Prácticas de Biotecnología de Microorganismos. Levaduras. 1

CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS. UAM BIOTECNOLOGÍA DE MICROORGANISMOS. LEVADURAS. Programa de Clase Práctica. Curso 2010/2011.

IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS CON CAPACIDAD AMILOLÍTICA. ESTABILIDAD MITÓTICA. Uno de los retos más destacados con que se enfrenta la Biotecnología es la

formación de microorganismos genéticamente manipulados que puedan ser utilizados en la

elaboración de productos alimenticios mejorados, adaptados a las crecientes necesidades

de la sociedad de consumo.

El almidón es la fuente de carbono idónea en las fermentaciones industriales. En la

mayoría de los casos y dadas las propiedades físico-químicas de esta molécula, para que

pueda ser utilizada se requiere su hidrólisis previa o simultánea. Con este fin se emplean

amilasas fúngicas (Aspergillus) y bacterianas (Bacillus) que hidrolizan tanto los enlaces

α(1-4) como los α(1-6) del polisacárido. Estas enzimas no son inactivadas totalmente con

la pasteurización, encarecen notablemente el coste del producto final y producen en

muchas de las personas que las manipulan alergias de distinto tipo. La molécula de

almidón está compuesta por una mezcla de α-amilosa y amilopectina. La α-amilosa es un

polímero lineal de unidades de α-D-glucosa unidas covalentemente por enlaces

glucosídicos α(1-4); en agua forma micelas que dan color azul con iodo. La amilopeptina

está formada por cadenas de amilosa unidas mediante enlaces α (1-6), a modo de

ramificaciones cada 30 residuos de glucosa aproximadamente; en agua forma micelas que

dan una coloración rojo-violácea con iodo.

La especie Saccharomyces cerevisiae es la levadura más utilizada en la industria

alimentaria, participa activamente en la elaboración del pan, bebidas alcohólicas y creación

de nuevos productos. Este organismo no puede utilizar almidón como fuente de carbono

porque carece de amilasas. Por ello, uno de los objetivos de la Biotecnología de

Microorganismos es la construcción de levaduras industriales con capacidad amilolítica.

En cervecería estos organismos darían lugar cervezas tipo "light" de escaso contenido en

amilodextrinas, compatibles con dietas de bajo contenido calórico. En panadería, la

biosíntesis de amilasas por levaduras permitiría su crecimiento en almidón, una fuente de

carbono relativamente barata. Además, al hidrolizar el polisacárido presente en la harina se

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obtendría una mayor producción de CO2, limitando con ello el tiempo de tratamiento de la

pasta y permitiendo modificar el proceso de hinchamiento durante el horneado.

La levadura Schwanniomyces occidentalis (no utilizada a nivel industrial) destaca

porque hidroliza la molécula de almidón de forma muy eficiente gracias a la producción y

exportación de actividades α-amilasa, glucoamilasa y desramificante.

Para la realización de esta práctica se ha alterado el fenotipo de distintas cepas de la

levadura S. cerevisiae de no fermentador (no utiliza) a fermentador (utiliza) de almidón por

la inclusión de genes de Sw. occidentalis.

Se han utilizado los genes de Sw. occidentalis SWA1 y SWA2 que codifican para

enzimas con actividad α-amilasa (α 1-4 glucan 4 glucanohidrolasa). Los genes se

obtuvieron inicialmente a partir de una genoteca del organismo realizada en el plásmido

bifuncional YEp13. Este elemento de DNA extracromosómico contiene el origen de

replicación del plásmido natural de levaduras de 2µm (multicopia) y el gen LEU2 como

marcador de selección.

El fenotipo amilolítico se visualiza fácilmente utilizando medios sólidos con

almidón. Un halo de hidrólisis del polisacárido rodea a la colonia que ha adquirido esta

característica. El halo se hace más nítido si tras el crecimiento celular se precipita el

almidón a 4ºC.

En la realización de esta práctica se utilizaran las cepas de levadura:

-IM1-8b: cepa de S. cerevisiae haploide mutante de laboratorio; fenotipo no

fermentador de almidón; genotipo: MATa, his4 leu2-3, 2-112 staº STA10.

-Panadera DADI: cepa de S. cerevisiae silvestre, poliploide-aneuploide; fenotipo

no fermentador de almidón.

-Sw. occidentalis: silvestre; fenotipo fermentador de almidón

y las cepas creadas por inclusión de DNA exógeno:

-IM1-8b que incluye el plásmido YEp13.

-IM1-8b que incluye el plásmido YEp13 en el que se ha insertado el gen SWA1. -IM1-8b que incluye el plásmido YEp13 en el que se ha insertado el gen SWA2. -Panadera DADI que incluye el gen SWA2 integrado en su genoma.

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Al final de este programa, en el Anexo I, se ha incluido un esquema de los plásmidos

YEp13 y pFH2.111 (YEp13+SWA2).

El OBJETIVO de esta práctica es:

1º) Identificar el genotipo/fenotipo de las distintas cepas de levadura que se suministran a

cada alumno.

2º) Analizar la estabilidad mitótica de las construcciones utilizadas: integrativa e incluidas

en plásmido multicopia.

METODOLOGÍA

ATENCIÓN: TODAS LAS SOLUCIONES Y EL MATERIAL QUE SE UTILICE

(TUBOS, PLACAS,..) DEBEN ESTAR ESTÉRILES. TRABAJAD CERCA DE LA

LLAMA DEL MECHERO PARA MANTENER, EN LO POSIBLE, LAS

CONDICIONES DE ESTERILIDAD.

Los organismos se han crecido previamente en medio mínimo (MM: YNB 0.7%, agar

2.5%, requerimientos necesarios en cada caso a 30 µg/ml) con almidón-maltosa (MMAM:

maltosa 0.5%, almidón 2%), maltosa (MMM: maltosa 2%) o en medio rico YEPD

(extracto de levadura 1%, bactopeptona 2%, glucosa 2%, agar 2%) a 30ºC.

DÍA 1 (Martes 26-10-2010).

Para la caracterización del genotipo/fenotipo, el alumno recibirá:

-Placas con las distintas cepas de levadura (silvestres y modificadas genéticamente)

numeradas del 1 al 7.

-Placa A, de medio mínimo almidón-maltosa (MMAM).

-Placa B, de medio mínimo almidón-maltosa más Leu e His (MMAM+L+H).

-Placa C, de medio mínimo almidón-maltosa más His (MMAM+H).

-Placa D, de medio rico para levaduras (YEPD).

Realizar una suspensión celular con cada una de las cepas de levadura recibidas (mantener

la numeración original). Para ello:

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1º- Resuspender una pequeña cantidad de las células de partida (utilizando

un asa de siembra o palillo estéril) en 50 µl de agua estéril. Agitar hasta que la

solución tenga un aspecto turbio homogéneo.

2º- Visualizar la suspensión (2-3µl) al microcopio óptico.

3º- Inocular las placas (A-D) con 3-5µl de las distintas suspensiones

celulares. Extender la suspensión con un palillo estéril. Utilizad la plantilla que se

adjunta en el Anexo II.

4º- Incubar a 30 ºC hasta obtener crecimiento (por lo general uno o dos días)

y luego mantener a 4ºC.

Para el estudio de la estabilidad mitótica, el alumno recibirá:

-Las cepas de levadura modificadas genéticamente.

-Medio sin presión selectiva (YEPD) líquido y sólido.

-Medio con presión selectiva (MMAM ó MMM+his) sólido.

Cada alumno realizará el ensayo utilizando DOS de los microorganismos obtenidos

por manipulación genética, uno de ellos es la cepa silvestre de levadura con la

amilasa SWA2 integrada en su genoma (DADI-SWA2). Las cepas de levadura se

crecerán en ausencia de presión selectiva (medio rico YEPD), se calculará el

tiempo de generación de cada organismo y se valorará el porcentaje de células que

porta la construcción para cada caso. Se seguirá el esquema que se muestra en el

Anexo III y para ello:

1º- Resuspender una pequeña cantidad de las cepas de levadura elegida en

100 ó 200 µl de agua estéril. Agitar hasta obtener una suspensión turbia

homogénea.

2º- Tomar dos matraces de 50 ml estériles. Añadirle 20 ml de medio YEPD

a cada uno

3º- Inocular cada uno de los matraces con 10 µl (ó 50 µl, dependiendo de la

turbidez) de la suspensión del organismo elegido (DADI-SWA2 e IM18b-

construcción multicopia). Anotad la hora a la que se realizo el inóculo.

4º- Agitar bien la suspensión. Medir la absorbancia de las preparaciones a

660 nm. Esta medida será la DO(1). Utilizar cubetas de plástico de 1 ml. Como

blanco de la medida se emplea el medio en el que se encuentren las células.

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5º- Incubar los matraces a 30 ºC con agitación constante durante toda la

noche. ∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴

DÍA 2 (Miércoles 27-10-2010).

Estudio de la estabilidad mitótica. 1º- Medir la absorbancia de los cultivos tal y como se hizo el día anterior. Este

valor será la DO(2). La cepa IM1-8b flocula con facilidad. Antes de realizar la medida de

absorbancia hay que agitar el cultivo fuertemente y tratar de obtener una suspensión celular

homogénea (si se precisa, utilizar la pipeta automática para la resuspensión). Cuando la

densidad óptica sea mayor de 0.8, repetir la medida de absorbancia empleando una

dilución 1:10 del cultivo. Anotad la hora a la que se toma la muestra celular.

2º- Calcular el número de generaciones (g) que ha transcurrido para cada

organismo.

DO(2)/DO(1) x V inóculo/ V preinóculo= 2g

V inóculo = 20 ml V preinóculo= 10 (ó 50) x 10-3 ml

3ª- Calcular el tiempo de generación=tiempo (minutos) que tarda en duplicarse el

número de células de cada organismo en el medio utilizado.

4º- A tenor de la medida de densidad óptica a 660nm obtenida y los datos que se

muestran en el Anexo IV, hacer las diluciones correspondientes para que se obtenga un

número de colonias contable por cada placa (un número comprendido entre 100-500

colonias). Generalmente se utiliza la dilución 1:100 (1:102) ó 1:1000 (1:103). Ver Anexo

V.

5º- Añadir 50 µl de cada una de las diluciones celulares (el cultivo ha de estar

homogéneo) a placas de medio sólido sin y con la presión selectiva adecuada para cada

tipo de construcción. Extender la suspensión de células con asa de vidrio lo más rápido

posible. Utilizar el siguiente esquema:

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CULTIVOS LÍQUIDOS SIN PRESIóN (YEPD) Nº DE

PLACA PLACAS A INOCULAR

DADI-SWA2

IM18b-construcción

1.1 Sin presión: YEPD 50 µl (1:102) 1.2 Sin presión: YEPD 50 µl (1:103) 1.3 Sin presión: YEPD 50 µl (1:102) 1.4 Sin presión: YEPD 50 µl (1:103) 2.1 Con presión:MMAM 50 µl (1:102) 2.2 Con presión:MMAM 50 µl (1:103) 2.3 Con presión:MMM+H 50 µl (1:102) 2.4 Con presión:MMM+H 50 µl (1:103)

6º- Incubar las placas a 30 ºC durante un par de días y pasar a 4ºC hasta comentar

resultados.

Caracterización del genotipo/fenotipo.

1º- Comprobar el crecimiento de las levaduras en los distintos medios y elaborar un

esquema con los datos obtenidos. Si no hay crecimiento en alguna de las placas, incubarla

a 30 ºC hasta el día siguiente.

2º- Si hay crecimiento, pasar las placas a 4ºC.

∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴

DÍA 3 (Jueves 28-10-2010).

Caracterización del genotipo/fenotipo. 1º- Pasar las placas a 4ºC, si es que no se ha hecho el día anterior.

¿A tenor de los resultados obtenidos podrías identificar los organismos que has utilizado

(1, 2, 3,..) en cada caso?. Si no se aprecian halos de hidrólisis analizar el resultado al día

siguiente.

∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴∴

DÍA 4 (Viernes 29-10-2010).

Estudio de la estabilidad mitótica. Contar el número de colonias crecidas para cada organismo y medio utilizado. Calcular la

estabilidad mitótica para cada construcción: % células que mantienen la construcción en

relación al número total de células (valor obtenido en el medio con presión selectiva en

relación al obtenido en el medio sin presión, rico).

Análisis de resultados.

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ANEXO I

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ANEXO II

RESPUESTAS: Nº NOMBRE DE LA CEPA 1 2 3 4 5 6 7

1 2

3 4

5 6

7

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Anexo III

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Anexo IV

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Anexo V

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MATERIALES Y SOLUCIONES

-Gas, hay que trabajar en esterilidad, es suficiente "a la llama".

-Mecheros, uno por persona.

-Asas o palillos de siembra estériles.

-Asas de extensión desechables o de vidrio (si son de vidrio, vaso de vidrio y etanol para esterilizar

a la llama).

-Matraces de 50 ml.

-Espectrofotómetro y cubetas de plástico de 1ml.

-Baño con agitación a 30ºC.

-Agua estéril.

Placas de MM almidón-maltosa (MMAM) suplementadas o no con los requerimientos necesarios.

-Placas de MM maltosa (MMM) suplementadas o no con los requerimientos necesarios.

-Placas de medio rico, YEPD.

-Medio líquido YEPD.

-Pipetas automáticas.

-Gradillas para eppendorff.

-Tubos de 1.5 ml estériles.

-Microscopio.

-Portas y cubres.

-Estufa a 30 ºC.

-Rotulador marcador placa y vidrio.

-pipetas Pasteur.