majhne celice, ki rastejo v suspenziji. Optimalna koncentracija 0,5−1,5 x 106 celic/ml.

Podvojevalni čas je pribl. 48h.

Celični označevalci: CD3 -, CD10 +, CD13 -, CD19 +, CD20 (+), CD34 -, CD37 +, CD38

+, cyCD79a +, CD80 -, CD138 -, HLA-DR +, sm/cyIgG -, smIgM -, cyIgM +, sm/cykappa

-, sm/cylambda - (48).

19

PERIFERNE MONONUKLEARNE KRVNE CELICE (PBMC; angl: peripheral

blood mononuclear cells):

PBMC so zdravi levkociti z negranuliranim okroglim jedrom. Pridobljene so iz polne krvi

zdravega darovalca s postopkom ekstrakcije s fikolom.

PBMC so primarna celična kultura. Vsebujejo limfocite B in T, monocite ter naravne

celice ubijalke. V primerjavi s celično linijo se razlikujejo v tem, da niso nesmrtne in da se

se ne delijo v neskončnost. Ravno nasprotno, so zelo občutljive in v nekaj dneh odmrejo,

zato jih odmrznemo tik pred eksperimentom. Dobro oponašajo pogoje in vivo.

3.2 METODE DELA S CELICAMI

Za ustrezno delo s celicami moramo najprej zagotoviti aseptične pogoje prostorov in

površin. Delo opravljamo v komori z laminarnim pretokom zraka (komora LAF), ki je

nameščena v prostorih, kjer velja poseben režim čistote (namenska zaščitna oblačila in

obutev). LAF komora zagotavlja sterilne pogoje z omejenim dostopom ter stalnim

pretokom filtriranega zraka na delovno površino (zrak onemogoča dostop kontaminantom

in prahu). Komoro pred uporabo razkužimo s polurnim obsevanjem z ultravijolično

svetlobo. Tik pred pričetkom dela pa površine komore očistimo s 70-odstotnim etanolom.

Pri delu uporabljamo zaščitne rokavice, ki jih razkužimo s 70-odstotnim etanolom.

3.2.1 Gojenje celic

Celice smo gojili v mediju RPMI z dodatki. Gojili in redčili smo jih v plastenkah ali

ploščicah za celične kulture v inkubatorju, ki zagotavlja ustrezne pogoje za rast celic

(temperatura 37 °C, 100-odstotna vlažnost ter atmosfera s 5-odstotnim CO2).

3.2.2 Subkultiviranje celičnih linij

Za zagotavljanje ustreznega števila celic smo jih morali subkultivirati. Celice rastejo v

suspenziji. Za doseganje optimalne rasti smo morali celice redčiti z medijem RPMI,

segretim na 37 °C.

3.2.3 Odmrzovanje celic

Celične kulture shranjujemo v krioampulah pri -80 ºC v zmrzovalniku ali pri -180 ºC v

Dewarjevi posodi s tekočim dušikom. Celice so shranjene v 10-odstotnem

20

dimetilsulfoksidu (DMSO), ki je citotoksičen, zato se mora postopek odmrzovanja izvesti

hitro. Krioampulo s celicami smo takoj prenesli iz zmrzovalnika oz. tekočega dušika v

vodno kopel, segreto na 37 ºC in jo rahlo stresali, da smo pospešili odmrzovanje.

Odmrznjeno vsebino smo prenesli v 15 mL centrifugirko, v katero smo predhodno

odpipetirali 10 mL medija RPMI, segretega na 37 ºC. Suspenzijo smo centrifugirali 5

minut pri 1200 obr./min. Nastali supernatant smo odpipetirali in celice resuspendirali v

ustreznem volumnu medija RPMI, segretega na 37 ºC. Celično suspenzijo smo prenesli v

sterilno mikrotitrsko ploščico za gojenje celičnih kultur in jo inkubirali v CO2 inkubatorju.

3.2.4 Štetje celic

Celice smo šteli s pomočjo hemocitometra pod invertnim mikroskopom. Ta metoda

omogoča štetje celic v znanem volumnu in izračunanje koncentracije celic (št. celic/mL).

Pod sterilnimi pogoji smo odpipetirali 20 μL celične suspenzije in jo prenesli v

mikrocentrifugirko. Dodali smo 20 μL tripanskega modrila, ki obarva poškodovane in

mrtve celice modro. Zmes smo dobro premešali s pipeto in jo nanesli na hemocitometer.

Nadalje smo prešteli žive in mrtve celice v štirih poljih, določili povprečno število živih in

mrtvih celic na mililiter ter izračunali odstotek mrtvih celic. Pri zdravi populaciji celic

odstotek mrtvih celic ne presega 10 %.

4104

/.

DFDCBA

mlcelicŠt

A, B, C, D…………število živih/mrtvih celic v posameznem polju hemocitometra

DF…………………….faktor redčenja

Enačba 1: Računanje koncentracije celic s hemocitometrom

3.2.5 Priprava celičnih kultur za mikroskopiranje in pretočni citometer

Fiksacija celic

Poznamo tri načine trajne ohranitve strukturne organizacije celice. Fiksacija s

premreževanjem, fiksacija s precipitacijo ter fiksacijo z zamrzovanjem. Fiksacija s

premreževanjem je najpogosteje uporabljena metoda v fluorescenčni mikroskopiji.

Najpogosteje uporabljeni reagenti so aldehidi, ki preko tvorbe inter- in intra-molekularnih

21

kovalentnih vezi z aminsko skupino omogočajo premreženje proteinov in nukleinskih

kislin.

Formaldehid je pogosto reagent izbire. Za fiksacijo celic smo uporabili 4-odstotno

raztopino paraformaldehida v PBS.

Permeabilizacija celic

S permeabilizacijo celične membrane omogočimo vstop fluorescenčnih barvil in primarnih

ter sekundarnih protiteles. Za permeabilizacijo lahko uporabimo organska topila oz.

detergente.

Za permeabilizacijo celic smo uporabili detergent Triton X–100, ki učinkovito

permeabilizira celične membrane, hkrati pa ne vpliva na proteinske interakcije ter

spremembo epitopov.

Zaradi visoke viskoznosti Tritona X-100 smo najprej pripravili 20-odstotno raztopino

Tritona X-100 v PBS, ki smo jo po potrebi redčili do delovne, 0.5-odstotne raztopine

Tritona X-100 v PBS.

Zmanjšanje nespecifične vezave protiteles

Da zmanjšamo nespecifično vezavo primarnih in sekundarnih protiteles v celici, celične

kulture pred inkubacijo s protitelesi inkubiramo z raztopino proteinov, ki tekmujejo za

nespecifična vezavna mesta. V ta namen se lahko uporablja raztopina govejega serumskega

albumina (BSA), raztopina kazeina, raztopina gelatina oz. serum živali, v kateri so

proizvedena sekundarna protitelesa.

Pri svojem delu smo uporabili 3-odstotno raztopino BSA.

Inkubacija s protitelesi

Po predhodni obdelavi celic (fiksacija in/ali permeabilizacija, zmanjšanje nespecifične

vezave protiteles) so celice pripravljene za inkubacijo s primarnimi protitelesi, ki so

usmerjena proti določenemu proteinu. Protitelesa hranimo pri 4 °C ali na -20 °C, odvisno

od zahtev proizvajalca. Primarna protitelesa optimalno razredčimo v 3-odstotni raztopini

BSA in jih dodamo k celicam. Po končani inkubaciji celice speremo z 1 x PBS

(centrifugiranje celične suspenzije na 1200 rpm 5 min, dekantiranje supernantanta in

redispergiranje v 1 mL PBS). Nato dodamo sekundarna protitelesa, ki so ravno tako

razredčena v 3-odstotni BSA. Sekundarna protitelesa so usmerjena proti Fc regiji

22

primarnih protiteles in so lahko označena s specifičnim encimom, radioaktivnim izotopom,

fluorescentnim barvilom.

3.3 TEST ZA DOLOČANJE CELIČNE METABOLNE AKTIVNOSTI Z

REAGENTOM MTS

Test za določanje metabolne aktivnosti celic je kolorimetrična metoda za merjenje

aktivnosti metabolnih encimov, ki reducirajo reagent MTS v formazan vijolične barve.

Reagent MTS je zmes 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-

sulfofenil)-2H-tetrazola v obliki soli in fenazin etosulfata (angl. phenazine ethosulfate;

PES), ki je reagent za prenos elektronov. Tetrazolijeva sol prehaja v celice, kjer se pod

vplivom reducirajočih reagentov v mitohondrijih reducira do formazana. Količina

nastalega formazana je sorazmerna številu živih metabolno aktivnih celic in lahko jo

merimo spektrofotometrično pri 490 nm na mikrotitrskem čitalcu (Safire2TM Genios).

Postopek:

Po stimulacji celic z 1, 10 in 100 μM PGE1-OH ter vzporedno z ustrezno količino

DMSO smo test izvajali v časih 24, 48 in 72 ur v mikrotitrskih ploščicah s 96

vdolbinicami. V vsako vdolbinico smo dodali 100 μL predhodno stimulirane oz.

kontrolne celične suspenzije. Nato smo ob želenem času dodali 10 μL reagenta

MTS. Vsak vzorec je imel 2 tehnični ponovitvi. Po treh urah inkubacije v

inkubatorju za gojenje celic (37 ºC, 5 % CO2) smo z mikrotitrskim čitalcem Tecan

Safire2 izmerili absorbanco nastalega formazana pri 490 nm. Večja kot je bila

izmerjena absorbanca, večja je bila metabolna aktivnost celic. Istočasno smo test

izvedli tudi z medijem RPMI in 10 μL MTS brez celic, s čimer smo določili

absorbanco ozadja (slepa kontrola), ter jo odšteli od absorbance vzorcev.

3.4 FLUORESCENČNA MIKROSKOPIJA

3.4.1 Fluorescenca

Pojav, pri katerem molekula absorbira in posledično emitira vidno svetlobo, imenujemo

fotoluminiscenca. Le-to delimo na fosforescenco in fluorescenco. Kadar molekula emitira

vidno svetlobo po prenehanju izpostavitve ekscitacijski svetlobi, imenujemo ta pojav

23

fosforescenca. Če pa emisija vidne svetlobe poteka samo med izpostavitvijo ekscitacijski

svetlobi, se ta pojav imenuje fluorescenca.

Fluorescenca je pojav, ki ga je prvič opazoval Sir George Gabriel Stokes leta 1852,

fizikalno pa ga je opisal Alexander Jablonski leta 1935. Molekule, ki imajo sposobnost

fluorescence, imenujemo fluorofori. Kadar fluorofor v t. i. osnovnem energijskem stanju

absorbira svetlobno energijo (foton), pride do sprememb v elektronskem, vibracijskem in

rotacijskem energijskem stanju fluorofora. Vibracijska relaksacija in fluorescenca sta

poglavitni poti vračanja fluoroforov v osnovno energijsko stanje.

Pojav fluorescence najlažje predstavimo z Jablonski-jevim diagramom (slika 3), kjer so

predstavljena energijska stanja molekule. Fluorofor, ki ni absorbiral energije, se nahaja v

najnižjem vibracijskem stanju osnovnega stanja S0. Kadar fluorofor absorbira svetlobo, se

vsa energija fotona, ki je odvisna od valovne dolžine, prenese na fluorofor. Če je ta

energija večja, kot je potrebno za preskok elektrona iz osnovnega v vzbujeno energetsko

stanje, bo molekula podvržena tudi rotacijskim in vibracijskim spremembam. Zato obstaja

širok interval valovnih dolžin, ki lahko povzročijo ekscitacijo molekule. Minimalna

energija, potrebna za fluorescenco, je tista, pri kateri pride do prehoda elektrona iz

osnovnega S0 v vzbujeno stanje S1.

Slika 3: Jablonski-jev diagram

Energija oddanega fotona je zaradi interne konverzije in vibracijske relaksacije do

najnižjega vibracijskega stanja S1 manjša kot energija absorbiranega fotona. Spekter

emitirane svetlobe je zato pomaknjen k daljšim valovnim dolžinam, kar imenujemo

Stokes-ov premik (slika 4). Dolžina Stokesovega premika je odvisna od fluorofora in večji

kot je Stokesov premik, lažje ločimo emitirano svetlobo od ekscitacijske svetlobe (51).

24

Slika 4: Stokes-ov premik

Stokesov premik je posledica izgube energije fluorokroma v višjih energjskih stanjih. Tako je absorbcijska

energija večja od emisijske in zato ima emisijska svetloba manjšo energijo in s tem večjo valovno dolžino od

absorbcijske.

3.4.2 Epifluorescenčna mikroskopija

Fluorofori po absorpciji svetlobe zaradi Stokesovega premika emitirajo svetlobo daljših

valovnih dolžin. Zato je osvetlitev vzorca, označenega z fluoroforom, z izbrano valovno

dolžino in nato zaznavanje šibkejše fluorescenčne svetlobe daljše valovne dolžine, osnovni

princip fluorescenčnega mikroskopa. Tip fluorescenčnega mikroskopa, kjer isti objektiv

uporabljamo tako za kondenzor ekscitacijske svetlobe kot za zbiranje emitirane

fluorescenčne svetlobe, imenujemo epifluorescenčni mikroskop (slika 5). Zaradi skupne

optične poti ekscitacijske in emitirane svetlobe mikroskop uporablja dikromatično

ogledalo, ki odbija svetlobo manjših valovnih dolžin in prepušča svetlobo večjih valovnih

dolžin. Optični sistem vodi ekscitacijsko svetlobo preko ekscitacijskega filtra, ki prepušča

svetlobo izbrane valovne dolžine. Le-ta se na dikromatičnem ogledalu pod kotom 90 0

odbije do objektiva, ki deluje kot kondenzor ekscitacijske svetlobe, in osvetli vzorec.

Ekscitacijska svetloba potuje skozi vzorec in stran od objektiva, ki v tej stopnji služi kot

zbiralec emitirane svetlobe. Optični sistem vodi emitirano svetlobo preko dikromatičnega

ogledala, ki prepušča samo svetlobo daljših valovnih dolžin in preko emisijskega filtra do

detektorja, kjer se tvori slika vzorca (52).

25

Slika 5: Shema epifluorescenčnega mikroskopa

Ugotavljanje lokalizacije receptorja EP4 v celicah z uporabo fuorescenčne mikroskopije

Označevanje celičnih jeder

Fluorescenčno barvanje celičnih jeder se pogosto porablja za ugotavljanje statusa celičnega

cikla in za razlikovanje med različnimi celičnimi populacijami. Hkrati nam jedro pomaga

pri preučevanju in prostorski umestitvi drugih celičnih struktur v celici. Najpogosteje

barvila delujejo kot interkelatorji DNA (etidijev bromid, propidijev jodid) ter preko vezave

v mali žleb DNA (DAPI, Hoechst).

Hoechst 33342 (Ek. maks.: 350 nm / Em. maks.: 461 nm; filter: DAPI)

Hoechst, barvilo bis-benzimidinskega tipa, prosto prehaja celično membrano in se veže v

mali žleb DNA, pri čemer regije, bogate z AT pari, močno ojačajo fluorescenco. Zaradi

ekscitacije v UV področju in relativno velikega Stokesovega premika je barvilo uporabno

za kombinacijo z drugimi fluorofori. Primerno je za barvanje fiksiranih in živih celic.

Osnovno raztopino barvila Hoechst 33342 (1,66 mM) pred uporabo redčimo s PBS do

delovne koncentracije 8 μM.

Označevanje receptorja EP4

Receptor EP4 smo s fluoroforom označili s pomočjo primarnih in sekundarnih protiteles.

26

Primarna protitelesa:

Uporabili smo tri različna primarna, v kuncu proizvedena, poliklonska protitelesa, ki se

specifično vežejo receptor EP4. Uporabili smo eno protitelo proti zunajceličnemu delu (N-

terminalni del) receptorja EP4 proizvajalca Imgenex, katerega smo redčili 1:200 v 3%

BSA v PBS. Uporabili smo tudi dve protitelesi proti znotrajceličnemu delu receptorja EP4

(C-terminalni del), ki smo ju redčili 1:100 (protitelo proizvajalca Cayman) in 1:40

(protitelo proizvajalca SantaCruz) v 3% BSA v PBS.

Sekundarna protitelesa:

Za zaznavo primarnih protiteles smo uporabili v kozi proizvedena anti-kunčja IgG,

konjugirana z barvilom AlexaFluor 488. Z redčenjem osnovne raztopine sekundarnih

protiteles (2 mg/mL) z 3% BSA v PBS smo pripravili delovno raztopino sekundarnih

protiteles s koncentracijo 0,4 ug/mL.

Postopek priprave preparata za opazovanje pod fluorescenčnim mikroskopom:

Odstranili smo celični medij nad kulturo,

enkrat smo sprali s PBS,

fiksirali smo v 4-odstotnem formaldehidu (10 min),

spirali smo s PBS,

permeabilizirali smo z 0,5-odstotno raztopino Tritona-X 100 (10 min),

inkubirali smo s 3-odstotno raztopino BSA v PBS (30 min),

inkubirali smo z raztopino primarnih protiteles proti EP4 (60 min)*,

spirali smo s PBS,

inkubirali smo z raztopino sekundarnih protiteles (1 : 5000 v 3-odstotni BSA) in

barvilom Hoechst (8 μM) (60 min),

spirali smo s PBS,

celice smo nanesli na objektna stekelca z napravo Cytofuge,

delno smo osušili celice in dodali ProLong Antifade reagent ter pokrili s

krovnim stekelcem.

* V kontrolo nismo dodali primarnih protiteles.

27

3.5 PRETOČNA CITOMETRIJA

(angl. flow cytometry), tudi: FACS (angl. fluorescence-activated cell sorting)

Pretočna citometrija je tehnika, s katero merimo in analiziramo lastnosti posameznih celic,

ki v suspenziji ena za drugo potujejo skozi ozek snop laserske svetlobe. Pri prehodu skozi

izvor svetlobe odda posamezna celica svetlobne signale, ki so odvisni od njenih lastnosti.

Analiziramo lahko več sto celic na sekundo, kar nam omogoči zanesljiv vpogled v

fizikalne in biokemične lastnosti celic. Svetlobni žarek zadene celico, se odbije, lomi ali pa

absorbira v fluoroforih, ki nato emitirajo svetlobo daljše valovne dolžine, ki jo zaznamo z

detektorjem. Fotodetektorji pretvorijo svetlobne signale v električne, ki jih izmerimo,

obdelamo z ustrezno programsko opremo in prikažemo v obliki točkovnih diagramov in/ali

histogramov. Dobimo podatek o velikosti in granuliranosti celic ter vrsti in moči

fluorescenčnih signalov.

Slika 6: Shema pretočnega citometra

Glavni sestavni deli pretočnega citometra so vir svetlobe, pretočni sistem za regulacijo toka nosilne tekočine

skozi ustrezen svetlobni žarek, optični sistem za fokusiranje in usmerjanje svetlobe, elektronika, ki omogoča

merjenje intenzitete svetlobnega signala ter računalniški sistem z ustrezno programsko opremo za analizo

dobljenih podatkov.

3.5.1 Sipanje svetlobe

Pri interakciji laserskega žarka z vzorcem večina fotonov neovirano prispe skozi tok celic.

Nekateri pa zaradi ovirane poti skozi vzorec spremenijo svoje lastnosti, kar opazimo kot

odboj oz. razprševanje svetlobe. Dva fotodetektorja merita količino razpršene svetlobe, ki

jo oddaja obsevana celica (oddana svetloba je enake valovne dolžine kot obsevalna

28

svetloba). Prvi detektor je FALS (angl. forward angle light scatter), ki se nahaja v liniji

poti laserskega žarka (tj. na nasprotni strani toka) in omogoča zaznavo uklonjene svetlobe.

Parameter, ki ga najpogosteje imenujemo »prednje sipanje« (angl. forward scatter, FSC),

nastane zaradi kontakta s celičnimi membranami in je sorazmeren velikosti celice; čim

večja je celica, tem večje bo sipanje svetlobe in višji bo signal na detektorju, ki sprejema

razpršeno svetlobo iz smeri laserskega žarka (odbojni kot žarka je majhen).

Ker so celice prosojne, prehaja veliko fotonov tudi skozi citoplazmo. Če pride do

interakcije z organeli (endoplazemski retikulum, jedro, ...), bo prišlo do odboja fotona

pravokotno od smeri laserskega žarka. Fotodetektor RALS (angl. right angle light scatter)

se nahaja pravokotno od poti laserskega žarka in omogoča zapis drugega parametra −

»stransko sipanje« (angl. side scatter), ki je premosorazmerno kompleksnosti (zrnatosti oz.

granuliranosti) posamezne celice; več kot je organelov oz. membranskih strukur, večje bo

stransko sipanje in višji bo signal. S takšno analizo določujemo morfološke lastnosti celic

kot sta velikost in zrnatost oz. granuliranost.

Slika 7: Sipanje svetlobe v pretočni citometriji

Pri interakciji s celico se svetloba razprši v dve smeri; dobimo prednje in stransko sipanje.

3.5.2 Imunofluorescenca

Poleg morfoloških lastnosti lahko s pretočnim citometrom analiziramo funkcionalne

lastnosti celic. Pretočni citometer ima dva do štiri fluorescenčne detektorje, ki merijo

svetlobo večjih valovnih dolžin od vzbujevalne (laserske) svetlobe. Vsak detektor prejema

emitirano fluorescenčno svetlobo določene valovne dolžine in na ta način meri signal, ki ga

oddaja določeno fluorescenčno barvilo. Fotodetektorji pretvorijo svetlobne signale v

električne, izmerjene vrednosti električnih signalov po računalniški obdelavi pa prikažemo

matematično in grafično. Na ta način lahko o vsaki celici, poleg podatkov o njeni relativni

29

velikosti in zrnatosti (FSC in SSC), dobimo še informacijo o vrsti in jakosti oddanih

fluorescenčnih signalov.

Razvrščanje celic glede na velikost in zrnatost omogoči razločitev belih krvnih celic na

posamezne populacije. Če želimo razločevati med podvrstami limfocitov, jih je potrebno

razvrstiti glede na prisotnost posameznih označevalskih molekul (ponavadi na površini

celice), katerih navzočnost ugotavljamo s specifičnimi protitelesi.

Prisotnost specifičnih antigenov na površini celic ali v njihovi notranjosti lahko določimo z

imunofluorescenčnimi tehnikami, pri katerih uporabljamo za želeni antigen specifična

protitelesa, ki so konjugirana s fluorokromi. Fluorokromi so barvila, ki absorbirajo

svetlobo določene valovne dolžine, oddajajo pa svetlobo večje valovne dolžine; pri

imunofluorescenčnih tehnikah vzorec obsevamo z vzbujevalno (ekscitacijsko) svetlobo, ki

jo fluorokromi absorbirajo, merimo pa relativno intenziteto oddane (emitirane) svetlobe, ki

odraža količino imunskih kompleksov.

Metoda pretočne citometrije je v osnovi enaka metodi fluorescenčne mikroskopije s to

razliko, da je odčitavanje odstotka obarvanih celice avtomatizirano, hitrejše in

objektivnejše. Odstotek pozitivnih celic (celice, ki po reakciji s fluorescenčno označenimi

protitelesi fluorescirajo) lahko zanesljivo izračunamo v primeru, da lahko jasno ločimo

med pozitivnimi in negativnimi celicami (53).

3.5.3 Metode za pripravo celic za pretočno citometrijo

a) Ugotavljanje izražanja receptorja EP4 s pomočjo imunofenotipizacije

Imunofenotipizacija je tehnika, s katero določamo proteine, izražene na celični membrani

ali znotraj celice. Obstajata posredna in neposredna tehnika označevanja proteinov s

protitelesi. Pri neposredni tehniki uporabljamo le eno vrsto protiteles: flourescenčno

označena in usmerjena proti želenemu proteinu. Pri posredni tehniki s primarnimi

(fluorescenčno neoznačenimi) protitelesi dosežemo specifično vezavo na želen protein, s

sekundarnimi protitelesi, ki so konjugirana s fluorokromom, pa označimo primarna

protitelesa, saj je Fab regija sekundarnega protitelesa usmerjena proti Fc regiji primarnega

protitelesa. (53).

Podobno kot v primeru priprave preparatov za fluorescenčno mirkoskopijo smo tudi tu

uporabili tri različna primarna, v kuncu proizvedena, poliklonska protitelesa, ki se

specifično vežejo receptor EP4. Uporabili smo eno protitelo proti zunajceličnemu delu (N-

30

terminalni del) receptorja EP4 proizvajalca Imgenex, katerega smo redčili 1:200 v 3%

BSA v PBS. Uporabili smo tudi dve protitelesi proti znotrajceličnemu delu receptorja EP4

(C-terminalni del), ki smo ju redčili 1:100 (protitelo proizvajalca Cayman) in 1:40

(protitelo proizvajalca SantaCruz) v 3% BSA v PBS. Za zaznavo primarnih protiteles smo

uporabili anti-kunčja IgG, konjugirana z barvilom AlexaFluor 488. Z redčenjem osnovne

raztopine sekundarnih protiteles (2 mg/mL) z 3% BSA v PBS smo pripravili delovno

raztopino sekundarnih protiteles s koncentracijo 0,4 ug/mL).

Z namenom razlikovanja med receptorjem EP4 na površini celice oz. znotraj celice smo

označevali nefiksirane celice, fiksirane celice ter fiksirane in istočasno permeabilizirane

celice. Če želimo označiti samo proteine na zunanjem delu membrane, celic namreč ne

smemo permeabilizirati s Triton-X, saj ta naluknja membrano in omogoča protitelesu

prosto difuzijo v notranjost celice. V primeru permeabilizacije označimo proteine zunaj in

znotraj celice.

Postopek za označevanje receptorja EP4 na suspenzijskih malignih celicah:

Odstranili smo celični medij nad kulturo (5 x 105 celic),

fiksirali smo v 4-odstotnem formaldehidu (10 min)*,

spirali smo s PBS,

permeabilizirali smo z 0,5-odstotno raztopino Tritona-X 100 (10 min)**,

spirali s PBS

inkubirali smo s 3-odstotno raztopino BSA (30 min),

inkubirali smo z raztopino primarnih protiteles proti EP4 v 3-odstotni BSA (60

min)***,

spirali smo s PBS,

inkubirali smo z raztopino sekundarnih protiteles (1 : 5000 v 3-odstotni BSA)

(60 min),

spirali smo s PBS,

resuspendirali smo celice v 500 μL PBS

analizirali smo na pretočnem citometru

*Nefiksiranih celic nismo fiksirali in permeabilizirali.

**Samo fiksirane celice niso bile permeabilizirane.

***V kontrolo nismo dodali primarnih protiteles, le sekundarna.

31

Postopek za označevanje receptorja EP4 na primarnih zrelih limfocitih B (CD19+):

Odstranili smo celični medij nad suspenzijo PBMC (5 x 105 celic),

fiksirali smo v 4-odstotnem formaldehidu (10 min)*,

spirali smo s PBS,

permeabilizirali smo z 0,2-odstotno raztopino Tritona-X 100 (10 min)**,

spirali s PBS

inkubirali smo s 3-odstotno raztopino BSA (30 min),

inkubirali smo z raztopino primarnih protiteles proti EP4 v 3-odstotni BSA (60

min)***,

spirali smo s PBS,

inkubirali smo z raztopino sekundarnih protiteles Alexa Fluor 488 (1 : 5000 v

3-odstotni BSA) in protiteles antiCD19 (1 : 20 v 3-odstotni BSA) (60 min),

spirali smo s PBS,

resuspendirali smo celice v 500 μL PBS

analizirali smo na pretočnem citometru

*Nefiksiranih celic nismo fiksirali in permeabilizirali.

**Samo fiksirane celice niso bile permeabilizirane.

***V kontrolo nismo dodali primarnih protiteles, le sekundarna.

b) Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V

Apoptozo lahko dokazujemo v celicah na več načinov, saj na njih poteka veliko

morfoloških sprememb, ki jih je s sodobnimi tehnikami preprosto ugotoviti. Ena od takih

sprememb je nestabilnost celične membrane, ki nastopi precej zgodaj v procesu apoptoze.

Zaradi nestabilnosti celične membrane se fosfolipid fosfatidilserin, ki je sicer v

neapoptotični celici na citosolni strani celične membrane, izpostavi na zunanjo,

eksoplazmatsko stran celice.

Annexin V je protein, ki se z veliko afiniteto veže na fosfatidilserin. Če s fluorescenčno

označenim Annexinom označujemo celice, ki imajo fosfatidilserin na zunanji strani,

dobimo obarvane celice oz. zaznamo Annexin- pozitiven rezultat na pretočnem citometru.

Pozitiven rezultat dajo tako žive celice v procesu apoptoze kot mrtve celice, ne glede na

način, na katerega so umrle (apopoza ali nekroza). Pozitivne za apoptozo so torej le tiste

32

celice, ki so pozitivne na Annexin in hkrati še žive. S tem namenom celice obarvamo še s

propidijevim jodidom (PI), ki prodira le v mrtve celice, žive pa se ne obarvajo. Torej bodo

celice pozitivne za apoptozo tiste, ki bodo Annexin pozitivne in PI negativne.

Postopek priprave vzorca za označevanje z Anexinom V:

Po stimulacji s 100 μM PGE1-OH smo v času 12 in 24 ur sprali celice s PBS in

jih resuspendirali v 250 μL raztopine 1 x Binding Buffer s koncentracijo 0,5 x

106 celic/ml,

dodali smo 2,5 μL FITC Annexina V in 5 μL PI,

nežno smo premešali in inkubirali 10 min v temi, pri sobni temperaturi (23 °C)

analizirali smo na pretočnem citometru v roku 60 min.

Za pomoč pri kompenzaciji prekrivanja signalov, smo celice pobarvali posebej s

FITC Annexinom V in posebej s PI. Tako smo z barvanjem samo z Annexinom V

določili mejo, ki loči apoptotične celice od neapoptotičnih in z barvanjem samo s PI

mejo, ki loči apoptotične (še vedno žive) celice od mrtvih.

c) Ugotavljanje vpliva stimulacije receptorja EP4 na spremembe v celičnem ciklu

celic

Razmerje med celicami v posameznih fazah celičnega cikla ugotavljamo na podlagi

količine DNA, ki se nahaja v celici. Propidijev jodid (PI) je fluorescentno barvilo, ki se

interkelira v DNA in RNA. Pri analizi celičnega cikla želimo opazovati le količino DNA,

zato RNA z dodatkom eksogenih RNAz razgradimo. Celice v G2 in M fazi imajo

dvakratno količino DNA, torej je fluorescenca dvakrat višja v primerjavi s celicami v G0

in G1 fazi. Celice v S fazi imajo količino DNA nekje med tema vrednostima (54).

Postopek priprave preparata za ugotavljanje sprememb v celičnem ciklu :

Po stimulaciji celic z 10 μM PGE1-OH smo v času 24 in 48 ur ostranili celični

medij nad kulturo (5 x 106 celic),

celice smo resuspendirali v 200 μL hladnega PBS in dobro

premešali/prepipetirali,

dodali smo 2 ml etanola ohlajenega na -20 °C in premešali,

inkubirali smo na -20 °C(60 min,)

33

premešali in spirali smo s PBS (2500 rpm, 5min),

resuspendirali smo v 500 μL PBS,

dodali smo 5 μL RNAze in 20 μL PI in premešali,

inkubirali smo na 37°C (30 min),

analizirali smo na pretočnem citometru v roku 60 min.

d) CellTrace™ postopek za vrednotenje celične proliferacije

CFDA-SE je brezbarvno »pred-barvilo«, ki z difuzijo prehaja v celice, kjer mu esteraze

odcepijo obe acetatni skupini (nastane CFSE!) in s tem postane močno fluorescenten. S

svojo sukcinimidilno skupino se kovalentno veže na aminske ostanke v citosolu. Uporablja

se večinoma za in vivo »sledenje« (ang. tracing) obarvanim celicam, saj ostane v celici tudi

do osem tednov. Obarvane celice se ne razbarvajo tudi po fiksaciji. S celično delitvijo se

količina barvila razpolovi v hčerinski celici, kar povzroči padec fluorescence hčerinskih

celic (glede na materinsko) za polovico. Tako lahko v časovnih intervalih spremljamo

generacije celičnih linij ter ugotavljamo hitrost in pogostost delitve (55).

Postopek za označevanje celic s CFSE:

Vzeli smo 1,5 x 106 celic in odstranili medij nad kulturo,

celice smo resuspendirali v 1 mL na 37 °C segretega PBS,

dodali smo 3 μL 5 mM reagenta CFDA-SE, da smo dosegli koncentracijo 15

μM,

inkubirali smo15 min na 37 °C,

sprali in resuspendirali smo v 1 mL svežega medija RPMI za gojenje (37 °C),

inkubirali smo 30 min na 37 °C,

celicam dodali smo 12 mL svežega medija RPMI (37 °C)in jih razdelili v

mikrotitrske ploščice (6 vdolbinic, v vsako po 2mL).

V tri vdolbinice smo dodali 0,4 μL 50 mM PGE1-OH (s tem smo dobili

koncentracijo 10 μM), ostale tri pa so služile kot kontrola.

V času 24, 48, 72, 96 ur smo merili fluorescenco živih celic.

34

4 REZULTATI IN RAZPRAVA

Ena izmed bistvenih razlik med nezrelimi in zrelimi limfociti B je njihov odziv na

stimulacijo antigenskega receptorja BCR, po katerem gredo nezreli limfociti B v apoptozo,

zreli pa v aktivacijo in proliferacijo. Ta razlika je bila ovrednotena na transkripcijskem

nivoju s pomočjo mikromrež in največja razlika med zrelimi in nezrelimi limfociti B po

stimulaciji BCR se je pokazala v izražanju gena Ptger4, ki kodira prostaglandinski receptor

EP4. Na mišji celični liniji A20 (limfom zrelih limfocitov B) so dokazali, da se po

stimulaciji BCR z antiIgM (agonist BCR) poveča ekspresija EP4 na celični membrani.

Fiziološka stimulacija EP4 receptorja naj bi delovala kot negativna povratna zanka pri

klonalni ekspanziji aktiviranega zrelega limfocita B in zato so Ptger4 označili kot tumor

supresorski gen (13).

Na podlagi te trditve smo hoteli v prvem delu diplomske naloge preveriti, kakšna je

ekspresija receptorja EP4 na humanih levkemičnih linijah limfocitov B. To smo ugotovjali

s specifičnimi protitelesi, usmerjenimi proti iskanemu receptorju. Obarvane celice smo

analizirali s pretočno citometrijo ter fluorescenčno mikroskopijo. Rezultate smo primerjali

z ekspresijo receptorja na zdravih humanih limfocitih.

V drugem delu diplomske naloge smo raziskovali, kako in v kakšni meri se maligni

lmfociti odzivajo na stimulacijo receptorja EP4. Celično metabolno aktivnost in viabilnost

smo preverjali s testom MTS, kasneje pa smo z različnimi tehnikami poskušali dokazati, da

gre po stimulaciji receptorja EP4 za programirano celično smrt − apoptozo in ne za

nekrozo.

4.1 IZRAŽANJE RECEPTORJA EP4 V HUMANIH MALIGNIH

LIMFOCITIH B

Receptor EP4 so odkrili v večini človeških tkiv. Nahaja se na celični in tudi jedrni

membrani (56). Naše poskuse smo zasnovali na humanih celičnih linijah limfocitov B v

različnih stopnjah razvoja. Najprej smo želeli ugotoviti, ali izbrane levkemične celice

izražajo receptor EP4, kje je ta lociran in v kakšni meri ga izražajo v primerjavi z zdravimi

zrelimi limfociti B iz periferne krvi. Analize smo opravljali s pretočnim citometrom (4.1.1)

in fluorescenčnim mikroskopom (4.1.2).

35

4.1.1 Določanje ekspresije EP4 receptorja na malignih limfocitih B s

pretočno citometrijo

Na voljo smo imeli 3 različna protitelesa proti receptorju EP4. Protitelo proizvajalca

Imgenex (v nadaljevanju Ab Imgenex) je usmerjeno proti zunanji N-terminalni domeni,

protitelesi proizvajalca Cayman (v nadaljevanju Ab Cayman) in Santa Cruz (v

nadaljevanju Ab Santa Cruz) pa proti notranji C-terminalni domeni. Slednja sta usmerjena

proti različnim epitopom, vsa protitelesa pa so poliklonalna. Z Ab Imgenex smo želeli torej

dokazati lokalizacijo receptorja na membrani, z ostalima dvema pa podkrepiti te hipoteze.

Celice smo označili s protitelesi po postopku, opisanem v poglavju 3.5.3.a, in jih analizirali

s pretočnim citometrom.

Jakost fluorescence (log) Slika 8: Primer histograma iz analize s pretočnim citometrom.

Abcisa predstavlja jakost fluorescence, ordinata pa število celic. Na enem histogramu lahko prikažemo tudi

več vzorcev hkrati, ki so označeni z drugačno barvo.

36

Celice NALM-6

Nefiksirane Fiksirane Fiksirane in permeabilizirane

Slika 9: Ekspresija receptorja EP4 na celicah NALM-6.

Legenda:

Črke na sliki pomenijo vrsto primarnega protitelesa, s katerim so bile celice inkubirane:

A - celice inkubirane z primarnimi protitelesi Ab Imegenex (proti zunanjemu N-term. delu receptorja);

B - celice inkubirane z primarnimi protitelesi Ab Cayman (proti notranjemu C-term. delu receptorja);

C - celice inkubirane z primarnimi protitelesi Ab Santa Cruz (proti notranjemu C -term. delu receptorja);

številke pa različne obdelave celic pred inkubacijo s protitelesi:

1 in 2 − nefiksirane, nepermeabilizirane celice;

3 − fiksirane, nepermeabilizirane celice;

4 − fiksirane in permeabilizirane celice.

Z modro barvo je na histogramih označena kontrolna populacija celic (samo sekundarna brez primarnih

protiteles), z zeleno pa populacija celic, označena s primarnimi in sekundarnimi protitelesi (Alexa Fluor 488).

Histogram predstavlja ševilo celic (y-os) pri določeni jakosti fluorescence (x-os). Detektor (FL-1) smo

nastavili glede na kontrolni vzorec tako, da so vse celice imele manjšo jakost fluorescence od 10. Tako smo

postavili mejo (navpična črta) med EP4 negativnimi in EP4 pozitivnimi celicami (prikazano na histogramu

A1). Jakost fluorescence med tremi različnimi primarnimi protitelesi se razlikuje zaradi različne afinitete

protitelesa do epitopa.

Histogrami ostalih preiskovanih celic so v prilogi (slike 26-29).

37

Iz histogramov A4, B4 in C4 (slika 9) je razvidno, da so fiksirane in permeabilizirane

celice NALM-6 za EP4 receptor 100-odstotno pozitivne. To pomeni, da je receptor v

celicah definitivno prisoten. Kot je razvidno iz slik 26-29 v prilogi je receptor prisoten tudi

na ostalih preiskovanih celicah RAMOS, MHH-PREB, KOPN-8, SU-DHL.

V določeni meri lahko sklepamo tudi o natančnejši lokaciji receptorja v celici. Histogram

A3 z Ab Imgenex, ki je usmerjeno proti zunanjemu epitopu (N-terminalna domena) EP4

receptorja, nam na naše presenečenje razkrije, da delež celic NALM-6, ki imajo receptor

na membrani, ni stoodstoten. Zanimivo pa je, da dobimo delno pozitiven rezultat, a v

manjši meri, tudi pri nepermeabiliziranih celicah s protitelesi Ab Cayman in Ab Santa Cruz

(B3 in C3), ki sta usmerjena proti notranjemu delu receptorja in bi morala dati pozitiven

rezultat le na permeabiliziranih celicah. Podobne rezultate smo pridobili tudi z analizo

ostalih preiskovanih celičnih linij (priloga: slika 26-29). Glede na to, da so nefiksirane in

nepermeabilizirane celice vseh linij EP4 negativne, sklepamo, da lahko postopek fiksacije

celic v določeni meri naluknja celično membrano in olajša protitelesom vstop v celico.

Iz teh rezultatov zato težje sklepamo o natančnejši lokalizaciji EP4 receptorja. Zaenkrat

smo razvili dve predpostavki. Prva, očitnejša, je, da je receptor lociran znotraj celice oz. da

je internaliziran pod membrano. Opazili so namreč, da se receptor EP4 izrazi na membrani

zrelega mišjega limfocita B šele potem, ko celice stimuliramo z antiIgM po sprožitvi BCR

(13). To bo predmet prihodnjih raziskav.

Druga predpostavka pa je, da je epitop na zunanji strani membrane, ki ga prepozna

primarno protitelo Imgenex, pokrito z mucini in tako protitelo fizično ne more do njega,

permeabilizacija s Triton-x pa te mucine odstrani. Pokazali so namreč, da imajo rakave

celice izraženo veliko količino mucinov na površini kot odgovor na dražljaje iz okolja.

(57).

4.1.2 Določanje ekspresije EP4 receptorja na malignih limfocitih B s

fluorescenčno mikroskopijo

Za podkrepitev rezultatov iz pretočnega citometra smo naredili še nekaj posnetkov pod

fluorescenčnim mikroskopom. Postopek, s katerim smo obarvali celice, je opisan v

poglavju 3.4. Zaradi zaključkov rezultatov iz 4.1, ki kažejo, da se naše preiskovane celice

stoodstotno obarvajo le s permeabilizacijo celic, smo izdelali le preparate iz celic, ki smo

jih pred tem fiksirali in permeabilizirali.

38

Kontrola N - term C - term

Slika 10: Posnetki malignih limfocitov B pod fluorescenčnim mikroskopom.

39

Legenda:

A – RAMOS; B – NALM-6; C – MHH-PREB; D – KOPN-8; E – SU-DHL

1 – kontrola (celice inkubirane brez primarnih protiteles, le s sekundarnimi)

2 – celice inkubirane z primarnimi protitelesi Ab Imegenex

3 - celice inkubirane z primarnimi protitelesi Ab Cayman

Celice smo snemali pod 100-kratno povečavo s fluorescenčnim mikroskopom (OLYMPUS BX50). Za vsak

posnetek smo posneli 10 rezin v razmiku 1 μm po koordinatni osi z (torej od vrha do dna celice). Na sliki 10

so prikazane optične rezine, ki potekajo preko prereza celice. Posnetki so obdelani z algoritmoma

»Backround Substraction« in »3D Blind deconvolution«, ki odstrani svetlobo, ki ne spada v preiskovano

optično rezino, ter jo prišteje v ravnino, iz katere izvira. Jedro je obarvano z barvilom HOECHST in emitira

svetlobo modre barve (področje DAPI). Uporabili smo dve primarni protitelesi proti EP4: za zunanjo domeno

receptorja Ab Imgenex in za notranjo domeno Ab Cayman. Sekundarna protitelesa s kovalentno vezanim

FITC (Alexa Fluor 488) uperjena proti Fc regiji primarnega protitelesa so na slikah obarvana zeleno. Slike so

bile posnete pri istih barvnih nastavitvah in pri isti izpostavitvi (100 ms), zato so med seboj primerljive.

S primerjavo med sličicami, ki prikazujejo kontrolo (stolpec 1), in sličicami, na katerih so

celice inkubirane še s primarnimi protitelesi (stolpec 2 in 3), smo potrdili predhodne

ugotovitve, pridobljene s pretočnim citometrom: vse maligne celice izražajo receptor EP4,

ta pa se nahaja v citosolu oz. ob celični membrani limfocitov B.

Za natančnejšo lokalizacijo preiskovanega receptorja na sličicah nimamo dovolj

informacij, saj v času izvedbe eksperimenta označevalcev, ki bi nazorno pobarvali

membrano celice, ni bilo na voljo. V nasprotnem primeru bi morda lahko kolokalizirali

receptor s celično membrano in z gotovostjo trdili ali se receptor EP4 nahaja ob jedrni

membrani, v citosolu ali pa je izražen tudi na celični membrani.

4.1.3 Določanje ekspresije EP4 receptorja na nemalignih PBMC s

pretočno citometrijo

Potem ko smo dokazali ekspresijo receptorja EP4 na humanih malignih celičnih linijah

limfocitov B, nas je zanimalo, kakšen je nivo ekspresije v primerjavi z limfociti B iz krvi

zdravega krvodajalca. Uporabili smo mononuklearne celice iz periferne krvi (angl.

Peripheral blood mononuclear cells − PBMC). PBMC sestavljajo, limfociti B in T,

monociti in celice ubijalke (NK; angl: natural killer cells). Za razlikovanje med

posameznimi podvrstami celic smo poleg receptorja EP4 označevali tudi antigen CD19

(angl: cluster of differentiation 19) , ki je specifičen za limfocite B. Ta je prisoten na

40

celicah B v vseh stopnjah, razen na plazmatkah. V ta namen smo uporabili zajčja

monoklonalna protitelesa proti humanemu CD19 označena s konjugiranim fikoeritrinom

(angl. phycoerythrin; PE), ki ga zazna detektor FL2 na pretočnem citometru.

PBMC smo odmrznili po enakem postopku kot celice iz celične linije in jih pustili 24 ur v

inkubatorju v mediju RPMI. Nato smo pripravili tri serije po pet vzorcev (vsak 0,5 x 106

celic). Prva dva vzorca sta nam služila kot negativna kontrola (vz. 1: brez primarnih in

sekundarnih protiteles; vz. 2: brez primarnih, samo sekundarna protitelesa), naslednja dva

kot kontrole za kompenzacijo prekrivanja fluorescenc (vz. 3: samo antiCD19, vz. 4: samo

antiEP4), ter vzorec 5: s primarnimi (Ab Imgenex ali Ab Cayman) in sekundarnimi

protitelesi (Alexa Fluor 488) proti receptorju EP4 ter protitelesa antiCD19. Prva serija

vzorcev je vsebovala nefiksirane, nepermeabilizirane, druga serija fiksirane,

nepermeabilizirane, tretja pa fiksirane in permeabilizirane celice, torej enako, kot smo to

naredili pri celičnih linijah. Receptor EP4 smo v prvem eksperimentu označili z Ab

Imgenex, v drugem pa z Ab Cayman.

Pripravo vzorcev smo izvedli po postopku 3.5.3 a.

41

Slika 11: Ekspresija receptorja EP4 na zrelih limfocitih B iz periferne krvi zdravega krvodajalca (CD19+).

Slika 11 prikazuje analizo nefiksiranega in nepermeabiliziranega vzorca PBMC, kjer smo istočasno označili

receptor EP4 ter CD19.

Na 1A in 1B sta histograma vseh PBMC. Vidimo več populacij, ki se ločijo glede na velikost in

granuliranost. Z leve proti desni: limfociti, monociti. Na histogramih 2A so prikazane vse PBMC in jakost

fluorescence za EP4 receptor. Vse celice, ki imajo večjo fluorescenco od 10, so pozitivne za receptor EP4.

42

Na 2B so vse PBMC in jakost fluorescence za CD19. Mejo, ki loči CD19 pozitivne od negativnih, dobimo iz

histograma 4, kjer vidne populacije ločimo z vodoravno črto (rdeča puščica) in na ordinati odčitamo

vrednost. Vse celice, ki imajo fluorescenco večjo od te vrednosti (v tem primeru 102), smatramo za CD19

pozitivne. Na tak načim lahko iz histograma 2B izvzamemo le CD19 pozitivne celice (skupina R3 na

histogramu 2B) in jih prikažemo na histogramu 3B. Ta prikazuje torej vse CD19 pozitivne celice. Iz 3B

histograma izvzamemo le “čisto” populacijo limfocitov B brez celičnega debrija (skupina R10 na 3B) in na

tej populaciji preučujemo izražanje receptorja EP4 (histogram 3A). Na histogramu 3A imamo sedaj samo

limfocite B, ki jih pri vrednosti jakost fluorescence = 10 razdelimo na EP4 negativne (M1) in EP4 pozitivne

(M2). V tabeli pod histogramom je z rdečim okvirčkom označena povprečna fluorescenca EP4 pozitivne

populcije limfocitov B. Ostali histogrami so v prilogi (slika 31).

Primerjali smo jakosti povprečne fluorecence fiksiranih in permeabiliziranih celic, saj

predvidevamo, da le na ta način označimo celokupno količino receptorja EP4.

Slika 12: Primerjava relativne povprečne fluorescence označenega EP4 receptorja med fiksiranimi in

permeabiliziranimi preiskovanimi celicami in nemalignimi CD19+ celicami iz periferne krvi zdravega

krvodajalca (Ab Imgenex).

Slika prikazuje jakost povprečne fluorescence sekundarnih protiteles označenih z Alexa Fluor 488. To

sekundarno protitelo je usmerjeno proti Fc regiji primarnega protitelesa, ki pa selektivno veže epitop na

receptorju EP4. Vrednost je normalizirana na fluorescenco zdravih CD19+ B limfocitov iz PBMC, kar

omogoča lažjo primerjamvo jakosti fluorescenc, ki so sorazmerne z izražanjem receptorja EP4.

43

Slika 13: Primerjava relativne povprečne fluorescence med fiksiranimi in permeabiliziranimi preiskovanimi

celicami RAMOS in NALM-6 ter nemalignimi CD19+ celicami iz periferne krvi zdravega krvodajalca (Ab

Cayman).

Slika prikazuje jakost povprečne fluorescence sekundarnih protiteles označenih z Alexa Fluor 488. To

sekundarno protitelo je usmerjeno proti Fc regiji primarnega protitelesa, ki pa selektivno veže epitop na

receptorju EP4. Vrednost je normalizirana na fluorescenco zdravih celicih CD19+, da lahko med sabo lažje

primerjamo jakosti fluorescenc, ki so sorazmerne z izražanjem receptorja EP4.

Na sliki 12 je razvidno, da imajo celice RAMOS in NALM-6, označene z protitelesom

proti EP4, ki prepozna N-terminalni del receptorja, dvakrat višjo povprečno fluorescenco,

kot enako pripravljen vzorec CD19+ zrelih B limfocitov. Podoben rezultat vidimo tudi na

sliki 13, kjer smo uporabili protitelo proti EP4, ki prepozna C-terminalni del receptorja. V

tem primeru je povprečna fluorescenca celic RAMOS in NALM-6 kar 4 – 5 krat višja od

CD19+ zrelih B limfocitov izoliranih iz periferne krvi zdravega krvodajalca. Maligno

spremnjene celice, ki izražajo večjo količino preiskovanega receptorja so potencialne tarče

za terapijo z agonisti receptorja EP4, saj lahko razlike v izražanju farmakološke tarče

vodijo v selektivno modulacijo maligno spremenjenih celic z agonisti ali antagonisti

receptorja EP4.

Ostale celice MHH, KOPN-8 in SU-SHL (slika 12) imajo po tem kriteriju izraženega

nekoliko manj EP4 receptorja kot zdravi limfociti.

44

Kot v predhodnih eksperimentih, kjer smo ugotavljali ekspesijo receptorja EP4 na maligno

spremenjenih celicah, smo tudi tu ugotovili, da s permeabilizacijo fiksiranih celic

dosežemo večje obarvanje receptorja EP4, ko uporabimo protitelo, ki prepozna N-

terminalni del receptorja. Glede na to, da zdravi CD19+ limfociti B na svoji membrani

nimajo presežka mucinov, ki bi lahko zakrivali vezavno mesto protitelesa Ab Imgenex,

lahko sklepamo, da se del receptorjev nahaja tudi znotraj celice bodisi v citosolu ali na

drugih membranskih strukturah v celici. Natančnejša lokalizacija in farmakološka

aktivnost različno lokaliziranega receptorja EP4 bo predmet prihodnjih raziskav.

4.2 PGE1-OH ZMANJŠA METABOLNO AKTIVNOST MALIGNIH

LIMFOCITOV B

Potem ko smo v humanih celičnih linijah ovrednotili nivo ekspresije EP4 receptorja, smo v

naslednjem koraku preizkušali, kakšen je farmakološki odziv celic na stimulacijo tega

receptorja. Celice smo inkubirali v prisotnosti selektivnega agonista za receptor EP4,

PGE1-OH, in merili njihovo metabolno aktivnost s testom MTS (opisan v poglavju 3.3).

4.2.1 Ugotavljanje vpliva stimulacije receptorja EP4 na metabolno

aktivnost celic z MTS testom

Iz vsake celične kulture smo vzeli 6 alikvotov po 1 ml kulture (0,1 x 106 celic/ml) in

odpipetirali vsak alikvot v svojo vdolbinico na mikrotitrski ploščici s 24 vdolbinicami. Prvi

alikvot je služil kot kontrola celic, ki smo jih inkubirali le v popolnem mediju RPMI. Drugi

in tretji alikvot sta služila kot kontroli topila. DMSO je citotoksičen, zato bi lahko dobili

lažno pozitivne rezultate, saj je DMSO v našem primeru topilo za PGE1-OH.

V naslednje 3 alikvote smo dodajali agonist PGE1-OH v različnih koncentracija. V četrti

alikvot smo dodali 2 μL PGE1-OH (redčen 1 : 100 v RPMI) in 18 μL RPMI, v petega 20

μL PGE1-OH (redčen 1 : 100 v RPMI), v šestega pa 2 μL osnovne raztopine PGE1-OH s

koncetracijo 50 mM ter 18 μL RPMI. Tako smo dobili v četrti vdolbinici 1 μM PGE1-OH,

v peti 10 μM PGE1-OH in v šesti 100 μM PGE1-OH. Vsako vdolbinico posebej smo

premešali z 1 mL pipeto, preden smo z multikanalno pipeto razdelili stimulirane kulture

vzporedno na 3 (24, 48, 72 h) mikrotitrske ploščice s 96 vdolbinicami. Iz vsakga alikvota

različno tretirane celične kulture smo vzeli 2-krat po 100 μL (dvojna tehnična ponovitev)

45

in tako dobili 6 x po 2 vzorca za vsako linijo. Poleg kultur smo v posebne vdolbinice

dodali še 2-krat po 100 μL RPMI kot slepo kontrolo. Celice smo dali v inkubator in vsakih

24 ur izvedli MTS test.

Eksperiment smo ponovili še dvakrat (3 biološke ponovitve) in podatke statistično

obdelali.

Slika 14: Metabolna aktivnost celic RAMOS in MHH PREB stimuliranih s PGE1-OH.

Stolpci prestavljajo celično metabolno aktivnost, normalizirano na kontrolo nestimuliranih celic v času 24, 48

in 72 ur. Rezultati iz analize celic KOPN-8, SU-DHL in NALM-6 so v prilogi (slika 30).

46

Izpostavili smo rezultate celic RAMOS, ki se je po 48h najhitreje odzivala na stimulacijo z

10 μM PGE1-OH (4. stolpec) in celic MHH-PREB, ki so se na isto koncentracijo PGE1-

OH odzivale počasneje (slika 14).

Iz zgornjih grafov je razvidno, da PGE1-OH kot agonist receptorja EP4 inhibitorno vpliva

na metabolno aktivnost celic. Zmanjšanje oz. prenehanje metabolne aktivnosti je odvisno

od koncentracije agonista. Pri koncentraciji PGE1-OH 1 μM je učinek slabo viden. Pri 10

μM je učinek znaten, medtem ko je koncetracija 100 μM za večino celic smrtna že po prvih

24 urah. Za natančnejšo korelacijo med koncetracijo in odzivom bi bilo potrebno izvesti

ekspreriment z linearnim povečevanjem koncentracij in ne logaritemskim, kar pa prvotno

niti ni bil naš namen.

Pri RAMOS smo glede na ostale celice ugotovili najhitrejši in najintenzivnejši

farmakološki odziv na stimulacijo receptorja EP4. Celice RAMOS druge po vrsti izražajo

največ receptorja EP4, kar smo določili s predhodno analizo s pretočnim citometrom

(4.1.3). Iz te primerjave bi lahko sklepali, da je odziv celic povezan s količino izraženega

receptorja EP4, vendar nam rezultati celic NALM-6 (priloga: slika 30) to hipotezo ovržejo.

NALM-6 namreč izražajo največ receptorja EP4, na testu MTS pa imajo najšibkejši odziv

na stimulacijo z 10 μM PGE1-OH. Eden imzmed verjetnih vzrokov za različen odziv celic,

kljub podobni ekspresiji receptorja EP4 je tudi diferenciacijska stopnja maligno

transformiranega B limfocita.

Namen tega testa je bil ovrednotiti učinke PGE1-OH na celice z vidika metabolične

aktivnosti oz. viabilnosti. Potrdili smo domnevo, da PGE1-OH kot agonist na receptorju

EP4 zmanjša metabolno aktivnost celic kar posledično vodi v celično smrt.

Iz tega poizkusa je nemogoče ugotoviti, za kateri tip celične smrti gre. Ali po tretiranju s

PGE1-OH nastopi nekroza ali programirana celična smrt (apoptoza) kot posledica

stimulacije receptorja EP4, bomo odgovorili v naslednjih poglavjih.

47

4.3 PGE1-OH INDUCIRA APOPTOZO V MALIGNIH LIMFOCITIH B

V predhodnih eksperimentih smo pokazali, da 100 μM PGE1-OH povzroči smrt celične

kulture v roku 24 ur. Inkubiranje z 10 μM PGE1-OH pa znantno zmanjša njihovo

metabolno aktivnost. Iz MTS testov je razvidno, da se vse celice odzivajo na podoben

način, zato smo za nadaljne preizkuse izbrali dve liniji, RAMOS in MHH-PREB. V testu

na metabolno aktivnost z MTS so se celice RAMOS najhitreje odzivale na 10 μM PGE1-

OH, MHH-PREB pa počasneje in v manjši meri.

Raziskati je bilo treba še vrsto celične smrti, ki nastopi po stimulaciji s 100 μM PGE1-OH

(poglavje 4.3.1), saj tega s testom MTS ni bilo mogoče ugotoviti. Želeli smo tudi še

preučiti, kaj se dogaja s celicami, ki so stimulirane z 10 μM PGE1-OH ( poglavje 4.4).

4.3.1 Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V

Nestabilnost celične membrane je eden zgodnejših dogodkov potem, ko celica stopi v

proces apoptoze. Fosfolipid fosfatidilserin se v tem procesu premakne iz notranje strani

membrane na njeno eksoplazmatsko površino, s čimer se izpostavi zunanjemu okolju

celice. Protein, ki se veže na fosfatidilserin z visoko afiniteto, se imenuje Annexin V in če

je ta konjugiran s fluorokromom (v našem primeru FITC), lahko služi kot občutljiva sonda

za apoptotične analize na pretočnem citometru. Fosfatidilserin se eksternalizira v zelo

zgodnji fazi apoptoze, zato lahko z barvanjem s FITC Annexinom V določimo apoptozo na

zgodnejši stopnji kot s testi, ki temeljijo na spremembah v jedru celice (npr. DNA

fragmentacija) (58).

FITC Annexin V obarva tudi celice v poznih stopnjah celične smrti, tako apoptoze kot

nekroze. Celice zato pobarvamo s FITC Annexinom V skupaj s propidijevim jodidom (PI).

PI prehaja samo v mrtve celice in tako lahko ločimo žive celice, ki so v procesu apoptoze

(PI negativne, Annexin V pozitivne), od mrtvih celic (58). Celice morajo biti pred tem

postopkom tako stimulirane, da se v njih sproži proces apoptoze. Test na pretočnem

citometru izvajamo v več časovnih točkah med potekom apoptoze.

Celice RAMOS in MHH-PREB smo najprej prešteli in določili število celic na mL medija

RPMI. Nato smo pripravili po 3 mL suspenzije vsake kulture s koncentracijo 5 x 105

celic/mL. V mikrotitrsko ploščico z 12 vdolbinicami smo za vsako linijo pripravili po tri

kontrole in tri stimulacije v volumnu 0,5 mL. Celice smo stimulirali v 100 μM PGE1-OH

48

(1μL 50 mM PGE1-OH). Postavili smo jih v inkubator za gojenje celic. V danih časih 12

in 24 ur smo vzeli vzorce, jih obarvali po postopku, opisanem v poglavju 3.5.3 b) in jih

analizirali na pretočnem citometru.

Slika 15: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS, stimuliranih z 100 μM PGE1-OH

(12h)

Na histogramu 1 vidimo dve populaciji celic − PI negativne oz. žive spodaj (R1 + R2) in PI pozitivne oz.

mrtve zgoraj (R3). Meja, ki ločuje živo populacijo od mrtve, je na abcisi približno 110. Za točno število

mrtvih celic prenesemo mejo na histogram 3 in odčitamo število celic v tabeli 3 pod M1 (označeno z rdečim

okvirčkom). Preostale žive celice na histogramu 1 (R1 in R2) pa razdelimo na Annexin V negativne in

pozitivne. Meja na abcisi je pri 10 in je določena s pomočjo nestimuliranih celic (slika 16, histogram 1). Tako

dobimo populacijo R2, ki predstavlja PI negativne in Annexin V pozitivne celice, torej žive celice v procesu

apoptoze. Za točno število teh zajamemo na histogramu 2 Annexin pozitivne celice − M1 in odštejemo

vrednost PI pozitivnih, ki smo jo določili pred tem na histogramu 3.

49

Slika 16: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS na nestimulranih celicah (12h)

Na histogramu 1 vidimo populacijo živih, neapoptotičnih celic, ki so PI in Annexin V negativne. Pri

vrednosti fluorescnce za Annexin V = 10 postavimo mejo, ki loči žive apoptotične celice od živih

neapoptotičih. To mejo uporabimo pri ločevanju stimuliranih celic (slika 15), kjer ta meja ni jasna. Pri

histogramih nestimuliranih celic pa upoštevamo meje za jakosti fluorescence PI, ki smo jih določili pri

stimuliranih celicah. Na enak način izračunamo števila celic posameznih skupin R. Histogrami za ostale

časovne točke in celice MHH-PREB so v prilogi (slika 32-34).

50

Preglednica 1: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS.

12 h Št. celic % 24 h Št. celic % kontrola A neg. PI neg. (R1) 6634 88,83% A neg. PI neg. 9005 94,03% A poz. PI neg. (R2) 355 4,75% A poz. PI neg. 391 4,08% A poz. PI poz. (R3) 479 6,41% A poz. PI poz. 181 1,89%

A neg. PI neg. (R1) 1288 6,44% A neg. PI neg. 158 1,35%PGE1-OH

100uM A poz. PI neg. (R2) 13314 66,57% A poz. PI neg. 6352 54,17% A poz. PI poz. (R3) 5398 26,99% A poz. PI poz. 5216 44,48%

kont

rola

12h

kont

rola

24h

stim

ulac

ija 1

2h

stim

ulac

ija 2

4h

Mrtve

Apoptotične

Žive

0%

20%

40%

60%

80%

100%

De

lež

ce

lic

Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na liniji RAMOS

Slika 17: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS.

Na grafu vidimo, da stimulacija receptorja EP4 povzroči začetek apoptoze na večini celic že po 12 urah. Po

24 urah pa so že vse celice v procesu programirane celične smrti, polovica teh pa je že mrtvih.

51

Preglednica 2: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB.

12 h Št. celic % 24 h Št. celic %

kontrola A neg. PI neg. (R1) 16392 92,94% A neg. PI neg. 124 98,41% A poz. PI neg. (R2) 536 3,04% A poz. PI neg. 1 0,79% A poz. PI poz. (R3) 710 4,03% A poz. PI poz. 1 0,79%

A neg. PI neg. (R1) 15045 81,23% A neg. PI neg. 9946 53,58%PgE1-OH 100uM A poz. PI neg. (R2) 1423 7,68% A poz. PI neg. 3932 21,18% A poz. PI poz. (R3) 2053 11,08% A poz. PI poz. 4684 25,23%

kont

rola

12h

kont

rola

24h

stim

ulac

ija 1

2h

stim

ulac

ija 2

4h Mrtve

Apoptotične

Žive

0%

20%

40%

60%

80%

100%

De

lež

ce

lic

Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na liniji MHH-PREB

Slika 18: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB.

Pri celicah MHH-PREB se po 12 urah stimulacije manjši delež živih neapoptotičnih celic (zeleni stolpci)

zmanjša na račun apoptotičnih (rumeni stolpci), po 24 urah pa se poveča število mrtvih celic (rdeči stolpci)

na račun živih apoptotičnih in neapoptotičnih.

Namen tega eksperimenta je bil odkriti, na kakšen način limfociti B po stimulaciji

receptorja EP4 umrejo: po nekrotični ali po apoptotični poti. Primerjava histogramov 1

med kontrolo (slika 16 ) in stimulacijo (slika 15) nazorno prikazuje apoptotično pot smrti.

Okvir R2 na histogramu 1 (slika 15), ki označuje žive apoptotične celice, je v stimuliranih

celicah dobro vidna, kar je neposreden dokaz, da celice umirajo po principu apoptoze.

52

Če primerjamo rezultate obeh celičnih tipov med seboj, ugotovimo, da proces apoptoze pri

celicah RAMOS poteka bistveno hitreje kot pri MHH-PREB. Ta podatek lahko

primerjamo s količino izraženega receptorja EP4, ki smo jo določili v poglavju 4.1.3:

Ekspresija EP4 na RAMOS je približno dvakrat večja od ekspresije na celicah MHH-

PREB. Rezultat, pridobljen v tem poglavju, pa sovpada tudi s podatki, pridobljenimi z

MTS testom v poglavju 4.2.1, kjer smo ugotovili, da se RAMOS bolj odziva na stimulacijo

kot MHH-PREB.

Z rezultati iz tega poglavja tako lahko potrdimo, da se s stimulacijo receptorja EP4 z

agonistom PGE1-OH sproži signalna pot, ki vodi maligen humani limfocit B v

programirano celično smrt.

4.4 PGE1-OH INHIBIRA PROLIFERACIJO V MALIGNIH

LIMFOCITIH B

Z Annexinom V smo dokazali EP4 inducirano apoptozo na celicah RAMOS in MHH-

PREB po stimulaciji s PGE1-OH. Nadalje smo želeli ugotoviti, kaj je vzrok manjši celični

metabolni ativnosti celic, ki jih stimuliramo z nižjimi koncentracijami agonista receptorja

EP4.

4.4.1 Ugotavljanje vpliva stimulacije receptorja EP4 na celični cikel

malignih imfocitov B

Najprej smo ugotavljali, ali stimulacija EP4 receptorja vpliva na cikel celične delitve in s

tem na proliferacijo malignih celic.

Celični cikel v grobem razdelimo na interfazo (rast in podvojevanje DNA) in mitozo

(delitev). Interfazo pa lahko razdelimo na faze G0, G1, S, in G2. V G0 celica miruje, preden

stopi v proces celične delitve, v katerega stopi s fazo G1. V G1 se prepisujejo mRNA in

posledično proteini, potrebni za podvojevanje DNA − celica raste. Na koncu te faze je “G1

kontrolna točka”, v kateri se preverja, če je vse pripravljeno za podvojevanje DNA, in v

fazi S se DNA podvoji. Nastopi G2 faza, v kateri celica še naprej pridobiva na velikosti,

sintetizira se tudi veliko proteinov, potrebnih za mitozo (mikrotubuli). Na koncu te faze, tik

pred delitvijo, je “G2 kontrolna točka”, v kateri celica preveri, če ima vse potrebno za

vstop v mitotsko delitev.

53

Za ta poskus smo vzeli 6-krat po 4 ml kulture s koncentracijo 1 x 105 celic/ml. Te celice

smo prenesli v ploščico s šestimi vdolbinicami. Naredili smo dve biološki ponovitvi: prvi

dve vdolbinici sta bila kontrolni, v drugi dve smo odpipetirali 0,8 μL DMSO, v tretji dve

pa 0,8 μL PGE1-OH (50mM v DMSO), tako da smo dobili končno koncentracijo PGE1-

OH 10 μM. Ploščico s celicami smo postavili v inkubator, po 24 in 48 urah pa smo vzeli iz

vdolbinic 2 mL kulture, jih obdelali po postopku v poglavju 3.5.3 c) in jih analizirali na

pretočnem citometru.

54

Slika 19: Vpliv stimulacije receptorja EP4 na potek celične delitve celic RAMOS in MHH-PREB

Na sliki so histogrami, pridobljeni z analizo na pretočnem citometru, ki prikazujejo stimulirane celice

RAMOS (10 μM PGE1-OH) v času 0, 24, 48 ur. Posamezen histogram prikazuje število celic v odvisnosti od

jakosti fluorescence PI. Analizirano celično kulturo lahko razdelimo v štiri skupine, ki predstavljajo faze

celičnega cikla, v kateri se te celice nahajajo: M1 − faza G0/G1, M2 − faza S, M3 − faza G2/M, M4 − faza

sub G0/mrtve celice. V tabeli so podatki o deležih celic v posamezni fazi.

55

Preglednica 3: Numerični prikaz vpliva stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic RAMOS

DMSO PGE1-OH 10uM 0h 24h 48h

G0/G1 37,48 37,82% 41,69 43,63% 34,28 34,74% S 37,61 37,95% 35,79 37,46% 31,46 31,88% G2/M 23,29 23,50% 14,96 15,66% 16,86 17,08% sub G0/mrtve 0,72 0,73% 3,11 3,25% 16,09 16,30%

0h24h

48h

sub G0/mrtveG2/M

S G0/G1

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

del

ež c

elic

Vpliv stimulacije EP4 receptorja na celični cikel linije RAMOS

Slika 20: Vpliv stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic RAMOS

Iz 3D grafa (slika 20) je razvidno, da se v prvih 24 urah odstotek RAMOS celic z dvojnim

dednim materijalom (G2/M − zeleni stolpci) zmanjša, odstotek mirujočih (G0/G1 − rumeni

stolpci) pa poveča. Sklepamo, da se celice v G2/M fazi normalno razdelijo in obstanejo v

G0/G1 fazi.

V drugih 24 urah se zmanjša delež celic v G0/G1 in S fazi (modri stolpci), poveča pa se

odstotek mrtvih celic (rdeči stolpci). Prav tako sklepamo, da v tem časovnem intervalu

mitoza v celicah, ki so že aktivno v procesu celične delitve, poteče normalno do konca,

potem pa pride do zastoja v G0/G1 fazi. Celice zatem stopijo v cikel apoptoze, saj

stimulacija receptorja EP4 sproži kaskado proapoptotičnih signalov.

56

Preglednica 4: Numerični prikaz vpliva stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic MHH-PREB

DMSO PGE1-OH 10uM 0 h 24 h 48h G0/G1 43,94 45,17% 47,03 50,14% 35,81 59,41% S 34,74 35,72% 36,19 38,59% 18,14 30,09% G2/M 14,83 15,25% 7,03 7,50% 3,19 5,29% sub G0/mrtve 3,76 3,87% 3,54 3,77% 3,14 5,21%

0h24h

48h

sub G0/mrtveG2/M

S G0/G1

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

del

ež c

elic

Vpliv stimulacije EP4 receptorja na celični cikel linije MHH-PREB

Slika 21: Vpliv stimulacije EP4 receptorja na celični cikel celic MHH-PREB

Pri celicah MHH-PREB vidimo podoben, a počasnejši odziv kot pri RAMOS (slika 21).

Tudi tukaj pride do zastoja v fazi G0/G1 (rumeni stolpci) v prvih 24 urah. Ta delež celic se

enakomerno poveča tudi v drugih 24 urah, v nasprotju z RAMOS, kjer ta pade zaradi

indukcije apoptoze. V prvih 48 urah se delež mrtvih celic skoraj ne spremeni.

V tem podpoglavju smo torej pokazali, da 10 μM PGE1-OH kot agonist receptorja EP4

inhibira proliferacijo z zastojem celic v G0/G1 fazi celičnega cikla. Pri celicah RAMOS, ki

ima izraženega več receptorja EP4 kot MHH-PREB, pa v takšni koncentraciji inducira še

apoptozo.

57

4.4.2 Vrednotenje celične proliferacije malignih limfocitov B s postopkom

CFSE CellTrace™

Izraz CFSE se tudi v stroki velikokrat uporablja napačno namesto CFDA-SE, ki je njegov

diacetatni analog. CFDA-SE je namreč nefluorescentno “barvilo”, ki ga uporabljamo pri

tem preizkusu. Z difuzijo prehaja v celice, kjer esteraze odcepijo obe acetatni skupini

(nastane CFSE!) in s tem postane močno fluorescenten. S svojo sukcinimidilno skupino se

kovalentno veže na aminske ostanke v citosolu. Uporablja se večinoma za in vivo

»sledenje« (ang. tracing) obarvanih celic, saj ostane v celici tudi do osem tednov. S celično

delitvijo se količina barvila razpolovi v hčerinski celici, kar povzroči padec fluorescence

hčerinskih celic (glede na materinsko) za polovico. Tako lahko v časovnih intervalih

spremljamo generacije celic ter ugotavljamo hitrost in pogostost delitve (55).

Celice smo stimulirali po postopku 3.5.3 d) in jih analizirali na pretočnem citometru.

Slika 22: Vpliv stimulacije receptorja EP4 na vsebnost barvila cfse v celicah RAMOS.

Na sliki vidimo 4 manjše histograme na levi, ki predstavljajo analize meritev na pretočnem citometru v časih

0, 24, 48 in 72 ur. Pod vsakim histogramom je tabela, v kateri je povprečna jakost fluorescence prikazane

populacije označena z rdečim okvirčkom. Na večjem histogramu na desni smo prikazali vse analize skupaj. Z

desne proti levi si sledijo populacije, analizirane v časih 0, 24, 48, 72 ur (vijolična 0 ur, oranžna 72 ur).

Vsak histogram ima na ordinati število celic, na abcisi pa jakost fluorescence za barvilo CFSE.

58

Slika 23: Vsebnost barvila CFSE v nestimuliranih celicah RAMOS

Na sliki vidimo 4 manjše histograme na levi, ki predstavljajo analize meritev na pretočnem citometru v časih

0, 24, 48 in 72 ur. Pod vsakim histogramom je tabela, v kateri je povprečna jakost fluorescence prikazane

populacije označena z rdečim okvirčkom. Na večjem histogramu na desni smo prikazali vse analize skupaj. Z

desne proti levi si sledijo populacije, analizirane v časih 0, 24, 48, 72 ur (vijolična 0 ur, oranžna 72 ur).

Vsak histogram ima na ordinati število celic, na abcisi pa jakost fluorescence za barvilo CFSE.

Slika 24: Vpliv stimulacije receptorja EP4 na vsebnost barvila CFSE v celicah MHH-PREB.

Levi histogram prikazuje analizo nestimuliranih celic s pretočnim citometrom, desni pa analizo celic,

stimuliranih z 10 μM PGE1-OH. Z desne proti levi si sledijo populacije, analizirane v časih 0, 24, 48, 72, 96

ur (vijolična 0 ur, oranžna 96 ur). Zadnja meritev 96 ur je izvzeta in označena z M1. Njej smo izmerili

povprečno fluorescenco za primerjavo med stimuliranimi in nestimuliranimi celicami.

59

Preglednica 5: Primerjava povprečne fluorescence CFSE med nestimuliranimi in stimuliranimi celicami

RAMOS in MHH-PREB

RAMOS Kontrola 72h PGE1-OH 72h

Povprečna fluorescenca 40,27 194,65

MHH-PREB Kontrola 96h PGE1-OH 96h

Povprečna fluorescenca 16,435 140,215

Povprečna fluorescenca CFSE v celicah RAMOS

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Kontrola 72h PGE1-OH 72h

Po

vprečn

a fl

uo

resc

enca

Povprečna fluorescenca CFSE v celicah MHH-PREB

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Kontrola 96h PGE1-OH 96h

Po

vprečn

a fl

uo

resc

enca

Slika 25: Primerjava povprečne fluorescence CFSE med nestimuliranimi in stimuliranimi celicami RAMOS

in MHH-PREB

Zaradi enostavnejše statistične primerjave rezultatov celičnih linij med sabo smo se

odločili upoštevati le povprečno fluorescenco iz zadnje meritve (72 ur za RAMOS oz. 96

ur za MHH-PREB). Iz tega podatka lahko izračunamo, kolikokrat so se celice v danem

času razdelile.

Pri celicah RAMOS je v 72 urah pri nestimuliranih celicah fluorescenca padla iz 371 na

40. Če upoštevamo, da pri vsaki celični delitvi povprečna fluorescenca pade na polovico,

lahko izračunamo, da so se nestimulirane celice RAMOS razdelile približno 3-krat (1-krat

na 24h).

Pri nestimuliranih MHH-PREB pa je padla fluorescenca v 96h iz 1500 na 16, kar pomeni,

da so se celice razdelile 6-krat (1-krat na 16 h).

Pri stimuliranih RAMOS je fluorescenca padla v 72h na ~190,. Iz tega izračunamo, da so

se stimulirane RAMOS razdelile samo 1-krat.

Pri MHH-PREB je povprečna fluorescenca padla v 96h iz ~1500 na ~140. Torej so se

stimulirane MHH-PREB razdelile pa 3 do 4-krat (1-krat na 27h).

60

Iz danih podatkov lahko izračunamo, da hitrost ene delitve pri celicah RAMOS pade iz 24h

na 72h, pri MHH-PREB pa iz 16h na 27h.

Tako pridobljeni rezulati potrjujejo spremembe v razporeditvi faz celičnega cikla s PGE1-

OH tretiranih celic, saj zaustavitev celic v fazi G0/G1 po 24h vodi v zmanjšanjo število

celičnih delitev v kasnejših časovnih točkah.

Ti rezultati potrjujejo, da stimulacija receptporja EP4 posreduje inhibitorne učinke na

proliferacijo maligno spremenjenih B limfocitov, kar je posledica regulacije celičnega

cikla in nadaljne indukcije apoptoze.

61

5 SKLEP

Z izhodiščem, da stimulacija receptorja EP4 na mišjh malignih nezrelih limfocitih

povzroča apoptozo in inhibicijo proliferacije, smo v tej diplomski nalogi želeli ugotoviti ali

velja podobno tudi za humane maligne celice B. Namen je bil določiti kje in v kakšni meri

celice humanih modelnih linij limfocitov B izražajo receptor EP4 in ali stimulacija

receptorja EP4 vodi v zastoj celične rasti in apoptozo. Preizkuse smo zasnovali na

nesmrtnih oz. malignih celičnih linijah limfocitov B v različnih stopnjah zrelosti.

Prvi del diplome obsega molekularno-imunološki aspekt te naloge. Naprej smo s tremi

vrstami protiteles proti različnim epitopom receptorja EP4 celice analizirali s pretočno

citometrijo in fluorescenčno mikroskopijo. Potrdili smo, da celice vseh linij izražajo iskani

receptor. Nejasnosti so se pojavile pri lokalizaciji receptorja, kar pa bo predmet nadaljnih

razskav.

Drugi del naloge vsebuje farmakološko preverjanje odziva celic na stimulacijo receptorja

EP4 s specifičnim agonistom PGE1-OH. S testom za oceno metabolne aktivnosti celic

(MTS) smo ugotovili, da so celice, odvisno od koncetracije agonista, po stimulaciji

receptorja EP4 metabolno manj aktivne oz. mrtve. V naslednjem koraku smo ugotavljali,

za katero vrsto celične smrti gre. Z Annexinom V smo nedvoumno potrdili programirano

celično smrt na preiskovanih celicah RAMOS in MHH-PREB. Hipotezo, da je za

inhibicijo proliferacije humanih celic odgovorna stimulacija receptorja EP4, smo potrdili z

rezultati iz analize celičnega cikla. Ti potrjujejo zastoj stimuliranih celic v fazi G0/G1.

Dognanja smo podkrepili še s testom za vrednotenje celične proliferacije z barvilom CFSE,

s katerim smo ugotovili upočasnjeno delitev stimuliranih celic.

EP4 receptor so že označili kot tarčo zdravljenja B-celičnega limfoma. Jasno je, da bi

ciljanje EP4 receptorja zaradi lahke dostopnosti na površini celic B lahko predstavljalo

klinično uporabno alternativo ali dodatek h kemoterapiji pri zdravljenju B-celičnega

limfoma.

Določitev vloge Ptger4 pri nezrelih limfocitih B bi omogočilo boljše poznavanje razlik

med zrelimi in nezrelimi limfociti B, kar bi odprlo nove poti pri iskanju terapij in

terapevtikov za zdravljenje avtoimunskih bolezni, imunskih pomankljivosti in malignih

stanj imunskega sistema.

62

6 LITERATURA

1. Elmore S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 2007 Jun 1;35(4):495 -516.

2. Hunot S, Flavell RA. APOPTOSIS: Death of a Monopoly? Science. 2001 May

4;292(5518):865-866. 3. Fischer U, Schulze-Osthoff K. New Approaches and Therapeutics Targeting Apoptosis

in Disease. Pharmacological Reviews. 2005 Jun;57(2):187-215. 4. Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature. 2000 Oct 12;407(6805):770-

776. 5. Stenson-Cox C, FitzGerald U, Samali A. In the cut and thrust of apoptosis, serine

proteases come of age. Biochemical Pharmacology. 2003 Oct 15;66(8):1469-1474. 6. LeBien TW, Tedder TF. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 2008

Sep 1;112(5):1570-1580. 7. Abbas KA, Lichtman HA, Cellular and Molecular Immunology. 5.izdaja, Saunders. 5.

ed. 8. Kuppers R. Mechanisms of B-cell lymphoma pathogenesis. Nat Rev Cancer. 2005

Apr;5(4):251-262. 9. Testa U, Riccioni R. Deregulation of apoptosis in acute myeloid leukemia.

Haematologica. 2007 Jan 1;92(1):81-94. 10. Osorio LM, Aguilar-Santelises M. Apoptosis in B-chronic lymphocytic leukaemia.

Med Oncol. 1998 12;15(4):234-240. 11. Nicholas Chiorazzi, M.D., Kanti R. Rai, M.B., B.S. and Manlio Ferrarini, M.D.

Chronic Lymphocytic Leukemia [Internet]. [cited 2010 Aug 14];Available from: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra041720

12. Acute lymphoblastic leukaemia; Pui et al. The Lancet, Volume 371, Issue 9617, Pages

1030 - 1043, 22 March 2008 13. Murn J, Alibert O, Wu N, Tendil S, Gidrol X. Prostaglandin E2 regulates B cell

proliferation through a candidate tumor suppressor, Ptger4. Journal of Experimental Medicine. 2008;205(13):3091.

14. Myc - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. [cited 2010 Aug 26];Available

from: http://en.wikipedia.org/wiki/Myc 15. Thorley-Lawson DA, Allday MJ. The curious case of the tumour virus: 50 years of

Burkitt's lymphoma. Nat Rev Micro. 2008 Dec;6(12):913-924.

63

16. A Biologic Definition of Burkitt's Lymphoma from Transcriptional and Genomic Profiling [Internet]. [cited 2010 Aug 25];Available from: http://www.contentnejmorg.zuom.info/cgi/content/abstract/354/23/2419

17. Hallek M, Cheson BD, Catovsky D, Caligaris-Cappio F, Dighiero G, Dohner H, et al.

Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2008 Jun 15;111(12):5446-5456.

18. Hagop Kantarjian, M.D., Charles Sawyers, M.D., Andreas Hochhaus, M.D., Francois

Guilhot, M.D., Charles Schiffer, M.D., Carlo Gambacorti-Passerini, M.D., Dietger Niederwieser, M.D., Debra Resta, R.N., Renaud Capdeville, M.D., Ulrike Zoellner, M.Sc., Moshe Talpaz, M.D. and Brian Druker, M.D. for the International STI571 CML Study Group. Hematologic and Cytogenetic Responses to Imatinib Mesylate in Chronic Myelogenous Leukemia [Internet]. [cited 2010 Aug 14];Available from: http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa011573

19. Coiffier B, Lepretre S, Pedersen LM, Gadeberg O, Fredriksen H, van Oers MHJ, et al.

Safety and efficacy of ofatumumab, a fully human monoclonal anti-CD20 antibody, in patients with relapsed or refractory B-cell chronic lymphocytic leukemia: a phase 1-2 study. Blood. 2008 Feb 1;111(3):1094-1100.

20. Stein R, Mattes MJ, Cardillo TM, Hansen HJ, Chang C, Burton J, et al. CD74: A New

Candidate Target for the Immunotherapy of B-Cell Neoplasms. Clinical Cancer Research. 2007;13(18):5556s-5563s.

21. Fischer U, Schulze-Osthoff K. Apoptosis-based therapies and drug targets. Cell Death

Differ. 2005 Jan 21;12(S1):942-961. 22. Regan JW. EP2 and EP4 prostanoid receptor signaling. Life sciences. 2003;74(2-

3):143–153. 23. Dey I, Lejeune M, Chadee K. Prostaglandin E2 receptor distribution and function in

the gastrointestinal tract. British journal of pharmacology. 2006;149(6):611–623. 24. Bastepe M, Ashby B. Identification of a region of the C-terminal domain involved in

short-term desensitization of the prostaglandin EP4 receptor. British journal of pharmacology. 1999;126(1):365.

25. Fedyk ER, Phipps RP. Prostaglandin E2 receptors of the EP2 and EP4 subtypes

regulate activation and differentiation of mouse B lymphocytes to IgE-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996 Oct 1;93(20):10978 -10983.

26. Arakawa T, Laneuville O, Miller CA, Lakkides KM, Wingerd BA, DeWitt DL, et al.

Prostanoid Receptors of Murine NIH 3T3 and RAW 264.7 Cells. Journal of Biological Chemistry. 1996 Nov 22;271(47):29569 -29575.

27. Kitamura. Combined effects of prostaglandin E receptor subtype EP1 and subtype EP4

antagonists on intestinal tumorigenesis in adenomatous polyposis coli gene knockout

64

mice - Kitamura - 2005 - Cancer Science - Wiley Online Library [Internet]. [cited 2010 Sep 2];Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1349-7006.2003.tb01492.x/pdf

28. Hoshino T, Tsutsumi S, Tomisato W, Hwang H, Tsuchiya T, Mizushima T.

Prostaglandin E2 Protects Gastric Mucosal Cells from Apoptosis via EP2 and EP4 Receptor Activation. Journal of Biological Chemistry. 2003 Apr 11;278(15):12752 -12758.

29. Kabashima K, Saji T, Murata T, Nagamachi M, Matsuoka T, Segi E, et al. The

prostaglandin receptor EP4 suppresses colitis, mucosal damage and CD4 cell activation in the gut. J. Clin. Invest. 2002 4;109(7):883-893.

30. Akira Ushio, Yasuhiro Takikawa. Induction of Bcl-xL is a possible mechanism of anti-

apoptotic effect by prostaglandin E2 EP4-receptor agonist in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells; Ushio A, Takikawa Y, Lin SD, Miyamoto Y, Suzuki K.; Hepatology Research: The Official Journal of the Japan Society of Hepatology

31. Martineau LC, McVeigh LI, Jasmin BJ, Kennedy CRJ. p38 MAP kinase mediates

mechanically induced COX-2 and PG EP4 receptor expression in podocytes: implications for the actin cytoskeleton. Am J Physiol Renal Physiol. 2004 Apr 1;286(4):F693-701.

32. Higaki S, Gebhardt BM, Lukiw WJ, Thompson HW, Hill JM. Effect of

Immunosuppression on Gene Expression in the HSV-1 Latently Infected Mouse Trigeminal Ganglion. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002 Jun 1;43(6):1862-1869.

33. Bradbury D, Clarke D, Seedhouse C, Corbett L, Stocks J, Knox A. Vascular

Endothelial Growth Factor Induction by Prostaglandin E2 in Human Airway Smooth Muscle Cells Is Mediated by E Prostanoid EP2/EP4 Receptors and SP-1 Transcription Factor Binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 2005;280(34):29993 -30000.

34. Miyaura C, Inada M, Suzawa T, Sugimoto Y, Ushikubi F, Ichikawa A, et al. Impaired

Bone Resorption to Prostaglandin E2 in Prostaglandin E Receptor EP4-knockout Mice. Journal of Biological Chemistry. 2000 Jun 30;275(26):19819 -19823.

35. Kobayashi Y, Mizoguchi T, Take I, Kurihara S, Udagawa N, Takahashi N.

Prostaglandin E2 Enhances Osteoclastic Differentiation of Precursor Cells through Protein Kinase A-dependent Phosphorylation of TAK1. Journal of Biological Chemistry. 2005 Mar 25;280(12):11395 -11403.

36. McCoy JM, Wicks JR, Audoly LP. The role of prostaglandin E2 receptors in the

pathogenesis of rheumatoid arthritis. J. Clin. Invest. 2002 9;110(5):651-658. 37. Nguyen M, Camenisch T, Snouwaert JN, Hicks E, Coffman TM, Anderson PAW, et

al. The prostaglandin receptor EP4 triggers remodelling of the cardiovascular system at birth. Nature. 1997 Nov 6;390(6655):78-81.

38. Nataraj C, Thomas DW, Tilley SL, Nguyen M, Mannon R, Koller BH, et al. Receptors

65

for prostaglandin E2 that regulate cellular immune responses in the mouse. J. Clin. Invest. 2001 10;108(8):1229-1235.

39. Roper R, Brown D, Phipps R. Prostaglandin E2 promotes B lymphocyte Ig isotype

switching to IgE. J Immunol. 1995 Jan 1;154(1):162-170. 40. The utilization of recombinant prostanoid receptors to determine the affinities and

selectivities of prostaglandins and related analogs. 41. Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: Multiple roles in inflammation

and immune modulation; Pharmacology & Therapeutics Volume 103, Issue 2, August 2004, Pages 147-166; Aaron N. Hata and Richard M. Breyer

42. Tanaka M, Sakai A, Uchida S, Tanaka S, Nagashima M, Katayama T, et al.

Prostaglandin E2 receptor (EP4) selective agonist (ONO-4819.CD) accelerates bone repair of femoral cortex after drill-hole injury associated with local upregulation of bone turnover in mature rats. Bone. 2004 Jun;34(6):940-948.

43. Kabashima K, Saji T, Murata T, Nagamachi M, Matsuoka T, Segi E, et al. The

prostaglandin receptor EP4 suppresses colitis, mucosal damage and CD4 cell activation in the gut. J. Clin. Invest. 2002 4;109(7):883-893.

44. Rao R, Redha R, Macias-Perez I, Su Y, Hao C, Zent R, et al. Prostaglandin E2-EP4

Receptor Promotes Endothelial Cell Migration via ERK Activation and Angiogenesis in Vivo. Journal of Biological Chemistry. 2007 Jun 8;282(23):16959 -16968.

45. Clark P, Rowland SE, Denis D, Mathieu M, Stocco R, Poirier H, et al. MF498 [N-{[4-

(5,9-Diethoxy-6-oxo-6,8-dihydro-7H-pyrrolo[3,4-g]quinolin-7-yl)-3-methylbenzyl]sulfonyl}-2-(2-methoxyphenyl)acetamide], a Selective E Prostanoid Receptor 4 Antagonist, Relieves Joint Inflammation and Pain in Rodent Models of Rheumatoid and Osteoarthritis. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2008 May 1;325(2):425 -434.

46. Ma X, Kundu N, Rifat S, Walser T, Fulton AM. Prostaglandin E Receptor EP4

Antagonism Inhibits Breast Cancer Metastasis. Cancer Research. 2006 Mar 15;66(6):2923-2927.

47. Prostaglandin E receptor EP4 antagonist suppresses osteolysis due to bone metastasis

of mouse malignant melanoma cells; FEBS Letters 2007 Feb 6;581(3):565-71.; Takita M, Inada M, Maruyama T, Miyaura C.

48. DSMZ [Internet]. [cited 2010 Aug 17];Available from:

http://www.dsmz.de/plant_cell_lines/main.php?menu_id=2 49. Hayflick limit - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. [cited 2010 Sep

1];Available from: http://en.wikipedia.org/wiki/Hayflick_limit 50. Telomerase - Wikipedia, the free encyclopedia [Internet]. [cited 2010 Sep 1];Available

66

from: http://en.wikipedia.org/wiki/Telomerase 51. Lichtman JW, Conchello J. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2005 Dec;2(12):910-

919. 52. Lichtman JW, Conchello J. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2005 Dec;2(12):910-

919. 53. Flow-Cytometry.pdf (Predmet application/pdf) [Internet]. [cited 2010 Aug

16];Available from: http://www.abdserotec.com/uploads/Flow-Cytometry.pdf 54. Cellcycle PI/RNAse staining buffer [Internet]. [cited 2010 Aug 16];Available from:

http://www.bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/tds/cell_bio/live/web_enabled/80571E_550825.pdf

55. CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit [Internet]. [cited 2010 Aug 16];Available

from: http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34554.pdf 56. Dey I, Lejeune M, Chadee K. Prostaglandin E2 receptor distribution and function in

the gastrointestinal tract. British journal of pharmacology. 2006;149(6):611–623. 57. Hollingsworth MA, Swanson BJ. Mucins in cancer: protection and control of the cell

surface. Nat Rev Cancer. 2004 Jan;4(1):45-60. 58. FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit II [Internet]. [cited 2010 Aug 16];Available

from: http://www.bdbiosciences.com/external_files/pm/doc/tds/cell_bio/live/web_enabled/6710KK_556570.pdf

67

7 PRILOGE

Slika 26: Ekspresija receptorja EP4 na celicah RAMOS



Histogram predstavlja ševilo celic (y-os) pri določeni jakosti fluorescence (x-os).

Detektor (FL-1) smo nastavili glede na kontrolni vzorec tako, da so vse celice imele manjšo jakost

fluorescence od 10. Torej smatramo vse celice z večjo jakostjo fluorescence od 10, da so receptor EP4 –

pozitivne (desno od navpične črte).

Jakost fluorescence med tremi različnimi primarnimi protitelesi se razlikuje zaradi različne afinitete


68

Slika 27: Ekspresija receptorja EP4 na celicah SU-DHL, KOPN-8 in MHH-PREB (primarno protitelo Ab

Imgenex).






pozitivne (desno od navpične črte)



69


Cayman).









70


Santa Cruz).









71

Slika 30: Metabolna aktivnost celic NALM-6, KOPN-8 in SU-DHL stimuliranih s PGE1-OH.

Stolpci prestavljajo celično metabolno aktivnost, normalizirano na kontrolo nestimuliranih celic v času 24, 48

in 72 ur.

72

Nefiksirane Fiksirane Permeabilizirane

Slika 31: Ekspresija receptorja EP4 na zrelih limfocitih B iz periferne krvi zdravega krvodajalca (CD19+).

A - Ab Imgenex; B – Ab Cayman;

1 – nefiksirane celice; 2 – fiksirane celice; 3 – permeabilizirane celice

Slika prikazuje rezultate iz pretočnega citometra. Na celicah smo istočasno označili receptor EP4 ter CD19.

Na histogramih so po postopku opisanem pod sliko 11 izvzete že vse CD19-pozitivne celice. Vse celice

desno od navpične črte pozitivne za EP4 receptor. Te predstavljajo torej populacijo nemalignih limfocitov B

(CD19+), ki izražajo recptor EP4. V tabeli pod histogramom je z rdečim okvirčkom označena povprečna

fluorescenca EP4-pozitivne populcije limfocitov B.

Histogram A1 je že predstavljen na sliki 11 kot histogram 3A.

73

Slika 32: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah RAMOS (24h).

Na histogramu A1 vidimo populacijo živih, neapoptotičnih celic, ki so PI in Annexin V negativne (R4). Pri

vrednosti fluorescnce za Annexin V = 500 določimo navpično mejo, ki loči žive apoptotične celice od živih

neapoptotičih. To mejo uporabimo pri ločevanju stimuliranih celic (B1), kjer ta meja ni jasna. Na histogramu

B1 vidimo dve populaciji celic − PI negativne oz. žive spodaj (R4 + R5) in PI pozitivne oz. mrtve zgoraj

(R6). Meja, ki ločuje živo populacijo od mrtve, je na abcisi približno 600. Za točno število mrtvih oz. PI-

negativnih celic prenesemo mejo na histogram B3 in odčitamo število celic v tabeli 3 pod M1 (označeno z

rdečim okvirčkom). Žive oz. PI-negativne celice na histogramu B1 (R4 in R5) pa razdelimo na Annexin V

negativne in pozitivne. Za točno število Annexin V pozitivnih in PI negativnih zajamemo na histogramu B2

vse Annexin pozitivne celice − M1 in odštejemo vrednost PI pozitivnih, ki smo jo določili pred tem na

histogramu B3.

74

Slika 33: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB (12h).










histogramu B3.

75

Slika 34: Ugotavljanje apoptoze z Annexinom V na celicah MHH-PREB (24h).










histogramu B3.

76

DARJAN ANDREJC - ffa.uni-lj.si · pharmacological effects on proliferation in human B cell lymphoma...

Documents

Transcript of DARJAN ANDREJC - ffa.uni-lj.si · pharmacological effects on proliferation in human B cell lymphoma...