CITOGENTICA CONVENCIONALRUSMER PUMAPILLO LAGUNA.

Estudio de cromosomas, estructura y herencia.Los transtornos cromosmicos constituyen una entidad dentro de las enfermedades genticas.

CITOGENTICA CONVENCIONAL

Estudio Citogentico/ Cromosmico

Clulas estn divisin celular (Mitosis)Anlisis cromosmico (morfologa y patrn de bandas) en Metafase.Algunas clulas normalmente en proceso de proliferacin y diferenciacin por lo que no necesitan de un estimulante mitognico para que entren divisin.Otras clulas ya diferenciadas requieren de un estimulante mitgeno para que entren en mitosis.Cultivos Indirectos y Cultivos DirectosCultivos a corto plazo y cultivos a largo plazo

Cultivo Celular Directo

La clula no requiere de un estimulante mitognico para entrar en divisin celular.Cultivo de Clulas FetalesCultivo a largo plazo (10-14 d)Muestra: Liquido Amnitico obtenido por Amniocentesis alrededor de la 16 semana de gestacin.Dx prenatal de una alteracin cromosmica.Cultivo de Vellosidades Coriales Cultivo corto plazo (24 48 horas) y Cultivo largo plazo (10-14 d) Muestra: Biopsia aspiracin de Vellosidades Corinicas alrededor de la 10 sem. de gestacin.Dx prenatal de una alteracin cromosmica.Cultivo de Restos EndouterinosCultivo largo plazo (10-14 das)Muestra: Legrado uterino y/o producto abortadoDetectar una anomala cromosmica del producto.

Procedimiento (Cultivo Directo de Lquidos Orgnicos )

Centrifugar a 1000 RPM por 10min. Eliminar sobrenadante y colectar los sedimentosAdicionar 6 ml. De Solucin Hipotnica ( ClK 0.075 M ) agitar con Pipeta PasteurIncubar a 37C por 30 min.Centrifugar a 1000 RPM por 10 min. Eliminar el sobrenandante.

Procedimiento (Cultivo Directo de Lquidos Orgnicos )

Aadir 5 ml de Fijador. Agitar con Pipeta Pasteur y dejar a TA por 30 min.Centrifugar a 1000 RPM por 10 min, eliminar sobrenandante y aadir 5 ml de Fijador. Repetir este paso 2 o 3 veces. Colocar 3 a 4 gotas sobre una lmina portaobjeto y fijarlo al calor.Coloracin convencional (Giemsa).Bandeo Cromosmico (Banda GTG).Observacin Microscpica.

Cultivo Celular Indirecto

La clula requiere de un estimulante mitognico para que entre en divisin celular.Cultivo de Linfocitos Cultivo a corto plazo (72 horas) Muestra: Sangre Perifrica Se realiza para detectar cualquier alteracin cromosmica constitucional (que el defecto cromosmico este presente en todas las clulas de nuestro organismo).Se utiliza para detectar las autosomopatas (Sndromes Down, Patau, Edwards, etc.) y las Gonosomopatas (Sndromes de Turner, Triple X, Klinefelter, etc.)

Cultivo Celular: MEDIOS DE CULTIVO CELULAR

Contienen todos los aminocidos, vitaminas, cofactores, coenzimas, enzimas, sales, iones, indicadores de pH. Todo lo necesario para que la clula pueda dividirse in vitro.Existen distintos medios de cultivo los cuales se seleccionan dependiendo del tipo de muestra o tipo de clula a cultivar y lograr que estos respondan adecuadamente con un crecimiento celular.

Cultivo CelularMedios de Cultivo ms Utilizados1. Medio McCoys 5A Modified Cultivo Sangre Perifrica (Linfocitos) 2. Medio RPMI 1640: Cultivo Sangre Perifrica (Linfocitos)

3. Medio Tc199: Cultivo Sangre Perifrica (Linfocitos) 4. Medio Ham F10 Ham F12 Cultivo de clulas fetales

Cultivo CelularSUPLEMENTOS Las clulas requieren para su crecimiento y divisin celular de suplementos, los cuales sern utilizados dependiendo del tipo de clulas que se desea cultivar y del tipo de estudio citogentico requerido.

1.- SUERO BOVINO FETAL (SBF) : Se utiliza a diferentes concentraciones: 20% para el cultivo de SP 30% para el cultivo de clulas fetales

Cultivo Celular2.- PENICILINA + ESTREPTOMICINA: Utilizado como antibiticos para evitar la contaminacin bacteriana.

3.- ANTIMICOTICOS: Fungizona para evitar el crecimiento de hongos, si es que fuera necesario.

4.- L- GLUTAMINA: Aa que en su forma levgira mejora el crecimiento celular.

5.- ESTIMULANTE MITOGENICO: Utilizado para estimular el proceso de mitosis en el cultivo de linfocitos. Fitohemaglutinina (PHA)

Cultivo CelularMedios de Cultivo y SuplementosFormas de presentacin :Medio Lquido y en polvo

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)Toma de Muestra. Condiciones de asepsia. Anticoagulante heparina. Volumen de muestra

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)Seleccin de los medios de cultivo y suplementos

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)Sedimentar la mx 2h aprox.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)Eliminar elP.G (dejar un pequeo remanente) dejando la interfase (Globulos blancos) y el plasma.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS) Se utilizar para la siembra( 20 gotas).

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS). Incubar a 37c por 72 horas

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS). El ndice mximo de mitosis se obtiene a las 70-72horas. Por lo tanto habrn ms clulas en metafase

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS). Diariamente se debe mezclar el frasco de cultivo.. Controlar cambios de color que indica cambios del ph o turbidez que indica contaminacin.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS). COSECHA1. Colchicinizacin. Agregar Colchicina 100 uL. Mezclar suavemente

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS). Incubar a 37C por 15 minutos

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)Eliminar el sobrenadante. Trabajar siempre con el sedimento

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)2. Hipotonizacin. Adicionar solucin hipotnica: Cloruro de Potasio 0.075 M 7mL y homogenizar.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS). Incubar a 37C por 12 minutos.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)3. FIJACIN: . Adicionar Fijador (Metanol +Acido Actico Glacial ) V/V. Sacar el tubo de la estufa y adicionar 5 mL de fijador Carnoy para detener la accin de la solucin hipotnica.Observar color marrn oscuro.. Homogenizar. Centrifugar 2500 RPM por 12 minutos.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS). Eliminar el sobrenadante y repetir el paso anterior 3 veces hasta que ya no haya turbidez.El ltimo sedimento resuspender con 1mL de fijador.

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)4. Preparado Cromosmico. Adicionar 3 a 4 gotas sobre una lmina portaobjetos helada.. Secar al calor de un mechero.. Guardar en una gradilla

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)Coloracin Convencional: Bandeo GTG - Tripsina 1% (buffer) - Solucin Salina Fisiolgica - Giemsa 4%

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)Cromosomas con Bandas G

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)

CULTIVO DE SANGRE PERIFERICA (LINFOCITOS)

Elaboracin del Cariograma

GRACIAS