CdLM Molecular & Medical Biotechnology

Aa 2016/17

Prof A.Turco

CYTOGENETICS

CYTOGENOMICS

1953…La Doppia Elica! (J.Watson, F.Crick, M.Wilkins, Nobel 1962)

Citogenetica: un po’ di storia…

PREPARAZIONE CARIOTIPO STANDARD (Citogenetica classica o convenzionale)

-Cc somatiche nucleate

(es.leucociti sangue periferico, fibroblasti)

-Mitogeno (PHA fitoemoagglutinina)

-Colchicina, inibitore del fuso mitotico

(blocco in metafase)

-Soluzione ipotonica (rigonfiamento cellulare)

-Fissazione (su vetrino)

-Colorazione (bandeggio)

telomero

telomero

centromero

Bandeggio G caratteristico

bande G

CHIARE

ricche in GC

molti geni

bande G

SCURE

ricche in AT

pochi geni

Anatomia di un cromosoma

Morfologia dei cromosomi

(dimensioni e posizione centromero)

AUTOSOMI = dall’1 al 22, dal più lungo al più corto…….(il più corto è il 21)

ETEROSOMI, GONOSOMI, CROMOSOMI SESSUALI = X e Y

IDIOGRAMMA = rappresentazione grafica schematica

dell’assetto cromosomico

CARIOTIPO STANDARD UMANO (G-banding pattern)

CROMOSOMI ACROCENTRICI

Satelliti = geni in tandem per rRNA

Cromosomi acrocentrici 13

14

15

21

22

Satelliti = geni ripetuti in tandem

per rRNA

Cariotipo fluorescente (Colorazione Q = Quinacrina)

Notare i 2 cromatidi fratelli (o sisters…)

«Bandeggio»

Braccio

Regione

Banda

Sottobanda

Sotto-sottobanda

Es 12q24.32 12qduequattropuntotredue

La Citogenetica Classica

(convenzionale, standard)

permette di identificare riarrangiamenti

cromosomici di non meno di 5 Mb

La Citogenetica Molecolare

(Citogenomica)

permette di identificare

riarrangiamenti fino a poche Kb

EVOLUZIONE DELLA CITOGENETICA

1Kb = mille coppie di basi (bp)

1Mb = 1 milione di bp

CITOGENETICA MOLECOLARE Livello di risoluzione < 4-5Mb (4-5 milioni di basi)

F.I.S.H. (Fluorescent In Situ Hybridization)

Array – CGH

(aCGH) (array-based Comparative Genomic Hybridization)

FISH Anni 90, nasce la citogenetica molecolare

Marcatura fluorescente

Elevata risoluzione

Rapidità

Nuclei in interfase

Marcature multiple

Elaborazione computerizzata immagini

TRISOMIA

A = “painting”

B = sonde centromeriche nucleo interfasico

Marcatura multipla (13, 18, 21, X, Y)

C = sonda telomerica cromosoma 2 (del 2q)

FISHFISHFISHFISHFISHFISH

G U L P !!!

PGS = Preimplantation Genetic Screening (aneuploidies) 5-color FISH – Single Interphase Blastomere Nucleus

FISH interfasica in diagnosi prenatale

FISH – Chromosome painting

(MICRO)DELEZIONE

S.da microdelezione: es. S.Wolf - Hirschhorn

S.da microdelezione……

1/10.000, ipercalcemia infantile, facies caratteristica (ponte nasale, narici anteverse,

guance paffute, bocca larga, labbra carnose. Anomalie dentali.) Vomito frequente. Insonnia.

“Cocktail party manner” (bambini): socialità, logorrea, amicalità, iperattività….. Iperacusia.

Ritardo mentale e disabilità intellettiva che impedisce indipendenza.

SVAS (stenosi sopravalvolare aortica). Stenosi periferiche polmonari. Bassa statura…

La microdelezione in 7q coinvolge circa 20 geni (CGS =Contiguous Gene Syndrome)

compreso, sempre, iI gene per l’elastina (espressione nella parete aortica)………

FISH

FISH interfasica multicolor in DIAGNOSI

GENETICA PREIMPIANTO (PGD)

FISH – Based Single-Cell

Preimplantation Sexing (Severe X-linked conditions)

XX (green)

XY (green, red)

Es. casi clinici: Alport syndrome

Ricerca di (micromicro) delezioni

e/o duplicazioni…..

Ibridazione Genomica Comparativa (convenzionale)

Comparative Genomic Hybridization (CGH) convenzionale e microarray

Screening dell’intero genoma

Cianine, sostanze

fluorescenti

…o CMA (Chromosomal MicroArray)

Identificazione di una microdelezione

nel cromosoma 11

del(11)(q13.2-q13.4) mediante aCGH