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Contaminanti emergenti nelle

acque: la Watch List europea e i

recenti sviluppi operativi

Busetto, Barreca, Colzani,

Clerici, Dellavedova

http://www.labelab.it/ravenna2018

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WATCH LIST

La Watch List è una normativa europea che prevede il monitoraggio di

sostanze emergenti, su tutto il territorio europeo, almeno per un

periodo di 4 anni e su un numero ristretto di stazioni significative. Le

sostanze emergenti individuate saranno poi inserite nella lista delle

sostanze prioritarie da monitorare per definire lo stato chimico delle

acque.

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La prima lista è stata emessa nel 2015 e conteneva:

• quattro farmaci (tre antibiotici macrolidi ed un antiinfiammatorio),

• filtro solare (4-metossicinnamato-di 2-etilesile)

• tre estrogeni (sia di sintesi che naturali)

• otto pesticidi/erbicidi (imidacloprid, tiacloprid,

tiametoxam,clotianidin, oxadiazon, triallato e metiocarb)

• antiossidante: BHT (2,6-di-terz-butil-4-metilfenolo)



La Decisione 840/2018: Conferme e

Cambiamenti

Nel 2018 è stata pubblicata una nuova Watch List che supera la

precedente. Rispetto all’elenco del 2015 sono stati eliminati il BHT ed il

metossicinnammato (che verranno ricercati nei sedimenti), sono stati

introdotti due nuovi antibiotici (amoxicillina, ciprofloxacina) ed un

pesticida, il metaflumizone e sono stati confermati il gruppo dei

neonicotenoidi, il metiocarb e gli estrogeni

Gli ormoni sono stati confermati nella nuova Watch List perché non tutti

gli stati membri sono riusciti a sviluppare metodi in grado di

raggiungere il limite estremamente impegnativo di 0,035 ng/L richiesto

per il 17-α-etinilestradiolo

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La Decisione 840/2018

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La sfida analitica della determinazione degli

ESTROGENI

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La principale difficoltà per la determinazione degli ormoni richiesti dalla

Watch List è quella di raggiungere il limite di 0,035ng/L.

Per riuscire a raggiungere questo limite è stato necessario mettere a

punto un metodo comprensivo di una doppia estrazione.

1L di campione 1° Estrazione

SPE off line

2° Estrazione

SPE on line



1° Concentrazione

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• Campione acidificato a pH=2 con HCl - stabilizzazione all’arrivo

• 1L di campione caricato su cartuccia SPE stirene/divinilbenzene (tipo WATERS

OASIS HLB 200mg/6mL) precedentemente condizionata con metanolo

• La cartuccia viene lavata con acqua per rimuovere gli interferenti.

• Gli analiti vengono infine eluiti con 10mL di Metanolo

• L’estratto viene ridotto a piccolo volume sotto flusso di azoto e poi ricostituito

con 10 mL di acqua

• 5 mL dell’estratto vengono iniettati nel sistema SPE on-line –UHPLC –MS/MS

(ABISciex 6500)



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2° ConcentrazioneOn-line SPE

• Colonna di concentrazione: Strata C18-E 20 µm, 20x2 mm

• Volume di iniezione: 5mL

• Eluente per la fase di carico: Acqua

• Flusso per la fase di carico: 1,6ml/min

• Eluenti per la fase di lavaggio: Acetone : Isopropanolo: Acetonitrile (1:1:1)



Cromatogramma Livello 1 della Retta

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https://de.wikipedia.org/wiki/Datei:Ethinylestradiol.png

https://de.wikipedia.org/wiki/Datei:Ethinylestradiol.png

https://en.wikipedia.org/wiki/File:Estron.svg

https://en.wikipedia.org/wiki/File:Estron.svg


Parametri di qualità valutati al livello del LOQ

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AnalitaLOQ

(ng L−1)

Linearità

(ng L−1)R2

Recupero

%

Ripetibilità

CV %

17-α-Etinilestradiolo 0.035 0.035 – 1.12 0.999 96.7 10.5

17-β-Estradiolo 0.1 0.07 - 2.24 0.999 99.9 17.20

Estrone 0.1 0.07 – 2.24 0.999 105.9 17.43



Metodo ORMONI –SPE ON LINE

10



11

Novità Amoxicillina, Metaflumizone,

Ciprofloxacina



Novità Amoxicillina

L'amoxicillina è un antibiotico ad ampio spettro largamente usato

per il trattamento di malattie sia umane che animali e appartiene al

gruppo delle penicillinne (antibiotici β-lattamici) che viene escreto

immodificato nelle urine e nelle feci.

In Italia nel 2001 ne sono state vendute 209 tonnellate.

L’Amoxicillina è molto solubile in acqua (solubilità = 3430 mg/L) e la

ricerca bibliografica ha evidenziato alcune criticità per la sua

determinazione mediante SPE OFF Line

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SPE Recupero

13

Cent. Eur. J. Chem. • 11(8) • 2013 • 1343-1351

B. Kasprzyk-Hordern et al.

J. Chromatogr. A 1161 (2007)

132–145



AMOXICILLINA

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Doppio picco

dell’Amoxicillina in

acqua e solvente

Picco

Amoxicillina in

acqua e solvente

e acido

Aggiungendo una

minima quanità di acidoPicco Amoxicillina in

acqua



Ciprofloxacina

Ciprofloxacina è un antibiotico sintetico del gruppo dei

fluorochinoloni ed uno degli antibiotici più largamente utilizzati al

mondo.

Nel 2016, in Italia, solo per uso veterinario ne sono state vendute

9,592 tonnellate.

E’ molto solubile in acqua (solubilità = 30 mg/L), ma poco stabile a

pH acidi. (Braschi, et al., 2013; Moarefian et al., 2014)

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https://it.wikipedia.org/wiki/Antibiotico

https://it.wikipedia.org/wiki/Chinoloni


STABILITA’

Sebbene diversi studi abbiano riportato la presenza di amoxicillina e ciprofloxacina nelle

acque di scarico ed in quelle superficiali le loro emivite in acqua superficiale sono

relativamente brevi a causa della rapida bio-e-fotodegradazione.

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AMOXICILLINA

Country Source of monitoring data Values (µg/L) Reference

SpainHospital wastewater, and urban WWTP effluent

in Girona 0.218-0.258

Gros et al., 2013

France Seine River 0.068 Dinh et al., 2011

Italy River Po <0.002 Zuccato et al., 2010

Italy River Arno0.006 (mean);

0.010 (max)

Zuccato et al., 2010

Italy WWTP effluents 0.015 – 0.120 Castiglioni et al., 2005

Italy Different WWTP effluents 0.0018 – 0.120 Andreozzi et al., 2004

CIPROFLOXACINA

Spain Ter River downstream WWTP in Girona 0.072 (max) Rodriguez-Mozaz et al., 2015

FranceSeine River;

Charmoise River, downstream WWTP

0.017;

0.135

Dinh et al., 2011

Italy Surface water, River Po 0.009 (mean)Zuccato et al., 2010

Italy Surface water, River Arno 0.019 (mean) Zuccato et al., 2010

France, Greece, Italy, Sweden WWTP effluents 0.060 (median) Andreozzi et al., 2003

Italy Po and Lambro River 0.020 (median); 0.026 (max) Calamari et al., 2003



Novità, Metaflumizone,

Il Metaflumizone è un insetticida ad ampio spettro, utilizzato nella

difesa delle colture orticole.

Vendita media nazionale (2009-2012) = 4,5 tonnellate/anno

Ha una bassa solubilità in acqua (0.0018 mg/L)

Nelle prove iniziale risultava critica la stabilità del metaflumizone.

Questo perché l’analita precipitava in soluzione acquosa anche

dopo poche ore. Il problema è stato risolto preparando gli standard

delle rette, i quality control ed i campioni aggiungendo una

percentuale di solvente (metanolo) pari al 20%.

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«Whole water analysis»

Durante l’ultimo Workshop tenutosi ad ISPRA ad ottobre 2018, si è

molto discusso sulla opportunità dell’iniezione diretta per la

determinazione di queste sostanze, alla luce del fatto che alcune di loro

potrebbero tendere a rimanere adese al particolato e l’iniezione diretta

è una tecnica che richiede la filtrazione del campione, onde evitare

problemi strumentali.

Sono state quindi condotte delle prove mediante ESTRAZIONE SU

SPE OFF LINE e successiva analisi del campione mediante LC-MS/MS

La natura molto differente delle sostanze in discussione rende però

difficile l’utilizzo di un unico metodo di estrazione, soprattutto a causa di

quelle sostanze che potrebbero tendere a rimanere adese al

particolato, su cui si evidenziano grossi problemi di recupero (cit)

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SPE OFF LINE

19

0

20

40

60

80

100

120

140

Analiti a Confronto

Data la natura molto differente delle sostanze, l’utilizzo di un unico metodo

di estrazione risulta critico, soprattutto per Metiocarb ed Amoxicillina, per i

quali si evidenziano bassi recuperi

Sono state testate differenti fasi SPE (polimeriche/C18) con differenti

quantitativi di riempimento (150mg/6mL; 200mg/6mL; 500mg/6mL)



EMPORE DISK

Viste le difficoltà di mettere a punto un unico metodo di estrazione dato

il differente comportamento delle sostanze in studio si è deciso di

provare ad utilizzare gli empore disk non come sistema per effettuare

un estrazione in fase solida, ma come filtro su cui fermare il particolato

che verrà successivamente eluito con solvente in modo da estrarre

l’eventuale sostanza organica adesa al particolato.

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METODO DI ANALISI DEL CAMPIONE INTERO

100 mL di campione +

standard marcati

21

Filtrazione su

EMPORE DISK

Eluizione del

particolato con 20mL

di Metanolo

Recupero del

campione intero

Analisi in LC

MS/MS

Condizionamento del

EMPORE DISK con 10

mL di Metanolo



METODO DI ANALISI DEL CAMPIONE INTERO

100 mL di campione +

standard marcati

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Filtrazione su

EMPORE DISK

Eluizione del

particolato con 20mL

di Metanolo

Recupero del

campione intero

Analisi in LC

MS/MS

Condizionamento del

EMPORE DISK con 10

mL di Metanolo

Per la determinazione è

necessario acidificare il campione

dell’AMOXICILLINA IL CAMPIONE



RIVELATORE

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Tutte analisi sono state condotte con il sistema 6500 Plus della Sciex,

che è sistema ibrido: triplo quadrupolo/trappola lineare

Gli analiti sono stati identificati:

• per confronto dei loro tempi di ritenzione

con quelli degli standard interni,

• attraverso le transizioni ione precursore /

ione prodotto.

La quantificazione è stata eseguita mediante

calibrazione con il metodo dello standard

interno.

E’ indispensabile l’utilizzo di standard interni

marcati, fondamentali per correggere l’effetto

matrice.

L’utilizzo del triplo quadrupolo ci permette, perciò, di raggiungere i LOQ (ng/L)

richiesti dalla Watch List.



MRM Multi-Reaction-Monitoring:

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In questo caso il quadrupolo Q1 è fisso sullo ione molecolare ed il quadrupolo Q3

sullo ione frammento.



Parametri di qualità valutati al LOQ

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AnalitaLOQ

(ng L−1)

Linearità

(ng L−1)R2

Recupero

%

Ripetibilità

CV %

Azitromicina 19 10 - 500 0,999 116,5 4,9

Claritromicina 19 10 - 500 0,999 100,1 4,0

Eritromicina 19 10 - 500 0,999 95,0 27,0

Metiocarb 2 2 - 500 0,999 126,2 7,6

Imidacloprid 9 5 - 500 0,999 85,7 4,4

Clotianidin 9 5 - 500 0,999 100,4 7,1

Tiametoxam 9 5 - 500 0,999 72,5 14,7

Tiacloprid 9 5 - 500 0,999 72,6 4,2

Acetamiprid 9 5 - 500 0,999 74,8 16,8

Metaflumizone 65 50 - 500 0,999 114,9 2,7

Ciprofloxacina 78 50 - 500 0,999 105,3 8,3

Amoxicillina 89 50 - 500 0,999 84,1 8,6



CONCLUSIONI

Unico metodo di estrazione (esclusi gli ormoni).

Due metodi di analisi a causa delle differenti condizioni richieste per

l’amoxicillina rispetto agli altri analiti

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GRAZIE PER L’ATTENZIONE

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