CELB30090Advanced Cell Biology

Prof. Jeremy C. Simpson

Lecture 14The cytoskeleton – IFs and actin

Today’s lecture ...

Intermediate filaments

Actin filaments and accessory proteins

Motor proteins of the actin cytoskeleton

Role of actin in cell motility

Small GTPase activation of the actin cytoskeleton

Intermediate filaments (IFs)

‐ provide cells with mechanical stability

‐ different families of IFs are expressed in different cell types 

‐ important role at cell‐cell contact sites (desmosomes)

keratin filaments

‐ keratins are the most diverse family, with over 50 members

10 µmvimentin filaments

‐ vimentin IFs are particularly prevalent in fibroblasts

Intermediate filaments

‐ individual IF polypeptides are elongated α‐helical molecules that form parallel coiled coils with one another

‐ pairs of parallel dimers associate in an anti‐parallel manner forming staggered tetramers

‐ unlike actin or tubulin IFs cannot bind nucleotide triphosphates (ATP/GTP)

‐ tetramers pack together laterally forming filaments

‐ each individual IF has a cross section of 32 individual α‐helical coils

‐ IF are joined to one another (or to microtubules) by the protein plectin

Intermediate filaments

‐ caused by expression of defective keratins in the basal cell layer of the epidermis

‐ the strength of linkage to the hemidesmosomes is lost, and cells become easily damaged by slight mechanical stress 

‐mutations in keratin genes can cause disease, for example skin blisters (epidermolysis bullosa simplex)

normal skin tissue defective skin tissue

Actin filaments

‐ actin filaments are composed of individual globular polypeptides of actin

‐ actin subunits can bind ATP (or ADP)

‐ actin subunits assemble head‐to‐tail, generating protofilaments with polarity

‐ two protofilaments twist around one another in a right‐handed helix forming the final actin filament

‐ individual filaments are flexible, however when cross‐linked and bundled together, such as in stress fibres, they become very strong 

10 µm

Actin filament binding proteins

actinnucleation

actincross‐linking

Actin cross‐linking proteins

‐ in animal cells actin is organised into bundles and gel‐like networks

‐ actin cross‐linking proteins help stabilise and maintain these structures

‐ stress fibres are contractile, and exert tension

‐ the cortex underlies the plasma membrane

‐ filopodia are spike‐like projections of the plasma membrane

‐ cross‐linking proteins are modular, with usually two actin binding sites

‐ the spacing and arrangement of these binding domains determine thetype of actin structure that forms 

‐ α‐actinin is a homo‐dimer which only loosely packs actin filaments

‐ fimbrin packs actin filaments very tightly, making them non‐contractile

Myosin motors

‐ actin‐based motor proteins are members of the myosinsuperfamily

‐ some myosins are formed from heavy and light chains, such as myosin II (skeletal muscle myosin)

‐myosin head domains bind ATP, and use the energy from its hydrolysis to move towards the plus ends of actin filaments  

‐ at least 37 myosin family members have been identified

‐ although the motor (head) domains are highly conserved, their C‐terminal tails are diverse, therefore allowing them to bind to a variety of cargoes

‐ the precise functions of many myosins remain to be determined. Some play a role in vesicle and organelle transport, some in cytokinesis, and some in contractile activity of cardiac and muscle cells

Actin nucleation

‐ actin nucleation most frequently occurs near the plasma membrane

‐ this is often as a response to external signals

‐ actin nucleation is catalysed by ‘formin’ proteins and the ‘ARP complex’ (Arp 2/3 complex)

‐ in the absence of activation factors, Arp2 and Arp3 are held in an inactive complex

‐ on activation, Arp2 and Arp3 bind into a conformation resembling the minus end of an actin filament

‐ actin subunits are then able to assemble on this structure

‐ ARP nucleation is most efficient from pre‐existing filaments

‐ resulting branches grow at a 70° angle relative to the original filament

Role of actin in cell motility

‐ in animal cells almost all cell locomotion comes from crawling, and this process is dependent on constant rearrangement of the actin cytoskeleton

‐ in epithelial and fibroblast cells, extensions called ‘lamellipodia’ are sheet‐like structures that indicate the direction of motility

‐ actin polymerisation in the lamellipodium causes the cell to protrude in a specific direction

‐ the front of the cell attaches through focal adhesion sites, and the rear of the cell contracts

‐ this process is repeated, propelling the cell forward

Role of actin in cell motility

Crawling keratocyte cells

Role of actin in cell motility

1) signals to initiate cell movement are transduced across the plasma membrane

2) ‘WASp’ proteins activate the Arp2/3 complex

3) activated Arp2/3 nucleates actin filament assembly

4) the protein profilin binds actin monomers in such a conformation that it only allows actin filaments to extend in the plus direction

5) elongating filaments push the plasma membrane forward, becoming increasingly branched. The plus ends are periodically capped

6) as the growing filaments hydrolyse their bound ATP, they become susceptible to depolymerisation by cofilin

Small GTPase activation of the actin cytoskeleton

‐ processes such as cell migration require long‐distance co‐ordination and communication

‐ actin cytoskeleton restructuring occurs as a response to external signals perceived by cell surface receptors 

‐ inside the cell these signals are received by small GTPases of the Rho family (Cdc42, Rac and Rho)

‐ for example, activation of Cdc42 triggers actin polymerisation and bundling to form filopodia or shorter cell protrusions called microspikes

‐ key targets of activated Cdc42 are members of the WASp protein family

‐ binding of Cdc42‐GTP to WASp stabilises it, allowing it to bind the Arp2/3 complex and initiate actin nucleation

Small GTPase activation of the actin cytoskeleton

‐ Rac‐GTP also activates WASp family members, in turn activating actin nucleation

‐ Rac‐GTP also activates the kinase PAK, which in turn activates the cross‐linked protein filamin

‐ PAK phosphorylates myosins MHC and MLCK, which reduces their activity, and in turn decreases their contractile activity (thereby reducing stress fibre formation)

Small GTPase activation of the actin cytoskeleton

‐ Rho‐GTP activates formin proteins that construct parallel actin bundles that assemble into stress fibres

‐ Rho‐GTP also activates Rho kinase (ROCK), that activates other kinases that increase myosin activity, thereby promoting stress fibre assembly

‐ ROCK also activates LIM kinase, which then inhibits the activity of the actin depolymerising factor cofilin

Key take home point

Co-ordinated regulation of the actin cytoskeleton network allows cells to rapidly adapt and move in

response to external stimuli