Clase 1. Histología y Microscopía

7/30/2019 Clase 1. Histologa y Microscopa

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Universidad de Carabobo

Facultad de Ciencias de la SaludEscuela de Ciencias Biomdicas y Tecnolgicas

Departamento de Ciencias Morfolgicas y ForensesAsignatura: Histologa y Embriologa

Prof. Sofa Douaihi


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Unidad I . Introduccin al Estudio de laHistologa y Morfologa Celular

Objetivo General: Especificar las herramientas que utiliza lahistologa para el estudio ultraestructural de tejidos y de laclula como unidad morfolgica y funcional del organismo.

Contenido:

Histologa. Concepto y aplicaciones cientficas y clnicas.

Tcnica Histolgica. Etapas en la preparacin de tejidos parasu estudio al microscopio ptico y electrnico.

Histoqumica y Citoqumica. Aplicacin, tipos, fundamentosqumicos de la coloracin.

Microscopa. Tipos de microscopios y aplicacin. Microscopioptico: partes y funcionamiento. Microscopio electrnico: detransmisin y de barrido.


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Qu es la Histologa?

Etimolgicamente: histo: tejido logos: estudio

Es la rama de la biologa encargada del anlisismicroscpico de la anatoma celular y tisular delos tejidos biolgicos.

Marcello Malpighi es reconocido como elfundador de la Histologa

Las primeras investigaciones histolgicas sehicieron en el siglo XVII gracias a la invencindel microscopio ptico por Antonio Van

Leeuwenhoek

Cuello uterino: Exocervix: Epitelio planoestratificado


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Qu es la Anatoma?

Es el estudio de la forma y laestructura de los organismos vivos

organizados

Anatoma Macroscpica: estudio de

las estructuras observables a simplevista.

Anatoma Microscpica: es aquella

que requiere de auxiliares pticos.


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Qu es la Citologa o Biologa

Celular?

Es una disciplina acadmica que seencarga del estudio de las

propiedades, estructura, funciones yorganelos que contienen las clulas,

as como su interaccin con elambiente y su ciclo vital.


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BIOQUMICA

FISIOLOGA

ANATOMA

GENTICA

CLNICA

PATOLOGA


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Obtencin de la muestra de material humano:

El material humano puede provenir de tres fuentes:

Las necropsias o autopsia

Las biopsias

Las piezas operadas.


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Necropsias: Se obtienen piezas de un cadver.Para histologa normal es necesario que se trate de uncadver fresco y que no haya sido atacado por ninguna

lesin, al menos el rgano que se quiere estudiar.

Biopsias: Son trozos de tejido que se obtienende un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos almicroscopio y efectuar un diagnstico histopatolgico.

Piezas operadas: Los tejidos que han sido extrados delas intervenciones quirrgicas, generalmente tumores urganos inflamados, tambin pueden darnos material

de investigacin.


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TECNICA HISTOLOGICAFundamentos generales de la

preparacin de los tejidos para suestudio al microscopio

(ptico y electrnico)


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1.- Obtencin de la muestra: medianteextirpacin de pequeos fragmentos de tejido

(humano o animal)


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2.- Fijacin: Su propsito esmantener la morfologa del

tejido lo ms parecidaposible a lo que sta tena

antes de hacer la extraccin.(formaldehdo al 37%)

Mtodos:

Qumico inmersin Fsico: congelacin

La formalina no preserva

todos los componentes dela clula y los tejidos


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3.- Deshidratacin:proceso porel cual se elimina

completamente el agua de lamuestra para que se pueda

embeber(impregnar, empapar)adecuadamente el tejido en

aquellos medios de inclusin

que no sean hidrosolubles.(Alcohol etilco enconcentraciones crecientes)


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4.- Aclaramiento:proceso por

el cual se consigue lasustitucin del agentedeshidratante por una sustancia

miscible (mezclable) con el

medio de inclusin. (Xilol)


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5.- Infiltracin(Impregnacin o Inclusin)Proceso que tiene por objeto

rellenar o infiltrar

completamente la muestrahistolgica con el medio que se

va a usar para la imbibicin

(absorcin) del tejido. (Baode parafina fundida)


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6.- Encastramiento del tejidoy confeccin de los bloques:

consiste en la obtencin de unbloque slido de tejido msmedio de inclusin, mediante

el enfriamiento lento a 10-

15C: El bloque slido se llamaTACO


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7.- Orientacinde la pieza:pararealizar el corte del tejido se

monta el taco en el microtomo

(aparato equipado con una hojade acero) y se obtienen cortes

sumamente delgados cuyo grosorpara microscopa ptica vara

entre 510 micrmetros1milmetro = 1000 micrmetros


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8.- Montaje: los cortes se

colocan sobre lminasportaobjetos cubiertospreviamente con capa de

albmina o gelatina

9.- Aclaramiento: Extraccin

de la parafina con xilol(Desparafinacin)


20/80TOMADO DE: Histologa y Embriologa del ser humano. Eynard-Valentich-Rovasio.


21/80TOMADO DE: Histologa y Embriologa del ser humano. Eynard-Valentich-Rovasio.


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7. Orientacin (Microtomo)


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10.- Rehidratacin: desplazar el xilol por agua. Alcohol conagua en concentraciones decrecientes.

11.- Tincin o Coloracin: con colorantes histolgicos ensu mayora en solucin acuosa.


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FOTOGRAFA: LABORATORIO-HISTOTECNOLOGA. DPTO CS. MORFOLGICAS Y FORENSES.

Muestrafijada enformol al

10%

Gasa eidentificacinde la muestra.


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Corte del tejido (hoja de bistur)

Tejido fijado


Bistur


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Batera de Deshidratacin



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Batera de Aclaramiento


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EstufaInclusin en parafina fundida



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Estufa con el tejido a ser incluido



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Cajas de papel para preparar el bloque



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Preparacin del Bloque



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Tejido incluido en parafina



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Bloque terminado



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Microtomo



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Corte del tejido en el Microtomo

Bloque de

Tejido

Cuchilla delMicrotomo



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Tejido Cortado

Bloque deTejido

Tejido

Cortado



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Tejido Cortado en el Bao de flotacin

TejidoCortado


(3-8 m de grosor).


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Montaje del tejido en el portaobjeto para su desparafinacin

LminaPortaobjeto

Tejido



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Investigar: Diferencias entre microtomo y ultramicrotomo


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Preparacin de Tejidos para Microscopa Electrnica

1. Fijacin:Glutaraldehdo o Tetrxido de osmio.

2. Deshidratacin: Etanol y/o acetona en concentraciones crecientes.

3. Aclaramiento:xido de propileno (1-2 epoxipropano).

4. Inclusin:plstico (resinas). Epoxirresinas (araldite, resina epon y

resina de Spurr)5. Cortes de los bloques: con un ultramicrotomo con cuchilla de vidrio o

diamante (20-100 nm). El corte se controla con un microscopio y seaumenta el contraste mediante el pasaje rpido por una solucin deacetato de uranilo.

No es necesario eliminar el plstico de inclusin.6. Montaje: Los cortes ultrafinos se montan sobre un reticulado de cobre

(grilla) cubierto por una pelcula plstica de sostn delgada.

Correlacin Clnica: Biopsias por congelacin


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Correlacin Clnica: Biopsias por congelacin

Evaluar de inmediato el tejido obtenido.durante el acto quirrgico y el diagnsticoinstantneo determina el paso siguiente enla ciruga. Para identificar hallazgos intraoperatorios inesperados. Para saber si se ha extirpado toda la masa patolgica y si el borde

de la reseccin quirrgica est libre de tejido enfermo. Se congelan fragmentos de tejido usando anhdrido carbnicocomprimido o un lquido fro (isopentano) a una temp de -50C. Corte del tejido congelado en un criostato (cmara refrigerada que

contiene un microtomo) Montaje del corte en un portaobjetos. Tincin del corte: HE, azul de metileno y PAS. El proceso puede tardar 10 minutos y el resultado se comunica al

cirujano inmediatamente


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Conjunto de tcnicas quepermiten la identificacin,localizacin y cuantificacinde una sustancia o molculas

en un tejido.

Se pueden detectar glcidos,protenas y nucletidos.

La tcnica histoqumica msempleada es la reaccin de

PAS (Periodic Acid Schiff).

HISTOQUMICA


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Este mtodo provee datos acerca de la funcin de las clulas

y de los componentes extracelulares de los tejidos.

HISTOQUMICA

Tincin con hematoxilina-eosina (imagen de la izquierda) y PAS-hematoxilina (imagen de laderecha) de las vellosidades del intestino de humano cortadas transversalmente. Se puede apreciar a

las clulas caliciformes teidas de rosado con la tnica de PAS por su alto contenido enmucopolisacridos, mientras que en una ticin general aparecen transparentes, sin teir.


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Se ocupan de investigar la actividad qumicaque tiene lugar en las clulas y los tejidos.

Se fundamentan en:

La unin especfica de un colorante. El uso de anticuerpos marcados con un colorante

fluorescente (INMUNOHISTOQUMICA) La actividad enzimtica inherente de un elemento

constitutivo de las clulas.

HISTOQUMICA Y CITOQUMICA


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Composicin qumica de las muestras histolgicas

La composicin qumica de un tejido listo para una coloracin derutina es diferente de la del tejido vivo.

Los componentes que perduran son molculas grandes que no se

disuelven con facilidad con el fijador. Entre ellas: nucleoprotenas,protenas intracelulares del citoesqueleto, protenas extracelulares,

complejos de fosfolpidos y protenas o carbohidratos en las

membranas.


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Composicin qumica de las muestras histolgicas

Muchos componentes de los tejidos desaparecen durante la

preparacin de los cortes teidos con H-E.

Los solventes disuelven los lpidos neutros.

Las macromolculas que se pierden durante la fijacin

de rutina son: Glucgeno, Proteoglucanos y glucosaminoglucanos.

Los componentes solubles, los iones y las molculas

pequeas tambin desaparecen durante la preparacinde las muestras includas en parafina: glucosa, sodio,

cloro y sustancias similares.

Estos iones y pequeas molculas solubles no constituyen

elementos morfognicos hsticos sino que participan en los procesosde sntesis o en las reacciones celulares.


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Colorantes Utilizados en Microscopa ptica

Fundamento: Radica en la propiedad quetienen todos los tejidos para incorporar yfijar de modo variable diversas sustancias

coloreadas. Segn su afinidad tisular:

Piel


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Colorantes Bsicos:poseen una carga globalpositiva (catinicos), reaccionan con loscomponentes aninicos de las clulas.Ejemplo: Hematoxilina.

Colorantes cidos:poseen una carga globalnegativa (aninicos), reaccionan con loscomponentes catinicos de las clulas.

Ejemplo: Eosina.


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Colorantes Neutros: sucarga global es neutra.

Propiedad de colorear juntao separadamente diversasestructuras.Ejemplo: Giemsa.

Colorantes Metacromticos:Colorantes bsicos. Producen

tonos de color totalmentedistintos al que se espera porel colorante empleado.Ejemplo: Azul de Toluidina.


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Colorantes Indiferentes: no

poseen carcter cido, bsico osalino definido. Coloreanmediante impregnacin.Ejemplo: Plata

Fibras Reticulares


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Coloracin Hematoxilina-Eosina(H.E).

Utiliza dos tipos de colorantes.

La hematoxilina que es un colorantebsico, colorea los componentes cidosde la clula (ncleo) de color morado; yla eosina que es un colorante cido seune a estructuras bsicas de la clula(citoplasma) otorgndole una tonalidadrosada

Testculo

COLORACIONES MS UTILIZADAS


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Coloraciones Tricrmicas:


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Se obtiene tres coloresdiferentes:

Azul oscuro en losncleos de la clula.

Rojo en el msculo, la

queratina y citoplasmacelular.

Azul Claro en el tejido

conjuntivo

Coloraciones Tricrmicas:

1.- AZAN

2.- MALLORY


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Coloracin con metales (ejemplo: Plata)Actan impregnando a ciertos componentes celulares.

Ejemplo: se usan para demostrar aparato de Golgi y las neurofibrillas.


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Coloracin con Hematoxilina Frrica:Coloracin diferencial til para estudiardetalles celulares finos. Ejemplo: lasmitocondrias presentes en el citoplasma de

las clulas renales.

Tricrmico de Cajal y Gallego:Implica el uso de tres colorantes.Para demostracin diferencial y selectivade las fibras colgenas y del msculo.


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La Orcena y la FucsinaResorcina: son colorantes parafibras elsticas. Se observan entre

bordeau y castao oscuro.

Carmn de Best: para tincinnuclear y deteccin deGlucgeno.

El t l l t BASOFILIA


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Elementos celulares que presentan BASOFILIA, querepresentan los estructuras cidas y se ven de colormorado al microscopio ptico

- Heterocromatina y nuclolos del ncleo- Algunos componentes citoplasmticos- Material extracelular

Elementos celulares que presentan ACIDOFILIA, querepresentan las estructuras bsicas y se ven de colorrosado al microscopio ptico-La mayora de los filamentos citoplasmticos-La mayora de los componentes membranosos

intracelulares-La mayora de las fibras extracelulares


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Receso!!!


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MICROSCOPA

Qu es un Microscopio?

Es un Instrumento que aumenta el tamao de una imgen y

permite ver mayores detalles. El Microscopio ms sencillo: lupa, lentes de correccin.

El conocimiento detallado moderno de la arquitectura celular se basasobre varios tipos de observacin por diferentes tipos de microscopios

M. ptico

compuesto

Campo claro

Campo oscuroContraste de faseFluorescenciaLuz U.V.

M. ElectrnicoTransmisin (MET)

Barrido (MEB)


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d= 0.61/An

MICROSCOPA


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MICROSCOPA

AUMENTO

Es la relacin entre el tamaode la imagen y el del objeto enmedidas lineales.

El Aumento de un microscopioes:

Am= Alente objetivo x ALente ocular

Ej: Ocular: 10X

Objetivo: 40X

Cuanto es el aumento delmicroscopio?

PODER DE RESOLUCIN

Es la capacidad de distinguir por separado,dos objetos muy cercanos entre si,numricamente equivale a 1/d, siendo d ladistancia mnima entre dos objetosdistinguibles.

Ojo humano: d = 0.2 mm

Depende de:

ndice de Refraccin (n): Aire =1

Apertura numrica (An) del sistema ptico.An= n x sen uLongitud de onda de la luz incidente ()

d= 0.61/An

Poder de Resolucin mximo de un

microscopio ptico = 0.2um


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PODER DE RESOLUCIN

Ojo humano: 0.2 mm

Microscopios pticos: 0.2 mmMicroscopios electrnicos: 0.2 nm

1 cm : 10 mm (milmetro)

1 mm : 1.000 mm (micra)1 mm: 1.000 nm (nanmetro)1 nm: 10 A (Armstrong)

Microscopio ptico de Campo Claro


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Microscopio ptico de Campo Claro

Usa Luz Visible. D = 0.2 mm (micromtro)

La luz atraviesa el objeto examinado y elobjetivo capta la luz directa provenientede la fuente luminosa.

Utilidad: Acadmico, Diagnstico clnico(Lab. Bioanlisis, Patolgico), Investigacin.

Componentes Principales:- Fuente Luminosa

- Lente Condensadora:para enfocar el haz de luz a la altura de lamuestra- Platina: sobre la que se coloca la muestra.- Lente Objetivo:para recoger la luz que ha atravesado la muestra- Lente Ocular: a travs de la cual se puede examinar directamente la

imgen formada por la lente objetivo.

MICROSCOPA


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MICROSCOPAPARTES DE UN MICROSCOPIO PTICO

Mecnicas

Cabezal

BrazoRevolver

Platina

Carro

Tornillosmacromtrico ymicromtrico

Base

pticas

LmparaCondensador

/Diafragma

Objetivos

Oculares


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Los rganos son

tridimensionales,mientras que los corteshistolgicos tienen slo

dos dimensiones

Al examinar un corte hayque reconstruirmentalmente la

organizacin de laestructura y sus partes

constitutivas


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Examen de un PreparadoHistolgico con el

Microscopio ptico

Los artefactos o artificiosson elementos que

representan un error en elproceso de preparacin

(partculas de polvo,

fragmentos de vidrio,agregados de colorante,filamentos de gasa etc.)

OTROS SISTEMAS PTICOS


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Microscopio de Contraste de Fases

Aprovecha las pequeas diferencias en el ndicede refraccin que hay en diferentes partes de una

muestra de clulas o tejidos.

Las partes oscuras corresponden a las regionesdensas y las partes claras corresponde a las

regiones menos densas.

Utilidad: Permite observar las clulasen accin y estudiar los movimientosimplicados en procesos como la mitosiso la migracin celular. Estudiar cortessemifinos no teidos.

Se emplean objetivos de fase ycondensadores especiales.

Microscopio de Campo Oscuro
http://www.gefor.4t.com/concurso/parasitologia/naegleria1.jpg


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Microscopio de Campo Oscuro

-La lente objetivo no capta la luz directa provenientede la fuente luminosa.

-El principio se consigue gracias a un condensadorespecial que ilumina el preparado con mucha

intensidad pero en forma oblicua.- Con esto se logra que el fondo de la muestraaparezca negro y los especmenes brillantes.

-Utilidad: En la prctica clnica para

la deteccin de cristales en la orinay la identificacin de espiroquetas. Observarmicroorganismos que muestran alguna caractersticamorfolgica en estado vivo y en suspensin, porejemplo: flagelos.

Glbulos rojos

Espiroquetas

Microscopio de Fluorescencia


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Microscopio de Fluorescencia

-Aprovecha la capacidad de algunas molculas de

fluorescer bajo la luz UV, emiten luz de unalongitud de onda diferente a la luz que la hizofluorescer.

-Utilidad: Deteccin de molculas con

autofluorescencia como la vitamina A y algunosneurotransmisores (fluorescencia natural).

En tcnicas de inmunocitoqumica utilizansustancias qumicas que absorben la energa de la

luz ultravioleta y emiten radiaciones que pueden servistas, colorantes fluorescentes. (fluorescenciasecundaria).

En la investigacin del trayecto de fibras nerviosas.

Se detectan molculas mspequeas que el poder deresolucin del microscopio


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Microscopio Confocal

- Permite la visualizacin de una muestra

biolgica en tres dimensiones.

- Combina componentes de unmicroscopio ptico de campo claro conun sistema de barrido para disecar

pticamente una muestra.

Fotografa microscpica que ilustra la cabeza deun pez cebra de 5 das de edad, aumentada 20veces tal y como se observa en un microscopio

confocal

Microscopio de Luz Ultravioleta (UV)


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Microscopio de Luz Ultravioleta (UV)

-Utiliza lentes de cuarzo con una fuente de luz ultravioleta.-Tiene mayor poder de resolucin.- La imagen depende de la absorcin de la luz UV por lasmolculas de la muestra.-La muestra no puede inspeccionarse directamente a travsdel ocular porque la luz UV no es visible y lesiona el ojo.-Las imgenes se registran en una pelcula fotogrfica.

Utilidad: Detectar cidos nuclicos, en

especial las purinas y pirimidinas.Detectar protenas que tienen ciertos aminocidosen la prctica clnica para evaluar el gradode ploidia en cortes de tumores.

MICROSCOPA ELECTRNICA


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Representa un gran adelanto respecto a la

microscopa ptica ya que el poder deresolucin muy elevado :

La longitud de onda del haz de electrones es2.000 veces menor que la del haz de luz, por loque aumenta la resolucin por un factor de 10.

Los electrones no pueden atravesar el vidrio, porlo que deben remplazarse por bobinas o lenteselectromagnticas

Existen dos tipos: MET y el MEB Microscopio Electrnico de Transmisin


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-Utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz.

-La fuente es un filamento de tungstenocalentado que emite electrones (ctodo), son atrados haciael nodo producindose una aceleracin de estos y por lotanto un haz.

-El haz de electrones atraviesa una serie de lenteselectromagnticas que cumplen la misma funcin quelas lentes cristal de un microscopio ptico.

-La imagen final se observa en una pantalla

Fosforescente

-La parte de la muestra atravesada por los electronesaparecen claras y las que han absorbido y dispersado alos electrones aparecen oscuras.

Microscopio Electrnico
http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/1ESO/clasica/imagenes/met.jpg


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Microscopio Electrnicode Barrido

-El haz de electrones no atraviesa la muestra sino que explora(barre) su superficie.

- Forma una imagen de tipo tridimensional en un tubo de rayoscatdicos de alta resolucin.


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Microscopio de Fuerza Atmica

Con las tcnicas de AFM es posible trabajar a escala nanomtrica,0'000000001 m, eso nos permite ver estructuras 1.000 veces ms pequeas que una

bacteria, y 10.000 veces ms pequeas que las clulas del epitelio bucal. Esto suponepoder ver las molculas, incluso los tomos, y ms sorprendente an "pescar"molculas en una muestra y extraerlas de su entorno.

Las tcnicas de AFM permiten trabajar en medio lquido o fisiolgico y porlo tanto observar la interaccin de la muestra con otras molculas. Ahora podemosver en detalle cmo interaccionan un antgeno y un anticuerpo; en un futuro se podrver paso a paso cmo interacciona un medicamento con una clula enferma.


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Gracias!

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