Columna uso biorreactor para la optimización de la producción de pectinasa en el cultivo de sustrato

sólido RESUMEN

Este estudio tuvo como objetivo determinar la influencia de variables de proceso y producción de poligalacturonasa (PG) y polymetylgalacturonase (PMG) por el cultivo en sustrato sólido utilizando un biorreactor de lecho de la columna fija. Un diseño factorial fraccional (FFD) para estudiar el efecto de las variables siguientes: microorganismos (Aspergillus oryzae y Aspergillus niger), sustrato (salvado de trigo y salvado de arroz sin grasa), aireación (40 y 60 h ml -1 g -1) , pectina (5 y 10 gg -1) y nitrógeno (urea y sulfato de amonio). Microorganismo, la aireación y la pectina inicial se identificaron en FFD como variables significativas (p <0,05) en la producción de PG. Un diseño compuesto central para optimizar el PG y producciones PMG indicó que Aspergillus niger presenta una mayor producción de PG; sustrato y el nitrógeno no afectar la producción de PG, la tasa de aireación afecta positivamente la producción de PG y negativamente en la producción de PMG y la concentración de pectina inicial afecta positivamente tanto PG y la producción de PMG. El punto óptimo de la aireación y la concentración de pectina inicial para la producción de PG son 66.13 h ml -1 g -1 y 12,8 gg -1, respectivamente, y para la producción de PMG son 40 h ml -1 g -1 y 15,0 gg -1, respectivamente.

MATERIALES Y MÉTODOS

Preparación de inóculos: Aspergillus niger y Aspergillus oryzae se mantuvieron en agar papa dextrosa (PDA) a 4 º C. Los inóculos se realizaron después de que el crecimiento de estos microorganismos en un PDA durante 7 días a 30 º C, hasta la esporulación del hongo completo. Las esporas fueron suspendidas en solución acuosa esterilizada (121 º C durante 15 min) con Tween% 0,2-80 detergente. la concentración de esporas se determinó por conteo directo en una celda-contador cámara de Neubauer, según Hasan et al. (9).

Diseño experimental:Un diseño factorial fraccionario 2 5-1 (FFD) para identificar las variables que afectan a (p <0,05) la producción de PG en el cultivo de sustrato sólido. Las variables estudiadas en el FFD se aireación en el volumen de aire por el tiempo y la masa seca de la media (h ml -1 g -1), la concentración de la pectina de la masa de la pectina añadido por unidad de masa seca de la media (gg -1), las fuentes de nitrógeno agregado para obtener 0,03 moles de nitrógeno por medio de la masa (g mol -1), microorganismos desecados (Aspergillus niger yAspergillus oryzae), y el salvado (de trigo o de arroz). Las pistas, las variables y los valores codificados en estudio para FFD se muestran en la Tabla 1 . De acuerdo con los resultados de la financiación para el desarrollo, un diseño central compuesto (CCD) se llevó a cabo para optimizar las condiciones de cultivo para producir PG y PMG. Las pistas, las variables y los valores codificados en estudio para el diseño compuesto central se muestran en la Tabla 2 . .

Medios de cultivo y biorreactor :Los medios de cultivo de financiación para el desarrollo y la CLD se prepara mezclando 150 g de arroz o salvado de trigo con la pectina comercial de naranja (Braspectina con alto grado de metoxylation) como se muestra en la Tabla 1 para la financiación para el desarrollo y en la Tabla 2 de la CLD. La humedad en el medio de cultivo se ajustó a 50% y 0.018 g de KH 2 PO 4 y 0,09 g de MgSO4 se agregaron por gramo de secado medio. La esterilización de los medios de comunicación se llevó a cabo a 121 º C durante 15 min. El pH se ajustó a 3,5 con HCl (N 2) y, a continuación soluciones de nitrógeno se agregaron para obtener 0,03 moles de nitrógeno por gramo de secado medio. Todas las soluciones se esterilizaron por filtración (0,22 micras de tamaño de poro del filtro). Los medios de cultivo se inocularon con la concentración de 4x10 6 esporas por gramo de medio seca. Cada medio de cultivo inoculado fue transferido asépticamente a un biorreactor de lecho de la columna fija. El biorreactor consistió de un tubo de vidrio con un diámetro interno de 50 mm y una longitud de 300 mm, flujo de agua rodeados por otro tubo de vidrio (5 mm entre los tubos de vidrio) para mantener la temperatura exterior del biorreactor a 30 º C. La entrada de agua saturada de aire dentro del biorreactor fue controlado por un sistema descrito por Hassan et al. (9), que se muestra en la figura. 1 .

Actividad enzimática y la extracción:El extracto crudo se realizó con 5 g de medio de cultivo fermentado mixto (1:10) con solución tampón acetato (pH 4.4). La mezcla se agita a 100 rpm durante 30 min a 35 º C y filtrado a continuación. El extracto crudo se utilizó para determinar azúcares reductores (NIF) y la actividad enzimática de PG y PMG, de acuerdo con Castilho et al. (5).

Para determinar FRS un dinitrosalicílico ácido 3,5-método se utilizó con la glucosa como estándar (15). El FRS se expresa como la masa de la glucosa por masa seca de la media (mg g -1). masa seca se determinó con base en el principio de secado hasta peso constante a 105 º C, según AOAC (1).

Para la actividad PG 5 ml de ácido poligalacturónico (0,5% elaborados a diario en el pH 5.0 con tampón ácido cítrico-fosfato) fue introducido en un tubo de ensayo con 1 ml de extracto enzimático crudo (1:50 diluida). La reacción enzimática se produjo durante 60 minutos a 37 º C. El D-galacturónico ácido liberado se cuantificó como la reducción de azúcar con el ácido 3,5-dinitrosalicílico a 540 nm y ácido D-galacturónico como estándar (15). Una unidad de actividad enzimática (U) se define como la cantidad de enzima que libera un mol de ácido galacturónico por minuto a 37 º C (12,14). producción de PG se expresó como unidad de actividad enzimática por masa de medio seco (U g -1).

Para la medición de la actividad enzimática de PMG, 2 ml de extracto crudo enzimático (1:25 diluida) se mezcló con 8 ml de la pectina de naranja de Sigma en el 0,63% en tampón acetato, pH 4,0. La solución se mantuvo en un baño de agua a 30 º C durante 30 min. La reducción de la viscosidad de la mezcla se midió con un viscosímetro rotacional Brookfield. Una unidad enzimática se define como la cantidad de enzima que reduce la viscosidad inicial de la solución al 50% en 30 min (12). producción de PMG se expresó como unidad de actividad enzimática por masa de medio seco (U g -1).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Identificación de las variables que la producción de PG afectados en el diseño factorial fraccional (FFD)

De acuerdo a la condiciones de financiación para el desarrollo experimental ( Tabla 1 ) se calculó los efectos de las variables en la producción de PG presentan en la Tabla 3 . Los efectos de mostrar una pequeña parte de cada variable afectada la producción de PG cómo. La variable "microorganismo" presentaron mayor efecto sobre la producción de PG. A las 60 h de cultivo, el Aspergillus niger aumento de la producción de PG en 368,9 U g -1 ( Cuadro 3 ), lo que representa un 46,1%, en comparación con Aspergillus oryzae. Este resultado es similar a Baracat et al. (4) y Castilho et al. (5), que informó de las actividades de alto pectinasa producidos por cepas de Aspergillus niger. La A. niger se ha utilizado como productor de pectinasas (18,26). Patil y Dayanand (21) utilizaron una técnica de paso de detección multi-basado en el coeficiente de pectolysis y la capacidad de producción de pectinasa para aislar microorganismos con alto potencial para producir pectinasas. Encontraron A. niger como el mejor productor, entre los microorganismos ensayados. Además de que los extractos enzimáticos de A. niger se han utilizado con seguridad en los alimentos (10) y los piensos 17) industria (y otras aplicaciones como modelo para estudiar la interacción entre la proteína y 11) y para promover la protección de las plantas (hidratos de carbono (2). Así, el uso de A. niger fue elegido para la próxima fase experimental, y una variable fue descartada.

La pectina Además de los medios de cultivo inducido por la producción de PG (p <0,05). A las 60 h de cultivo, un aumento en la concentración de pectina inicial 5-10 gg -1 resultó en un aumento de la producción de PG en 140,6 U g -1 ( Cuadro 3 ). La producción de pectinasa inducida por la concentración de pectina en el sustrato, que se encuentra en este estudio, fue similar a la reportada por Kashyap et al. (10) con Bacillus sp y por Fontana et al. (8) con A. niger. Fontana et al. (8) reportó que la pectina puede ser utilizado por A. niger como sustrato de crecimiento, además de su papel como inductor. Estos resultados concuerdan con Maldonado y Strasser de Saad (13) que verifica el crecimiento del micelio y la producción de pectinasas por A. niger con pectina como

única fuente de carbono. Por lo tanto, la pectina fue seleccionado para ampliar la gama de estudio en el documento básico.

La aireación afectados (p <0,05) la producción de PG. A las 60 h de cultivo de un aumento en la aireación de 40 a 60 ml h -1 g -1 producción de PG aumentó en 153,5 U g -1 ( Cuadro 3 ). Aumenta la tasa de ventilación reduce la temperatura del medio de cultivo y por lo tanto reduce la desnaturalización enzimática (16,22). Esto podría explicar por qué la aireación variable afectada de manera significativa la producción de PG. Por lo tanto, la aireación fue seleccionado para ampliar la gama de estudio en el documento básico para determinar el rango óptimo para la producción de pectinasa.

Pectinasa optimización de la producción a través del diseño compuesto central (CCD)

De acuerdo con el CCD de condiciones experimentales ( Tabla 2 ) se calculó los efectos de las variables de PG y PMG producciones se presentan en la Tabla 4 y 5 . El mayor valor obtenido en el documento básico para la producción de PG fue 1.829 U g -1 a 48 h de cultivo. Este resultado fue 228% superior al valor más alto obtenido en la financiación para el desarrollo, que fue de 800 U g -1 en 60 h. Esta optimización de las variables de proceso muestra un valor más alto de actividad de PG en un tiempo de cultivo más corta. El aumento de la tasa de aireación, en cualquier tiempo de cultivo, mostró un comportamiento inverso y PMG actividades PG ( tablas 4 y 5 ).

Aumenta la tasa de ventilación reduce la temperatura del medio de cultivo y por lo tanto reduce la desnaturalización enzimática (16,22). En él se explica el aumento de la producción de PG, pero no la disminución de la producción de PMG en este estudio. Es posible que la actividad de PMG y / o síntesis se ven fuertemente afectados por la concentración de FRS en el medio de cultivo. Los resultados encontrados en este estudio muestran que los valores más altos de actividad PMG ocurrido siempre cuando la concentración de FRS fue menor de 110 mg g -1 . Esto significa que un aumento en la tasa de aireación induce la actividad de PG que aumenta la concentración de FRS y por lo tanto inhibe la actividad de PMG. .

Teniendo en cuenta las condiciones y las metodologías utilizadas en este estudio se concluyó que Aspergillus niger presentó mayor actividad poligalacturonasa de Aspergillus oryzae, el sustrato y la fuente de nitrógeno no afectó la actividad poligalacturonasa, la tasa más alta de aireación afectado a la actividad poligalacturonasa positiva y polymetylgalacturonase, negativamente, la más alta concentración de la pectina inicial afectó positivamente tanto y polymetylgalacturonase actividades poligalacturonasa, el punto óptimo para las variables de proceso para la actividad poligalacturonasa fue 66.13 h ml -1 g -1 para la aireación y el 12,8 gg -1 para la pectina; los valores más altos de actividad PMG se obtuvieron con 40.0 h ml -1 g -1 para la aireación y el 15,0 gg -1 para pectina.