Cervix Carcinoma

8/3/2019 Cervix Carcinoma

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B r i t i s h J o u m a l o f C a n c e r ( 1 9 9 8 ) 7 7 ( 7 ) , 1 1 0 8 - 1 1 1 4 1 9 9 8 C a n c e r R e s e a r c h C a m p a i g n

The r a t i o o f i n i t i a U r e s i d u a l DNA damage p r e d i c t si n t r i n s i c r a d i o s e n s i t i v i t y i n seven c e r v i x carcinomac e l l l i n e sB M a r p l e s , D L o n g h u r s t , AM E a s t h a m a n d CML W e s tC a n c e r R e s e a r c h C a m p a i g n D e p a r t m e n t o f E x p e r i m e n t a l R a d i a t i o n O n c o l o g y , P a t e r s o n I n s t i t u t e f o r C a n c e r R e s e a r c h , C h r i s t i e H o s p i t a l ( N H S ) T r u s t ,W i l m s l o w R o a d , M a n c h e s t e r M20 4 B X , UK

Summary T h e s i n g l e - c e l l g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( c o m e t ) a s s a y was u s e d t o m e a s u r e r a d i a t i o n - p r o d u c e d DNA d o u b l e - s t r a n d b r e a k s ( d s b s ) i n as e r i e s o f s e v e n c e r v i c a l t u m o u r c e l l l i n e s ( M E 1 8 0 , H T 3 , C 3 3 A , C 4 1 , S i H a , M S 7 5 1 a n d C a S k i ) . T h e p r o p o r t i o n o f DNA d s b s was m e a s u r e di m m e d i a t e l y a f t e r r a d i a t i o n t r e a t m e n t ( i n i t i a l d a m a g e ) a n d 1 6 h l a t e r a f t e r i n c u b a t i o n a t 3 7 0 C ( r e s i d u a l d a m a g e ) . L i n e a r d o s e - r e s p o n s e c u r v e sw e r e s e e n f o r i n i t i a l ( s l o p e s 0 . 2 3 - 0 . 6 6 ) a n d r e s i d u a l ( s l o p e s 0 . 1 6 - 0 . 8 7 ) DNA d s b s . N e i t h e r o f t h e s l o p e s o f t h e l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s o nt h e i n i t i a l a n d o n t h e r e s i d u a l DNA d s b s d o s e - r e s p o n s e c u r v e s ( r a n g e 0 - 8 0 G y ) c o r r e l a t e d w i t h S F 2 ( s u r v i v i n g f r a c t i o n a t 2 G y ) m e a s u r e da f t e r h i g h - ( H D R ) o r l o w - d o s e - r a t e ( L D R ) i r r a d i a t i o n . An a s s o c i a t i o n was e v i d e n t b e t w e e n S F 2 a f t e r HDR a n d LDR i r r a d i a t i o n a n d t h e r a t i o o ft h e a b s o l u t e l e v e l o f i n i t i a l a n d r e s i d u a l damage a f t e r a s i n g l e d o s e o f 6 0 G y . H o w e v e r , a s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n was f o u n d b e t w e e n HDR ( r =- 0 . 7 8 , P = 0 . 0 4 ) a n d LDR ( r = - 0 . 8 6 , P = 0 . 0 3 ) S F 2 v a l u e s a n d t h e r a t i o o f t h e s l o p e s o f t h e i n i t i a l a n d r e s i d u a l DNA d s b s d o s e - r e s p o n s ec u r v e s ( r a n g e 0 . 4 7 - 0 . 9 9 ) , r e p r e s e n t i n g t h e f r a c t i o n o f DNA d a m a g e r e m a i n i n g . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e n e u t r a l c o m e t a s s a y c a n b eu s e d t o p r e d i c t r a d i o s e n s i t i v i t y o f c e r v i c a l t u m o u r c e l l l i n e s b y a s s e s s in g t h e r a t i o o f i n i t i a l a n d r e s i d u a l DNA d s b s .K e y w o r d s : p r e d i c t i v e a s s a y ; i n t r i n s i c r a d i o s e n s i t i v i t y ; c o m e t a s s a y ; c e r v i x c a n c e r

T h e v a r i a t i o n i n c e l l u l a r r a d i o s e n s i t i v i t y o f h u m a n f i b r o b l a s t sm e a s u r e d i n v i t r o c a n b e e x p l a i n e d l a r g e l y b y t h e e x t e n t o f DNAd o u b l e - s t r a n d b r e a k ( d s b ) r e p a i r ( W u r m e t a l , 1 9 9 4 ; K i l t i e e t a l ,1 9 9 7 ) . H o w e v e r , f o r t u m o u r c e l l s , n o f i r m c o n s e n s u s e x i s t s f o r ac o r r e l a t i o n b e t w e e n i n v i t r o r a d i o s e n s i t i v i t y a n d t h e m a g n i t u d e o fr a d i a t i o n - i n d u c e d DNA d s b d a m a g e o r r e p a i r . A n u m b e r o f r e p o r t si n d i c a t e t h a t t u m o u r c e l l r a d i o s e n s i t i v i t y i s p o s i t i v e l y c o r r e l a t e dw i t h t h e l e v e l s o f i n i t i a l r a d i a t i o n - i n d u c e d DNA d s b s ( K e l l a n de t a l , 1 9 8 8 ; P e a c o c k e t a l , 1 9 8 9 ; M c M i l l a n e t a l , 1 9 9 0 ; R u i z d eA l m o d o v a r e t a l , 1 9 9 4 ) , w h i l e o t h e r s h a v e s h o w n n o c o r r e l a t i o n( S m e e t s e t a l , 1 9 9 3 ; O l i v e e t a l , 1 9 9 4 ; McKay a n d K e f f o r d , 1 9 9 5 ) .P o s i t i v e c o r r e l a t i o n s b e t w e e n t u m o u r c e l l r a d i o s e n s i t i v i t y a n d t h ee x t e n t o f r e s i d u a l DNA d s b s ( G i a c c i a e t a l , 1 9 9 2 ; Z a f f a r o n i e t a l ,1 9 9 4 ) , t h e r a t e o f DNA d s b r e p a i r ( S c h w a r t z e t a l , 1 9 8 8 ) a n d t h em i s r e p a i r o f r a d i a t i o n - i n d u c e d DNA d a m a g e ( P o w e l l e t a l , 1 9 9 2 ;P o w e l l a n d M c M i l l a n , 1 9 9 4 ) h a v e a l s o b e e n r e p o r t e d .

T h e a i m o f t h i s s t u d y w a s t o m e a s u r e t h e l e v e l o f i n i t i a l a n dr e s i d u a l r a d i a t i o n - i n d u c e d DNA d s b s i n s e v e n c e r v i c a l c a r c i n o m ac e l l l i n e s o f d i f f e r i n g r a d i o s e n s i t i v i t y , a s a s s e s s e d b y c l o n o g e n i cs u r v i v a l a f t e r h i g h - ( H D R ) a n d l o w - d o s e - r a t e ( L D R ) i r r a d i a t i o n t oe v a l u a t e t h e p o t e n t i a l o f t h e n e u t r a l c o m e t a s s a y a s a p r e d i c t o r o fr a d i o s e n s i t i v i t y . T h i s m e t h o d o f m e a s u r i n g DNA d s b s w a s u s e da s i t i s r a p i d ( O l i v e e t a l , 1 9 9 1 ; F a i r b a i m e t a l , 1 9 9 5 ) , i s l e s st e c h n i c a l l y d e m a n d i n g t h a n o t h e r a s s a y s ( e . g . n e u t r a l f i l t e r e l u t i o na n d p u l s e f i e l d g e l e l e c t r o p h o r e s i s ) a n d d o e s n o t r e q u i r e t h e u s eo f p r e t r e a t m e n t r a d i o l a b e l l i n g t o q u a n t i f y DNA d s b d a m a g e ,

R e c e i v e d 4 A p r i l 1 9 9 7R e v i s e d 4 S e p t e m b e r 1 9 9 7A c c e p t e d 9 S e p t e m b e r 1 9 9 7C o r r e s p o n d e n c e t o : B M a r p l e s

a t t r i b u t e s t h a t m a k e t h e a s s a y a n a t t r a c t i v e s u r r o g a t e m e a s u r e f o rr a d i o s e n s i t i v i t y f o r r o u t i n e m e a s u r e m e n t s o f DNA d s b r e p a i rc a p a c i t y o n c l i n i c a l m a t e r i a l .

MATERIALS AND METHODSC e l l c u l t u r eT h e s e v e n c e r v i c a l c a r c i n o m a c e l l l i n e s u s e d i n t h e s e s t u d i e s( C a S k i , S i H a , M E 1 8 0 , H T 3 , C 4 1 , C 3 3 a n d M S 7 5 1 ) w e r e o b t a i n e do r i g i n a l l y f r o m t h e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n ( A T C C ) .A l l c e l l s w e r e g r o w n i n minimum e s s e n t i a l m e d i u m ( M E M ) ,s u p p l e m e n t e d w i t h L - g l u t a m i n e ( 2 m M ) , p e n i c i l l i n ( 1 0 0 I U m l - ' ) ,s t r e p t o m y c i n ( 0 . 1 mg m l - ' ) a n d 10% f e t a l c a l f s e r u m ( B i o l o g i c a lI n d u s t r i e s , k i b b u t z b e t h h a e m e k , I s r a e l ; b a t c h 5 0 1 1 0 4 a n d7 8 5 2 2 5 ) . A l l m e d i a a n d s u p p l e m e n t s w e r e o b t a i n e d f r o m G i b c o ,P a i s l e y , UK. C e l l s w e r e g r o w n i n s e a l e d T 2 5 t i s s u e c u l t u r e f l a s k sc o n t a i n i n g 5 m l o f m e d i u m a n d g a s s e d w i t h a m i x t u r e o f 95%a i r - 5 % c a r b o n d i o x i d e w h e n r e s e e d e d . S u b c u l t u r i n g o c c u r r e dw e e k l y ( s e e d e d a t 5 x 1 0 5 c e l l s m l - 1 ) w i t h t w i c e - w e e k l y f e e d i n gw i t h c o m p l e t e f r e s h c u l t u r e m e d i u m .S u r v i v a l a f t e r i o n i z i n g r a d i a t i o nC e l l s u r v i v a l w a s a s s e s s e d u s i n g a c o n v e n t i o n a l c l o n o g e n i cs u r v i v a l a s s a y a f t e r h i g h - ( 3 . 1 Gy m i n - ' ) o r l o w - ( 0 . 1 1 2 Gy m i n - ' )d o s e - r a t e i r r a d i a t i o n u s i n g a 6 O C o - y s o u r c e ( W i l k s e t a l , 1 9 9 6 ) .B r i e f l y , c e l l s w e r e i r r a d i a t e d e i t h e r a s s i n g l e - c e l l s u s p e n s i o n s a troom t e m p e r a t u r e ( h i g h d o s e r a t e ) o r c e l l m o n o l a y e r s i n t i s s u ec u l t u r e f l a s k s a t 3 7 C ( l o w d o s e r a t e ) . I n a l l c a s e s , c o n t r o l ( u n i r r a -d i a t e d ) c e l l s w e r e s h a m i r r a d i a t e d a n d t r e a t e d i d e n t i c a l l y t ot h e i r r a d i a t e d c e l l s . A f t e r r a d i a t i o n t r e a t m e n t , t h e c e l l s w e r e

1 1 0 8


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R a d i o s e n s i t i v i t y i n c e r v i x cancer 1 1 0 9t r y p s i n i z e d ( l o w d o s e r a t e o n l y ) , a n d c e l l s u s p e n s i o n s w ere d i l u t e di n c o m p l e t e t i s s u e c u l t u r e m e d i u m t o an a p p r o p r i a t e d e n s i t y a n dp l a t e d t o e n s u r e 1 0 0 s u r v i v i n g c o l o n i e s p e r 50-mm P e t r i d i s h , i r r e -s p e c t i v e o f t h e r a d i a t i o n d o s e g i v e n . S e p a r a t e p l a t e s w e r e s e t u p a ttwo or t h r e e c e l l d e n s i t i e s f o r u n i r r a d i a t e d c e l l s t o o b t a i n a p r e c i s ee s t i m a t e o f p l a t i n g e f f i c i e n c y . T h e d i s h e s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 Ci n an a t m o s p h e r e o f 95% a i r - 5 % c a r b o n d i o x i d e f o r 3 w e e k s .P l a t e s w ere t h e n s t a i n e d w i t h G e n t i a n v i o l e t , a n d c o l o n i e s a s s e s s e da s c o n t a i n i n g more t h a n 5 0 c e l l s w e r e s c o r e d as s u r v i v o r s .S u r v i v a l curve a n a l y s i sS u r v i v i n g f r a c t i o n s we r e c a l c u l a t e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y( M a r p l e s a n d J o i n e r , 1 9 9 3 ) . B r i e f l y , f o r e a c h i n d i v i d u a l e x p e r i -m e n t , t h e p l a t i n g e f f i c i e n c i e s ( P E ) o f t h e r e p l i c a t e c o n t r o l ( u n i r r a -d i a t e d ) p l a t e s w ere d e t e r mi n e d a n d a mean v a l u e c a l c u l a t e d , t h i swas t h e n u s e d t o d e t e r m i n e t h e s u r v i v i n g f r a c t i o n o f i r r a d i a t e dc e l l s i n t h a t e x p e r i m e n t . T h e p l a t i n g e f f i c i e n c i e s o f t h e seventumour c e l l l i n e s r a n g e d f r o m a mean v a l u e o f 1 5 % f o r C 4 1 c e l l st o 67% f o r S i H a c e l l s . F o r e a c h i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t , s u r v i v i n gf r a c t i o n was c a l c u l a t e d u s i n g a m i n i m u m o f t h r e e r e p l i c a t e P e t r id i s h e s p e r d o s e p o i n t . T h e v a l u e s c a l c u l a t e d f r o m t h e i n d e p e n d e n te x p e r i m e n t s ( n = 3 - 1 2 ) w ere a v e r a g e d t o g i v e an o v e r a l l meanv a l u e o f s u r v i v a l f o r t h e c o m p l e t e d a t a f o r e a c h c e l l l i n e . T h e s ed a t a w e r e p l o t t e d a n d f i t t e d u s i n g a l i n e a r q u a d r a t i c m o d e l[ s u r v i v i n g f r a c t i o n = e x p ( a d + P d 2 ) ] ; a m a t h e m a t i c a l l y d e r i v e de s t i m a t e o f t h e s u r v i v i n g f r a c t i o n a t 2 G y ( S F 2 ) was t h e n c a l c u -l a t e d f r o m t h e f i t t e d s u r v i v a l curves.T r e a t m e n t o f s a m p l e s f o r comet a n a l y s i sTw o t r e a t m e n t r e g i m e n s we r e u s e d t o measure i n i t i a l a n d r e s i d u a lDNA d s b s . F o r a s s e s s m e n t o f i n i t i a l d a m a g e , a c o n f l u e n t m ono -l a y e r o f c e l l s w a s t r y p s i n i z e d a n d r e s u s p e n d e d i n b i j o u t u b e s a t8 x 1 0 4 c e l l s m l - ' i n 2 m l o f - i c e - c o l d c o m p l e t e m e d i u m a n d p l a c e do n i c e . F o r e a c h e x p e r i m e n t , a c e l l c y c l e p r o f i l e o f t h e c e l l p o p u l a -t i o n w a s m e a s u r e d u s i n g f l o w c y t o m e t r y ( s e e b e l o w ) ( O r m e r o d ,1 9 9 0 ) . T h e i c e - c o l d c e l l s u s p e n s i o n ( 8 x 1 0 4 c e l l s m l - ' ) w as i r r a d i -a t e d a t room t e m p e r a t u r e a n d r e t u r n e d i m m e d i a t e l y t o i c e t o m i n i -m i z e e n z y m a t i c DNA d s b r e p a i r . A 1 - m l a l i q u o t o f t h e i c e - c o l dt r e a t e d c e l l s u s p e n s i o n w as m i x e d w i t h 2 . 5 m l o f p r e - w a r m e d( 4 5 C ) 1 % a g a r o s e ( l o w - g e l l i n g - p o i n t t y p e V I I , S i g m a C h e m i c a l ) ,t h e n 1 m l o f t h e c e l l - a g a r o s e m i x t u r e w as r a p i d l y a p p l i e d t o as t a n d a r d m i c r o s c o p e s l i d e , p r e c o a t e d 2 4 h p r e v i o u s l y w i t h 4 0 0 , u lo f 1% a g a r o s e . T h e s l i d e s we r e p l a c e d i m m e d i a t e l y o n t o an i c e -c o l d m e t a l s u r f a c e t o h a s t e n t h e s o l i d i f i c a t i o n o f t h e a g a r o s e a n dr e d u c e t h e t i m e f o r DNA r e p a i r t o occur. O n c e t h e a g a r o s e h a d s e t ,t h e s l i d e s w ere c a r e f u l l y s u b m e r g e d i n 5 0 0 m l o f a f r e s h l yp r e p a r e d 5 0 C l y s i s s o l u t i o n o f 0 . 5 % s o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e( S D S ) a n d 3 0 mm E D T A , p H 8 , f o r 4 h . S u b s e q u e n t l y , t h e s l i d e sw ere r i n s e d i n a s o l u t i o n o f TBE b u f f e r ( 4 5 m n i m T r i s b a s e , 4 5 mMb o r i c a c i d , 2 mm E D T A , p H 8 . 2 ) o v e r n i g h t f o l l o w e d b y f o u r1 5 - m i n w a s h e s i n f r e s h TBE b u f f e r . T h e s l i d e s were t h e n t r a n s -f e r r e d t o an e l e c t r o p h o r e s i s t a n k c o n t a i n i n g 1 1 5 0 m l o f TBE b u f f e ra t room t e m p e r a t u r e . T h e e l e c t r o p h o r e s i s a n d w a s h i n g t a n k s a r em a d e o f b l a c k p e r s p e x , e n s u r i n g a l l l i g h t w as e x c l u d e d . E l e c t r o -p h o r e s i s was c a r r i e d o u t a t room t e m p e r a t u r e f o r 2 5 mi n a t 2 0 V ( -0 . 6 V c m - ' ) . S u b s e q u e n t l y , t h e s l i d e s w ere r i n s e d b y s u b m e r g i n g i nd o u b l e - d i s t i l l e d w a t e r a n d s t a i n e d w i t h 2 . 5 , u g m l - ' o f P I i n 0 . 1 Ms o d i u m c h l o r i d e f o r 6 0 min f o l l o w e d b y a 3 0 - m i n r i n s e i n d o u b l e -d i s t i l l e d w a t e r t o remove u n b o u n d p r o p i d i u m i o d i d e . S l i d e s were

d r i e d a t room t e m p e r a t u r e f o r s t o r a g e a n d r e h y d r a t e d b y p l a c i n g i nd o u b l e - d i s t i l l e d w a t e r f o r 4 5 m i n t o s c o r e . I n o r d e r t o measurer e s i d u a l d a m a g e , m o n o l a y e r s o f c e l l s i n T 2 5 f l a s k s c o n t a i n i n gS m l o f c u l t u r e m e d i u m were i r r a d i a t e d a t room t e m p e r a t u r e a n di m m e d i a t e l y r e t u r n e d t o a 3 7 C i n c u b a t o r . A f t e r 1 6 h , t h e c e l l sw e r e t r y p s i n i z e d , s u s p e n d e d a t 8 x 1 0 4 c e l l s m l ' a n d p r o c e s s e d f o rc o m e t a n a l y s i s a s d e s c r i b e d a b o v e . E x p e r i m e n t s m e a s u r i n g t h ek i n e t i c s o f DNA d s b r e j o i n i n g u s i n g t h e most r a d i o s e n s i t i v e( M E 1 8 0 ) a n d r a d i o r e s i s t a n t c e l l l i n e ( M S 7 5 1 ) i n d i c a t e d t h a t s m a l ld i f f e r e n c e s w e r e e v i d e n t i n t h e r a t e o f b r e a k r e j o i n i n g a t t i m e s< 4 h , h o w e v e r n o d i f f e r e n c e s were d e t e c t e d a f t e r a 1 2 - h r e p a i rp e r i o d . C o n s e q u e n t l y , t o e n s u r e s u f f i c i e n t t i m e f o r a l l t h e ' r e j o i n -a b l e ' b r e a k s t o r e j o i n , a 1 6 - h r e p a i r p e r i o d w as u s e d i n e x p e r i -m e n t s m e a s u r i n g t h e a b s o l u t e p r o p o r t i o n o f r e s i d u a l DNA d s b s . I na d d i t i o n , 1 6 h i s e x p e r i m e n t a l l y a p p r o p r i a t e f o r t h e d e v e l o p m e n to f a r o u t i n e p r e d i c t i v e r a d i o s e n s i t i v i t y t e s t u s i n g t h e n e u t r a l cometa s s a y , a s i t r e p r e s e n t s a n o v e r n i g h t t i m e i n t e r v a l .A n a l y s i s o f i n i t i a l a n d r e s i d u a l d a m a g eA minimum o f t h r e e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s were c a r r i e d o u t p e rc e l l l i n e . C o m e t s w e r e a n a l y s e d u s i n g a L e i t z D i a p l a n f l u o r e s c e n tm i c r o s c o p e a t 2 0 0 x m a g n i f i c a t i o n u s i n g a K i n e t i c I m a g i n g K o m e ts y s t e m ( L i v e r p o o l , U K ) ( A s h b y e t a l , 1 9 9 5 ) . T a i l moment w asu s e d a s a n i n d e x o f DNA d a m a g e , w h i c h c o m b i n e s a measure o ft h e l e n g t h o f t h e c o m e t t a i l a n d t h e p r o p o r t i o n o f DNA t o m i g r a t ei n t o t h e t a i l ( O l i v e a n d B a n a i t h , 1 9 9 3 ) . B e f o r e comet s c o r i n g , t h ec o n t r o l s a m p l e s l i d e ( u n i r r a d i a t e d ) was e x a m i n e d m a n u a l l y a n dt h e b r i g h t e s t c o m e t u s e d t o c a l i b r a t e t h e CCD c a m e r a b y e n s u r i n gt h e f l u o r e s c e n c e o f t h e c o m e t h e a d d i d n o t e x c e e d 2 5 5 g r e y s c a l e s .T h i s p r o c e d u r e e n s u r e d t h a t s u b s e q u e n t m e a s u r e m e n t s o f o t h e rc o m e t i m a g e s d i d n o t s a t u r a t e t h e CCD c a m e r a p r e v e n t i n g i n c o r -r e c t h e a d t o t a i l r a t i o s b e i n g s c o r e d . C o m e t s w e r e m e a s u r e d b yr a n d o m l y s e l e c t i n g i m a g e s f r o m t h e m i c r o s c o p e f i e l d o f v i e w a n da d e f i n e d s e q u e n c e o f s e a r c h i n g g u a r a n t e e d t h a t t h e same i m a g ew a s n o t s c o r e d t w i c e . T h e mean t a i l moment v a l u e was c a l c u l a t e df r o m 1 0 0 c o m e t s o n t w o r e p l i c a t e s l i d e s p e r d o s e p o i n t i n e a c h o ft h e t h r e e i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t s u s i n g t h e K i n e t i c I m a g i n ga n a l y s i s s o f t w a r e . T o o b t a i n a n o v e r a l l mean t a i l moment v a l u ef r o m t h e r e p e a t e x p e r i m e n t s , t h e mean v a l u e s f r o m t h e i n d i v i d u a le x p e r i m e n t s w e r e a v e r a g e d a n d s t a n d a r d e r r o r o n t h e mean c a l c u -l a t e d a n d p l o t t e d .F l o w c y t o m e t r yI m m e d i a t e l y b e f o r e e a c h e x p e r i m e n t a n a l i q u o t o f t h e c e l l p o p u l a -t i o n w a s w a s h e d t w i c e i n p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) a n dr e s u s p e n d e d i n 0 . 5 m l o f PBS a n d f i x e d w i t h 4 . 5 m l o f i c e - c o l d70% e t h a n o l ( i n P B S ) f o r a m i n i m u m o f 2 4 h a t 4 C .S u b s e q u e n t l y , t h e c e l l s w e r e w a s h e d t w i c e i n P B S , p e l l e t e d a n dr e s u s p e n d e d i n 8 0 0 g l o f P B S , 1 0 0 , l o f RNAase ( 1 mg m l ' )a n d 1 0 0 , l o f p r o p i d i u m i o d i d e ( 1 mg m l - ' ) f o r 3 0 m i n a t 3 7 C( O r m e r o d , 1 9 9 0 ) . A n a l y s i s o f c e l l c y c l e p h a s e d i s t r i b u t i o n s w e r ec a r r i e d o u t o n a B e c t o n D i c k i n s o n F A C S c a n f l o w c y t o m e t e r a t4 8 8 nm u s i n g a l o n g - p a s s f i l t e r .RESULTST h e r a d i a t i o n s u r v i v a l c u r v e p a r a m e t e r s a f t e r h i g h - (HDR) a n dl o w - d o s e - r a t e ( L D R ) i r r a d i a t i o n f o r t h e s e v e n c e l l l i n e s u s e d a r eg i v e n i n T a b l e 1 , a n d t h e d a t a a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 1 . T h e d a t a

B r i t i s h J o u r n a l o f C a n c e r ( 1 9 9 8 ) 7 7 ( 7 ) , 1 1 0 8 - 1 1 1 4C a n c e r R e s e a r c h C a m p a i g n 1 9 9 8


3/7

1 1 1 0 B M a r p l e s e t a lT a b l e 1 P a r a m e t e r s f r o m t h e l i n e a r q u a d r a t i c m o d e l f i t t e d t o t h e s u r v i v a l d a t a i n F i g u r e 1 a n d t h e m a t h e m a t i c a l l y d e r i v e d S F 2 v a l u e s

H i g h - d o s e - r a t e s u r v i v a l p a r a m e t e r s L o w - d o s e - r a t e s u r v i v a l p a r a m e t e r sC e l l l i n e S F 2 ( 9 5 % C L ) a ( 9 5 % C L ) f ( 9 5 % C L ) S F 2 ( 9 5 % C L ) a ( 9 5 % C L ) ( 9 5 % C L )M S 7 5 1 0 . 7 8 0 . 0 9 0 . 0 7 0 . 0 3 0 . 0 3 0 . 0 1 0 . 8 7 0 . 1 8 0 . 0 6 0 . 0 5 0 . 0 1 0 . 0 1ME180 0 . 3 1 0 . 0 6 0 . 5 6 0 . 0 5 0 . 0 1 0 . 0 2 0 . 3 8 0 . 0 7 0 . 4 2 0 . 0 1 0 . 0 3 0 . 0 1C33A 0 . 5 5 0 . 1 6 0 . 2 5 0 . 0 5 0 . 0 3 0 . 0 1 ND ND NDC 4 1 0 . 6 1 0 . 0 2 0 . 1 5 0 . 0 3 0 . 0 5 0 . 0 1 0 . 7 4 0 . 0 3 0 . 1 2 0 . 0 8 0 . 0 4 0 . 0 2HT3 0 . 3 8 0 .1 0 0 . 4 1 0 . 0 4 0 . 0 3 0 . 0 1 0 . 7 2 0 . 2 3 0 . 1 2 0 . 0 3 0 . 0 3 0 . 0 1S i H a 0 . 7 5 0 . 0 5 0 . 1 3 0 . 1 2 0 . 0 2 0 . 0 5 0 . 6 0 0 . 1 4 0 . 2 5 0 . 1 1 0 . 0 1 0 . 0 2C a S k i 0 . 8 7 0 . 0 6 0 . 0 9 0 . 0 6 0 . 0 8 0 . 0 2 0 . 7 3 0 . 0 8 0 . 0 8 0 . 0 2 0 . 0 4 0 . 0 1

c)C: 3

c n ,

D o s e ( G y )F i g u r e 1 R a d i a t i o n s u r v i v a l c u r v e s f o r t h e c e r v i c a l t u m o u r c e l l l i n e s a f t e r HDR ( r i g h t p a n e l ) a n d LD R ( l e f t p a n e l ) i r r a d i a t i o n . T h e l i n e s a r e a l i n e a r q u a d r a t i c f i tt o t h e d a t a

p o i n t s f o r HDR i r r a d i a t i o n r e p r e s e n t t h e m e a n s u r v i v a l ( s t a n d a r dd e v i a t i o n ) c a l c u l a t e d f r o m a minimum o f t h r e e i n d e p e n d e n t e x p e r -i m e n t s ( n = 3 - 1 2 ) w i t h t h r e e t o s i x r e p l i c a t e d o s e m e a s u r e m e n t s ;s u r v i v a l a f t e r LDR i r r a d i a t i o n w a s c a l c u l a t e d f r o m t w o o r t h r e ei n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . A r a n g e o f c e l l u l a r r a d i o s e n s i t i v i t y w a ss e e n , w i t h t h e S F 2 v a l u e s d i f f e r i n g b y a f a c t o r o f 2 . 8 ( r a n g e0 . 3 1 - 0 . 8 7 ) a f t e r HD R i r r a d i a t i o n a n d b y a f a c t o r o f 2 . 3 ( r a n g e0 . 3 8 - 0 . 8 7 ) a f t e r LDR r a d i a t i o n t r e a t m e n t .F i g u r e 2 s h o w s t h e i n i t i a l a n d r e s i d u a l DNA d s b d o s e - r e s p o n s ec u r v e s o b t a i n e d f r o m t h e t h r e e i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t s f o r t w o o ft h e t u m o u r c e l l l i n e s u s e d . L i n e a r d o s e - r e s p o n s e c u r v e s w e r ee v i d e n t i n e a c h e x p e r i m e n t f o r i n i t i a l a n d r e s i d u a l d a m a g e . Al i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n d o s e a n d i n i t i a l a n d r e s i d u a l DNA d s b sw a s a l s o s e e n i n t h e m a j o r i t y o f t h e i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t s f o r t h e

o t h e r f i v e c e l l l i n e s , a l b e i t w i t h g r e a t e r v a r i a b i l i t y ( c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t s > 0 . 7 4 ) ( d a t a n o t s h o w n ) . I n a l l e x p e r i m e n t s , t h ei n f l u e n c e o f c e l l a g e o n a s s a y v a r i a b i l i t y w a s m i n i m i z e d b y u s i n gc o n f l u e n t c u l t u r e s t o r e d u c e t h e p r o p o r t i o n o f c e l l s i n S - p h a s e , a st h e p r e s e n c e o f r e p l i c a t i o n f o r k s i n DNA c a n r e s t r i c t m i g r a t i o nu n d e r e l e c t r o p h o r e s i s ( O l i v e e t a l , 1 9 9 2 ; 1 9 9 3 ) . I n e a c h e x p e r i -m e n t , f l o w c y t o m e t r y a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t h e p r o p o r t i o n o fc e l l s i n t h e S - p h a s e o f t h e c e l l c y c l e w a s a l w a y s b e l o w 18% ( r a n g e7 - 1 7% , m e a n 1 2 % ) , i r r e s p e c t i v e o f t h e c e l l l i n e u s e d .

T h e c o m b i n e d i n i t i a l a n d r e s i d u a l DNA d s b d o s e - r e s po n sec u r v e s c o m p i l e d f r o m t h e d a t a o f t h e i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t s f o r a l ls e v e n c e l l l i n e s a r e s h o w n i n F i g u r e 3 . F o r e a c h c e l l l i n e , t h e d a t ap o i n t s r e p r e s e n t t h e m e a n ( s . e . m . ) t a i l m o m e n t ( T M ) v a l u e c a l c u -l a t e d f r o m t h e a v e r a g e TM v a l u e s f r o m t h e i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t s

B r i t i s h J o u r n a l o f C a n c e r ( 1 9 9 8 ) 7 7 ( 7 ) , 1 1 0 8 - 1 1 1 4 0 C a n c e r R e s e a r c h C a m p a i g n 1 9 9 8


4/7

R a d i o s e n s i t i v i t y i n c e r v i x c a n c e r 1 1 1 11 0 08 0 .6 0 '4 0 '2 0 '

ca )E0EH

O - H T 3 - 1

D o s e ( G y )F i g u r e 2 D o s e - r e s p o n s e c u r v e s f o r i n i t i a l ( - - - - ) a n d r e s i d u a l ( - ) DNA d s b s m e a s u r e d u s i n g t h e n e u t r a l c o m e t a s s a y i n t h e t h r e e i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t s f o rt h e HT3 ( u p p e r p a n e l s ) a n d S i H a ( l o w e r p a n e l s ) c e r v i c a l t u m o u r c e l l l i n e s . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s t h e mean ( s . d . ) t a i l m o m e n t v a l u e c a l c u l a t e d f r o m t w or e p l i c a t e s l i d e s p e r d o s e p o i n t p e r i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t

1 0 0 '8 0 '6 0 '4 0 '2 0 '

cE0E

P H

D o s e ( G y )F i g u r e 3 D o s e - r e s p o n s e c u r v e s f o r i n i t i a l ( - - - - ) a n d r e s i d u a l ( - ) DNA d s b s m e a s u r e d u s i n g t h e n e u t r a l c o m e t a s s a y . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s t h e mean( s . e . m . ) c a l c u l a t e d f r o m r e p l i c a t e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . T h e l i n e s a r e f i t t e d b y l i n e a r r e g r e s s i o n

a n d a r e f i t t e d b y l i n e a r r e g r e s s i o n . T h e c o m b i n e d d a t a s h o w n i n T h e s l o p e s o f t h e f i t t e d l i n e a r r e g r e s s i o n t o t h e i n i t i a l DNA d s bF i g u r e 3 w e r e a l l w e l l d e s c r i b e d b y a l i n e a r f i t , w i t h c o r r e l a t i o n d o s e - r e s p o n s e d a t a v a r i e d b y a f a c t o r o f 2 . 9 ( r a n g e 0 . 2 3 - 0 . 6 6 ) a n dc o e f f i c i e n t s o f 0 . 9 6 o r h i g h e r . w e r e s t e e p e r t h a n t h o s e f o r r e s i d u a l d a m a g e . T h e s h a l l o w e r r e s i d u a lB r i t i s h J o u r n a l o f C a n c e r ( 1 9 9 8 ) 7 7 ( 7 ) , 1 1 0 8 - 1 1 1 4C a n c e r R e s e a r c h C a m p a i g n 1 9 9 8


5/7

1 1 1 2 B M a r p l e s e t a lT a b l e 2 S l o p e s ( 95% C L ) f r o m l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s o f t h e i n i t i a l a n dr e s i d u a l d o s e - r e s p o n s e c u r v e s i n F i g u r e 3 . R a t i o o f d a m a g e i s c a l c u l a t e d a sr e s i d u a l d a m a g e / i n i t i a l d a m a g eC e l l l i n e I n i t i a l damage R e s i d u a l damage R a t i oM S 7 5 1 0 . 6 6 0 . 0 4 0 . 3 1 0 . 0 4 0 . 4 7ME180 0 . 5 8 0 . 0 2 0 . 5 8 0 . 0 5 0 . 9 9C33A 0 . 2 3 0 . 0 2 0 . 1 6 0 . 0 3 0 . 7 2C 4 1 0 . 3 2 0 . 0 2 0 . 2 2 0 . 0 1 0 . 6 8HT3 0 . 3 0 0 . 0 1 0 . 1 8 0 . 0 1 0 . 6 1S i H a 0 . 3 6 0 . 0 2 0 . 2 1 0 . 0 2 0 . 5 8C a S k i 0 . 2 9 0 . 0 3 0 . 8 7 0 . 0 1 0 . 5 3

d a m a g e s l o p e s i n d i c a t e t h a t t h e r e w e r e f e w e r DNA d s b s a f t e r a1 6 - h i n c u b a t i o n a t 3 7 C ( T a b l e 2 ) . T h e s l o p e s o f t h e f i t t e d l i n e a rr e g r e s s i o n t o t h e r e s i d u a l D NA d s b d o s e - r e s p o n s e c u r v e s v a r i e d b y af a c t o r o f 3 . 6 ( r a n g e 0 . 1 6 - 0 . 5 8 ) . T h e r a t i o o f t h e s l o p e s o f t h e i n i t i a la n d t h e r e s i d u a l d o s e - r e s p o n s e c u r v e s , r e p r e s e n t i n g t h e f r a c t i o n o fDNA d a m a g e u n r e p a i r e d , v a r i e d b y a f a c t o r o f 2 . 1 ( r a n g e 0 . 4 7 - 0 . 9 9 ) .A c o m p a r i s o n w a s m a d e o f t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c l o n o g e n i cs u r v i v a l a f t e r HDR a n d LDR i r r a d i a t i o n a n d t h e l e v e l o f r a d i a t i o n -

i n d u c e d DNA d s b s m e a s u r e d u s i n g t h e n e u t r a l c o m e t a s s a y . No r e l a -t i o n s h i p w a s f o u n d b e t w e e n HDR S F 2 a n d t h e s l o p e s o f i n i t i a l ( P =0 . 9 1 ) o r r e s i d u a l ( P = 0 . 2 3 ) DNA d s b d o s e - r e s p o n s e c u r v e s f i t t e d b yl i n e a r r e g r e s s i o n . I n c o n t r a s t , a n a s s o c i a t i o n w a s e v i d e n t b e t w e e nHDR S F 2 a n d t h e r a t i o o f t h e n u m b e r o f i n i t i a l a n d r e s i d u a l DNAd s b s ( i . e . t h e f r a c t i o n o f DNA d a m a g e u n r e p a i r e d ) a f t e r a 6 0 - G y d o s eo f r a d i a t i o n ( r = 0 . 5 8 ; P = 0 . 1 7 ) ( F i g u r e 4 B ) . M o r e o v e r , a s t a t i s t i c a l l y

A

CDc n 1a0.00

c c

oC D

c -Z -0c c

2 . 0 -

1 . 5 -

1 . 0 I * J

0 . 5 - - -0 I r = - 0 . 7 8 , P = 0 . 0 4B

9 n .

1 . 5 '

1 . 0 *

0 . 5 1

0 . 2 0 . 4 0 . 6H i g h d o s e r a t e S F 2

0 . 8

s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n w a s f o u n d b e t w e e n HDR S F 2 a n d t h e r a t i o o fi n i t i a l a n d r e s i d u a l D NA d s b s o v e r t h e c o m p l e t e d o s e r a n g e e x a m -i n e d , a s r e p r e s e n t e d b y t h e s l o p e p a r a m e t e r s c a l c u l a t e d f r o m F i g u r e 3( r = - 0 . 7 8 ; P = 0 . 0 4 ) ( F i g u r e 4 A ) . S t r o n g e r c o r r e l a t i o n s w e r e f o u n db e t w e e n S F 2 a f t e r l o w - d o s e - r a t e i r r a d i a t i o n a n d t h e f r a c t i o n o f D NAd a m a g e u n r e p a i r e d ( r a t i o o f i n i t i a l a n d r e s i d u a l d a m a g e ) a t 6 0 G y( r = 0 . 7 8 ; P = 0 . 0 9 ) a n d o v e r t h e c o m p l e t e d o s e r a n g e s t u d i e d( r = - 0 . 8 6 ; P = 0 . 0 3 ) ( F i g u r e 4C a n d D ) .DISCUSSIONE v i d e n c e t h a t t h e r a d i o s e n s i t i v i t y o f a t u m o u r i s a n i m p o r t a n tf a c t o r i n v o l v e d i n d e t e r m i n i n g p a t i e n t r e s p o n s e t o r a d i o t h e r a p y h a sb e e n g a i n e d f r o m w o r k c a r r i e d o u t u s i n g c l o n o g e n i c a s s a y s ( W e s t ,1 9 9 5 ; W e s t e t a l , 1 9 9 7 ) . T h e s e a s s a y s a r e h o w e v e r t o o l a b o r i o u sf o r r o u t i n e c l i n i c a l a p p l i c a t i o n , a n d t h i s h a s s t i m u l a t e d a n i n t e r e s ti n t h e d e v e l o p m e n t o f m o r e r a p i d m e a s u r e s o f r a d i o s e n s i t i v i t y . T h ec o m e t a s s a y i s a t t r a c t i v e a s a p o t e n t i a l c l i n i c a l t e s t o f t u m o u rr a d i o s e n s i t i v i t y a s i t r e q u i r e s f e w c e l l s a n d g e n e r a t e s r e s u l t sr a p i d l y c o m p a r e d w i t h s t a n d a r d c l o n o g e n i c a n d o t h e r e l e c t r o -p h o r e s i s a s s a y s .

T h e l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e p r o d uc t i o n o f r a d i a t i o n -i n d u c e d DNA d s b s a n d d o s e s h o w n i n F i g u r e s 2 a n d 3 i s i n g o o da g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s u s i n g a v a r i e t y o f DNA d s ba s s a y s ( r e v i e w e d b y N u n i i e z , 1 9 9 6 ) a n d t h e n e u t r a l c o m e t a s s a y( O l i v e e t a l , 1 9 9 4 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , a c o m p a r i s o n o f t h e s l o p e so b t a i n e d f r o m t h e l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s o f t h e i n i t i a l DNA d s bd o s e - r e s p o n s e c u r v e s f o r t h e s e v e n t u m o u r l i n e s s h o w e d s i g n i f i -c a n t v a r i a t i o n , i n d i c a t i n g d i f f e r e n t l e v e l s o f i n i t i a l d a m a g e b e t w e e n

C O ),,060

. _ 5co

a :0( 0

0c oC c $C r

1 . 0

2 . 0

1 . 5

1 . 0

0 . 5 Ir = - 0 . 8 6 , P _ 0 . 0 3

D2 . 0 '

1 . 5 - 1 . 5 - - - ~ ~ ~ ~ . . . . . . . . . . . . .l - - - - - - - - ~ ~ ~ ~ . . . . . . . .

1 . 0 ' ,

0 . 5

r = 0 . 7 8 , P = 0 . 0 90 i , ,0 . 2 0 . 4 0 . 6Low d o s e r a t e S F 2

0 . 8 1 . 0

F i g u r e 4 R e l a t i o n s h i p b e t w e e n r a t i o o f damage ( i n i t i a l / r e s i d u a l ) a t 6 0 Gy (B an d D) or r a t i o o f slopes o f th e i n i t i a l and residual DNA dsb dose-response curvesa n d r a d i o s e n s i t i v i t y e x p r e s s e d as S F 2 f o r HDR ( A an d B ) an d LDR (C an d D) i r r ad i a ti o n f o r th e series o f cervical tumour c e l l l i n e s . The s o li d l i ne s represent ther e g r e s s i o n f i t t o t h e d a t a a n d t h e d a s h e d l i n e s t h e 95% c o n f i d e n c e on t h e f i t

B r i t i s h J o u r n a l o f C a n c e r ( 1 9 9 8 ) 7 7 ( 7 ) , 1108-1114

.-----....r = 0 . 5 8 ,P0 . 1 7

r= 0 . 5 8 , P =0.17O 1v

0 C a n c e r R e s e a r c h C a m p a i g n 1 9 9 8


6/7

R a d i o s e n s i t i v i t y i n c e r v i x c a n c e r 1 1 1 3T ab l e 3 C o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t s a n d P - v a l u e s c a l c u l a t e d f r o m e i t h e r HD R o rLD R S F 2 p l o t t e d a g a i n s t t h e s l o p e s o f t h e i n i t i a l a n d r e s i d u a l d a m a g ed o s e - r e s p o n s e c u r v e s , t h e r a t i o o f s l o p e s o f r e s i d u a l a n d i n i t i a l d a m a g ed o s e - r e s p o n s e c u r v e s o r t h e r a t i o o f t h e a b s o l u t e l e v e l o f i n i t i a l r e s i d u a l l e v e lo f DNA d s b s a t 6 0 G y ( a s d e t e r m i n e d f r o m F i g u r e 3 )

I n i t i a l s l o p e R e s i d u a l s l o p e R a t i o o f s l o p e s R a t i o a t 6 0 Gyr P r P r P r P

HDR S F 2 - 0 . 0 5 0 . 9 1 - 0 . 5 1 0 . 2 3 - 0 . 7 8 0 . 0 4 * 0 . 5 8 0 . 1 7LD R S F 2 - 0 . 0 7 0 . 8 9 - 0 . 5 9 0 . 2 1 - 0 . 8 6 0 . 0 3 * 0 . 7 8 0 . 0 9 * ** C o r r e l a t i o n i s s i g n i f i c a n t a t t h e l e v e l 0 . 0 5 . " C o r r e l a t i o n i s s i g n i f i c a n t a t t h el e v e l 0 . 1 0 .

t h e d i f f e r e n t c e l l l i n e s ( F i g u r e 3 a n d T a b l e 2 ) . T h e p r e s e n t f i n d i n ga g r e e s w i t h o t h e r s t u d i e s t h a t h a v e s h o w n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e si n DNA d s b i n d u c t i o n b e t w e e n h u m a n t u m o u r c e l l s l i n e s u s i n gn e u t r a l e l u t i o n ( K e l l a n d e t a l , 1 9 8 8 ) o r p u l s e d - f i e l d g e l e l e c t r o -p h o r e s i s ( W h i t a k e r e t a l , 1 9 9 5 ) . H o w e v e r , t h e r e s u l t s f r o m F i g u r e3 c o n t r a s t w i t h t h e d a t a o f O l i ve e t a l ( 1 9 9 4 ) u s i n g t h e n e u t r a lc o m e t a s s a y w h i c h s h o w e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n r a d i a t i o n -i n d u c e d DNA d s b i n a r a n g e o f s i x h i s t o l o g i c a l l y d i s t i n c t h u m a nt u m o u r c e l l l i n e s ( m e l a n o m a , p r o s t a t e c a r c i n o m a , g l i o m a , c o l o na d e n o c a r c i n o m a a n d c e r v i c a l c a r c i n o m a ) .I n o r d e r t o h a v e c o n f i d e n c e i n t h e p o t e n t i a l u s e o f a r a p i d a s s a yo f t u m o u r r a d i o s e n s i t i v i t y , c o r r e l a t i o n s m u s t b e s h o w n w i t h c l o n o -g e n i c m e a s u r e s o f r a d i o s e n s i t i v i t y . A s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n h a sb e e n r e p o r t e d p r e v i o u s l y b e t w e e n c l o n o g e n i c r a d i o s e n s i t i v i t y a n dt h e l e v e l s o f i n i t i a l r a d i a t i o n - i n d u c e d d a m a g e i n h u m a n t u m o u rc e l l s ( K e l l a n d e t a l , 1 9 8 8 ; N u n i i e z e t a l , 1 9 9 6 ) . I t w a s p o s t u l a t e dt h a t t h i s m i g h t r e f l e c t d i f f e r e n c e s i n t h e n u m b e r o f l e s i o n s i n c u r r e db y t h e r a d i o s e n s i t i v e c e l l s c o m p a r e d w i t h t h e r e s i s t a n t c e l l s , a ss h o w n b y P e a c o c k e t a l ( 1 9 8 9 ) , o r p o s s i b l y d i f f e r e n c e s i n c h r o -m a t i n c o n f o r m a t i o n t h a t a f f e c t t h e a c c e s s i b i l i t y o f s c a v e n g i n gm o l e c u l e s t o d a m a g e d DNA o r r a d i c a l a t t a c k ( O l e i n i c k e t a l , 1 9 8 4 ;O l i v e e t a l , 1 9 9 2 ) o r t h e ' p r e s e n t a t i o n ' o f DNA d a m a g e s i t e s( W o u d s t r a e t a l , 1 9 9 6 ) . H o w e v e r , t h e r e s u l t s f r o m t h i s s t u d y i n d i -c a t e t h a t i n t h e c e r v i c a l t u m o u r l i n e s s t u d i e d h e r e t h e l e v e l o fi n i t i a l DNA d a m a g e d o e s n o t c o r r e s p o n d w i t h c l o n o g e n i cr a d i o s e n s i t i v i t y a f t e r HDR a n d LDR i r r a d i a t i o n ( T a b l e 3 ) .I n c o n t r a s t , W a r d ( 1 9 9 0 ) a r g u e d t h a t t h e y i e l d o f m o l e c u l a rl e s i o n s ( i n i t i a l d a m a g e ) i s i n d e p e n d e n t o f t u m o u r c e l l t y p e a n d t h a tr a d i a t i o n - s e n s i t i v e c e l l s a r e r e p a i r d e f i c i e n t , r e s u l t i n g i n d i f f e r e n tl e v e l s o f r e s i d u a l d a m a g e . H o w e v e r , i n o u r w o r k , t h e r e w e r e n os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n t h e s l o p e s o f t h e r e s i d u a l DNA d s bd o s e - r e s p o n s e c u r v e s f i t t e d b y l i n e a r r e g r e s s i o n a n d S F 2 a f t e rHDR a n d LDR i r r a d i a t i o n . N e v e r t h e l e s s o t h e r h u m a n t u m o u rs t u d i e s m e a s u r i n g DNA d s b s b y a s y m m e t r i c f i e l d - i n v e r s i o n g e le l e c t r o p h o r e s i s ( G i a c c i a e t a l , 1 9 9 2 ) a n d n e u t r a l f i l t e r e l u t i o n( Z a f f a r o n i e t a l , 1 9 9 4 ) h a v e i n d e e d s h o w n s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n sb e t w e e n t h e l e v e l o f r e s i d u a l d s b s a n d r a d i o s e n s i t i v i t y .A ne w f i n d i n g i n t h e p r e s e n t s t u d i e s w a s t h e s i g n i f i c a n t c o r r e l a -t i o n w i t h t h e e x t e n t o f d s b r e p a i r ( r a t i o o f i n i t i a l a n d r e s i d u a ls l o p e s ) a f t e r 1 6 h o f p o s t - i r r a d i a t i o n i n c u b a t i o n a n d r a d i o s e n s i -t i v i t y a f t e r HD R ( r = - 0 . 7 8 , P = 0 . 0 4 ) o r LDR ( r = - 0 . 8 6 , P = 0 . 0 3 )i r r a d i a t i o n ( F i g u r e 4 ) . DNA d s b r e p a i r m e a s u r e d u s i n g t h e n e u t r a lc o m e t a s s a y a n d c e l l u l a r r a d i o s e n s i t i v i t y w e r e f o u n d n o t t o c o r r e -l a t e i n a s t u d y b y O l i v e e t a l ( 1 9 9 2 ) , h o w e v e r o n e p o s s i b l e e x p l a -n a t i o n f o r t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e p r e s e n t s t u d y a n d t h a t o fO l i v e e t a l ( 1 9 9 2 ) may r e f l e c t t h e t i m e i n t e r v a l a l l o w e d f o r r e p a i r :

4 h i n t h e p r e v i o u s s t u d y a n d 1 6 h i n t h e p r e s e n t s t u d y . I t h a s b e e nn o t e d t h a t m e a s u r i n g r e s i d u a l DNA d s b s u s i n g t h e n e u t r a l c o m e ta s s a y a t 4 h may u n d e r e s t i m a t e t h e l e v e l o f DNA d a m a g e a s ar e s u l t o f t h e i n c r e a s e i n t h e p e r c e n t a g e o f S - p h a s e c e l l s a f t e r i r r a d i -a t i o n , a s S - p h a s e DNA m i g r a t e s i n e f f i c i e n t l y . T h i s w o u l d n o t b ee x p e c t e d i n t h e p r e s e n t s t u d y u s i n g a 1 6 h p e r i o d o f r e p a i r ( O l i v ee t a l , 1 9 9 4 ) .I n s u p p o r t o f t h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n S F 2 a n d r e p a i r c a p a c i t yr e p o r t e d h e r e , a n o n - s i g n i f i c a n t t r e n d w a s e v i d e n t b e t w e e n LDRS F 2 a n d t h e a b s o l u t e d i f f e r e n c e i n r e s i d u a l a n d i n i t i a l DNA d s b sa s s e s s e d f r o m a s i n g l e d o s e o f 6 0 Gy ( P = 0 . 0 9 ) a n d a s i g n i f i c a n tt r e n d o v e r t h e c o m p l e t e d o s e r a n g e s t u d i e d ( P = 0 . 0 3 ) ( F i g u r e 4Ba n d D ) . T h e s t r o n g e r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e l e v e l o f DNA d s b sa n d S F 2 m e a s u r e d a f t e r LDR i r r a d i a t i o n i s n o t u n e x p e c t e d a n dr e f l e c t s t h e p o t e n t i a l o f e a c h c e l l l i n e t o r e p a i r r a d i a t i o n - i n d u c e dDNA d s b s d u r i n g e x p o s u r e . A c o r r e l a t i o n b e t w e e n r a d i o s e n s i t i v i t ya n d l e v e l o f d s b s i n f o u r h i s t o l o g i c a l l y r e l a t e d t u m o u r c e l l l i n e sh a s b e e n r e p o r t e d p r e v i o u s l y a f t e r l o w - do s e - ra t e b u t n o t a t h i g h -d o s e - r a t e i r r a d i a t i o n u s i n g PGFE ( C a s s o n i e t a l , 1 9 9 2 ) .

T h e a p p r o a c h o f e x a m i n i n g t h e u n r e p a i r e d DNA d s b f r a c t i o n b yt a k i n g a r a t i o o f d o s e - r e s p o n s e c u r v e s l o p e s ( t h e r e b y a s s e s s i n gd a m a g e f r o m a r a n g e o f m u l t i p l e d o s e p o i n t s ) m i n i m i z e s v a r i -a b i l i t y b e t w e e n e x p e r i m e n t s o n t h e d i f f e r e n t c e l l l i n e s a n ds u g g e s t s t h a t i t i s o n l y b y d o i n g s o t h a t a s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n c a nb e s e e n b e t w e e n HDR S F 2 a n d DNA d s b r e p a i r c a p a c i t y a sm e a s u r e d b y t h e n e u t r a l c o m e t a s s a y . R e c e n t l y , we h a v e a l s o f o u n da s t r o n g c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e r a t i o o f s l o p e s o f i n i t i a l / r e s i d u a lDNA d s b d o s e - r e s p o n s e c u r v e s a n d r a d i o s e n s i t i v i t y a f t e r HDRi r r a d i a t i o n f o r n i n e n o r m a l f i b r o b l a s t s t r a i n s d e r i v e d f r o m v a g i n a lb i o p s i e s f r o m p r e t r e a t m e n t c a n c e r p a t i e n t s ( r = 0 . 8 0 , P = 0 . 0 1 )( M a r p l e s e t a l , 1 9 9 7 ) . I t i s n o t c l e a r y e t w h e t h e r t h e i m p o r t a n c e o ft h e u n r e p a i r e d f r a c t i o n o f DNA d s b s i s r e l a t e d t o , f o r e x a m p l e ,DNA p l o i d y , p o s s i b l e i n f l u e n c e o f c h r o m a t i n s t r u c t u r e / D N A o r g a -n i z a t i o n o n t h e t r a n s l a t i o n o f r e s i d u a l DNA d a m a g e i n t o p o t e n -t i a l l y l e t h a l e v e n t s o r o n t h e t o l e r a n c e o f c e l l s t o g e n e t i c i n j u r y .A l t e r n a t i v e l y , a s s e s s i n g r e p a i r c a p a c i t y b y t h e r a t i o o f d a m a g e( i n i t i a l / r e s i d u a l ) may r e l a t e t o m i s r e p a i r o f r a d i a t i o n - i n d u c e d DNAd s b s . S u c h p o s s i b i l i t i e s w i l l r e q u i r e f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n .A r e v i e w o f t h e l i t e r a t u r e ( s e e I n t r o d u c t i o n ) i l l u s t r a t e s t h ed i s p a r a t e f i n d i n g s o v e r t h e p o s s i b l e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n DNA d s bd a m a g e a n d c l o n o g e n i c m e a s u r e s o f r a d i o s e n s i t i v i t y . T h e r e i sc l e a r l y s o m e r e l a t i o n s h i p b u t t h e q u e s t i o n o f i n t e r e s t i s w h i c hp a r a m e t e r i s t h e m o s t i m p o r t a n t c o m p o n e n t ( i n i t i a l o r r e s i d u a ld a m a g e , r a t i o o f d a m a g e , r a t e o f r e p a i r , t i m e a t w h i c h r e p a i r i sa s s a y e d , e t c . ) . T h e b a l a n c e o f e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t r e s i d u a ld a m a g e i s l i k e l y t o b e t h e m o s t c r i t i c a l a s p e c t b u t , i n v i e w o f t h ep u b l i s h e d d a t a , t h e s i g n i f i c a n c e o f i n i t i a l d a m a g e c a n n o t y e t b ed i s c o u n t e d . T h e d i v e r g e n t r e s u l t s may r e l a t e t o d i f f e r e n c e s i n t h ea s s a y s u s e d t o s c o r e DNA d s b d a m a g e a n d / o r e x p e r i m e n t a l d e s i g n( e . g . s e l e c t i o n a n d n u m b e r o f c e l l l i n e s , d o s e s u s e d , t i m e a l l o w e df o r r e p a i r ) . I n a n a t t e m p t t o o v e r c o m e s o m e o f t h e l i m i t a t i o n s o fo t h e r s t u d i e s , w e h a v e s e l e c t e d a l a r g e s e r i e s o f c e l l l i n e s o f t h es a m e h i s t o l o g i c a l o r i g i n ( s e v e n h u m a n c e r v i c a l c a r c i n o m a c e l ll i n e s ) a n d h a v e a s s e s s e d b o t h i n i t i a l a n d r e s i d u a l D NA d a m a g eo v e r a r a n g e o f r a d i a t i o n d o s e s . I n d o i n g s o , w e h a v e d e m o n s t r a t e da s i g n i f i c a n t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e r a t i o o f i n i t i a l a n d r e s i d u a lr a d i a t i o n - i n d u c e d DNA d s b s , m e a s u r e d u s i n g t h e n e u t r a l c o m e ta s s a y , a n d c e l l u l a r r a d i o s e n s i t i v i t y m e a s u r e d u s i n g a c l o n o g e n i ca s s a y . I t i s l i k e l y t h a t t h e c o n t i n u e d i m p r o v e m e n t s o f a s s a y c o n d i -t i o n s may i m p r o v e t h i s f u r t h e r , e . g . m o r e s e n s i t i v e D N A - b i n d i n gd y e s , m o r e o p t i m a l l y s i n g c o n d i t i o n s . T h e w o r k s u p p o r t s t h e

B r i t i s h J o u r n a l o f C a n c e r ( 1 9 9 8 ) 7 7 ( 7 ) , 1 1 0 8 - 1 1 1 4C a n c e r R e s e a r c h C a m p a i g n 1 9 9 8


7/7

1 1 1 4 B M a r p l e s e t a lc o n t i n u e d u s e o f t h e n e u t r a l c o m e t a s s a y a s a p o t e n t i a l r a p i dp r e d i c t i v e t e s t f o r t u m o u r r a d i o s e n s i t i v i t y i n r a d i o t h e r a p y .ACKNOWLEDGEMENTST h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h e A s s o c i a t i o n f o r I n t e r n a t i o n a lC a n c e r R e s e a r c h a n d t h e C a n c e r R e s e a r c h C a m p a i g n , U K . T h ea s s i s t a n c e o f Mr J B a r r y i n c a r r y i n g o u t t h e f l o w c y t o m e t r i cm e a s u r e m e n t s i s a c k n o w l e d g e d . We p a r t i c u l a r l y t h a n k D r P e g g yO l i v e ( M e d i c a l B i o p h y s i c s , B r i t i s h C o l o m b i a C a n c e r R e s e a r c hC e n t r e , V a n c o u v e r , C a n a d a ) f o r d i s c u s s i o n o f t h e c o m e t a s s a y d a t a .A l s o , t h e a u t h o r s w o u l d l i k e t o t h a n k t h e s t a f f a n d c u s t o m e r s a t A s d a( C h a d d e r t o n , UK ) f o r f u n d s t o p u r c h a s e t h e i m a g e a n a l y s i s s y s t e m .REFERENCESA s h b y J , T i n w e l l H , L e f e v r e PA a n d B r o w n e MA ( 1 9 9 5 ) T h e s i n g l e c e l l g e le l e c t r o p h o r e s i s a s s a y f o r i n d u c e d DNA d a m a g e ( c o m e t a s s a y ) : m e a s u r e m e n t o ft a i l l e n g t h a n d m o m e n t . M u t a g e n e s i s 1 0 : 8 5 - 9 0C a s s o n i AM, M c M i l l a n T J , P e a c o c k JH a n d S t e e l G G ( 1 9 9 2 ) D i f f e r e n c e s i n t h el e v e l o f DNA d o u b l e - s t r a n d b r e a k s i n h u m a n t u m o u r c e l l l i n e s f o l l o w i n g l o wd o s e - r a t e i r r a d i a t i o n . E u r J C a n c e r 2 8 A : 1 6 1 0 - 1 6 1 4F a i r b a i m DW, O l i v e PL a n d O ' N e i l l KL ( 1 9 9 5 ) T h e c o m e t a s s a y : a c o m p r e h e n s i v er e v i e w . M u t a t R e s 3 3 9 : 3 7 - 5 9G i a c c i a A J , S c h w a r t z J , S h i e h J a n d B r o w n J M ( 1 9 9 2 ) T h e u s e o f a s y m m e t r i c - f i e l di n v e r s i o n g e l e l e c t r o p h o r e s i s t o p r e d i c t t u m o r c e l l r a d i o s e n s i t i v i t y . R a d i o t h e rO n c o l 2 4 : 2 3 1 - 2 3 8K e l l a n d L R , E d w a r d s SM a n d S t e e l G G ( 1 9 8 8 ) I n d u c t i o n a n d r e j o i n i n g o f DNAd o u b l e - s t r a n d b r e a k s i n h u m a n c e r v i x c a r c i n o m a c e l l l i n e s o f d i f f e r i n gr a d i o s e n s i t i v i t y . R a di a t R e s 1 1 6 : 5 2 6 - 5 3 8K i l t i e A E , O r t o n C J , R y a n A , R o b e r t s S A , M a r p l e s B , D a v i d s o n S E, H u n t e r R D ,M a r g i s o n G , W e s t CML a n d H e n d r y J H ( 1 9 9 7 ) A c o r r e l a t i o n b e t w e e n DNAd a m a g e a n d c l o n o g e n i c m e a s u r e m e n t s o f r a d i o s e n s i t i v i t y i n f i b r o b l a s t s f r o mp r e - r a d i o t h e r a p y c e r v i x c a n c e r p a t i e n t s . I n t J R a d i a t O n c o l B i o l P h y s 3 9 :1 1 3 7 - 1 1 4 4M c K a y ML a n d K e f f o r d RF ( 1 9 9 5 ) T h e s p e c t r u m o n i n v i t r o r a d i o s e n s i t i v i t y i n f o u rh u m a n m e l a n o m a c e l l l i n e s i s n o t a c c o u n t e d f o r b y d i f f e r e n t i a l i n d u c t i o n o rr e j o i n i n g o f DNA d o u b l e - s t r a n d b r e a k s . I n t J R a d i a t O n c o l B i o l P h y s 3 1 :3 4 5 - 3 5 2M c M i l l a n T J , C a s s o n i AM, E d w a r d s S , H o l m e s A a n d P e ac o ck JH ( 1 9 9 0 ) T h er e l a t i o n s h i p o f DNA d o u b l e - s t r a n d b r e a k i n d u c t i o n t o r a d i o s e n s i t i v i t y i n h u m a nt u m o u r c e l l l i n e s . I n t J R a d i a t B i o l 5 8 : 4 2 7 - 4 3 8M a r p l e s B a n d J o i n e r MC ( 1 9 9 3 ) T h e r e s p o n s e o f C h i n e s e h a m s t e r V79 c e l l s t o l o wr a d i a t i o n d o s e s : e v i d e n c e o f e n h a n c e d s e n s i t i v i t y o f t h e w h o l e c e l l p o p u l a t i o n .R a d i a t R e s 1 3 3 : 4 1 - 5 1M a r p l e s B , E a s t h a m AM, K i l t i e A E , O r t o n J C a n d W e s t CML ( 1 9 9 7 ) F i b r o b l a s tr a d i o s e n s i t i v i t y m e a s u r e d u s i n g t h e c o m e t a s s a y c o r r e l a t e s w i t h c l o n o g e n i cs u r v i v a l p a r a m e t e r s . ( I n p r e p a r a t i o n )N u n e z M I , M c M i l l a n T J , V a l e n z u e l a M T , R u i z d e A l m o d o v a r J M a n d P e d r a z a V( 1 9 9 6 ) R e l a t i o n s h i p b e t w e e n DNA d a m a g e , r e j o i n i n g a n d c e l l k i l l i n g b yr a d i a t i o n i n m a m m a l i a n c e l l s . R a d i o t h e r O n c o l 3 9 : 1 5 5 - 1 6 5O l e i n i c k N L , C h i u S a n d F r i e d m a n LR ( 1 9 8 4 ) Gamma i r r a d i a t i o n a s a p r o b e o fc h r o m a t i n s t r u c t u r e : d a m a g e a n d r e p a i r o f c h r o m a t i n i n t h e m e t a p h a s ec h r o m o s o m e . R a d i a t R e s 9 8 : 6 2 9 - 6 4 1

O l i v e PL a n d B a n a t h J P ( 1 9 9 3 ) I n d u c t i o n a n d r e j o i n i n g o f r a d i a t i o n i n d u c e d DNAs i n g l e - s t r a n d b r e a k s : t a i l m o m e n t a s a f u n c t i o n o f p o s i t i o n i n t h e c e l l c y c l e .M u t at R e s (DNA r e p a i r ) 2 9 4 : 2 7 5 - 2 8 3

O l i v e P L , W l o d e k D a n d B a n a t h J P ( 1 9 9 1 ) DNA d o u b l e s t r a n d b r e a k s m e a s u r e d i ni n d i v i d u a l c e l l s s u b j e c t e d t o g e l e l e c t r o p h o r e s i s . C a n c e r R e s 5 1 : 4 6 7 1 - 4 6 7 6O l i v e P L , D u r a n d R E , W l o d e k D a n d B a n a t h J P ( 1 9 9 2 ) F a c t o r s i n f l u e n c i n g DNAm i g r a t i o n f r o m i n d i v i d u a l c e l l s s u b j e c t e d t o g e l e l e c t r o p h o r e s i s . E x p C e l l R e s1 9 8 : 2 5 9 - 2 6 7O l i v e P L , B a n a th J P a n d M a c P h a i l HS ( 1 9 9 4 ) L a c k o f a c o r r e l a t i o n b e t w e e nr a d i o s e n s i t i v i t y a n d DNA d o u b l e - s t r a n d b r e a k i n d u c t i o n o r r e j o i n i n g i n s i xh u m a n t u m o u r c e l l l i n e s . C a n c e r R e s 5 4 : 3 9 3 9 - 3 9 4 6O r m e r o d MG ( 1 9 9 0 ) A n a l y s i s o f DNA: g e n e r a l m e t h o d s . I n F l o w C y t o m e t r y : AP r a c t i c a l A p p r o a c h , O r m e r o d MG . ( e d . ) , p p . 6 9 - 8 7 . O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s :Ne w Y o r kP e a c o c k J M , E a d y J J , E d w a r d s S , H o l m e s A , M c M i l l a n T J a n d S t e e l G G ( 1 9 8 9 )I n i t i a l d a m a g e a n d r e p a i r a s t h e m a j o r d e t e r m i n a n t o f c e l l u l a r r a d i o s e n s i t i v i t y .I n t J R a d i a t B i o l 5 6 : 5 4 3 - 5 4 7P o w e l l SN a n d M c M i l l a n T J ( 1 9 9 4 ) T h e r e p a i r f i d e l i t y o f r e s t r i c t i o n

e n z y m e - i n d u c e d d o u b l e s t r a n d b r e a k s i n p l a s m i d DNA c o r r e l a t e w i t hr a d i o r e s i s t a n c e i n h u m a n t u m o u r c e l l l i n e s . I n t J R a d i a t O n c o l B i o l P h y s 2 9 :1 0 3 5 - 1 0 4 0P o w e l l S N , W h i t a k e r S J , E d w a r d s SM a n d M c M i l l a n T J ( 1 9 9 2 ) A DNA r e p a i rd e f e c t i n a r a d i a t i o n - s e n s i t i v e c l o n e o f a h u m a n b l a d d e r c a r c i n o m a c e l l l i n e .B r J C a n c e r 6 5 : 7 9 8 - 8 0 2R u i z d e A l m o d 6 v a r J M R , N u n e z M I , M c M i l l a n T J , O l e a N , M o r t C , V i l l a l o b o s M ,

P e d r a z a V a n d S t e e l GG ( 1 9 9 4 ) I n i t i a l r a d i a t i o n - i n d u c e d DNA d a m a g e i nh u m a n t u m o u r c e l l l i n e s : a c o r r e l a t i o n w i t h i n t r i n s i c c e l l u l a r r a d i o s e n s i t i v i t y .B r J C a n c e r 6 9 : 4 5 7 - 4 6 2S c h w a r t z J L , R o t m e n s c h J , G i o v a n a z z i S M , C o h e n MB a n d W e i c h s e l b a u m RR( 1 9 8 8 ) F a s t e r r e p a i r o f DNA d o u b l e - s t r a n d b r e a k s i n r a d i o r e s i s t a n t h u m a n

t u m o u r c e l l s . I n t J R a d i a t O n c o l B i o l P h y s 1 5 : 9 0 7 - 9 1 2S m e e t s M F , M o o r e n EH a n d B e g g AC ( 1 9 9 3 ) R a d i a t i o n - i n d u c e d DNA d a m a g e a n dr e p a i r i n r a d i o s e n s i t i v e a n d r a d i o r e s i s t a n t h u m a n t u m o u r c e l l s m e a s u r e d b yf i e l d i n v e r s i o n g e l e l e c t r o p h o r e s i s . I n t J R a d i a t B i o l 6 3 : 7 0 3 - 7 1 3W a r d J F ( 1 9 9 0 ) T h e y i e l d o f DNA d o u b l e - s t r a n d b r e a k s p r o d u c e d i n t r a c e l l u l a r l y b yi o n i s i n g r a d i a t i o n : a r e v i e w . I n t J R a d i a t B i o l 5 7 : 1 1 4 1 - 1 1 5 0W e s t CML ( 1 9 9 5 ) I n t r i n s i c r a d i o s e n s i t i v i t y a s a p r e d i c t o r o f p a t i e n t r e s p o n s e t or a d i o t h e r a p y . B r J R a d i o l 6 8 : 8 2 7 - 8 3 7W e s t CML, D a v i d s o n S E , R o b e r t s SA a n d H u n t e r RD ( 1 9 9 7 ) T h ei n d e p e n d e n c e o f i n t r i n s i c r a d i o s e n s i t i v i t y a s a p r o g n o s t i c f a c t o r f o r p a t i e n t

r e s p o n s e t o r a d i o t h e r a p y o f c a r c i n o m a o f t h e c e r v i x . B r J C a n c e r 7 6 :1 1 8 4 - 1 1 9 0W h i t a k e r S J , U n g Y a n d M c M i l l a n T J ( 1 9 9 5 ) DNA d o u b l e - s t r a n d b r e a k i n d u c t i o n

a n d r e j o i n i n g a s d e t e r m i n a n t s o f h u m a n t u m o u r r a d i o s e n s i t i v i t y . I n t J R a d i a tB i o l 6 7 : 7 - 1 8W i l k s D P , B a r r y J , H u g h e s MF a n d W e s t CML ( 1 9 9 6 ) A s s e s s m e n t o f l i g h t s c a t t e r b yn u c l e o i d s a s a r a p i d p r e d i c t i v e a s s a y o f r a d i o s e n s i t i v i t y . R a d i a t R e s 1 4 6 :6 2 8 - 6 3 5W ou d s t r a E C , B r u n s t i n g J F , R o e s i n k J M , K o n i n g s SW a n d K a m p i n g a HH ( 1 9 9 6 )R a d i a t i o n i n d u c e d DNA d a m a g e r e p a i r i n t h r e e h u m a n t u m o u r c e l l l i n e s . M u t a tR e s 3 6 2 : 5 1 - 5 9Wurm R , B u m e t N G , D u g g a l N , Y a m o l d J R a n d P e a c o c k J H ( 1 9 9 4 ) C e l l u l a rr a d i o s e n s i t i v i t y a n d DNA d a m a g e i n p r i m a r y h u m a n f i b r o b l a s t s . I n t J R a d i a tO n c o l B i o l P h y s 3 0 : 6 2 5 - 6 3 3Z a f f a r o n i N , O r l a n d i L , V i l l a R , B e a r z a t t o A , R o f s t a d EK a n d S i l v e s t r i n i R ( 1 9 9 4 )DNA d o u b l e - s t r a n d b r e a k r e p a i r a n d r a d i a t i o n r e s p o n s e i n h u m a n t u m o u rp r i m a r y c u l t u r e s . I n t J R a d i a t B i o l 6 6 : 2 7 9 - 2 8 5

B r i t i s h J o u r n a l o f C a n c e r ( 1 9 9 8 ) 7 7 ( 7 ) , 1 1 0 8 - 1 1 1 4 C C a n c e r R e s e a r c h C a m p a i g n 1 9 9 8

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