7/29/2019 cDNA Cloning Reveals That the Major Group Rhinovirus Receptor on HeLa Cell Sis Intercellular Adhesion Molecule 1

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P r o c . N a d . A c a d . S c i . USAV o l . 8 6 , p p . 4 9 0 7 - 4 9 1 1 , J u l y 1 9 8 9B i o c h e m i s t r y

cDNA c l o n i n g r e v e a l s t h a t t h e m a j o r g r o u p r h i n o v i r u s r e c e p t o ro n HeLa c e l l s i s i n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e 1( c y t o k i n e i n d u c t i o n / v i r a l r e c e p t o r / t r a n s f e c t i o n )

JOANNE E . T o M A S S I N I , DONALD GRAHAM, C O R R I L L E M . D E W I T T , DONALD W. L I N E B E R G E R ,JOHN A . R O D K E Y , AND R I C H A R D J . COLONNO*D e p a r t m e n t o f V i r u s a n d C e l l B i o l o g y , M e r c k S h a r p & Dohme R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , W e s t P o i n t , PA 1 9 4 8 6C o m m u n i c a t e d b y E d w a r d M. S c o l n i c k , A p r i l 1 0 , 1 9 8 9ABSTRACT A 9 0 - k D a s u r f a c e g l y c o p r o t e i n w a s p r e v i -o u s l y i s o l a t e d a n d s h o w n t o b e r e q u i r e d f o r i n f e c t i o n b y t h e" m a j o r " g r o u p o f h u m a n r h i n o v i r u s ( I R V ) s e r o t y p e s . I n t h ep r e s e n t w o r k , t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h e r e c e p t o r p r o t e i nw a s o b t a i n e d f r o m CNBr a n d t r y p t i c p e p t i d e s . U s i n g d e g e n -e r a t e o l i g o n u c l e o t i d e s p r e d i c t e d f r o m t h e p e p t i d e s e q u e n c e s , w ei d e n t i f i e d f o u r cDNA c l o n e s t h a t e n c o d e a 3 - k i l o b a s e mRNA.T h e c l o n e s w e r e l i g a t e d , s u b c l o n e d i n a s i m i a n v i r u s 4 0e x p r e s s i o n v e c t o r , a n d u s e d t o t r a n s f e c t r e c e p t o r - n e g a t i v e V e r o( m o n k e y ) c e l l s . R e s u l t s s h o w e d t h a t t r a n s f e c t e d c e l l s e x p r e s s e dr e c e p t o r m o l e c u l e s c a p a b l e o f b i n d i n g H R V a n d a m o n o c l o n a la n t i b o d y w h i c h r e c o g n i z e s t h e mjor g r o u p H R V r e c e p t o r . T h ec l o n e d r e c e p t o r cDNA e n c o d e d a p r o t e i n w i t h a s e q u e n c e n e a r l yi d e n t i c a l t o t h a t o f t h e i n t e r c e l l u l a r a dh e s i o n m o l e c ul e 1( I C A M - 1 ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e t w o s u r f a c e p r o t e i n s a r e o n e a n dt h e s a m e . B o t h p r o t e i n s h a v e i d e n t i c a l m a s s , c a r b o h y dr a t ec o m p o s i t i o n , a n d t i s s u e d i s t r i b u t i o n . I n a d d i t i o n , m a j o r g r o u pr e c e p t o r s o n H e L a c e l l s c o u l d b e i n d uc e d w i t h v a r i o u s c y t o k i n e si n a m a n n e r s i m i l a r t o t h e I C A M - 1 l i g a n d . A s i m i l a r i n d u c t i o no f t h e H R V " m i n o r " g r o u p r e c e p t o r w a s n o t o b s e r v e d .Human r h i n o v i r u s e s ( H R V s ) a r e m e m b e r s o f t h e P i c o r n a v i r -i d a e a n d a r e t h e m a j o r c a u s a t i v e a g e n t o f t h e common c o l d i nh u m a n s ( 1 ) . E a r l i e r s t u d i e s h a v e i n d i c a t e d t h a t H R V s e r o -t y p e s c a n b e d i v i d e d i n t o " m a j o r " ( 7 8 s e r o t y p e s ) a n d" m i n o r " ( 1 0 s e r o t y p e s ) g r o u p s b a s e d o n r e c e p t o r s p e c i f i c i t y( 2 , 3 ) . An a n t i - r e c e p t o r m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( d e s i g n a t e da n t i b o d y 1 A 6 ) h a s b e e n p r e v i o u s l y i s o l a t e d w h i c h s p e c i f i c a l l yb l o c k s a t t a c h m e n t o f t h e m a j o r g r o u p o f HRVs ( 4 ) . B y u s i n gt h i s a n t i b o d y , a 9 0 - k D a g l y c o p r o t e i n w a s i s o l a t e d f r o m HeLac e l l m e m b r a n e s a n d s h o w n t o b e r e q u i r e d f o r a t t a c h m e n t o ft h e m a j o r g r o u p o f HRVs t o s u s c e p t i b l e c e l l s i n c u l t u r e ( 5 ) .C h i m p a n z e e a n d h u m a n c l i n i c a l t r i a l s t e s t i n g t h e e f f i c a c y o fa n t i b o d y 1 A 6 h a v e a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t t h i s r e c e p t o r i si n v o l v e d i n HRV i n f e c t i o n o f t h e n a s a l c a v i t y i n v i v o ( 6 , 7 ) .F u r t h e r b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p u r i f i e d 9 0 - k D ap r o t e i n d e m o n s t r a t e d t h a t i t w a s a n a c i d i c g l y c o p r o t e i nh a v i n g a p I o f 4 . 2 ( 8 ) . C a r b o h y d r a t e s a c c o u n t e d f o r 3 0 % o f t h em o l e c ul ar m a s s o f t h e p r o t e i n a n d s e v e n N - g l y c o s y l a t i o ns i t e s w e r e p r e d i c t e d o n t h e b a s i s o f p a r t i a l d i g e s t i o n w i t hN - G l y c a n a s e ( 8 ) .T h e i n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e 1 ( I C A M - 1 ) i s a c e l ls u r f a c e l i g a n d f o r t h e l y m p h o c y t e f u n c t i o n - a s s o c i a t e d a n t i -g e n 1 ( L F A - 1 ) a d h e s i o n r e c e p t o r ( 9 ) . I C A M - 1 i s a s i n g l e -c h a i n 7 6 - t o 1 1 4 - k D a g l y c o p r o t e i n w i t h a p o l y p e p t i d e c o r e o f5 5 k D a t h a t c a n b e i n d u c e d b y s e v e r a l c y t o k i n e s ( 1 0 ) . T h ei n t e r a c t i o n o f I C A M - 1 a n d L F A - 1 p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i nl e u k o c y t e a d h e s i o n a n d i n t h e e x e c u t i o n o f i m m u n o l o g i c a la n d i n f l a m m a t o r y f u n c t i o n s ( 1 0 ) .

T h e p r e s e n t s t u d y d e s c r i b e s t h e c l o n i n g a n d s e q u e n c i n g o ft h e cDNA t h a t e n c o d e s t h e c e l l s u r f a c e r e c e p t o r r e q u i r e d f o ri n f e c t i o n b y t h e m a j o r g r o u p o f H R V s . t S e q u e n c e a n d p r o t e i nc o m p a r i s o n s s h o w t h a t I C A M - 1 i s t h e s u r f a c e g l y c o p r o t e i nu t i l i z e d b y HRVs d u r i n g i n f e c t i o n .MATERIALS AND M E T H O D S

P e p t i d e S e q u e n c e . H R V m a j o r g r o u p r e c e p t o r p r o t e i n w a si s o l a t e d f r o m HeLa R 1 9 c e l l s ( 2 ) a n d p u r i f i e d b y i m m u n o a f -f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 5 ) . P u r i f i e dp r o t e i n ( 4 0 u g ) w a s r e d u c e d i n 6 M g u a n i d i n e h y d r o c h l o -r i d e / 0 . 1 M T r i s ' H C l , pH 7 . 1 / 0 . 1 % EDTA c o n t a i n i n g 1 0 0 mMd i t h i o t h r e i t o l a t 5 0 0 C f o r 2 . 5 h r , t h e n a l k y l a t e d w i t h 0 . 5 , u Mi o d o a c e t i c a c i d i n t h e s a m e b u f f e r a t pH 7 . 8 f o r 4 5 m i n a t 2 3 0 C .A f t e r e x t e n s i v e d i a l y s i s a g a i n s t H 2 0 , t h e p r o t e i n w a s l y o p h 'i l i z e d a n d t r e a t e d w i t h 0 . 4 mMCNBr i n 7 0 % ( v o l / v o l ) f o r m i ca c i d a t 2 3 0 C f o r 2 0 h r . T h e s a m p l e w a s c h r o m a t o g r a p h e d o na 1 0 % o p o l y a c r y l a m i d e g e l a n d t r a n s f e r r e d o n t o P o l y b r e n e -c o a t e d g l a s s f i b e r f i l t e r s ( 1 1 ) . S t r i p s c o n t a i n i n g p e p t i d e s w e r ec u t o u t a n d t h e N - t e r m i n a l s e q u e n c e w a s d e t e r m i n e d a sd e s c r i b e d ( 1 2 ) .A l t e r n a t i v e l y , 8 0 1 L g o f r e c e p t o r p r o t e i n w a s p u r i f i e d b yPAGE a n d t r a n s f e r r e d d i r e c t l y o n t o a n i t r o c e l l u l o s e f i l t e r .F i l t e r s t r i p s w e r e b l o c k e d a n d t h e n d i g e s t e d w i t h 1 . 2 u g o ft o s y l a m i d o - 2 - p h e n y l e t h y l c h l o r o m e t h y l k e t o n e - t r e a t e d t r y p -s i n f o r 1 8 h r a t 3 7 0 C ( 1 3 ) . T h e r e s u l t i n g p e p t i d e s w e r es e p a r a t e d b y r e v e r s e - p h a s e HPLC a n d s e q u e n c e d a s a b o v e .P r e p a r a t i o n a n d S c r e e n i n g o f cDNA L i b r a r i e s . P o l y s o m a lmRNA a n d t o t a l RNA w e r e i s o l a t e d f r o m d i v i d i n g HeLa R 1 9c e l l s b y u s i n g t h e p r o c e d u r e s d e t a i l e d p r e v i o u s l y ( 1 4 , 1 5 ) .B o t h R NA p r e p a r a t i o n s w e r e s u b s e q u e n t l y p u r i f i e d b y o l i -g o ( d T ) - c e l l u l o s e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y .D o u b l e - s t r a n d e d cDNA w a s s y n t h e s i z e d ( 1 6 ) b y p r i m i n gp o l y ( A ) + RNA w i t h o l i g o ( d T ) ( C o l l a b o r a t i v e R e s e a r c h ) o rd e g e n e r a t e o l i g o n u c l e o t i d e s ( 2 1 - 2 4 b a s e s i n l e n g t h ) p r e d i c t e df r o m p e p t i d e s e q u e n c e s , u s i n g cDNA S y n t h e s i s P l u s r e a g e n t s( A m e r s h a m ) . D o u b l e - s t r a n d e d cDNA w a s b l u n t - e n d l i g a t e dt o E c o R I l i n k e r s ( N e w E n g l a n d B i o l a b s ) a n d i n s e r t e d i n t o AZAP d e p h o s p h o r y l a t e d E c o R I a r m s ( S t r a t a g e n e ) . T h e l i g a t e dDNA w a s p a c k a g e d i n S t r a t a g e n e G i g a p a c k P l u s e x t r a c t sa c c o r d i n g t o d i r e c t i o n s s u p p l i e d b y t h e s u p p l i e r a n d p l a t e d a t3 5 , 0 0 0 p l a q u e - f o r m i n g u n i t s p e r 1 5 0 - m m p l a t e .M u l t i p l e f i l t e r l i f t s ( 1 7 ) o f p h a g e DNA w e r e h y b r i d i z e d t o3 2 P - l a b e l e d o l i g o n u c l e o t i d e s i n 6 x S S C / S x D e n h a r d t ' s s o l u -t i o n / 0 . 5 % S D S / 5 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r , pH 6 . 8 ,c o n t a i n i n g 0 . 2 mg o f s a l m o n s p e r m DNA p e r m l o v e r n i g h t a t1 0 C b e l o w t h e c a l c u l a t e d T m o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e s u s e d ( 1 xS S C = 0 . 1 5 M N a C l / 0 . 0 1 5 M s o d i u m c i t r a t e ; l x D e n h a r d t ' sA b b r e v i a t i o n s : HRV, h u m a n r h i n o v i r u s ; I C A M - 1 , i n t e r c e l l u l a r a d h e -s i o n m o l e c u l e 1 ; L F A - 1 , l y m p h o c y t e f u n c t i o n - a s s o c i a t e d a n t i g e n 1 .* T o wh o m r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .t T h e s e q u e n c e r e p o r t e d i n t h i s p a p e r h a s b e e n d e p o s i t e d i n t h eG e n B a n k d a t a b a s e ( a c c e s s i o n n o . M 2 4 2 8 3 ) .

4 9 0 7

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

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4 9 0 8 B i o c h e m i s t r y : T o m a s s i n ' i e t a l .s o l u t i o n = 0 . 0 2 % p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e / 0 . 0 2 % F i c o l l / 0 . 0 2 9b o v i n e s e r u m a l b u m i n ) . F i l t e r s w e r e t h e n w a s h e d i n 6 :S S C / 0 . 5 % SDS f o r 5 m i n a t 2 3 0 C a n d t h e n f o r 1 0 m i n a t t hh y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e . H y b r i d i z a t i o n - p o s i t i v e p h ag e w e rp i c k e d a n d p l a q u e p u r i f i e d b y d i l u t i o n p l a t i n g a n d r e s c r e e n i n jC o n s t r u c t i o n o f F u l l - L e n g t h cDNA C l o n e . A f u l l - l e n g tDNA f r a g m e n t [ 3 0 4 8 b a s e p a i r s ( b p ) ] w a s o b t a i n e d b y j o i n i nt h e i n s e r t s o f c l o n e s 3 - 1 0 a n d 2 1 a t a common S a c I s i t e an u c l e o t i d e 2 2 5 7 a n d c l o n e s 1 0 5 a n d 2 0 C a t a common B g l I s i tl o c a t e d a t n u c l e o t i d e 6 5 7 . T h e 3 - 1 0 / 2 1 a s s e m b l e d DNA wat h e n j o i n e d t o t h e 1 0 5 / 2 0 C d i m e r b y m e a n s o f a common S aI s i t e a t n u c l e o t i d e 1 3 5 8 t o f o r m p l a s m i d p H R V r 1 . P u r i f i e ip l a s m i d DNA w a s s e q u e n c e d b y u s i n g t h e S e q u e n a s e K i( U n i t e d S t a t e s B i o c h e m i c a l ) . T h e 3 ' - r e c e s s e d e n d s o f t hf u l l - l e n g t h cDNA w e r e f i l l e d i n w i t h t h e K l e n o w f r a g m e n t cDNA p o l y m e r a s e a n d b l u n t - e n d l i g a t e d i n t o t h e s i m i a n v i r u4 0 e a r l y p r o m o t e r t r a n s f e c t i o n v e c t o r pSVL ( 1 8 ) , b y i n s e r t i oi n t o t h e f i l l e d - i n Xba I s i t e s o f t h e v e c t o r . T h e c o n s t r u c t wau s e d t o t r a n s f o r m E s c h e r i c h i a c o l i DH5a c e l l s ( B R L ) tg e n e r a t e p l a s m i d p S V L - H R V r l .T r a n s f e c t i o n o f C e l l s w i t h H R V R e c e p t o r c D N A . C s C ]p u r i f i e d p l a s m i d DNA ( p S V L - H R V r l ) a t 1 0lOg/ml wat r a n s f e c t e d i n t o s u b c o n f l u e n t m o n o l a y e r s o f V e r o ( m o n k e yc e l l s b y t h e c a l c i u m p h o s p h a t e p r e c i p i t a t i o n p r o c e d u r e d es c r i b e d e l s e w h e r e ( 1 9 ) . A f t e r a 4 8 - h r i n c u b a t i o n i n m e d i u rc o n t a i n i n g 1 0 % 6 s e r u m a t 3 7 C , c e l l s w e r e s u b j e c t e d t o b i n d i ns t u d i e s u s i n g [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e - l a b e l e d HRV-15 a n d 1 2 5 1l a b e l e d 1 A 6 a n t i b o d y a s i n d i c a t e d ( 2 ) .I n d u c t i o n o f H R V R e c e p t o r s . C o n f l u e n t m o n o l a y e r s cHeLa R 1 9 c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h t h e i n d i c a t e d c o n c e n t r at i o n s o f c y t o k i n e s f o r 5 o r 2 4 h r a t 3 7 C . A f t e r i n c u b a t i o nm e d i u m w a s r e m o v e d a n d r e p l a c e d w i t h a f r e s h M c C o y ' s 5 )m e d i u m c o n t a i n i n g [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e - l a b e l e d HRV-2 o r H R V1 5 . F o l l o w i n g i n c u b a t i o n w i t h v i r u s f o r 1 h r a t 3 4 C , t h ip e r c e n t o f v i r u s b o u n d a n d u n b o u n d w a s d e t e r m i n e d ap r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 2 ) . S p e c i f i c i t y o f b i n d i n g w a s c o nf i r m e d b y p a r a l l e l b i n d i n g a s s a y s i n t h e p r e s e n c e o f u n l a b e l e1 A 6 a n t i b o d y .

0 . 0 6 - -

0 . 0 4 -

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