Classificação filogenética de escherichia coli (APEC)
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CLASSIFICAÇÃO FILOGENÉTICA DE ESCHERICHIA COLI PATOGÊNICA
PARA AVES (APEC) E CORRELAÇÃO COM A PRESENÇA DE FATORES DE VIRULÊNCIA
Ana Lívia da Silva FerreiraDepartamento de Microbiologia
Universidade Estadual de Londrina
Orientadora: Renata K. T. Kobayashi
Objetivos
•O objetivo deste trabalho é Classificar as amostras de Escherichia coli isoladas de aves com colibacilose e de frangos comercializados nos grupos filogenéticos A, B1, B2 e D;
•Comparar esses resultados com a presença/ ausência de fatores de virulência das APEC previamente analisados, observando se há uma relação dos grupos com fatores específicos.
INTRODUÇÃO
Escherichia coli
•um bacilo gram-negativo;
•Microbiota intestinal de humanos, outros mamíferos e aves;
•Comensais, patogênicas intestinais e patogênicas extra-intestinais;
•Em humanos causa infecções como meningites, septicemias,, pneumonias, infecções urinárias e intestinais;
•em alimentos, como carnes congeladas, é permitida uma quantidade de 104 UFC/g alimento.
INTRODUÇÃO
Fator de virulência Função
tsh hemaglutinina temperatura sensível
papC, papG fímbria P
felA fímbria F11
fimH fímbria tipo 1
fac
afa/draBC adesina afimbrial
sfaDE
sfaS fímbria S
csgA curli
cvaC colicina V
iutA aerobactina
iss resistência sérica
kps cápsula
cnf1, cnf2 fator necrozante citotóxico
RELACIONADOS A ADESÃO
NÃO RELACIONADOS A ADESÃO
INTRODUÇÃO
MATERIAIS E MÉTODOS
•Foram utilizadas 200 amostras de frangos com colibacilose: estoque da profa. Dra. Marilda c. vidotto;
•103 Amostras isoladas de frangos comercializados: estoque da profa. Dra. Renata kobayashi.
•As amostras utilizadas como controle positivo foram gentilmente cedidas pela profa. Dra. Halha Ostrensky Saridakis.
Essas amostras foram crescidas em lb caldo durante 24h.
O dna de cada uma delas foi extraído para que pudéssemos realizar pcr.
MATERIAIS E MÉTODOS
A pcr realizada foi descrita por clermont et al., 2000.
Ciclo curto:-desnaturação por 4 min a 94ºC, -30 ciclos de 5 s a 94ºC e 10 s a 59ºC -uma extensão final de 5 min a 72ºC. Ao final da reação,
as amostras foram mantidas a 4ºC, até sua corrida em gel de agarose 2%.
Os primers utilizados foram:-chuA-yja-tspe4.c2
Gene Seqüencia de oligonucleotideo pb
ChuA (CGG ACG AAC CAA CGG TCA GGA T)(TGC CGC CAG TAC CAA AGA CAC G)
279
Yja (CGT GAA GTG TCA GGA GAC GCT GC)(TGC GTT CCT CAA CCT GTG ACA AAC C)
211
Tsp (GGG AGT AAT GTC GGG GCA TTC AG)(CAT CGC GCC AAC AAA GTA TTA CGC AG)
152
MATERIAIS E MÉTODOS
KOTLOWSKI et al., 2007; Clermont et al., 2000
Análise estatística:-ANOVA não paramétrico (Kruskal-Wallis), através do programa de estatística Epi Info, versão 3.4.3.
MATERIAIS E MÉTODOS
Clermont et al., 2000
Resultados e discussão
chuA (279pb)yja (211pb)TSPE4.C2 (152pb)
1 2 3 4 5 6 7 C+ C-
B1 A A B2 D B1 B1 B2
Resultados e discussão
Frangos comercializados Aves com colibacilose (APEC)
B2 B2/ D
JOHNSON et al., 2000 apud MOULIN-SCHOULEUR et al., 2007, PICARD et al., 1999
Resultados esperados:
Resultados e discussão
frango comercializado apec
33; 32%
18; 17%17; 17%
35; 34%56; 28%
66; 32%
45; 23%
33; 17%
Resultados e discussão
0,00%
20,00%
40,00%
60,00%
80,00%
100,00%
120,00%
Fator de virulência
Po
rcen
tag
em d
e p
osi
tivo
s
Grupo A
Grupo B1
Grupo B2
Grupo D
APEC:
Resultados e discussão
A (56) B1 (66) B2 (45) D (33) TOTAL DE AMOSTRAS POSITIVAS
P(0,05)
tsh 13 (16,5%)C: 23,2%
31 (39,2%)C: 47,0%
26 (32,9%)C: 57,8%
9 (11,4%)C: 27,3%
79 p<0,05
papC 4 (10,8%)C: 7,1%
6 (16,2%)C: 9,1%
18 (48,6%)C: 40,0%
9 (24,3%)C: 27,3%
37 p<0,05
papG 2 (6,3%)C: 3,6%
5 (15,6%)C: 7,6%
17 (53,1%)C: 37,8%
8 (25%)C: 24,2%
32 p<0,05
felA 1 (4,2%)C: 1,8%
5 (20,8%)C: 7,6%
17 (70,8%)C: 37,8%
1 (4,2%)C: 3,0%
24 p<0,05
fimH 54 (28,0%)C: 96,4%
61 (31,6%)C: 92,4%
45 (23,3%)C: 100,0%
33 (17,1%)C: 100,0%
193 p>0,05
afa/draBC
0 1 (100%)C: 1,5%
0 0 1 p>0,05
csgA 56 (28,0%)C: 100,0%
66 (33,0%)C: 100,0%
45 (22,5%)C: 100,0%
33 (16,5%)C: 100,0%
200 p>0,05
APEC:
Resultados e discussão
A (56)* B1 (66) B2 (45) D (33) TOTAL DE AMOSTRA
S POSITIVAS
P(0,05)
cvaC 11 (15,7%)C: 19,6%
18 (25,7%)C: 27,3%
34 (48,6%)C: 75,6%
7 (10,0%)C: 21,2%
70 p<0,05
iutA 22 (17,5%)C: 39,3%
42 (33,3%)C: 63,6%
39 (31,0%)C: 86,7%
23 (18,3%)C: 69,7%
126 p<0,05
iss 12 (15,6%)C: 21,4%
25 (32,5%)C: 37,9%
22 (28,6%)C: 48,9%
18 (23,4%)C: 54,5%
77 p<0,05
kpsII 6 (14,6%)C: 10,7%
7 (17,1%)C: 10,6%
22 (53,7%)C: 48,9%
6 (14,6%)C: 18,2%
41 p<0,05
APEC:
Fatores Número de amostras
iutA + tsh + iss 40
iutA + tsh + iss + cvaC 28
iutA + tsh + iss + cvaC + kps 17
tsh + papC + papG + felA 14
Resultados e discussão
UPEC
NMEC
APEC
APEC:
Resultados e discussão
DELICATO et al., 2003
APEC:
A; 55%
B1; 35%
B2; 22,50%
D; 42,50%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
Grupos FilogenéticosPo
rcen
tag
em d
os
fran
go
s q
ue
apre
sen
tara
m
os
gru
po
s fil
og
enét
ico
s
A
B1
B2
D
Resultados e discussão
Frangos comercializados::
22
14
9
17
CONCLUSÃO
este trabalho visou à correlação entre virulência e classificação filogenética de amostras patogênicas, necessitando de estudos mais profundos para se chegar às amostras com potencial patogênico.
Quando estas relações forem elucidadas, o tratamento e a prevenção de infecções serão mais específicos, tanto em animais quanto em humanos, podendo levar à economia de tempo e de verbas destinadas à saúde pública ou ao controle de qualidade dos produtos do agronegócio.
CONCLUSÃO