CONFER ENZE E SEMI NARI

Some biologica} interactions studied by pulse radiolysis techniques (*)

J. V. DAVIES

Paltr!on Labortrtorie!, Christie Il ospitai an d Ilo/t Radium I M IÌirrtP, .lfanrMsttr. F:rrglatrà

D . .\l. POWER and J. S . .\rOORE

Drportmenl of Chemistry and App!ied Chemistry, UnivPrsity of Salfo rd, Engilmtl.

Complex formation betwel'n proteins and ùrug ' , mLLco-poly,;accharide;, an1l dyes, or detergent typc molecules is well documentcd in tbc litcraturc ( 1•3) and has been studied b y a varicty of methods including ultrafiltration , dialysis and metachromatic spcctrometry. In this romrnunication we attempt to show that thesl' binding procc ses can be gcnerally investigated by pulsc radiolysis which , in 1>ome cases, providcs information not obtainablc by oth cr methods.

For the particular example of penicillin binding to proteins (~) we hav<· measurcd tbc variation in the reaction rate of e~ with proteins (e.g. bovini' serum albumin [BSA] or lysozyme) alone, and wh en complcxed witb peni­cillin G [P en G]. Tbc logic of tbc method can be underslood from tbc data prescntcd in Fig. l. Curve a rcpresents the change in firs t order rate cons tant of e- r elative to the conccntration of P en G. With the same con·

a q

centrations of Pen G, in tbc presence of 10 - 5 M BSA, curve b is obtained . Curve cis the expected cbange in rate constant if the BSA and Pcn G reacteù inùcpcndently with e~ and no interaction between thc two components took piace. By subtraction of curve a from curve b one obtain curve d which shows a progressive decrease in r eactivity <>f BSA towards c~ when complexed ·with increasing amounts of P en G. The fact that the reactivity of BSA-Pen G complex (curve b) is lcss than the expectrcl additive function (curve c) indicates some kind of intcraction h etwcen the two comp01wnts.

( • ) This paper is based on a leeture given al lhe Istituto Superiore di Sanità, Rome, on October 15 th, 1970 by one of the aulhors, J. V. Davies. who wi;obes to thank lhe lnsti· tute fo: the invitation to visit their laboratories and for finan cial nssistancc.

Amt. 1st. Sup er, Sanitt\ <1971) 7, 005-612.

(,06 CO~FtRENZI:. t St:MINARI

5-

~ ' ~ l '6"0·-o·---o •.•• o. ---o----o----o---o-~--o----o ; 3 ~

o 3 ' 5 6 9

(P•n G) x 10' M

Fig. l. - Intcraction of Pcu G with BSA at pH 6. (BSA) = l x IQ-5 M. k1 (B8A +e;)= 4.1 x 106 (8ec- 1). Curve a (X) = k 1 (Pen G +c-;,;). Curve b (C:.)= k 1(•b•) .

the observed rate con­stant for mixture• of Pen Gand BSA (l > 10-4M). CurvP. c (o) = k 1{(Pen G - e~) +

k 1 (BSA , E'~). Cur· ,.e d (o) = k ,Cob<) ­

k1 (Peu G .L e;;).

\Xlhcn KCl or l\aCl is addcd in ~; uflit'i <·nt conccntration to tbc mixturc, the expPrted additive rate constanl (curve c) is obtaincd. This proves thal this typ e of compl1·x ca n be cle~troyrd by inorganic salt ~; similar to the case of ccrtain metachromalic compounds (~) and furthcr, indicates that

t hP hincling is ioni c in nalu re. From consideration of tlw stru cturc of thc penicillin molccu}(• tbc most

oln·iou;, binding sit c is the carbox~ group attadtNI to thc thiazolidine ring. I n Pc n G t h e H is r cplaced b y l\ a. but t bi~ carhoxy group ca n b e csterificd and cxperiments ha,·c been pcrformt·d with tht• methyl ester of P en G aml a lso thc acetoxy methyl est er (P l·namccillin). In both cascs tbc cxpectcd theorctical curve c was obtaiucd " ·bieh i;. <·vidcnre for binding bctween tbe ionizc· cl carbo:-.:· group of tht· pcnicillin molccule and a positivcly charged

amino group in th(' protein (srr bclow) :

H O H Il 11 l il l l l / S ""- / CH3

R-C - C -1\-C-C C l l l l CH3

H C-l\ C-COOH l

O H

Peuicillin

A tlll. 1st. Surer. Soui tù rt971J 7, 005 612

•

DAVIES, POWEB E MOOBE 607

P enicillin V [Pen V] in which the group R is modified by substitution of Ce H

6 -0 - CH2- for Ce H 5 • CH 2-, bchaves in a very s imilar manner to

Pen G. 1f lysozyme is used as tbc protcin part of the complex, the interaction

of Pen G shows thc same type of behaviour as that observed '\'ith BSA, as can be seen in Fig. 2. In this case also addition of KCl caused a break ­down of the complex formation and addition of 10- 2 M KCl was required

Fig. 2. - Interaction of P eu G with l ysozyme nt pii 6. (Lyoozymc) = l x l0- 6 ..\f. Curve" (X) i.• vnriation of k 1 (Pcn G + e.q). Curve b (t:,) = k 1(obo), the o!Jscrved rate constant for mi· xtures of Pen G and l) SOZ) mc. Curve c (o ) = k1 (Pc n G + e;) + k1 (lysozyme + e-;.;). Curve cl (O) = k 1(ob>)

- k1 (Pcn G + e;;).

O ' 6 8 10 12 t' 16 18

[ Pen G]x10'M

to observe curve c, i. c. complete uestruction of the complex. The KCI concentration is some tcn timcs greater in the case of the lysozymc com­plex than the BSA ('omplcx inùicating grca ter binùing efficiency by lysozyrnc than BSA. Howcver, the rcactivity of lysozyme towards e~

dccreases with incrcasing sal t concentration and this obscrvation must be taken into account wht' n intcrpreting the binding data. The decrease in reactivity of lysozyme with e- is the same for ali the different pcnicillins

•q used , namcly, Pen G, Pcn V, Ampicillin, methyl penicillin, Carbenicillin, Phrnethicillin , Methicillin and Cloxacillin.

From a comparison of Figs. l and 2 it will be seen that whereas the fir st molectÙe of bound P en G causes a larger decrcase in e~ reactivity of BSA than subsequently bound molectùcs, cach molecule of pcnicillin complcxed to lysozyrne has an cqual eff<'ct on e;;; r eactivity up to six mole-

.4 ntl. lat. Suve·r. Scz111tà (1971) 7, 605- 612

60R CO='Ot' EIIENZE E SEMI~ARI

ctt.lcs, aftcr whicb no furthcr efl'ect is notcd. This may indicate tbat tlw 6rs t molcctùc of penicillin caust•s a considcrab1c structural cbange (or r ear­rangemcnt) in BSA wbicb results in certain of tlw sitcs of e- r t'activity

n q

h ccoming unavailablc. Sue h chang<'s ha ve n o l l.H•cn ohscrved for l yso-zymc .

Tbc evidcnce aLovc is s trongly indicative of short range iouic binding occurring rapidly hctween tbe ionizc1l carboxyl group of thc peniciUin anù positively charged amino groups in the protein <'hain. Thc poss ihlt• T Ca C'­

tion sitc1:> in lysozymc are thc si nglc histidinc rc~ idue. the <·lc,·en arginine rcsidues and lhe six lysirtt' r esidue._, onc of t h e latter being tht· N -te r­minai ex-amino acid. Th<' arginine a mi ly~:~inc r cl-idul', an• h.now11 to bt· arrangcd extcrnally (6). Whcn lyso~.yrn l' is treatetl with 2.4-,u-trinitro­bcnzcnc sulphonie acid. reaction oeeur ;; cxclu;:iYcl) aml co- valenti~· · with tbc e-amino groupi; of t hc Jysine n :sidu<·s (7). Lysozym(' modilied in thi s way docs not bimi to penicillins a" proved by th1· fact t ha t ''t' obtain curve c (Fig. 2) whcn this materia! is uscd. Wc conclude, then•fon·. that in lysozyme hinding occur, with lysin(' r e:iiducs only and uot with a rginine or hist idine. This confirtn!' tlw obsnrvation that after addition of s ix: molt•· cules of P en G to nati n l)•sozv rne no furtht-r r cdttct ion in c- reactivit y

• afJ •

takes piace (Fig. 2). It must be notcd tha l thc cxpcrimental evidl•nce rl·porl ed h en · relalt·~

to a hinding process whicl1 is electronic• in natun· aml docs not ex:clmle othcr types of complcx formation sucla as h yt!rophubic hcmding or cvcn <·o-valcnt addition, whicb would be non-rcnrs ible. P eni<·illin alleq~ie;.. han- bl'en attributed to irrcvcrsibh· prote in-pcnicillin comiJination sudl a,; woultl occur witb mixcd disulphide bridges Letwccn thiazolidin e :.ulphur and cy:Stcirw SH groups or acylation o f the amino group of the ~-lactarn ring. Th(•sc· two lattcr products would not h<· affcctcd hy adcli t ion of salt. a" ,,·c havc obscrvcd, aml therefore do not play a par t in our experimPnt.s .

Thc obscrvation tbat methyl pcnicillin. whit·h docs not contain an aromatic nuclcus in the si de cbain R, causcs a smallc· r d<·ereast• in c- r ea et i·

"''l v ity than eithcr P en G or P cn Y which both contain a benzene r ing. is n ot unexpcctcd, s incc the two latter compounds would be more etlìcicnt in form­ing hydrophohic bonds. W e cnvisagc that th c clcctrostatic (ionic) procr:o;s takcs piace mucb more rapidly than hydrophobic hunding, a not unreasona­ble assumption, and tcnds to « allign» thc components of the complcx aftcr which hydrophobic hond formation occurs.

Thc ohserYation of thc staining of tissucs by ecrtain dycs is a very old one and is thc hasis of much histological and hiochcmical experimcntation . Originally an empirica} fìnding, tbc undcrlying phcnomcna of metachromasia have recently been cxtens ively investigated Ly Mich aelis, (8) McKay an d Hill­son (9 ) Scott (1°) and other s . Many polyanions, such as hcparin and tbc cbon·

A'"'· l'r. Sull<' r. Su•lil!ì (1971) 7, 005· 612

D.t.VIU, POWEil l MOOU 609

droitins when mixed with cationic dyes, e.g. methylene bine or acridine orange, cause a so-called metachromatic shift in the absorption spectra of the dye. The explanation of this spectral change is stili a matter of some controversy but among the possible reasonl! are interactions between neigh­bouring dye molecules bound to closely adjacent sites on the polyanion chain and interactions between the dye and the binding site.

W e have sought to investigate this binding process by means of pulae radiolysis which is independent of spect:rophometric changes and can be used even when no visible or ultra-violet spectrum exists. The rationale of the experiments can be cnvisaged from the example of complex formation between methylene blue and heparin (U).

The reaction between e~ and methylene blue is very rapid with a second order rate constant of k, = 2.4 X 1010M- 1 sec - 1•

MB+ + e;;; .....- MB (semiquinone)

In generai, however, polyanions react much more slowly with e~, ks being approximately 107 to 1()8 M- 1 sec- 1 and N aCl and KCl arevirtually un­reactive (kt < l 06 M- 1 se c- 1). When the N a salt of heparin an d methyleDe blue chloride are mixed the reactivity of e;;; becomes dependent OD the coD· centration ratio. If the concentration of heparin is expressed in the form of number of negative sites available for complex formatioD 'lvith the positive charge OD MB+, an d the ratio of negative sitesfpositive charge is gradually increased, the r eactivity of e;;; decreases until at a ratio of 10/1 or greater it becomes equal to that with heparin alone. UDder these conditions we conclude that ali MB has been hound and that the e- r eactivity of the a q complex is the same as heparin itself.

The equilihrium equatioD for the process may be written as follows:

MB+ CI-+ Na+ Hep- ~ MB -Hep + NaCI

an d K = _ _,[M::.._B-_H_e~p-=-] .::.[N_ aC_l.;:...]- - - --=-[MB-__ H____,ep:.::]_• -- a t a giveD [MB+ CI-] [Na+ Hep-] [MB+ CI-] [Na+ Hep-]

temperature. Since first order rate constante are additive we can write:

where k1o.bo) is the first order rate constant ohserved in a solution of complex and the other k1 values are as indicated by their super scripts. W e know that k~NaCIJ is Degligible and that k1 for the complex and polyanion are

A nn. ltt. Super. Sanlt4 (1971) 7, 006-611

610 CO~FERE:>;ZE E SE:\JINARJ

identica} and sincc tbc sum of tbc concentrationl:> of the complexed and uncomplexed heparin equals tbc initial eoncentration of hepar.in used we can writl':

or k [lllB + CII k lob•) k:"•- Ut ~j l = L - l

[liB .._ Cl- l

Sinee the second ordcr rate eons tant k~~m+ CIJ = _k_ 1 --­

[Cone.]

it follows that

a od k (ob•) k(N• ~ lltpj

eone. offrec MB -r Cl-= 1 -_

1 _ _ _

k~~Ill r CI- J

Thus the conecntrat.ion of fr ee (unbound) )'lB+ CJ - cau bt• calculated, ami h cnce the amount of complcx formed aud the frl' e hcparin. Ry carrying out exper.iments a t various tempera tures wc can e!>timatc thc cqu.ilibrium con-

stant K and by using an Arrhcnius typc plot of log K against -~ euthalpi es

can b e calculated from the expression .l G = -HT Jog K. F urtht•r . entropy ehangcs can be evaluated from thc s lope of the plot of ~ G againl' t T. sinn~ Il G = Il H -T Il S. In tbc accompauying Taòh· l data for some of thc:>c thermodynamie propert.ies are giveu for a numbcr of polyanion, of tht• mucopolysacchar.ide type complcxed with mPthylt>m· blue.

As in thc case oftht· penicillin-protl' iu complt•x tbt• addition of inorganic salts tends to break up thr. eomplex. What m ay bt• callcd thc « limit.in ~ salt coneentration » can h<' estimateci by IDI'asnring thc eoncentration of salt n eeessary to res ton' thr n;;:; r cactiYity of thc complcx to that of mcth) • lene blue i . c. to that condition when thc compie:-. ha.., bcen complctcl~ de­stroyed and all thc dye becomes free again. Thw; ru1 es-timate of thc binding affinity of differcnt polyanion s can b t" made and depending on the uatun· of thc negati\'e anioni<' s ite on the pol yanion we ean show that thc hinùing eflicicncy follows the serie~:

This simple conclusion must h•· takcn with some eaution, since tho: data presentcd in Table l suggcst that factors such as number of siu:; per moleeule and molecular weight play a part in b incling cffieiency. Fur-

.hlll. lat. Suv~r. Sanità 11971) 7, 605-ll!Z

DAVIES, POWER E ~IOOJIE 611

TABLE l

Some thermody namic data for interaction of methylene blue ~ ith polyanions.

(\18-] -= 10 -S ~I[Polyanion) = 10- 1 equivalent •ite~ per litr e. Colurnns ' ond 5 indicate, re.pectively, the nature of the negative :lite and the numhtr of such ~i tes

per repea t ing dimer urut of the polyanion.

POLYANION E '"'uu l Entbalpby atropy

~cal • D>ole-1 cal·d-s.-t 1----.,.----- '\L\\ l. x t <H mole-l ~ature ' '' dtmtr

llyaluronic .\ eid - 13.8 -42.7 -CO, l :!00

Hynluronie Acid Sulphatc - L l -17.3 -co;- l 1:: < 200 - o.so;- 1 !~ , _

Choudroitin·1·Sulphnte . - ILA l - Js. 11- co;- l l

l ? -.. . ~')

-0.501 :!

Chondrc>itin -6· nlphate .

l - llJ.l l -36.4 - r.o;- •l -

l -.. ) - O . SO, :!

\!giunte l 8.6 1 -:!9.7 l - co;- 2 1\.8

Kt>rnlllll Snlphate l - 6.9 -:!i.7 -O.SO, l 1.11

Jcpnrin -10.2 - 3·L2 -co;- =~ l • L. l -0 SO) l l~ -~so;- l

l

··Dr,ulphatcd Jlepariu - 9.5 -26.8 2 1 ~ 1.1 - O so;- l 1 ~ l 1-ro;-

l Poly· I·Ch.~m"' .. · 1- 13.2 -45.s l- co;- J 9.0

thcr wo rk is nce(]cd to cstublish with more ccrtttinty thc funcliOtl of thr sb:c, wt•ight and confìguration of the polyanion, thc numht•r as wr ll as 1 he outurP of the negative l" itcs and their distribution on tbc prOC('SS of complcx fo rma tion.

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612 CO!IIFUENZE E IIEMUIAIU

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A nn. l et. Super. Santt4 t1971) T, OOH12

Il bilancio sodico durante il digiuno e la rialimentazione, con particolare riferimento ad una forma di terapia

dell'obesità (*)

GIUSEPPE GIOCOLI

Laboratori di Biologia

La terapia dell'ob esità basata sul digiuno assoluto c prohrngato fu intro­dotta da Bloom nel 1959 (l) c si diffuse notevolmente negli anni seguenti n egli Stati Uniti cd in Europa. Da allora, sono stati riportati risultati com­plessivamente favorevoli ma, con l'estendersi del numero delle osservazioni, non sono mancate segnalazioni di sgraditi effetti collaterali, dei quali il più conosciuto e il più studiato è stato senza dubbio il fenomeno della con­tinua perdita urinaria di sodio durante il digiuno, seguita nella fase della rialimentazionc da una ritenzione idrosalina.

In realtà sembra che l'eliminazione di sodio, con conseguente diuresi e deplezionc dello spazio extracellulare, costituisca la vera ragione delle cospicue perdite di peso alle quali vanno incontro tali pazienti (da 0,5 a l k g al giorno durante le prime due settimane di trattamento), largamente in eccesso in confronto al dispendio calorico durante il digiuno. Con un analogo meccanismo, e altrettanto sproporzionatamente al numero delle calorie introdotte, molti chili perduti sono spesso riguadagnati durante la rialimentazione. In questa fase il sodio degli alimenti, e con esso l'acqua, vengono infatti quasi completamente ritenuti nell'organismo. La caratteri­stica di quest'ultimo fenomeno è la sua appar ente speci6cità in presenza di carboidrati (2), benché qualcuno lo abbia descritto r ecentemente anche in presenza di proteine, ma non di gras!'i (3) .

L'argomento ha des tato notevole interesse, oltre che clinico, anche fi sio­patologico e biochimico. E sistono infatti molte ipotesi sulle cause di queste modificazioni del bilancio sadico durante il digiuno e la rialimentazione e la seguente trattazione è una rassegna clelia vasta le tteratura esistente in materia.

(0

) Dal l e!to di un seminario tenuto dall'A. il 12 gennaio 1971 all'Endocrine Study Group presso il V rterans Administration Hospital d i Syracuse, New Y ork.

A nn. Cst. SupeT. Sanità (1971) 7, 613-625

8

614 CON.FEIIENZE E SEMINAIII

* * * L'cscrcz.ionc urinaria di sodio durant<· il dig:iuno protratto prest'nta

una serie di osciJJazioni di varia ampiezza cht' vanno dimimu·ndo con il pa nrc dci giorni, lìno a valori ba5ali di circa 5-10 mEq al giorno (Fig. 1).

120

~ o ~ 100

......... rr .., E

~ 80 o

111

40

20

o 2 3 L

l n contrappos izione a tah· andamL'IIlo, J>iuttos to con~ou ••to, s i osserva in ulcwti sogg('tl i unu natriuresi non decliuante, ma sempre piit inten ... a, p er cui l'organismo "a iucontro ad una gra\ c deplezione di sodi o, for s<' dovutu ad uu cedimt•nto dei meccanismi norma lmente messi in opcru per limitare le p«'rditc di questo catione (Fig. !!).

Fig. 2. - E•crl'tione urinaria di sndio Ì11 uu obeso sollopo•to n digiune> proluugato: i n ufficien· za del sistemo sodio­rileutore r enule. Da Ruucie r Thom•oo (4 )

6

140-l

~ o 120.

... .::::.. rr ... E IOO o :0 o

111

80

60

4 0

20 ~ l

o

7 8 9 s~t!tmant'

4

A'"'· hl

IC

Fig. l. - E-crt•7ÌUill' urin.t• ria di ~odio iu uu ol•('•u >Ottopo'' o a di~tinnn prolu11 · gatu. U<t Huuci•• c Thnm-on (•).

l

5 6 7 IO Il Stllima nt'

Su11er. ~Cintlò 119i l ) 1. 6!3-C!~)

GIOCO LI 615

Nella Fig. 3 è evidente ch e durante il digiuno i soggetti obesi eliminano sodio in quantità eccedente quella introdotta; la natriuria è però arrestat:a dnlla somminis trazione di calorie glucidiche.

Fig. 3. - Escrezione winaria di &odio in soggetti obesi durante il digiuno e la rialimentuione (200 g

di gluco&io al giorno). L'introduzione giorna­liera di sodio venne mantenuta costante durante tutto il perio· do (linea tratteggiata). Medie di 8 valori. Dai dati di Kolanowski e coli . (1).

Periodo di 70 controllo

Digiuno Rta limenta~IOne glucidica

60

! 50 o ~

"' ....... .,.. "' E

~ 30

5l 20

o

SODI O

2 3 4 5 6 1 8 9 IO Il 12 13 g•omi

t. intere sante affermarsi sulle correlazioni tra perdita di pe o e volume 11rinario descritte nella Fig. 4. Da questi e da altri dati (7) ~ abbastanza evidente che le rapide modificarioni ponderali nel digiuno e nella rialimen·

" ... o

2J)

~ I.S

~ \: c:

~1.0 o ...

0,5

o

PERIODO DI CONTROUO

l

r-

1/ }l~

3

f"' \. "\

DIGIU NO RIALIMENTAZIONE

D dtur esi

-- calo di peso

l'l \.fl '-l"- ..... !--' ~~ "' " v Ì\1 ~~- ...... ~

1\ IO 20 24 30

giorni Fig. 4. - Rapporti tra diure~;i e perdita di peeo in soggetti obesi d11rante il digiuno e la

rialim,.ntuione (900 Cal miste al giorno). L'introduzione giornaliera di acqua fa mantenuta coHante (1,7 l) e praticamente costante fu In • per'lJÌratio insenaibili5 » (1,3 l al giomo). Medie di 4 valori. Dai dati di Rapoport, From e Haadan (1).

l'"'- l lt. upo~r. Sanltd 11971) 7, 81H2b

616 CONFEilE:"'ZE E SE:IHNARI

tazione sono legate soprattutto ai movimenti delracqua <' dei ali, partico­larmente del sodio. In realtà solo una modesta aliquota del calo di pe o sarebbe attribuibile a perdita di grasso (circa il 20<}0 nei periodi ùi digiuno a breve termine). Infatti nell'esperimento dcscritlo nr lla figura. le urine giornaliere scesero da 1.2 l nella prima settimana a 0.81 l nella terza. e durante questo periodo il calo di peso diminul da 0.8 a 0,4 kg al ~iorno .

Essendo costanti durante l'intero periodo la razion<' giornal iera di acqua da bere (1,7 l) e la« perspiratio insensibilis» (circa 1.3 l al f!Ìorno), Ì' chiaro che s ia la diuresi che la perdita di peso furono più alte n <' lla prima fa c de) digiuno e che l'una fu correlata all'altra.

L 'effetto dci carboidrati dietetici Rul mantenimento dt·l livello del soclio è noto da lungo tempo. Gamblf" (8) lo descrisse fin dagli anni della Ja guerra

4> ... o

~ ..........

200

~ 100 E ·~ 'b o Il)

50

20

2

mondiale quando, in espr-d l~fa iposod1ca ( obeSI ) • • ull rtmenll s a sopra,...,;_

Il d 1g ru no ( mag r 1 l venza dci naufraghi, som-111 die t a ag L'1cid ica (magri) mini1-trò a soggetti v o· l V d 1g 1uno (obesi)

' l

lontari digiunanti acqua semplirc· o contenentc glucosio : i soggetti rice­, -enti glucosio eliminaro· no n t'llt• urine quantità minori di sodio. Ncll952 H an <'' e McCancc (9)

com pi rono un'altra serir di c~pcrimenti che dicdc· ro ri ,.ultati comparabili ed inùic·arono l'importan ­te ruolo dei carboidrati nella <·onserYazione del­r acqua (' del ~aie in sog­getti in stato di inanizio­ne. L'importanza d ell 'as-sunzionf' di calorif' per la ritenzione del sodio fl1 ulteriormente messa in

3 ' 5 luce d a Bloom c IDt-glorni

Fig. S. - Escre:tione urinaria di sodio in soggetti ohe~i t' chell (10) che paragonaro­

magri sottoposti n diversi trattamenti dietetici. no l'csrrezionc di sodio n declino d ella natriuria è lento e non esponrn- di soggetti obesi a digiu ­ziale, tranne che nella dieta I (iJ>O•odica). Dai no con quella di altri io ­dati di Bloom e Mitchell ( l0) (cun ·e l e 1\ ); dividui a dieta iposodica Bloom, Azar e Clark (11 ) (cun·n 11): Bloom c Azar (l') (curva III). (Fig. 5) . In questi ultimi

A un. h l . Suvcr Sa111tà 119711 7, 613~25

l

GIOCOU 611

iil declino della natriuria ha un andamento esponenziale (curva I), per cui l'eliminazione di sodio si riduce assai rapidamente (circa del 50% ogni giorno), mentre nei soggetti obesi a digiuno il declino non è esponenziale e la na­ttiuria è più elevata e persistente (curva IV). In altre parole, l'ingestione dei carboidrati contenuti nella dieta limita le perdite di· sodio. ~ interes· sante notare che il modello non esponenziale dell'eliminazione del sodio a digiuno non è caratteristico solo dei pazienti in sovrappeso, ma anche dei soggetti magri normali (curva II) (U).

Inoltre, come rilevato da Bloom e Azar (U) e in seguito da Bloom (U), osservazioni analoghe possono esser e effettuate anche in soggetti che con· sumano una dieta, purché sia del tutto priva di carboidrati (curva III).

Secondo Bloom ( 13), digiuno e dieta aglicidica hanno una componente comune, vale a dire « la limitata disponibilità di carboidrati nella m.iacela metabolica a livello cellulare ... ; gli effetti dei carboidrati dietetici non sarebbero qualitativì, ma dipendenti dalla loro quantità, largamente in eccesso sull'ammontare proveniente dal catabolismo proteico mediante la gluconeogenesi». Del resto, durante il digiuno, le modificazioni della glicemia sono minime. Un'altra componente comune potrebbe essere la difettosa utilizzazione del glucosio disponibile, a causa dell'aumento della concen· trazione degli acidi grassi e dei chetoni (~').

Saranno ora presi in esame e discussi vari fattori indicati come responsabili della natriu­resi a digiuno e della ritenzione di sodio durante la rialimenta· zione selettiva.

l) ClaeUXJCiào1i. I chetoni acidi e l'urea, come sostanze partecipanti al processo osmo­.tico e, nel caso dei chetoni aci­di, come molecole richiedenti la neutralizzazione, aumentereb­bero l'escrezione di sodio du­rante il digiuno; la ritenzione sodica nella rialimentazione si potrebbe spiegare proprio per l'azione antichetogena e pro­teino·risparmiatrice dei carbo­idrati. Bloom (U) definl «erro­nea» tale interpretazione, ba­sandosi sul fatto che, se si pon-

150

~ o ~ 100

""' ~ e ·.s o

U)

so

24

200

150

50

o sodiQ A chetoni

48 72 96 h

Fi«. 6. - Escreltione u.rinaria di eodio e di che­toni io eogetti obesi dura.ote il digiuno. lledie rispettive di 10 e 14 puientì. Dai dati di Bloom (q) .

. t nn . lat . Sup..-. SonftA (1971) 7, 81~2b

618 CONFERI:.NZE t SEM Il\ ARI

gono in Wl diagramma r escrezione uri n aria di ~odio l' q udla di chetoni du­rante i primi 4 giorni di digitmo, si puc'1 immrdiat~url l'lllt· coHs tntare ch e la escrezione sodica è piit r1evata quando quella di chrtoni (• più bassa (Fig. 6).

Le argomentazioni di Dloom 'fili' ano puhblieat c tJUa~i contcmporanea­mt:nte a due lavori (Hi , 16) tlt'i quali l' i da' u i rH t 't'f' uma ~o~ pi egazion c abbastanza soddisfaeente della teoria d ella elwt l.aridoi- i. Gli A •\ . s tudiarono in var il' fasi l'eliminazione di sodio d i pazienti uhe~i ( Fi~. i'). La natr ittria fu misurata durante un periodo di seti t· giorni tli di t> ta ipm.odic·a (dieta di Kempncr):

DIETA IPOSODICA DIETA IPOSODICA + NH4CI DIGIUNO

1° esper1mento 2° espenmento

\~ ~,--.-,--r-,--.~--~~T ~ --r

2 6 7 2 L. 6 8 2 4 6 8 giorni

10

Fig. i. - E·crcziow: urinaria d i •odio iu I'·IZH'II ti ulw•i . J• t'•f't rirneutu (li11ea marcata): diet a ipo•odica (giorni 7) ·er.uitu tl.t IU J!•urui di diJ!iunu: !!0 e•1wriruento (linea sott ile): dieta ipo~ndica (giunt i 7) •f'~uia .• ;l.tll.l .u·.-a ...L :"HlCI (~orni 8) e da 9 j!'iurni di dij!'iurw '\d i " o'•i•••rimt•utu l,, cutlutu tklln nutriuriu i.- el i t ipo t'•(lOncnzialc durantf lu dirla ipu·111liea cd ,. •<'ttuit.t tla uu alto picco di e:-crt'­zione durante il digiunu. :'\el !!• r•pt·rirucutu •i ha la ·t•···a cadutu della oatriuria durante la diew ipo-oJ ica, !'f'j!'ll illl da uu pin-n dt c-t·rrziont dur•rn t e l'at'idu~i du -H, CI; nel succc-sivo dtj!irruu ti J'Ì<'<'U uatriurit'11 i- multo più uo ~ .. o. La conclusione è cht' l 'anunorlloj!t'll<'•i indntta tJ,,JJ'a( tdu•Ì lll('tubolìca ~~titui-ct

gr adualmente l'e;;cre;:ioue df' l ••l(ltn nrlla neutr<~luz.u:ume d ei chet oni acidi (vedi aocbr il t r~t u). H ai dati tlr . tinrhauj\h e Sdrlorder (l') r Schloedu e Stinebaug.b (11).

l'escrezione scese rapidamcn tt• da cin ·o 130 mElJ al giorno a poC'o più di 10 mEq al giorno, seguendo nei primi 3 o 4 giorui il tlccliuo t•-.poneuzialc descritto da Bloom e Mitchell (10). Successi' anH·n tc i ~oggetti furono posti a digiuno, e allora venne osservato di nuoYo un pirco di r~cr<·zione sodica intorno al quarto giorno, con succcll~i vo rapido dcclioo. Gli AA. conclusero che la natriuria, sin allora interamente attribuita a l digiuno calorico, consiste in

Ànn. Itt. Super. Sanitd !1971) 7, 61~26

CI OCOLI 619

realtà di due fenomeni contemporanei c distinti: l) 1ma perdita di sodio iniziale e rapidamente declinante dovuta a lla sottrazione del sodio dietetico; 2) una su ccessiva « poussée» escr etoria dovuta alla sottrazione di calorie.

Le due curve di eliminazione, separate n ell'esperimento di Schloeder e Stinehaugh, sono combinate e sovrappostc quando il digiuno inizia dopo un periodo di dieta normale e normosodica. In realtà è la seconda curva di t' liminarione descritta dai due AA. che rappresenta la vera « natriuresi da digiuno» e« delinea chiaramente sia n egli aspetti quantitativi che t emporali le modifìcazioni dell'escrezione r enale di Eodio cfft~ttuate dal digiuno quando gli influssi dietetici precedenti sono eliminati». In tale circostanza l'elimina­zione di sodio va aumentando nei primi giorni di digiuno insieme all'escre­zione dei chetoni che vengono così neutralizzati; nel frattempo entra in azione l'ammoniogenesi renale, che permette la sostituzione degli ioni sodio <'On gli ioni ammonio a livello dei tubuli renali.

In un successivo esperimento di Schloeder e Stinehaugh (15) venne :,amministrato cloruro d'ammonio per indurre un'acidosi metabolica durante il periodo a dieta iposodica precedente il digiuno: s i ebbe una « poussée » Ji nat:riuria, pero nel successivo p eriodo di digiuno il consueto picco di elimina­zione apparve molto abbassato. Ciò venne interpretato come i l ristÙtato ùelJl'induzione dcll ' ammoniogenesi. Il diagramma mostrato da Bloom ribul­ter ebhe pertanto una sovrapposizione di diver se curve e la diminuzione ddla natriuria contemporanea all'aumento della chctonuria potrebbe perciò l'sser e spiegata con l'entrata in funzione dell'ammonjogenesi renalc.

La spiegazione è suggestiva e viene appoggiata da V crdy e de Cham­plain (17). E ssi menzionano il fatto che i cani, i quali non vanno soggetti ad a pprezzabile che tosi durante il digiuno, mostrano una precoce scomparsa del sodio urinario quando Ycngono totalmente privati del cibo.

Katz. Hollingswortb c E pstein (3) ritengono invece che la diminuzione della na triuria da digiuno dopo la somminis t raziooe di cloruio d 'ammonio non è dovuta all'ammoniogenesi, ma alla lieve ùeplczione sodica provocata ne l periodo prepara torio a l digiuno. Inoltre questi AA. sostengono che la natriuria del digiuno non è imputabile ad una ùiurcsi osmotica, nt1 ad una neu tralizzazione de i raclicali acidi; ne sarebbe prova che nei loro esperimenti anche la rialim entazionc con proteine (ma non con grassi) provoca il fl'no­meno della ritenzione sodica. Effeuivamente l'apporto proteico dopo il cligiuno non causa l'arresto dt'lla r betonnria né riduce l'escrezione urinaria di tuea.

In c:.perimenti di altri AA. fu somminis t ra to bicarbonato di ~odio clurante il digiuno per n eutralizzare l'acidosi ; malgrado ciò i livelli d i escre­zion e del sodio continuarono ad essere !iuper iori a i Livelli ingeriti (5) c nella rialimentazione gliciùica s i Ycr ificò la consueta ritcnzione sodica (18). Questi dati vennero interpretati come una prova che l 'acidosi non è responsabile

A nn. l 1t . Super. Sanità (197t) 7. 613-025

620 CONFERENZE t. St: ~IINMU

d ella natriuria. ~cl compl<'l""O n on sembra pcrù rht' ripote i dell'acidos i sia de6uitintmente da scartart' . perchè l'<·,·itlcnza contraria ì· ancora affetta cla dubbi.

:!) 'ecre::ione di aldosteronP. Seconùo Bloom e )litch cll (10) il decl in o n on espon enziale della nat riu.resi a digiuno potn·hlw esserC' correlato ad un'in:-;uCTicicuza clelia rispu.sla aJJo,tenmica, nelfipult·.~i <.:he Ju di eta. u uuu dci suoi costituenti. influisca sulla secrezione di alclosteronc. A tale pTO· posito possiamo ricordare alcuni espcrimt'nti da nni condotti con Augt•lico e col i. (19) c con Angelico (2D) dai quali ì• emerso eh,• una dictu ipcrlipiclica contc tH' III<' l'l% di colestero lo, l ! una di da iperglicid iea somministrata dopo un pt·ritJilo di digitmo sono rispt' ttivamf'nt e in gruclo di diminuir•· o aumcn · tare il contenuto in a ldostc·ronc della ghiandola surrrnalf'. La t1•oria aldolit!'· ronica fu in seguito ripresa da Rapopor t. .From l' H u!-idan (6 ) . che trovarono un aumento d ella vclocitù di sccuzionf' d t>ll 'aldostrront' (AS H) durantf' il digiuno. Precisamente, l'ASR era apprussimativamente raddopp iato in un soggetto obeso all'So e al I 6o giorno di rugiuno. ma l"incrcmcnto era addirit· tura di (i volte durante la r ialimentaziont• con una razione contt•nentc cirrca ilso c;~ eli calorie in carboidrati e praticamPntc asodiea. L 'aumento p ersi!1t rva , anelli' !1 t' in grado minore, d opo aggiunta di sodio alla dieta ( Fi~. 8).

PERIODO DI CONTROLLO

DIG IUNO RIALIMENTAZIONE

100,------ l

sodìo mg.:rito aldosterone

~------T1ooo ~ • o 1 col

""-.... 60~ Qf E 40

. ~ "tJ ~ 20

Fig. 8.

5 10 15 20 25 30 35 L, Q

-..;t-

taoo ~

• 600 ~ V)

L,.QO "(

200

45 giorni

E-erezione urinnria di ~odio e secrezione giorunlil'rn di aldosteroue (ASR) io un ~oggetto obe.o d urant e il rligiuno e dut> consecutivi periodi di rialimentazione con una dieta nùsta (50"0 delle calorir in carboidrati) content.>utr divet sc quun· tità di sodio (linee trll.ttcggiatc). Dai dnti di Rapoport, From c llusdan (1 ).

Secondo gli AA. l'increm cnto dell 'A R durante• il djgiuno era probabil­mente un effetto secondario della ruminuzionc del volume plasmatico e dello spazio extracellulare conseguente alla deplezione sod ica nei primi giorni di digiuno. Tale opinione fu da noi condivisa quando, in 9 obesi

~ rw. li t. S11per. Sartitd 11971) 7, 01~

r.10c01.1

a ll'no g iorno cii digiuno. riJe., ammo un .:: igrùficativo aumc>n to clelraldo.::tero·

nurin ri:"pcllo u valori d i base (Fig. 9) e•). Rap oport (.' i '-liOi ('Cilluhora tori

~ i ch ie ... t•ro :nH•bc se l'aum ento dell'_\. R a lla fitu• tlt' lla prima ,cttimana di ùig itmo non fo«~c minor e di

CJtH·llo c·hc ._j voteva :1ttcndl're do pu un pcrioclo di d t•plezionl'

-c>cli cn, <' M' l· iò non pot e•ht·

-piq;.t rc le perduranti perd ite eli ., odio nell e u rinl'.

L: incrctnl'nto molto pw mar(·a to th·ll' \ SR nc•lla riali · rot•n tazionn poteva invc<'e es:, e·

re ntt·glio c·orrc·lato t'on la t'oli · ... id c•rt•\ ulc; ritt•nzinnc i>Od ica pro·

prio di fJill'lla fa i'c, schbt' nc i IDCt'l':llliSm i di f{lH'S t!l miglio­ratn ril'po~ta t' ntlocrina fu,.;;au

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\Itri ri -.ultnti fa,·or evoli nlla t eoria a ldo:.t ero nic·a fttrnno puhhlic•ati nd l9o7 da Ha nst'n c coU. (;!2) i 'JUali trovarono rapporti "Xn "-. urinari infPriorì ad l :di' uo giorno di diginno. t ' da Haag c l'oli. ( 1 ~).

.. 100 o ... N

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o ALOOSTERONE C:. RENINA t J~m~nto r~spetto al ncrmale

Fij:". IO. - 1-Jf,•lli olt:l dì!!,ìttttll,. tlo•ll.t rill l imt•nt:n;ìnn r -o·ll'tll\ .1

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urinurio r di n•nuln pl.t·

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\l ht'•o. Le mc.nrnztoni fn· mtto o·-t'gu ilt' tlnpo 17

t!iurni di tli~Zinttu i' due Ctlthl'l' llli' i pt•riHtli di j

~-tiorni di ri ul iutrnt uziou•· ('Q il 1011 c.tl oli ~ra ... i c

100 Cal oli glucu-io. '-;ulu ttc lln rinliutrulutitml' ~li·

••io licn i li\'l' ll i tli rcuiu.t ,

··lrv11li in lutlt• le c •tmli· Ltoo tt t, •OnO .tct·ompagnlllt

ola nhi liHIIi tli .ti.Jo,ll•·

rnuc. Dai cinti ol i Hau~t

c ., .. n. ( "').

~•·<·ondo ' JliC, ti ultimi _\.-\.. , il sbll'ma r eninn-a ogil) tr n:-. ina·altlul-olfororlt'

~ in ~rado di r i ~poutl c• rc ~olo parzialmr utc a lJo :,timolu tli un tlimimù to

vulume plu~matico clurante il di~;iuno (conseguen tt• a lla tlt·plrt.imw 'lltli<·a).

1 1111 , ' ' ' · SUJitf .... ,, ,,, llil 7, tHJ t\:!~ ••

-622 CON FEIIE'\ZI: l SI \11'\Alll

Infatti i lin•ll i di r cnina. ma nou qu<•Ui di alclo,..lcrouc, erano cltvati in un pazit·n t e all7° ~dorno di d igitwo: lo ~ • ~·~l'o actadc\a durant<' la rialimt·nta­z ione t•on gra~!oi. mt·ntrt> sowmiuistrando t•arLuidrnLi non solo i li\ ciii di r eni n a t·rano el<'' a ti . m a r e:"crrzione urinaTia di a ldui->tcron c aunwnta va paTalJI'lamt•ntr (Fi~. 10). La sint rsi di a ltlo .. terom· .,auhbe quiJldi « glueoso­dipcn~lf'n te·».

Dati 1\f:I\Ort'\ uli a lJIIN·t ~l teoria furono Ìu \ t'l'l' riportati da Smith e roU. (23 •

21) . m a il m ct•can ism n a ldostf'rtlrli<·o ioocmhra defin iti\ a men te fuo ri

t·au a da quando Hillnf'Tova. Hath <' l\la-.el. (2:i) hanno tro' ato d•e la r it rn· zionc Forlit·n durant<' la rialimrntarione ._j 'criftca nuche H' il pazicn tt• ,.,

:-o tto traiUHliCnl o ton l'pironolntton e (Fil!. 11), il ··lu· roo fl'rmu prerNienti o4.1a t i parzia li di Grr~in~t c Bloom (26). ]nf:ttti. colll'ì· nolo, lo :.pironolattouc

Controllo Dig uno

4- SPIRONOLATTONE

3-

o

I il!. Il. - Bii.Hll' ltt •t>dic" f!HITIItllwro iu fH11it·uli ulw•t' lr.allal<> CUli •JIIfet·

nobttt>IH' (IUU 11111 nl df). durnult' il tli!:iuuu ,. l.t ri.llintt•ntiiLitollf'

c o11 :;uu ( ol l!iur,anlil'rr di (';arhuadrnti (nwdit• di l) voluri). L<' pazieuti in,.:eri' a n o Hl g di :\n( l n l !,(iorno. Lo ~pironoluttu11!'

11011 influi,cr •nl f <' II(IIJII'IIt> drlln ritt'IJZÌOIII' •nùico da riulinll'll·

taz imH' ~;licidit'a. Dai dali di Bitturrova, Hoth e )[o<rJ.. ("").

!Jiol'('a raziunt· eodio-r it.·nth a dell'aldo~t {· ronc tl Jj, ello dl· l tuhulll (•ontort o di!-talt·. Jll'r t•ui il .. uo impiego permcttr rrhb1• di t•liminarc. ogni influenza minrraloall i' a :,lÙ f1•nomeni studiati.

3) .'\ll•rcallismo re11nle. ~'righ i . Gann «' A.LLcrtseH (Z7) Ol>Servarono ch t• la ~ommini ... trazione 1•ndo' r nosa d i glttCObÌO a soggetti obesi a digiuno da .J- :> giorni diminuiva l' r erezione urinaria di sodio c aumcnta,·a il potere di conrentraziou l' del r cnr dopo un in t rn·allo d i sole 2 ore (Fig. 12).

A 111'1 . lat. Sur•er Sa111tà U9i i J 1, 61H26

GIOCOLI 623

Secondo gli AA., poichè il riassorbimento del sodio nella porzione midollare del n efrone è glucoso-dipendente, il digiuno può porre un limite ad esso ed anche al concomitante riassorbimento di acqua. In tal modo

o l diuresi • Il diuresi

6 l diuresi • Il diuresi

1000

-~ E 800

............

~ ~ ~ 600

<(

:}

200

600

550

500

450

400

350

8 12 16 20 24 28

Cos14 oppur~ V mlj m in

Fig. 12. - Parngone degli effetti del glucosio in successive diuresi osmotiche su: l) escrezione urinaria d!i sodio (U •• V) in rapporto alla clearanec dci soluti (C.,.m) e, 2) osroo­lalita urinaria (U.,.m) in rapporto al flusso urinario (V). In &oggetti obesi al 40 giorno di digiun o furono eseguite due successive infusioni di 600-700 mi di soluzione glu­cosata a l 10% (con circa 90"'ln di intervallo), unitamente alle varie determinazioni. La Coem venne ricavata dalla formula: C.,m = U.,ru x VJPoem (ove P.,.,. = osmolalita plasmatica) e corrisponde ai ml di plasma <<depurati» ogn i minuto dai soluti. Nella seconda diuresi osmotica l'eliminazione di sodio è più bassa per ciascun valore di clearance e il pot ere di concentrazjone è più alto per ciascun valore di flu sso, in seguito alla prima infusio­ne di glucosio. Dai dati di Right, Gann e Albertsen (27).

o i' ~

............ E V1 o E l: V)

-:3

aumenterebbe la natriuria e diminuirebbe il potere di concentrazione del rene; il glucosio sar ebbe in grado di r estaurare i meccanismi di riassorbi­mento. Tuttav ia gli AA. non seppero spiegare come mai soggetti a digiuno

A nn. lat. Super. Sanit~ 11971) 7, 613-625

624

non possono conservare normalmeul t• il sodio malgrado una glicemia che ò pressoché normalf' grazie alla gluconcogcnebi.

Un a« ipotesi renale » alquanto dif[crcntc è quella formulata r eeen tcment c da Kolanowsky e coli. (5). Essi ri~conlrurono in obes i n digiuno tma marcata riduzione della tolleranza al carico di gluco:.io, a~o~ ~ocia ta ad un ritardato èd eccessivo aumento dei Ji, elli pia ma t i l'i di insuluta (Fig. 13). L'ipott•si avanzata dagli AA. fu di 1111 ~>fff't to 1lell'immlina Stll ria~sorbimeulu ~odicn

e sulla ritenzione idrica , in quanto e Ì'\ lOno O""'t'rYazioni (citate) di un effetto antidiuretico di quest 'ormone nell'uomo e di una sua influenza s uJ trasportu attivo di sodjo nella vescica di ro!-pn.

Dall'esaro<' della letteratura ci s<·mbrn di pott•r l'lmcludl' rc eh <' la s pi<-gu· zione fornita da Gambl t.• e coli. (~ij) a propo~ito df' lle p<'rditc di mineral i

-E o o

300

'­~200

100

GLICEMIA

o

·--·~. ~.

o prima del d igiuno

• 2° g iorno d• dig•uno

L.S 90 135 180 minuti

INSULINEMIA

3001 200.

lOO~v~ o 45 90 135 180

mmut1

Fig. 13. - Prove du enrico orole di glucosio (SU g) in ~o(lgl'lti obesi prima e tlopo un periodo di :2 giorni di digiuno (I.IU. in•ulinn do~atu con metodu immunologico). Medie di 8 \'Olori. Uai dati di Kolano" •ki e coli. ($).

durante il digitmo sembra tuttora la più \'alida, anche "" pre~enta akuni punti oscuri. Secondo tali AA., il odio t' il pota:. ... io dci tl·s-.uti (particolar­mente muscoli e fegato) vengono liberati nell t· vi t· circolatorie ed escnt i nelle urine quando le proteine cd il glicogeuo ti!'sutali Vf'llf!Ono catabolizzati durant(• il digiww. Quando la demolizioni' dell t· proteine· ('Orporce Yi cnc minimizzata dalla rialimcntazionc. sodio, potas;,iu t • Ut·quu vengon o « seque­strati» come parte integrante deU(' !-trutturt· ti ~:-utali c quindi la loro climi­nazione declina.

Il pilOto debole della tcoriaè rappresrutnto dalla sp<'cificità dei carbo · idrati in questo fenomeno. Io r<·alto'& Kntz c coli. (3) ç,ono riusciti a dimostrare nei loro pazienti una efficacia delle proteine, però mr no immrdiata <li quella

''"'· llt . :>ur•cr Sanllà (1971) 7, GlH2r>

GIOCO LI 625

dei carboidrati . Se tali da ti verranno confermati ed estesi, si potrà rite· nere la spiegazione di Gamhle assai verosim ile. Essa non esclude la comparte· cipazione di altri meccanismi par zia li operanti a livello renale, del sistema rcnin a-angiotcnsina-aldostcrone ed un intervento della chetoacidosi e della diuresi osmotica.

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ZURITA, CABTA D& ANCELI E TE!In C .A M POSANO

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