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Comparisons of two proteomic analyses of non-mucoid and mucoid Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from a cystic

fibrosis patient

Jayasim haRao, F.Heath Damron, Marek Basler, Antonio Di Giandomenico, Nicholas E.Sherman, Jay W. Fox, John J. Mekalanos

and Joanna B.Goldberg

Iliana Vanessa Medellín AlfonsoEsteban Jiménez Gaviria.Universidad Pontificia Bolivariana Facultad de Medicina3th Semester

Introduction

 

In this study

used

Strains 2192 (mucoid)

Strains 383 (non-mucoid)

were isolated from sputum were isolated from sputum 

days apart from the patient with CFdays apart from the patient with CF FIGURE 1 Phenotypesof P.aeruginosa CF isolates383and2192on L agarmedia. Streaks ofstrains383and2192wereculturedonLagarfor 24 hat37˚C.Thesetwostrainswereisolatedwithin2daysapartfroma CF patient.Previousdataindicatedthesestrainsareisogenic(Hanna etal., 2000). Thegenomeofstrain2192hasbeensequenced1 (Mathee etal., 2008).

Strains 2192 (mucoid)Strains 2192 (mucoid)

Strains 383 (non-mucoid)Strains 383 (non-mucoid)

AlginateAlginate Unbranched linear polymer of parcially acetylated β -mannuronic acid and it´s C5 epimer α-guluronic

Introduction

Synthesis:Synthesis:Begins: cytoplasmEnds: extracellular

Synthesis:Synthesis:Begins: cytoplasmEnds: extracellular

algD: alginate biosynthesis operon

algD: alginate biosynthesis operon

algC: encode enzymes required for synthesis of alginate

algC: encode enzymes required for synthesis of alginate

FactorFactor MucAMucA

Biosynthetic are controlated

Biosynthetic are controlated

byby Production of alginate

Production of alginate

DegradationDegradation

ineffective elimination of P.A in the CF lung

ineffective elimination of P.A in the CF lung

conversion to the alginate mucoid, over expressing phenotype

conversion to the alginate mucoid, over expressing phenotype

provides these bacteria additional protection from antibiotics and phagocytic killing

provides these bacteria additional protection from antibiotics and phagocytic killing

Introduction

Introduction

Variants of P.aeruginosaVariants of P.aeruginosa

Establish as dominant pathogens in chronic lung diseases of CF

patients.

Establish as dominant pathogens in chronic lung diseases of CF

patients.

Contribute to the lung infection of CF patients.

Contribute to the lung infection of CF patients.

Alginate over production Alginate over production

GENERALITIES

Pseudomonas Group

The pseudomonas are gramnegative bacillus, with motility and are aerobic.

There are few pseudomonas in normal intestinal flora and the human skin.

The ranking is based on the homology of the rRNA / DNA and the common characteristics of the crop (cultivo).

Pseudomonas

They are distributed in soil, water, plants and animals.

Pseudomonas aeruginosa colonizes the human and is the major human pathogen group.

The PA is invasive and toxigenic

infections in pacients with poor

defenses and is an important

nosocomial pathogen

Pseudomonas Aeruginosa

• P. aeruginosa secretes a variety of pigments: pyocyanin, fluorescein and pyorubin.

• Clinical identification of P. A

includes identifying the production

of both pyocyanin and fluorescein.

• The microorganism use carbohydrates for his nutrition, causing microbial corrosion. It creates a dark gellish sometimes improperly called "algae" because of their appearance.

Proteomic

•  Area of molecular biology.

• Is the large-scale study of proteins, particularly their functions and structures, which is homologous to the genomic.

• The term "proteomics" was first coined in 1997 to make an analogy with genomics, the study of the genes.

The word "proteome" is a blend of

"protein" and "genome", and was

coined by Marc Wilkins in 1994

Robotic preparation of MALDI mass spectrometry samples on a sample carrier.

Cystic fibrosis

• The most common autosomal recessive diseases and potentially fatal among the population.

• Is caused by a mutation in the CFTR gene, located on chromosome 7. This gene is quite large and complex. Found more than 1,000 different mutations that cause CF.

Cystic Fibrosis

CFTR Gene

CFTR Encode the synthesis of a protein

transports chloride across cells

transports Cl- across cells Cl- H2o

Filling of water and production of viscous mucus.

Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator

Pseudomonas aeruginosa / Cystic Fibrosis

The big relation between Pseudomonas aeruginosa / Cystic Fibrosis is:

•Cystic Fibrosis is a perfect environment for the development of Pseudomonas aeruginosa, making patients more unstable.

•Most people with cystic fibrosis have a chronic respiratory infection caused by Pseudomonas aeruginosa

Objetive

• The main propose is to get a relative and absolute proteomic quantification using iTRAQ analysis and Gel electrophoresis (2 DE) in strain 383 and 2192 comparing the amount of it.To determine clear differences between mucoid strains and non mucoid strains in respiratory airways with Cystic Fibrosis.

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES Y MÉTODOS

CEPASCEPAS

MATERIALES Y MÉTODOS

Análisis iTRAQ

Es un método para descubrir que diferencias se encuentran en pacientes con fibrosis quística en comparación al análisis con 2 DE electroforesis.

Consiste en:• Un análisis de cuantificación• Utilizando técnicas de espectrofotometría

•Prueba de electroforesis para separar las proteínas para determinar si eran sintetizadas o no determinando la diferencia de tamaño y de carga

Es un método para descubrir que diferencias se encuentran en pacientes con fibrosis quística en comparación al análisis con 2 DE electroforesis.

Consiste en:• Un análisis de cuantificación• Utilizando técnicas de espectrofotometría

•Prueba de electroforesis para separar las proteínas para determinar si eran sintetizadas o no determinando la diferencia de tamaño y de carga

MATERIALES Y METODOS

Análisis 2 DE electroforesis

Es un método para descubrir que diferencias encuentro en pacientes con fibrosis quística en comparación al análisis iTRAQ.

Consiste en :

• Se extraen un total de proteínas de las cepas 383 y 2192• Se recogieron cultivos por centrifugación• Extracción de proteínas mediante solubilizacón •Finalmente las muestras de proteínas fueron sometidas a electroforesis en gel 2 DE utilizando anticuerpos

Es un método para descubrir que diferencias encuentro en pacientes con fibrosis quística en comparación al análisis iTRAQ.

Consiste en :

• Se extraen un total de proteínas de las cepas 383 y 2192• Se recogieron cultivos por centrifugación• Extracción de proteínas mediante solubilizacón •Finalmente las muestras de proteínas fueron sometidas a electroforesis en gel 2 DE utilizando anticuerpos

Purificación de la ProteínaPurificación de la Proteína

Las proteínas se pueden visualizar y distinguir fácilmente por métodos de la electroforesis. 

La purificación de la proteína es vital en la caracterización de estas proteínas:• HCP•PAO• Opr•TSSB mediante la purificación de estas proteínas se permite el estudio de sus funciónes por medio de ITRAQ y electroforesis 2 DE

Las proteínas se pueden visualizar y distinguir fácilmente por métodos de la electroforesis. 

La purificación de la proteína es vital en la caracterización de estas proteínas:• HCP•PAO• Opr•TSSB mediante la purificación de estas proteínas se permite el estudio de sus funciónes por medio de ITRAQ y electroforesis 2 DE

MATERIALES Y METODOS

MATERIALES Y MÉTODOS

Espectrometría de masas en tándemEspectrometría de masas en tándem

La espectrometría de masas es una técnica de análisis basada sobre la separación de acuerdo a sus razones masa/carga de las especies

cargadas

La espectrometría de masas es una técnica de análisis basada sobre la separación de acuerdo a sus razones masa/carga de las especies

cargadas

formadas a partir de la ionización de una muestra, los puntos individuales de proteinas se cortaron de los geles y fueron analizados utilizando el algoritmo

SEQUEST de busqueda para encontrar Pseudomonas midiendo su peso (masa).

formadas a partir de la ionización de una muestra, los puntos individuales de proteinas se cortaron de los geles y fueron analizados utilizando el algoritmo

SEQUEST de busqueda para encontrar Pseudomonas midiendo su peso (masa).

MATERIALES Y MÉTODOS

DETERMINAR EL PESO DE LA PROTEINAS POR MEDIO DE ELECTROFORESIS UTILIZANDO ANTICUERPOS.

DETERMINAR EL PESO DE LA PROTEINAS POR MEDIO DE ELECTROFORESIS UTILIZANDO ANTICUERPOS.

Técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en muestras determinadas

Técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en muestras determinadas

Se trata de analizar Pseudomonas aeruginosa el las cepas 383 y 2192 que crecieron en L-agar a 37ºCSe trata de analizar Pseudomonas aeruginosa el las cepas 383 y 2192 que crecieron en L-agar a 37ºC

RESULTADOS

Análisis iTRAQ

Resultados

• Aquí se presenta la identificación de fragmentos de 399 proteínas.• Los datos de cuantificación relativa se obtuvieron de 297 proteinas de las 2 cepas.• Se encontraron proteínas expresadas diferencialmente.

297 proteínas

1

2

3

67 proteínas (23%)

77 proteínas (26%)

153 proteínas (51%)

Expresion en cepa no mucoide (383)

Expresion en cepa mucoide (2192)

Expresion relativa entre cepas mucoide y no mucoide

Análisis iTRAQ

Resultados

• Identificación de la expresión diferencial

(rara vez se expresan en altos niveles)

Reguladores de la transcripción

identificación

Análisis fue capaz de detectar proteínas de abundancia baja

Resultados

FENOTIPO MUCOIDEFENOTIPO MUCOIDE

Metabolismo para producción de alginato

Metabolismo para producción de alginato

Este análisis proteomico indicó que la motilidad de Alginato regulador Z (Amrz), algF, algD y algC, fueron

sobre reguladas en la cepa 2192

Amrz: cinta de union al ADN de helice-helice de proteínas que actúa como represor transcripcional

algC: enzima que cataliza fosfomanomutasa, segundo paso en la via del alginato, la cual estaba en la cepa 2192

algD: precursor del acido polimanuronico

algF: proteína que funciona al acetilar residuos del acido manurónico.Acetilacion de prop fisicas e inmunes del alginato.

Cuando P. aeruginosa produce en exceso el alginato

No hay gran demanda en el metabolismo central para producir los intermediarios metabólicos y como

combustible para la alta demanda de energía para la producción de Alginato

Resultados

Resultados

TssB1(PA0083)TssC1(PA0084)Hcp1 (PA0085)

Tienen mayores niveles de expresion en no mucoide 383 que en la 2192

Canal por donde pasan macromoleculas

Cepa 383

Tiene mayor expresión de la mayoría de los operón

Se sobreregulan en no mucoide, derivados de las

mucoides CF

T6SS

Resultados

Relación inversa entre el T6SS y el fenotipo mucoide de la P.Aeruginosa

Usa para competir con otras bacterias y aumentar la amplitud de la P. Aeruginosa para la infección del pulmón de la CF.

La adición de este fenotipo mucoide a este modelo presenta un cuadro por el que el no mucoide inicia la infección y el fenotipo mucoide surge, después de que la infección crónica puede ser

establecida, negando de la necesidad de T6SS

Análisis 2 DE electroforesis

Resultados

Éste análisis da el tamaño y el pI de las proteínas aisladas

383 2192

Para visualizar diferencias entre las proteínas de cada cepa, éstas fueron separadas y se visualizaron manchas con expresión diferencialPara visualizar diferencias entre las proteínas de cada cepa, éstas fueron separadas y se visualizaron manchas con expresión diferencial

El tamaño previsto y el pl se compara con la de las secuencias de proteínas de larga duraciónEl tamaño previsto y el pl se compara con la de las secuencias de proteínas de larga duración

Resultados

PMM

MS-MS

Indica las proteínas que son los mas abundantes en un lugar sin corazónIndica las proteínas que son los mas abundantes en un lugar sin corazón

No sugiere que una proteína se abundante, sino que identifica péptidos que pueden corresponder a proteínas de cualquier lugar en núcleo.

No sugiere que una proteína se abundante, sino que identifica péptidos que pueden corresponder a proteínas de cualquier lugar en núcleo.

Resultados

Reveló dos proteínas de la membrana externa

OprH

OprF

Fuerón expresadas diferencialmente entre las cepas 383 y 2192

OprH Mas abundante en la cepa mucoide 2192

Resultados

Un punto diferencial de proteínas teñidas entre las cepas 2192-383 es una proteína conservada (PA0460)

PA0460 Es 5 veces sobreregulada cuando sensor elimina la cepa PAO1

PA0315 Proteína conservadora en la 2192

PA0315 en la cepa 2192

Pr- Bacterianas de Pseudomonas aeruginosa

TAMAÑo

Carga

Resultados

Secreción de la proteína tipo 6, en las cepas 383 y 2192

• Disminución en la HCP1 en la cepa 2192.

• En el 2-DE electroforesis confirmo que HCP1 y TssB1 se incrementaron en la 383.

• Los anticuerpos específicos para la TssB1, TssC1, HCP1, se utiliza para cuantificar la expresión de la T6SS en las cepas 383 y 2192.

•Los anticuerpos de interés de la TssC1, se relacionan con TssB1 y HCP1

•Sugiere que la cepa 383 ha incrementado la expresión de la T6SS mas que la 2192.

Western blot sistema de secreción de análisis tipo 6

(T6SS) en las cepas 383 y 2192

AUTHOR WHAT HE /SHE SAID AGREE DESAGREE

Winsor Bioinformatics analysis of the 297 proteins recognized from iTRAQ analysis allowed funtional classifications as defined by the Pseudomonas genome database

X

Guina Of the quantified 297,81 proteins showed significant p values in either one or both iTRAQ replicates. In comparison with earlier studies of other P.aeruginosa strains.

X

Discussion

Conclusions

• Were identified some biological differences between isolates of P. Aeruginosa from a patient with Cystic Fibrosis.

• The mucoid strain (2192), was associated with CF in the chronic stage of disease due to the overproduction of alginate by the strain

•The use of electrophoresis perfect determines the way to identify specific differences between the weight and size of specific proteins.

•This type of activities improve the learning of medical students by giving them strategies for research and analysis skills.

Bibliography

Jawetz, Melnick, Adelberg, MICROBIOLOGIA MÉDICA, Edition 18th Manual moderno editorial, chapter 17, pages 257-259.

Nelson, behrman, Kliegman, Jenson, TRATADO DE PEDIATRIA, Edition 17th pages,1437-1441

http://cysticfibrosis.about.com/od/relateddiseases/a/paeruginosa.htm

Elaborado por: Iliana Medellín

THANKS!