Conversion of Cell Ulo Sic Materials to Sugar

7/29/2019 Conversion of Cell Ulo Sic Materials to Sugar

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United States Patent 1 1 9 1Wilke e t a l .

3 , 9 7 2 , 7 7 5A u g . 3 , 1 9 7 6

[ 1 1 ]1 4 5 ]

CONVERSION OF CELLULOSICMATERIALS TO SUGARI n v e n t o r s : C h a r l e s R . W i l k e , E l C e r r i t o ;Gautam M i t r a , B e r k e l e y , b o t h o f

C a l i f .

[ 5 4 ][ 7 5 ]

[ 7 3 ] A s s i g n e e : The U n i t e d S t a t e s o f America a sr e p r e s e n t e d b y t h e U n i t e d S t a t e sE n e r g y R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n tA d m i n i s t r a t i o n , W a s h i n g t o n , DC.

[ 2 2 ] F i l e d : J u n e 2 8 , 1 9 7 4[ 2 1 ] A p p l . N o . : 4 8 4 , 0 1 0[52] US. Cl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195/33; 195/100;

1 9 5 / 1 1 5[51] I n t . C l . 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . C12D 13/02; C12B 3/08[ 5 8 ] F i e l d o f Search . . . . . . . . . . . . . . . . 1 9 5 / 3 3 , 1 1 5 , 9 9 , l l ,

1 9 5 / 7 , 1 0 4 , 4 , 8 , 9 , 1 0 , 6 6 R , 6 3 , 6 8 , 1 0 0[ 5 6 ] R e f e r e n c e s C i t e d

UNITED S T A TE S PATENTS3,462,275 8/1969 Bellamy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195/1043,616,222 10/1971 Dasinger . . . . . . . .. 195/333,642,580 2/1972 Ghose. . . . . . . . . . . .. 195/333,711,392 1/1973 Metzger. . . . . . . . . . . . . . . .. 195/333,734,831 5/1973 Hulme. . . . . . . . . . . . . . . . . .. 195/66R3 , 7 6 4 , 4 7 5 1 0 / 1 9 7 3 Mandels t a 1 . 1 9 5 / 3 33,812,013 5/1974 Bellamy e t a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195/33

OTHER PUBLICATIONSMandels e t a l . , The P r o d u c t i o n o f C e l l u l o s e , C e l l u

l a s e s a n d T h e i r A p p l i c a t i o n s , G o u l d E d . A . C . S . P u b l ic a t i o n s W a s h i n g t o n , D . C. ( 1 9 6 9 ) p p . 3 9 1 - 3 9 6 .P r i m a r y Examiner-A. L o u i s M o n a c e l lA s s i s t a n t Examiner'lhomas G . WisemanA t t o r n e y , A g e n t , o r Firm~Dean E . C a r l s o n ; F . A .R o b e r t s o n ; I r e n e S . C r o f t[ 5 7 ] ABS TRACTA r o c e s s f o r t h e p r o d u c t i o n o f s u g a r , m a i n l y g l u c o s e ,b y t h e e n z y m a t i c d e g r a d a t i o n o f c e l l u l o s i c m a t e r i a l s ,p a r t i c u l a r l y c e l l u l o s i c w a s t e s , w h i c h c o m p r i s e s h y d r ol y z i n g t h e c e l l u l o s i c m a t e r i a l i n t h e p r e s e n c e o f c e l l ul a s e enzyme t o produce a s u g a r s o l u t i o n and r e c o v e ri n g f r o m t h e h y d r o l y s i s p r o d u c t s a m a j o r p r o p o r t i o n o ft h e c e l l u l a s e enzyme u s e d i n t h e h y d r o l y s i s r e a c t i o nf o r r e - u s e . At l e a s t a p o r t i o n o f t h e r e q u i r e d makeupc e l l u l a s e enzyme s p r o d u c e d i n a t w o - s t a g e o p e r a t i o nw h e r e i n , i n t h e ? r s t s t a g e , a p o r t i o n o f t h e o u t p u ts u g a r s o l u t i o n i s u t i l i z e d t o gr ow a c e l l u l a s e - s e c r e t i n gm i c r o o r g a n i s m , a n d , i n t h e s e c o n d s t a g e , c e l l u l a s e e nzyme f o r m a t i o n i s i n d u c e d i n t h e m i c r o o r g a n i s mc o n t a i n i n g c u l t u r e medium b y t h e a d d i t i o n o f a n a pp r o p r i a t e i n d uc e r , s u c h a s a c e l l u l o s i c m a t e r i a l . C e l l ul a s e enzyme s p r e c i p i t a t e d f r o m t h e c u l t u r e l i q u i d b yt h e a d d i t i o n o f an o r g a n i c s o l v e n t m a t e r i a l , s u c h a s al o w m o l e c u l a r w e i g h t a l k y l k e t o n e o r a l c o h o l , a n d t h ec e l l u l a s e p r e c i p i t a t e i s t h e n f e d t o t h e h y d r o l y s i sr e a c t i o n .

9 C l a i m s , 1 D r a w i n g F i g u r e

CELLULOSlC 1 2 1 4 1 5WASTES 1 3 1 6 ABSORPTION ' 7w5 1 1 1 1 5 1 1 0 5 1 1 GRINDER STAGE J , 1 8PRODUCT SUGAR SOLUTION 22 1 9

I281 1 1 1 1 2 6 A 2 27

23 W A S H F I L T E R 2o, 29 TRAIN /24 11 1 5 1 1 1 EXCHANGER H Y D R O L Y Z E R

$ 5 5 ;l FILTRATE '404 s 3 8 /

DISTILLATION A K SOLVENT4 2 C O L U M N g O L V E E U P l T4 5 ]43 W37

___ 1 5 1 1 1 5 1 1FURNACE HEAT / ENZYME-44 EXCHANGER 39 PRECIPITATE c 5 1 . | . u 1 _ o s 1 cA SH 35 INDUCER"DSPENTs o u o s 36, 3 , F I L T E R

STEM 3 3 26 MYCELIUM 73 ENZYMENUTRIENT 3 , , GROWTH enowm\3 2 5 5 1 1 1 1 5 1 1 1 0 1 1 5 5 1 1 1 4 5 1 1 1 0 1 1 M Y C E L I U Msounss r 5 1 1 1 u z 5 1 1 1 1 5 1 1 EXCHANGER


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1CONVERSION OF CELLULOSIC M ATERIALS TOS U G ARThe i n v e n t i o n d i s c l o s e d h e r e i n was made i n t h ec o u r s e o f , o r u n d e r , C o n t r a c t N o . W-7405-ENG-48w i t h t h e U n i t e d S t a t e s A t o m i c E n e r g y C o m m i s s i o n .

BACKGROUND OF THE INVENTIONT h i s i n v e n t i o n r e l a t e s t o t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o fc e l l u l o s i c m a t e r i a l s , p a r t i c u l a r l y c e l l u l o s i c w a s t e s .H y d r o l y s i s o f c e l l u l o s e y i e l d s a m i x t u r e o f s i mp l er e d u c i n g s u g a r s , m a i n l y g l u c o s e . T h e s e h y d r o l y s i s

p r o d u c t s c a n b e c o n v e r t e d t o e t h y l a l c o h o l which canb e u s e d a s a l i q u i d f u e l t o r e p l a c e p e t r o l e u m , o r t h e ycan be converted t o methane which c an be a u s e f u ls o u r c e o f g a s e o u s f u e l . Or t h e h y d r o l y s i s p r o d u c t s c a nb e u s e d t o m a n u f a c t u r e v a r i o u s o r g a n i c c h e m i c a l s p r e se n t l y p r o d u c e d f r o m p e t r o l e u m . I n t e r m s o f a v a i l a b l ee n e r g y , e x p r e s s e d e i t h e r a s t h e h e a t o f c o m b u s t i o n o fc e l l u l o s e o r o f t h e g l u c o s e o r a l c o h o l t h e o r e t i c a l l y 0bt a i n a b l e t h e r e f r o m , a pound o f c e l l u l o s e i s e q u i v a l e n tt o 0 . 3 5 l b o f g a s o l i n e ( 7 2 0 0 B T U ) .On h e l a n d a r e a o f t h e e a r t h about 1 . 6 X 1 0 1 0 t o n s of

c a r b o n a r e ?xed e v e r y y e a r b y p h o t o s y n t h e s i s , o u t o fw h i c h a b o u t h a l f a p p e a r s i n t h e form o f c e l l u l o s e . Thes h e e r m a g n i t u d e o f t h i s p o t e n t i a l s o u r c e d i c t a t e s t h en e c e s s i t y o f i m p r o v i n g t h e s c i e n t i ? c a n d t e c h n o l o g i c a lc a p a b i l i t i e s f o r c e l l u l o s e u t i l i z a t i o n . I n t h e N o r t h Ameri c a n c o n t i n e n t c e r t a i n c e l l u l o s i c m a t e r i a l s a r e a v a i l a b l ef o r economic p r o c e s s i n g a t t h i s t i m e . T w o h u n d r e dn i n e t y m i ll i o n t o n s p e r y e a r o f r e s i d e n t i a l , i n s t i t u t i o n a la n d c o m m e r c i a l s o l i d w a s t e s c o n t a i n i n g a p p r o x i m a t e l y? f t y p e r c e n t p a p e r a n d o t h e r c e l l u l o s i c m a t e r i a l s a r ep r o d u c e d i n t h e U n i t e d S t a t e s . I n a d d i t i o n , a b o u t s i x t ym i l l i o n t o n s o f b a g a s s e a r e a v a i l a b l e . These a l t o g e t h e rc o n t a i n a b o u t one hundred and t w e n t y m i l l i o n t o n s o fc e l l u l o s e , t h e e n e r g y e q u i v a l e n c e o f w h i c h i s a b o u t a? f t h o f t h e c u r r e n t US. g a s o l i n e c o n s u m p t i o n . F u r t h e rm o r e , 2 . 3 b i l l i o n t o n s p e r y e a r o f a g r i c u l t u r a l w a s t e s i nt h e U n i t e d S t a t e s , h a v i n g a v e r y h i gh c e l l u l o s e c o n t e n t ,i n c r e a s e t h e s u p p l y s i g n i ? c a n t l y . I n s p i t e o f t h e s e v a r io u s s o u r c e s o f a v a i l a b l e c e l l u l o s e , a major i n d u s t r i a la l c o h o l f e r m e n t a t i o n p r o c e s s c a n o n l y be s u c c e s s f u l i ft h e r e d u c i n g s u g a r s a r e a v a i l a b l e a t a s u f ? c i e n t l y lowp r i c e .Most a r l y e f f o r t s i n t h i s ? e l d w e r e g e a r e d t o t h e a c i dh y d r o l y s i s o f w o od p r o d u c t s t o s u g a r s . The m o s t n o t ab l e p r o c e s s i n t h i s c o n t e x t was t h e B e r g i u s p r o c e s s i nt h e 1 9 3 0 s ( B e r g i u s , F . , I n d . E n g . Chem, 2 9 , 2 4 7 ,1 9 3 7 ) . H o w e v e r , a c i d h y d r o l y s i s r e q u i r e s c o s t l y m a t e r ia l s o f c o n s t r u c t i o n b e c a u s e o f t h e i n h e r e n t p r o b l e m s o fc o r r o s i o n . I n r e c e n t y e a r s , c e l l u l o s e d e g r a d a t i o nt h r o u g h e n z y m a t i c m e a n s h a s b e e n a s u b j e c t o f i n v e s t ig a t i o n b y v a r i o u s w o r k e r s .

SUMMARY OF THE INVENTIONI t i s a n o b j e c t o f t h i s i n v e n t i o n t o p r o v i d e a n e f ? c i e n t

a n d e c o n o m i c a l method f o r t h e u t i l i z a t i o n o f c e l l u l o s i cm a t e r i a l s .M o re s p e c i ? c a l l y , i t i s a n o b j e c t o f t h i s i n v e n t i o n t op r o v i d e a p r o c e s s f o r t h e p r o d u c t i o n o f s u g a r b y t h ee n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f c e l l u l o s i c m a t e r i a l s , p a r t i c ul a r l y c e l l u l o s i c wastes. -

I t i s a f u r t h e r o b j e c t o f t h e i n v e n t i o n t o r e c o v e r f o rr e c y c l i n g a m a j o r p r o p o r t i o n o f t h e enzyme u s e d i n t h eh y d r o l y s i s o f c e l l u l o s i c m a t e r i a l s .I t i s s t i l l a f u r t h e r o b j e c t o f t h e i n v e n t i o n t o p r o d u c et h e n e c e s s a r y makeup enzyme f o r t h e h y d r o l y s i s o f t h e

20

2 5

3 5

40

45

5 0

55

6 0

6 5

3 , 9 7 2 , 7 7 5c e l l u l o s i c m a t e r i a l s b y u t i l i z i n g a p o r t i o n o f t h e o u t p u ts u g a r s o l u t i o n .I n a c c o r d a n c e w i t h t h e p r e s e n t i n v e n t i o n , t h e r e i sp r o v i d e d a p r o c e s s f o r t h e c o n v e r s i o n o f c e l l u l o s i cm a t e r i a l s , p a r t i c u l a r l y c e l l u l o s i c w a s t e s , t o s u g a r w h i c hc o m p r i s e s h y d r o l y z i n g t h e c e l l u l o s i c m a t e r i a l i n t h ep r e s e n c e o f c e l l u l a s e e n z y m e , t h e r e b y c o n v e r t i n g t h ec e l l u l o s e t o s u g a r , a n d r e c o v e r i n g f r o m t h e h y d r o l y s i sp r o d u c t s c e l l u l a s e e n z y m e f o r r e c y c l i n g t o t h e h y d r o l ys i s r e a c t i o n a n d a s o l u t i o n c o n t a i n i n g p r o d u c t s u g a r .M o r e s p e c i ? c a l l y , i n t h e p r e s e n t i n v e n t i o n , t h e p r o du c t s o f t h e e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f t h e c e l l u l o s i c m a t er i a l a r e s e p a r a t e d i n t o a l i q u i d s u g a r - c o n t a i n i n g p h a s ea n d a s o l i d p h a s e c o n t a i n i n g u n h y d r o l y z e d s o l i d s . B o t ho f t h e s e p h a s e s c o n t a i n c e l l u l a s e e n z y m e f r o m t h e h yd r o l y s i s s t a g e . The o l i d p h a s e i s w a s h e d w i t h w a t e r f o rr e c o v e r y o f enzyme a d s o r b e d t h e r e o n , a n d t h e r e s u l ti n g w a s h w a t e r c o n t a i n i n g r e c o v e r e d e n z y m e i s t h e nf e d t o t h e h y d r o l y s i s r e a c t i o n . T h e l i q u i d s u g a r - c o n t a i ni n g p h a s e i s c o n t a c t e d w i t h i n c o m i n g c e l l u l o s i c s o l i d swhereby t h e enzyme c o n t a i n e d t h e r e i n i s a d s o r b e d ont h e s o l i d m a t e r i a l w h i c h i s t h e n i n t r o d u c e d i n t o t h eh y d r o l y s i s v e s s e l . A m a j o r p r o p o r t i o n o f t h e c e l l u l a s eenzyme u s e d i n t h e h y d r o l y s i s r e a c t i o n c a n t h u s b er e c o v e r e d f r o m t h e h y d r o l y s i s p r o d u c t s . T h e l i q u i ds u g a r - c o n t a i n i n g s t r e a m f r o m t h e a d s o r p t i o n s t e p i s t h epro duct stream of h e p r o c e s s .

I n a p a r t i c u l a r mode o f o p e r a t i o n o f t h e i n v e n t i o n , ap o r t i o n o f t h e p r o d u c t s u g a r s t r e a m i s u t i l i z e d t o p r od u c e a t l e a s t a p o r t i o n o f t h e r e q u i r e d makeup enzymeb y t h e s t e p s c o m p r i s i n g g r o w i n g a c e l l u l a s e - s y n t h e s i zi n g m i c r o o r g a n i s m t h e r e o n a n d i n d u c i n g c e l l u l a s e e nzyme f o r m a t i o n i n t h e m i c r o o r g a n i s m - c o n t a i n i n g c u lt u r e medium b y t h e a d d i t i o n o f a n a p p r o p r i a t e i n d u c e rsuch a s a c e l l u l o s i c m a t e r i a l . S i n c e t h e amount f c e l l ul a s e e n z y m e r e c o v e r e d b y t h e a b o v e - d e s c r i b e d w a s h i n go f u n h y d r o l y z e d s o l i d s i s a f u n c t i o n o f t h e amount o fwash w a t e r u s e d , i t i s p r e f e r a b l e t o f e e d makeup e n - -zyme n s o l i d f o r m t o t h e h y d r o ly s i s r e a c t i o n i n o r d e r t om a x i m i z e t h e amount o f w a t e r u t i l i z e d i n t h e w a s h i n gs t e p . P r e c i p i t a t i o n o f t h e makeup c e l l u l a s e e n z y m ef r o m t h e c u l t u r e medium a f t e r t h e r e m o v a l o f s o l i d st h e r e f r o m i s a c c o m p l i s h e d b y o r g a n i c s o l v e n t e x t r a ct i o n . T h e p r e c i p i t a t e d e n z y m e i s t h e n i n t r o d u c e d i n t ot h e h y d r o l y s i s r e a c t i o n t o p r o v i d e makeup e n z y m e .The c e l l u l o s e m o l e c u l e i s a h i g h m o l e c u l a r w e i g h tp o l y m e r o f B ~ 1 , 4 - l i n k e d D - g l u c o s e r e s i d u e s , t h e d e g r e eo f p o l y m e r i z a t i o n v a r y i n g w i d e l y d e p e n d i n g u p o n i t so r i g i n . F o r c h e m i c a l p u l p a n d ? l t e r p a p e r t h e d e g r e e o fp o l y m e r i z a t i o n g e n e r a l l y v a r i e s b e t w e e n 5 0 0 a n d 1 0 0 0 ,whereas i n w o o d c e l l u l o s e i t i s about 8000 1 0 , 0 0 0 .D u r i n g e n z y m a t i c h y d r o l y s i s b y c e l l u l a s e e n z y m e , B - l , 4g l u c o s y l b o n d s a r e s p l i t t o p r o d u c e a m i x t u r e o f s i m p l er e d u c i n g s u g a r s , m a i n l y g l u c o s e , a c c o r d i n g t o t h e f o ll o w i n g e q u a t i o n :

The e r m s c e l l u l a s e and c e l l u l a s e enzyme a r e u s e dh e r e i n t o d e s i g n a t e a c o m p l e x s y s t e m o f e n z y m e s (mol e c u l a r w e i g h t r a n g e 1 2 , 0 0 0 - 6 8 , 0 0 0 ) s h o w i n g v a r i o u st y p e s o f a c t i v i t i e s w i t h r e s p e c t t o d i f f e r e n t k i n d s o fs u b s t r a t e s . A l t h o u g h t h e d e g r a d a t i o n o f c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e b y e n z y m a t i c m e a n s h a s b e e n t h e o b j e c t o fi n t e n s e s t u d y f o r t h e l a s t 2 5 y e a r s , t h e e x a c t mechanismt h e r e o f i s n o t y e t e n t i r e l y c l e a r . The m o s t a c c e p t e dp o s t u l a t e i n t h i s a r e a h a s been t h e two s t e p C1 - C , 7 rt h e o r y p r o p o s e d b y R e e s e e t a l . , J . B a c t e r i o L , 5 9 , 4 8 5


4/6

3 , 9 7 2 , 7 7 5( 1 9 5 0 ) . A c c o r d i n g t o t h i s t h e o r y t h e C 1 c o m p o n e n t o ft h e e n z y m e ? r s t d i s i n t e g r a t e s t h e c e l l u l o s e c h a i n p r i o rt o i t s s o l u b i l i z a t i o n . The s u b s e q u e n t h y d r o l y t i c a c t i o na t t h e B - l , 4 l i n k e d g l u c o s y l bonds o f t h e s o l u b i l i z e dc h a i n i s a t t r i b ut e d t o t h e CI component o f t h e e n z y m e .The r e s u l t s o f v a r i o u s o t h e r w o r k e r s i n t h e ? e l d c o mb i n e t o p o s t u l a t e a n a l t e r n a t i v e h y p o t h e s i s a c c o r d i n g t ow h i c h i t i s t h e C1 component w h i c h d e l i v e r s t h e i n i t i a la t t a c k on t h e c e l l u l o s e c h a i n b y random a c t i o n , p r o d u c i n g f r a g m e n t s o f l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t w h i c h c a nt h e n b e a c t e d upon b y t h e C 1 component b y a n e n d w i s e( e x o ) m e c h a n i s m p r o d u c i n g c e l l o b i o s e r e s i d u e s .

C e l l u l a s e a c t i v i t i e s a r e measured b y i n t e r a c t i n g ag i v e n s u b s t r a t e w i t h t h e enzyme a n d m e a s u r i n g t h eamount o f r e d u c i n g s u g a r p r o d u c e d i n a g i v e n t i m e .One s u c h t e s t i s t h e F i l t e r P a p e r a c t i v i t y t e s t w h i c hmeasures combined Cl CI a c t i v i t y . I n t h i s t e s t , 50 mg( l X 6 c m) o f Whatman i l t e r P a p e r N o . 1 i s added t oa m i x t u r e o f 1 ml o f a p p r o p r i a t e l y d i l u t e d enzyme and

, 1 m l o f 0 . 0 5 M o d i u m c i t r a t e b u f f e r a t pH o f 4 . 8 .R e a c t i o n i s c a r r i e d o u t a t ' 5 0 C f o r l h o u r and r e d u c i n gs u g a r c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n e d b y d i n i t r o s a l i c y l i c a c i dt e s t . F i l t e r P a p e r a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s m i l l i g r a m s o fr e d u c i n g s u g a r p r o d u c e d b y t h e u n d i l u t e d enzyme samp l e .The c e l l u l a s e enzyme u s e d i n t h e h y d r o l y s i s s t e p o ft h e p r e s e n t i n v e n t i o n i s s y n t h e s i z e d b y c e r t a i n c e l l u l ol y t i c m i c r o o r g a n i s m s w h i c h a r e c a p a b l e o f p r o d u c i n gb o t h C , a n d C , r c o m p o n e n t s . T h i s g r o u p o f m i c r o o r g a ni s m s i n c l u d e s T r i c h o a ' e r m a v i r i d e , T r i c h o d e r m a k o n i n g i i ,F u s a r i u m s o l a n i , P e n i c i l l i u m f u n i c u l o s u m , a n d t h e l i k e .( S e e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n , C a t a l o g u e o fS t r a i n s , N i n t h E d i t i o n , 1 9 7 0 . ) Of t h e s e , t h e f u n g u sT r i c h o d e r m a v i r i d e , p a r t i c u l a r l y T . v i r i a ' e QM9414w h i c h i s a mutant t r a i n o b t a i n e d b y i r r a d i a t i n g c o n i d i ao f T . v i r i d e QM6a i t h a l i n e a r a c c e l e r a t o r and which so b t a i n a b l e f r o m US . A r m y N a t i c k L a b o r a t o r i e s i nM a s s a c h u s e t t s , h a s b e e n f o u n d t o b e e s p e c i a l l y p r o d u ct i v e i n t h e s y n t h e s i s o f c e l l u l a s e .

BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGThe i n v e n t i o n i s i l l u s t r a t e d i n t h e a c c o m p a n y i n gd r a w i n g w h e r e i n t h e s i n g l e FIGURE s a f l o w d i a g r a m

o f a p a r t i c u l a r mode o f o p e r a t i o n o f t h e c e l l u l o s e conv e r s i o n p r o c e s s o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n .DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTIONR e f e r r i n g no w t o t h e d r a w i n g i n d e t a i l , w a s t e c e l l ul o s i c m a t e r i a l , s u c h a s w a s t e p a p e r , i s i n t r o d u c e d b ymeans o f l i n e 1 1 i n t o s h r e d d e r l 2 and t h e n d i s c h a r g e d

v i a l i n e 1 3 i n t o g r i n d e r 1 4 where t i s ground t o a s u i t ~a b l e p a r t i c l e s i z e i f n e c e s s a r y . The g r o u n d w a s t e i s t h e nf e d t o a d s o r p t i o n s t a g e 1 5 b y way o f l i n e 1 6 w h e r e i t i sc o n t a c t e d w i t h ? l t r a t e s o l u t i o n f r o m t h e h y d r o l y z e rr e a c t i o n . F l t r a t e s o l u t i o n i s i n t r o d u c e d i n t o t h e a d s o r pt i o n s t a g e b y way o f l i n e 1 7 . A d s o r p t i o n s t a g e 1 5 i sp r e f e r a b l y a t r a i n o f c o u n t e r c u r r e n t m i x e r - ? l t e r s . Theg r o u n d w a s t e i s t h e n c o n v e y e d b y way o f l i n e 1 8 t oh y d r o l y z e r 1 9 w h i c h c o n s i s t s p r e f e r a b l y o f a p l u r a l i t y o fa g i t a t e d c y l i n d r i c a l c o n c r e t e d i g e s t e r s o f t h e t y p e g e ne r a l l y u s e d i n s o l i d w a s t e t r e a t m e n t i n s a n i t a r y e n g in e e r i n g . I n h y d r o l y s is s e c t i o n 1 9 , t h e g r o u n d w a s t e i sc o n t a c t e d w i t h c e l l u l a s e enzyme p r o t e i n a t a temperat u r e f r o m s u b s t a n t i a l l y 3 0 C t o s u b s t a n t i a l l y 6 0 C , p r e fe r a b l y a r o u n d 5 0 C , f o r a p e r i o d o f t i m e s u f ? c i e n t t oe f f e c t c o n v e r s i o n o f a s u b s t a n t i a l p r o p o r t i o n o f t h ec e l l u lo s e i n t o s u g a r . T e m p e r a t u r e s m u c h a b o v e s u bs t a n t i a l l y 60C w i l l t e n d t o d e n a t u r e t h e c e l l u l a s e e n

20

2 5

3 0

40

45

55

6 0

65

4z y m e . The amount o f t i m e r e q u i r e d f o r h y d r o l y s i s d ep e n d s upon t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e c e l l u l a s e enzymep r e s e n t . G e n e r a l l y , t h e c o n c e n t r a t i o n s h o u l d b e s u c h a st o p r o v i d e an enzyme a c t i v i t y o f from s u b s t a n t i a l l y 0 . 5t o s u b s t a n t i a l l y 6 F i l t e r P a p e r u n i t s w h i c h c o r r e s p o n d st o a c o n c e n t r a t i o n o f fr o m s u b s t a n t i a ll y 0 . 2 t o s u b s t a nt i a l l y 5 m g / m l o f e n z y m e p r o t e i n . The u p p e r l i m i t o fc e l l u l a s e c o n c e n t r a t i o n i s d e t e r m i n e d b y t h e s o l u b i l i t yo f t h e enzyme p r o t e i n i n s o l u t i o n w h i l e t h e l o w e r l i m i ti s d i c t a t e d b y economic c o n s i d e r a t i o n s . I t h a s b e e nf o u n d t h a t a n enzyme a c t i v i t y o f from s u b s t a n t i a l l y 2 t os u b s t a n t i a l l y 3 F i l t e r P a p e r u n i t s i s m o s t e f ? c a c i o u s .The s o l u t i o n i n t h e h y d r o l y s i s s e c t i o n i s m a i n t a i n e dp r e f e r a b l y on t h e a c i d s i d e , t h a t i s , a t a p H o f f r omabout 4 t o about 6 .F o l l o w i n g h y d r o l y s i s , t h e e f f l u e n t s a r e d i s c h a r g e d b yway o f l i n e 20 t o ? l t e r 2 1 where a l i q u i d s u g a r - c o n t a i ni n g p h a s e i s s e p a r a t e d f r o m a s o l i d s p h a s e . T h e l i q u i ds u g a r - c o n t a i n i n g s t r e a m f r o m ? l t e r 2 1 e n t e r s a d s o r pt i o n s t a g e 1 5 b y means o f l i n e 1 7 , a s n o t e d a b o v e , t or e c o v e r c e l l u l a s e enzyme n t h e l i q u i d p h a s e b y a d s o r pt i o n on incoming c e l l u l o s i c s o l i d s . T he c e l l u l o s i c s o l i d sw i t h t h e r e c o v e r e d enzyme p r o t e i n a d s o r b e d on thema r e t h e n f e d t o h y d r o l y z e r 19 v i a l i n e 18 a s noteda b o v e . The i q u i d s t r e a m l e a v i n g a d s o r p t i o n s e c t i o n 1 5v i a l i n e 22 i s t h e p r o d u c t s t r e a m o f t h e p r o c e s s andc o n s i s t s o f a m i x t u r e o f s i m p l e r e d u c i n g s u g a r s , m a i n l yg l u c o s e . A o r t i o n o f t h e o u t p u t s t r e a m , l e s s t h a n a b o u t15% b y w e i g h t , f o r e x a m p l e , o f t h e o r d e r o f f r o m s u bs t a n t i a l l y 6% o s u b s t a n t i a l l y 1 0 % , i s r e m o v e d b y meanso f l i n e 2 3 a n d u t i l i z e d i n t h e enzyme makeup s e c t i o nf o r t h e g r o w t h o f f u n g a l m i c r o o r g a n i s m a s h e r e i n a f t e rd e s c r i b e d .T h e ? l t e r e d u n h y d r o l y z e d s o l i d s l e a v e ? l t e r 2 1 b yway o f l i n e 24 and e n t e r wash r a i n 2 5 , w h i c h i s p r e f e ra b l y a p l u r a l s t a g e c o u n t e r c u r r e n t m i x e r - ? l t e r , f o r t h er e c o v e r y o f a d s o r b e d enzyme b y w a s h i n g w i t h p r o c e s sw a t e r a t a t e m p e r a t u r e and p H c o r r e s p o n d i n g t o t h a t i nt h e h y d r o l y s i s s e c t i o n . T he wash w a t e r , which c a n beh e a t e d t o p r o c e s s t e m p e r a t u r e i n h e a t e x c h a n g e r 2 6 b yt h e makeup enzyme s t r e a m , i s i n t r o d u c e d i n t o washt r a i n 2 5 b y way f l i n e 2 7 . The i q u i d s t r e a m c o n t a i n i n gd e s o r b e d enzyme s t h e n f e d t o h y d r o l y z e r 1 9 b y way fl i n e 2 8 , and t h e s p e n t s o l i d s , w h i c h a r e d i s c h a r g e d v i al i n e 2 9 , c an be used a s a source o f f u e l f o r t h e r e b o i l e rf u r n a c e i n t h e enzyme makeup s e c t i o n a n d f o r s t e a m /power e n e r a t i o n . O v e r a l l c e l l u l a s e enzyme e c o v e r y i na d s o r p t i o n s t a g e 1 5 and wash t r a i n 25 amounts t o a tl e a s t 75%, and a s m u c h a s about 85%, o f t h e t o t a ls u p p l i e d t o t h e h y d r o l y s is s e c t i o n .Makeup enzyme s p r o d u c e d i n f e r m e n t o r s 3 0 a n d 3 1u t i l i z i n g t h a t p o r t i o n o f t h e o u t p u t s u g a r s o l u t i o n r emoved by means o f l i n e 2 3 , a s noted a b o v e . T he conc e n t r a t i o n o f s u g a r i n t h e p r o d u c t s o l u t i o n i s g e n e r a l l ya b o v e a b o u t 5 % b y w e i g h t w h i c h h a s b e e n f o u n d t o b et o o h i g h a c o n c e n t r a t i o n t o e f f e c t i v e ly s u p p o r t g r o w t ho f t h e c e l l u l o l y t i c m i c r o o r g a n i s m . I t i s , t h e r e f o r e , p r ef e r r e d t o d i l u t e t h e s o l u t i o n t o approximately 0 . 5 ~ 3%b y w e i g h t . T h e w a t e r n e c e s s a r y f o r d i l u t i o n , t o g e t h e rw i t h a s u i t a b l e n u t r i e n t c o m p o s i t i o n , i s i n t r o d u c e d v i al i n e 32 and mixed w i t h i n c o m i n g s u g a r s o l u t i o n froml i n e 2 3 . N u t r i e n t c o m p o s i t i o n s s u i t a b l e f o r s u b m e r g e dc u l t u r e g r o w t h o f a c e l l u l a s e - p r o d u c i n g f u n g a l m i c r o o rg a n i s m s u c h a s T r i c h o d e r m a v i r i d e a r e r e p o r t e d b yM a n d e l s a n d R e e s e , J . B a c t e r i o l . , 7 2 , 2 6 9 ( 1 9 5 7 ) ; J .B a c t e r i o l . , 7 9 , 8 1 6 ( 1 9 6 0 ) ; a n d J . B a c t e r i o l . , 8 3 , 4 0 0( 1 9 6 2 ) . A n o t h e r s u i t a b l e n u t r i e n t m a t e r i a l c o m p r i s i n ga m i x t u r e o f t h e i n o r g a n i c c h e m i c a l s ( N H 4 ) 2 S O 4 ,


5/6

K H 2 P O 4 , ( N H 2 ) 2 C O 2 , C a C l z a n d P I Ot e o s e p e p t o n e i s d e s c r i b e d b y M a n d e l s a n d W e b e r ,A d v . i n C h e m . S e r . , 9 5 , 3 9 1 ( 1 9 6 9 ) . i t h a s b ? e m f o u n dt h a t a m i x t u r e o f c o t t o n s e e d o i l a s a p r o t e i n s o u r c e anda s u p e r p h o s p h a t e - c o n t a i n i n g f e r t i l i z e r o f t h e t y p er e a d i l y a v a i l a b l e o n t h e c o m m e r c i a l m a r k e t i s e q u a l l ys u i t a b l e and m u c h mo re e c o n o m i c a l . The n u t r i e n t mat e r i a l i s a d d e d p r e f e r a b l y i n a c o n c e n t r a t i o n o f s u b s t a nt i a l l y 5 1 2 mg/ml o f a p p r o p r i a t e l y d i l u t e d s u g a r s o l ut i o n . T h e g r o w t h medium i s i n t r o d u c e d i n t o s t e r i l i z e r3 3 w h e r e i t i s h e a t e d t o a s u i t a b l y h i g h t e m p e r a t u r e , f o re x a m p l e , b y h e a t e x c h a n g e w i t h c o n d e n s i n g s t e a m .H e a t i n g t o a t e m p e r a t u r e o f a b o u t 1 4 5 C w i l l e f f e ct i v e l y s t e r i l i z e t h e g r o w t h m e d i u m . T h e s t e r i l e mediumi s t h e n f e d t o h e a t e x c h a n g e r 26 v i a l i n e 34 where t i sc o o l e d t o a t e m p e r a t u r e s u i t a b l e f o r f e r m e n t a t i o n .C o o l i n g i s p r e f e r a b l y e f f e c t e d ' b y h e a t e x c h a n ge w i t hw a s h w a t e r e n t e r i n g w a s h t r a i n 2 5 , t h e r e b y h e a t i n g t h ew a s h w a t e r t o h y d r o l y s i s - r e a c t i o n t e m p e r a t u r e . Thef e r m e n t a t i o n r e a c t i o n i s c a r r i e d o u t a t a . temperatureoff r o m s u b s t a n t i a l l y 2 0 C t o s u b s t a n t i a l l y 5 0 9 C , p r e f e ra b l y a r o u n d 3 0 C . The c o o l e d , s t e r i l e m e d i u m , t ow h i c h a n i n o c u l u m o f t h e d e s i r e d m i c r o o r g a n i s m i sa d d e d i n o r d e r t o i n i t i a t e g r o w t h , i s f e d i n t o m y c e l i u mg r o w t h f e r m e n t o r 30 f o r a p e r i o d o f t i m e s u f ? c i e n t t oe x h a u s t e s s e n t i a l l y a l l o f t h e s u g a r s f o r g r o w t h o f t h ec e l l u l a s e - s e c r e t i n g m i c r o o r g a n i s m . M y c e l i u m f r o mf e r m e n t o r 30 s f e d i n t o enzyme g r o w t h f e r m e n t o r 3 1 f o r p r o d u c t i o n o f enzyme i n t h e p r e s e n c e o f a n a p p r op r i a t e i n d u c e r w h i c h i s i n t r o d u c e d b y way o f l i n e 3 5 .The p r e s e n c e o f a c e l l u l o s i c m a t e r i a l i s r e q u i r e d . t oi n d u c e f o r m a t i o n o f t h e c e l l u l a s e e n z y m e . - The c e l l ul o s i c m a t e r i a l c a n b e from a n y s o u r c e , b u t f o r t h e p r es e n t p r o c e s s , a p o r t i o n o f t h e f e e d f r o m g r i n d e r 1 4 i smost f e a s i b l y u t i l i z e d a s t h e i n d u c e r . G e n e r a l l y , anamount s u f ? c i e n t t o p r o v i d e a c e l l u l o s e c o n c e n t r a t i o no f a b o u t 0 . 3 1.5% by w e i g h t i n f e r m e n t o r 31 i s p r ef e r r e d . The p l a n t f e e d i s s t e r i l i z e d p r i o r t o i n t r o d u c t i o nt o t h e f e r m e n t o r . F o l l o w i n g e n z y m e p r o d u c t i o n , mycel i u m s o l i d s a r e s e p a r a t e d f r o m t h e e n z y m e - c o n t a i n i n gl i q u i d p h a s e i n ? l t e r 3 6 . IT h e l i q u i d s t r e a m c o n t a i n i n g t h e makeup e n z y m e i sd i s c h a r g e d f r o m f e r m e n t o r 3 1 b y means o f l i n e 3 7 . A no r g a n i c s o l v e n t i s a d d e d t o t h e l i q u i d s t r e a m b y meanso f l i n e 3 8 f o r e n z y m e p r e c i p i t a t i o n . A l t h o u g h a c e t o n ei s t h e p r e f e r r e d o r g a n i c s o l v e n t , o t h e r l o w e r a l k y l ( l e s st h a n a b o u t 6 c a r b o n a t o m s ) k e t o n e s o r a l c o h o l s , p a r t i cu l a r l y m e t h y l o r e t h y l a l c o h o l , c a n a l s o b e u s e d . Thep r e c i p i t a t e d e n z y m e p r o t e i n i s s e p a r a t e d i n ? l t e r 3 9a n d f e d i n t o h y d r o l y z e r 1 9 b y means o f l i n e 4 0 . Thel i q u i d s t r e a m , d i s c h a r g e d f r o m ? l t e r 3 9 b y m e a n s o fl i n e 4 1 , i s u t i l i z e d f o r s o l v e n t r e c o v e r y i n d i s t i l l a t i o nc o l u m n 4 2 . T h e d i s t i l l a t i o n f e e d c a n b e p r e h e a t e d b yh e a t e x c h a n g e w i t h c o l u m n b o t t o m s i n h e a t e x c h a n g e r43 and c a n b e f u r t h e r h e a t e d i n r e b o i l e r - f u r n a c e 44b e f o r e i t s e n t r y t o t h e d i s t i l l a t i o n c o l u m n . The r e b o i l e rfumace c a n be f u e l e d b y c o m b u s t i o n o f s p e n t s o l i d sf r o m wash t r a i n 25 a s n o t e d a b o v e . S u b s t a n t i a l l y a l l o ft h e o r g a n i c s o l v e n t i s r e c o v e r e d f r o m t h e t o p o f t h ed i s t i l l a t i o n c o l u m n . Column b o t t o m s a r e d i s c h a r g e d v i al i n e 4 5 a n d c a n b e c o o l e d b y - p r e h e a t i n g d i s t i l l a t i o nf e e d i n h e a t e x c h a n g e r 43 a n d t h e n r e c y c l e d t o t h ewash w a t e r s t r e a m f o r i n t r o d u c t i o n t o wash t r a i n 2 5 .Makeup s o l v e n t i s a d d e d b y means o f l i n e 46 t o t h el i q u i d s t r e a m f r o m t h e d i s t i l l a t i o n column t o p b e f o r eb e i n g r e u s e d f o r s o l v e n t p r e c i p i t a t i o n .

3 , 9 7 2 , 7 7 5

5

2 5

3 5

45

5 0

55

6 0

6 5

6EXAMPLE

. C o n s i d e r i n g no w a s p e c i ? c e x a m p l e , w a s t e p a p e rc o n t a i n i n g s u b s t a n t i a l l y 6% m o i s t u r e a n d h a v i n g a c e ll u l o s e c o n t e n t o f s u b s t a n t i a l l y 61% i s s h r e d d e d a n dg r o u n d t o , . 2 0 0 . m e s h s i z e b e f o r e b e i n g u t i l i z e d f o rh y d r o l y s i s , , S o l i d c o n c e n t r a t i o n i n t h e h y d r o l y s i s v e s s e li s 1 0 % . T h e h y d r o l y s i s t e m p e r a t u r e i s m a i n t a i n e d a ts u b s t a n t i a l l y 5 0 C a n d pH t s u b s t a n t i a l l y 4 . 8 . F o r a nenzyme c t i v i t y o f 2 . 7 F i l t e r P a p e r , a r e s i d e n c e t i m e o f4 0 h o u r s i s m a i n t a i n e d , c o r r e s p o n d i n g t o s u b s t a n t i a l l y82% conversion. . >E f f l u e n t s f r o m t h e h y d r o l y z e r a r e p a s s e d t h r o u g h a? l t e r t o remove t h e u n r e a c t e d s o l i d s f r o m t h e enzymea n d g l u c o s e s o l u t i o n . A p p r o x i m a t e l y 51% f t h e h y d r ol y z e r e n z y m e a c t i v i t y r e m a i n s i n t h e l i q u i d p h a s e a f t e r? l t r a t i o n , t h e r e s t b e i n g a d s o r b e d on s p e n t s o l i d s . T or e c o v e r t h e adsorbed enzyme t h e f i l t e r e d s o l i d s a r ewashed n a s e r i e s o f c o u n t e r c u r r e n t m i x e r - s e t t l e r s andt h e - w a s h w a t e r f e d b a c k t o t h e h y d r o l y s i s v e s s e l . Thee n z y m e a c t i v i t y i n t h e l i q u i d p h a s e i s r e c o v e r e d b yc o u n t e r c u r r e n t a d s o r p t i o n o n t h e i n c o m i n g s o l i d f e e dt o t h e h y d r o l y s i s s t a g e . The l i q u i d s t r e a m f r o m t h ea d s o r p t i o n s t e p i s t h e p r o d u c t o u t p u t o f r e d u c i n g s u gars as 5.58% solution.A m i n o r p o r t i o n , s u b s t a n t i a l l y 7% , o f t h e o u t p u ts u g a r s o l u t i o n i s d i l ut e d t o a n a p p r o x i m a t e l y 1% o l ut i o n a n d m i x e d w i t h a n u t r i e n t c o m p o s i t i o n c o m p r i s i n gc o t t o n s e e d o i l a n d a c o m m e r c i a l f e r t i l i z e r c o m p r i s i n gs u p e r p h o s p h a t e , t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e n u t r i e n t mat e r i a l b e i n g s u b s t a n t i a l l y 1 0 m g / m l . T h e g r o w t h f e e d i ss t e r i l i z e d a t ' a t e m p e r a t u r e o f s u b s t a n t i a l l y 1 4 4 C a n dc o o l e d t o a ' t e r n p e r a t u r e o f s u b s t a n t i a l l y 3 0 C . A n n o cu l u m o f T r i c h o d e r m a v i r i d e QM9414, d e s c r i b e d a b o v e ,i s a d d e d t o t h e c o o l e d , s t e r i l e f e e d j u s t p r i o r t o i n t r od u c t i o n t o a m y c e l i u m g r o w t h f e r m e n t o r f o r g r o w t h o ft h e f u n g u s . F o l l o w i n g g r o w t h o f t h e f u n g u s t h e c u l t u r ei s t r a n s f e r r e d t o an enzyme growth fermentor t o which a n amount o f s t e r i l i z e d p l a n t f e e d s u f f i c i e n t t o p r o v i d ea c e l l u l o s e c o n c e n t r a t i o n o f s u b s t a n t i a l l y 1% s a d d e da s a n enzyme i n d u c e r . Enzyme s produced a t s u b s t a nt i a l l y 1 . 3 F i l t e r P a p e r a c t i v i t y . A f t e r ? l t r a t i o n t o r emove m y c e l i u m s o l i d s , t h e e n z y m e p r o t e i n i s p r e c i p it a t e d f r o m t h e c u l t u r e b r o t h b y t h e a d d i t i o n t h e r e t o o fa c e t o n e , t h e v o l u m e r a t i o o f s o l v e n t t o l i q u i d b e i n gs u b s t a n t i a l l y 3 : 1 . The p r e c i p i t a t e d e n z y m e i s t h e n f e dt o t h e h y d r o l y s i s v e s s e l . S u b s t a n t i a l l y a l l o f t h e a c e t o n ei s r e c o v e r e d f r o m t h e ? l t r a t e b y d i s t i l l a t i o n . The s p e n ts o l i d s f r o m t h e h y d r o l y z e r f o l l o w i n g w a s h i n g a r e u t il i z e d a s f u e l f o r t h e r e b o i l e r - f u r n a c e f o r h e a t i n g t h ef e e d t o t h e d i s t i l l a t i o n column a n d f o r s t e a m / p o w e rg e n e r a t i o n .A l t h o u g h t h e i n v e n t i o n h a s b e e n d e s c r i b e d s p e c i ?c a l l y w i t h r e s p e c t t o t h e e n z y m a t i c d e g r a d a t i o n o fw a s t e p a p e r , i t w i l l b e a p p r e c i a t e d t h a t t h e p r e s e n ti n v e n t i o n i s a p p l i c a b l e t o t h e t r e a t m e n t o f c e l l u l o s i cm a t e r i a l s from o t h e r s o u r c e s . V a r i o u s m o d i ? c a t i o n sa n d c h a n g e s i n t h e p r o c e s s o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n w i l lb e o b v i o u s t o t h o s e s k i l l e d i n t h e a r t w i t h o u t d e p a r t i n gf r o m t h e t r u e s p i r i t a n d s c o p e t h e r e o f , a n d t h u s i t i s n o ti n t e n d e d t o l i m i t t h e i n v e n t i o n e x c e p t b y t h e t e r m s o ft h e f o l l o w i n g c l a i m s .What we claim i s : l1 . A o n t i n u o u s p r o c e s s f o r e n z y m a t i c a l l y c o n v e r t i n g

a c e l l u l o s i c m a t e r i a l t o s o l u b l e s u g a r which c o m p r i s e s :a . h y d r o l y z i n g t h e c e l l u l o s i c m a t e r i a l b y t h e d e g r a di n g a c t i o n o f c e l l u l a s e e n z y m e u n d e r c o n d i t i o n s


6/6

3 , 9 7 2 , 7 7 57w h i c h p r o m o t e c o n v e r s i o n o f c e l l u l o s e t o s o l u b l es u g a r ;

' b . removing a s t r e a m o f h y d r o l y s i s p r o d u c t s from t h eh y d r o l y s i s s t a g e , s a i d h y d r o l y s i s p r o d u c t s c o m p r i si n g a l i q u i d s u g a r - c o n t a i n i n g p h a s e a n d a s o l i d 5p h a s e c o n t a i n i n g u n h y d r o l y z e d s p e n t s o l i d s , b o t ho f s a i d p h a s e s c o n t a i n i n g c e l l u l a s e e n z y m e f r o mt h e h y d r o l y s i s s t a g e ;

c . adding a stream of f r e s h c e l l u l o s i c m a t e r i a l t o t h eh y d r o l y s i s s t a g e t o r e p l e n i s h t h e c e l l u l o s i c m a t e r i a lc o n v e r t e d t o h y d r o l y s i s p r o d u c t s ;d . c o n t a c t i n g t h e l i q u i d s u g a r - c o n t a i n i n g p h a s e f r o ms t e p ( b ) w i t h t h e added f r e s h c e l l u l o s i c m a t e r i a lp r i o r t o t h e i n t r o d u c t i o n t h e r e o f t o t h e h y d r o l y s i ss t a g e , t h e r e b y r e c o v e r i n g t h e c e l l u l a s e e n z y m e 1 5c o n t a i n e d i n t h e l i q u i d s u g a r - c o n t a i n i n g p h a s e b ya d s o r p t i o n on f r e s h c e l l u l o s i c m a t e r i a l ;

e . r e c o v e r i n g a s t r e a m o f p r o d u c t s u g a r s o l u t i o n froms t e p ( d ) ;f . w a s h i n g t h e s o l i d p h a s e c o n t a i n i n g u n h y d r o l y z e ds p e n t s o l i d s f r o m s t e p ( b ) w i t h a s t r e a m o f w a t e r ,t h e r e b y r e c o v e r i n g c e l l u l a s e a d s o r b e d o n s a i d s o li d s b y s o l u t i o n i n w a t e r ;g . a d d i n g t h e w a t e r c o n t a i n i n g r e c o v e r e d c e l l u l a s eenzyme f r o m s t e p ( f ) t o t h e h y d r o l y s i s s t a g e ; a n dh . p r o v i d i n g a s t r e a m o f makeup e l l u l a s e enzyme o rt h e h y d r o l y s i s s t a g e b y t h e s t e p s i n c l u d i n g :1 . i n a ? r s t z o n e , g r o w i n g a c e l l u l a s e - s y n t h e s i z i n gm i c r o o r g a n i s m on a m i n o r p o r t i o n o f t h e p r o d u c t

s u g a r s o l u t i o n , a n d2 . i n a s e c o n d z o n e , c o n t a c t i n g t h e m i c r o o r g a n i s mc o n t a i n i n g medium w i t h a n amount o f c e l l u l o s i cm a t e r i a l s u f f i c i e n t t o i n d u c e f o r m a t i o n o f c e l l ul a s e enzyme u n d e r c o n d i t i o n s s u b s t a n t i a l l y non

3 5

20

25

30

45

50

55

60

65

s u p p o r t i v e o f g r o w t h o f t h e c e l l u l a s e - s e c r e t i n gm i c r o o r g a n i s m .2 . A r o c e s s a c c o r d i n g t o c l a i m 1 w h e r e i n t h e c e l l ul o s i c m a t e r i a l i s w a s t e c e l l u l o s i c m a t e r i a l .3 . A r o c e s s a c c o r d i n g t o c l a i m 1 f u r t h e r de?ned b yu t i l i z i n g i n t h e h y d r o l y s i s r e a c t i o n c e l l u l a s e e n z y m e i nan amount s u f ? c i e n t t o p r o v i d e an enzyme a c t i v i t y i nt h e r a n g e f r o m s u b s t a n t i a l l y 0 . 5 t o s u b s t a n t i a l l y 6 F i l t e rP a p e r a c t i v i t y .4 . A r o c e s s a c c o r d i n g t o c l a i m 1 f u r t h e r de?ned b ym a i n t a i n i n g t h e t e m p e r a t u r e o f t h e h y d r o l y s i s r e a c t i o ni n t h e r a n g e from s u b s t a n t i a l l y 30C t o s u b s t a n t i a l l y6 0 C .5 . A r o c e s s a c c o r d i n g t o c l a i m 1 f u r t h e r d e ? n e d b ym a i n t a i n i n g t h e t e m p e r a t u r e d u r i n g m i c r o o r g a n i s mg r o w t h a n d d u r i n g c e l l u l a s e enzyme f o r m a t i o n i n t h er a n g e f r o m s u b s t a n t i a l l y 2 0 C t o s u b s t a n t i a l l y 5 0 C .6 . A r o c e s s a c c o r d i n g t o c l a i m 1 f u r t h e r de?ned b yg r o w i n g t h e c e l l u l a s e - s y n t h e s i z i n g m i c r o o r g a n i s m i nt h e p r e s e n c e o f a n u t r i e n t c o m p o s i t i o n c o m p r i s i n gs u p e r p h o s p h a t e a n d c o t t o n s e e d o i l .7 . A r o c e s s a c c o r d i n g t o c l a i m 1 f u r t h e r de?ned b yr e c o v e r i n g t h e makeup e l l u l a s e enzyme f r o m t h e c u lt u r e medium b y a d d i n g t o t h e l i q u i d p h a s e t h e r e o f a no r g a n i c s o l v e n t t o p r e c i p i t a t e t h e c e l l u l o s e enzymet h e r e f r o m .

8 . A p r o c e s s a c c o r d i n g t o c l a i m 7 w h e r e i n t h e o rg a n i c s o l v e n t i s a c e t o n e .9 . A r o c e s s a c c o r d i n g t o c l a i m 7 f u r t h e r de?ned b yr e c o v e r i n g o r g a n i c s o l v e n t f r o m t h e l i q u i d p h a s e b yd i s t i l l a t i o n a n d u t i l i z i n g s p e n t u n h y d r o l y z e d s o l i d s a sf u e l t o s u p p l y p r o c e s s h e a t f o r t h e d i s t i l l a t i o n s t e p .

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Conversion of Cell Ulo Sic Materials to Sugar

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