1

Department of Ophthalmology

University of Helsinki

Helsinki, Finland

CORNEAL NERVES IN REFRACTIVE

SURGERY AND DRY EYE

ILPO S. TUISKU

Academic Dissertation

To be publicly discussed,

with the permission of the Medical Faculty of the University of Helsinki,

 in Lecture Hall 2 of Biomedicum, Haartmaninkatu 8,

 Helsinki, on February 22nd, 2008, at 12 noon.

Helsinki 2008

2

Supervised by:

Professor Timo Tervo

Department of Ophthalmology

University of Helsinki

FINLAND

Reviewed by:

Professor Hannu Uusitalo

Department of Ophthalmology

University of Tampere

FINLAND

and

Professor Marja­Liisa Vuori

Department of Ophthalmology

University of Turku

FINLAND

Opponent:

Professor Friedrich Kruse

Department of Ophthalmology

University of Erlangen­Nürnberg

GERMANY

© Ilpo S. Tuisku

ISBN 978­952­92­3307­6 (paperback)

ISBN 978­952­10­4500­4 (PDF)

Yliopistopaino

Helsinki 2008

3

To Johanna, Tom, and Matias

4

CONTENTS

LIST OF ORIGINAL PUBLICATIONS 6

ABBREVIATIONS   7

ABSTRACT 9

INTRODUCTION 10

REVIEW OF THE LITERATURE 11

1. Corneal structure 11

2. Corneal innervation and sensitivity 13

3. Neurosecretorial regulation of tearing 15

4. Tear fluid cytokines 16

5. Corneal wound healing 17

6. Antigen­presenting cells 20

7. Excimer laser 20

8. Photorefractive keratectomy – PRK 218.1  Nerve regeneration after PRK 228.2  Corneal sensitivity after PRK 23

9. Laser in situ keratomileusis – LASIK 239.1  Nerve regeneration after LASIK 249.2  Corneal sensitivity after LASIK 25

10. Dry eye 27

11. Dry eye after refractive surgery 29

12. Sjögren’s syndrome 3012.1 Neurological manifestations in Sjögren’s syndrome 31

AIMS OF THE STUDY 32

SUBJECTS AND METHODS 33

1. Subjects 331.1 PRK patients 331.2 LASIK patients and controls 331.3 Primary Sjögren’s syndrome patients and controls 34

5

2. Methods 352.1 Clinical examination 352.2 Tear fluid analysis 362.3 In vivo confocal microscopy –  IVCM 382.4 Noncontact esthesiometry 392.5 PRK 402.6 LASIK 402.7 Statistical analyses 41

RESULTS 42

1. Tear fluid cytokines, haze, and nerve regeneration after PRK 421.1 Tear fluid cytokines after PRK 421.2 IVCM three months after PRK 421.3 Correlations between IVCM data and cytokines 44

2. Dry eye and corneal sensitivity after high myopic LASIK 442.1 Subjective symptoms 442.2 Objective dry eye tests 442.3 Corneal sensitivity 45

3. Corneal morphology and sensitivity in primary Sjögren’s syndrome 453.1 Subjective symptoms 453.2 Objective dry eye tests 453.3 Corneal sensitivity 463.4 IVCM in primary Sjögren’s syndrome 46

DISCUSSION 48

1. Tear fluid cytokines and haze after PRK 48

2. Nerve regeneration after PRK 48

3. Corneal sensitivity after high myopic LASIK 50

4. Corneal sensitivity in primary Sjögren’s syndrome 52

5. Corneal nerves in primary Sjögren’s syndrome 53

SUMMARY AND CONCLUSIONS 57

ACKNOWLEDGMENTS 58

REFERENCES   60

ORIGINAL PUBLICATIONS 74

6

LIST OF ORIGINAL PUBLICATIONS

This dissertation is based on the following original publications, which are referred to in the text

by Roman numerals I – IV:

I Ilpo S. J. Tuominen, Timo M. T. Tervo, Anna­Maija Teppo, Tuuli U. Valle, Carola

Grönhagen­Riska  and  Minna  H.  Vesaluoma.  Human  tear  fluid  PDGF­BB,  TNF­

and TGF­  1 vs corneal haze and regeneration of corneal epithelium and subbbasal

nerve plexus after PRK. Exp. Eye Res. 2001;72:631–641.

II Ilpo  S.  Tuisku,  Nina  Lindbohm,  Steven  E.  Wilson,  Timo  M.  Tervo.  Dry  eye  and

corneal sensitivity after high myopic LASIK. J. Refract. Surg. 2007;23:338­342.

III Ilpo  S.  J.  Tuominen,  Yrjö  T.  Konttinen,  Minna  H.  Vesaluoma,  Jukka  A.O.

Moilanen, Maaret Helintö, Timo M. T. Tervo. Corneal innervation and morphology

in primary Sjögren’s syndrome. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003;44:2545­2549.

IV Ilpo S. Tuisku, Yrjö T. Konttinen, Liisa M. Konttinen, Timo M. Tervo. Alterations

in  corneal  sensitivity  and  nerve  morphology  in  patients  with  primary  Sjögren’s

syndrome. Submitted 2007.

These publications have been reprinted with the kind permission of  their copyright holders. In

addition, some unpublished material is presented.

7

ABBREVIATIONS

APC Antigen­presenting cellAr­F Argon fluorideARVO Association for Research in Vision and OphthalmologyBSCVA Best spectacle­corrected visual acuityBM Basal membraneBUT Tear break­up timeCCK CholecystokininCGRP Calsitonin gene­related peptideCMTF Confocal microscopy through focusingD DiopterDC Dendritic cellDLK Diffuse lamellar keratitisECM Extracellular matrixEGF Epidermal growth factorExcimer Excited dimerFas Fas (Apo­95) receptorFas­L Fas­ligandFML FluorometholoneGAL GalaninHGF Hepatinocyte growth factorIGF Insulin­like growth factorIL InterleukinIVCM In vivo confocal microscopykDa kiloDaltonKGF Keratinocyte growth factorLASIK Laser assisted in situ keratomileusisLINE LASIK­induced neurotrophic epitheliopathyM­ENK Methionine­enkephalinNCE Noncontact esthesiometerNFB Nerve fiber bundleNGF Nerve growth factorNPY Neuropeptide YOSDI Ocular surface disease indexPACAP Pituitary adenylate cyclase­activating polypeptidePDGF Platelet­derived growth factorPRK Photorefractive keratectomypSS Primary Sjögren’s syndromeSP Substance PSS Sjögren’s syndromesSS Secondary Sjögren’s syndromeTGF­ Transforming growth factor ­ TNF­ Tumor necrosis factor – Trk Tyrosine kinaseTSCM Tandem scanning confocal microscopyUCVA Uncorrected visual acuityVAS Visual analog scaleVIP Vasoactive intestinal polypeptide

8

9

ABSTRACT

This  study  aimed  to  investigate  the  morphology  and  function  of  corneal  sensory  nerves  in  1)patients after corneal refractive surgery and 2) patients with dry eye due to Sjögren’s syndrome.A  third  aim  was  to  explore  the  possible  correlation  between  cytokines  detected  in  tears  anddevelopment  of  post­PRK  subepithelial  haze.  The  main  methods  used  were  tear  fluid  ELISAanalysis, corneal in vivo confocal microscopy, and noncontact esthesiometry.

The  results  revealed  that  after  PRK  a  positive  correlation  exists  between  the  regeneration  ofsubbasal nerves and the thickness of regenerated epithelium.  Pre­ or postoperative levels of thetear  fluid  cytokines  TGF­ 1,  TNF­ , or PDGF­BB  did  not  correlate  with  the  development  ofcorneal haze objectively estimated by  in vivo confocal microscopy 3 months after PRK. Afterhigh myopic LASIK, a discrepancy between subjective dry eye symptoms and objective signsof dry eye was observed. The majority of patients reported ongoing dry eye symptoms even 5years after LASIK, although no objective clinical signs of dry eye were apparent.  In addition,no difference  in corneal sensitivity was observed between these patients and controls. PrimarySjögren’s  syndrome  patients  presented  with  corneal  hypersensitivity,  although  their  cornealsubbasal  nerve density was  normal. However,  alterations  in corneal  nerve morphology  (nervesprouting  and  thickened  stromal  nerves)  and  an  increased  number  of  antigen­presenting  cellsamong subbasal nerves were observed, implicating the presence of an ongoing inflammation.

Based on  these  results,  the  relationship  between  nerve  regeneration  and  epithelial  thickness  3months  after  PRK  appears  to  reflect  the  trophic  effect  of  corneal  nerves  on  epithelium.  Inaddition, measurement of tear fluid cytokines may not be suitable for screening patients for riskof  scar  (haze)  formation  after  PRK.  Presumably,  at  least  part  of  the  symptoms  of  “LASIK­associated dry eye” are derived from aberrantly regenerated and abnormally functioning cornealnerves. Thus,  they may represent a form of corneal neuropathy or “phantom pain” rather  thanconventional  dry  eye.  Corneal  nerve  alterations  and  inflammatory  findings  in  Sjögren’ssyndrome  offer  an  explanation  for  the  corneal  hypersensitivity  or  even  chronic  pain  orhyperalgesia  often  observed  in  these  patients.  In  severe  cases  of  disabling  chronic  pain  inpatients with dry eye or  after LASIK, when conventional  therapeutic possibilities  fail  to offerrelief, consultation of a physician specialized in pain treatment is recommended.

10

INTRODUCTION

The  cornea  is  an  avascular  and  delicate  optically  transparent  tissue.  Its  transparency  ismaintained by metabolically active pump systems located mainly in the endothelium.  Cornealsensory  nerves  also  have  a  crucial  role  in  maintaining  corneal  architecture  and  transparency.The cornea is one of the most densely innervated peripheral tissues in humans. Corneal nervesinterfere  with  epithelial  mitotic  activity  and  proliferation,  and  presumably  also  with  theregulation of keratocyte function. Secretion of tear fluid is also regulated by the corneal nervesforming the afferent loop of the cornea­lacrimal gland reflex arc. Several systemic and cornealdisorders as well as ocular  surgery  may damage  the corneal  nerves and  impair  their  function.Consequently,  the  regulation  of  epithelial  cell  and  keratocyte  metabolism  and  also  tearformation and corneal sensitivity are disturbed until innervation is restored.

Corneal refractive surgery (PRK and LASIK) severs corneal sensory nerves,  impairing cornealsensitivity and  function. Corneal nerve regeneration begins  shortly, but  the original  fine nervearchitecture may never be completely restored. Patients experience varying degrees of dry eyesymptoms for a 1­ to 6­month period following refractive surgery. Occasionally, extensive dryeye symptoms or even ocular pain may persist for years, with or without dry eye signs. On theother hand, patients may have clinical signs compatible with dry eye, but present with minimalor no symptoms.

Dry  eye  is  a  common  external  eye  disease  that  arises  from  a  wide  variety  of  etiologies.Sjögren’s syndrome (SS) is a systemic autoinflammatory disorder of unknown etiology, and dryeye  is one of  its major  manifestations. Primary Sjögren’s syndrome (pSS) occurs without anyassociation  with  other  rheumatological  diseases.  Consequently,  it  represents  a  relativelyhomogeneous group of patients.

Patients  presenting  with  symptoms  compatible  with  dry  eye,  but  with  minimal  or  no  dry  eyesigns  found on ocular  examination  are  relatively  frequently  seen  after  refractive  surgery.  Thegoal of  this  thesis was to explore the reasons behind this clinical discrepancy by  investigatingcorneal nerves and sensitivity in patients after refractive surgery and in patients with SS.

11

REVIEW OF THE LITERATURE

1. Corneal structure

The cornea is an avascular tissue accounting for most of the refractive power of the human eye.Due  to  its  transparency,  it  allows  light  to  enter  the  eye  and  to  be  projected  to  the  retina.According  to  a  recent  meta­analysis,  the  average  thickness  of  the  central  cornea  is  534  µmcentrally,  although values are affected by measurement techniques:  for slit­lamp­based opticalpachymetry,  the mean central corneal  thickness  is 530  m, and  for ultrasonic pachymetry 544

m  (Doughty  and  Zaman  2000).  The  normal  cornea  is  thinnest  in  the  center  and  thickestperipherally, measuring approximately 650  m.

Anatomically, the cornea can be divided into five sublayers: 1. epithelium, 2. Bowman’s layer,3. stroma or substantia propria, 4. Descemet’s membrane, and 5. endothelium.

The  epithelium  consists  of  5­7  layers  of  nonkeratinized  squamous  epithelial  cells,  measuring50–60  m  in  thickness.  Three  morphological  cell  types  are  present  in  human  cornealepithelium:  superficial  epithelial  cells,  intermediate  wing  cells,  and  the  innermost  basalepithelial  cells  (Ehlers  1970).  The  corneal  epithelium  is  a  dynamic  tissue  in  which  cells  areconstantly renewed and lost; nevertheless, the total mass is kept steady by mechanisms not yetfully  elucidated.  A  strong  body  of  evidence  suggests  that  corneal  epithelial  cells  arise  fromlimbal stem cells (reviewed by Tseng 1989 and Dua et al. 2000). Once inside the cornea, cellsslowly move towards the apex in a centripetal fashion; this is supported by the XYZ theory byThoft  and  Friend  (1983)  as  well  as  by  various  clinical  observations  (Bron  1973,  Kaye  1980,Lemp  and  Mathers  1989).  Evidence  for  the  XYZ  theory  has  also  been  gained  from  in  vivoconfocal microscopy studies (Auran et al. 1995) and experimental in vivo studies on transgenicmice (Nagasaki and Zhao 2003).

Superficial  epithelial  cells,  which  form  a  barrier  against  foreign  substances,  are  connected  toeach other by tight junctions and desmosomes. They have numerous microvilli and microplicaeon  their  surfaces  that  increase  the  adherence  of  tear  fluid  mucins.  The  life  span  of  surfaceepithelial cells is only a few days, after which they are shed in tear fluid. The intermediate wingcells  form 2–3 layers beneath the surface epithelium and have wing­like extensions. The basalepithelial cells  form a monolayer of cells anchored tightly to the basement membrane with theaid  of  hemidesmosomes  and  different  anchoring  fibrils  (Gipson  et  al.  1989).  Basal  epithelialcells  have  limited  capacity  to  divide  before  terminal  differentiation,  thus  being  partly

12

responsible  for  the  excellent  capability  of  the  epithelium  to  regenerate  (Hanna  and  O’Brien1960, Kruse et al. 1990, reviewed by Li et al. 2007).

Bowman’s  layer  was  first  described  by  Sir  William  Bowman  at  the  London  OphthalmicHospital  (Moorfields)  in  1847.  Bowman’s  layer  separates  the  epithelium  from  the  stroma,acting as an anterior limiting membrane and giving tensile strength to the cornea. In Bowman’slayer, individual collagen fibrils are interwoven densely to form a felt­like sheet. The thicknessof this acellular layer is 8 ­12  m (Komai and Ushiki 1991).

The stroma, or substantia propria, consists of keratocytes, extracellular matrix, and nerve fibers.The stroma constitutes the largest portion of the cornea; its thickness is approximately 470  m.Three hundred to five hundred collagen lamellae running from limbus to limbus are oriented atprecise  angles  with  respect  to  adjacent  lamellae,  contributing  to  corneal  transparency  andstrength  (Komai  and  Ushiki  1991,  reviewed  by  Ihanamäki  et  al.  2004).  Stromal  collagenlamellae (consisting of  types I, III, V, XII, and XIII) are surrounded by several proteoglycansresponsible for proper spacing of collagen and stromal hydration (reviewed by Ihanamäki et al.2004).

Descemet’s membrane dividing the stroma from the endothelium acts as a basement membranefor the endothelium. The thickness of Descemet’s membrane gradually  increases  from birth (3µm) to adulthood (8­10  m) (Johnson et al. 1982).  The endothelium  is a monolayer of 5­ m­thick cells and is the innermost layer of the cornea, functioning in fluid pumping and regulationof  corneal  hydration.  Endothelial  cells  are  not  known  to  be  capable  of  dividing,  thus  lackingmitotic activity (Nishida 2005).

Figure 1. Schematic drawing of cornea: 1) epithelium, 2) subbasal nerve plexus and Bowman’s layer, 3)stromal nerves, 4) stroma, and 5) Descemet’s membrane and endothelium.

12

34

5

13

2. Corneal innervation and sensitivity

Corneal afferent sensory neurons are derived from the Gasserian ganglion and enter the eye ballvia long ciliary nerves, which are branches of the nasociliary portion of the ophthalmic divisionof the trigeminal nerve. In some cases, the inferior cornea receives additional  innervation fromthe maxillary  branch  of  the  trigeminal  nerve  (Zander  and  Weddel  1951,  Ruskell  1974,  Rozsaand Beuerman 1982).   Long ciliary  nerves are  myelinated until  they penetrate the  limbus andform  nerve  bundles  surrounded only  by  the Schwann’s cells  (Zander  and  Weddel  1951).  Theabsence of myelin on central corneal axons is essential for maintaining corneal transparency. Inthe human cornea,  thick nerve trunks move  from  the periphery below the anterior  third of thestroma  due  to  organization  of  collagen  lamellae  (Muller  et  al.  2001,  Radner  and  Mallinger2002).  Nerve  fibers  run  forward  in  a  radial  fashion  towards  the  center  of  the  cornea  andpenetrate  Bowman’s  layer,  then  turning  abruptly  and  continuing  parallelly  to  the  cornealsurface,  simultaneously  losing  their  Schwann’s  cell  ensheathment  (Schimmelpfennig  1982,Muller et al. 1996). Nerve fibers  form a network by branching both vertically and horizontallybetween Bowman’s  layer  and  basal  epithelial  cells;  this  network  is  called  the  subbasal  nerveplexus  (Muller et  al. 1997). Nerve terminals are  then sent between epithelial cells  (Rozsa andBeuerman  1982),  electromicroscopic  studies  have  shown  evidence  that  nerve  terminalsinvaginate both basal epithelial cells and wing cells (Muller et al. 1996). Beaded nerve  fibers,with a  diameter of approximately 2 µm, contain  many  mitochondria and glycogen,  indicatingactive metabolism, and are thought to also contain neuropeptides (Muller et al. 1996). Most ofthe corneal neurons are classified as C­type, with a conducting velocity less than 2 m/s, and therest are myelinated A ­type axons,  typically with conduction velocities between 2 and 15 m/s(Belmonte and Tervo 2005).

Figure  2.  After  the  stromal  nerves  have  penetrated  Bowman’s  layer,  they  run  parallel  to  the  cornealsurface between the basal epithelium and Bowman’s layer, forming a neural network called the subbasalplexus. 1) Wing cells 2) basal epithelial cells, and 3) Bowman’s layer.

2

3

1

14

Several  neural  transmitters  and  neuropeptides  have  been  demonstrated  in  the  corneal  nerves.Substance  P  (SP)  (Tervo  et  al.  1982),  calcitonin  gene­related  peptide  (CGRP)  (Stone  et  al.1986),  and  galanin  (GAL)  (Jones  and  Marfurt  1998)  are  of  sensory  origin.  Catecholamines(Toivanen et al. 1987) and neuropeptide Y (NPY) (Jones and Marfurt 1998) are of sympatheticorigin,  and  galanin  (GAL)  (Jones  and  Marfurt  1998),  cholecystokinin  (CCK)  (Stone  et  al.1984), vasoactive intestinal peptide (VIP) (Jones and Marfurt 1998), and methionine­enkephalin(M­ENK) (Jones and Marfurt 1998) are of parasympathetic origin.

Development  of  modern  corneal  imaging  techniques,  such  as  in  vivo  confocal  microscopy(IVCM),  has  enabled  corneal  nerves  in  living  corneas  to  be  analyzed.  IVCM  allowsvisualization  of  the  subbasal  nerve  plexus,  and  is  also  used  in  imaging  normal  corneas(Oliveira­Soto and Efron 2001, Grupcheva et al. 2002 and Patel et al. 2005), patients after PRK(Heinz et al. 1996, Kauffmann et al. 1996, Linna and Tervo 1997, Bohnke et al. 1998, Frueh etal. 1998, Moilanen et al. 2003, Erie et al. 2005b), patients after LASIK (Kauffmann et al. 1996,Linna  et  al.  2000,  Lee  et  al.  2002,  Calvillo  et  al.  2004,  Bragheeth  and  Dua  2005,  Erie  et  al.2005b), patients with herpetic keratitis (Rosenberg et al. 2002), patients with keratoconus (Pateland McGhee 2006), patients with diabetes mellitus (Rosenberg et al. 2000b), and patients withvarious  corneal  dystrophies,  e.g.  epithelial  basement  membrane  dystrophy  (Rosenberg  et  al2000a), lattice dystrophy type II  (Rosenberg et al. 2001), cornea plana (Vesaluoma et al. 2000),and  Fuchs’  dystrophy  (Mustonen  et  al.  1998).    Patel  et  al.  (2005)  have  developed  a  noveltechnique to elucidate the overall distribution of subbasal nerves  in the human cornea by  laserscanning in vivo confocal microscopy. Multiple  images are obtained  from several  locations  inthe cornea, and overlapping images are later reconstructed to confluent montages. With the aidof this novel technique, they observed that subbasal nerves were settled in a whorl­like pattern,similar  to that seen  in the epithelium  in corneal verticillata. On the basis of  their observations,they hypothesized that epithelial cells and nerves would migrate centripetally  in tandem (Patelet al. 2005).

Normal corneal sensitivity is higher in the center of the cornea than at the periphery (Millodotand  Larson 1969). Accordingly,  the  central  cornea  is  5­6  times  more  densely  innervated  thanthe  peripheral  cornea  (Muller  et  al.  1997).  The  cornea  is  one  of  the  most  densely  innervatedperipheral tissues in humans; the nerve density is estimated to be 300–400 times higher than in,for  example,  the  human  finger  (Rozsa  and  Beurman  1982,  reviewed  by  Muller  et  al.  2003).Based on electrophysiological studies, different functional types of sensory nerve fibers exist inthe  cornea.  The  majority  of  corneal  nerves  are polymodal  nociceptors  (70%),  which  areactivated  by  near­noxious  mechanical  energy,  heat,  chemical  irritants,  and  a  large  variety  ofendogenous  chemical  mediators. Mechano­nociceptors,  accounting  for  15­20%  of  cornealperipheral axons, respond only to coarse mechanical  forces  in the order of magnitude close tothat required to damage corneal epithelial cells. Cold­sensitive thermal axons accounting for the

15

remaining 10­15% of corneal peripheral axons, respond by increasing their firing rate when thecorneal temperature falls below normal levels (reviewed by Belmonte et al. 2004, Belmonte andTervo  2005).  Several  corneal  diseases,  corneal  dystrophies,  and  ocular  surgery  may  cause  adecline  in corneal  sensitivity  (reviewed by  Muller et  al.  2003).  In addition,  corneal  sensitivityhas  been  reported  to  diminish  with  increasing  age  (Millodot  1977),  although  the  density  andorientation of the subbasal nerves seem to be unaffected (Erie et al. 2005a).

Corneal  sensitivity  can  be  tested  in  the  clinical  setting  by  gently  touching  the  ocular  surfacewith a wisp of cotton and observing the blink reflex or by comparing the subjective sensationwith  that  evoked  from  the  other  eye.  This  information  is  easily  obtained  in  clinical  settings.However,  the  results are not quantified and  represent only an approximation of  the  functionalstatus  of  corneal  nerves.  The  Cochet­Bonnet  esthesiometer  represents  a  more  quantitativeapproach  and  uses  a  calibrated  nylon  hair  of  variable  length.  It  measures  mainly  coarsemechanical  sensation  and  cannot  discriminate  between  mechanical,  thermal  and  chemicalsensations.  Moreover,  it  has  a  limited  ability  to  accurately  measure  corneal  sensitivity  at  lowstimulus thresholds compared with modern noncontact gas esthesiometers (Murphy et al. 1998).The noncontact gas esthesiometer uses an air  jet of adjustable  flow and  temperature that maycontain CO2 in a variable concentration to reduce local pH. This allows mechanical, thermal, orchemical  stimulation  of  a  specific limited  area  of  the  cornea  (Belmonte  et  al.  1999).  Thenoncontact  gas  esthesiometer  is  more  accurate  and  has  better  repeatability  than  the  Cochet­Bonnet esthesiometer (Murphy et al. 1998).

3. Neurosecretorial regulation of tearing

Main lacrimal glands are innervated by parasympathetic and sympathetic nerves (Botelho et al.1966, Sibony et al.  1988).  In addition,  scarce  sensory  nerves have been  identified  in  lacrimalglands  (Botelho  et  al.  1966).  Nerves  are  located  in  close  proximity  to  acinar,  ductal,  andmyoepithelial cells as well as to blood vessels (Botelho et al. 1966, Sibony et al. 1988).

Stimulation  of  the  lacrimal  gland  and  secretion  occur  via  the  cornea  –  trigeminal  nerve  –brainstem – facial nerve – lacrimal gland reflex arc. Afferent sensory nerves of the cornea andconjunctiva  are  activated  by  stimuli  to  the  ocular  surface.  Efferent  parasympathetic  andsympathetic  nerves  are  then  activated  to  stimulate  secretion  from  acinary  and  tubular  cells(Botelho 1964). Neurotransmitters and neuropeptides released by lacrimal gland nerves includeacetylcholine  (Botelho  1964),  vasoactive  intestinal  peptide  (VIP)  (Uddman  et  al.  1980),neuropeptide Y (NPY) (Tsukahara and Jacobowitz 1987),  substance P  (Nikkinen et al.  1984),and calcitonin gene­related peptide (CGRP) (Tsukahara and Jacobowitz 1987).

16

While regulation of  tearing  is under  tight neural control,  a  loss of  innervation  in  the  inflamedlacrimal gland has been suggested to explain associated decreased secretory function in SS dryeye  (Hakala and Niemelä 2000). Accordingly,  lymphocytic  infiltration of  lacrimal glands wasassociated  with  decreased  reflex  tearing  (Schirmer’s  test  II  with  nasal  stimulation)  in  dry  eye(Tsubota  et  al.  1996).      However,  several  studies  have  shown  that  viable  nerves  do  exist  innonfibrotic areas of lacrimal glands, while they are absent in fibrotic areas (Zoukhri et al. 1998aand Zoukhri et al. 1998b). Hence, the lack of lacrimal gland secretion in SS cannot be explainedby a loss of neural support. Zoukhri and Kublin (2001) found that remaining nerves were unableto release their neurotransmitters and this also correlated with the lack of lacrimal gland proteinsecretion. In conclusion, autonomic nerves  in the lacrimal gland are not lost in SS dry eye, butthe  inability  to  release  their  neurotransmitters  seems  to  play  an  important  role  in  impairedlacrimal gland secretion.

4.           Tear fluid cytokines

Corneal  cells  are  known  to  express  different  cytokines  and/or  their  receptors  potentiallymodulating wound healing (Wilson et al. 1992, 1994a, 1994b, 1996a, Li and Tseng 1996).

The transforming growth factor (TGF) –   family, consisting of TGF­β1, TGF­β2, and TGF­β3,are polypeptides of approximately 25 kDa (Kokawa et al. 1996). TGF­  is generally thought toinhibit  epithelial,  endothelial,  and  leukocyte  cell  growth  and  to  stimulate  proliferation  offibroblasts  (Song et  al.  2002). TGF­β2  seems  to  be  the  major  isoform  present  in  all  types  ofcorneal cells (Nishida et al. 1995), but TGF­β1 has also been detected in small amounts  in allcorneal  layers (Wilson et al. 1992, Nishida et al. 1995). In addition, TGF­β1 and 2 have beenshown to be present  in human tear fluid (Gupta et al. 1996, Kokawa et al. 1996, Vesaluoma etal.  1997a).  TGF­β1  and  2  are  produced  and  TGF­β1  secreted  by  the  human  lacrimal  gland,suggesting that the lacrimal gland may be one source of TGF­β in human tear fluid (Yoshino etal.  1996).  TGF­ β 1  is  involved  in  the  regulation  of  keratocyte  activation,  myofibroblasttransformation, proliferation, chemotaxis, and wound healing after refractive surgery, and  it  isstrongly  associated  with  excessive  scarring  (Jester  et  al.  1996,  1999,  Andresen  et  al.  1997,Myers et al. 1997, Andresen and Ehlers 1998, Moller­Pedersen et al. 1998b, Jester et al. 2003).

Platelet­derived growth factor (PDGF) is a cysteine knot­containing dimer of 35 kDa composedof an A and B chain. It exists as  isomers PDGF­AA, PDGF­AB, and PDGF­BB (reviewed byJones and Kazlauskas 2001). PDGF­BB is produced by corneal epithelial cells and is bound athigh  levels  in  the  epithelial  basement  membrane  (reviewed  by  Wilson  et  al.  2001).  PDGFreceptors are found in corneal fibroblasts (Li and Tseng 1996).  PDGF­BB has also been shown

17

to  have  mitogenic,  chemotactic,  and  migratory  effects  on  corneal  fibroblasts  in  vitro(Hoppenreijs  et  al.  1993,  Andresen  et  al.  1997,  Andresen  and  Ehlers  1998,  Kamiyama  et  al.1998, Kim et al. 1999, Jester et al. 2002).

Tumor  necrosis  factor­α (TNF­α),  on  the  other  hand,  is  an  inducer  of  apoptosis,  which  issupposed  to  play  an  important  role  in  the  first  steps  of  corneal  wound  healing  after  PRK(Wilson et al. 1996a, 1996b, Helena et al. 1998). TGF­β1, TNF­α, and PDGF­BB are present inlow concentrations in human tear fluid, and PRK induces an increased release of TGF­β1, TNF­α, and PDGF­BB during the early days of wound healing (Gupta et al. 1996, Vesaluoma et al.1997a, 1997b, 1997c).

5. Corneal wound healing

Corneal  wound  healing  is  a  complex  physiologic  sequence  of  events  that  contributes  to  re­establishment  of  normal  function  and  clarity  of  the  cornea.  Interindividual  variations  in  thewound  healing  process  after  all  keratorefractive  procedures  are  the  major  determinants  ofsurgical  outcome.  The  wound  healing  process  plays  a  critical  role  in  overcorrection,undercorrection,  regression,  and other  complications as well as  in corneal haze and  refractiveinstability.  Major  challenges  of  corneal  refractive  surgery  are  to  control  the  wound  healingprocess more precisely and to promote more tissue regeneration than tissue fibrosis (Stramer etal. 2003, reviewed by Fini and Stramer 2005).

Interaction  between  the  corneal  epithelium  and  stroma  is  a  well­known  phenomenon  and  acritical step in corneal wound healing. Removal of the epithelium induces disturbances in ATPcontent of anterior keratocytes (Herrman and Lebeau 1962), and the anterior stroma beneath theepithelial  wound becomes acellular within  the  following 24 h  (Nakayasu 1988, Campos et al.1994).  Initially,  the  keratocyte  loss  was  thought  to  be  the  result  of  mechanical  trauma  orosmotic  changes  (Dohlman  et  al.  1968).  However,  more  recently,  the  loss  of  keratocytesfollowing epithelial removal has been shown to be mediated primarily by apoptosis (Wilson etal.  1996a,  1996b,  Gao  et  al.  1997,  Helena  et  al.  1998,  Kim  et  al.  1999).  Among  others,interleukin – 1  (IL­1 ) and TNF­  are released from the injured corneal epithelium and induceautocrine suicide in keratocytes by activating the Fas / Fas­ligand system (Wilson et al. 1996b,Mohan et al. 1997, reviewed by Wilson et al. 2001).

After stromal keratocyte loss due to apoptosis, stromal cells adjacent to the wound area becomeactivated  and  proliferate.  The  activated  keratocytes  migrate  to  the  wound  area  (Hanna  et  al.1989, Del Pero et al.  1990, Zieske et al.  2001), and  five days after wounding,  these  migrated

18

keratocytes  in  the wound  area undergo  subsequent  rounds  of  cell  division  and  repopulate  thewound area (Zieske et al. 2001).

Table 1. Characteristic differences in activated keratocytes.

FibroblastsMyofibroblasts /

Altered keratocytes

Presence in epithelial abrasions + ­

Presence in wounds penetrating Bowman’s layer + +

Association with wound fibrosis ­ +

Biomechanical activity less active active

Expression of  ­smooth muscle actin ­ +

Expression  of  collagens,  fibronectin,  and  other  matrixproteins ­ +

Expression of MMPs upregulated downregulated

The extent of the  initial wound, especially whether or not the epithelial basement membrane  isdisrupted, results in different phenotypes of activated keratocytes: fibroblasts or myofibroblasts/altered  keratocytes  (Table  1).  Wounds  that  penetrate  the  basement  membrane,  such  askeratectomy,  lead  to  the  presence  of  myofibroblasts  in  the  wound  area,  while  after  pureepithelial abrasions with an intact basement membrane, myofibroblast are not present (Moller­Pedersen  et  al.  1998b,  Zieske  et  al.  2001).  Fibroblasts  are  less  biomechanically  active,synthesize  matrix  metalloproteinases  (West­Mays  et  al.  1997,  Bargagna­Mohan  et  al.  1999),and  are  associated  with  corneal  ulceration  (Riley  et  al.  1995,  Hargrave  et  al.  2002).Myofibroblasts,  by  contrast,  are  associated  with  wound  fibrosis,  synthesize  collagen,fibronectin,  and  other  matrix  proteins  (Ohji  et  al.  1993,  Jester  et  al.  1996),  and  havedownregulated matrix metalloproteinase production (Girard et al. 1991, Fini et al. 1995, West­Mays  et  al.  1999).    Myofibroblasts  express  ­smooth  muscle  actin  and  have  well­developedfocal  adhesions,  while  fibroblasts  do  not  express  ­smooth  muscle  actin  and  have poor  focaladhesions  (Jester  et  al.  1995,  1996,  Petridou  et  al.  2000).  Myofibroblasts  have  strongbiomechanical involvement in matrix organization and wound contraction. Excess proliferationof  stromal  fibroblasts  and  myofibroblasts  results  in  stromal  hyperplasia  and  clinical  haze,affecting  optical  transparency  of  the  cornea  (Moller­Pedersen  et  al.  1998a,  1998b).  TGF­seems  to  be  the  most  essential  cytokine  in  orchestrating  the  transformation  process  ofmyofibroblasts  (Jester  et  al.  1997,  2003).  However,  in  the  cornea,  the  synergistic  function  of

19

TGF­  and PDGF  via  integrin  signaling pathways  is needed  for  myofibroblast  transformation(Jester et al. 2002).

The  epithelial  healing  process  requires  epithelial  cell  proliferation,  migration,  anddifferentiation.  The  combination  of  cytokines  and  growth  factors  present  in  corneal  cells  andtear fluid regulates the early epithelial wound healing cascades. Paracrine cytokine trafficking inthe human cornea presents a unique stromal / epithelial interaction (Wilson et al. 1994a).

Cytokines  responsible  for  epithelial  proliferation  are  keratinocyte  growth  factor  (KGF),hepatocyte  growth  factor  (HGF),  and  epidermal  growth  factor  (EGF)  (Wilson  et  al.  1993,1994b,  1994c,  Tervo  et  al.  1997).  Epithelial  proliferation  is  further  stimulated  by  increasedlevels of PDGF­BB (Li and Tseng 1997). Elevated production of KGF and HGF by keratocytesis present up to 7 days after corneal  injury (Wilson et al. 1999a). In addition,  increased reflextear  fluid  production  results  in  higher  availability  of  HGF  (Tervo  et  al.  1997),  PDGF­BB(Vesaluoma et al. 1997c), and EGF (van Setten 1990). Enhanced expression of mRNA for EGFand HGF is present in the  lacrimal gland after wounding, contributing to greater availability intear  fluid  (Wilson  et  al.  1999b).  In  addition,  mRNAs  for  EGF  and  HGF  receptors  areconcurrently upregulated in the epithelium and keratocytes (Wilson et al. 1999a).

Migration  of  epithelial  cells  at  the wound  periphery  is  induced by  HGF  (Li  and  Tseng  1997)and EGF (Wilson et al. 1994c) on a provisional fibronectin matrix that accumulates around thewound (Maldonado and Furcht 1995). Fibronectin is not present in the normal corneal epithelialbasement membrane, but 8 h after wound healing it  is detected in the epithelium (Fujikawa etal. 1984). Endogenously produced fibronectin by corneal epithelial cells promotes cell adhesion(Ohji et al. 1993). Elevated levels of fibronectin are also found in human tear fluid after PRK,promoting epithelial cell migration and attachment (Virtanen et al. 1995).

Once  epithelial  confluence  is  achieved,  the  epithelial  cells  are  triggered  to  proliferate  andsequentially differentiate to  form a normal  corneal  stratified epithelium (Wilson et al.  1994c).Normal  composition  of  the  basement  membrane  is  achieved  by  restoring  collagens  andlaminins,  which  occurs  when  the  fibronectin  matrix  disappears  (reviewed  by  Suzuki  et  al.2003).

20

6. Antigen­presenting cells

In 1867, Engelman noted dendritic or polygonal cells in the corneal epithelium. One year later,a medical  student Paul Langerhans observed dendritic  cells  in  the  skin  epidermis. Similaritiesbetween corneal dendritic cells and Langerhans cells of the skin have since been proposed. Thecornea is an immune privileged tissue and has long been considered to lack antigen­presentingcells  (APC)  (Gillette  et  al.  1982).  Today,  APCs  are  known  to  play  a  critical  role  in  cornealimmunology in both health and disease (Hamrah et al. 2002, Rosenberg et al. 2002, Hamrah etal. 2003a, 2003b, Zhivov et al. 2005, 2007, Mastropasqua et al. 2006).

Two  distinct  phenotypic  populations  of  APCs  in  the  normal  cornea  have  been  reported.Immature APCs, which do not express MHC class II antigen on their surface, tend to be locatedin the central corneal epithelium. Immature APCs have a large cell body with only a few shortprocesses,  if  any  (Hamrah  et  al.  2003a).  These  APCs  are  able  to  capture  the  antigen,  but  areunable to present to lymphocytes. Mature APCs, by contrast, have a slender nucleated cell bodyfrom which mazes of  long  membrane processes extend  that  resemble dendrites of nerve cells.Mature APCs, expressing MHC class II antigen, are found in the peripheral corneal and limbalepithelium (Hamrah et al. 2002, 2003a, 2003b).

The evolution of corneal  in  vivo  imaging  techniques has provided new data  regarding  humancorneal  APCs  in  living  tissue. The density of  APCs declines  from  the  limbus  to the center ofhealthy corneas (Hamrah et al. 2002, Zhivov et al. 2005, 2007, Mastropasqua et al. 2006). In thecorneal  limbal  epithelium,  dendritic  cells  are  found  in  virtually  every  healthy  subject,  whileonly 20–30% of healthy controls show APCs  in  the central cornea  (Zhivov et al.  2005, 2007,Mastropasqua et al.  2006). More often APCs are present  in  the peripheral cornea, where  theyshow  signs  of  a  mature  phenotype  with  long  slender  dendritic  processes,  whereas  immatureAPCs without dendrites typically predominate in the central cornea (Zhivov et al. 2005). Mostof  the  APCs  are  located  at  the  level  of  subbasal  cells  or  among  the  subbasal  nerve  plexus(Zhivov et al. 2005).

7. Excimer laser

The excimer laser used to sculpt the cornea has been the single most important advancement inthe  field  of  refractive  surgery.  Excimer  laser  keratectomy  involves  remodeling  the  cornealstroma by tissue removal. The advantage of the excimer laser is its ability to remove tissue witha microscopic precision unattainable with other procedures.

21

Excited dimers  are  molecules with  bound  upper  states  and  weakly  bound  ground  states.  Thereaction  of  an  excited  rare  gas  atom  with  a  halogen  atom  produces  excited  dimers  that  emitultraviolet  radiation  when  decaying  from  the  bound  upper  state  to  the  rapidly  dissociatingground state. Trokel et al.  (1983) demonstrated that  far­UV  laser  emissions (between 150 and200 nm) can precisely  remove corneal  tissue without apparent thermal  trauma  to the adjacenttissue. According to several experimental studies, the 193 nm UV light from the argon fluoridelaser was established as the optimal wavelength with the least corneal  transmission. The high­energy UV photons emitted by the  argon fluoride laser caused less adjacent thermal trauma andcreated smoother ablation than longer wavelength lasers (Trokel et al. 1983).

8. Photorefractive keratectomy – PRK

Photorefractive keratectomy (PRK)  is  based on  the use of excimer  laser  for  accurate removaland resculpturing of corneal tissue in order to change the corneal curvature and refractive powerof  the  cornea.  Before  excimer  laser  photoablation,  the  epithelium  must  be  removed  eithermechanically with a blunt spatula or brush, or by excimer  laser (Trokel et al. 1983, Seiler andWollensak 1991, Palllikaris et al. 1994, Gimbel et al. 1995).

Figure  3.  Myopic  PRK.  After  the  epithelium  is  removed  either  mechanically  or  by  excimer  laser,Bowman’s layer, subbasal nerves, and the anterior stroma, including stromal nerves, are photoablatedby excimer  laser. The depth of ablation depends on  the magnitude of dioptric correction. Accordingly,stromal nerves are destroyed to a variable extent depending on ablation depth.

Clinical studies have shown relatively good safety, predictability, and refractive  results  in  lowto  moderate  myopia  (Seiler  and  Wollensak  1991,  Gartry  et  al.  1992,  McDonald  et  al.  1999).However,  deeper  ablation  depths  and  higher  corrections  produce  a  greater  incidence  ofpostoperative haze and regression and less predictable refractive results (Seiler et al. 1992, Shahet al. 1998).

22

8.1 Nerve regeneration after PRK

PRK photoablates Bowman’s layer, subbasal nerves, and anterior stromal nerves in the ablationzone, leaving sharply cut nerve trunks at the base and margin of the wound (Tervo et al. 1994,Trabucchi  et  al.  1994).  The  degree  of  stromal  nerve  destruction  depends  on  the  requiredablation  depth.  Considerable  data  exists  on  corneal  nerve  regeneration  after  PRK,  includingboth experimental and human studies done by in vivo confocal microscopy (IVCM).

Experimental  studies  using  histochemical  methods  have  shown  that  nerve  regeneration  afterPRK is a biphasic process (Rozsa et al. 1983, Beuerman and Rozsa 1984, Tervo et al. 1994). Inthe first phase,  the reinnervated subbasal plexus  is  formed by  fine neurites that originate  fromthe  cut  peripheral  nerve  plexus  and  extend  centrally  alongside  the  migrating  epithelial  cells(Rozsa  et  al.  1983,  Beuerman  and  Rozsa  1984,  Tervo  et  al.  1994).  Neurofilamentimmunoreactivity can be observed as early as 24 h after the procedure (Trabucchi et al. 1994).The  second  phase  of  nerve  regeneration  is  initiated  by  the  degeneration  of  wound­orientedneurites  and  the  concomitant  appearance  of  a  second  generation  of  stromal  neurites  thatultimately  re­establish a new subbasal plexus  (Rozsa et al.  1983, Beuerman and Rozsa 1984).The second­phase neurites originate from the transected stumps of stromal nerves at the woundbase  and  the  wound  margin  (Rosza  et  al.  1983).  The  regenerating  stromal  nerves  reach  theepithelium and contribute to the formation of a new subbasal plexus 6 months after PRK (Tervoet al. 1994, Trabucchi et al. 1994). Trabucchi et al. (1994) observed a regenerated nerve plexusat 1–4 months after surgery that actually appeared thicker  than normal.  Ishikawa et al.  (1994)noted  a  transient  increase  in  intraepithelial  nerves  after  PRK,  the  density  returning  to  normallevels  by  about  7  months  after  surgery.  Normal  density  of  intraepithelial  nerve  endings  wasreached 3 months after PRK (Tervo et al. 1994). However, the morphological alterations in theepithelial  nerves  persisted  for  as  long  as  12  months  after  the  procedure,  with  stromal  nervealterations also being present (Tervo et al. 1994).

In  vivo  confocal  microscopy  (IVCM)  enables  imaging  of  the  living  cornea,  allowingobservation of  the regeneration of subbasal nerves after PRK.   The  first regenerating subbasalnerves have been seen as early as one week after PRK (Linna and Tervo 1997). At one monthafter PRK, subbasal nerves were observed in only 1 of 18 eyes (Frueh et al. 1998). Partial or insome cases  total  recovery of  subbasal  nerves has been  reported  to occur at 8­12 months afterPRK (Corbett  et  al. 1996, Kauffman et al. 1996). However,  even at 5  years after PRK, somecorneas  do  not  achieve  a  normal  pattern  of  subbasal  nerve  morphology,  although  the  meansubbasal nerve density does not differ from that of normal controls (Moilanen et al. 2003). In arecent  prospective  longitudinal  study,  preoperative  levels  of  nerve  density  were  achieved  2years after myopic PRK, and the levels remained stable during the 5­year follow­up (Erie et al.2005b).

23

8.2 Corneal sensitivity after PRK

The early postoperative decline in corneal sensitivity is followed by a relatively fast recovery ofsensation  in  the  following  3  months,  when  preoperative  levels  also  in  the  central  cornea  areachieved (Perez­Santonja et al. 1999, Matsui et al. 2001, Kumano et al. 2003, Lee et al. 2005).Interestingly, in some studies, no decrease in corneal sensitivity after PRK was observed duringthe  follow­up  (Kumano et al.  2003), while  in another  study a  time period of up to 12 monthsafter PRK was needed to achieve normal sensitivity  levels (Nejima et al. 2005). PRK patientsare characterized by higher tear fluid NGF levels 3 months postoperatively. Higher NGF levelscorrelated with faster recovery of corneal sensitivity (Lee et al. 2005). Loss of sensitivity afterPRK seems to be less severe than after LASIK, and the overall rate of recovery of sensitivity topreoperative  levels  is  faster  after  PRK than  LASIK  (Perez­Santonja  et  al.  1999,  Matsui  et  al.2001, Kumano et al. 2003, Lee et al. 2005, Nejima et al. 2005).

9. Laser in situ keratomileusis ­ LASIK

Ionnis  Pallikaris  was  the  first  to  describe  laser  in  situ  keratomileusis  (LASIK)  in  1990(Pallikaris et al. 1990). A hinged corneal flap, consisting of the epithelium, the subbasal nerveplexus, and the anterior stroma, is created with a microkeratome.  After the flap is lifted, cornealsculpturing  is performed on the exposed stromal bed, after which the corneal  flap  is  replaced.The flap adheres spontaneously to the stromal bed, with no suturing required.

Figure 4. Myopic LASIK. A hinged flap, consisting of the epithelium, Bowman’s layer, subbasal nerves,and the anterior stroma, is created using a microkeratome. After the flap is lifted, the corneal stroma issculptured using excimer laser.

24

LASIK is nowadays the most commonly performed procedure in refractive surgery and the firstchoice  for  the correction of  refractive errors  in  the  majority of patients  (Duffey and  Leaming2005). It is a relatively safe, predictable, and effective method for correcting low to moderatelyhigh  (up  to –15 D) myopia, offering  many advantages over other existing procedures such asfast and painless recovery of vision,  less regression, and  less  subepithelial haze (McDonald etal.  2001,  Solomon  et  al.  2002,  Sugar  et  al.  2002).  However,  patients  subjected  to  LASIKsurgery  often  report  dry  eye  symptoms  postoperatively,  and  tear  fluid  abnormalities  arefrequently described (Battat et al. 2001, Hovanesian et al. 2001, Toda et al. 2001, Albietz et al.2004a, De Paiva et al 2006, Shoja and Besharati 2007). These symptoms are the most commonadverse effects of LASIK, causing frustration for both patients and surgeons alike (Sugar et al.2002). LASIK­associated dry eye  is believed  to be attributable  to the severing of  the afferentcorneal nerves during the flap formation. Subbasal nerve bundles and superficial stromal nervebundles  in  the  flap  interface are  cut by  the  microkeratome, with only  nerves entering  the  flapthrough the hinge region being spared. Subsequent sculpturing of corneal stroma using excimerlaser severs stromal nerve fiber bundles (Linna et al. 1998, 2000, Lee et al. 2002, Brageeth andDua 2005, Erie et al. 2005b).

9.1 Nerve regeneration after LASIK

The regeneration of corneal nerves after LASIK has been  investigated  in experimental models(Latvala et  al.  1996, Linna et al.  1998, Fukiage et al.  2007, reviewed by Tervo and Moilanen2003). Thin  regenerating nerve  fibers  form connections with  neighboring stromal  nerve  fibersand penetrate the most anterior acellular stromal layer to send subbasal nerve fibers to form thenerve  terminals  between  epithelial  cells.  Regeneration  of  anterior  stromal,  subbasal,  andepithelial nerve fibers occurs approximately 3 months after LASIK, while deep stromal nervesmay show abnormal morphology even 5 months after the procedure (Latvala et al. 1996, Linnaet  al.  1998). Topically  administered  neurotrophic  factor  pituitary  adenylate  cyclase­activatingpolypeptide  (PACAP)  has  accelerated  neural  regeneration  after  LASIK  in  an  experimentalmodel (Fukiage et al. 2007). Accordingly, topical neurotrophic factors PACAP and NGF seemto  enhance  the  recovery  of  sensitivity  after  LASIK  (Joo  et  al.  2004,  Fukiage  et  al.  2007).However,  lower  tear  fluid NGF  levels after LASIK compared with PRK  in  human have beenaccompanied by slower recovery of sensation (Lee et al. 2005).

In vivo confocal microscopy studies have enabled imaging of the  living human cornea  in  fourdimensions (x, y, z, and t [time]) and have produced abundant information on regeneration andmorphological changes in corneal nerves during the post­LASIK healing process (Kauffmann etal. 1996, Slowik et al. 1996, Linna et al. 2000, Lee et al. 2002, Perez­Gomez and Efron 2003,Avunduk  et  al.  2004,  Calvillo  et  al.  2004,  Bragheeth  and  Dua  2005,  Erie  et  al.  2005b).

25

Degeneration of cut subbasal nerves manifests during approximately one week after surgery, atwhich  time  subbasal  nerve  density  decreases  by  90%  (Linna  et  al.  2000,  Lee  et  al.  2002,Calvillo  2004,  Erie  et  al.  2005b).  Thereafter,  a  slow  regenerative  process  occurs  andregenerating  nerve  fibers  form connections with neighboring nerve  fibers. Prospective studieshave  shown  that  during  the  first  year  after  LASIK,  subbasal  nerve  fiber  bundles  graduallyregenerate,  achieving  numbers  that  nevertheless  remain  more  than  50%  lower  than  beforeLASIK  (Lee  et  al.  2002).  Total  recovery  of  the  subbasal  plexus,  especially  its  morphology,probably never occurs, and a significantly longer period of time than previously assumed seemsto  be  needed.  Subbasal  nerve density  remained < 60% of  preoperative  levels  at  3  years post­LASIK  (Calvillo  et  al.  2004),  and  nerve  density  near  preoperative  densities  was  not  reacheduntil 5 years after LASIK (Erie et al. 2005b).

9.2 Corneal sensitivity after LASIK

An  early  loss  of  corneal  sensitivity  to  coarse  mechanical  stimulation  has  been  reported  afterLASIK,  followed  by  progressive  recovery  of  sensitivity  during  the  following  postoperativemonths.  Corneal  sensitivity  seems  to  be  at  its  lowest  1­2  weeks  after  LASIK,  and  by  6­12months  sensitivity  has  recovered  to  normal  levels  (Kim  and  Kim  1999,  Perez­Santonja  et  al.1999,  Linna  et  al.  2000,  Benitez del  Castillo  et  al.  2001,  Toda  et  al.  2001,  Donnenfeld et  al.2003, 2004, Michaeli et al. 2004, Bragheeth and Dua 2005, Lee et al. 2005). Recovery periodsof over 12 months have also been reported (Nejima et al. 2005). By contrast, the return of near­normal sensitivity levels by 3 weeks post­LASIK has also been described (Chuck et al. 2000).Studies comparing  the  recovery of corneal  sensitivity after PRK and LASIK have utilized  theCochet­Bonnet  esthesiometer,  which  measures  coarse  mechanical  sensation,  but  has  certainlimitations in sensitivity and reproducibility (Murphy et al. 1998). In any case, after LASIK, theloss  of  sensitivity  seems  to  be  more  intense  and  the  time  needed  for  recovery  longer  (Perez­Santonja  et  al.  1999,  Matsui  et  al.  2001,  Kumano  et  al.  2003,  Lee  et  al.  2005).  Interestingly,lower  tear  fluid  NGF  levels  in  humans  after  LASIK,  compared  with  PRK,  have  beenaccompanied by slower recovery of sensation. NGF is known to be a potent neurotrophic factor,and  thus,  tear  fluid  NGF  is  suggested  to  play  a  role  in  recovery  of  sensitivity  as  well  as  inregeneration of corneal nerves (Lee et al. 2005).

More recently,  noncontact gas esthesiometers, which are more sensitive and reproducible thanmechanical  esthesiometers,  have  been  utilized  in  studies  exploring  the  recovery  of  cornealsensitivity  after  LASIK  (De  Paiva  and  Pflugpfelder  2004,  Gallar  et  al.  2004,  Stapleton  et  al.2006).  In  contrast  to  studies  utilizing  mechanical  esthesiometers,  which  report  the  greatestdecrease of sensitivity 1­2 weeks post­LASIK (Linna et al. 2000, Donnenfeld et al. 2004), in theabove study,  corneas were observed  to be hypersensitive at 1 week post­LASIK (Gallar  et al.2004). This was followed by a significant decrease in sensitivity to mechanical stimuli during 3­

26

5 months after surgery.  Corneal sensitivity was close to normal values by 2 years post­LASIK(Gallar  et  al.  2004).  Patients  without  dry  eye  at  1­40  months  after  LASIK  presented  withdecreased  corneal  sensitivity,  while  patients  with  LASIK­associated  dry  eye  showed  cornealhypersensitivity  at  3­36  months  (De  Paiva  and  Pflugfelder  2004).  Corneal  hypersensitivityobserved  in  LASIK­associated  dry  eye  patients  was  suggested  to  result  from  compromisedocular surface barrier function and hypersensitivity to air jet (De Paiva and Pflugfelder 2004).

Several factors influencing the severity of the postoperative decrease in corneal sensitivity andsubsequent recovery have been suggested, including ablation depth, hinge orientation (superioror nasal), hinge width, and flap thickness.

Deep ablations,  thus greater corrections,  result  in a larger decrease  in corneal sensitivity and alonger  recovery  (Kim  and  Kim  1999,  Nassaralla  et  al.  2003,  Bragheeth  and  Dua 2005, Shojaand Besharati 2007). Accordingly,  ablation depth  is a clear  risk  factor  for developing dry eyeafter LASIK (De Paiva et al. 2006, Shoja and Besharati 2007).

Depending on  the  microkeratome used  in  LASIK, the hinge  is positioned either  superiorly ornasally. While long ciliary nerves run and penetrate the cornea at the 3 and 9 o’clock positions,it  has  been  suggested  that  flaps  with  a  superior  hinge  cause  more  severe  nerve  damage  thanthose with  a  nasal  hinge,  which  spares  the  medial  nerve  fibers.  Seemingly  in  agreement  withthis concept, eyes with a nasal hinge were found to have less dry eye symptoms (Donnenfeld etal.  2003)  and  better  corneal  sensitivity  than  eyes  with  a  superior  hinge  during  a  6­monthpostoperative  period  (Donnenfeld  et  al.  2003,  Vroman  et  al.  2005,  Nassaralla  et  al.  2005).However,  a  prospective  randomized  clinical  study  found  no  difference  in  dry  eye  signs  orsymptoms  between  patients  treated  with  superiorly  and  those  with  nasally  hinged  flaps(Ghoreishi et al. 2005).

The narrow hinge of  the  flap resulted  in a more pronounced decline  in corneal  sensitivity andmore severe dry eye than flaps with a broader hinge (Donnenfeld et al. 2004). The thickness ofthe flap has also been suggested to be an important factor in regaining corneal sensitivity; thinflaps with a nasally placed hinge were related to more rapid recovery (Nassaralla et al. 2005).

In  conclusion,  corneal  mechanical  sensitivity,  measured  with  a  Cochet­Bonnet  esthesiometer,decreases  during  the  first  postoperative  weeks,  and  regeneration  of  nerves  coincides  with  therecovery  of  sensitivity,  with  normal  sensitivity  levels  typically  being  achieved  6­12  monthsafter LASIK. However, studies utilizing more sensitive noncontact gas esthesiometers suggestthat alterations in corneal sensitivity may persist for up to 24 months.

27

10. Dry eye

A definition of dry eye was recently produced by the International Dry Eye WorkShop (DEWS2007): “Dry eye is a multifactorial disease of tears and ocular surface that results in symptomsof discomfort, visual disturbance,  and tear  film  instability with potential damage  to the ocularsurface.  It  is  accompanied  by  increased  osmolarity  of  the  tear  film  and  inflammation  of  theocular surface (Lemp et al. 2007).”

Large  epidemiological  studies  have  revealed  the  prevalence  of  dry  eye  at  various  ages  rangefrom 5% to 34% (Smith et al. 2007). However, the definition of dry eye and the diagnostic testsand criteria varied markedly between these studies, and thus, caution is advised in making directcomparisons between the results.

Dry eye  is classified  into two etiopathogenic categories: 1) aqueous tear­deficient dry eye and2) evaporative dry eye.

Aqueous tear­deficient dry eye is further divided into SS dry eye and non­SS dry eye. Non­SSdry eye  includes 1) primary  lacrimal gland deficiencies, e.g. age­related dry eye; 2) secondarylacrimal gland deficiencies such as conditions with  lacrimal gland  infiltration, e.g. sarcoidosis,lymphoma,  acquired  immunodeficiency  syndrome  (AIDS),  or  graft  versus  host  disease;  3)conditions  associated  with  obstruction  of  lacrimal  gland  ducts,  e.g.  trachoma,  cicatricalpemphigoid,  erythema  multiforme,  and  chemical  and  thermal  burns;  4)  conditions  affectingsensory  innervation,  e.g.  herpes  simplex  keratitis,  herpes  zoster  ophthalmicus,  penetratingkeratoplasty,  PRK,  LASIK,  diabetes  mellitus,  and  topical  anesthetic  abuse,  as  well  assecretomotor innervation, e.g. damage to the VII cranial nerve and certain systemic medications(Lemp et al. 2007).

Evaporative  dry  eye  may  be  intrinsic,  with  regulation  of  evaporative  loss  from  the  tear  filmbeing directly affected by, for instance, meibomian lipid deficiency, poor lid congruity, wide lidaperture,  and  low  blink  rate.  Extrinsic  evaporative  dry  eye  embraces  those  etiologies  thatincrease  evaporation  by  their  pathological  effects  on  the  ocular  surface,  including  vitamin  Adeficiency, topical drug preservatives, contact lens wear, and ocular surface disease, e.g. allergy(Lemp et al. 2007).

28

Figure 5. Lacrimal gland functional unit. Stimulation of the free nerve endings in the cornea generatesafferent  nerve  impulses  that  travel  through  the  ophthalmic  division  of  the  trigeminal  nerve  to  thesuperior salivary nucleus in the pons. The nerves synapse and the signal is integrated with cortical andother  input  in  the  pons.  The  efferent  branch  of  the  loop  passes  along  the  nervus  intermedius  to  thepterygopalatine ganglion. Postganglionic fibers then terminate in the main and accessory (Wolfring andKrause) lacrimal glands. Increasing evidence suggests that nerve endings found around the Meibomianglands and conjunctival Goblet cells travel along the same route (Stern et al. 2004).

In the normal  situation,  the ocular surface,  interconnecting nerves, and  lacrimal glands  form afunctional  unit  (Fig.  5)  that  controls  the  major  components  of  the  tear  film  and  responds  toenvironmental, endocrinological, and cortical  influences. If any portion of this funtional unit  iscompromised, lacrimal gland support to the ocular surface is impeded (Stern et al. 2004).

29

11. Dry eye after refractive surgery

All keratorefractive surgical procedures,  including PRK and LASIK, cause morphological andfunctional disturbances of corneal nerves.   Dry eye  is one of  the most common complicationsafter  refractive  surgery  (Hong  and  Kim  1997,  Sugar  et  al.  2002).  It  is  mainly  thought  to  beattributable to the transection of afferent corneal nerves during the lamellar microkeratome cutin LASIK,  and  additional damage caused by excimer  laser photoablation. The ocular  surface,lacrimal  glands,  and  interconnecting  nerves  form  a  functional  unit  (Stern  et  al.  2004),  andimpairment of corneal  nerves  interrupts  the cornea–trigeminal  nerve–brain  stem–facial  nerve–lacrimal gland reflex arc, influencing both reflex and basal tear production.

The  diagnostic  criteria  and  treatment  strategies  for  dry  eye  vary  widely  amongophthalmologists, and among cornea and dry eye specialists. Some clinicians consider clinicalsigns more essential than symptoms. Conversely, other clinicians value symptoms more highlyas  early  evidence  of  ocular  disease.  On  the  other  hand,  little  correlation  exists  between  thesymptoms and clinical  test results in dry eye patients (reviewed by Pflugfelder et al. 2000 andBron 2001, Dogru et al. 2005). The clinical signs of LASIK dry eye include evaluation of tearfilm stability with application of fluorescein to the tear film to measure tear film break­up timeand positive vital staining of the ocular surface with lissamine green, fluorescein or rose bengal.Schirmer’s test with or without anesthesia is considered an important parameter at least for usein studies where statistical trends can be monitored. However, there is no consensus as to whichmethod is most useful or regarding diagnostic cut­offs (reviewed by Bron 2001). Symptoms canbe  monitored using different validated questionnaires  such as the ocular  surface disease  index(OSDI) questionnaire (Schiffman et al. 2000). Punctate epithelial keratopathy detected with rosebengal  or  fluorescein  staining  has  been  noted  in  2­6%  of  eyes  that  have  undergone  LASIK(reviewed by Ang et al. 2001, Wilson 2001), but symptoms of ocular dryness and irritation werenoted in approximately half of the LASIK patients (Hovanesian et al. 2001).

In  addition  to  decreased  reflex  and  basal  tear  production,  impairment  of  corneal  nerves  maylead  to  LASIK­induced  neurotrophic  epitheliopathy  (LINE)  (Wilson  2001,  Wilson  andAmbrosio  2001),  where  punctate  epithelial  microerosions  are  present  on  the  corneal  surface.However, LASIK patients who developed symptoms and signs of dry eye after  the procedurehad no significant difference in tear production detected by Schirmer’s test with anesthesia frompatients with no symptoms or  signs of dry eye at  time­points  from 1 month  to 6 months aftersurgery (Wilson 2001). Soreness of the eye to touch was observed at 6 months more often afterPRK than LASIK, affecting 26.8% and 6.7% of patients, respectively (Hovanesian et al. 2001).This was suggested to be related to symptoms of recurrent erosions.

30

Other  issues potentially contributing  to dry eye symptoms after LASIK  include differences  incorneal  curvature;  while  normal  corneas  show  prolate  profiles,  i.e.  steeper  in  the  center,  andhigh conventional myopic LASIK produces oblate corneas. These changes in corneal curvaturemay  interfere  with  even  tear  distribution,  but  the  mechanical  rubbing  due  to  the  anatomicalchange may also be causative. Moreover, patients who seek refractive surgery are often contactlens intolerant and may have preclinical dry eye before surgery. In addition, mechanical traumacaused by the microkeratome suction ring to limbal Goblet cells  has been suggested to play arole  in  LASIK­associated  dry  eye  (Lenton  and  Albietz  1999).  Diminished  afferent  input  alsoresults  in  a  decreased  blinking  rate,  which  appears  to  be  involved  in  the  pathogenesis  ofLASIK­associated dry eye (Toda et al. 2001).

Risk  factors  for  developing  LASIK­associated  dry  eye  are:  female  gender,  dry  eye  beforesurgery  (Albietz  et  al.  2004a),  depth  of  photoablation,  and  preoperative  refractive  error(Nassaralla et al. 2003, Albietz et al. 2004a, De Paiva et al. 2006, Shoja and Besharati 2007).LASIK  dry  eye  has  been  reported  to  develop  more  often  in  patients  of  Asian  origin  than  inCaucasians (Albietz et al. 2005).

In addition to symptoms of dry eye, blurring of vision, and halos, dry eye has been associatedwith regression of refractive result  in PRK (Corbett et al. 1996), hyperopic LASIK (Albietz etal. 2002), and myopic LASIK (Albietz et al. 2004b).

12. Sjögren’s syndrome

In 1928,  Swedish ophthalmologist  Henrik  Sjögren  (1899­1986)  saw  a patient  complaining  ofdry eyes, dryness of mouth, and pain in several joints. Henrik Sjögren was not the first to noticethe  combination  of  xeroftalmia,  xerostomia,  and  arthralgia.    French  ophthalmologist  HenriGougerot published similar observations a few years earlier,  in 1926. In 1933, Henrik Sjögrendefended his doctoral  thesis “Zur Kentniss der Keratoconjunctivitis Sicca”, where he carefullydescribed 19 patients with a combination of dry eyes and dry mouth. The eponym “Gougerot­Sjögren disease” appeared in the literature in the 1930s, but a decade later this was shortened toSjögren’s disease, mainly because of Sjögren’s ongoing interest in the syndrome.

Sjögren’s syndrome (SS) is a chronic, generalized autoimmune disease. Dry eye and dry mouthare  its major  clinical  manifestations.  In primary  Sjögren’s syndrome (pSS),  typical  symptomsoccur  in  a  pure  form  without  an  association  with  any  other  underlying  autoimmune diseases.Secondary  Sjögren’s  syndrome  (sSS)  is  associated  with  other  autoimmune  diseases  such  asrheumatoid arthritis or systemic lupus erythematosus (Fox et al. 2000, Fox and Stern 2002). Inaddition  to  sicca  syndrome,  patients  frequently  suffer  from  visceral  manifestations,  including

31

autoimmune  thyreoiditis,  atrophic  gastritis,  renal  tubular  glomerular  nephritis,  autoimmunehepatitis, and interstitial cystitis.

12.1 Neurological manifestations in Sjögren’s syndrome

In 1933, Henrik Sjögren described a patient with trigeminal nerve  involvement  in his doctoralthesis. Since  then,  the  trigeminal  nerve  has been  identified  to be  the most commonly affectedcranial  nerve  in  SS  (Kaltreider  and  Talal  1969,  reviewed  by  Kaplan  et  al.  1990). The  overallprevalence  of  peripheral  neuropathy,  most  commonly  of  the  distal  sensory  symmetrical  type,ranges  from  10%  to  30%  in  pSS;  fortunately,  these  neuropathies  are  often  subclinical(Gemignani  et  al.  1994,  Olney  1998,  Barendregt  et  al.  2001).  In  a  Japanese  study  on  pSSpatients,  trigeminal  neuropathy was observed  in  50% (Tajima et al.  1997), while  in a Finnishstudy only 4% of patients were reported to have trigeminal neuropathy (Hietaharju et al. 1990).Electrophysiological  studies  of  the  trigemino­facial  and  trigemino­trigeminal  reflexes  inpatients  with  trigeminal  nerve  involvement  suggest  lesions  in  the  neurons  of  the  Gasserianganglia  rather  than  in  the  trigeminal  axons  (Valls–Sole  et  al.  1990).  The  pathophysiologicalmechanisms  are  unknown,  but  may  involve  vasculitis  (Melgren  et  al.  1989)  or  lymphocyticinflammation  of  nerve  cell  ganglia  (Griffin  et  al.  1990).  Decreased  corneal  sensitivity  in  SS­related dry eye has been observed with  the aid of the Cochet­Bonnet esthesiometer  (Xu et  al.1996).

32

AIMS OF THE STUDY

The role of corneal innervation in dry eye following corneal refractive surgery and in Sjögren’ssyndrome­related dry eye was investigated. The following goals were set:

1.   To  examine  the  role  of  tear  fluid  cytokines,  regeneration  of  subbasal  nerves,  and  subepithelial haze after PRK using IVCM (I).

2. To examine the recovery of corneal sensitivity using a novel noncontactesthesiometer in patients who had undergone  correction of high myopia by LASIKand to assess the relationship between dry eye symptoms and sensory recovery (II).

3. To  examine  the  alterations  in  corneal  nerve  morphology  in  primary  Sjögren’ssyndrome (III).

4. To  examine  the  relationship  between  corneal  nerve  morphology  and  cornealsensitivity in primary Sjögren’s syndrome patients (IV).

33

SUBJECTS AND METHODS

1. Subjects

These studies were carried out according to the tenets of the Declaration of Helsinki at HelsinkiUniversity Eye Hospital. Research protocols were approved by the Ethics Review Committee ofHelsinki University Eye Hospital. All patients and controls were informed both orally and witha written brochure about the studies. Informed consent was obtained from all participants.

Table 2. Demographic characteristics of subjects enrolled in studies I­IV.Patients

nFemale

%Patients

ageControls

nFemale

%Controls

age

I ­ PRK 20 80 30.7 ± 5.9 ­ ­ ­

II ­ LASIK 20 70 34.0 ± 7.4 10 60 39.8 ± 10.4

III ­ pSS 10 90 50.1 ± 13.5 10 90 48.3 ± 14.5

IV ­ pSS 20 95 54.5 ± 7.0 10 90 50.2 ± 4.6

Data presented as mean ± SD.

1.1 PRK patients (I)

The study evaluated 20 eyes of 20 patients (16 females and 4 males, mean age 30.7 ± 5.9 years)scheduled for myopic PRK. The spherical equivalent (SE) of the intended correction was ­4.7 ±1.5  D  (range  ­2.75  D  to  ­9.00  D).  Astigmatic  correction  was  performed  on  12  patients.  Theintended cylinder correction was ­0.73 ± 0.27 D (range ­0.50 to ­1.50 D).

1.2 LASIK patients and controls (II)

The  study  evaluated  30  eyes  of  30  subjects.  Twenty  eyes  of  20  patients  (14  females  and  6males, mean age 34.0 ± 7.4 years) who had undergone > 10 D myopic LASIK 2­5 years earlierwere included in the study, and 10 eyes of 10 healthy volunteers (6 females and 4 males, meanage 39.8  ± 10.4  years)  served as  a  control  group.  The mean  follow­up  time was  44.2  ± 11.3months (range 23­58 months). A cohort of patients who met the inclusion criteria was selectedfrom  the  hospital  database.  These  patients  were  sent  an  invitation  to  an  additional  follow­upexamination. The inclusion criteria were 1) high myopic correction (SE > 10D) with or without

34

astigmatic  correction  and  2)  time  interval  of  2  years  or  more  after  the  last  LASIK  surgery.Exclusion criteria were 1) re­treatments, and 2) patients with a history of any other ophthalmicsurgical operations.  The first 20 consecutive volunteers were included in the study.

1.3 Primary Sjögren’s syndrome patients and controls (III and IV)

Study III evaluated 20 eyes of 20 subjects. Ten patients with pSS (9 females and 1 male, meanage  50.1  ±  13.5  years)  were  recruited  from  the  Department  of  Rheumatology,  HelsinkiUniversity  Central  Hospital,  where  they  had  been  thoroughly  examined  by  a  rheumatologist.Ten age­ and sex­matched healthy controls (9 females and 1 male, mean age 48.3 ± 14.5 years)served as a control group. The mean duration of dry eye symptoms was 16.3 ± 8.2 years, but theaverage time elapsed from diagnosis was only 8.0 ± 4.6 years.

Study IV evaluated 30 eyes of 30 subjects. Twenty patients with pSS (19 females and 1 male,mean  age  54.5  ±  7.0  years)  and  ten  age­  and  sex­matched  healthy  controls  (9  females  and  1male,  mean  age 50.2  ± 4.6  years)  participated.  The  mean duration  of  dry  eye  symptoms was18.3 ± 10.0 years, and the average time interval between first symptoms and diagnosis was 10.3± 10.3 years.

SS diagnosis in both studies (III and IV) was made according to American–European consensuscriteria  (Vitali  et  al.   2002). The diagnosis was  set when at  least 4 of  the 6  following criteriawere met, with either item 4 (histopathology) or item 6 (serology) being present. Diagnosis wasalso set if any 3 of the 4 objective criteria were present (i.e. items 3, 4, 5, and 6).

1.  Ocular  symptoms  (daily,  persistent,  troublesome  dry  eyes  for  more  than  3  months  and/orrecurrent sensation of sand or gravel in the eyes and/or use of tear substitutes more than 3 timesa day).

2.  Oral  symptoms  (daily  feeling  of  dry  mouth  for  more  than  3  months  and/or  recurrently  orpersistently swollen salivary glands or the need to frequently drink liquids to aid swallowing ofdry food).

3. Ocular signs (Schirmer’s I test, performed without anesthesia [< 5 mm in 5 min] and/or Rosebengal score or other ocular dye score [> 4 according to van Bijsterveld’s scoring system]).

4. Histopathology (focal lymphocytic sialadenitis in minor salivary glands).

35

5. Salivary gland  involvement  (unstimulated whole salivary  flow [< 1.5 ml  in 15  min]  and/orparotid  sialography  showing  the  presence  of  diffuse  sialectasias  and/or  salivary  scintigraphyshowing delayed uptake, reduced concentration, and/or delayed excretion of tracer).

6. Autoantibodies (antibodies to Ro [SSA] and/or La [SSB]).

Patient were excluded if they had past head and neck radiation treatment, hepatitis C infection,acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), pre­existing lymphoma, sarcoidosis, graft versushost disease, or if they used anticholinergic drugs.

2. Methods

2.1 Clinical examination

Ophthalmic examinationAll patients were evaluated for uncorrected visual acuity (UCVA) and best spectacle­correctedvisual  acuity  (BSCVA)  and  manifest  refractions  and  underwent  tonometry,  slit­lampexamination, and dilated funduscopic examination.

Schirmer’s testSchirmer’s  test was performed using a Schirmer  test  strip  (Clement Clarke  International Ltd.,Harlow,  United  Kingdom).  Two  drops  of  oxybuprocaine  hydrochloride  4  mg/ml  (Oftan®

Obucain, Santen Oy, Tampere, Finland) were then administered to prevent reflex tearing. Thestrip  was  positioned  at  the  intersection  of  the  temporal  third  with  the  nasal  two­thirds  of  thelower eyelid, and the patient waited for 5 min with eyes closed until  the strips were removed,and the length of the moistened area was measured.

Tear break­up time (BUT)To measure BUT, 1 drop of oxybuprocaine hydrochloride 3 mg/ml and sodium fluorescein dye1.25  mg/ml  (Oftan®  Flurecain,  Santen  Oy,  Tampere,  Finland)  was  instilled  in  the  lowerconjunctival  sac  with  a  micropipette.  The  tear  film  was  observed  under  cobalt­blue­filteredlight.  The  interval  between  the  last  complete  blink  and  the  first  appearance  of  randomlydistributed dry spots was measured. The average of three measurements was calculated.

Grading of corneal fluorescein stainingGrading of corneal  fluorescein staining was performed as recommended by Lemp (1995). Thecornea  was  divided  into  five  areas:  central,  upper,  temporal,  inferior,  and  nasal.  Punctate

36

corneal  staining was  recorded using a standardized grading system of 0­3  for each of  the  fiveareas, resulting in a scale of 0­15.

Clinical haze gradingClinical corneal haze was estimated with a slit lamp according to the Fantes’ scale (Fantes et al.1990). Criteria  for corneal opacity grading were as follows: grade 0, totally clear; grade 0.5, atrace or a faint corneal haze; grade 1, haze of minimal density  seen with difficulty with directand  diffuse  illumination;  grade  2,  mild  haze  easily  visible  with  direct  focal  slit  illumination;grade  3,  moderately  dense  opacity  partially  obscuring  the  iris  details;  and  grade  4,  severelydense opacity completely obscuring details of intraocular structures.

CMTF haze estimateConfocal microscopy through focusing (CMTF) scans were obtained as previously described (Liet  al.  1997,  Moller­Pedersen  et  al.  1997).  Using  the  custom  software,  the  CMTF  data  weredigitized onto the PC, intensity profile curves were calculated, and a quantitative estimate of theincreased back­scattering  from the subepithelial  haze (CMTF­haze estimate) was achieved. Thethickness  of  the  haze  area  was  also  calculated.  One  to  four  acceptable  CMTF  scans  wereproduced for each eye. Mean values of the measurements were used for all statistical calculations.

Subjective dry eye symptomsSubjective  symptoms  were  evaluated  using  ocular  surface  disease  index  (OSDI),  which  is  areliable and validated 12­item questionnaire for assessing subjective symptoms in ocular surfacediseases  and  the  impact  on  visual  functioning  (Schiffmann  et  al.  2000).  In  addition,  visualanalog  scale  (VAS)  was  used  to  evaluate  global  severity  of  ocular  discomfort.  The  subjectswere asked to evaluate severity of ocular symptoms during the past month and to place a markwith a pencil on a 100­mm scale, with the left end representing minimal symptoms (0 mm) andright end maximal symptoms (100 mm).

2.2 Tear fluid analysis (I)

Tear fluid collectionAll tear fluid samples were collected with a scaled 5­ or 25­µl fire­polished microcapillary tube asdescribed previously (van Setten et al. 1989). Tears were collected preoperatively (day 0), on thesecond postoperative  day  (day 2)  and 3  months postoperatively. The  samples were  immediatelytransferred to Eppendorf tubes and stored at ­70oC until assessed. Tear fluid flow in the collectioncapillary (µl/min) was calculated by dividing the volume of the tear fluid sample by the tear fluidcollection  time.  The  tear  flow­corrected  concentration,  i.e.  rate  of  release,  was  calculated  bymultiplying the concentration in the sample (ng/l) by the tear fluid flow in the collection capillary(µl/min)  (Vesaluoma  et  al.  1997a).  As  the  interindividual  variations  in  the  tear  fluid  cytokine

37

concentrations  were  high,  changes  (%)  in  the  cytokine  concentrations  and  rates  of  release  inpreoperative vs. postoperative samples were also calculated.

Cytokine immunoassaysThe  concentrations  of  TGF­ 1  in  tear  fluid  were  measured  by  an  enzyme  immunoassay(Vesaluoma et al. 1997a). Microtiter plates (Maxisorp, Nunc Intermed, Denmark) were coated withmonoclonal mouse anti­TGF­β1, ­β2, and ­β3 (Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA, USA) 0.1µg/well in 0.05 M Na2CO3 buffer, pH 9.2, overnight at 4°C. After washing the wells with 0.05 Mphosphate­buffered  saline,  pH  7.3,  containing  0.05%  Tween  20,  100  µl  of  acid­activated  andneutralized (0.1 M HCL, 4°C, 1 h) standard dilutions (natural human TGF­β1, Code BDP 1, R &D  Systems,  London,  UK)  and  samples  (final  dilutions  18­fold)  were  added    to  the  wells  andincubated overnight at 4°C. The unbound material  was removed with the above washing buffer,and 100 µl of 1000­fold diluted antibodies to human TGF­β1 (Code 27.283.29, Jansen Biochimica,Beerse, Belgium) conjugated with alkaline phosphatase was added and incubated at 37°C for 2 h.After  washing,  the  amount  of  alkaline  phosphatase  fixed  to  the  tubes  was  determined  indiethanolamine  (1.0  mol/l)­magnesium  chloride  (0.5  mol/l)  buffer,  pH  10.0,  using  p­nitro­phenylphosphate  as  a  substrate  for  1  h  at  room  temperature.  The  absorbance  of  the  p­nitrophenolate liberated was measured at 405 nm with a 340 ATC microtitration plate reader (SLT,Lab­instruments, Vienna, Austria). The detection limit for the assay was 5 ng/l.

PDGF­BB concentrations were measured by a sandwich enzyme immunoassay (Vesaluoma et al.1997b).  Microtiter  plates  (MaxisorpTM,  Nunc  Instrumed,  Denmark)  were  coated  with  goat  IgG­type  antibody  to  highly  purified Escherichia  coli­derived  recombinant  human  PDGF­BB  (CodeAB­220­Na,  R  &  D  Systems  Europe  Ltd.,  Abingdon,  UK)  (0.25  µg/well)  in  0.05  M  Na2CO3

buffer,  pH  9.2,  overnight  at  4°C.  After  washing  the  wells  with  350  µl  of  water,  100  µl  ofrecombinant  human  PDGF­BB  homodimer  (Code  2038­01,  Genzyme  Diagnostics,  Cambridge,MA, USA) as a standard (serial dilutions from 1000 to 5 ng/l) or 5­ to 20­fold diluted tears wereadded to the wells and incubated at 24°C for 60 min on a horizontal rotating table (80 rpm). Theunbound  material  was  removed  and  the wells  were washed  twice with  saline  containing  0.05%Tween 20. One hundred microliters of 100­fold diluted rabbit antibody to human PDGF­BB (CodeZP­215, Genzyme Diagnostics, Cambridge, MA, USA) was added and incubated for 1 h at roomtemperature as above. After washing, 100 µl of 500­fold diluted alkaline phosphatase conjugatedswine  antibody  to  rabbit  IgG  (Code  67850,  Orion  Diagnostica, Espoo, Finland)  was  added  andincubated as above. The plates were then washed three times with 350 µl of washing solution. Theamount of alkaline phosphatase fixed to the tubes was determined in 1.0 M diethanolamine­0.5 MMgCl2 buffer, pH 10.0 (Code 170057, Reagena Ltd., Kuopio, Finland) at room temperature for 3 hin  the dark, using  p­nitrophenolphosphate  (Code  104­105, Sigma  Chemical  Co., St. Louis, MO,USA) as a substrate. The absorbance of p­nitrophenolate liberated was measured at 405 nm with a

38

340 ATC microtitration plate  reader  (SLT­Lab Instruments, Vienna, Austria). The absorbance ofthe 0 ng/l standard was subtracted from all the other absorbances, and the delta absorbances wereused for calculations. The detection limit of the assay was 20 ng/l.

TNF­α concentrations  were  determined  by  a  double  antibody  radioimmunoassay  developed  formeasuring of serum TNF as described by Vesaluoma et al. (1997b). A volume of 10 µl of tear fluidsamples was  first diluted by adding assay buffer to reach a  final volume of 100 µl. TNF­α fromtears competed with a fixed amount of 125 I­labeled TNF­α (10 000 counts/min for 50 µl) for thebinding sites of 30 000­fold diluted specific rabbit antibodies. The bound TNF­α was precipitatedwith Sepharose­bound antirabbit IgG and centrifuged, and the radioactivity of the pellets was thencounted. E.  coli­derived  recombinant  human  TNF­ α  (Code  TNF­H,  Genzyme  Diagnostics,Cambridge,  MA,  USA)  was  used  as  a  standard.  This  had  a  molecular  weight  of  36  kDa,  and  aspecific  activity > 1  x  107  U/mg  of  protein,  as  measured  by  bioassay  with  mouse  L  929  cells.Rabbit  antiserum  to  human  TNF­α (Code  P­300A,  Endogen,  MA,  USA)  showed  <  1%  cross­reaction with lymphotoxins. The detection limit of the assay was 10 ng/l.

2.3 In vivo confocal microscopy – IVCM (I, III, and IV)

Tandem scanning in vivo confocal microscopy (I and III)

A tandem scanning confocal microscope (TSCM, Model 165A, Tandem Scanning Corp., Reston,VA,  USA)  was  used  to examine  the  central  cornea.  A  24X, 0.6  NA  variable  working  distanceobjective  lens  was  used.  The  field­of­view  with  this  lens  is  450  x  360  µm,  and  the  z­axisresolution 9 µm. Images were detected by using a low­light­level camera (model VE1000; Dage­MTI, Michigan, IN, USA) and recorded on SVHS tape. Video images of  interest were digitizedusing  a  PC­based  imaging  system  with  custom  software  (University  of  Texas,  SouthwesternMedical Center at Dallas, Dallas, TX, USA).In addition, confocal microscopy through focusing (CMTF) scans were obtained. Intensity profilecurves  for digitized  CMTF data were  calculated. From  each  CMTF  scan, epithelial,  Bowman’slayer,  and  total  corneal  thicknesses  were  measured.    The  mean  values  of  each  individual’smeasurements were used for the statistical analysis.

After  the  layers of  the central cornea had been scanned with  the confocal  microscope,  specialattention was paid to the morphology of the surface and basal epithelium. The microscope wasthen  focused  beneath  the  basal  epithelium  to  evaluate  the  subbasal  nerve  plexus  in  detail.Afterwards, images were digitized from the SVHS video tape, and the number of nerve fibers inthe  image was determined using point­counting principles. The number of  nerve  fibers  in  the

39

image  with  the  most  subbasal  nerve  fibers  was  used  as  a  measure  of  nerve  density.  Nervemorphology was assessed from the SVHS video tape and digitized images. The morphology ofthe  nerve  fibers  was  evaluated,  with  attention  being  paid  to  the  following  aspects:  thickness(fine  and  faint,  normal,  thick),  beading,  side­branching,  and  sprouting.  It  must,  however,  benoted that resolution of confocal microscopy enables counting of nerve fiber bundles, but not ofsingle fibers or terminals.

Scanning slit in vivo confocal microscopy (ConfoScan 3) (IV)Corneal  in vivo morphology was evaluated using an in vivo scanning slit confocal microscope(ConfoScan 3,  software version 3.4, Nidek Technologies Slr, Vigonza,  Italy)  equipped with aAchroplan 40 x objective (Carl Zeiss Meditec AG, Jena, Germany).   A topical anesthetic wasinstilled  in  the  lower  conjunctival  fornix  of  both  eyes  before  examination  (oxybuprocainehydrochloride  4  mg/ml,  Oftan®  Obucain,  Santen  Oy,  Tampere,  Finland).  The  subject  wascomfortably seated in front of the microscope with the aid of chin and forehead rests and askedto look straight ahead, while a fixation target was not available. A drop of ophthalmic lubricantgel  (2  mg/g  carbomere,  Viscotears®,  CIBA  Vision  Europe  Ltd.,  Southhampton,  UK)  wasapplied  on  the  objective  tip  to  serve  as  a  coupling  media.  The  microscope  is  supplied  withautomatic alignment software that was used to center the objective.  Automated mode was usedto obtain  full­thickness scans  from  the central cornea. During a  scan,  the  instrument  recordedimages at 25 frames/s as the focal plane advanced anteriorly 4.0­8.0 µm between frames; scanswere repeated until 350 frames were recorded.  The best focused confocal microscopic imagesfrom the central cornea were used for nerve density calculations with software supplied by themanufacturer. The  field  size of  the microscope was 422 µm × 322 µm (0.136 mm2) based oncalculations from a calibration slide.

2.4 Noncontact esthesiometry (II)

Central  corneal  mechanical  sensitivity  was  assessed  with  a  modified  Belmonte  Noncontactesthesiometer  developed  by  the  Cooperative  Research  Center  for  Eye  Research  andTechnology, Sydney, Australia, and based on an instrument previously designed by Dr. CarlosBelmonte, which has been used extensively to assess corneal sensation in animals and humans(Belmonte et al. 1999, Acosta et al. 2001). The  instrument  is  mounted on the  frame of an airtonometer  and  has  a  box  controller  and  two  gas  tanks,  containing  100%  air  and  100%  CO2,respectively.  The  tip  of  the  esthesiometer  is  adjusted  to  a  distance  of  4  mm  in  front  of  thecornea, using a focusing mechanism.

Subjects were seated in front of the gas esthesiometer, with their chin placed in a cup and theirforehead against a band. An audible click produced by the opening of  the gas valve  identified

40

the onset of the stimulus. After each pulse, the subject was asked to report whether the stimuluswas  felt  independently of  the sensation evoked. Sequential  stimulus was only performed afterthe  patient  reported  no  sensation  from  the  previous  stimulation.  Subjects  were  told  to  blinkfreely between stimuli.

Mechanical  stimulation consisted of a  series of pulses of warmed air  (constant  temperature of42°C at  the  tip of  the probe), with  flow  varying  from 0  to 160 ml/min, applied  to the centralcorneal  surface.  Sensation  caused  by  the  mechanical  stimulation  was  determined  using  thevisual analog scale. Briefly, a  series of 2­s pulses were applied  randomly  in 20  ml/min steps,from  160  ml/min  to  20  ml/min.  After  a  negative  answer,  the  next  stimulus  was  10  ml/minhigher until the lowest positive value was achieved. The lowest airflow that elicited a response,even weakly, was recorded as the mechanical threshold.

2.5 PRK (I)

PRK was performed after  surgical abrasion of  the epithelium (diameter 6.5 mm) using a BeaverEye Blade  (Becton Dickinson,  Franklin  Lakes, NJ, USA). Six­millimeter­wide PRKs of  varyingablation  depths  were  performed  using  a  VisX  20/20  excimer  laser  (VisX  Co.,  Sunnyvale,  CA,USA) or a NIDEK EC 5000 excimer  laser (Nidek, Gamagoni, Aichi,  Japan). The mean ablationdepth was 60.7 ± 14.1 µm (range 36­93 µm).

Eye­patching and postoperative medicationEach eye was pressure­patched for 3 days following PRK. In the morning of the first and/or secondpostoperative  day,  the  patch  was  removed  and  the  lids  were gently  cleaned  with  a  paper  wipe.After  waiting  for  about  30  s,  the  tear  fluid  sample  was  collected,  after  which  chloramphenicolointment (Oftan Chlora; Santen, Tampere, Finland) was applied and the eye repatched. In additionto  the  ointment  twice  a  day  for  4  days,  the  postoperative  medication  included  fluorometholonedrops (Liquifilm­FML; Allergan, Irvine, CA, USA) starting on the fourth postoperative day threetimes  a  day  for  1­3  months,  oral  diclofenac  sodium  25  mg  (Voltaren;  Ciba­Geigy,  Basel,Switzerland) 30 min before the operation and 2­3 times a day for the first days after PRK, and oraldiazepam 5­10 mg (Diapam; Orion, Helsinki, Finland) for the first two postoperative nights.

2.6 LASIK (II)

The corneal flap was created with an automated Hansatome microkeratome (Hansatome, modelHT  230,  Chiron  Vision,  Hansa  Research  &  Developement,  Inc.,  Miami,  FL,  USA).  Theintended  thickness  of  the  flap  was  either  160  or  180  µm,  with  a  superiorly  located  hinge.Subsequent  laser  ablation  was  performed  using  a  VisX  Star  S2  (VisX  Co.,  Sunnyvale,  CA,USA) excimer laser. The patients were prescribed topical ofloxacin 3 mg/ml (Exocin; Allergan

41

Pharmaceuticals  Ltd.,  Westport,  Ireland)  three  times  a  day  for  7  days  and  fluorometholone  1mg/ml,  (Liquifilm­FML,  Allergan  Pharmaceuticals  Ltd.,  Westport,  Ireland)  two  times  a  dayfor 7 days starting on day 2.  Nonpreserved artificial tears were to be used four times a day forat least 6 months after the operation.

2.7 Statistical analyses

Statistical  comparisons  of  the  mean  between  groups  were  performed  either  with  the t­test  orwith  the  Mann–Whitney U­test  for  normally  distributed  or  skewed  data,  respectively,  usingSPSS for Windows (version 8.0 ­11.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Normality of the data wastested using the Shaphiro­Wilk test or the Kolmogorov­Smirnov test as appropriate. In addition,histograms  were  used  to  help  in  testing  normality  of  samples.  Bonferroni  corrections  wereapplied  in  multivariate  analysis.  Bivariate  correlations  were  examined  using  Pearson’s  (r)  orSpearman’s  (rho)  correlation  test.  All  values  are given  as  mean  +  standard  deviation  (SD)  ormedian and  interquartile  range (IQR) for normally distributed or skewed data,  respectively. P­values of less than 0.05 were considered statistically significant.

42

RESULTS

1. Tear fluid cytokines, haze, and nerve regeneration after PRK (I)

1.1 Tear fluid cytokines after PRK

The  tear  fluid  flow  in  the  collection  capillary  was  (mean ± SD)  9.6 ± 11.1  µl/min  (0.7­42.9µl/min)  preoperatively,  43.0 ± 30.7 µl/min  (7.1­125.0 µl/min; P  <  0.001) on  day  2,  and  8.8 ±8.2  µl/min  (0.7­33.3  µl/min; P =  0.003)  at  3  months  postoperatively.  A  weak  positivecorrelation  (r = 0.498, P = 0.03) was observed between ablation depth and  tear  fluid  flow onday 2. However, at 3 months postoperatively,  no correlation existed between these parameters(rho = ­0.285, P = 0.237). Cytokine concentrations and rates of release are given in Table 3.

1. 2 IVCM three months after PRK

Confocal images can be found in the original articles (I, III, and IV) at the end of this thesis.

Surface  epithelial  cells,  posterior  stromal  keratocytes,  and  endothelial  cells  of  all  corneaspresented with a normal shape and reflectivity (images not shown). The basal epithelial cell areaof  two  corneas  showed  pathological  findings.  The  basal  epithelial  cells  of  a  cornea  with  ahistory of recurrent erosions presented with presumably intracellular deposits (Rosenberg et al.2000).  Similar  deposits  could  be  discerned  among  subepithelial  haze  resulting  from  highlyreflective  keratocyte  nuclei  and  visible  keratocyte  processes  (I  /  Fig.  1A).  Another  corneashowed highly reflective particles, round to oval in shape, in the subepithelial area (I / Fig. 1B).The  basal  epithelial  cells  of  all  other  patients  appeared  normal,  and  the  Bowman’s  layer  wasabsent  in all corneas. The epithelial  thickness varied  from 25 to 49 µm (39 ± 7 µm), thus,  theepithelium was thinner than in normal corneas (Li et al. 1997).

The subbasal  nerve plexus was absent  in  two corneas,  and 18 corneas showed 1­5 (2.1 ± 1.4)regenerating nerve  fiber bundles (I  / Fig. 1C). Subepithelial haze was observed  in all corneas,and  in two cases  it was very highly reflecting and appeared vacuolized (I  / Fig. 1D). The firstanterior keratocytes exhibited  brightly  reflecting  nuclei and  thickened keratocyte processes assigns of ongoing keratocyte activation (I  / Fig. 1D). In one of  these two corneas,  the subbasalnerve  plexus  was  absent  (I  /  Fig.  1D).  In  the  other  18  corneas,  haze  was  more  subtle,  andsubbasal  nerve  fiber  bundles were visible  (I  / Fig.  1C),  except  in one case.   The mean CMTFhaze estimate was 506 ± 402 U, and the thickness of the haze area was 40.9 ± 9.2 µm. With theslit­lamp, haze was mild (0.38 ± 0.39; range 0 – 1, (scale +0 to +4)) in all eyes. In general, theCMTF haze estimates were relatively low, in accordance with the clinical scoring.

43

Table 3. Concentrations and releases of PDGF­BB, TGF­ 1, and TNF­  after PRK (I).

Release Day 0

Concentration Day 0

ConcentrationDay 2

ConcentrationMonth 3

ReleaseDay 2

ReleaseMonth 3

(ng /l) (ng/l) (ng/l) (pg/min) (pg/min) (pg/min)PDGF­BB

Below detectionlimit (n)

(13/19) (7/19) (10/20) (13/19) (7/19) (10/19)

Median 20 1230 660 0.02 51 2Mean 1700 7280 2920 13 301 7SD 4330 13500 5900 41 553 14Min 20 20 20 0.02 0.02 0.02Max 17780 56950 21200 180 2373 59P­value 0.075 0.248 0.008* 0.721

TGF­  1Below detectionlimit (n)

(12/19) (13/19) (7/20) (12/19) (13/19) (7/19)

Median 5 5 255 0.005 0.005 1Mean 820 210 840 1 5 3SD 2850 440 1500 2 10 4Min 5 5 5 0.005 0.005 0.005Max 12560 1720 6730 10 36 17P­value 0.445 0.198 0.203 0.116

TNF­Below detectionlimit (n)

(0/19) (0/19) (0/20) (0/19) (0/19) (0/19)

Median 1760 920 770 7 27 4Mean 1920 1020 990 10 37 5SD 1560 480 970 8 27 5Min 120 240 90 2 11 0,8Max 6910 1930 4150 30 120 18P­value 0.039* 0.002* 0.000** 0.085

    * = P < 0.05, ** = P < 0.01

44

1.3 Correlations between IVCM data and cytokines (I)

The number of subbasal nerve fiber bundles was positively correlated with epithelial thickness(r = 0.58, P = 0.007). However, the number of subbasal nerve fiber bundles was not correlatedwith the CMTF haze estimate (rho = ­0.281, P = 0.230) or the thickness of the haze area (r = ­0.398, P  =  0.082).  Ablation  depth  showed  no  correlation  with  nerve  count  (r  =  0.240, P  =0.308), CMTF haze estimate (rho = 0.041, P = 0.865), or thickness of the haze area (r = ­0.006,P  =  0.979).  The  CMTF  haze  estimate,  as  expected,  showed  a  strong  correlation  with  thethickness of the haze area (rho = 0.783, P = 0.000).

No  correlations  were  found  between  cytokine  concentrations  or  rates  of  release  at  any  time­points and the CMTF haze estimate at 3 months. The magnitude of the changes from day 0 today 2 in the concentrations or rates of release of the three cytokines was not correlated with theCMTF haze estimate at 3 months (data not shown).

2. Dry eye and corneal sensitivity after high myopic LASIK (II)

2.1 Subjective symptoms

The majority of patients (55%) reported dry eye symptoms when asked a simple question: Doyou  have dry  eyes?   Ocular  surface disease  index  (OSDI)  score,  indicating degree of dry eyesymptoms, was significantly  higher  in  LASIK patients  (18.6 ± 6.4%) than  in  normal controls(7.5 ±  5.7%; P  =  0.022).  However,  almost  all  LASIK  patients  (95%)  were  satisfied  with  theoverall  outcome  and  would  have  chosen  the  operation  again.  The  only  patient  who  was  notentirely  satisfied  had  undergone  epithelial  erosion  during  the  surgery  and  subsequent  diffuselamellar  keratitis  (DLK)  in  both  eyes.  A  predisposing  factor  seemed  to  be  a  loose  epitheliumdue to basement membrane dystrophy,  although  the patient had a negative history of erosionsand the preoperative examination revealed no abnormalities.

2.2 Objective dry eye tests

We  found  no  difference  in  objective  dry  eye  tests.  Schirmer’s  test  values  did  not  differsignificantly between patients and controls (14.4 ± 8.9 mm and 9.0 ± 4.2 mm, respectively, P =0.066),  although  LASIK patients showed slightly higher scores contrary  to expectations. TearBUTs were similar  in patients and controls (15.9 ± 11.2 s and 14.0 ± 10.0 s, respectively, P =0.505). None of the patients or controls showed corneal fluorescein staining.

45

2.3 Corneal sensitivity

The  mean  corneal  sensitivity  thresholds  did  not differ  between  the  groups,  being  73.5 ±  29.6ml/min in LASIK patients and 78.0 ± 18.7 ml/min in controls (P = 0.666). No correlations werepresent between corneal sensitivity threshold values and OSDI scores. Even when patients weredivided  into two groups: 1) patients claiming to have dry eyes and 2) patients claiming not tohave  dry  eyes,  we  found  no  significant  difference  between  sensitivity  threshold  values.  Nosignificant correlation existed between corneal sensitivity thresholds and objective dry eye signs(Schirmer’s test or BUT).

3. Corneal morphology and sensitivity in primary Sjögren’s syndrome               (III and IV)

3.1 Subjective symptoms (IV)

OSDI and VAS scores were significantly higher in pSS patients than in controls (Table 5), witha  strong positive correlation  between  these  two measures of ocular discomfort  (rho 0.92, P <0.01), suggesting that VAS can be used to assess severity of dry eye symptoms  in a relativelytime­effective manner.

3.2 Objective dry eye tests (III and IV)

Objective  dry  eye  test  values  (Schirmer’s  test,  tBUT)  were  lower  in  pSS  patients  than  incontrols  (Tables  4  and  5).  Corneal  fluorescein  was  observed  in  the  majority  of  pSS  patients,while none of the controls showed corneal fluorescein staining (Tables 4 and 5).

Table 4. Characteristics of pSS patients and controls (III).

pSS Controls P­value

Number of patients 10 10 ­

Nerve count (nerves/frame) 5.4 ± 1.8 5.0 ± 1.4 0.584†

Schirmer’s test (mm) 3.0 ± 2.8 7.8 ± 4.8 0.015†

Corneal fluorescein staining  % 60 0

Data  presented  as  mean  ±  SD,  †  =  t­test,  Corneal  fluorescein  staining  %  =  percentage  of  patientsshowing corneal fluorescein staining.

46

Table 5. Characteristics of pSS patients and controls (IV).

pSS Controls P­value

Number of patients 20 10 ­

Corneal fluorescein staining 1.5 (0.0­4.0) ­ 0.002‡

Schirmer’s test (mm) 2.5 (1.0­4.8) 9.0 (3.0­10.0) 0.012‡

Tear break­up time (s) 5.0 (3.0­6.0) 7.0 (5.8­12.0) 0.006‡

Mechanical threshold (ml/min) 54.5 + 40.1 85.0 + 24.6 0.036†

Chemical threshold (% ­CO2) 29.2 ± 24.0 28.8 ± 14.6 0.960†

Nerve count (nerves/frame) 5.9 ± 2.2 6.1 ± 2.5 0.782†

Stromal nerve thickness (µm) 7.9 (6.4­13.3) 5.7 (3.7­7.3) 0.018‡

VAS (0­100 mm) 61.0 (23.0­80.5) 2.5 (0.0­8.8) 0.000‡

OSDI (0­100 %) 37.5 (20.8­60.8) 5.3 (0.0­12.5) 0.000‡

Data  presented  as  mean  ±  SD  or  median  and  (interquartile  range),  Mechanical  threshold  = Cornealmechanical sensitivity detection threshold, Chemical threshold = Corneal chemical sensitivity detectionthreshold, OSDI = Ocular Surface Disease  Index, VAS = Visual Analog Scale,  † =  t­test,  ‡ = Mann­Whitney U­ test.

3.3 Corneal sensitivity (IV)

The  mean  mechanical  sensitivity  detection  threshold  was  lower  in  pSS  patients,  implicatingcorneal  mechanical  hypersensitivity  in  pSS  dry  eye.  However,  no  difference  was  found  inchemical sensitivity detection thresholds (Table 5).

3.4 IVCM in primary Sjögren’s syndrome (III and IV)

Confocal images can be found in the original articles (III and IV) at the end of this thesis.

The  surface  epithelium  was  irregular  or  patchy  in  the  majority  of  SS  corneas  (III  /  Fig.  1A),whereas  control  corneas  showed  normal  morphology  (III  /  Fig.  1B).  Basal  epithelial  cellsappeared normal in all subjects.

The subbasal nerve density did not differ between SS and control groups (Tables 4 and 5), asreflected in long nerve fiber bundles per microscopic field. The normal subbasal nerve plexus of

47

a healthy control subject is shown in IV / Figure 1.  Nerve sprouting or a nerve growth cone­likepattern (III / Figs 2A and 2B; IV / Fig. 2), presumably indicating neural regeneration, was foundat  the  level  of  the  subbasal  nerve  plexus  in  20­40%  of  patients.  One  SS  patient  with  severeperipheral neuropathy showed very thin subbasal nerve fiber bundles without beading (III / Fig.2C).  Control  subjects,  by  contrast,  had  relatively  thick  subbasal  nerve  fibers.  Only  a  singlehighly  reflective  nerve  fiber  bundle  was  observed  in  one  of  the  control  subjects.  In  addition,subbasal nerve fiber bundles showed abnormal tortuosity in 2/10 eyes of the SS group (III / Fig.3B); no such abnormality was seen in the control group (III / Fig. 3D). Interindividual variationin the density of the subbasal nerve plexus was wide, ranging between 4 and 9 long nerve fiberbundles per microscopic field. Round particles, measuring approximately 11­12 µm in diameter,possibly cells of  inflammatory origin, were  found at  the  level of  the  subbasal  nerve plexus ofone SS cornea (III / Fig. 3A).

Anterior keratocytes revealed signs of activation, hyperreflectivity, or visible processes in 5/10SS corneas (III / Fig. 1C).  Interestingly, three of these corneas also showed nerve sprouting (III/ Figs. 1A and 1B).

The stromal nerves appeared significantly thicker in pSS (IV / Figs 4 and 5) than in controls (IV/  Fig.  3; Table  5),  possibly  indicating  neural  regeneration.  In  one  patient,  an  extremely  thickstromal  nerve  measuring  43  µm  in  diameter  was  observed  (IV  /  Fig.  5);  this  patient  alsopresented with APCs among subbasal nerves and a very low mechanical sensory threshold (10ml/min), implicating severe corneal hypersensitivity.

Mature APCs with  typical  branching  and  long  dendritic  extensions were observed among  thesubbasal plexus of  the central cornea  in 35% (7/20) of patients (IV  / Fig. 6.) but  in only 10%(1/10) of controls. In patients in whom APCs were observed (n = 7), their average density in thecentral cornea was 174 ± 26 cells/mm2. The number of  mature APCs  in  the central cornea ofthese  patients  displayed  a  strong  positive  correlation  with  the  subjective  symptom  score  (r  =0.847, P = 0.016). Patients with APCs and/or nerve growth cones otherwise did not differ fromother patients with  respect  to  subjective symptoms, objective signs, or other  features of nervemorphology.

48

DISCUSSION

1. Tear fluid cytokines and haze after PRK (I)

The cytokines TGF­ 1, TNF­ , and PDGF­BB were chosen to be analyzed in tear fluid for theirpotential  influence  on  corneal  keratocytes  and  stromal  wound  healing,  including  keratocyterepopulation  of  the  ablated  area  after  initial  keratocyte  apoptosis,  keratocyte  activation,  andsubsequent  production  of  the  ECM  (Ohji  et  al.  1993,  Jester  et  al.  1996,  2002,  Wilson  et  al.1996a, Andresen et al. 1997, Myers et al. 1997, Andresen and Ehlers 1998, reviewed by Jesteret  al.  1999).  However, of  the  measured  cytokines,  only  TNF­   was  readily  measurable  in  allsamples at all time­points. TGF­ 1 and PDGF­BB were detected in 8/20 and 7/20 preoperativesamples,  in  6/19  and  13/19  samples  on  day  2,  and  in  7/20  and  10/20  samples  at  3  months,respectively.

Several  potential  sources  exist  for  tear  fluid  cytokines,  including  the  main  and  accessorylacrimal  glands,  corneal  epithelial  and  stromal  cells,  conjunctival  or  inflammatory  cells,  theECM,  and  leakage  from  conjunctival  vessels.  Corneal wounding  seems  to  result  in  increasedlacrimal gland mRNA levels  for TNF­ , HGF, KGF, and EGF (Thompson et al. 1994, Wilsonet  al.  1999b).    Whether  the  PRK  wound  induces  cytokine  production  in  the  human  lacrimalgland is unknown.

No correlations were present between pre­ or postoperative tear fluid levels of TGF­  1, TNF­ ,or PDGF­BB and subepithelial post­PRK haze estimated at 3 months by IVCM. Nor did eyeswith elevated in cytokine concentrations present with higher CMTF haze estimates. The clinicalhealing of  all  eyes proceeded  without  problems,  and  the  maximal  clinical  haze observed at  3months was scored 1 on a scale from +0 to +4. One of the limitations of the study was the smallsize  of  the  patient  group,  with  no  severe  complications,  such  as  dense  haze  (score  +3 or  +4)occurring in this group. The CMTF haze estimates were also low, which might have contributedto  the  result.  Nevertheless,  the  observed  high  cytokine  concentrations,  e.g.  of  TGF­ 1,  inindividual eyes without haze  formation  may suggest  that  tear  fluid analysis  is  not optimal  forscreening  potential  candidates  for  haze  formation  even  had  the  patient  cohort  been  morerepresentative in terms of different degrees of subepithelial haze.

2. Nerve regeneration after PRK (I)

During  PRK  the  anterior  stromal  nerve  trunks  and  subbasal  nerve  plexus  are  ablated.  Properinnervation  has  long  been  known  to  be  necessary  for  normal  corneal  epithelial  regeneration(Beuerman  and  Schimmelpfennig  1980).  In  addition,  individual  epithelial  cells  and  possibly

49

also keratocytes are innervated (Muller et al. 1996).  It is, therefore, to be expected that properinnervation is important for the physiological status of epithelial cells and quiescent keratocytes.Intriguingly,  innervation  might  have  a  direct  effect  on  corneal  wound  healing.  To  myknowledge, I am the first to demonstrate that the degree of subbasal nerve plexus regenerationafter  PRK  in  human  in  vivo  cornea  positively  correlates  with  restoration  of  the  thickness  ofcorneal  epithelium.  This  is  an  additional  piece  of  indirect  evidence  for  the  trophic  andregulatory  functions  of  corneal  innervation.  My  observation  is  in  line  with  earlier  in  vitro  orexperimental  findings  showing  that  innervation  has  an  influence  on  epithelial  proliferation(Araki et al. 1994, Nakamura et al. 1997). Whether nerves also exert an effect on the healing ofstromal tissue remains obscure. No significant correlation was observed between the number ofsubbasal nerve fiber bundles and the CMTF haze estimate or the thickness of the haze area.

After the initial anterior keratocyte loss after PRK, the area  is repopulated with new migratorykeratocytes  (reviewed  by  Fini  and  Stramer  2005),  which  will  rapidly  transform  to  alteredkeratocytes  that  produce  ECM  (Moller­Pedersen  et  al.  1997).  The  return  of  keratocytes  toquiescence takes months (Linna and Tervo 1997, Bohnke et al. 1998, Frueh et al. 1998), and thetiming  coincidences  with  the gradual  disappearance of  the  subepithelial  haze  (as observed byslit  lamp)  and  regeneration  of  innervation.  Moller­Pedersen  et  al.  (1997)  showed  delicatesubbasal nerve  fibers  in 9/17 patients at 1 month after PRK, whereas according to Frueh et al.(1998)  only  1/18  corneas  presented  with  subbasal  nerves  at  that  time.  In  their  study,  7/18corneas showed nerve regeneration by 4 months and 13/18 corneas by 12 months. Bohnke et al.(1998) examined 15 eyes at 8­43 months postoperatively and found regenerated nerve fibers inall eyes. In my study, only two corneas showed a total absence of a subbasal nerve plexus at 3months, whereas in the other 18 corneas at least single nerve fiber bundles were observed in thecentral area, although the branching pattern was not normal by 3 months. However, recovery ofcorneal nerve density  to preoperative  levels  took 2 years after PRK (Erie et al. 2005b). Thereare  certain  limitations  in  grading  of  neural  regeneration,  e.g.  dense  haze  impedes  theobservation of thin nerve fiber bundles. The resolution of confocal microscopy equipment alsohas a limited threshold.

Regrowth  of  nerve  fibers  into  the  ablated  area  is  also  essential  for  restoration  of  cornealsensitivity after refractive surgery. After PRK, the central sensitivity, measured using a Cochet­Bonnet esthesiometer, returns to the preoperative level by 3 months (Perez­Santonja et al. 1999,Matsui  et  al.  2001,  Lee  et  al.  2005).  Until  then,  the  cornea­lacrimal  gland  reflex  arc,  whichregulates  tear  fluid  release  from  the  lacrimal  glands,  is  supposed  to  be damaged,  and  severalpatients complain about dryness of the ocular surface for the first few months after PRK.

50

3. Corneal sensitivity after high myopic LASIK (II)

Corneal  mechanical  sensitivity  detection  thresholds  over  the  long  term  after  high  myopicLASIK did not differ  from those of control subjects. Accordingly, the results of objective dryeye  tests  were  similar  to  those  of  controls.  However,  the  patients  reported  ongoing  oculardiscomfort and symptoms resembling dry eye (photophobia, grittiness,  foreign body sensation,and  ocular  irritation)  significantly  more  than  age­  and  sex­matched  control  subjects.  Loss  ofsensitivity  and  recovery  of  sensitivity  after  LASIK  have  been  shown  to  correlate  with  highcorrections  (Kim  and  Kim  1999,  Nassaralla  et  al.  2003,  Bragheeth  and  Dua 2005,  Shoja  andBesharati  2007).  It  is  therefore  logical  to  presume  that  corneal  nerves  are  implicated  in  thisprocess in some way. On the other hand, high correction seems to be one of the risk factors forpatients developing so­called chronic dry eye syndrome after LASIK (reviewed by Albietz andLenton. 2004, De Paiva et al. 2006, Shoja and Besharati 2007).

De  Paiva  and  Pflugfelder  (2004)  found  decreased  corneal  sensitivity  after  LASIK  in  patientswithout dry eye. They also observed corneal hypersensitivity  in patients with post­LASIK dryeye  compared  with  normal  controls.  The  LASIK group  consisted of  20  patients 1­40  monthsafter  myopic  or  hyperopic  correction;  data  for  refractive  corrections  were  not  provided.  Thepost­LASIK dry eye group included six patients who reported dry eye symptoms and had ocularsigns  compatible  with  dry  eye  after  a  mean  interval  of  12  months  (range  3–36  months)following myopic LASIK. The authors suggested that corneal hypersensitivity observed in dryeye  patients  is  due  to  compromised  ocular  surface  barrier  function  and  hypersensitivity  to  airjet. Some of the differences between their study and my own may be explained by 1) I includedonly patients with high myopic corrections, and 2) the mean interval after surgery in my studywas longer (44.2 ± 11.3 months, range 23­58 months).

In  addition  to  decreased  reflex  and  basal  tear  production,  impairment  of  corneal  nerves  maylead  to  LASIK­induced  neurotrophic  epitheliopathy  (LINE)  (Wilson  2001,  Wilson  andAmbrosio  2001,  reviewed  by  Ambrosio  et  al.  2007),  where  punctate  epithelial  microerosionscan be detected on the corneal surface. However, patients who developed symptoms and signsof dry eye after LASIK had no significant difference in tear production detected by Schirmer’stest with anesthesia from patients who had no symptoms or signs of dry eye at time­points from1  month  to  6  months  after  surgery  (Wilson  2001).  LASIK­associated  dry  eye  has  beensuggested  to  represent  a  neurotrophic  epitheliopathy  rather  than  an  actual  dry  eye  syndrome(Wilson  2001).  This  is  supported  by  the  data  presented  in  my  study  of  high  myopic  LASIKpatients.  The  majority  of  patients  reported  ocular  discomfort  resembling  dry  eye  symptoms,although  clinical  dry  eye  tests  were  normal  and  corneal  sensitivity  levels  were  within  normallimits.  These  symptoms  of  ocular  discomfort  could  be  in  part  be  derived  from  aberrantlyregenerated corneal nerves.

51

LASIK DRY EYE HYPOTHESISLASIK patients complain

about ongoing dry eye symptoms

ALTHOUGH...

Some of the symptoms may becaused by aberrantly

regenerated nerve fibers

?Objective clinicaldry eye tests are normal

Mechanical sensitivityis normal

Figure 6. LASIK dry eye hypothesis: in the long term (2­5 years) after high myopic LASIK, the majorityof patients complain about ongoing dry eye –like symptoms.  However, clinical dry eye tests are normal,and corneal mechanical sensitivity is comparable with that of normal controls. Some of these symptomsmay  thus  be  derived  from  aberrantly  regenerated  nerve  fibers,  representing  a  form  of  cornealneuropathy rather than conventional dry eye disease.

Other  issues  possibly  contributing  to  dry  eye  symptoms  after  LASIK  include  differences  incorneal curvature; while normal corneas show prolate profiles, i.e. are steeper in the center, highconventional myopic LASIK produces oblate corneas. These changes in corneal curvature mayinterfere  with  even  tear  distribution,  but  mechanical  rubbing  due  to  the  actual  anatomicalchange may also be causative.  Mechanical trauma caused by the microkeratome suction ring to

52

limbal Goblet cells has been suggested to play a  role  in LASIK dry eye (Shin and Lee 2006).Diminished afferent  input from corneal nerves also results  in a decreased blinking rate, whichmay be involved in the pathogenesis of LASIK dry eye (Toda et al. 2001). Moreover, patientswho seek refractive surgery are often contact  lens­intolerant and may have preclinical dry eyebefore  surgery.  Unfortunately,  my  study  was  cross­sectional  and  I  was  not  able  to  conductpresurgical examinations.

Lay  patients  are  unable  to  differentiate  between  symptoms  of  ocular  dryness  and  "sore  eyes"due to other basic conditions.  In the end, however, the most  important aspect  is  the subjectivesymptoms experienced by patients. Interestingly, patients report relief in symptoms when usingartificial  tears, which may be explained by  lowering the  frictional  forces between  lids and theocular surface, and thus, the corneal afferent nerves being less activated.

Some of the symptoms experienced may be derived from aberrantly regenerated corneal nervesafter LASIK surgery. LASIK dry eye could in fact be a sort of “phantom pain”, representing aform of corneal  neuropathy  rather than conventional dry  eye syndrome. This new  insight  intothe  pathogenesis  of  LASIK  dry  eye  syndrome  as  a  form  of  corneal  neuropathy  has  clinicalimplications and also offers novel  therapeutic possibilities. Patients should be  informed of thepossibility of developing chronic dry eye symptoms, especially after deep ablations.  In severecases of disabling chronic pain after LASIK, when conventional therapeutic possibilities fail tooffer relief, consultation of a physician specialized in pain treatment is recommended.

4. Corneal sensitivity in primary Sjögren’s syndrome (IV)

Corneal sensitivity detection thresholds to mechanical air jet stimuli were significantly decreasedin  patients  with  pSS  dry  eye,  implicating  corneal  hypersensitivity.  My  finding  is  in  line  withearlier observations by De Paiva and Pflugfelder (2004), who also  found decreased mechanicalsensitivity  detection  thresholds  in  dry  eye  measured  using  a  similar  modified  Belmontenoncontact gas esthesiometer. By contrast, Bourcier et al. (2005) and Benitez Del Castillo et al.(2007) reported increased corneal sensitivity detection thresholds in dry eye patients, suggestingcorneal hypoesthesia.

Many variables, such as selection of patients and controls and disease severity, can influence theresults. For example,  in the Bourcier study, only one­third of patients had a diagnosis of pSS orsSS.  I  included  only  patients  with  a  diagnosis  of  pSS  and  age­  and  sex­matched  controls.  Inaddition, variability among noncontact gas esthesiometers  is  inevitable and may explain part ofthe  discrepancy.  We  and  De  Paiva  and  Pflugfelder  (2004)  used  a  modified  Belmonteesthesiometer, while Bourcier et al. and Benitez Del Castillo et al. utilized the original Belmonteesthesiometer. Differences in the size of the tip, the tip distance to the cornea, and the size of the

53

corneal area stimulated by the air  jet are important factors. Moreover, therapeutic approaches intreating  dry  eye  obviously  differ.  For  instance,  different  use  of  topical  and/or  systemic  anti­inflammatory pharmaceuticals during the course of the disease may affect the results.

Decreased corneal sensitivity in dry eye utilizing the Cochet­Bonnet esthesiometer was observedby Xu et al. (1996) and Villani et al. (2007).  Different results in these cases might be explainedby  different  research  methodologies,  as  the  Cochet­Bonnet  esthesiometer  uses  mechanicalcontact probe stimulation with some limitations in sensitivity and reproducibility. In addition, amechanical  contact  probe  and  a  noncontact  air  jet  stimulate  corneal  afferent  sensory  nerveendings differently.

De Paiva and Pflugfelder (2004) suggested that the corneal hypersensitivity observed in dry eyeis due to compromised ocular surface barrier function. In my study, I found a positive correlationbetween  corneal  mechanical  sensitivity  and  increased  corneal  fluorescein  staining,  supportingthis  part  of  their  hypothesis.  In  addition,  I  observed  a  positive  correlation  between  cornealmorphology, corneal mechanical (hyper)sensitivity, and subjective symptoms,  indicating that  inpatients with the most severe ocular symptoms weak stimuli are recognized and may even elicitpainful  sensations.  The  findings  of  altered  corneal  nerve  morphology  may  offer  anotherexplanation for the observed corneal mechanical hypersensitivity.

5. Corneal nerves in primary Sjögren’s syndrome (II and IV)

Corneal  subbasal  nerve  density  was  similar  between  pSS  patients  and  controls  (III  and  IV),suggesting that this may not per se explain the difference seen in corneal sensation. Previouslypublished  data  concerning  corneal  nerve  density  in  dry  eye  have  been  conflicting.  Increasedsubbasal nerve counts in aqueous tear­deficient patients were observed by Zhang et al. (2005),whereas decreased nerve counts were reported by Benitez Del Castillo et al. (2004), and (2007)and Villani et al. (2007). However, in the Benitez Del Castillo studies, a statistically significantdifference  was  found  between  the  SS  group  and  the  control  group  composed  of  youngersubjects,  but  not  between  the  SS  group  and  the  control  group  of  older  subjects.  Althoughcorneal nerve density is easily calculated and quantified, other properties of the corneal nerves,such  as  morphological  alterations  and  inflammatory  findings,  seem  to  play  a  more  importantrole than nerve density, which may be increased, decreased, or similar compared with controls.

Although  corneal  subbasal  nerve  density  showed  no  difference,  several  morphologicalalterations were present in corneal nerves. Nerve growth cone­like structures in subbasal nerveswere found in 20­40% of our patients (III / Figs. 2A and 2B; IV / Fig. 2). These alterations mayimplicate ongoing  nerve  sprouting,  and  may  result  from  attempts  of  the  inflammation­injured

54

nerve fibers to regenerate. Inflammation is recognized as a critical factor in the pathogenesis ofdry  eye,  and  the  upregulation  of  neurotrophins,  e.g.  nerve  growth  factor  (NGF),  duringinflammation  has been shown  in  many studies. NGF  is  known  to  induce axonal  regeneration,nerve  sprouting,  and  when  overexpressed  even  hypertrophy  of  the peripheral  nervous  system(Albers et al. 1994). On the other hand,  focally applied neutralizing antibodies to neurotrophicfactors  reduce  collateral  axonal  branching  after  peripheral  nerve  lesion  (Streppel  et  al.  2002).NGF  is  expressed  in  alpha­smooth  muscle  actin­positive  dermal  myofibroblasts  (Hasan  et  al.2000),  which  are  comparable  with  corneal  altered  keratocytes.  Altered  keratocytes  developduring  the  corneal  wound  healing  process  (reviewed  by  Jester  et  al.  1999),  and  in  variousinflammatory  conditions  (reviewed  by  Petrol  et  al.  1998,  Rosenberg  et  al.  2002).  I  observedaltered  anterior  keratocytes  with  signs  of activation:  hyperreflectivity  or  visible  processes,  in5/10 SS corneas (III / Fig. 1C).  Interestingly, the majority of these corneas also showed nervegrowth cone­like structures. Presumably, these altered keratocytes are the source of NGF in SSdry eye. Recently,  it has been shown that patients with dry eye present with elevated tear fluidlevels of  NGF  (Lee et  al.  2006),    and    topical  anti­inflammatory  treatment  with  prednisolonedecreases tear fluid NGF levels and markedly alleviates dry eye symptoms (Lee et al. 2006).

Stromal nerves appeared significantly thicker in SS patients than in controls. A similar findingwas reported by Benitez Del Castillo et al. 2004. The  implication of  the thickening of stromalnerves remains unclear. However, it has earlier been shown using immunoelectron microscopyand  morphometry  that  nerve  fibers  regenerating  after  an  inflammatory  insult  are  significantlythicker  than  normal  healthy  nerve  fibers  (Imai  et  al.  1997,  Niissalo  et  al.  2002).  Possibly,stromal  nerves are  thickened secondary  to chronic ocular  surface  inflammation or this  findingmay represent a form of neural regeneration.

Antigen­presenting  cells  (APCs)  play  a  critical  role  in  corneal  immunology  in  health  anddisease  (Hamrah  et  al.  2002,  2003a,  2003b).  APCs  have  been  observed  in  living  corneas  bymodern  IVCM (Rosenberg  et  al.  2000a,  2002,  Zhivov  et  al.  2005,  2007,  Mastropasqua  et  al.2006). The density of APCs declines from the limbus to the center in healthy corneas (Hamrahet al. 2002, 2003b, Zhivov et al. 2005, 2007, Mastropasqua et al. 2006). In the corneal  limbalepithelium,  dendritic  cells  are  present  in  virtually  all  healthy  subjects  (Mastropasqua  et  al.2006), while in the central cornea only some 20­30% of healthy controls show APCs (Zhivov etal. 2005, 2007, Mastropasqua et al. 2006). APCs are more often found in the peripheral cornea,where  they  show  signs  of  having  a  mature  phenotype  with  long  slender  dendritic  processes,while immature APCs without dendrites typically predominate in the central cornea (Zhivov etal. 2005). We focused on the central cornea and observed APCs in 35% of patients and in 10%of  controls.  The  density  of  the  APCs  in  the  central  cornea  in  pSS  patients  was  significantlyhigher  than  that  reported  in  healthy  subjects  (Zhivov  et  al.  2005,  2007,  Mastropasqua  et  al.2006). The high  APC density  together with  the mature phenotype of  these cells  in  the central

55

cornea (IV / Fig. 6) suggest that these cells are actively involved in the local pathomechanism asantigen processing and presenting cells. This may contribute to the perpetuation of dry eye andeven  lacrimal  gland  adenitis,  as  it  has  recently  been  shown  that  desiccating  stress  exposesantigenic epitopes shared by the ocular surface and lacrimal glands (Niederkorn et al. 2006).

Primary  Sjögren’s  syndrome  patients  presented  with  corneal  mechanical  hypersensitivity,although  their  corneal  nerve  density  did  not  differ  from  that  of  controls.  Corneal  sensitivityappeared to correlate with subjective symptoms and objective ocular signs, but not with cornealnerve  density.  However,  alterations  in  corneal  nerve  morphology  (nerve  sprouting  andthickened  stromal  nerves)  and  an  increased  number  of  APCs,  implicating  the  role  ofinflammation, were observed. I hypothesize that chronic  inflammation and diminished volumeof tear fluid, enriched in pro­inflammatory cytokines such as IL­1 and IL­6 (Tishler et al. 1998,Solomon et al. 2001),  lead to keratocyte activation, which  is  followed by synthesis of NGF orother  neuronal  growth  factors.  NGF  and  its  high­affinity  receptor  TrkA  are  expressed  in  thehuman  corneal  stroma  and  epithelium  (Lambiase  et  al.  2000, You  et  al.  2000).  In  addition  tohypertrophy  of  neural  tissue  (Albers  et  al.  1994),  NGF  facilitates  transmission  of  pain(hyperalgesia), possibly due to its effect on ion channels (Lewin et al. 1993, reviewed by Apfel2000, Gould et al. 2000). Overexpression of neuronal growth factors could explain not only theobserved  changes  in  corneal  nerves  and  corneal  hypersensitivity  but  also  the  tenderness  –  oreven chronic pain and ocular hyperalgesia ­ often observed in these patients.

56

SJÖGREN’S SYNDROMEHYPOTHESIS

Hyperalgesia

Nerve sproutingDegeneration ofepithelium and nervesKeratocyte activation

Neurotrophins

Chronic ocularsurface inflammation­ Langerhan’s cells­ IL­1, IL­6, etc

Figure 7. Sjögren’s syndrome hypothesis: ongoing ocular surface  inflammation along with diminishedtear  fluid  volume,  enriched  with  pro­inflammatory  cytokines,  leads  to  degeneration  of  the  surfaceepithelium and subbasal nerves. This results in activation of altered keratocytes, followed by synthesis ofNGF  or  other  neuronal  growth  factors.  Overexpression  of  neuronal  growth  factors  could  explain  notonly  the observed changes  in corneal nerves and corneal hypersensitivity but also the tenderness – oreven the chronic pain and ocular hyperalgesia ­ often observed in these patients.

57

SUMMARY AND CONCLUSIONS

Pre­ or postoperative  levels of  the tear fluid cytokines TGF­ 1, TNF­  and PDGF­BB did notcorrelate with the development of corneal haze, as estimated by IVCM at 3 months after PRK.However, it is noteworthy that none of our patients showed severe grade 3 or 4 haze. Subbasalnerve  fibers  were  observed  in  the  central  cornea  in  18/20  eyes.  A  positive  correlation  wasobserved between the regeneration of subbasal innervation (based on the IVCM nerve count at3 months after PRK) and the thickness of regenerated epithelium, possibly reflecting the trophiceffect of corneal nerves on epithelium. However, the CMTF haze estimate did not correlate withregeneration of the subbasal nerve plexus.

The majority of patients  reported ongoing dry eye symptoms  long after high  myopic LASIK,although  objective  clinical  signs  were  not  demonstrable.  No  difference  in  corneal  sensitivitywas observed between patients and controls. I assume that at least some of the symptoms maybe derived from aberrantly regenerated corneal nerves after LASIK surgery, thus representing aform of corneal neuropathy rather than conventional dry eye.

Primary  Sjögren’s  syndrome  patients  presented  with  corneal  mechanical  hypersensitivity,although  their  corneal  subbasal  nerve  density  did  not  differ  from  that  of  controls.  Cornealmechanical  sensitivity  appeared  to  correlate  with  subjective  symptoms  and  objective  ocularsigns,  but  not  with  corneal  nerve  density.  However,  alterations  in  corneal  nerve  morphology(nerve  sprouting  and  thickened  stromal  nerves)  and  an  increased  number  of  APCs  amongsubbasal  nerves,  implicating  the  role  of  inflammation,  were  observed.  We  suggest  that  thesefindings offer an explanation for the corneal hypersensitivity or even ocular hyperalgesia oftenobserved in these patients.

58

ACKNOWLEDGMENTS

This  study  was  carried  at  the  Department  of  Ophthalmology,  Helsinki  University  CentralHospital,  from  2000  to  2007.  I  am  sincerely  grateful  to  Professor  Leila  Laatikainen  and  hersuccessor,  Professor  Tero  Kivelä,  the  current  head  of  the  Department  of  Ophthalmology,  forproviding excellent working facilities.

My  deepest  gratitude  goes  to  my  supervisor,  Professor  Timo  Tervo,  with  whom  I  have  hadnumerous  inspiring conversations on scientific  issues  as well as on other  common subjects ofinterest. Without his innovative ideas, my thesis would not be the same.

I  am  sincerely  grateful  to  Professor  Yrjö  T.  Konttinen.  I  have  been  privileged  to  be  able  tocollaborate with him and to share thoughts and ideas 24 hours a day, 365 days a year, literally.His  consistent  enthusiasm  and  positive  thinking  were  instrumental  to  the  completion  of  thisthesis.

I am deeply grateful to Docent Minna Vesaluoma. Without her, I would not have been able tostart my scientific career in 1998.

My  thanks  also  belong  to  my  collaborators  and  colleagues  Carola  Grönhagen­Riska,  MaaretHelintö,  Juha  Holopainen,  Eija  Kaila,  Sissi  Katz,  Liisa  Konttinen,  Maria  Lamberg,  NinaLindbohm, Jukka Moilanen, Waldir Neira, Anna­Maija Teppo, Tuuli Valle, and Steven Wilson.

Professors  Hannu  Uusitalo  and  Marja­Liisa  Vuori,  the  official  reviewers  of  the  thesis,  arethanked for constructive criticism that vastly improved the manuscript.

I  am  deeply  grateful  to  my  author­editor  Carol  Ann  Pelli  for  editing  the  language  of  thismanuscript, and also to architect Anna Pakkala for drawing the pictures of my thesis.

Special  thanks  go  to  my  teacher  of  ophthalmology  in  medical  school  in  1997,  Docent  PaulaSummanen.  She  inspired  my  interest  in  ophthalmology  at  the  beginning  of  my  career.  I  alsoowe special  thanks to Jouko Larinkari, MD and Tapio Stenborg, MD, for their encouragementand for teaching me the basics of ocular surgery and ophthalmology.

I  am  very  grateful  to  Richard  C.  Troutman,  MD,  and  the  International  Society  of  RefractiveSurgery of  the American Academy of Ophthalmology  for  the prestigious Troutman  Award  in2007. I was privileged to meet Dr. Troutman, a pioneer  in microsurgery of  the eye, and reallyappreciate his encouragement.

59

Scientific work has brought an enormous amount of joy and contentment into my life. I cannotimagine  my  years  as  an  ophthalmic  resident  without  being  involved  in  academic  research.Several interesting congresses around the world and many new friends are but a few examples.Research  has  opened  my  eyes  in  so  many  ways  and  given  me  courage  to  make  my  owndecisions, not always blindly accepting information written by others.

I  am  deeply  grateful  to  have  wonderful  parents­in­law,  Arja  and  Tapani  Tuisku,  who  havealways been there for me and lent a helping hand.

I  have  been  blessed  with  loving  parents,  my  mother  Marja­Leena  and  my  late  father  SeppoTuominen.  They  have  always  been  supportive  and understanding  and  have  encouraged  me  tofollow in their footsteps as an MD. I remember discussions between my father and myself as alittle  boy about  the definition of an academic dissertation.  It was not easy  to understand whypeople have to argue about things – why can’t they just agree? It took some thirty years for meto discover the answer. I also wish to thank my sister Anna and my brothers Jouni and Joonasfor their interest in my project.

This  work  is  dedicated  to  my  family,  to  whom  I  owe  my  warmest  thanks,  especially  to  mywonderful wife Johanna, who has encouraged and sometimes even pressured me to finish thisthesis. She has always taken such good care of us boys (see below), although it has sometimesrequired  exceptionally  long  nerve  fibers.  My  two  lively  sons,  Tom  (4  years)  and  Matias  (3years), have brought an enormous amount of energy and joy into my life. Unfortunately, I havenot been able to do things with them as much as I would have  liked. Thankfully,  though, theyunderstand  that  we  are  not  always  able  to  do  our  men’s  jobs,  such  as  fixing  things  with  ourdifferent tools, because daddy must sometimes leave to fix eyes...

This work was supported by  the Mary and Georg C. Ehrnrooths Foundation,  the Finnish EyeFoundation,  the  Finnish  Medical  Society  Duodecim,  the  Finnish  Eye  and  Tissue  BankFoundation, the Friends of the Blind Foundation, the Paulo Foundation, and State EVO grants.

Helsinki, January 2008

     Ilpo S. Tuisku

60

REFERENCES:

Acosta  MC, Tan  ME,  Belmonte C,  Gallar  J.  Sensations  evoked  by  selective mechanical,  chemical,  and  thermalstimulation of the conjunctiva and cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42:2063­2067.

Albers KM, Wright DE, Davis BM. Overexpression of nerve growth factor in epidermis of transgenic mice causeshypertrophy of the peripheral nervous system. J Neurosci 1994;14:1422­1432.

Albietz JM, Lenton LM, McLennan SG. Effect of laser in situ keratomileusis for hyperopia on tear film and ocularsurface. J Refract Surg 2002;18:113­123.

Albietz  JM,  Lenton  LM.  Management  of  the  ocular  surface  and  tear  film  before,  during,  and after  laser  in  situkeratomileusis. J Refract Surg 2004a;20:62­71.

Albietz  JM,  Lenton  LM,  McLennan  SG.  Chronic  dry  eye  and  regression  after  laser  in  situ  keratomileusis  formyopia. J Cataract Refract Surg 2004b;30:675­684.

Albietz JM, Lenton LM, McLennan SG. Dry eye after LASIK: comparison of outcomes for Asian and Caucasianeyes. Clin Exp Optom 2005;88:89­96.

Ambrosio R, Tervo T, Wilson SE. LASIK associated dry eye and neurotrophic epitheliopathy: Pathophysiologyand strategies to prevention and treatment. J Refract Surg 2007. In Press.

Andresen  JL,  Ledet  T, Ehlers  N.  Keratocyte  migration  and peptide  growth  factors:  the  effect  of PDGF,  bFGF,EGF,  IGF­I, aFGF and TGF­beta on human keratocyte migration in a collagen gel. Curr Eye Res 1997;16:605­613.

Andresen  JL,  Ehlers  N.  Chemotaxis  of  human  keratocytes  is  increased  by  platelet­derived  growth  factor­BB,epidermal  growth  factor,  transforming  growth  factor­alpha,  acidic  fibroblast  growth  factor,  insulin­like  growthfactor­I, and transforming growth factor­beta. Curr Eye Res 1998;17:79­87.

Ang RT, Dartt DA, Tsubota K. Dry eye after refractive surgery. Curr Opin Ophthalmol 2001;12:318­322.

Apfel SC. Neurotrophic factors and pain. Clin J Pain 2000;16:S7­11.

Araki K, Ohashi Y, Kinoshita S, Hayashi K, Kuwayama Y, Tano Y. Epithelial wound healing in the denervatedcornea. Curr Eye Res 1994;13:203­211.

Auran JD, Koester CJ, Kleiman NJ, Rapaport R, Bomann JS, Wirotsko BM, Florakis GJ, Koniarek JP. Scanningslit confocal microscopic observation of cell morphology and movement within the normal human anterior cornea.Ophthalmology 1995;102:33­41.

Avunduk AM, Senft CJ, Emerah S, Varnell ED, Kaufman HE. Corneal healing after uncomplicated LASIK and itsrelationship  to  refractive  changes:  a  six­month  prospective  confocal  study.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci2004;45:1334­1339.

Barendregt PJ, van den Bent MJ, van Raaij­van den Aarssen VJ, van den Meiracker AH, Vecht CJ, van der HeijdeGL, Markusse HM. Involvement of the peripheral nervous system in primary Sjogren's syndrome. Ann Rheum Dis2001;60:876­881.

Bargagna­Mohan P, Strissel KJ, Fini ME. Regulation of gelatinase B production in corneal cells is independent ofautocrine IL­1alpha. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999;40:784­789.

Battat L, Macri A, Dursun D, Pflugfelder SC. Effects of laser in situ keratomileusis on tear production, clearance,and the ocular surface. Ophthalmology 2001;108:1230­1235.

Belmonte C, Acosta MC, Schmelz M, Gallar  J. Measurement of corneal  sensitivity  to mechanical and chemicalstimulation with a CO2 esthesiometer. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999;40:513­519.

61

Belmonte  C,  Acosta  MC,  Gallar  J.  Neural  basis  of  sensation  in  intact  and  injured  corneas.  Exp  Eye  Res2004;78:513­525.

Belmonte C and Tervo T. Pain in and around the eye. In Wall&Melzack’s Textbook of Pain: Kimber T (Ed).Elsevier 2005. ISBN 0443072876. Chapter 57, 887­901.

Benitez­del­Castillo  JM,  del  Rio  T,  Iradier  T,  Hernandez  JL,  Castillo  A,  Garcia­Sanchez  J.  Decrease  in  tearsecretion and corneal sensitivity after laser in situ keratomileusis. Cornea 2001;20:30­32.

Benitez­del­Castillo JM, Acosta MC, Wassfi MA, Diaz­Valle D, Gegundez JA, Fernandez C, Garcia­Sanchez J.Relation  between  corneal  innervation  with  confocal  microscopy  and  corneal  sensitivity  with  noncontactesthesiometry in patients with dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007;48:173­181.

Benitez  del  Castillo  JM,  Wasfy  MA,  Fernandez  C,  Garcia­Sanchez  J.  An  in  vivo  confocal  masked  study  oncorneal epithelium and subbasal nerves in patients with dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 2004;45:3030­3035.

Beuerman  RW,  Schimmelpfennig B.  Sensory  denervation of  the  rabbit  cornea affects  epithelial properties. ExpNeurol 1980;69:196­201.

Beuerman  RW,  Rozsa  AJ.  Collateral  sprouts  are  replaced  by  regenerating  neurites  in  the  wounded  cornealepithelium. Neurosci Lett 1984;44:99­104.

Bohnke  M,  Thaer  A,  Schipper  I.  Confocal  microscopy  reveals  persisting  stromal  changes  after  myopicphotorefractive keratectomy in zero haze corneas. Br J Ophthalmol 1998;82:1393­1400.

Botelho SY. Tears and the lacrimal gland. Sci Am 1964;211:78­86.

Botelho  SY,  Hisada  M,  Fuenmayor  N.  Functional  innervation  of  the  lacrimal  gland  in  the  cat.  Origin  ofsecretomotor fibers in the lacrimal nerve. Arch Ophthalmol 1966;76:581­588.

Bourcier  T,  Acosta  MC,  Borderie  V,  Borras  F,  Gallar  J,  Bury  T,  Laroche  L,  Belmonte  C.  Decreased  cornealsensitivity in patients with dry eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 2005;46:2341­2345.

Bragheeth MA, Dua HS. Corneal sensation after myopic and hyperopic LASIK: clinical and confocal microscopicstudy. Br J Ophthalmol 2005;89:580­585.

Bron AJ. Vortex patterns of the corneal epithelium. Trans Ophthalmol Soc U K 1973;93:455­472.

Bron AJ. Diagnosis of dry eye. Surv Ophthalmol 2001;45 Suppl 2:S221­S226.

Calvillo  MP,  McLaren  JW,  Hodge  DO,  Bourne  WM.  Corneal  reinnervation  after  LASIK:  prospective  3­yearlongitudinal study. Invest Ophthalmol Vis Sci 2004;45:3991­3996.

Campos  M,  Szerenyi  K,  Lee  M,  McDonnell  JM,  Lopez  PF,  McDonnell  PJ.  Keratocyte  loss  after  cornealdeepithelialization in primates and rabbits. Arch Ophthalmol 1994;112:254­260.

Chuck RS, Quiros PA, Perez AC, McDonnell PJ. Corneal sensation after laser in situ keratomileusis.  J CataractRefract Surg 2000;26:337­339.

Corbett  MC,  Prydal  JI,  Verma  S,  Oliver  KM,  Pande  M,  Marshall  J.  An  in  vivo  investigation  of  the  structuresresponsible for corneal haze after photorefractive keratectomy and their effect on visual function. Ophthalmology1996;103:1366­1380.

De  Paiva  CS,  Pflugfelder  SC.  Corneal  epitheliopathy  of  dry  eye  induces  hyperesthesia  to  mechanical  air  jetstimulation. Am J Ophthalmol 2004;137:109­115.

De  Paiva  CS,  Chen  Z,  Koch  DD,  Hamill  MB,  Manuel  FK,  Hassan  SS,  Wilhelmus  KR,  Pflugfelder  SC.  Theincidence and risk factors for developing dry eye after myopic LASIK. Am J Ophthalmol 2006;141:438­445.

62

Del Pero RA, Gigstad JE, Roberts AD, Klintworth GK, Martin CA, L'Esperance FA, Jr., Taylor DM. A refractiveand histopathologic study of excimer laser keratectomy in primates. Am J Ophthalmol 1990;109:419­429.

Dogru M, Stern ME, Smith JA, Foulks GN, Lemp MA, Tsubota K. Changing trends in the definition and diagnosisof dry eyes. Am J Ophthalmol 2005;140:507­508.

Dohlman CH, Gasset AR, Rose J. The effect of the absence of corneal epithelium or endothelium on the stromalkeratocytes. Invest Ophthalmol 1968;7:520­534.

Donnenfeld ED, Solomon K, Perry HD, Doshi SJ, Ehrenhaus M, Solomon R, Biser S. The effect of hinge positionon corneal sensation and dry eye after LASIK. Ophthalmology 2003;110:1023­1029.

Donnenfeld ED, Ehrenhaus  M, Solomon  R, Mazurek  J, Rozell  JC,  Perry  HD.  Effect  of  hinge  width on  cornealsensation and dry eye after laser in situ keratomileusis. J Cataract Refract Surg 2004;30:790­797.

Doughty MJ, Zaman ML. Human corneal thickness and its impact on intraocular pressure measures: a review andmeta­analysis approach. Surv Ophthalmol 2000;44:367­408.

Dua HS, Azuara­Blanco A. Limbal stem cells of the corneal epithelium. Surv Ophthalmol 2000;44:415­425.

Duffey RJ, Leaming D. US trends in refractive surgery: 2004 ISRS/AAO Survey. J Refract Surg 2005;21:742­748.

Ehlers  N.  Some  comparative  studies  on  the  mammalian  corneal  epithelium.  Acta  Ophthalmol  (Copenh)1970;48:821­828.

Erie JC, McLaren JW, Hodge DO, Bourne WM. The effect of age on the corneal subbasal nerve plexus. Cornea2005a;24:705­709.

Erie  JC,  McLaren  JW,  Hodge  DO,  Bourne  WM.  Recovery  of  corneal  subbasal  nerve  density  after  PRK  andLASIK. Am J Ophthalmol 2005b;140:1059­1064.

Fini ME, Girard MT, Matsubara M, Bartlett JD. Unique regulation of the matrix metalloproteinase, gelatinase B.Invest Ophthalmol Vis Sci 1995;36:622­633.

Fini  ME,  Stramer  BM.  How  the  cornea  heals:  cornea­specific  repair  mechanisms  affecting  surgical  outcomes.Cornea 2005;24:S2­S11.

Fox RI, Stern M, Michelson P. Update in Sjogren syndrome. Curr Opin Rheumatol 2000;12:391­398.

Fox  RI,  Stern  M.  Sjogren's  syndrome:  mechanisms  of  pathogenesis  involve  interaction  of  immune  andneurosecretory systems. Scand J Rheumatol Suppl 2002;3­13.

Frueh  BE,  Cadez  R,  Bohnke  M.  In  vivo  confocal  microscopy  after  photorefractive  keratectomy  in  humans.  Aprospective, long­term study. Arch Ophthalmol 1998;116:1425­1431.

Fujikawa  LS,  Foster  CS,  Gipson  IK,  Colvin  RB.  Basement  membrane  components  in  healing  rabbit  cornealepithelial wounds: immunofluorescence and ultrastructural studies. J Cell Biol 1984;98:128­138.

Fukiage C, Nakajima T, Takayama Y, Minagawa Y, Shearer TR, Azuma M. PACAP induces neurite outgrowth incultured  trigeminal  ganglion  cells  and  recovery  of  corneal  sensitivity  after  flap  surgery  in  rabbits.  Am  JOphthalmol 2007;143:255­262.

Gallar  J, Acosta MC, Moilanen JA, Holopainen JM, Belmonte C, Tervo TM. Recovery of corneal  sensitivity  tomechanical and chemical stimulation after laser in situ keratomileusis. J Refract Surg 2004;20:229­235.

Gao  J,  Gelber­Schwalb  TA,  Addeo  JV,  Stern  ME.  Apoptosis  in  the  rabbit  cornea  after  photorefractivekeratectomy. Cornea 1997;16:200­208.

Gartry  DS,  Kerr  Muir  MG,  Marshall  J.  Excimer  laser  photorefractive  keratectomy.  18­month  follow­up.Ophthalmology 1992;99:1209­1219.

63

Gemignani  F,  Marbini  A,  Pavesi  G,  Di  VS,  Manganelli  P,  Cenacchi  G,  Mancia  D.  Peripheral  neuropathyassociated with primary Sjogren's syndrome. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994;57:983­986.

Ghoreishi M, Aidenloo NS, Peyman A, Peyman M, Haghdoustoskoey M. Does hinge position affect dry eye afterlaser in situ keratomileusis? Ophthalmologica 2005;219:276­280.

Gillette TE, Chandler JW, Greiner JV. Langerhans cells of the ocular surface. Ophthalmology 1982;89:700­711.

Gimbel HV, DeBroff BM, Beldavs RA, van Westenbrugge JA, Ferensowicz M. Comparison of laser and manualremoval of corneal epithelium for photorefractive keratectomy. J Refract Surg 1995;11:36­41.

Gipson  IK,  Spurr­Michaud  S,  Tisdale  A,  Keough  M.  Reassembly  of  the  anchoring  structures  of  the  cornealepithelium during wound repair in the rabbit. Invest Ophthalmol Vis Sci 1989;30:425­434.

Girard  MT,  Matsubara  M,  Fini  ME.  Transforming  growth  factor­beta  and  interleukin­1  modulatemetalloproteinase expression by corneal stromal cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 1991;32:2441­2454.

Gould HJ, III, Gould TN, England JD, Paul D, Liu ZP, Levinson SR. A possible role for nerve growth factor in theaugmentation of sodium channels in models of chronic pain. Brain Res 2000;854:19­29.

Griffin JW, Cornblath DR, Alexander E, Campbell  J, Low PA, Bird S, Feldman EL. Ataxic sensory neuropathyand dorsal root ganglionitis associated with Sjogren's syndrome. Ann Neurol 1990;27:304­315.

Grupcheva  CN,  Wong  T,  Riley  AF,  McGhee  CN.  Assessing  the  sub­basal  nerve  plexus  of  the  living  healthyhuman cornea by in vivo confocal microscopy. Clin Experiment Ophthalmol 2002;30:187­190.

Gupta A, Monroy D, Ji Z, Yoshino K, Huang A, Pflugfelder SC. Transforming growth factor beta­1 and beta­2 inhuman tear fluid. Curr Eye Res 1996;15:605­614.

Hakala  M,  Niemela  RK.  Does  autonomic  nervous  impairment  have  a  role  in  pathophysiology  of  Sjogren'ssyndrome. Lancet 2000;355:1032­1033.

Hamrah P, Zhang Q, Liu Y, Dana MR. Novel  characterization of MHC class  II­negative population of  residentcorneal Langerhans cell­type dendritic cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002;43:639­646.

Hamrah  P,  Liu  Y,  Zhang  Q,  Dana  MR.  The  corneal  stroma  is  endowed  with  a  significant  number  of  residentdendritic cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003a;44:581­589.

Hamrah P, Liu Y, Zhang Q, Dana MR. Alterations in corneal stromal dendritic cell phenotype and distribution ininflammation. Arch Ophthalmol 2003b;121:1132­1140.

Hanna  C,  O'Brien  JE.  Cell  production  and  migration  in  the  epithelial  layer  of  the  cornea.  Arch  Ophthalmol1960;64:536­539.

Hanna KD, Pouliquen Y, Waring GO, III, Savoldelli M, Cotter J, Morton K, Menasche M. Corneal stromal woundhealing in rabbits after 193­nm excimer laser surface ablation. Arch Ophthalmol 1989;107:895­901.

Hargrave SL,  Jung JC, Fini ME, Gelender H, Cather C, Guidera A, Udell  I, Fisher S,  Jester  JV, Bowman RW,McCulley  JP,  Cavanagh  HD.  Possible  role  of  the  vitamin  E  solubilizer  in  topical  diclofenac  on  matrixmetalloproteinase  expression  in  corneal  melting:  an  analysis  of  postoperative  keratolysis.  Ophthalmology2002;109:343­350.

Hasan W, Zhang R, Liu M, Warn JD, Smith PG. Coordinate expression of NGF and alpha­smooth muscle actinmRNA and protein in cutaneous wound tissue of developing and adult rats. Cell Tissue Res 2000;300:97­109.

Heinz  P,  Bodanowitz  S,  Wiegand  W,  Kroll  P.  In  vivo  observation  of  corneal  nerve  regeneration  afterphotorefractive keratectomy with a confocal videomicroscope. Ger J Ophthalmol 1996;5:373­377.

Helena MC, Baerveldt F, Kim WJ, Wilson SE. Keratocyte apoptosis after corneal surgery. Invest Ophthalmol VisSci 1998;39:276­283.

64

Herrmann H, Lebeau PL. ATP level, cell injury, and apparent epithelium­stroma interaction in  the cornea. J CellBiol 1962;13:465­467.

Hietaharju A, Yli­Kerttula U, Hakkinen V, Frey H. Nervous system manifestations in Sjogren's  syndrome. ActaNeurol Scand 1990;81:144­152.

Hong JW, Kim HM. The changes of tear break up time after myopic excimer laser photorefractive keratectomy.Korean J Ophthalmol 1997;11:89­93.

Hoppenreijs VP, Pels E, Vrensen GF, Felten PC, Treffers WF. Platelet­derived growth factor: receptor expressionin corneas and effects on corneal cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 1993;34:637­649.

Hovanesian  JA,  Shah  SS,  Maloney  RK.  Symptoms  of  dry  eye  and  recurrent  erosion  syndrome  after  refractivesurgery. J Cataract Refract Surg 2001;27:577­584.

Ihanamaki T, Pelliniemi LJ, Vuorio E. Collagens and collagen­related matrix components in the human and mouseeye. Prog Retin Eye Res 2004;23:403­434.

Ishikawa T, del Cerro M, Liang FQ, Loya N, Aquavella JV. Corneal sensitivity and nerve regeneration after excimerlaser ablation. Cornea 1994;13:225­231.

Imai  S,  Tokunaga  Y,  Konttinen  YT,  Maeda  T,  Hukuda  S,  Santavirta  S.  Ultrastructure  of  the  synovial  sensorypeptidergic  fibers  is  distinctively  altered  in  different  phases  of  adjuvant  induced  arthritis  in  rats:ultramorphological characterization combined with morphometric and  immunohistochemical  study  for  substanceP, calcitonin gene related peptide, and protein gene product 9.5. J Rheumatol 1997;24:2177­2187.

Jester  JV,  Petroll  WM,  Barry  PA,  Cavanagh  HD.  Expression  of  alpha­smooth  muscle  (alpha­SM)  actin  duringcorneal stromal wound healing. Invest Ophthalmol Vis Sci 1995;36:809­819.

Jester  JV,  Barry­Lane  PA, Cavanagh  HD,  Petroll  WM.  Induction  of  alpha­smooth  muscle actin  expression  andmyofibroblast transformation in cultured corneal keratocytes. Cornea 1996;15:505­516.

Jester  JV,  Barry­Lane  PA,  Petroll  WM,  Olsen  DR,  Cavanagh  HD.  Inhibition  of  corneal  fibrosis  by  topicalapplication of blocking antibodies to TGF beta in the rabbit. Cornea 1997;16:177­187.

Jester  JV,  Huang  J,  Barry­Lane  PA,  Kao  WW,  Petroll  WM,  Cavanagh  HD.  Transforming  growth  factor(beta)­mediated corneal myofibroblast differentiation requires actin and fibronectin assembly. Invest Ophthalmol Vis Sci1999;40:1959­1967.

Jester  JV,  Petroll  WM,  Cavanagh  HD.  Corneal  stromal  wound  healing  in  refractive  surgery:  the  role  ofmyofibroblasts. Prog Retin Eye Res 1999;18:311­356.

Jester  JV,  Huang  J,  Petroll  WM,  Cavanagh  HD.  TGFbeta  induced  myofibroblast  differentiation  of  rabbitkeratocytes requires synergistic TGFbeta, PDGF and integrin signaling. Exp Eye Res 2002;75:645­657.

Jester  JV,  Huang  J,  Fisher  S,  Spiekerman  J,  Chang  JH,  Wright  WE,  Shay  JW.  Myofibroblast  differentiation  ofnormal  human  keratocytes  and  hTERT,  extended­life  human  corneal  fibroblasts.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci2003;44:1850­1858.

Johnson  DH,  Bourne  WM,  Campbell  RJ.  The  ultrastructure  of  Descemet's  membrane.  I.  Changes  with  age  innormal corneas. Arch Ophthalmol 1982;100:1942­1947.

Jones MA, Marfurt CF. Peptidergic innervation of the rat cornea. Exp Eye Res 1998;66:421­435.

Jones SM, Kazlauskas A. Growth factor­dependent signaling and cell cycle progression. FEBS Lett 2001;490:110­116.

Joo MJ, Yuhan KR, Hyon JY, Lai H, Hose S, Sinha D, O'Brien TP. The effect of nerve growth factor on cornealsensitivity after laser in situ keratomileusis. Arch Ophthalmol 2004;122:1338­1341.

65

Kaltreider HB, Talal N. The neuropathy of Sjogren's  syndrome. Trigeminal nerve  involvement. Ann Intern Med1969;70:751­762.

Kamiyama K, Iguchi I, Wang X, Imanishi J. Effects of PDGF on the migration of rabbit corneal fibroblasts andepithelial cells. Cornea 1998;17:315­325.

Kaplan  JG,  Rosenberg  R,  Reinitz  E,  Buchbinder  S,  Schaumburg  HH.  Invited  review:  peripheral  neuropathy  inSjogren's syndrome. Muscle Nerve 1990;13:570­579.

Kauffmann T, Bodanowitz S, Hesse L, Kroll P. Corneal reinnervation after photorefractive keratectomy and laserin situ keratomileusis: an in vivo study with a confocal videomicroscope. Ger J Ophthalmol 1996;5:508­512.

Kaye DB. Epithelial response in penetrating keratoplasty. Am J Ophthalmol 1980;89:381­387.

Kim  WJ,  Mohan  RR,  Mohan  RR,  Wilson  SE.  Effect  of  PDGF,  IL­1alpha,  and  BMP2/4  on  corneal  fibroblastchemotaxis:  expression  of  the  platelet­derived  growth  factor  system  in  the  cornea.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci1999;40:1364­1372.

Kim  WS,  Kim  JS.  Change  in  corneal  sensitivity  following  laser  in  situ keratomileusis.  J  Cataract  Refract  Surg1999;25:368­373.

Kokawa N, Sotozono C, Nishida K, Kinoshita S. High total TGF­beta 2 levels in normal human tears. Curr EyeRes 1996;15:341­343.

Komai Y, Ushiki T. The three­dimensional organization of collagen fibrils in the human cornea and sclera. InvestOphthalmol Vis Sci 1991;32:2244­2258.

Kruse  FE,  Chen  JJ,  Tsai  RJ,  Tseng  SC.  Conjunctival  transdifferentiation  is  due  to  the  incomplete  removal  oflimbal basal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci 1990;31:1903­1913.

Kumano Y, Matsui H, Zushi I, Mawatari A, Matsui T, Nishida T, Miyazaki M. Recovery of corneal sensation aftermyopic  correction  by  laser  in  situ  keratomileusis  with  a  nasal  or  superior  hinge.  J  Cataract  Refract  Surg2003;29:757­761.

Lambiase  A,  Manni  L,  Bonini  S,  Rama  P,  Micera  A,  Aloe  L.  Nerve  growth  factor  promotes  corneal  healing:structural,  biochemical,  and  molecular  analyses  of  rat  and  human  corneas.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci2000;41:1063­1069.

Latvala  T,  Linna  T,  Tervo  T.  Corneal  nerve  recovery  after  photorefractive  keratectomy  and  laser  in  situkeratomileusis. Int Ophthalmol Clin 1996;36:21­27.

Lee  BH,  McLaren  JW,  Erie  JC,  Hodge  DO,  Bourne  WM.  Reinnervation  in  the  cornea  after  LASIK.  InvestOphthalmol Vis Sci 2002;43:3660­3664.

Lee  HK,  Lee  KS,  Kim  HC,  Lee  SH,  Kim  EK.  Nerve  growth  factor  concentration  and  implications  inphotorefractive keratectomy vs laser in situ keratomileusis. Am J Ophthalmol 2005;139:965­971.

Lee  HK,  Ryu  IH,  Seo  KY,  Hong  S,  Kim  HC,  Kim EK.  Topical  0.1%  prednisolone  lowers nerve  growth  factorexpression in keratoconjunctivitis sicca patients. Ophthalmology 2006;113:198­205.

Lemp MA, Mathers WD. Corneal epithelial cell movement in humans. Eye 1989;3 ( Pt 4):438­445.

Lemp  MA.  Report  of  the  National  Eye  Institute/Industry  workshop  on  Clinical  Trials  in  Dry  Eyes.  CLAO  J1995;21:221­232.

Lemp MA and the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). Thedefinition  and  classification  of  dry  eye  disease:  report  of  the  Definition  and  Classification  Subcommittee  of  theInternational Dry Eye WorkShop (2007). Ocul Surf. 2007;5:75­92.

66

Lenton LM, Albietz JM. Effect of carmellose­based artificial tears on the ocular surface in eyes after laser in situkeratomileusis. J Refract Surg 1999;15:S227­S231.

Lewin  GR,  Ritter  AM,  Mendell  LM.  Nerve growth  factor­induced hyperalgesia  in  the neonatal  and  adult  rat.  JNeurosci 1993;13:2136­2148.

Li  DQ,  Tseng  SC.  Differential  regulation  of  cytokine  and  receptor  transcript  expression  in  human  corneal  andlimbal fibroblasts by epidermal growth factor, transforming growth factor­alpha, platelet­derived growth factor B,and interleukin­1 beta. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996;37:2068­2080.

Li DQ, Tseng SC. Differential regulation of keratinocyte growth factor and hepatocyte growth factor/scatter factorby different cytokines in human corneal and limbal fibroblasts. J Cell Physiol 1997;172:361­372.

Li  HF,  Petroll  WM,  Moller­Pedersen  T,  Maurer  JK,  Cavanagh  HD,  Jester  JV.  Epithelial  and  corneal  thicknessmeasurements by in vivo confocal microscopy through focusing (CMTF). Curr Eye Res 1997;16:214­221.

Li W, Hayashida Y, Chen YT, Tseng SC. Niche regulation of corneal epithelial stem cells at the limbus. Cell Res2007;17:26­36.

Linna T, Tervo T. Real­time confocal microscopic observations on human corneal nerves and wound healing afterexcimer laser photorefractive keratectomy. Curr Eye Res 1997;16:640­649.

Linna TU, Perez­Santonja JJ, Tervo KM, Sakla HF, Sanz JL, Tervo TM. Recovery of corneal nerve morphologyfollowing laser in situ keratomileusis. Exp Eye Res 1998;66:755­763.

Linna  TU,  Vesaluoma  MH,  Perez­Santonja  JJ,  Petroll  WM,  Alio  JL,  Tervo  TM.  Effect  of  myopic  LASIK  oncorneal sensitivity and morphology of subbasal nerves. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000;41:393­397.

Maldonado  BA,  Furcht  LT.  Epidermal  growth  factor  stimulates  integrin­mediated  cell  migration  of  culturedhuman corneal epithelial cells on fibronectin and arginine­glycine­aspartic acid peptide. Invest Ophthalmol Vis Sci1995;36:2120­2126.

Mastropasqua  L,  Nubile  M,  Lanzini  M,  Carpineto  P,  Ciancaglini  M,  Pannellini  T,  Di  NM,  Dua  HS.  Epithelialdendritic  cell  distribution  in  normal  and  inflamed  human  cornea:  in  vivo  confocal  microscopy  study.  Am  JOphthalmol 2006;142:736­744.

Matsui H, Kumano Y, Zushi I, Yamada T, Matsui T, Nishida T. Corneal sensation after correction of myopia byphotorefractive keratectomy and laser in situ keratomileusis. J Cataract Refract Surg 2001;27:370­373.

McDonald MB, Deitz MR, Frantz JM, Kraff MC, Krueger RR, Salz JJ, Kraff CR, Maguen E, Matta CS, NesburnAB, Piebenga LW. Photorefractive keratectomy for low­to­moderate myopia and astigmatism with a small­beam,tracker­directed excimer laser. Ophthalmology 1999;106:1481­1488.

McDonald  MB,  Carr  JD,  Frantz  JM,  Kozarsky  AM,  Maguen E,  Nesburn  AB,  Rabinowitz  YS,  Salz  JJ,  StultingRD,  Thompson  KP,  Waring  GO,  III.  Laser  in  situ  keratomileusis  for  myopia  up  to  ­11  diopters  with  up  to  ­5diopters  of  astigmatism  with  the  summit  autonomous  LADARVision  excimer  laser  system.  Ophthalmology2001;108:309­316.

Mellgren  SI,  Conn DL,  Stevens  JC,  Dyck  PJ.  Peripheral neuropathy  in  primary  Sjogren's  syndrome.  Neurology1989;39:390­394.

Michaeli A, Slomovic AR, Sakhichand K, Rootman DS. Effect of laser in situ keratomileusis on tear secretion andcorneal sensitivity. J Refract Surg 2004;20:379­383.

Millodot  M,  Larson  W.  New  measurements  of  corneal  sensitivity:  a  preliminary  report.  Am  J  Optom  Arch  AmAcad Optom 1969;46:261­265.

Millodot M. The influence of age onthe sensitivity of the cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci 1977;16:240­242.

67

Mohan  RR,  Liang  Q,  Kim  WJ,  Helena  MC,  Baerveldt  F,  Wilson  SE.  Apoptosis  in  the  cornea:  furthercharacterization of Fas/Fas ligand system. Exp Eye Res 1997;65:575­589.

Moilanen  JA,  Vesaluoma  MH,  Muller  LJ,  Tervo  TM.  Long­term  corneal  morphology  after  PRK  by  in  vivoconfocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003;44:1064­1069.

Moller­Pedersen T, Vogel M, Li HF, Petroll WM, Cavanagh HD, Jester  JV. Quantification of  stromal  thinning,epithelial  thickness,  and  corneal  haze  after  photorefractive  keratectomy  using  in  vivo  confocal  microscopy.Ophthalmology 1997;104:360­368.

Moller­Pedersen T, Li HF, Petroll WM, Cavanagh HD, Jester JV. Confocal microscopic characterization of woundrepair after photorefractive keratectomy. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998a;39:487­501.

Moller­Pedersen T, Cavanagh HD, Petroll WM,  Jester  JV. Neutralizing antibody  to TGFbeta modulates  stromalfibrosis but not regression of photoablative effect following PRK. Curr Eye Res 1998b;17:736­747.

Muller LJ, Pels L, Vrensen GF. Ultrastructural organization of human corneal nerves. Invest Ophthalmol Vis Sci1996;37:476­488.

Muller  LJ,  Vrensen  GF,  Pels  L,  Cardozo  BN,  Willekens  B.  Architecture  of  human  corneal  nerves.  InvestOphthalmol Vis Sci 1997;38:985­994.

Muller  LJ,  Pels  E,  Vrensen  GF.  The  specific  architecture  of  the  anterior  stroma  accounts  for  maintenance  ofcorneal curvature. Br J Ophthalmol 2001;85:437­443.

Muller  LJ,  Marfurt  CF,  Kruse  F,  Tervo  TM.  Corneal  nerves:  structure,  contents  and  function.  Exp  Eye  Res2003;76:521­542.

Murphy  PJ,  Lawrenson  JG,  Patel  S,  Marshall  J.  Reliability  of  the  non­contact  corneal  aesthesiometer  and  itscomparison with the Cochet­Bonnet aesthesiometer. Ophthalmic Physiol Opt 1998;18:532­539.

Mustonen RK, McDonald MB, Srivannaboon S, Tan AL, Doubrava MW, Kim CK. In vivo confocal microscopyof Fuchs' endothelial dystrophy. Cornea 1998;17:493­503.

Myers JS, Gomes JA, Siepser SB, Rapuano CJ, Eagle RC, Jr., Thom SB. Effect of transforming growth factor beta1 on stromal haze following excimer laser photorefractive keratectomy in rabbits. J Refract Surg 1997;13:356­361.

Nagasaki  T,  Zhao  J.  Centripetal  movement  of  corneal  epithelial  cells  in  the  normal  adult  mouse.  InvestOphthalmol Vis Sci 2003;44:558­566.

Nakamura  M,  Ofuji  K,  Chikama  T,  Nishida  T.  The  NK1  receptor  and  its  participation  in  the  synergisticenhancement  of  corneal  epithelial  migration  by  substance  P  and  insulin­like  growth  factor­1.  Br  J  Pharmacol1997;120:547­552.

Nakayasu K. Stromal changes following removal of epithelium in rat cornea. Jpn J Ophthalmol 1988;32:113­125.

Nassaralla  BA,  McLeod  SD,  Nassaralla  JJ,  Jr.  Effect  of  myopic  LASIK  on  human  corneal  sensitivity.Ophthalmology 2003;110:497­502.

Nassaralla BA, McLeod SD, Boteon JE, Nassaralla JJ, Jr. The effect of hinge position and depth plate on the rateof recovery of corneal sensation following LASIK. Am J Ophthalmol 2005;139:118­124.

Nejima R, Miyata K, Tanabe T, Okamoto F, Hiraoka T, Kiuchi T, Oshika T. Corneal barrier  function, tear  filmstability,  and  corneal  sensation  after  photorefractive  keratectomy  and  laser  in  situ  keratomileusis.  Am  JOphthalmol 2005;139:64­71.

Niederkorn  JY,  Stern  ME,  Pflugfelder  SC,  De  Paiva  CS,  Corrales  RM,  Gao  J,  Siemasko  K.  Desiccating  stressinduces T cell­mediated Sjogren's Syndrome­like lacrimal keratoconjunctivitis. J Immunol 2006;176:3950­3957.

68

Nishida T. Cornea. In Cornea Volume 1: Fundamentals, diagnosis and management. Eds. Krachmer JH, MannisMJ and Holland EJ. 2005: 3­26. Elsevier Mosby, London, UK.

Niissalo  S,  Hukkanen  M,  Imai  S,  Tornwall  J,  Konttinen  YT.  Neuropeptides  in  experimental  and  degenerativearthritis. Ann N Y Acad Sci 2002;966:384­399.

Nikkinen A, Lehtosalo JI, Uusitalo H, Palkama A, Panula P. The lacrimal glands of the rat and the guinea pig areinnervated  by  nerve  fibers  containing  immunoreactivities  for  substance  P  and vasoactive  intestinal  polypeptide.Histochemistry 1984;81:23­27.

Nishida K, Sotozono C, Adachi W, Yamamoto S, Yokoi N, Kinoshita S. Transforming growth factor­beta 1, ­beta2 and ­beta 3 mRNA expression in human cornea. Curr Eye Res 1995;14:235­241.

Ohji M, Sundarraj N, Thoft RA. Transforming growth factor­beta stimulates collagen and fibronectin synthesis byhuman corneal stromal fibroblasts in vitro. Curr Eye Res 1993;12:703­709.

Oliveira­Soto L, Efron N. Morphology of corneal nerves using confocal microscopy. Cornea 2001;20:374­384.

Olney RK. Neuropathies associated with connective tissue disease. Semin Neurol 1998;18:63­72.

Pallikaris IG, Papatzanaki ME, Stathi EZ, Frenschock O, Georgiadis A. Laser in situ keratomileusis. Lasers SurgMed 1990;10:463­468.

Pallikaris  IG,  Karoutis  AD,  Lydataki  SE,  Siganos  DS.  Rotating  brush  for  fast  removal  of  corneal  epithelium.  JRefract Corneal Surg 1994;10:439­442.

Patel DV, McGhee CN. Mapping of the normal human corneal sub­basal nerve plexus by in vivo laser scanningconfocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci 2005;46:4485­4488.

Patel DV, McGhee CN. Mapping the Corneal Sub­basal Nerve Plexus in Keratoconus by In Vivo Laser ScanningConfocal Microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006;47:1348­1351.

Perez­Gomez  I,  Efron  N.  Change  to  corneal  morphology  after  refractive  surgery  (myopic  laser  in  situkeratomileusis) as viewed with a confocal microscope. Optom Vis Sci 2003;80:690­697.

Perez­Santonja JJ, Sakla HF, Cardona C, Chipont E, Alio JL. Corneal sensitivity after photorefractive keratectomyand laser in situ keratomileusis for low myopia. Am J Ophthalmol 1999;127:497­504.

Petridou  S,  Maltseva  O,  Spanakis  S,  Masur  SK.  TGF­beta  receptor  expression  and  smad2  localization  are  celldensity dependent in fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000;41:89­95.

Petroll WM, Cavanagh HD, Jester JV. Clinical confocal microscopy. Curr Opin Ophthalmol 1998;9:59­65.

Pflugfelder  SC,  Solomon  A,  Stern  ME.  The  diagnosis  and  management  of  dry  eye:  a  twenty­five­year  review.Cornea 2000;19:644­649.

Pflugfelder SC. Antiinflammatory therapy for dry eye. Am J Ophthalmol 2004;137:337­342.

Radner  W,  Mallinger  R.  Interlacing  of  collagen  lamellae  in  the  midstroma  of  the  human  cornea.  Cornea2002;21:598­601.

Riley GP, Harrall RL, Watson PG, Cawston TE, Hazleman BL. Collagenase (MMP­1) and TIMP­1 in destructivecorneal disease associated with rheumatoid arthritis. Eye 1995;9 ( Pt 6):703­718.

Rosenberg  ME,  Tervo  TM,  Petroll  WM,  Vesaluoma  MH.  In  vivo  confocal  microscopy  of  patients with  cornealrecurrent erosion syndrome or epithelial basement membrane dystrophy. Ophthalmology 2000;107:565­573.

Rosenberg ME, Tervo TM,  Immonen  IJ, Muller LJ, Gronhagen­Riska C, Vesaluoma MH. Corneal  structure andsensitivity in type 1 diabetes mellitus. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000;41:2915­2921.

69

Rosenberg  ME,  Tervo  TM,  Gallar  J,  Acosta  MC,  Muller  LJ,  Moilanen  JA,  Tarkkanen  AH,  Vesaluoma  MH.Corneal  morphology  and  sensitivity  in  lattice  dystrophy  type  II  (familial  amyloidosis,  Finnish  type).  InvestOphthalmol Vis Sci 2001;42:634­641.

Rosenberg ME, Tervo TM, Muller LJ, Moilanen JA, Vesaluoma MH.  In vivo confocal microscopy after herpeskeratitis. Cornea 2002;21:265­269.

Rozsa AJ, Beuerman RW. Density and organization of free nerve endings in the corneal epithelium of the rabbit.Pain 1982;14:105­120.

Rozsa  AJ,  Guss  RB,  Beuerman  RW.  Neural  remodeling  following  experimental  surgery  of  the  rabbit  cornea.Invest Ophthalmol Vis Sci 1983;24:1033­1051.

Ruskell GL. Ocular fibres of the maxillary nerve in monkeys. J Anat 1974;118:195­203.

Schiffman RM, Christianson MD, Jacobsen G, Hirsch JD, Reis BL. Reliability and validity of the Ocular SurfaceDisease Index. Arch Ophthalmol 2000;118:615­621.

Schimmelpfennig  B. Nerve  structures  in human  central  corneal  epithelium.  Graefes  Arch  Clin  Exp  Ophthalmol1982;218:14­20.

Seiler  T,  Wollensak  J.  Myopic  photorefractive  keratectomy  with  the  excimer  laser.  One­year  follow­up.Ophthalmology 1991;98:1156­1163.

Seiler T, Derse M, Pham T. Repeated excimer laser treatment after photorefractive keratectomy. Arch Ophthalmol1992;110:1230­1233.

Shah  S,  Chatterjee  A,  Smith  RJ.  Predictability  of  spherical  photorefractive  keratectomy  for  myopia.Ophthalmology 1998;105:2178­2184.

Shin  SY,  Lee  YJ.  Conjunctival  changes  induced  by  LASIK  suction  ring  in  a  rabbit  model.  Ophthalmic  Res2006;38:343­349.

Shoja  MR,  Besharati  MR.  Dry  eye  after  LASIK  for  myopia:  Incidence  and  risk  factors.  Eur  J  Ophthalmol2007;17:1­6.

Sibony  PA,  Walcott  B,  McKeon  C,  Jakobiec  FA.  Vasoactive  intestinal  polypeptide  and  the  innervation  of  thehuman lacrimal gland. Arch Ophthalmol 1988;106:1085­1088.

Slowik  C,  Somodi  S,  Richter  A,  Guthoff  R.  Assessment  of  corneal  alterations  following  laser  in  situkeratomileusis by confocal slit scanning microscopy. Ger J Ophthalmol 1996;5:526­531.

Smith JA and the Epidemiology Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The epidemiology ofdry  eye  disease:  report  of  the  Epidemiology  Subcommittee  of  the  International  Dry  Eye  WorkShop  (2007).  OculSurf. 2007;5:93­107.

Solomon A, Dursun D, Liu Z, Xie Y, Macri A, Pflugfelder SC. Pro­ and anti­inflammatory forms of Interleukin­1in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry­eye disease. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42:2283­2292.

Solomon  KD,  Holzer  MP,  Sandoval  HP,  Vargas  LG,  Werner  L,  Vroman  DT,  Kasper TJ,  Apple  DJ.  RefractiveSurgery Survey 2001. J Cataract Refract Surg 2002;28:346­355.

Song  QH,  Klepeis  VE,  Nugent  MA,  Trinkaus­Randall  V.  TGF­beta1  regulates  TGF­beta1  and  FGF­2  mRNAexpression during fibroblast wound healing. Mol Pathol 2002;55:164­176.

Stapleton F, Hayward KB, Bachand N, Trong PH, Teh DW, Deng KM, Yang EI, Kelly SL, Lette M, Robinson D.Evaluation of Corneal Sensitivity to Mechanical and Chemical Stimuli After LASIK: A Pilot Study. Eye ContactLens 2006;32:88­93.

70

Stern  ME,  Gao  J,  Siemasko  KF,  Beuerman  RW,  Pflugfelder  SC. The  role  of  the  lacrimal  functional  unit  in  thepathophysiology of dry eye. Exp Eye Res 2004;78:409­416.

Stone RA, Kuwayama Y, Laties AM, McGlinn AM, Schmidt ML. Guinea­pig ocular nerves contain a peptide ofthe cholecystokinin/gastrin family. Exp Eye Res 1984;39:387­391.

Stone RA, Kuwayama Y, Terenghi G, Polak JM. Calcitonin gene­related peptide: occurrence  in  corneal  sensorynerves. Exp Eye Res 1986;43:279­283.

Stramer  BM,  Zieske  JD,  Jung  JC,  Austin  JS,  Fini  ME.  Molecular  mechanisms  controlling  the  fibrotic  repairphenotype in cornea: implications for surgical outcomes. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003;44:4237­4246.

Streppel  M,  Azzolin  N,  Dohm  S,  Guntinas­Lichius  O,  Haas  C,  Grothe  C,  Wevers  A,  Neiss  WF,  Angelov  DN.Focal  application  of  neutralizing  antibodies  to  soluble  neurotrophic  factors  reduces  collateral  axonal  branchingafter peripheral nerve lesion. Eur J Neurosci 2002;15:1327­1342.

Sugar  A,  Rapuano  CJ,  Culbertson  WW,  Huang  D,  Varley  GA,  Agapitos  PJ,  de  L,  V,  Koch  DD.  Laser  in  situkeratomileusis  for  myopia  and  astigmatism:  safety  and  efficacy:  a  report  by  the  American  Academy  ofOphthalmology. Ophthalmology 2002;109:175­187.

Suzuki  K,  Saito  J,  Yanai  R,  Yamada  N,  Chikama  T,  Seki  K,  Nishida  T.  Cell­matrix  and  cell­cell  interactionsduring corneal epithelial wound healing. Prog Retin Eye Res 2003;22:113­133.

Tajima  Y,  Mito  Y,  Owada  Y,  Tsukishima  E,  Moriwaka  F,  Tashiro  K.  Neurological  manifestations  of  primarySjogren's syndrome in Japanese patients. Intern Med 1997;36:690­693.

Tervo K, Tervo T, Eranko L, Vannas A, Cuello AC, Eranko O. Substance P­immunoreactive nerves in the humancornea and iris. Invest Ophthalmol Vis Sci 1982;23:671­674.

Tervo K, Latvala TM, Tervo TM. Recovery of corneal innervation following photorefractive keratoablation. ArchOphthalmol 1994;112:1466­1470.

Tervo T, Vesaluoma M, Bennett GL, Schwall R, Helena M, Liang Q, Wilson SE. Tear hepatocyte growth factor(HGF) availability increases markedly after excimer laser surface ablation. Exp Eye Res 1997;64:501­504.

Tervo T, Moilanen J. In vivo confocal microscopy  for evaluation of wound healing  following corneal refractivesurgery. Prog Retin Eye Res 2003;22:339­358.

Thoft  RA,  Friend  J.  The  X,  Y,  Z  hypothesis  of  corneal  epithelial  maintenance.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci1983;24:1442­1443.

Thompson  HW,  Beuerman  RW,  Cook  J,  Underwood  LW,  Nguyen  DH.  Transcription  of  message  for  tumornecrosis factor­alpha by lacrimal gland is regulated by corneal wounding. Adv Exp Med Biol 1994;350:211­217.

Tishler M, Yaron I, Geyer O, Shirazi I, Naftaliev E, Yaron M. Elevated tear interleukin­6 levels in patients withSjogren syndrome. Ophthalmology 1998;105:2327­2329.

Toda  I,  sano­Kato  N,  Komai­Hori  Y,  Tsubota  K.  Dry  eye  after  laser  in  situ  keratomileusis.  Am  J  Ophthalmol2001;132:1­7.

Toivanen M, Tervo T, Partanen M, Vannas A, Hervonen A. Histochemical demonstration of adrenergic nerves inthe stroma of human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci 1987;28:398­400.

Trabucchi G, Brancato R, Verdi M, Carones F, Sala C. Corneal nerve damage and regeneration after excimer laserphotokeratectomy in rabbit eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci 1994;35:229­235.

Trokel SL, Srinivasan R, Braren B. Excimer laser surgery of the cornea. Am J Ophthalmol 1983;96:710­715.

Tseng SC. Concept and application of limbal stem cells. Eye 1989;3 ( Pt 2):141­157.

71

Tsubota K, Xu KP, Fujihara T, Katagiri S, Takeuchi T. Decreased reflex  tearing  is associated with lymphocyticinfiltration in lacrimal glands. J Rheumatol 1996;23:313­320.

Tsukahara  S,  Jacobowitz  DM.  Peptidergic  innervation  of  the  rat  Harderian gland.  Histochemistry  1987;87:233­236.

Uddman R, Alumets J, Ehinger B, Hakanson R, Loren I, Sundler F. Vasoactive intestinal peptide nerves in ocularand orbital structures of the cat. Invest Ophthalmol Vis Sci 1980;19:878­885.

Valls­Sole  J,  Graus  F,  Font  J,  Pou  A,  Tolosa  ES.  Normal  proprioceptive  trigeminal  afferents  in  patients  withSjogren's syndrome and sensory neuronopathy. Ann Neurol 1990;28:786­790.

van Setten GB. Epidermal growth factor in human tear fluid: increased release but decreased concentrations duringreflex tearing. Curr Eye Res 1990;9:79­83.

Vesaluoma  M,  Teppo  AM,  Gronhagen­Riska  C,  Tervo  T. Release  of  TGF­beta  1 and  VEGF  in  tears  followingphotorefractive keratectomy. Curr Eye Res 1997a;16:19­25.

Vesaluoma  M,  Teppo  AM,  Gronhagen­Riska  C,  Tervo  T.  Increased  release  of  tumour  necrosis  factor­alpha  inhuman tear fluid after excimer laser induced corneal wound. Br J Ophthalmol 1997b;81:145­149.

Vesaluoma M, Teppo AM, Gronhagen­Riska C, Tervo T. Platelet­derived growth  factor­BB (PDGF­BB)  in tearfluid:  a  potential  modulator  of  corneal  wound  healing  following  photorefractive  keratectomy.  Curr  Eye  Res1997c;16:825­831.

Vesaluoma MH, Sankila EM, Gallar  J, Muller LJ, Petroll WM, Moilanen JA, Forsius H, Tervo TM. Autosomalrecessive  cornea  plana:  in  vivo  corneal  morphology  and  corneal  sensitivity.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci2000;41:2120­2126.

Villani E, Galimberti D, Viola F, Mapelli C, Ratiglia R. The cornea in Sjogren's  syndrome: an  in vivo confocalstudy. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007;48:2017­2022.

Virtanen T, Ylatupa S, Mertaniemi P, Partanen P, Tuunanen T, Tervo T. Tear fluid cellular fibronectin levels afterphotorefractive keratectomy. J Refract Surg 1995;11:106­112.

Vitali C, Bombardieri S, Jonsson R, Moutsopoulos HM, Alexander EL, Carsons SE, Daniels TE, Fox PC, Fox RI,Kassan SS, Pillemer SR, Talal N, Weisman MH. Classification criteria for Sjogren's syndrome: a revised versionof  the European  criteria proposed  by  the  American­European  Consensus  Group. Ann  Rheum  Dis  2002;61:554­558.

Vroman  DT,  Sandoval  HP,  Fernandez  de  Castro  LE,  Kasper  TJ,  Holzer  MP,  Solomon  KD.  Effect  of  hingelocation  on  corneal  sensation and  dry  eye  after  laser  in  situ  keratomileusis  for  myopia.  J  Cataract  Refract  Surg2005;31:1881­1887.

West­Mays JA, Sadow PM, Tobin TW, Strissel KJ, Cintron C, Fini ME. Repair phenotype in corneal fibroblasts iscontrolled by an interleukin­1 alpha autocrine feedback loop. Invest Ophthalmol Vis Sci 1997;38:1367­1379.

West­Mays  JA,  Cook  JR,  Sadow  PM,  Mullady  DK,  Bargagna­Mohan  P,  Strissel  KJ,  Fini  ME.  Differentialinhibition  of  collagenase  and  interleukin­1alpha  gene  expression  in  cultured  corneal  fibroblasts  by  TGF­beta,dexamethasone, and retinoic acid. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999;40:887­896.

Wilson  SE,  He  YG,  Lloyd  SA.  EGF,  EGF  receptor,  basic FGF,  TGF  beta­1, and  IL­1 alpha mRNA  in humancorneal epithelial cells and stromal fibroblasts. Invest Ophthalmol Vis Sci 1992;33:1756­1765.

Wilson  SE,  Walker  JW,  Chwang  EL,  He  YG.  Hepatocyte  growth  factor,  keratinocyte  growth  factor,  theirreceptors,  fibroblast  growth  factor  receptor­2,  and  the  cells  of  the  cornea.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci1993;34:2544­2561.

Wilson SE, Lloyd SA, He YG. Glucocorticoid receptor and interleukin­1 receptor messenger RNA expression incorneal cells. Cornea 1994a;13:4­8.

72

Wilson SE, Schultz GS, Chegini N, Weng J, He YG. Epidermal growth factor, transforming growth factor alpha,transforming growth factor beta, acidic fibroblast growth factor, basic fibroblast growth factor, and interleukin­1proteins in the cornea. Exp Eye Res 1994b;59:63­71.

Wilson  SE,  He  YG,  Weng  J,  Zieske  JD,  Jester  JV,  Schultz  GS.  Effect  of  epidermal  growth  factor,  hepatocytegrowth  factor,  and  keratinocyte  growth  factor,  on  proliferation,  motility  and  differentiation  of  human  cornealepithelial cells. Exp Eye Res 1994c;59:665­678.

Wilson  SE,  He  YG,  Weng  J,  Li  Q,  McDowall  AW,  Vital M,  Chwang EL.  Epithelial  injury  induces  keratocyteapoptosis:  hypothesized  role  for  the  interleukin­1  system  in  the  modulation  of  corneal  tissue  organization  andwound healing. Exp Eye Res 1996a;62:325­327.

Wilson  SE,  Li  Q,  Weng  J,  Barry­Lane  PA,  Jester  JV,  Liang  Q,  Wordinger  RJ. The  Fas­Fas  ligand  system  andother modulators of apoptosis in the cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996b;37:1582­1592.

Wilson SE, Chen L, Mohan RR, Liang Q, Liu J. Expression of HGF, KGF, EGF and receptor messenger RNAsfollowing corneal epithelial wounding. Exp Eye Res 1999;68:377­397.

Wilson SE, Liang Q, Kim WJ. Lacrimal gland HGF, KGF, and EGF mRNA levels increase after corneal epithelialwounding. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999;40:2185­2190.

Wilson  SE.  Laser  in  situ  keratomileusis­induced  (presumed)  neurotrophic  epitheliopathy.  Ophthalmology2001;108:1082­1087.

Wilson  SE,  Ambrosio  R.  Laser  in  situ  keratomileusis­induced  neurotrophic  epitheliopathy.  Am  J  Ophthalmol2001;132:405­406.

Wilson  SE,  Mohan  RR,  Mohan  RR,  Ambrosio  R,  Jr.,  Hong  J,  Lee  J.  The  corneal  wound  healing  response:cytokine­mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Prog Retin Eye Res 2001;20:625­637.

Xu  KP,  Yagi  Y,  Tsubota  K.  Decrease  in  corneal  sensitivity  and  change  in  tear  function  in  dry  eye.  Cornea1996;15:235­239.

Yoshino K, Garg R, Monroy D, Ji Z, Pflugfelder SC. Production and secretion of transforming growth factor beta(TGF­beta) by the human lacrimal gland. Curr Eye Res 1996;15:615­624.

You  L,  Kruse  FE,  Volcker  HE.  Neurotrophic  factors  in  the  human  cornea.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci2000;41:692­702.

Zander E, Weddell G. Observations on the innervation of the cornea. J Anat 1951;85:68­99.

Zhang M, Chen J, Luo L, Xiao Q, Sun M, Liu Z. Altered corneal nerves in aqueous tear deficiency viewed by invivo confocal microscopy. Cornea 2005;24:818­824.

Zhivov A, Stave J, Vollmar B, Guthoff R. In vivo confocal microscopic evaluation of Langerhans cell density anddistribution in the normal human corneal epithelium. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 2005;243:1056­1061.

Zhivov A, Stave J, Vollmar B, Guthoff R. In vivo confocal microscopic evaluation of langerhans cell density anddistribution in the corneal epithelium of healthy volunteers and contact lens wearers. Cornea 2007;26:47­54.

Zieske  JD,  Guimaraes  SR,  Hutcheon  AE.  Kinetics  of  keratocyte  proliferation  in  response  to  epithelialdebridement. Exp Eye Res 2001;72:33­39.

Zoukhri D, Hodges RR, Rawe IM, Dartt DA. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1­adrenergic agonists is up­regulated  in  lacrimal  and  submandibular  glands  in  a  murine  model  of  Sjogren's  syndrome.  Clin  ImmunolImmunopathol 1998a;89:134­140.

Zoukhri  D,  Hodges  RR,  Dartt  DA.  Lacrimal  gland  innervation  is not altered  with  the  onset  and  progression  ofdisease in a murine model of Sjogren's syndrome. Clin Immunol Immunopathol 1998b;89:126­133.

73

Zoukhri  D,  Kublin  CL.  Impaired  neurotransmitter  release  from  lacrimal  and  salivary  gland  nerves  of  a  murinemodel of Sjogren's syndrome. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42:925­932.