8/8/2019 Cell Division and Embryo Genesis

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P l a n t P h y s i o l . ( 1 9 8 5 ) 7 9 , 9 0 - 9 40 0 3 2 - 0 8 8 9 / 8 5 / 7 9 / 0 0 9 0 / 0 5 / $ 0 1 . 0 0 / 0

S t u d i e s o n C o n d i t i o n s f o r C e l l D i v i s i o n a n d E m b r y o g e n e s i s i nI s o l a t e d P o l l e n C u l t u r e o f N i c o t i a n a r u s t i c a lR e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n J u l y 3 , 1 9 8 4 a n d i n r e v i s e d f o r m May 9 , 1 9 8 5

MASAHARU K Y o * A ND H I R O S H I HARADAI n s t i t u t e o f B i o l o g i c a l S c i e n c e s , T h e U n i v e r s i t y o f T s u k u b a , S a k u r a - m u r a , I b a r a k i 3 0 5 , J a p a nABSTRACT

A m e t h o d f o r t h e i n d u c t i o n o f a h i g h r a t e o f c e l l d i v i s i o n a n d e m b r y o -g e n e s i s o f N i c o t i a n a r u s t i c a p o l l e n w a s d e v e l o p e d . B i n u c l e a t e p o l l e ng r a i n s w e r e f r a c t i o n a t e d b y P e r c o l l d e n s i t y g r a d i e n t ( 3 5 / 4 5 % ) c e n t r i f u -g a t i o n a n d c u l t u r e d i n OA m o l a r m a n n i t o l a t 3 0 C ( t h e f i r s t c u l t u r e ) .A f t e r 3 d a y s i n c u l t u r e p o l l e n w a s r e c o l l e c t e d b y a s e c o n d P e r c o l lf r a c t i o n a t i o n ( 0 / 3 0 % ) a n d t r a n s f e r r e d t o a n d c u l t u r e d i n a m e d i u mc o n t a i n i n g t h e M u r a s h i g e - S k o o g m a c r o - e l e m e n t s , OA m o l a r m a n n i t o l ,4 0 m i l l i m o l a r g a p a t o s e , 3 m i l l i m o l a r g l u t a m i n e , a n d 5 m i c r o m o l a r A B Af o r 1 0 d a y s ( t h e s e c o n d c u l t u r e ) . T h e c e l l p o p u l a t i o n c o n s i s t i n g o f a b o u t80% d i v i d i n g p o l l e n w a s t r a n s f e r r e d t o a M u r a s h i g e - S k o o g m e d i u mc o n t a i n i n g OA m o l a r m a n n i t o l , 3 m i l l i m o l a r g l u t a m i n e , a n d n o p h y t o h o r -m o n e ( t h e t h i r d c u l t u r e ) w h e r e a b o u t 40% o f d i v i d i n g p o l l e n d e v e l o p e di n t o e m b r y o s o r e m b r y o g e n i c c a l l i .

N u m e r o u s s t u d i e s h a v e d e m o n s t r at e d i n v i t r o e m b r y o g e n e s i se i t h e r t h r o u g h a n t h e r c u l t u r e o r p o l l e n c u l t u r e ( 5 ) . H o w e v e r ,t h e i n d u c t i o n m e c h a n i s m o f p o l l e n e m b r y o g e n e s i s i s e n t i r e l yu n k n o w n . T h e m e t h o d m o s t w i d e l y u s e d h a s b e e n a n t h e r c u l t u r e ,w h e r e a m a j o r i t y o f p o l l e n g r a i n s l o s e t h e i r v i a b i l i t y a n d a l i m i t e dn u m b e r s h o w e m b r y og e n i c r e s p o n s e . I t i s a l s o p o s s i b l e t o i n d u c ee m b r y o s f r o m t h e i s o l a t e d p o l l e n ( 7 , 9 , 1 2 - 1 4 ) . I n t h e s e c a s e st h e p r e c u l t u r e o f a n t h e r s o r c o l d t r e a t m e n t o f f l o w e r b u d s ( 9 )p r i o r t o i s o l a t i o n o f p o l l e n g r a i n s h a s g e n e r a l l y b e e n r e q u i r e d .T h u s , p r e v i o u s l y r e p o r t e d c u l t u r e m e t h o d s h a v e n o t b e e n s u i t a b l ef o r p r e c i s e s t u d y o f t h e i n i t i a l s t a g e s o f p o l l e n e m b r y o g e n e s i s .R e c e n t l y , I m a m u r a e t a l . ( 4 ) a n d G h a n d i m a t h i ( 2 ) w e r e s u c -c e s s f u l i n t h e i n d u c t i o n o f e m b r y o s f r o m i s o l a t e d p o l l e n o fN i c o t i a n a p l a n t s w i t h o u t a n y p r e t r e a t m e n t o f t h e a n t h e r s o rb u d s . I m m a t u r e p o l l e n g r a i n s w e r e c u l t u r e d i n w a t e r f o r a f e wd a y s , a f t e r w h i c h b a s i c n u t r i e n t s w e r e s u p p l i e d . T h e f r e q u e n c yo f e m b r y o g e n e s i s i n t h e s e i s o l a t e d p o l l e n c u l t u r e s w a s s i m i l a r t ot h o s e r e p o r t e d b y o t h e r m e t h o d s . N e v e r t h e l e s s , t h i s m e t h o ds e e m e d s u i t a b l e f o r s t u d y o f t h e e a r l y e v e n t s r e s p o n s i b l e f o rp o l l e n e m b r y o g e n e s i s . T h e r e f o r e , we h a v e a t t e m p t e d t o e s t a b l i s ha m e t h o d w h e r e b y h i g h r a t e s o f c e l l d i v i s i o n a n d e m b r y o g e n e s i sf r o m N i c o t i a n a r u s t i c a p o l l e n w e r e p o s s i b l e .

MATERIALS AND M E T H O D SP l a n t M a t e r i a l s . P l a n t s o f N i c o t i a n a r u s t i c a ( s e e d s w e r e s u p -p l i e d b y I w a t a E x p e r i m e n t a l S t a t i o n , J a p a n M o n o p o l y C o r p . )w e r e g r o w n i n a g r e e n h o u s e , b u t s e a s o n a l d i f f e r e n c e s i n t h es u c c e s s f u l p o l l e n c u l t u r e w e r e e x p e r i e n c e d . D a t a p r e s e n t e d i nt h i s p a p e r w e r e o b t a i n e d f r o m p l a n t s g r o w n m a i n l y i n w i n t e r' S u p p o r t e d b y a G r a n t - i n - A i d f o r S p e c i a l P r o j e c t R e s e a r c h f r o m t h eM i n i s t r y o f E d u c a t i o n , S c i e n c e a n d C u l t u r e ( P r o j e c t N o . 5 9 4 8 0 0 2 3 ) .

( N o v e m b e r t o F e b r u a r y ) w h e n t h e m o s t r e p r o d u c i b l e r e s u l t sw e r e o b t a i n e d .G e n e r a l P r o c e d u r e f o r P r e p a r a t i o n a n d C u l t u r e o f I s o l a t e dP o l l e n . T h e f o l l o w i n g w a s a s t a n d a r d p r o c e d u r e e s t a b l i s h e d b yt h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n . D e t a i l s o f t h e m a n i p u l a t i o n w i l l b ed e s c r i b e d i n e a c h e x p e r i m e n t .I s o l a t i o n o f P o l l e n G r a i n s . P o l l e n w a s i s o l a t e d b y a m e t h o ds i m i l a r t o t h e o n e d e s c r i b e d b y N i t s c h ( 7 ) . F l o w e r b u d s w h o s ec o r o l l a l e n g t h w a s 6 t o 9 mm w e r e c o l l e c t e d . A n t h e r s w e r ee x c i s e d f r o m b u d s a n d i m m e r s e d i n 8% N a O C I f o r 1 0 m i n , t h e nw a s h e d w i t h s t e r i l i z e d , d i s t i l l e d H 2 0 . P o l l e n g r a i n s w e r e i s o l a t e df r o m a n t h e r s b y g e n t l y g r i n d i n g w i t h a p e s t l e i n 0 . 4 M m a n n i t o ls o l u t i o n , f o l l o w e d b y f i l t r a t i o n t h r o u g h n y l o n m e s h ( 5 3 r m p o r es i z e ) . P o l l e n g r a i n s w e r e w a s h e d t w i c e b y c e n t r i f u g a t i o n ( 1 5 0 g ; 1m i n ) . F i n a l l y , p e l l e t s ( p o l l e n g r a i n s ) w e r e s u s p e n d e d i n 1 m l o f0 . 4 M m a n n i t o l .P e r c o l l F r a c t i o n a t i o n o f P o l l e n G r a i n s . P o l l e n g r a i n s w e r ef u r t h e r f r a c t i o n a t e d b y P e r c o l l d i s c o n t i n u o u s d e n s i t y g r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n . A l - m l s u s p e n s i o n o f p o l l e n w a s l a y e r e d o n 1 . 5m l e a c h o f 3 5 % ( t o p ) - 4 5 % ( b o t t o m ) P e r c o l l s o l u t i o n c o n t a i n i n g0 . 4 M m a n n i t o l . F o l l o w i n g c e n t r i f u g a t i o n ( 4 5 0 g ; 5 m i n ) , p o l l e ng r a i n s r e m a i n i n g a t t h e i n t e r f a c e o f t h e 3 5 / 4 5 % P e r c o l l w e r ec o l l e c t e d w i t h a p i p e t t e . T h e s e w e r e w a s h e d t w i c e w i t h 0 . 4 Mm a n n i t o l b y c e n t r i f u g a t i o n ( 1 5 0 g ; 1 m i n ) .

C u l t u r e M e t h o d s . F i r s t C u l t u r e . P o l l e n g r a i n s o b t a i n e d b y t h eP e r c o l l f r a c t i o n a t i o n w e r e s u s p e n d e d i n 0 . 4 M m a n n i t o l a t 3 xI 0 4 g r a i n s / m l a n d c u l t u r e d i n a P e t r i d i s h f o r 3 d . U n l e s so t h e r w i s e m e n t i o n e d e a c h c u l t u r e w a s a d j u s t e d t o t h e c e l l d e n s i t yi n d i c a t e d a b o v e a n d p l a c e d a t 30C i n t h e d a r k .S e c o n d C u l t u r e . A f t e r t h e f i r s t c u l t u r e , p o l l e n w a s r e c o l l e c t e db y c e n t r i f u g a t i o n ( 1 5 0 g ; I m i n ) a n d s u s p e n d e d i n 0 . 4 M m a n n i t o lc o n t a i n i n g M S 2 m a c r o - e l e m e n t s ( 6 ) , 4 0 mM g a l a c t o s e , a n d 3 mMg l u t a m i n e ; pH o f t h e m e d i u m w a s a d j u s t e d t o 6 . 8 , a s r e c o m -m e n d e d b y R a s h i d a n d R e i n e r t ( 1 0 ) . Two m l o f t h e p o l l e ns u s p e n s i o n w a s p i p e t t e d i n t o a P e t r i d i s h ( 3 . 5 cm i n d i a m e t e r ) .I n s o m e e x p e r i m e n t s , t h e s e c o n d c u l t u r e w a s c o m m e n c e d s i m p l yb y a d d i n g n u t r i e n t s t o t h e f i r s t c u l t u r e . No s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e si n t h e e f f i c i e n c y o f p o l l e n d i v i s i o n s w e r e o b s e r v e d b y u s i n g t h ea l t e r n a t i v e m e t h o d .T h i r d C u l t u r e . T e n d a f t e r t h e b e g i n n i n g o f t h e s e c o n d c u l t u r e ,c e l l s ( p o l l e n g r a i n s ) w e r e c o l l e c t e d a n d w a s h e d b y c e n t r i f u g a t i o n( I 5 0 g ; I m i n ) , t h e n r e s u s p e n d e d i n M S m e d i u m l a c k i n g p h y t o -h o r m o n e b u t c o n t a i n i n g 0 . 4 M m a n n i t o l a n d 3 mM g l u t a m i n e( p H 5 . 8 ) .P o l l e n V i a b i l i t y . P o l l e n s i z e a n d f l u o r e s c e n t d y e s t a i n i n g w e r et h e c r i t e r i a e m p l o y e d t o d i s c r i m i n a t e p o l l e n v i a b i l i t y . L i v i n gp o l l e n w a s s t a i n e d w i t h f l u o r e s c e i n d i a c e t a t e ( 0 . 1 m g / m l ) , w h i l ed e a d , s h r i v e l e d p o l l e n d i d n o t f l u o r e s c e u n d e r t h e f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e .P o l l e n D i v i s i o n . D i v i s i o n o f p o l l e n w a s a l w a y s a s s o c i a t e d w i t h2 A b b r e v i a t i o n : M S , M u r a s h i g e - S k o o g .

9 0

8/8/2019 Cell Division and Embryo Genesis

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CO NDI TI O N S FOR POLLEN CELL DIVISION AND EMBRYOGENESIST a b l e I . P e r c o l l F r a c t i o n a t i o n o f P o l l e n P r i o r t o t h e F i r s t C u l t u r e a n dt h e P e r c e n t a g e o f D i v i d i n g P o l l e n i n R e s p e c t i v e F r a c t i o n s

I n t h i s c a s e t h e s e c o n d c u l t u r e w a s c o m m e n c e d s i m p l y b y a d d i n gn u t r i e n t s t o t h e f i r s t c u l t u r e . T h e d i v i d i n g p o l l e n w a s c o u n t e d 3 w e e k sa f t e r t h e c u l t u r e .V i a b i l i t yF r a c t i o n N o . P e r c o l l P o l l e n a D i v i d i n g P o l l e nI b I I F

I 0 / 3 5 6 9 2 8 4 6 ( 3 - 1 O ) dI I 3 5 / 4 0 1 0 8 4 8 3 3 4 ( 2 8 - 4 0 )I I I 4 0 / 4 5 1 4 7 6 5 7 3 8 ( 3 2 - 4 4 )I V 4 5 / 5 0 2 1 2 2 1 4 7 ( 4 - 1 1 )V 5 0 / 5 5 1 7 1 2 7 1 ( 0 - 4 )V I 5 5 / 3 2 3 2 5 1 ( 0 - 4 )T h e p e r c e n t a g e o f t o t a l p o l l e n f o u n d i n c o r r e s p o n d i n g f r a c -t i o n s . b A t t h e b e g i n n i n g o f t h e f i r s t c u l t u r e . c A t t h e e n d o f t h ef i r s t c u l t u r e . d N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e 95% c o n f i d e n c e i n t e r v a l sf o r a b i n o m i n a l d i s t r i b u t i o n .

F I G . 1 . M i c r o s c o p i c v i e w o f d i v i d i n g p o l l e n a t d a y 1 0 i n t h e s e c o n dc u l t u r e . F o l l o w i n g t h e f i r s t c u l t u r e , t h e p o l l e n o b t a i n e d b y t h e s e c o n dP e r c o l l f r a c t i o n a t i o n ( 0 / 3 0 % ) w a s c u l t u r e d i n t h e medium c o n t a i n i n gt h e M S m a c r o - e l e m e n t s , 0 . 4 M m a n n i t o l , 4 0 mM g a l a c t o s e , 5 F M A B A ,a n d 3 mM g l u t a m i n e ( p H 6 . 8 ) . D i v i d i n g p o l l e n ( A ) w as s t a i n e d b y 4 ' , 6 -d i a m i d i n o - p h e n y l i n d o l e a n d o b s e r v e d u n d e r a f l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e( B ) . N o t e t h e n u c l e i s t r o n g l y s t a i n e d . B a r s = 5 0 ,m.t h e f o r m a t i o n o f s e p t a ( F i g . I A ) . The presence o f n u c l e i i nd a u g h t e r c e l l s w a s c o n f i r m e d b y s t a i n i n g w i t h 4 ' , 6 - d i a m i d i n o - 2 -p h e n y l i n d o l e ( 5 g g / m l ) a f t e r e t h a n o l f i x a t i o n ( F i g . 1 B ) .

RESULTSP e r c o l l F r a c t i o n a t i o n . I n p r e v i o u s w o r k ( 4 ) , t o t a l p o l l e n w a su s e d f o r i n v i t r o c u l t u r e , b u t t h e f r e q u e n c y o f d i v i d i n g p o l l e n w a sn o t s u f f i c i e n t l y h i g h f o r t h e s t u d y o f p o l l e n e m b r y o g e n e s i s . T h u s ,P e r c o l l d e n s i t y g r a d i e n t ( 0 / 3 5 / 4 0 / 4 5 / 5 0 / 5 5 % ) c e n t r i f u g a t i o n

w a s e m p l o y e d i n o r d e r t o c o l l e c t a u n i f o r m p o l l e n p o p u l a t i o nw h i c h m i g h t r e s u l t i n h i g h c e l l d i v i s i o n f r e q u e n c y . P o l l e n r e -m a i n i n g i n i n t e r p h a s e s o f t h e 3 5 / 4 0 % P e r c o l l a n d t h e 4 0 / 4 5 %P e r c o l l gave t h e h i g h e s t r a t e o f d i v i d i n g p o l l e n ( T a b l e I ) . T h ef r a c t i o n s r i c h i n v i a b l e p o l l e n t e n d e d t o s h o w h i g h e r d i v i s i o nc a p a c i t y w i t h e x c e p t i o n o f t h e t o p f r a c t i o n ( 0 / 3 5 % ) . T hu s , p o l l e nc o l l e c t e d f r o m 3 5 / 4 5 % P e r c o l l w a s u s e d f o r t h e f o l l o w i n g e x p e r -i m e n t s .M a n n i t o l C o n c e n t r a t i o n . E f f e c t o f m a n n i t o l i n t h e medium o np o l l e n v i a b i l i t y a n d d i v i s i o n i n t h e f i r s t a n d s e c o n d c u l t u r e s i ss h o w n i n F i g u r e 2 . I n c l u s i o n o f m a n n i t o l f a v o r e d b o t h p o l l e nv i a b i l i t y a n d d i v i s i o n . Optimum c o n c e n t r a t i o n w a s i n t h e rangeo f 0 . 3 t o 0 . 5 M , a n d t h e r e f o r e 0 . 4 M m a n n i t o l w a s s e l e c t e d as t h es t a n d a r d o s m o t i c s t a b i l i z e r i n t h e f i r s t a n d s e c o n d c u l t u r e s .

u . . . .

V i a b i l i t yW5 -C../L 5 0 P o l l e no v i s i o n

C I X 1

0 0 - 1 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 . 5 0 . 6 0 . 7M A N N I T O L ( M )F I G . 2 . E f f e c t s o f m a n n i t o l c o n c e n t r a t i o n o n p o l l e n v i a b i l i t y a n d c e l ld i v i s i o n . T h e p o l l e n o b t a i n e d i n t h e w a y d e s c r i b e d i n " M a t e r i a l s a n dM e t h o d s " w a s s u s p e n d e d i n m a n n i t o l s o l u t i o n a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so f 0 t o 0 . 7 M , a n d 1 . 8 m l o f e a c h s u s p e n s i o n w a s c u l t u r e d i n a P e t r i d i s h( 3 . 5 cm i n d i a m e t e r ) . P o l l e n v i a b i l i t y w a s c o u n t e d a t t h e e n d o f t h e f i r s tc u l t u r e . S u b s e q u e n t m a n i p u l a t i o n a n d o b s e r v a t i o n o f t h e c u l t u r e w e r em a d e a s d e s c r i b e d i n T a b l e I .P e r i o d o f t h e F i r s t C u l t u r e . Maximum p o l l e n d i v i s i o n w a sa c h i e v e d i f t h e f i r s t c u l t u r e p e r i o d w a s 3 d ( T a b l e I I ) . When t h i sf i r s t c u l t u r e w a s n o t d o n e , p o l l e n d i v i s i o n w a s r a r e l y o b s e r v e da n d t h e a c c u m u l a t i o n o f s t a r c h g r a i n s s i m i l a r t o t h a t o f p o l l e nm a t u r a t i o n ( F i g . 3 E ) o c c u r r e d .E v a l u a t i o n s o f t h e S e c o n d C u l t u r e M e d i u m . A c a r b o n s o u r c es u c h a s g a l a c t o s e i n t h e s e c o n d c u l t u r e m e d i u m w a s e s s e n t i a l f o rt h e i n d u c t i o n o f d i v i s i o n ( T a b l e I I I ) . A d d i t i o n o f M S m a c r o -e l e m e n t s e n h a n c e d t h e r a t e o f t h e p o l l e n d i v i s i o n . P r e l i m i n a r ys t u d i e s o n t h e e f f e c t o f s u g a r s s u g g e s t e d t h a t s u c r o s e w a s e f f e c t i v ea s g a l a c t o s e i n i n d u c i n g p o l l e n d i v i s i o n . H o w e v e r , i n t h e m e d i u mc o n t a i n i n g s u c r o s e t h e d i v i d i n g p o l l e n t e n d e d t o f o r m l a r g e re m b r y o s o r c a l l i , b u t i n t h e m e d i u m c o n t a i n i n g g a l a c t o s e a s as o l e c a r b o n s o u r c e n o f u r t h e r d e v e l o p m e n t o f t h e d i v i d e d p o l l e nt o o k p l a c e .U p o n t r a n s f e r r i n g t h e d i v i d e d p o l l e n f r o m t h e m e d i u m c o n -t a i n i n g g a l a c t o s e t o t h e t h i r d c u l t u r e m e d i u m , s i m u l t a n e o u se m b r y o g e n i c d e v e l o p m e n t w a s o b s e r v e d ( F i g . 5 , A a n d B ) . T h u sf o r c o n v e n i e n c e o f c o u n t i n g t h e p o l l e n d i v i s i o n s a n d s y n c h r o n i -z a t i o n o f e m b r y o g e n e s i s f o l l o w i n g t h e s e c o n d c u l t u r e , g a l a c t o s ew a s u s e d i n t h e s e c o n d c u l t u r e .

9 1

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P l a n t P h y s i o l . V o l . 7 9 , 1 9 8T a b l e I I . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e D u r a t i o n o f t h e F i r s t C u l t u r e a n d t h e R a t e o f t h e D i v i d i n g P o l l e n

A f t e r t h e v a r i o u s p e r i o d s o f t h e f i r s t c u l t u r e ( 1 0 m l s u s p e n s i o n i n a 1 0 - c m P e t r i d i s h ) , 1 . 8 m l e a c h o f t h es u s p e n s i o n s f r o m t h e c u l t u r e w a s t r a n s f e r r e d t o a 3 . 5 - c m P e t r i d i s h a n d M S m a c r o - e l e m e n t s , g a l a c t o s e ( f i n a l4 0 mM) a n d g l u t a m i n e ( f i n a l 3 mM) w e r e a d d e d . T h e d i v i d i n g p o l l e n w a s c o u n t e d a b o u t 3 w e e k s a f t e r t h ea d d i t i o n o f n u t r i e n t s .D u r a t i o n o f t h e f i r s tc u l t u r e ( d ) 0 1 2 3 5 7% o f d i v i d i n g p o l l e n 1 ( 0 - 4 ) a 1 9 ( 1 4 - 2 4 ) 2 8 ( 2 2 - 3 4 ) 4 8 ( 4 2 - 5 4 ) 2 0 ( 1 5 - 2 6 ) 1 6 ( 1 1 - 2 1 )

a N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e 95% c o n f i d e n c e i n t e r v a l s f o r a b i n o m i n a l d i s t r i b u t i o n .T a b l e I I I . E f f e c t o f t h e S e c o n d C u l t u r e M e d i u m o n t h e R a t e o fD i v i d i n g P o l l e n

A f t e r t h e f i r s t c u l t u r e p o l l e n w a s c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n , w a s ha n d r e s u s p e n d e d i n e a c h m e d i u m . D i v i d i n g p o l l e n w a s c o u n t e d 3 w e ea f t e r t h e c u l t u r e .

S e c o n d C u l t u r e M e d i u m a D i v i d i n g P o l l e nM a c r o - e l e m e n t s 0 ( 0 _ l ) bMC 0 ( 0 - 1 )M a c r o - e l e m e n t s + g l u t a m i n e d 0 ( 0 - 1 )G a l a c t o s e ' 3 1 ( 2 5 - 3 7 )M a c r o - e l e m e n t s + g a l a c t o s e 4 8 ( 4 2 - 5 4 )M a c r o - e l e m e n t s + g a l a c t o s e + g l u t a -m i n e 4 9 ( 4 3 - 5 5 )M + g a l a c t o s e 5 1 ( 4 5 - 5 7 )

a E a c h m e d i u m c o n t a i n e d 0 . 4 M m a n n i t o l a n d w a s a d j u s t e d t o6 . 8 . b N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e 95% c o n f i d e n c e i n t e r v a l s f o rb i n o m i n a l d i s t r i b u t i o n . c C o n t a i n s a l l c o m p o n e n t s o f M S medi( 6 ) e x c e p t s u c r o s e a n d p h y t o h or m o n e s . d G l u t a m i n e w a s a d d e d ac o n c e n t r a t i o n o f 3 m M . ' G a l a c t o s e w a s a d d e d a t a c o n c e n t r a t i o n4 0 m M .

5 0

; 2 4 0zwj3 00a-0200I

0 o

F I G . 3 . M i c r o s c o p i c v i e w o f N . r u s t i c p o l l e n c u l t u r e d i n v i t r o . A , B ,C , P o l l e n o b t a i n e d b y t h e P e r c o l l f r a c t i o n s , 0 / 3 5 % , 4 0 / 4 5 % , 5 0 / 5 5 % i nT a b l e I , r e s p e c t i v e l y . D , P o l l e n g r a i n s o b t a i n e d f r o m t h e s e c o n d P e r c o l lf r a c t i o n a t i o n ( 0 / 3 0 % ) . E , P o l l e n g r a i n s s a m p l e d f r o m ( B ) a n d c u l t u r e di n t h e s e c o n d c u l t u r e medium f o r 1 d w i t h o u t t h e f i r s t c u l t u r e . B a r = 5 0,i n .

S e v e r a l p h y t o h o r m o n e s w e r e t e s t e d a t c o n c e n t r a t i o n s f r o mI 0 - ' t o 1 0 - 9 M. O n l y ABA a t I o - ' t o 1 0 - 7 Mw a s f o u n d t o b ee f f e c t i v e i n i n c r e a s i n g t h e p e r c e n t a g e o f d i v i d i n g p o l l e n . O t h e rp h y t o h o r m o n e s s u c h as I A A , 2 , 4 - D , B A , a n d GA3 w e r e i n e f f e c -t i v e ( F i g . 4 ) , a n d e a c h o f t h e m i n c o n c e n t r a t i o n s g r e a t e r t h a nl 0 - 5 M s u b s t a n t i a l l y d e p r e s s e d p o l l e n v i a b i l i t y . E v e n i f g a l a c t o s ew a s r e p l a c e d b y s u c r o s e , A B A s t i l l e n h a n c e d p o l l e n d i v i s i o n , b u t

F I G . 4 . E f f e c t s o f p h y t o h o r m o n e i n t h e s e c o n d c u l t u r e m e d i u m . Tm e t h o d s o f c u l t u r e a n d o b s e r v a t i o n w e r e t h e same as t h o s e d e s c r i b e dT a b l e I I I . T h e b a s a l medium w a s t h e same a s t h a t d e s c r i b e d i n " M a t e r ia n d M e t h o d s . "s u p p r e s s e d t h e g r o w t h o f d i v i d i n g p o l l e n i n t o e m b r y o s or e m b ro g e n i c c a l l i i n t h e s e c o n d c u l t u r e ( d a t a n o t s h o w n ) .S e c o n d P e r c o l l F r a c t i o n a t i o n . E x p e r i m e n t s m e n t i o n e d a b ow e r e c o n d u c t e d t o a s s e s s c o n d i t i o n s f o r maximum r a t e s o f tp o l l e n d i v i s i o n . To a c h i e v e f u r t h e r i n c r e a s e i n p o l l e n d i v i s i o ns e c o n d P e r c o l l f r a c t i o n a t i o n ( 0 / 2 5 / 3 0 / 3 5 / 4 0 / 4 5 % ) a f t e r t h e f ic u l t u r e w a s e m p l o y e d . P o l l e n o b t a i n e d f r o m t h e l o w d e n s iP e r c o l l f r a c t i o n s ( 0 / 2 5 % , 2 5 / 3 0 % ) r e s u l t e d i n h i g h e r r a t e s o f tp o l l e n d i v i s i o n ( T a b l e I V ) .

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f.f p - f . ,*X~~~~~A

KYO A ND H A R A D A

I U

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CONDITIONS FO R POLLEN CELL D I V I S I O N AND EMBRYOGENESISE f f e c t s o f A B A a n d G l u t a m i n e o n t h e E m b r y o g e n e s i s . U s i n gt h e p o l l e n o b t a i n e d b y t h e s e c o n d P e r c o l l f r a c t i o n a t i o n t h e e f f e c to f A B A a n d / o r g l u t a m i n e s u p p l i e d i n t h e s e c o n d c u l t u r e m e d i u mo n e m b r y o o r e m b r y o g e n i c c a l l u s f o r m a t i o n w a s s t u d i e d ( T a b l eV ) . D i v i d i n g p o l l e n w a s t r a n s f e r r e d t o t h e t h i r d c u l t u r e a f t e r 1 0d i n t h e s e c o n d c u l t u r e t o o b s e r v e e m b r y o g e n i c d e v e l o p m e n t .A d d i t i o n s o f b o t h ABA ( 5 F M ) a n d g l u t a m i n e ( 3 mM) i n t h es e c o n d c u l t u r e m e d i u m s t i m u l a t e d t h e d e v e l o p m e n t o f d i v i d i n g

p o l l e n i n t o e m b r y o s o r e m b r y o g e n i c c a l l i i n t h e t h i r d c u l t u r e( F i g . 5 ) .DISCUSSION

I n v e s t i g a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t t o e s t a b l i s h c o n d i t i o n s w h e r e b ya h i g h f r e q u e n c y o f c e l l d i v i s i o n a n d e m b r y o g e n e s i s o f N i c o t i a n ar u s t i c a p o l l e n w o u l d b e f e a s i b l e . T h e m o s t s i g n i f i c a n t f i n d i n g i nt h i s s t u d y w a s t h e n e c e s s i t y o f a p r i m a r y c u l t u r e l a c k i n g a n yn u t r i e n t s i n t h e m e d i u m . We d e n o t e t h i s a s t h e s t a r v a t i o n p e r i o d .D u r i n g t h e s t a r v a t i o n p e r i o d s o m e p h y s i o l o g i c a l c h a n g e s r e s p o n -s i b l e f o r p o l l e n e m b r y o g e n e s i s s e e m t o b e t a k i n g p l a c e . O p t i m u ml e n g t h o f t h e s t a r v a t i o n p e r i o d w a s d e t e r m i n e d t o b e 3 d a t 3 0 C .T h i s c u l t u r e p e r i o d c o r r e s p o n d s t o t h a t r e p o r t e d b y D u n w e l l ( 1 )f o r h i s m e t h o d , n a m e l y , p r e t r e a t m e n t o f e x c i s e d a n t h e r s i n aw a t e r - s a t u r a t e d a t m o s p h e r e a t 2 3 C . O u r u n p u b l i s h e d r e s u l t si n d i c a t e t h a t t h e t e m p e r a t u r e o f t h e f i r s t c u l t u r e w a s a l s o c r i t i c a lf o r t h e a p p r o p r i a t e s t a r v a t i o n p e r i o d . U n d e r l o w t e m p e r a t u r e( e . g . 1 5 C ) , 7 t o 9 d w e r e n e e d e d a s t h e o p t i m u m p e r i o d f o r t h ef i r s t c u l t u r e . T h i s f i n d i n g i s i n a g r e e m e n t w i t h t h a t r e p o r t e d b yT a b l e I V . S e c o n d P e r c o l l F r a c t i o n a t i o n a n d t h e F r e q u e n c y o f D i v i d i n gP o l l e n i n R e s p e c t i v e F r a c t i o n s

T h e p o l l e n i n e a c h f r a c t i o n w a s w a s h e d b y a n d c u l t u r e d i n t h e s e c o n dc u l t u r e m e d i u m i n t h e s a m e manner a s d e s c r i b e d i n " M a t e r i a l s a n dM e t h o d s " .

F r a c t i o n N o . P e r c o l l P o l l e n a V i a b i l i t y b D i v i d i n g P o l l e n1 0 / 2 5 1 2 1 0 0 7 8 ( 7 2 - 8 3 ) c2 2 5 / 3 0 4 0 9 9 6 6 ( 6 0 - 7 2 )3 3 0 / 3 5 1 8 9 3 4 6 ( 4 0 - 5 2 )4 3 5 / 4 0 7 2 3 1 ( 0 - 4 )5 4 0 / 4 5 7 0 0 ( 0 - 1 )6 4 5 / 1 6 0 0 ( 0 - 1 )

a T h e p e r c e n t a g e o f t o t a l p o l l e n f o u n d i n c o r r e s p o n d i n g f r a c -t i o n s . b A t t h e b e g i n n i n g o f t h e s e c o n d c u l t u r e . C N u m b e r s i np a r e n t h e s e s a r e 9 5 % c o n f i d e n c e i n t e r v a l s f o r a b i n o m i n a l d i s t r i b u t i o n .

R a s h i d a n d R e i n e r t ( 9 , 1 0 ) f o r t h e o p t i m u m d u r a t i o n o f c o l dt r e a t m e n t o f b u d s , n a m e l y , 1 0 d a t 1 0 C . I n p r e v i o u s m e t h o d so f p o l l e n c u l t u r e , p r e c u l t u r e o f a n t h e r s o r c o l d t r e a t m e n t o ff l o w e r b u d s b e f o r e t h e i s o l a t i o n o f p o l l e n w a s g e n e r a l l y r e q u i r e d .f S W > }$Wt , t ' , o >

F I G . 5 . P o l l e n e m b r y o g e n e s i s i n t h e s e c o n d ( A ) a n d t e n t h ( B ) d o f t h et h i r d c u l t u r e . F o l l o w i n g t h e s e c o n d c u l t u r e , t h e d i v i d i n g p o l l e n ( F i g . 1,A ) w as t r a n s f e r r e d t o M S medium ( p H 5 . 8 ) c o n t a i n i n g 0 . 4 M m a n n i t o l ,3 mm g l u t a m i n e , a n d n o p h y t o h o r m o n e . B a r s = 1 0 0 , m.

T a b l e V . E f f e c t s o f G l u t a m i n e a n d A BA i n t h e S e c o n d C u l t u r e M e d i u m o n D i v i s i o n a n d E m b r y o o rE m b r y o g e n i c C a l l u s F o r m a t i o nA f t e r t h e f i r s t c u l t u r e , t h e s e c o n d P e r c o l l f r a c t i o n a t i o n w a s c o n d u c t e d a n d t h e p o l l e n f l o a t i n g on 3 0 % P e r c o l ls o l u t i o n w a s c u l t u r e d i n t h e m e d i a i n d i c a t e d . A f t e r t h e s e c o n d c u l t u r e ( 1 0 d ) , p o l l e n w a s c o l l e c t e d b yc e n t r i f u g a t i o n a n d p r o v i d e d f o r t h e t h i r d c u l t u r e . T e n d a f t e r t h e s t a r t o f t h e t h i r d c u l t u r e , e m b r y o g e n i c c a l l il a r g e r t h a n 1 0 0 , u m w e r e c o u n t e d .S e c o n d C u l t u r e M e d i u m a

+None + G l u t a m i n e b +ABAC + G l u t a m i n e , A B AD i v i d i n g p o l l e n i n t h e s e c -o n d c u l t u r e ( % ) 5 2 ( 4 6 - 5 8 ) " 4 6 ( 4 0 - 5 2 ) 7 8 ( 7 2 - 8 3 ) 7 8 ( 7 2 - 8 3 )E m b r y o o r e m b r y o g e n i cc a l l u s l a r g e r t h a n 1 0 0um M Y ) e 1 5 ( 1 0 - 2 0 ) 1 2 ( 8 - 1 7 ) 6 ( 3 - 1 0 ) 3 2 ( 2 6 - 3 8 )a G l u t a m i n e w a s o m i t t e d f r o m t h e o n e d e s c r i b e d i n " M a t e r i a l s a n d M e t h o d s " f o r t h e s e c o n d c u l t u r em e d i u m . b G l u t a m i n e w a s a d d e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 3 m M . c A B A w a s a d d e d a t a c o n c e n t r a t i o n o fS g M . d N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e 95% c o n f i d e n c e i n t e r v a l s f o r a b i n o m i n a l d i s t r i b u t i o n . ' T h e r a t et o t o t a l n u m b e r o f p o l l e n g r a i n s e x i s t i n g a t t h e s t a r t o f t h e t h i r d c u l t u r e .

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8/8/2019 Cell Division and Embryo Genesis

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P l a n t P h y s i o l . V o l . 7 9 , 1 9 8 5A c o m p a r a b l e s i t u a t i o n t o s t a r v a t i o n o f p o l l e n may o c c u r u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s .T h i s i n v e s t i g a t i o n a l s o p o i n t e d o u t t h a t p o l l e n s e l e c t e d b yP e r c o l l f r a c t i o n a t i o n c o u l d b e u s e d f o r t h e i n d u c t i o n o f d i v i s i o n .P e r c o l l f r a c t i o n a t i o n f a c i l i t a t e d t h e c o l l e c t i o n o f p o l l e n p o p u l a -t i o n s o f u n i f o r m d e n s i t y . T h i s w a s v i s i b l y c o n f i n e d b y a s i m i l a ra c c u m u l a t i o n o f s t a r c h g r a i n s . B a s e d u p o n m i c r o s c o p i c o b s e r -v a t i o n , p o l l e n o b t a i n e d f r o m t h e f i r s t P e r c o l l f r a c t i o n s , 0 / 3 5 % ,4 0 / 4 5 % , a n d 5 0 / 5 5 % w e r e i n t h e e a r l y b i n u c l e a t e s t a g e ( l a r g ev a c u o l e , n o s t a r c h g r a i n ) , m i d b i n u c l e a t e s t a g e ( s m a l l o r n ov a c u o l e , a f e w s t a r c h g r a i n s ) , a n d t h e l a t e b i n u c l e a t e s t a g e ( m a n ya n d l a r g e s t a r c h g r a i n s ) , r e s p e c t i v e l y ( F i g . 3 , A , B , C ) . I n p r e v i o u ss t u d i e s o f N . t a b a c u m a n d s o m e o t h e r p l a n t s , a n t h e r s s u i t a b l ef o r t h e i n d u c t i o n o f p o l l e n e m b r y o g e n e s i s c o n t a i n e d u n i n u c l e a t et o e a r l y b i n u c l e a t e p o l l e n ( 1 1 ) , w h e r e a s p o l l e n g r a i n s w h i c hs h o w e d e m b r y o g e n i c r e s p o n s e i n t h e p r e s e n t s t u d y o r i g i n a t e df r o m m i d b i n u c l e a t e p o l l e n g r a i n s .I n N . t a b a c u m a n t h e r c u l t u r e s , Homer a n d S t r e e t ( 3 ) s p e c u -l a t e d t h a t e m b r y o s o r i g i n a t e d f r o m s p e c i f i c p o l l e n , c a l l e d S( s m a l l e r ) g r a i n s , w h i c h e x i s t e d a t l o w f r e q u e n c y a n d h a d p r e d e -t e r m i n e d e m b r y o g e n i c c a p a c i t y i n i n t a c t a n t h e r s . T h i s h y p o t h e s i sh a s b e e n s u p p o r t e d b y R a s h i d a n d R e i n e r t , a n d a f e w o t h e ri n v e s t i g a t o r s ( 8 ) . I n o u r c a s e e m b r y o g e n i c p o l l e n g r a i n s c o u l d b ec o l l e c t e d b y a s e c o n d P e r c o l l f r a c t i o n a t i o n p e r f o r m e d r i g h t a f t e rt h e s t a r v a t i o n t r e a t m e n t ( t h e f i r s t c u l t u r e ) . T h e s e p o l l e n g r a i n sp o s s e s s i n g l o w d e n s i t y m i c r o s c o p i c a l l y r e s e m b l e t h e e m b r y o g e n i cp o l l e n g r a i n s o b t a i n e d f r o m p r e c u l t u r e d a n t h e r s ( 1 1 , 1 4 ) o r c o l d -t r e a t e d b u d s ( 9 ) . H o w e v e r , t h e s e p o l l e n g r a i n s d i d n o t o r i g i n a t ef r o m t h e s o - c a l l e d S g r a i n s b u t f r o m t h e m i d b i n u c l e a t e p o l l e ng r a i n s c o l l e c t e d b y t h e f i r s t P e r c o l l f r a c t i o n a t i o n . T h e d e c r e a s ei n t h e d e n s i t y o f p o l l e n w a s p r o b a b l y d u e t o t h e d i g e s t i o n o fs t a r c h g r a i n s d u r i n g t h e s t a r v a t i o n p e r i o d .O u r p r o c e d u r e r e q u i r e s a s e c o n d c u l t u r e f o l l o w i n g t h e s t a r v a -t i o n p e r i o d f o r i n d u c i n g p o l l e n d i v i s i o n . T h e s e c o n d c u l t u r e w a sa l s o i m p o r t a n t i n i m p r o v i n g t h e f r e q u e n c y o f p o l l e n d i v i s i o n .S t u d i e s o f f a c t o r s c o n t a i n e d i n t h e s e c o n d c u l t u r e m e d i u m d i s -c l o s e d t h a t a c a r b o n s o u r c e , s u c h a s g a l a c t o s e , w a s e s s e n t i a l f o ri n d u c i n g p o l l e n d i v i s i o n , a n d t h a t M S m a c r o - e l e m e n t s a n d A BA

w e r e e f f e c t i v e i n s t i m u l a t i n g p o l l e n d i v i s i o n . A d d i t i o n s o f b o t hg l u t a m i n e a n d A B A t o t h e s e c o n d c u l t u r e m e d i u m w e r e b e n e f i -c i a l i n i n d u c i n g d i v i d e d p o l l e n t o u n d e r g o a h i g h f r e q u e n c y o fe m b r y o n i c d e v e l o p m e n t i n t h e t h i r d c u l t u r e .A c k n o w l e d g m e n t s - V a l u a b l e a d v i c e f r o m D r . H . U c h i m i y a a n d D r . T . A .T h o r p e i n t h e p r e p a r a t i o n o f t h e m a n u s c r i p t i s a p p r e c i a t e d .

LITERATURE CITED1 . DUNWELL JM 1 9 8 1 S t i m u l a t i o n o f p o l l e n e m b r y o i n d u c t i o n i n t o b a c c o b yp r e t r e a t m e n t o f e x c i s e d a n t h e r s i n a w a t e r - s a t u r a t e d a t m o s p h e r e . P l a n t S c iL e t t 2 1 : 9 - 1 32 . G H A N D I M A T H I H 1 9 8 2 D i r e c t p o l l e n c u l t u r e o f N i c o l i a n a t a b a c u m . I n AF u j i w a r a , e d . , P r o c . 5 t h I n t . C o n g r . P l a n t T i s s u e a n d C e l l C u l t u r e . M a r u z e nC o . , L t d . , T o k y o, p p 5 2 7 - 5 2 83 . H O R N E R M , H E S T R E E T 1 9 7 8 P o l l e n d i m o r p h i s m - o r i g i n a n d s i g n i f i c a n c e i np o l l e n p l a n t f o r m a t i o n b y a n t h e r c u l t u r e . An n B o t 4 2 : 7 6 3 - 7 7 14 . I M A M U R A J , E O K A B E , M K Y o , H HARADA 1 9 8 2 E m b r yo g e ne s i s a n d p l a n t l e tf o r m a t i o n t h r o u g h d i r e c t p o l l e n c u l t u r e o f i s o l a t e d p o l l e n o f N i c o t i a n al a b a c u m c v . S a m s u n a n d N i c o t i a n a r u s t i c a c v . R u s t i c a . P l a n t C e l l P h y s i o l2 3 : 7 1 3 - 7 1 65 . M A H E S H W A R I S C , A R A S H I D , K T Y A G I 1 9 8 2 H a p l o i d s f r o m p o l l e n g r a i n s -r e s t r o p e c t a n d p r o s p e c t . Am J B o t 6 9 : 8 6 5 - 8 7 96 . M U R A S H I G E C , F S K O O G 1 9 6 2 A r e v i s e d m e d i u m f o r r a p i d g r o w t h a n d b i o a s s a yw i t h t o b a c c o t i s s u e c u l t u r e . P h y s i o l P l a n t 1 5 : 4 2 7 - 4 9 77 . N I T S C H C 1 9 7 4 L a c u l t u r e s d e p o l l e n i s o l e s u r m i l i e u s y n t h e t i q u e . C R A c a dS c i 2 7 8 D : 1 0 3 1 - 1 0 3 4

8 . R A S H I D A 1 9 8 3 P o l l e n d i m o r p h i s m i n r e l a t i o n t o p o l l e n p l a n t f o r m a t i o n .P h y s i o l P l a n t 5 8 : 5 4 4 - 5 4 89 . R A S H I D A , J R E I N E R T 1 9 8 0 S e l e c t i o n o f e m b r y o g e n i c p o l l e n f r o m c o l d - t r e a t e db u d s o f N i c o t i a n a l a b a c u m v a r . B a d i s c h e r B u r l e y a n d t h e i r d e v e l o p m e n ti n t o e m b r y o s i n c u l t u r e s . P r o t o p l a s m a 1 0 5 : 1 6 1 - 1 6 71 0 . R A S H I D A , J R E I N E R T 1 9 8 3 F a c t o r s a f f e c t i n g h i g h - f r e q u e n c y e m b r y o f o r m a t i o ni n a b i n i t i o p o l l e n c u l t u r e o f N i c o u i a n a . P r o t o p l a s m a 1 1 6 : 1 5 0 - 1 6 01 1 . S U N D E R L A N D N , JM DUNWELL 1 9 7 7 A n t h e r s a n d p o l l e n c u l t u r e . I n HE S t r e e t ,e d , P l a n t T i s s u e a n d C e l l C u l t u r e . B l a c k w e l l S c i e n t i f i c P u b l i c a t i o n s , O x f o r d ,p p 2 2 3 - 2 6 51 2 . T Y A G I A K , A R A S H I D , S C M A H E S H W A R I 1 9 7 9 H i g h f r e q u e n c y p r o d u c t i o n o fe m b r y o s i n D a t u r a i n n o x i a f r o m i s o l a t e d p o l l e n g r a i n s b y c o m b i n e d c o l dt r e a t m e n t a n d s e r i a l c u l t u r e o f a n t h e r s i n l i q u i d m e d i u m . P r o t o p l a s m a 9 9 :1 1 - 1 71 3 . WEATHERHEAD MA, GG HENSHAW 1 9 7 9 T h e i n d u c t i o n o f e m b r y o i d s i n f r e ep o l l e n c u l t u r e o f p o t a t o e s . Z . P f l a n z e n p h y s i o l 9 4 : 4 4 1 - 4 4 71 4 . W E R N I C K E WC, CT H A R M S , H L O R Z , E THOMAS 1 9 7 8 S e l e c t i v e e n r i c h m e n t o fe m b r y o g e n i c m i c r o s p o r e p o p u l a t i o n . N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 6 5 : 5 4 0 - 5 4 1

9 4 KYO AND H A R A D A