C o m u n i c a c i o n e s o r a l e s · p r oducción de citoquinas pro i n f l a m a t o r i a...

C o m u n i c a c i o n e s o r a l e s

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AUTOINMUNIDAD Y TOLERANCIA

O-1. INDUCCIÓN DE TOLERANCIA A LPSEN MONOCITOS HUMANOS POR LA VÍADEL CD14 SOLUBLE

B Vázquez, C Moreno, N Ramírez, A Sánchez-IbarrolaServicio de Inmunología. Clínica Universitaria. Faculadde Medicina. Universidad de Navarra. Pamplona

La molécula reconocedora del receptor mul-timérico para LPS en monocitos (mCD14) sep resenta en condiciones fisiológicas comosCD14. Se ha visto que sCD14 es responsable dela activación funcional por LPS de células queno expresan mCD14. En monocitos humanos launión de complejos sCD14-LPS a un receptor noidentificado supone activación monocitaria yp roducción de citoquinas pro i n f l a m a t o r i a s .N o s o t ros hemos documentado pre v i a m e n t eestos aspectos funcionales monocitarios en unmodelo experimental de depleción de mCD14mediante bloqueo de la exocitosis por Bre f e l d i n aA (BFA). En el presente trabajo y utilizando elmismo modelo, queremos tratar la posibilidadde inducción de tolerancia a LPS a través de lainteracción de complejos LPS-sCD14 y su re c e p-t o r.

Se cultivaron células mononucleares de san-g re periférica de donantes sanos en presencia de 10 µg/ml BFA durante 24 horas a 37°C, 5% CO2.A continuación se lavaron y se incubaron con 10 ng/ml LPS de E. coli durante 6 horas.P o s t e r i o rmente se efectuó un segundo estímulocon 100 ng/ml LPS durante 4 horas. La activa-ción celular se comprueba mediante cuantifica-ción de las células productoras de citoquinasi n t r a c e l u l a res; distintos controles incluyen unaúnica exposición a LPS para comparar con elmodelo de tolerancia a LPS.

En monocitos humanos estimulados por com-plejos sCD14-LPS no vemos diferencia en la acti-vación cuando se exponen a una o dos dosis deLPS. La producción de citoquinas pro i n f l a m a t o-rias es la misma en el modelo de inducción de tole-rancia a LPS que en el modelo de activación por

una única exposición a LPS (n = 7, IL-1, β = 14,8%rango 11-20, TNFα = 15,6% rango 11-18, v e r s u sIL-1β = 18% rango 8-23, TNFα = 18% rango 9-21).Se discute el hecho y la significación fisiopatoló-gica de la resistencia a la tolerancia a PS por víasCD14.

O-2. PÚRPURA TROMBOPÉNICA INDUCIDAPOR UN ANTICUERPO MONOCLONAL DIRIGIDO FRENTE A UNA PROTEÍNA DE SUPERFICIE 35 Kda EXPRESADA EN PLAQUETAS Y ENDOTELIO DE RATÓN

M. Rodríguez-Calvillo, I. Gabari, M. Duarte, G. Mazzolini, J. Prieto, I. MeleroUnidad de Terapia Génica. Departamento de MedicinaInterna. Universidad de Navarra. Pamplona

La púrpura trombótica inmune (PTI) es unade las causas más frecuentes de trombopenia quese encuentra en la práctica clínica hematológi-ca. Nosotros hemos producido un panel de anti-cuerpos monoclonales inmunizando ratas conlíneas de células endoteliales derivadas de ratón.Uno de estos anticuerpos (EOL5F5) inmunopre-cipita una proteína de superficie de 35 Kda encondiciones reductoras y no reductoras a part i rde lisados de plaquetas y de células endotelialesde ratón. La administración in vivo de este anti-cuerpo monoclonal purificado induce una pur-pura clínica franca con un número grande depetequias que se distribuyen uniformemente enla superficie de la piel. En estos ratones ocurreuna trombopenia intensa pero transitoria, ya quese recupera completamente en una semana.Mediante inmunohistoquímica se detecta elantígeno reconocido por EOL5F5 en los capila-res dérmicos sugiriendo que los efectos dañinosdel anticuerpo sobre células endoteliales pue-den además de la trombopenia contribuir a lapúrpura que se observa y explicar la localizaciónselectiva de las hemorragias en la piel. El síndro-me hemorrágico inducido por EOL5F5 imita lafase efectora de la púrpura trombopénica inmu-ne y permite establecer modelos experimentalesde utilidad.

XXVII CONGRESO DE LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE INMUNOLOGÍA VOL. 20 SUPL.1 / 2001

O-3. INMUNOLOGÍA DE LA DIABETES EN UN MODELO MURINO RIP-IFN EN BACKGROUND SUSCEPTIBLE (NOD) Y RESISTENTE (NOR)

A. Alba, J. Verdaguer, M. C. Puertas, J. Carrillo, F. Bosch*, R. Pujol-Borrell, M. Vives-PiUnidad de Inmunología. Hospital Germans Trías iPujol, Badalona y *Departamento de Bioquímica.Facultad de Veterinaria. UAB. Barcelona

La diabetes tipo I se produce por una destru c-ción autoinmune de las células beta del páncre a s ;f a c t o res ambientales y genéticos son determ i-nantes en el proceso. En páncreas de pacientes dia-béticos se han detectado transcritos de interf e ro-nes de tipo I.

O b j e t i v o : d e t e rminar el papel del IFN-β en laetiopatogenia de la enfermedad.

M é t o d o s : generación de un ratón transgénicoR I P - I F N -β (CD1) que expresa IFN-β humano enlas células productoras de insulina; re t ro c ru z a-miento con ratones NOD (modelo de diabetesespontánea) y NOR (resistente); determ i n a c i ó nde incidencia, grado de insulitis, caracterizacióndel infiltrado, autoanticuerpos, secreción y conte-nido de insulina.

Resultados: a) aceleración y aumento de la inci-dencia de la enfermedad en F1(RIP-IFN-β x NOD)y (RIP-IFN-β x NOR) (Tabla I); b) presencia deinsulitis en función de la edad, aumentada en RIP-I F N -β v s CD1 (control); c) infiltrado: c.1) TCD4+> TCD8+ > DCs > macrófagos > B; c-2) hipere x-p resión de MHC de clase I en células β; d) pre s e n-cia de anticuerpos anti-islote (ICA); e) el transgénno causa disminución de la secreción de insulina.

Conclusiones: la expresión de IFN-β c o n t r i b u y ea la autoinmunidad aumentando la expresión deMHC de clase I y presumiblemente la presentaciónantigénica endógena. El proceso se ve aceleradoen b a c k g ro u n d susceptible y resistente y, aunquede momento los estudios se han centrado en F1,se espera un aumento de la incidencia en sucesi-vas generaciones.

O-4. NUEVOS AUTOANTICUERPOS EN LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO

I. Aguilera, J.R. García-Lozano, A. Núñez-Roldán,I. WichmannServicio del Inmunología. Hospital Universitario Virgendel Rocío. Sevilla

Antecedentes: a una paciente con lupus eritema-toso sistémico (LES) se le detectaron en el sueroanticuerpos que producían un patrón de immu-n o f l u o rescencia indirecta (IFI) atípico, en célulasHep-2, con numerosos trazos en el citoplasma, noobservado anteriormente en nuestro laboratorio.

O b j e t i v o s : identificar la diana o dianas celulare sreconocidas por los autoanticuerpos presentes enel suero de esta paciente.

M é t o d o s : a) IFI en células Hep-2 para analizarla distribución del antígeno(s); b) We s t e rn blot;c) rastreo de una genoteca de expresión HeLa λ-Zap para aislar clones expresando el/los antíge-nos; d) secuenciación del cDNA obtenido y bús-queda de homologías en los bancos de datos.

R e s u l t a d o s : se aislaron dos clones, CVR8 con uni n s e rto de 1,2 Kb y CVR18 con un inserto de 1,0Kb. Una vez secuenciados se identificó el insert ode CVR8 con el oncogén K-ras y el de CVRl 8 conel gen HKE4 también llamado RING5, una pro t e í-na con regiones ricas en histidina por lo que se cre eque es una proteína transmembrana, aunque sufunción es desconocida. Tras expresar cada uno delos antígenos en E. coli se purificaron anticuerposdel suero por afinidad con estos antígenos.Encontramos que los anticuerpos anti-K-ras nosreconocen la misma banda en WB (de 130 Kda p rox.) que reconocía el suero original. Los anti-cuerpos anti-HKE4 no producen ninguna bandaen WB pero re p roducen el patrón de immunofluo-rescencia observado también con el suero original.

C o n c l u s i o n e s : la identificación de estos nuevosanticuerpos viene a ampliar la ya vasta gama deautoanticuerpos que aparecen en el LES dirigidosf rente a proteínas de replicación y transcripción.Estos anticuerpos de pacientes con enferm e d a d e sautoinmunes pueden ser herramientas muy útilespara estudiar mecanismos de fisiología celular.

O-5. POLIMORFISMO DEL GEN FcγRIIIB EN PACIENTES ESPAÑOLES DE LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO (CASO I)

F. Aguilar, M.ª P. Bermudo, Y. Vega, J. SánchezRomán, M.ª F. González Escribano, A. NúñezRoldánServicio de Inmunología. Hospital Universitario Virgendel Rocío. Sevilla

I n t ro d u c c i ó n : el lupus eritematoso sistémico(LES) es una enfermedad autoinmune caracteri-

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Edad % % %Modelo (sem) IDDM IDDM M IDDM H

RIP-IFN-β 12 7 13 0

FI(RIP-IFN-β 12 10 18 0x NOD)

FI(RIP-IFN-β 12 25 29 20x NOR)

RIP-IFN-β 30 14 26 0

Tabla I

INMUNOLOGÍA COMUNICACIONES ORALES

zada por la presencia de autoanticuerpos e inmu-nocomplejos circulantes. Defectos en los genesque tienen relación con la eliminación de inmu-nocomplejos, tales como: los componentes tem-pranos y re c e p t o res del complemento y los re c e p-t o res de la fracción Fc de las inmunoglobulinas( F cγRs), pueden estar implicados en la suscepti-bilidad o evolución del LES. FcγRIIIB se expre s aen los neutrófilos y traduce la señal para la fagoci-tosis y para el estallido respiratorio. Se ha descritoun polimorfismo en este gen, denominadoNA1/NA2 que consiste en la sustitución de 5 basesque se traduce en el cambio de 4 aminoácidos. Seha comprobado que los neutrófilos de individuosNA2NA2 muestran niveles más bajos de fagocito-sis que los de individuos NA1NA1.

O b j e t i v o s : estudiar la influencia del polimorf i s-mo NA1/NA2 del gen FcγRIIIB en la susceptibili-dad o evolución del LES.

Material y métodos: n u e s t ro estudio se llevó acabo en 276 pacientes de lupus (99 nefritis) y 194controles mediante un sistema de PCR-SSP.

R e s u l t a d o s : la frecuencia del genotipo NA2NA2se encontraba aumentada en pacientes con respec-to a los controles (61,2 v e r s u s 51,0%; p=0,03; OR= 1,5). No se encontraron diferencias significati-vas en la distribución de frecuencias genotípicas oalélicas entre pacientes con y sin nefritis.

Conclusiones: estos resultados indican que elp o l i m o rfismo del gen FcγRIIIB puede estar impli-cado en la susceptibilidad al lupus eritematoso sis-témico.

O-6. POLIMORFISMO DEL GEN FcγRIIIB EN PACIENTES ESPAÑOLES DE LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO (CASO II)

F. Aguilar, M.ª P. Bermudo, Y. Vega, J. SánchezRomán, M.ª F. González Escribano, A. NúñezRoldánServicio de Inmunología. Hospital Universitario Virgendel Rocío. Sevilla

I n t ro d u c c i ó n : el lupus eritematoso sistémico(LES) es una enfermedad autoinmune caracteri-zada por la presencia de autoanticuerpos, concen-traciones elevadas de componentes activos delcomplemento y formación y deposición de inmu-nocomplejos. Estos estímulos provocan la activa-ción de los leucocitos de sangre periférica y de lascélulas endoteliales que secretan moléculas proin-flamatorias que desencadenan el desarrollo de glo-m e rulonefritis y/o vasculitis severas. MCP-1 esuna potente quimiocina atrayente de monocitos alas zonas de inflamación. Recientemente, se hadescrito un polimorfismo en la región pro m o t o r ant –2518 (A/G) de este gen que afecta a los nivelesde transcripción. Los individuos AG o GG presen-

tan mayores niveles de transcripción que los indi-viduos AA.

O b j e t i v o : estudiar la influencia del polimorf i s-mo del gen MCP-1 en la susceptibilidad y mani-festaciones clínicas del LES.

Material y métodos: el polimorfismo de MCP-1se determinó en 276 pacientes de LES (99 nefritisy 54 vasculitis cutáneas) y 194 controles median-te un sistema de PCR-RFLP con la enzima de re s-tricción PvuII.

R e s u l t a d o s : no se encontraron diferencias sig-nificativas en cuanto a la distribución de fre c u e n-cias entre pacientes y controles, ni cuando se divi-d i e ron los pacientes según la presencia o ausenciade nefritis. Cuando los pacientes se clasificaro nsegún la presencia o ausencia de vasculitis cutá-neas la frecuencia de los heterozigotos AG seencontraba aumentada entre pacientes con vascu-litis (52 versus 32%; p = 0,006; OR = 2,3).

C o n c l u s i o n e s : estos resultados indican que elpolimorfismo del gen MCP-1 puede estar implica-do en el desarrollo de vasculitis cutánea en pacien-tes de lupus eritematoso sistémico.

O-7. IDVC CON CLÍNICA AUTOINMUNE:DIFICULTADES DIAGNÓSTICAS YTERAPÉUTICAS

L. Sánchez, F. León, C. Cámara, R. Pena, J. A. Garc í a ,A. Bootello, J. L. CastañerServicio de Inmunología. Hospital Ramón y Cajal.Madrid

En la IDVC se distingue un grupo de pacientesque, a pesar de cumplir los criterios del IUIS ( nive-les séricos disminuidos de IgG e IgA, deficientef o rmación de anticuerpos específicos y exclusiónde otras causas de hipogammaglobulinemia), pre-sentan una clínica predominantemente autoinmu-ne.

Estos pacientes plantean dificultades tanto enel diagnóstico (por la escasa clínica infecciosa)como en el manejo terapéutico.

P resentamos tres pacientes con IDVC cuya clíni-ca está dominada por los fenómenos autoinmunes(citopenias, gastritis atrófica, enteropatía autoinmu-ne, neumonitis intersticial y artritis). El tratamientode los brotes incluyó inmunosupre s o res y gamma-globulina a dosis moduladoras (0,4 g/kg/día duran-te 5 días). A pesar de la ausencia de infecciones,excepto las relacionadas con la inmunosupre s i ó n ,las cifras de IgG sérica por debajo de 300 mg/dl endos de los tres pacientes, llevaron a instaurar de for-ma empírica y profiláctica, tratamiento con inmu-noglobulina IV a dosis sustitutiva (0,4 g/kg/mes).Tras un periodo medio de seguimiento de 12 meses,los tres pacientes perm a n e c i e ron libres de infeccio-nes y la patología autoinmune experimentó franca

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mejoría en dos de ellos, empeorando tras la re t i r a d ade la gammaglobulina para la vacunación diagnós-t i c a .

A pesar de la dificultad en establecer una re l a-ción causa-efecto entre la normalización de losniveles séricos de gammaglobulinas y la mejoríade los procesos autoinmunes, estos casos ilustranla posible utilidad de este abordaje.

O-8. MICA Y NO MICB ES EL GEN QUEDETERMINA LA SUSCEPTIBILIDAD A LAARTRITIS PSORIÁSICA

S. González, J. Martínez-Borra, J. C. Torre-Alonso,A. López-Vázquez, C. López-LarreaBiología Funcional. Universidad de Oviedo. Servicio deInmunología. Hospital Central de Asturias. Oviedo

O b j e t i v o : d e t e rminar si MICA está primaria-mente asociado con artritis psoriásica (PsA) o suasociación es secundaria a desequilibrio de liga-miento con un gen cercano.

M é t o d o s : se analizaron 65 pacientes con PsA y109 controles. En estos individuos fueron tipadospara Cw*0602, HLA-DR, HLA-B y se determ i n a-ron las repeticiones de un microsatélite situado enel intrón 1 de MICB.

Resultados y conclusiones: HLA-Cw*0602 estabai n c rementado en pacientes con PsA (Pc <0,00001,OR = 7). Hay un ligero incremento de todos los ale-los que están en desequilibrio de ligamiento con Cw6en nuestra población (B13, B37, B50 y B57). MICA-A9 estaba incrementado en pacientes con PsA(Pc<0,0012, OR = 3,36). Hay un incremento secun-dario de los alelos de HLA-B que están en desequili-brio de ligamiento con MICA-A9, como HLA-B38,B39 y B57. MICB-CA22 está incrementado en enfer-mos con PsA (Pc<0,05, OR=3,8). Este polimorf i s m of o rma parte del haplotipo extendido Cw6-B57-MICA-A9-MICB-CA22, y su asociación es secunda-ria a desequilibrio de ligamiento. Los difere n t e shaplotipos asociados con PsA llevan diferentes ale-los MICB y HLA-DR. Esto sugiere que MICA está pri-mariamente asociado con PsA, y HLA-B38, B39, B57y MICB-CA-22 están asociados secundariamente aldesequilibrio de ligamiento con MICA-A9.

O-9. IMPLICACIÓN FUNCIONAL DELPOLIMORFISMO GENÉTICO DE CD154

M. J. Citore, P. Pérez-Aciego, A. Durántez*Fundación Lair. *Medicina Interna I. Clínica Puerta deHierro. Madrid

CD154 es una proteína implicada en la re g u l a-ción del sistema inmune y en procesos como la

inflamación. Su hipere x p resión se ha re l a c i o n a d ocon enfermedades autoinmunes y su ausencia coninmunodeficiencias, lo que indica que su expre-sión debe estar sujeta a un control estricto. Estaregulación es fundamentalmente postranscripcio-nal por estabilidad de ARNm y está involucradosu extremo 3UTR. En esta región se encuentra unm i c rosatélite (CA)n que podría influir en dichaestabilidad y por tanto en la expresión proteica deCD154.

O b j e t i v o : valorar el posible papel funcional delm i c rosatélite localizado en el 3UTR del ARNm deCD154.

M é t o d o s : células polimorf o n u c l e a res de sangreperiférica (PBMC) de 30 sujetos sanos con distin-tos grupos de alelos del polimorfismo: <24CA,24CA (alelo mayoritario) y >24CA, se sometiero na varios estímulos in vitro y se midió la expre s i ó nde CD154 en LT y LB por citometría de flujo.

R e s u l t a d o s : cuando los PBMC se activaron conPMA más ionomicina o SAC más IL2, no se encon-traron diferencias ni en los niveles de CD154 ni ensu cinética de expresión. Sin embargo, tras 72horas de estimulación con PHA más anti-CD28, lae x p resión de CD154 disminuía en homocigotospara 24CA o <24 CA, mientras que en los homo-cigotos para alelos con >24CA dicha expre s i ó nseguía aumentando. La diferencia de expre s i ó ne n t re estos grupos era significativa tanto en LT (p = 0,0068) como en LB (p = 0,024).

C o n c l u s i ó n : el polimorfismo localizado en el3UTR de CD154, puede estar involucrado en elmantenimiento de la expresión de dicha pro t e í n aante estímulos específicos de LT.

O-10. ARA, EMA, GECA Y AGA AUTOANTICUERPOS EN PACIENTES ESPAÑOLES CON DIABETES MELLITUSINSULINODEPENDIENTE Y SU RELACIÓNCON EL FENOTIPO HLA

J. M. Martín Villa*, J. C. López Suárez*, M. PérezBlas*, J. Martínez-Laso**, S. Ferre López**, J. Manzanares***, G. Lledó****, A. Arn a i zVillena*,***Inmunología. Facultad de Medicina. UniversidadComplutense de Madrid. **Inmunología, ***Gastroen -terología Infantil, ****Endocrinología Infantil. HospitalUniversitario 12 de Octubre. Madrid

Se estudió la frecuencia de anticuerpos frente areticulina, endomisio y gliadinaen en un grupo de86 pacientes diabéticos. Además se determinó sufenotipo HLA. Como grupo control se considera-ron una población de 76 pacientes con enferm e-dad celíaca y 176 individuos sanos no empare n t a-dos.

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Cuatro pacientes diabéticos (5%) poseían ARA-IgG (patrón R1), ocho (9%) AGA-IgG y ocho (9%)AGA-IgA. No se encontraron EmA y GECA.

Al comparar el grupo de diabéticos ARA-IgG+con el ARA-IgG-, se encontró un aumento en laf recuencia de HLA-DR7 (p = 0,064), mientras queal comparar el grupo AGA-IgG+ con el AGA-IgG,HLA-DR6 y HLA-DQ1 mostraron un aumento sig-nificativo (p = 0,034 y p = 0,015, re s p e c t i v a m e n-te).

Cuando se re a l i z a ron comparaciones con ung rupo de pacientes celíacos (no diabéticos) seobservó un aumento en la frecuencia de HLA-DR4y HLA-DQ3 (p = 0,00001) en el grupo de pacien-tes AGA-IgA+, mientras que HLA-DQ2 estaba dis-minuido en el grupo de pacientes diabéticos AGA-IgG+ y AGA-IgA+ (p=0,0045).

Finalmente, al comparar el grupo diabético conun grupo control sano, hay un descenso en la fre-cuencia de HLA-DR7 en el grupo ARA-IgG- (p =0,0000001), mientras que en el grupo AGA-IgG-HLA-DQ3 está aumentando (p = 0,00005) y HLA-DR6 y HLA-DQ1 disminuidos (p = 0,0072 y p =0,00001) respectivamente). Estos datos sugiere nque el componente genético relacionado con laaparición de los anticuerpos específicos de celia-quía en pacientes diabéticos, difieren según el tipode autoanticuerpos y es también diferente al com-ponente genético de susceptibilidad a padecer dia-betes en la población española.

O-11. ASOCIACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS DE LA MBL CON ELFENOTIPO DEL LUPUS ERITEMATOSOSISTÉMICO

M. I. Garc í a - L a o rden, I. Rua-Figueroa*, M. J. Citores**, P. Pérez-Aciego**, J. C. Rodríguez-Pérez***,C. Erausquin*, A. Bilbao*, A. Anabitarte**,A. Domínguez, C. Rodríguez-GallegoServicios de Inmunología, *Reumatología y ***Nefro -logía. Hospital Dr. Negrín. Las Palmas Gran Canaria.**Fundación LAIR (Grupo de Estudio de Genética deLES)

La MBL es una proteína sérica que participa enla inmunidad innata. Su defecto, como el de otro scomponentes del sistema de complemento, se haasociado a un aumento de la susceptibilidad ainfección y a desórdenes autoinmunes. Se anali-z a ron en población canaria dos grupos de muje-res: 82 pacientes con LES y 188 controles. Loshaplotipos del gen se estudiaron mediante PCR-RFLP, SDM-PCR-RFLP y PCR-SSP.

No se observ a ron diferencias significativas en lasf recuencias génicas ni genotípicas entre pacientes yc o n t roles. Al analizar a las pacientes según sus carac-terísticas clínicas, se vió que la prevalencia de anti-

cuerpos anti-RNP disminuía en aquellas con alelosmutados (p=0,034), así como con genotipos bajo on o - p ro d u c t o res. De manera similar, la pre v a l e n c i ade anticuerpos anti-Sm era menor en las pacientescon genotipos bajo o no-pro d u c t o res (p=0,024). Poro t ro lado, en pacientes homozigotas o hetero z i g o t a spara alelos mutados, las edades de inicio de enfer-medad y de cumplimiento de 4 criterios, fuero nm a y o res (p = 0,009 y p = 0,022).

Los polimorfismos de MBL no se asocian conmayor susceptibilidad a padecer LES; sin embar-go, pueden afectar a la presentación de la enferme-dad, al menos en mujeres. Las pacientes con défi-cit de MBL: a) presentan una edad de inicio de lae n f e rmedad más tardía; b) la prevalencia de anti-cuerpos anti-Sm y anti-RNP es menor.

O-12. PRESENCIA DE ANTICUERPOS FRENTE A SEROALBÚMINA BOVINA EN PACIENTES DIABÉTICOS CON AUTO-ANTICUERPOS CARACTERÍSTICOS CELÍAQUIA

A. Fuertes Huerta, C. Rodríguez Juan, L. SalaSilveira, M. Pérez Blas, M. J. Recio, J. M. MartínVilla Servicio de Inmunología. Facultad Medicina. UCM.Madrid

Los anticuerpos anti BSA se implicaron comofactor de riesgo en la aparición de la DMID.Además algunos diabéticos desarrollan anticuer-pos EmA, ARA, y AGA, marc a d o res de enferm e-dad celíaca.

Se estudió la presencia de anticuerpos frente aBSA en diabéticos divididos en dos grupos segúntenían (n = 16) o no (n = 63) EmA, ARA o AGA, y secomparó con un grupo control (n=45), pacientescelíacos (n=30) y pacientes con tiroiditis (n=10).

Se realizó un ELISA adsorbiendo BSA sobreplacas de poliestireno. Se utilizó un suero quep roducía unas lecturas espectrofotométricas muyelevadas para crear una curva patrón y transfor-mar los valores de densidad óptica (DO) obteni-das en unidades estándar. Se utilizaron 45 suero ssanos para establecer el punto de corte a part i rdel cual se consideraba que el suero era positivo(X + 3SD = 26,2 U), y se compararon las mediasde las unidades obtenidas en cada grupo (Mann-W h i t n e y ) .

Sólo los celíacos (X = 38,8 U) y los diabéticoscon anticuerpos de enfermedad celíaca (X = 35,7U) mostraron niveles elevados de anticuerposanti-BSA por encima del punto de corte estableci-do, a diferencia del resto de los grupos.

Además, estos valores difieren estadísticamen-te al compararlos con cualquiera de los otros tre sgrupos, mientras que no difieren entre sí.

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Los pacientes con un aumento de la perm e a b i-lidad intestinal (enfermedad celíaca o diabéticoscon marcadores de enfermedad celíaca), producenanticuerpos anti-BSA.

TRANSDUCCIÓN DE SEÑAL APOPTOSIS Y MOLÉCULAS

DE ADHESIÓN

O-13. LAS SEÑALES INHIBIDORAS INICIADAS POR CD3-<EPSILON> DEPENDEN DE LA FOSFORILACIÓN SELECTIVA DE LA TIROSINA N-TERMINALDE SU ITAM

M. Guirado, T. Orta, I. de Aós, L. Rivas*, C. Terhorst**, M. Zubiaur***, J. SanchoInstituto de Parasitología y Biomedicina, ConsejoSuperior de Investigaciones Científicas, Granada.*Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superiorde Investigaciones Científicas, Madrid. **Division ofImmunology, Beth Israel Deaconess Medical Center,Harvard Medical School, Boston, MA. EE.UU.***Hospital Clínico Universitario San Cecilio. Granada

Se estudiaron señales tempranas mediadas porCD3-<epsilon> en células Jurkat TCR/CD3+transfectadas con receptores quiméricos CD8<alp-ha>-CD3-<epsilon> (denominado CD8-<epsilon>wt) o los correspondientes mutantes en las tiro s i-nas del motivo de secuencia denominado ITA M( Y 1 7 0 F, Y181F o Y170F/181F). La estimulaciónsimultánea del TCR/CD3 endógeno y de la quime-ra Y181F induce una inhibición selectiva de: a) lafosforilación en tirosina de determinadas pro t e í-nas; b) la liberación de Ca2+ intracelular; y c) laactivación de las MAP-quinasas Erk1 y Erk2.

Por el contrario, no se observ a ron estos efectoscon las otras quimeras (CD8-<epsilon> wt, Y170Fo Y170F/Y181F). Estos y otros datos sugieren quelas señales mediadas por CD3-<epsilon> depen-den del grado de fosforilación de su ITAM y de lasproteínas efectoras asociadas al mismo.

O-14. LA ACTIVACIÓN DE RAS/ERK MEDIADA POR CD38 O EL TCR/CD3 PUEDEOCURRIR POR UNA VÍA ALTERNATIVAQUE NO REQUIERE LOS ITAM DE CD3-zeta,NI LOS ADAPTADORES LAT O SLP-76

M. Zubiaur, B. Malissen*, F. Malavasi**, J. Sancho***Hospital Clínico Universitario San Cecilio. Granada.* C e n t re d'Immunologie CNRS/INSERM de Marseille- L u m i n y. Marseille, Francia. **Laboratory of Immu -

nogenetics. Torino, Italia. ***Instituto de Parasitologíay Biomedicina, Consejo Superior de InvestigacionesCientíficas. Granada

Los linfocitos T pueden activarse a través delreceptor para el antígeno (TCR/CD3) o mediantela estimulación de otros re c e p t o res de membranae n t re los que se incluye el correceptor CD38.Datos previos de nuestro laboratorio indican queel módulo CD3-gamma, -delta, -epsilon es nece-sario y suficiente para activar el linfocito T a tra-vés de CD38. En este trabajo mostramos la seña-lización mediada por CD38 en linfocitos T quee x p resan una subunidad CD3-zeta del TCR/CD3que carece de todos los ITAM (CD3-zeta tru n c a-da), o en linfocitos deficientes en la expresión delos adaptadores LAT o SLP-76. En estos linfocitosla estimulación de CD38 con el anticuerpo mono-clonal anti-CD38, IB4, o del TCR/CD3 con el anti-cuerpo anti-CD3, OKT3, induce la activación dela MAP quinasa Erk independientemente de lap resencia de los ITAM de CD3-zeta, de la fosfori-lación de LAT y/o de la presencia de LAT o SLP-76. Por tanto, los resultados sugieren que la acti-vación de Ras/Erk mediada por CD38 o elTCR/CD3 puede ocurrir por una vía altern a t i v aque no re q u i e re CD3-zeta ni la fosforilación deL AT o SLP-76.

O-15. WIP (WASP INTERACTING PROTEIN)REGULA POLIMERIZACIÓN DE ACTINA ATRAVÉS DE N-WASP Y LA FORMACIÓN DEFILOPODIUM

N. Martínez-Quiles*, R. Rohatgi**, I. M. Antón*, M. Medina***, J. H. Hartwig****, R. S. Geha*,*****,N. Ramesh**Division of Immunology. Childre n ’s Hospital and****Division of Experimental Medicine Brigham andWomen’s Hospital. *Departments of Pediatrics, **CellB i o l o g y. ***Neurology and ****Medicine. HarlardMedical School. Boston, Massahusetts. EE.UU.

En 1994 fue clonado el gen mutado en la inmu-nodeficiencia síndrome de Wi s k o t t - A l d r i c h(WAS), desde entonces diversos estudios han rela-cionado la proteína (WASP) con la regulación delcitoesqueleto de actina. Nuestros estudios se hancentrado en la caracterización de WIP, una pro t e í-na que interacciona con WA S P. En esta comunica-ción presentamos hallazgos que serán re c i e n t e-mente publicados (N a t u re Cell Biology, vol 3,May), que sugieren que WIP es un regulador deWA S P. A través del estudio de la fisiología de lainteracción entre un homólogo de WA S P, llamadoN - WASP y WIP, concluimos que el complejoWASP/WIP es un regulador de la activación del

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complejo Arp2/3 en la polimeración de actina, yde la formación de filopodia, en la ruta de GTPasaCdc42.

O-16. ACTIVACIÓN DE LA RUTADE SEÑALIZACIÓN RHO-RHO-QUINASA(P160ROCK) POR LA QUIMIOQUINA SDF-1:PAPEL DE P160ROCK EN EL MANTENIMIENTO DE LA MORFOLOGÍA Y LA MIGRACIÓN DE LINFOCITOS

J. Román Cabrero, M. Vicente-Manzanares, M. Rey,M. Pérez-Martínez, F. Sánchez-MadridServicio de Inmunología. Hospital de La Princesa.Universidad Autónoma de Madrid. Madrid

La ruta de señalización que implica a la GTPasaRho y a p160ROCK (quinasa asociada a Rho) en laactivación celular inducida por SDF-1 se ha estu-diado en linfocitos humanos de sangre periférica.SDF-1 induce la activación de RhoA pero no la deRac1. La activación de RhoA induce la activaciónde p160ROCK, la cual conduce a la fosforilación deMLC (cadena ligera de miosina), que por lo tantoes dependiente tanto de la actividad de RhoA comode p160ROCK. El análisis cinético de la activaciónde RhoA, p160ROCK y de la fosforilación de MLCKs u g i e re una activación secuencial de las tres molé-culas. Se examinó el papel de esta ruta de señaliza-ción en la morfología celular y en las respuestas fun-cionales a SDF-1 mediante el uso de distintosi n h i b i d o res químicos. La inhibición de pl60ROCKno bloquea la polimerización de actina a corto pla-zo inducida por SDF-1 ni afecta a la polaridad celu-l a r, pero induce la formación de largos apéndicesc e l u l a res sustentados por actina. Por el contrarioML-7 (inhibidor de MLCK) inhibe completamentela polarización celular. Además, la inhibición en dis-tintos pasos de la ruta Rho-p160ROCK-MLCK blo-quea la migración de los linfocitos inducida porSDF-1. Nuestros resultados indican que el eje Rho-pl 60ROCK juega un papel decisivo en el control dela morfología celular como condición previa parala quimiotaxis dirigida de 1.

O-17. PROTEÍNAS ADAPTADORAS Y SEÑALIZACIÓN MEDIADA POR CD5

J. M. Vilà, I. Gimferrer, O. Padilla, M. Arman, L. Places, J. Vives, J. Alberola-Ila, F. LozanoInstitut Clínic d'Infeccions i Immunología (ICII).Hospital Clínic. Facultat de Medicina. Universitat deBarcelona. Barcelona

I n t ro d u c c i ó n : CD5 es una glicoproteína linfoci-taria capaz de modular las señales mediadas por el

receptor antigénico por mecanismos todavía nobien conocidos. CD5 es susceptible de ser fosfori-lado y de inducir fosforilación de numerosos sus-tratos intracelulares. Se desconoce si dichas fosfo-rilaciones incluyen proteínas con funciónadaptadora que acoplarían CD5 a diferentes cas-cadas señalizadoras.

Objetivo: estudiar el patrón de proteínas adap-tadoras asociadas a Grb2, inducido durante la acti-vación linfocitaria vía CD5.

M é t o d o s : análisis del contenido en fosfotiro s i-nas de proteínas adaptadoras inmunopre c i p i t a d a sde lisados de células Jurkat estimuladas vía CD3 oCD5.

R e s u l t a d o s : el patrón de fosfoproteínas asocia-das a Grb2 en células estimuladas vía CD5 difieredel inducido vía CD3. Existen bandas comunes de120 y 76 kD y bandas específicas para CD3 o paraCD5 de 36/38 y 55 kD, respectivamente. La bandade 120 kD corresponde a Cbl y la de 36/38 kD a LAT.La intensidad de la fosforilación de Cbl vía CD5 essimilar a la inducida vía CD3. Es rápida y transito-ria y no se afecta por la deleción de 2/3 C-term i n a l e sde la región citoplasmática de CD5, ni por sustitu-ción de sus residuos tirosina. En cambio, la de LATes muy débil comparada con la inducida vía CD3.

C o n c l u s i o n e s : dado el papel señalizador negati-vo atribuido a Cbl, el predominio de la fosforila-ción de Cbl sobre LAT podría estar relacionado conla función moduladora negativa re p o rtada paraCD5 en timocitos y células B1a.

O-18. DETECCIÓN EN UNA LIBRERÍA LINFOCITARIA DE LA INTERACCIÓN DELAS PROTEÍNAS DEL CICLO CELULAR SKP2Y CksH1: EFECTO SOBRE LA FUNCIÓN DECDK2 QUINASA

L. Mongay, S. Plaza, E. Vigorito, C. Serra-Pagès, J. VivesServei d’Immunología. Institut Clínic d’Infeccions iImmunología (ICII). Hospital Clínic. Barcelona

La proliferación celular, la apoptosis y destru c-ción proteica por ubiquitinización son pro c e s o scuyo equilibrio es esencial para una adecuadaregulación de la respuesta inmune. Estos procesosse pueden considerar como mecanismos estrecha-mente relacionados con los mecanismos re g u l a-d o res del ciclo celular. Bajo esta línea nos pro p u-simos conocer las interacciones proteicas de lamolécula SKP2 (S-phase kinase associated pro t e i n)que se ha descrito que actúa en los procesos de ubi-quitinización y en la regulación del ciclo celularf o rmando complejos con ciclina A y CDK2. Paraello, mediante la técnica de Two hybrid, en la quese utilizó una librería de linfocitos humanos, sedetectó la interacción de SKP2 con CksHs1. Se

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había descrito que la proteína CksHsl se podía aso-ciar con ciclina A y CDK2, pero aún no se conocesu función ni tampoco se conocía su capacidad deunión a SKP2. La unión de SKP2 con CksHs1 queo b s e rvamos por Two Hybrid se confirmó median-te estudios de coprecipitación en las líneas linfoi-des CEM y Jurkat. Utilizando los adecuados c o n s-tructs observamos también que SKP2 se asocia conCksH1por su región C terminal. Debido a queambas moléculas se asocian con CDK2, estudia-mos su acción sobre la función de CDK2, obser-vando mediante transfecciones en células COS-7que la sobre e x p resión de CksHs1 inhibe la activi-dad CDK2 quinasa y que la expresión adicional deSKP2 neutraliza esta inhibición y restaura la acti-vidad CDK2 quinasa. Asimismo se demostró quela asociación de CksHs1 y SKP2 es mutuamenteexclusiva sugiriendo que podría poseer un efectofuncional sobre la regulación de la actividad qui-nasa de CDK2.

O-19. CUANDO LAS CÉLULASDENDRÍTICAS SON INFECTADAS CON ADENOVIRUS RECOMBINANTESDEFECTIVOS SE ACTIVA NFκ-B Y MADURANPARCIALMENTE

M. Duarte, P. Bova, M. Rodríguez-Calvillo, I. Narvaiza, C. Qian, J. Prieto, I. MeleroUnidad de Terapia Génica. Departamento de MedicinaInterna. Universidad de Navarra. Pamplona

Las células dendríticas se vienen usando comoadyuvantes naturales para inducir re s p u e s t a sinmunitarias con utilidad terapéutica. Para con-seguir esto, los genes que codifican para antígenosrelevantes son transfectados en células dendríti-cas mediante vectores virales y no virales. Los ade-n o v i rus recombinantes defectivos que codificanpara antígenos o citoquinas, se utilizan con graneficiencia para transfectar e x - v i v o células dendrí-ticas. Hemos estudiado los efectos de infectar célu-las dendríticas humanas y murinas, con adenovi-rus que codifican para el gen re p o rt e ro β-galactosidasa (AdCMVLacZ). La infección conAdCMVLacZ induce la translocación nuclear dede diferentes factores de transcripción de la lafamilia de NFκ-B, a través la inducción de fosfori-lación de Ik-B, según se demuestra mediante gelesde re t a rdo de movilidad e i n m u n o b l o t s. La activa-ción de NFκ-B se indujo también, con cápsidesvirales semipurificadas o adenovirus sin transgen,pero no mediante un adenovirus que codifica paraun inhibidor dominante negativo de IkB( A d C M V Iκ-B). AdCMVLacZ a diferencia deA d C M V Iκ-B, induce aumentos en la expresión deCD40, CD80 y CD86 con aumentos menos signi-ficativos de la expresión de MHC clase II. También

induce la expresión de IL-6 pero no de TNFα n iIL-12. Estos cambios, hacen que las células den-dríticas sean más eficientes en inducir pro l i f e r a-ción en MLR alogénicos. Nuestros re s u l t a d o smuestran que los adenovirus recombinantes indu-cen de forma independiente de transgen, cambiosen el estatus madurativo de células dendríticashumanas y murinas que son relevantes para susfunciones.

O-20. RENAL CELL CARCINOMA INDUCESAPOPTOSIS IN JURKAT CELLS BY CASPASE-8-DEPENDENT AND MITOCHONDRION-DEPENDENT PATHWAYS THAT ARE DOWNREGULATEDBY BCL-XL OVEREXPRESSION

L. Molto, L. Reese, C. Tannenbaum, T. Bloom, P. Rayman, R. Bukowski, A. Novick, J. FinkeDepartments of Immunology, Urology and CancerCenter. The Cleveland Clinic Foundation. Cleveland,EE.UU.

Apoptosis of immunocompetent cells is depen-dent on prior upregulation of Fas (or TNF-re l a-ted) receptors following engagement by its ligandor a strong antigenic challenge. These mechanismscan result in the suicide or activation-induced cell-death of immunocompetent cells. Procaspases areinactive cisteine proteases activated during apop-tosis. Recruitment and cleavage of caspase-8 is onestep in cell death pathway following Fas re c e p t o rligation. In turn, caspase-8 is responsible for theactivation of downstream caspases, such as caspa-se-3 which is responsible for the cleavage of intra-cellular proteins and the eventual demise of thecells. However some components of the apoptoticsinal require amplification through the mitochon-drion pathway by release of apoptosis-inducingp roteins such as caspase-9 which in turn also cle-aves caspase-3. Here we dissect the ability of FasL-expressing Renal Cell Carcinoma 45 line (RCC45)to induce apoptosis in Jurkat lines.

Material and methods: after coculture withRCC45 Jurkat lines were stained for DNA bre a kusing APO-BrdU TUNEL apoptosis delection kitand analyzed in a FACsan. Whole cell lysate of pro-tein of Jurkat was isolated in lysis buffer contai-ning protease inhibitors. Equivalent amounts ofp rotein were resolved on 12.5% SDS-PAGE gel,transfected to nitrocellulose and probed with spe-cific Ab and horseradish peroxidase-linked secon-d a ry Ab and then visualized by chemiluminiscen-ce.

R e s u l t s : by repeated culture in FasL-enrichedsupernatants we obtained a mutant Jurkat cell lineresistant to treatment with anti-Fas antibody. Themutant Fas-resistant Jurkat cell line has surf a c e

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expression of Fas receptor in a range similar to thatfound in WT Jurkat cells but is caspase-8 negative(C8-). However following coculture with RCC45cell line 65% of wild type (WT) Jurkat cells under-went DNA fragmentation. C8- Jurkat cells werekilled in a lower range than that found in WTJurkat cells (27%). Immunoblotting showed thatWT Jurkat cells cocultured with RCC45 expre s scleaved products of caspase 8 (37, 35 kD), caspa-se 9 (35 kD) and caspase 3 (17 kD), whereas C8-Jurkat cells showed only a pattern of cleavage forcaspase 9 (35 kD) and 3 (17 kD) but no expressionof caspase 8. Experiments also showed that follo-wing 72 hours of coculture overe x p ression of Bcl-XL in Jurkat cells protects these cells from apop-tosis induced by RCC45 and Etoposide treatment.

Conclusion: our results show that in Jurkat cellst h e re are 2 signaling pathways of apoptosis follo-wing interaction with tumor, one that is mainlysignaled by caspase 8 and caspase 3 cleavage andthe other involves the mitochondrial pathway ofactivation of caspases 9 and 3. However overe x-p ression of Bcl-XL, protects Jurkat cells from bothre c e p t o r-mediated and mitochondrial pathway ofcell death following interaction with RCC45tumor cell line.

O-21. ATAXIA TELANGIECTASIA: MUTACIONES NUEVAS Y ACTIVACIÓN LINFOCITARIA DEFICIENTE A TRAVÉS DE LA PROTEÍNA KINASA C

L. M. Allende, M. A. Garc í a - P é rez, A. Corell, P. Varela, A. Moreno, A. Sotoca, E. Paz-Artal, E.Sarreiro*, A. Moreno*, S. Ferre, P. Paule, A. Arnaiz-VillenaDepartamento de Inrnunología y Biología Molecular.*Departamento Genética. Hospital 12 de Octubre .Universidad Complutense. Madrid

La ataxia telangiectasia es una enferm e d a dautosómica recesiva caracterizada por ataxia cere-belar pro g resiva, telangiectasias óculo-cutáneas,inmunodeficiencia, concentraciones séricas ele-vadas de α- f e t o p roteína e inestabilidad cro m o s ó-mica.

El gen responsable de la ataxia telangiectasia(ATM) se mapeó en el cromosoma 11 y se sabe quecodifica para una proteína (ATM) que juega unpapel muy importante en el mantenimiento de laestabilidad del genoma y en la transducción deseñal.

En este trabajo se han caracterizado inmunoló-gica y molecularmente tres pacientes con ataxiatelangiectasia. El paciente 1 presenta dos mutacio-nes de splicing que afectan a los exones 15 y 21 delgen de la ATM. El paciente 2 presentó una dele-ción genómica en homozigosis de 28 nucleótidos

en el último exon del gen. Esta deleción cambia lapauta de lectura normal tras el aminoácido 3.008y por tanto originará una proteína ATM tru n c a d a .El paciente 3 es un heterocigoto compuesto don-de sólo se descubrió uno de los defectos que con-sistió en una transición G>A en el primer nucleó-tido del intrón 62 (sitio donante de splicing) lo cualdio lugar a la deleción completa del exón 62.

Los resultados de proliferación celular obteni-dos durante 3 años mostraron un defecto en la co-activación con PMA (activador de la pro t e í n aKinasa C) tras la estimulación con CD69, CD26,CD28, CD3, PHA, PWM and Con A y no utilizan-do otros como CD2 o ionomicina., por lo que sepodría proponer una posible interacción entreATM y PKC.

HISTOCOMPATIBILIDAD

O-22. UTILIZACIÓN DE LA TÉCNICA RSCA(REFERENCE STRAND MEDIATEDCONFORMATION ANALYSIS) PARA RESOLVER AMBIGÜEDADES DE TIPAJE DEL GEN HLA-DRB1

A. Corell, A. L. Pay, A. M. Little, M. A. Oddinott, J. R Argüello, H. Ogilvie, J. O’shea, J. A. Madrigal,S. G. E. MarshDepartamento de Pediatría, Inmunología, Obstetricia yGinecología. Facultad de Medicina. Universidad deValladolidAnthony Nolan Research Institute, Royal Free Hospital,London, Reino Unido

Se muestra la utilización de la técnica RSCA( R e f e rence Strand mediated Conformation Ana-lisis) para resolver sin ninguna ambigüedad tipa-jes de HLA-DRB1 en dos casos de trasplante demédula ósea utilizando un banco de donantes noemparentados.

En el primer caso, el tipaje del gen HLA-DRB1,tanto por el método SSP (PCR con primers espe-cíficos de secuencia) como SSO (tipaje conOligonucleótidos específicos de secuencia) re a l i-zados de modo rutinario en dos laboratorios dife-rentes, dieron resultados ambiguos para dos posi-bles donantes. Ambos individuos re s u l t a ro ntipados como HLA-DRB1*04011 + 0403 ó alter-nativamente HLA-DRB1*0407 + 0413. Esta ambi-güedad no se podía resolver mediante secuen-ciación directa del exón 2 de los genes HLA-DRB1,pues nos encontraríamos de nuevo con la mismaambigüedad. Utilizando células homocigotas detipaje para los alelos HLA-DRB1*04011, 0403 y0407 y utilizando la técnica RSCA, ambos indivi-duos fueron tipados como HLADRB104011 +

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0403, sin ningún tipo de ambigüedad. De modoque ambos eran válidos como donantes, puestoque el receptor se había tipado mediante estudiofamiliar como HLA-DRB1*04011 + *0403mediante estudio familiar.

En el segundo caso, un donante fue tipado comoHLA-DRB1 * 1102 + 1103 mediante la técnica SSP,y de modo contradictorio la técnica SSO excluíadel tipaje el alelo HLADRB1*1102. En tanto queel receptor se había tipado sin ambigüedades comoHLADRB1*1101 + *1103. Utilizando de nuevo latécnica RSCA y células homocigotas de tipaje paralos alelos HLA-DRB1*1101, *1102, *1104 y hete-rocigotas para HLADRB1*1101 + *1103, se pudod e t e rminar sin ambigüedades que el donantepotencial era HLA-DRB1 * 1103 homocigoto.

Por lo tanto, y aunque esta técnica aún no estácompletamente desarrollada para realizar un tipa-je de alta resolución de los alelos de HLA-DRB1,en la actualidad puede ser empleada como unah e rramienta muy valiosa para resolver ambigüe-dades de tipaje generadas por otras técnicas, comoS S P, SSO o SBT (secuenciación directa) con unaelevadísima fiabilidad. Es necesario disponer decélulas homocigotas de tipaje con los alelos HLA-DRB1 involucrados en las ambigüedades.

O-23. UNA NUEVA VARIANTE DE HLA-B37CON HISTIDINA EN LA POSICIÓN 171

N. Gómez-Lozano, E. Estefanía, R. de Pablo, M. E.Moreno, C. VilchesServicio de Inmunología. Hospital Universitario ClínicaPuerta de Hierro, Madrid

El antígeno HLA-B37 está representado con unabaja frecuencia en la población caucásica españo-la. Se ha publicado la existencia de dos alelos HLA-B*37; el segundo de ellos es en realidad una qui-mera entre B*3701 (dominio alfa-1) y B*27( p o rción carboxi-terminal). Durante un estudiofamiliar rutinario de tipificación HLA obtuvimosindicios de la existencia de una nueva variante deHLA-B*37. Un miembro de la familia (H156H2)mostraba patrones de PCR-SSP y PCR-SSO re v e r-so compatibles con la presencia de HLA-B*37,excepto por una extrarreacción en PCR-SSOr noexplicable por los alelos B*37 conocidos.Mediante microlinfocitotoxicidad se observó reac-tividad con algunos sueros que reconocían a losantígenos HLA-B37 o B18.

Para determinar el origen de dicha extrarre a c-ción, obtuvimos cDNA a partir de células mononu-cleadas de sangre periférica del donante menciona-do (H156H2) y amplificamos la región codificantecompleta de HLA-B mediante PCR con cebadore sespecíficos para sus regiones 5’ y 3&#8217no traducidas. Tras clonar el producto de PCR yseleccionar mediante PCR-RFLP clones port a d o re s

de un inserto relacionado con B*37, determ i n a m o ssu secuencia de nucleótidos. De acuerdo con ésta,H156H2 posee una nueva variante de HLA-B*37 queporta una sustitución de Tyr por His en la posición171 (hélice alfa del dominio alfa-2). Este polimor-fismo es único entre los alelos B*37, pero es com-p a rtido por otros alelos HLA-B, principalmenteB*14, B*18 y algunos B*51.

O-24. EVOLUCIÓN DE LOS GENES DE HISTOCOMPATIBILIDAD EN UN MODELONATURAL DE AVES SUDAMERICANAS

A. A r n a i z - Villena, S. Ferre, J. Martínez-Laso, P. Varela, E. Lowy, J. Guillén, J. Zamora, L. M.AllendeDepartamento de Inmunología y Biología Molecular.Hospital 12 de Octubre. Universidad Complutense..Madrid

La evolución de los genes de histocompatibilidadha llevado aparentemente a la existencia de un granpolimorfismo en las especies “no naturales” (muyconsanguíneas) estudiadas, incluyendo el pollo,ratón y el hombre. No hay modelos naturales dondese puede estudiar la evolución de estos genes. En elpresente trabajo se han conseguido recolectar lamayoría de las especies de los jilgueros/lúganos suda-mericanos (género C a rd u e l i s) que apare c i e ron y evo-l u c i o n a ron hace 3 millones de años después de queuna especie norteamericana colonizase los Andes allevantarse el istmo de Panamá. Se han determ i n a d osus relaciones filogenéticas por medio del análisis delDNA mitocondrial y posteriormente se han secuen-ciado los genes de histocompatibilidad de clase I. Seha comprobado que existe un bajo polimorfismoe n t re las especies con variabilidad aminoacídica sola-mente en la posición 57. Asimismo, se ha observ a d ola existencia de evolución convergente en varias espe-cies y asegurado la secuencia ancestral (coincidentecon la de la especie norteamericana originaria) a niveldel polimorfismo descrito. Se discuten los hallazgoscomparando el bajo polimorfismo “natural” con elalto polimorfismo “no natural” y relacionando estehecho con la aparición de enfermedades autoinmu-n e s .

O-25. ORIGEN Y EVOLUCIÓN DE LOSHAPLOTIPOS HLA-B27 EN POBLACIONESHUMANAS

M. AGelaz, A. López-Vázquez, S. Garc í a - F e r n á n d e z ,S. González, J. M a rt í n e z - B o rra, C. López Larre aServicio de Inmunología, Hospital Central de Asturias

Una de los características más importantes delMHC es el fuerte desequilibrio de ligamiento. El

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estudio de los haplotipos HLA es una herr a m i e n t aútil para analizar diversidad de las poblacioneshumanas. La descripción de marc a d o res micro s a-télites dentro de la región MHC pueden ser utili-zados para analizar la evolución de los haplotiposHLA. Hasta el momento se han descrito 23 alelosB27 diferentes, aunque no existen datos conclu-yentes de su generación y evolución poblacional.

O b j e t i v o s : en el presente trabajo se han analiza-do diferentes poblaciones B27 pos. de difere n t e sgrupos étnicos (N=10) que contienen los subtiposmayoritarios descritos en poblaciones (B*2701-09), en un entorno de 300 kb alrededor de HLA-B, así como en diferentes lineas celulares. B27+.

M é t o d o s : para ello se han estudiado el polimorf i s-mo HLA (-B,-C, MICA) y de los siguientes marc a-d o res microsatélites polimórficos: D6S273/ K11A,T N Fβ,α, LTA, C1-2A, MIB, C1-4-1 y C1-2-5.

Resultados y conclusiones: los resultados deriva-dos del presente análisis permiten examinar la evo-lución y la historia de los haplotipos HLA-B27, elorigen de los subtipos y los patrones de re c o m b i-nación en diferentes poblaciones. Los re s u l t a d o sindican que existen dos regiones principales don-de se han producido los cambios: TNFα/ LTA, C1-4-1/C1-2-5. Se discuten los resultados en re l a c i ó ncon la estabilidad genómica de esta región MHC.

O-26. IDENTIFICACIÓN DE NUEVOS LIGANDOS DE HLA-B27 DERIVADOS DE REGIONES POLIMÓRFICAS DE LA MISMA Y DE OTRAS MOLÉCULAS DE CLASE I BASADAS EN LA GENERACIÓNDIRECTA POR EL PROTEASOSA

I. Álvarez, L. Sesma, M. Marcilla, M. Ramos, M.Martí, E. Camafena, J. A. López de CastroCentro de Biología Molecular Severo Ochoa. CSIC-UAM. Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma deMadrid

HLA-B27 está fuertemente asociado con laespondilitis anquilosante y la artritis reactiva. Esposible que péptidos de regiones polimórficas deHLA-B27 u otros antígenos de clase I pre s e n t a d o sen superficie por la propia molécula de HLA-B27puedan estar implicados en la enfermedad. Se hadescrito un péptido con estas características,c o rrespondiente en la región comprendida entrelos aminoácidos 169 y 179 de la secuencia de HLA-B27. El principal sistema proteolítico implicadoen la generación de péptidos que se presentan porlas moléculas de clase I es el proteasoma. Sinembargo, no está claro si dichos péptidos son gene-rados directamente, o se producen precursores quep o s t e r i o rmente son degradados por peptidasas,tanto en el citosol como en el retículo endoplás-mico.

En este trabajo, se ha estudiado la generacióndel autopéptido de HLA-B27 comentado anterior-mente por el proteasoma 20S purificando en diges-tiones in vitro a partir de percusores peptídicos. Enestas condiciones, el proteasoma rompió los enla-ces implicados en la generación de dicho ligando.La posición del ligando dentro de la secuencia desustratos pre c u s o res no modificó significativa-mente la especificidad de proteasoma, excepto enlas posiciones C-terminales del perc u s o r, posible-mente debido a la carga negativa del extremo C-t e rminal. Además, dichas digestiones ha perm i t i-do predecir la presencia de dos nuevos ligandos deHLA-B27 provenientes de moléculas de clase I,que posteriormente se han encontrado en el reper-torio peptídico de este alotipo.

O-27. AUSENCIA DE ISOFORMAS G4, G5 YG6 EN MHC-G DE PRIMATES EN LA FAMILIAPONGIDAE

M. J. Castro, P. Morales, J. Martínez-Laso, L. Allende, R. Rojo-Amigo, M. González-Hevilla, P. Va rela, J. Moscoso, M. Garc í a - B e rciano, J. Zamora, J. L. Peña, A. Arnaiz-VillenaDepartamento de Inmunología y Biología Molecular.Hospital 12 de Octubre. Universidad Complutense.Madrid

HLA G es un gen de Clase I no Clásico pert e n e-ciente al Complejo Principal de Histocompati-bilidad (MHC). La proteína que codifica se expre-sa en la interfase materno-fetal, donde se hapostulado que inhibe la lisis celular producida porlas células Natural Killer (NK).

El tránscrito M H C - G humano presenta form a sde maduración alternativas. Hasta la fecha se handescrito 6 isoformas distintas generadas por la eli-minación de unos u otros exones.

Para estudiar la importancia evolutiva de estefenómeno, hemos estudiado la presencia de s p l i-c i n g a l t e rnativos en las moléculas de mRNA deM H C - G en distintas especies de primates de lafamilia Pongidae: chimpancé, gorila y orangután.

Como resultados se han obtenido los transcri-tos de tres isoformas: G1, G2 y G3. No han apare-cido las isoformas G4 ni las solubles GS y G6.Además, hemos encontrado una nueva isoform aen el gorila, a la que hemos llamado “G2short ” .Esta molécula es similar a la isoforma G2 a la quele faltan los primeros 29 aminoácidos codificadospor el exón 4.

Como hipótesis, se sugiere la posibilidad de quelas isoformas solubles no sean necesarias para lasfunciones desempeñadas por M H C - G en este gru-po de primates (chimpancés, gorilas y oranguta-nes).

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O-28. REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL Y PROCESAMIENTO DESCOORDINADO DELHETERODÍMERO HLA-DP

M. T. Coiras, A. Álvarez*, J. Arroyo, M. Sánchez-Pérez**Departamento de Microbiología I. Facultad de Farmacia,UCM. *CCF, UCM. **Departamento de Microbiología yGenética. Facultad de Farmacia. Universidad deSalamanca

A n t e c e d e n t e s : varias líneas celulares linfoblas-toides defectivas en la expresión de HLA-DP(serie 45.EM) fueron generadas a partir de la líneap a rental 45.1, haploide para HLA de clase II( e x p resa DPw2). Por citometría de flujo se con-f i rmó que estas LCLs no expresaban DPw2, yexperimentos de RT-PCR mostraron que la can-tidad de mRNA para DPA1*0103 y DPB1*02012era variable en los diferentes mutantes. La obten-ción de híbridos somáticos entre las LCLs 45.EMy la línea 180 (negativa para HLA Clase II), per-mitió agrupar estos mutantes en transcripciona-les y no transcripcionales, en función de si re c u-peraban o no, después de la fusión, la expre s i ó nde HLA-DPw2.

O b j e t i v o s : estudio de la regulación de HLA-DPmediada por factores transactivadores específicos( C I I TA, RFX …), y la influencia del pro c e s a m i e n-to postraduccional de esta molécula.

R e s u l t a d o s : las líneas 45.EM3 y 45.EM15 po-seen transcritos para las cadenas α / β de HLA-DP(mRNA para DPA1: 75 y 148%, y para DPB1: 80y 20%, respectivamente). Se transfectaron losORFs de DPA1*0103 y DPB1*02012 en45.EM15 y 45.EM3. En 45.EM15 la expresión deDPw2 se recuperó tras la transfección de DPB1,p e ro en 45.EM3 no se recuperó la expresión. Elanálisis intracitoplasmático, por citometría deflujo, determinó la presencia de hetero d í m e ro sα/β de HLA-DP en el citoplasma de 45.EM3, perono en 45.EM15. Los híbridos de 45.EM15 con lalínea 180 no expresaban DPw2 pero sí los híbri-dos con la línea 127 (haploide para HLA ClaseII: expresa DPw4). Los híbridos de 45.EM15 conlíneas prototipos de grupos de complementaciónBLS sí re c u p e r a ron la expresión de DPw2.

C o n c l u s i o n e s : la línea mutante transcripcio-nal 45.EM15 podría presentar una mutación enun factor transcripcional específico del genDPB1 que puede localizarse en la región delMHC delecionada en 180. La línea mutante45.EM3 no expresa HLA-DP en superficie, debi-do a la posible alteración de la ruta de pro c e s a-miento y secreción de HLA-DP. Estos re s u l t a d o sindican que no sólo existen mecanismos de re g u-lación específicos de locus y de cadena, sino,además, diferentes rutas de procesamiento de losh e t e ro d í m e ros de clase II, como se ha descritopara HLA-DQ.

O-29. RECONOCIMIENTO ESPECÍFICO DE LA MOLÉCULA DE CLASE Ib HLA-E POR UN CLON T CITOTÓXICO HUMANO

P. García, M. Llano, T. Bellón, A. Beltrán deH e redia*, P. Aparicio*, V. M. Braud**, M. López-BotetServicio de Inmunología. Hospital de la Princesa. Madrid.*Departamento de Bioquímica B e Inmunología. Facultadde Medicina. Universidad de Murc i a . * * M o l e c u l a rImmunology Group. Institute of Molecular Medicine.John Radcliffe Hospital. Oxford, Reino Unido

HLA-E es una molécula de clase Ib (no clásica)que presenta péptidos hidrofóbicos derivados delas secuencias señal de otras moléculas HLA de cla-se I, constituyendo el ligando de los re c e p t o res tipolectina CD94/NKG2A (inhibidor) y CD94/NKG2C (activador). En el transcurso de nuestro sestudios sobre la función de CD94/NKG2 en linfo-citos T, enfrentamos un clon T citotóxico (K14B06;α / β+ CD8+ CD94/NKG2H+) a la línea murinaRMA-S transfectada con HLA-E/hβ2-m, y pre i n c u-bada con péptidos sintéticos correspondientes ad i f e rentes moléculas HLA de clase I que se unen aHLA-E; como control se empleó la RMA-S trans-fectada con hβ2-m. Algunos péptidos (VMAPR-TLIL, VMEPRTLIL, VMAPRTLLL) estimularo nsignificativamente la respuesta citotóxica específi-ca, mientras que otros tuvieron un efecto menor oi n a p reciable (VMAPRT LVL y VMAPRTLFL); no seo b s e rvó ningún efecto con los nonámeros que noestabilizan HLA-E (VTA P RTLLL y VTA P RT V L L ) .El tratamiento con AcM anti-CD94/NKG2 nomodificó la lisis mientras que, por el contrario, dosAcM anticlonotípicos (HP-P15 y QA106), quereconocen específicamente el TcR de K14B06, inhi-b i e ron la citotoxicidad. Por otra parte, se ensayópor inmunofluorescencia y citometría de flujo elm a rcaje del clon K14B06 con tetrámeros solublesde HLA-E/β2-m, replegados con diferentes pépti-dos sintéticos (VMAPRTVLL, VMAPRTLIL yV M A P RTLFL). En este tipo de experimentos seo b s e rvó una unión específica de los tetrámeros deHLA-E, que se bloqueó por los AcM anticlonotípi-cos y no se modificó preincubando con los AcManti-CD94. Estos resultados constituyen la prime-ra evidencia de la capacidad de los linfocitos Thumanos para reconocer específicamente HLA-Ea través del Tc R .

O-30. GENES HLA EN MACEDONIOS Y EL ORIGEN SUB-SAHARIANO DE LOSGRIEGOS

A. A r n a i z - Villena, K. Dimitroski, A. Pacho,J. Moscoso, E. Gómez-Casado, C. Silvera-Redondo,P. Va rela, R. Rojo-Amigo, M. Garc í a - B e rciano, J. Martínez-Laso

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Departamento de Inmunología y Biología Molecular,Hospital 12 de Octubre. Universidad Complutense.Madrid.*Tissue Typing Laboratory Institute of BloodTransfusion. Skopje, República de Macedonia

Se han determinado los alelos HLA en indivi-duos de la República de Macedonia por técnicasde tipaje de DNA y secuenciación. Las fre c u e n-cias alélicas y los haplotipos extendidos de losloci HLA-A, -B, -DR, -DQ se han determinado porprimera vez y los resultados se han comparadocon los de otros mediterráneos, especialmentecon sus vecinos los griegos. Se han calculado lasdistancias genéticas, los árboles filogenéticos ylos análisis de correspondencia. Se ha llegado alas siguientes conclusiones: a) los macedoniosp e rtenecen al sustrato más antiguo de los medi-t e rráneos, como los íberos (incluyendo vascos),n o rteafricanos, italianos, franceses, cre t e n s e s ,judíos, libaneses, turcos (anatolios), armenios eiraníes; b) los macedonios no se relacionan consus vecinos los griegos, los cuales no pert e n e c e nal sustrato antiguo de los mediterráneos; c) losgriegos tienen una gran relación con los sub-saharianos (etíopes) y se separan de los otros gru-pos de mediterráneos. Tanto los griegos como losetíopes comparten alelos DRB1 cuasi específicoscomo son *0305, *0307, *0411, *0413, *0416,*0417, *0420,*1110, *1112, *1304 y *1310. Lasdistancias genéticas son más cercanas entre losgriegos y los etíopes / sub-saharianos que concualquier otro grupo mediterráneo y además losgriegos se unen con los etíopes / sub-saharianostanto en los dendrogramas filogenéticos como enlos análisis de correspondencia. El periodo detiempo en el que se establecieron estas re l a c i o n e spodría ser muy antiguo pero incierto y podríaestar relacionado con los desplazamientos de laspoblaciones egipcio-etíopes que vivían en elEgipto faraónico.

O-31. DIFERENCIAS EN LOS HAPLOTIPOSHLA DE LAS POBLACIONES DE LAS ISLASBALEARES

C. Crespí, N. Martínez, A. Etxagibel, I. Muñoz, A. Luque, D. Priego, A. Serra, M. Centeno, J. Milà,N. MatamorosServicio de Inmunología. Hospital Son Dureta. Palmade Mallorca

A n t e c e d e n t e s : la población actual de las IslasB a l e a res se puede considerar como un punto defusión de las diferentes culturas mediterráneas.

De las tres islas principales (Mallorca, Menorc ae Ibiza), Ibiza muestra diferencias respecto a lasotras dos islas en cuanto a los orígenes de sus

poblaciones fundadoras. En Mallorca destaca lap resencia de los descendientes de los judíos con-versos conocidos como chuetas, que se han man-tenido aislados como población hasta nuestro sdías.

O b j e t i v o s : estudiar las diferencias en los haplo-tipos HLA de las poblaciones baleares.

M é t o d o s : 110 chuetas seleccionados al azar,sanos con los apellidos típicos (15 apellidos sonconocidos en la isla como chuetas) fueron estudia-dos. 400 individuos con apellidos típicos Baleare sno-chuetas componen la población Balear. To d o slos individuos fueron tipados serológicamente opor medio de métodos basados en PCR (SSP o SSO,Dynal).

Las frecuencias alélicas y haplotípicas fuero ncalculadas con el programa Arlequín 2.000.

Resultados: los haplotipos más frecuentes son:A1-Cw7-B8-DRB1*03-DQB1*02 (Mallorca, 5,7%;M e n o rca, 0,8%; Ibiza, 6,1%; Chuetas, 1,7%), A29-Cw16-B44-DRB1*07-DQB1*02 (Mallorca, 2,3%;M e n o rca, 3,9%, Ibiza, 6,1%, Chuetas, 2,6%), A2-Cw5-B44-DRB1*04-DQB1*03 (Mallorca, 1,1%,Menorca, 0,8%, Ibiza, 4,4%, Chuetas, 0,9%). En lapoblación chueta destaca la frecuencia del haplo-tipo A24-Cw6-B38-DRB1*11-DQB1*03 (4,3%).

C o n c l u s i o n e s : se observan marcadas difere n c i a se n t re población ibicenca, población chueta y elresto.

O-32. EFECTO DE LA MUTACIÓN C282Y DEL GEN HFE Y DEL TRATAMIENTO CON FeINTRAVENOSO EN PACIENTES DIALIZADOS

C. Rodríguez-Gallego, A. Domínguez, F. Alonso*,M. I. Garc í a - L a o rden, L. Palop*, F. Sánchez, A. Fernández*Servicios de Inmunología y *Nefrología. Hospital deGran Canaria Dr. Negrín. Gran Canaria

Los pacientes con insuficiencia renal crónicareciben con frecuencia Fe intravenoso (FeIV)como tratamiento de su anemia. Hemos estimadode interés analizar la influencia de la mutaciónC282Y del gen HFE (hemocromatosis hereditaria)en el metabolismo del hierro en estos pacientes.

Se ha analizado la mutación C282Y a 233pacientes sometidos a diálisis (102 mujeres y 131v a rones; edad media de 56,6 ± 15,03 años). 148pacientes cumplieron los criterios de inclusiónpara recibir FeIV (2 gramos durante 4 meses).Seanalizan los parámetros básicos del metabolismodel hierro al inicio del tratamiento, al fin del mis-mo y tras 4 meses de seguimiento, y se comparanlos resultados entre los individuos hetero z i g o t o spara la mutación C282Y (C282Y +/-; 11 indivi-duos) y los individuos negativos para la mutación(C282Y -/-).

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Si bien no se evidencian diferencias al inicio deltratamiento, en los pacientes C282Y +/- que re c i-ben FeIV se aprecia un mayor incremento de laf e rritina sérica al finalizar el tratamiento re s p e c t oa los pacientes C282Y -/- (939,9205,98 mg/ml v s659209,06 mg/ml respectivamente; p= 0,004), yse mantiene hasta al menos cuatro meses despuésde finalizado el mismo (668,80159,12 v s411,53240,33; p = 0,022).

El análisis de la mutación C282Y permitiría pre-decir la mayor sobre c a rga de hierro en los pacien-tes C282Y+ tras el tratamiento con FeIV y, de estemodo, prevenir las sobre c a rgas de Fe en estospacientes, con el consiguiente beneficio para susalud.

O-33. ASOCIACIÓN DEL DÉFICIT DE IgAA GENES DEL MHC

P. Vigil Cuesta, M. Fernández Arquero, A. MartínezDoncel, F. Lázaro Hernán, M. C. García Rodríguez*,G. Fontán**, E. Gómez de la ConchaServicio de Inmunología del Hospital Clínico SanCarlos. *Servicio de Inmunología del Hospital La Paz.Madrid

Introducción:el déficit de IgA (DIgA)es la inmu-nodeficiencia primaria más frecuente. En ellainfluyen factores genéticos que aún no han sidod e t e rminados con precisión. La mayor asociaciónse ha encontrado en la región del MHC, en concre-to con los alelos HLA-DR1, HLA-DR3 y HLA-DR7dentro de la Clase II.

O b j e t i v o : saber si la susceptibilidad a la enfer-medad viene dada por estos alelos o por re g i o n e sadyacentes que se encuentran en desequilibrio deligamiento.

Método: se han estudiado 91 familias de enfer-mos con DIgA, estableciéndose los 4 haplotipospaternos. Se han considerado haplotipos enfermosaquellos que aparecen en los sujetos con DIgA yhaplotipos sanos el resto. En total se han estudia-do 193 haplotipos enfermos frente a 154 haploti-pos sanos. En todos los casos se han tipado 4 genesp o l i m ó rficos (HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1 y HLA-B) y 5 microsatélites ( D6S273, BAT-2, TNFα, TNFβ y MICA).

R e s u l t a d o s : en nuestros enfermos vemos aso-ciación significativa con DRB1*0102 y con DR7p e ro no con DR3. Sin embargo si consideramos elhaplotipo HLA-DR3, HLA-B8 (8.1AH) la aso-ciación sí es significativa. En el caso de DR7 yDRB1*0102 la asociación es mayor con estos ale-los que con los haplotipos completos corre s p o n-dientes.

Discusión: nuestros resultados muestran que enel caso de DR3 la asociación no es con Clase II sino

con genes situados más teloméricos pert e n e-cientes al haplotipo ancestral 8.1AH.

Tanto en el caso de DRB1*0102 y DR7 la sus-ceptibilidad vendría dada por estos alelos de ClaseII o algunos muy próximos a ellos.

INMUNOTERAPIAY NUEVAS TECNOLOGÍAS

O-34. VACUNACIÓN TERAPÉUTICA CON CÉLULAS DENDRÍTICAS EN EL MELANOMA MALIGNO DISEMINADO

D. Benítez, R. Martí, R. Vilana, M. Lozano, J. Milà, J. Pomés, R. Rull, A. Vilalta, E. Yachi, S. Puig, C. Conill, T. Castel, R. VilellaUnidad Funcional de Melanoma. Hospital Clínic deBarcelona

Se han seleccionado 11 pacientes con melamo-na maligno diseminado, estadio IV, refractarios acualquier tipo de tratamiento, quimio o bioqui-mioterapéutico, con presencia de multiples metás-tasis en diferentes localizaciones, para el trata-miento con células dendríticas autólogas yc a rgadas con un lisado de 10 líneas celulares demelanoma heterólogas. La generación de las célu-las dendríticas se ha hecho a partir de leucoafére-sis, para evitar las múltiples extracciones. Las ali-cuotas se mantienen en nitrógeno líquido, hastael día de la obtención de monocitos por adhere n-cia en plástico y eliminación de las células sobre-nadantes. Las células se cultivan en medio X-VIVO15, libre de SBF o de suplementos de plasma, con500 U/ml de rIL-4 y 1.000 U/ml de GM-CSF. El día7 de cultivo se obtienen células dendríticas inma-duras (con pérdida de expresión de CD14) y semaduran, durante 48 horas, con un cocktail decitocinas compuesto de 10 ng/ml de IL-1, 1.000U/ml de IL-6, 10 ng/ml de TNF-α y 1 ng/ml dePGE2, aunque posteriormente se ha pasado a uti-lizar 20 ng/ml de TNF-α, como único estímulomadurativo; las células son pulsadas con el lisadoantigénico 24 horas antes de inducir la madura-ción, para que la captación sea más eficiente.A p roximadamente 2*106 de células dendríticasse resuspenden en 500 ml de PBS y se inoculand i rectamente en un ganglio linfático inguinal, porvía ecográfica.

El promedio de supervivencia de este grupo dee n f e rmos durante un año de seguimiento ha sidode 7,24 meses, frente a los 2-4 meses descritos paraeste grupo de pacientes no respondedores a la bio-quimioterapia. Se observó una respuesta parc i a l ,con una reducción importante de la masa tumo-

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ral, por un periodo de tres meses, 4 pacientes nore s p o n d i e ron al tratamiento (e x i t u s e n t re 3 y 5meses), tres pacientes se re t i r a ron del pro t o c o l o ,por aparición de lesiones cerebrales 2, y uno demanera voluntaria, y del resto 2 presentan pro g re-sión lenta de la enfermedad (11 y 9 meses de segui-miento) y otro la enfermedad se estabilizó por unperiodo de 9 meses, aunque posteriormente tuvouna rápida progresión. No se ha observado ningúntipo de toxicidad asociada a este tratamiento.

O-35. OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONESDE UTILIZACIÓN TERAPÉUTICA DE LASCÉLULAS DENDRÍTICAS EN PA C I E N T E SAFECTOS DE MELANOMA MALIGNO D I S E M I N A D O

D. Benítez, J. Milà, T. Castel, R. VilellaUnidad Funcional de Melanoma. Hospital Clínic deBarcelona

Las células dendríticas son los adyuvantes natu-rales en la inducción de la respuesta T específica.Han sido utilizadas en inmunoterapia de diversosc á n c e res: melanoma, próstata, linfomas,… conresultados esperanzadores. Sin embargo, es pre c i-so optimizar diversos aspectos de su utilizaciónterapéutica: su fuente de obtención, su madura-ción in vitro, la fuente de antígenos tumorales, el“ c a rgado” de los antígenos tumorales, la vía deadministración al organismo y la forma de moni-torizar la respuesta inducida por la administraciónde estas células.

Las células dendríticas se obtienen a partir decultivo de monocitos (por adherencia a plásticode la fracción mononuclear de sangre periférica del i n f o a f é resis de enfermos de MM) con IL-4 + GM-C S F, en medio de cultivo X-Vivo 15. Tras 7 días decultivo, se procede a su maduración y cargado conantígenos tumorales. Se estudiaron los siguientesestímulos madurativos: a) IL-1 + IL-6 + TNFα +PGE2 (CM); b) TNFα; c) CD40L y d) TNFα + IL-1 + L-6, en presencia de lisados de células de mela-noma autólogas o heterólogas. Se muestran losresultados de: a) citometría de flujo, con una bate-ría de anticuerpos monoclonales pertinentes; b)p roliferación inducida sobre linfocitos autólogosy heterólogos; c) producción de citocinas por lascélulas dendríticas.

Resultados:1. La presencia del CM induce una potente

maduración de las células dendríticas en funciónde la expresión de marc a d o res de maduración(CD40, CD80, CD83, CD86), respecto a las otrascondiciones madurativas. A pesar del fenotipo tanm a d u ro, la eliminación de la IL-4 en el cultivorevierte la expresión de CD14, lo que no sucede enlas otras condiciones de maduración.

2. La proliferación que se obtiene en situacio-nes alogénicas es independiente de los estímulosmadurativos, y son detectables a tres días de culti-vo. Respecto a la respuesta inducida por tumorautólogo, no es detectable utilizando PBLs, aun-que cabe investigar la generación de líneas especí-ficas.

3. Únicamente se detecta IL-10 con CM yT N Fα+IL-1+IL-6. No se detectan niveles de IL-12(p70) en ninguna de las situaciones, efecto quepuede ser debido a la falta de algún componenteen las condiciones de cultivo (se utiliza medio decultivo sin ningún tipo de suplemento de suero oplasma).

O-36. VACUNACIÓN IDIOTÍPICA EN LINFOMAS B DE BAJO GRADO: UNA NUEVA TERAPIA ANTITUMORAL

R. Yáñez, Y. Barrios, A. Plaza, E. Suárez, R. Cabrera*, F. Díaz-EspadaServicios de Inmunología y *Hematología. ClínicaPuerta de Hierro. Madrid

I n t ro d u c c i ó n : la mayoría de los pacientes conLNH B de bajo grado no se curan con tratamien-tos de quimioterapia y/o radioterapia, re c a y e n d o .Una alternativa terapéutica es la inducción de re s-puesta inmune mediante vacunación con la inmu-noglobulina de superficie de células B.

Material y métodos: el idiotipo tumoral se obtu-vo por fusión somática de células tumorales conel heteromieloma K6H6/B5.La Ig secretada se puri-ficó de cultivos de alta densidad y se conjugó aKLH. La respuesta anti-idiotípica se estudió porELISA y la presencia de linfocitos tumorales porPCR específica para la traslocación t(14;18).

R e s u l t a d o s : p resentamos los resultados del pri-mer ensayo clínico llevado a cabo en Europa coninmunización idiotípica en pacientes con LNH Bde bajo grado .

De un total de 12 pacientes, 7 han sido vacuna-dos. Todos desarro l l a ron una respuesta humoralanti-idiotipo específica y en aquellos pacientes contraslocación, desapare c i e ron las células port a d o-ras de la misma. El seguimiento es de 5 años.

C o n c l u s i o n e s : estos pacientes pueden inducirrespuesta inmune contra el idiotipo expresado ensu propio tumor. Este tratamiento es ventajoso alno dañar células B normales y su efecto es más pro-longado que el uso de anticuerpos monoclonaleshumanizados dirigidos contra moléculas específi-cas de células B.

Es necesario ampliar este protocolo a un mayorn ú m e ro de pacientes y un periodo de seguimientomás prolongado para probar si existe una re l a c i ó ne n t re la inmunidad anti-idiotípica y un mayorperiodo libre de enfermedad.

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O-37. RECHAZO TUMORAL POR LA INFILTRACIÓN DE CÉLULAS SUPRESORASNATURALES TRAS EL TRATAMIENTO CONINMUNOTERAPIA ADOPTIVA Y CICLOFOSFAMIDA

B. Peláez, J. A. Campillo, J. A. López Asenjo, J. L. SubizaDepartamentos de Inmunología y Patología. HospitalClínico San Carlos. Madrid

Las células supresoras naturales (NS) son célu-las generadas durante el crecimiento tumoral.Estas células son progenitoras de la serie mieloideque producen grandes cantidades de óxido nítri-co (NO) e inhiben respuestas linfocitarias. Estap ropiedad inmuno-supresora se encuentra dentrode los mecanismos de escape tumoral.

Las células NS también son inducidas bajo elrégimen de quimioterapia con Ciclofosfamida(Cy). Paradójicamente, la utilización de Cy poten-cia la respuesta antitumoral durante el tratamien-to con inmunoterapia adoptiva.

El o b j e t i v o de este trabajo fue investigar si den-t ro del sinergismo antitumoral que existe entre laCy y la terapia adoptiva estaban implicadas lageneración y activación de las células NS.

Se estudió la inducción de células NS por la Cyy su capacidad supresora. Se evaluaron cortes his-tológicos tumorales y la implicación del NO gene-rado por las NS en el rechazo tumoral tanto in vivocomo in vitro.

Los re s u l t a d o s in vivo re v e l a ron que las célulasNS ejerc i e ron una acción supresora antitumoralsólo en presencia de señales T activadoras (IFN-γ+ CD40). En las biopsias se identificaron célulasNS con el mAb ER-MP54 dentro de la re a c c i ó ninflamatoria de rechazo tumoral, la cual sólo sedesarrolló tras el régimen de terapia adoptiva y Cy.La utilización de un inhibidor del NO tanto en cul-tivo como in vivo, demostró que esta molécula,generada por las células NS, era la responsable derechazar la proliferación y el desarrollo de la masatumoral. Las células NS intratumorales expre s a-ron el enzima que sintetiza el NO.

La c o n c l u s i ó n de este estudio es que el sinerg i s-mo entre el tratamiento con Cy y terapia adoptivadepende por un lado, de la generación de célulasNS y por otro, de su activación, llegada al entorn otumoral y de su síntesis de NO. Estas dos últimascondiciones dependen de las señales linfocitariasprovenientes de la terapia adoptiva.

O-38. GENERACIÓN DE CTLS HB1-ESPECÍFICAS MEDIANTE LA TRANSDUCCIÓNDE CÉLULAS DENDRÍTICAS CON UN VECTORA D E N O V I R A L

A. Balas, M. Avilés, F. García-Sánchez, R. Lillo, A. Álvarez, J. L. Vicario

Departamento de Histocompatibilidad. Centro de Trans -fusión de Madrid

El antígeno menor de histocompatibilidad(mHA) HB1 está constituido por un péptido de 10aminoácidos, presentado en el contexto de B44.HB1 presenta un polimorfismo en el residuo enposición 8 (H/Y), siendo el alelo H el que pro v o c arespuesta citotóxica con expresión restringida encélulas LLA-B y EBVs.

Células dendríticas (CD) fueron difere n c i a d a sa partir de monocitos procedentes de individuossanos, obteniendo tras siete días de cultivo nive-les óptimos de expresión de marc a d o res de madu-ración. Condiciones de transducción fueron opti-mizadas utilizando un vector adenoviral quecontiene la proteína verde fluorescente (Ad-GFP),obteniendo cerca del 100% de eficiencia.

Se construyó un adenovirus que contiene unminigen incluyendo la región codificante del pép-tido HB1 H (Ad-HB1 H). La correcta transducciónrealizada con el Ad-HB1 H fue analizada a nivel detranscripción del minigen mediante RT-PCR.

Células CD8+ autólogas fueron co-cultivadascon CD transducidas con Ad-HB1 H utilizandop ro p o rciones de 5:1 a 10:1. Se llevaron a cabo tre srondas de estimulación.

La capacidad de lísis específica de las líneasCD8+ obtenidas fue analizada mediante ensayosde liberación de cromo estándar, utilizando comocélulas diana líneas EBV HLA-B44 positivas pre-viamente tipadas para el gen HB-1 mediante PCR-R F L P. Estos ensayos demostraron la posibilidadutilizando este sistema in vitro de obtener líneasCD8+ capaces de reconocer y lisar células dianaque expresen y presenten de forma adecuada elpéptido HB1 H. Estos resultados demuestran queCD transducidas con un adenovirus que codificapara este péptido tumor-específico inducen ‘inv i t ro’ respuesta citotóxica específica, abriendo laposibilidad de utilizar este sistema en la genera-ción de terapia celular anti-leucemia.

O-39. MONITORIZACIÓN IN VITRODE LAINMUNOTERAPIA: ELECCIÓN DE LA MEJORCOMBINACIÓN DE CITOCINAS

S. Viñas, E. Caparrós, R. Verdú, A. Mora*, G. RubioDivisió de Immunologia. Universitat Miguel Hernán -dez. Sant Joan, Alacant. *Alergología. Hospital Univer -sitario Morales Meseguer. Murcia

La efectividad de la inmunoterapia hiposensi-bilizante (IT) en enfermedades alérgicas se consta-ta por criterios clínicos tras largos periodos de tra-tamiento. No se dispone de pruebas objetivas i nv i t ro comúnmente aceptadas. El análisis de clonesT alérgeno específicos indica un cambio desde un

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fenotipo Th2 a Th1 o incrementos globales en laproducción de IL-10 con la IT. Previamente hemosdescrito cambios en la frecuencia de células T alér-geno específicas secretoras de IFN-γ e IL-4 asocia-das a la duración de la IT y en este trabajo se ana-liza la contribución de IL-2 e IL-10. Se utiliza comomodelo la alergia a ácaros D e rmatophagoides sp.(Derp). PBMC se obtienen de asmáticos alérg i c o sa Derp o a pólenes, recibiendo o no IT, y de donan-tes sanos. Se incuban con un extracto dializado deDerp y mAb 9,3 y HP2/1 como coestimuladore sdurante 6-18 horas, transcurriendo las últimas 5-17 horas en presencia de un agente de bloqueo(monensina), según los experimentos. Las célulasse marcan en superficie con anti CD4 e intracelu-l a rmente con anti CD69 y mAb anti IL-2 e IL-10 yse analizan por citometría de flujo (4FL).

Se detectaron células T Derp-específicas IL-2+con frecuencias que oscilaron entre 1 y 240 célu-las/10.000 linfocitos T CD4. Las frecuencias sonsolapantes en pacientes de los dos grupos de asmá-ticos y en los controles sanos, sin relación apare n-te con el tratamiento con IT o su duración, aun-que se está analizando la presencia de célulasdefinidas como altamente secretoras (FL intensa)en un grupo ampliado de alérgicos con IT durantemás de 12 meses. No se han detectado linfocitos Ta l é rgeno específicos pro d u c t o res de IL-10 en nin-guno de los pacientes o controles de la serie.Cambios en el protocolo de estimulación, comoa l a rgamiento (5 vs 17 h) del periodo de acumula-ción en Golgi, o del de preincubación libre de agen-te de bloqueo (1, 2, 13 h) no revelan la pre s e n c i ade células IL-10+ Derp-específicas. Por tanto, lad e t e rminación de células T Derp-específicas pro-ductoras de IL-2/IL-10 no mejora la inform a c i ó nque brinda la detección y estimación de la frecuen-cia clonal de células productoras de IFN-γ/IL-4.

O-40. CORRECCIÓN FENOTÍPICA Y FUNCIONAL IN VITRODE LINFOCITOS TDEFICIENTES DE CD3 : EFECTOS ADVERSOS DE LA TERAPIA GÉNICA POST-TÍMICA

A. Pacheco-Castro, J. M. Martín, R. Millán, J. Clemente*, A. A r n a i z - Villena*, L. Allende*, O. Sanal**, J. R. RegueiroInmunología. Facultad de Medicina. UniversidadComplutense. *Hospital 12 de Octubre. Madrid.**Hacettepe University Children’s Hospital. Ankara,Turquía

La deficiencia humana de CD3g es una inmu-nodeficiencia congénita de linfocitos T caracteri-zada por presentar un defecto de expresión enmembrana del receptor de la célula T, el complejoTCR/CD3, así como alteraciones en determ i n a d a s

funciones del linfocito T, como la modulación delcomplejo TCR/CD3 mediada por PMA o la sínte-sis de IL2 tras activación. Las deficiencias congé-nitas de linfocitos T son unas de las enferm e d a d e sen las que se están realizando ensayos de terapiagénica.

El o b j e t i v o del presente trabajo fue generar unprotocolo de terapia génica in vitro para la deficien-cia de CD3γ utilizando como células diana linfo-citos T de sangre periférica derivados de los doscasos existentes en la actualidad, uno de origenespañol y otro de origen turco, con dicha deficien-cia.

Para ello, se infectaron PBL derivados de los dosindividuos con deficiencia de CD3γ y de dos con-t roles sanos, con un vector re t roviral bicistrónicoportador del cDNA de CD3γ (LZRS-γ) y como pro-teína marcadora la proteína verde fluorescente, asícomo con el mismo vector pero sin el gen de inte-rés (LZRS-mock). Las células deficientes de CD3γde ambos individuos transducidas con el vectorLZRS-γ aumentaron la expresión en membrana delcomplejo TCR/CD3 (hasta llegar a niveles compa-rables a los individuos control), y re s t a b l e c i e ro nel defecto de modulación del complejo TCR/CD3mediado por PMA, pero, sorpre n d e n t e m e n t e ,s u f r i e ron una alteración en la síntesis de IL2 (y node otras citocinas como IFNγ), volviéndose cons-titutiva.

Estos resultados indican que el vector re t ro v i-ral utilizado puede re s t a b l e c e r in vitro los defectosfenotípicos y funcionales descritos en la deficien-cia de CD3γ, siendo válido el protocolo empleadocomo modelo de terapia génica, pero tambiéns u g i e ren que la reconstitución de células T post-tímicas deficientes de CD3γ puede alterar la re g u-lación de determinadas funciones de los linfocitosT y, por lo tanto, generar procesos autoinmunesy/o linfoproliferativos. La reconstitución de pre-c u r s o res pre o intratímicos sería la estrategia másapropiada.

O-41. INMUNIZACIÓN CON ANTÍGENOSESPECÍFICOS DEL VIH-1 Y ALOANTÍGENOSUTILIZANDO UN INMUNÓGENO DE VIH-1INACTIVADO (REMUNE): IMPLICACIONESEN INMUNOTERAPIA DE LA INFECCIÓNPOR EL VIH-1

J. Navarro, M. L. Abad, L. Díaz, B. Jiménez, F. García-Sanchez*, J. L. Vicario*, M. A. Muñoz-Fernández, M. Clereci**, E. Fernández-Cruz*Servicio de Inmunología. Hospital Gregorio Marañón.* C e n t ro de Transfusiones, CAM. Madrid. **Cattedra diImmunología. Universita' di Milano. Italia

En nuestro centro coordinamos un ensayo clí-nico multicéntrico, randomizado, doble ciego,

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controlado por adyuvante de REMUNE (una vacu-na terapéutica consistente en un inmunógenoVIH-1 sin gp120) versus IFA administrados conantirretrovirales. Los resultados son analizados def o rma blindada. REMUNE (REM) se obtiene de lalínea celular humana T78 (HuT-78) infectada porla cepa HZ321 de VIH-1, y contiene un 11,7% deHLA-DR. En el mes 24 postvacunación, encontra-mos anticuerpos anti-HLA (29% clase I; 65% cla-se II) en 25/34 pacientes de REM (REM-pts), perosolo en 8/32 pacientes de IFA (IFA-pts ) (9% claseI; 22% clase II) (p<0,0001). Estos anticuerpos enREM son específicos de HuT-78. Encontramos unarespuesta linfoproliferativa (LPR) significativa aHZ321 (índice de estimulación, SI = 29,6; p<0,005) y a HuT-78 (SI = 25,8; p <0,05) en REM-pts, pero no en IFA-pts (SI=5,8 y 7,5 re s p e c t i v a-mente). No existen diferencias entre ambos gru-pos en reacción mixta linfocitaria frente a CMSPde 6 donantes (SI = 48,3 y 51,7).

O b s e rvamos una fuerte correlación entre LPRa antígenos HZ321 del VIH-1 (Subtipo A), anp24de VIH-1 (r = 0,86) y BaL (Subtipo B) (r =0,81). Encontramos alta citotoxicidad específicaf rente a Gag/pol del VIH-1 en REM-pts compara-do con IFA-pts (media: 20,3 Unidades Líticas,UL/106 CMPS v s 1,9 UL/106 CMSP) (p <0,05).Además, la citotoxicidad frente a HuT-78 en REMpts fue mayor que IFA-pts (14,9 UL/106 CMPS vs3 UL/106 CMPS) (p<0,05). Estos datos indicanque la vacunación terapéutica con RENUME indu-ce respuestas específicas frente a aloantígeno yf rente al VIH-1, lo que podría tener implicacionesprácticas en el tratamiento de la infección por elVIH-1.

O-42. UTILIZACIÓN DE LA TÉCNICA RSCA(REFERENCE STRAND MEDIATEDCONFORMATION ANALYSIS) PARA RESOLVER AMBIGÜEDADES DE TIPAJE DEL GEN HLA-DRB1

A. Corell, A. L. Pay, A. M. Little, M. A. Hoddinott,J. R. Argüello, H. Ogilvie, J. O’shea, J. A. Madrigal,S. G. E. MarshDepartamento de Pediatría, Inmunología, Obstetricia yGinecología, Facultad de Medicina, Universidad deValladolid. Anthony Nolan Research Institute, RoyalFree Hospital. London, Reino Unido

Se muestra la utilización de la técnica RSCA(R e f e rence Strand Mediated Conformation Análisis)para resolver sin ninguna ambigüedad tipajes deHLA-DRB1 en dos casos de trasplante de médulaósea utilizando un banco de donantes no empa-rentados.

En el primer caso, el tipaje del gen HLA-DRB1,tanto por el método SSP (PCR con p r i m e r s e s p e c í-

ficos de secuencia) como SSO (tipaje con oligonu-cleótidos específicos de secuencia) realizados demodo rutinario en dos laboratorios diferentes, die-ron resultados ambiguos para dos posibles donan-tes. Ambos individuos re s u l t a ron tipados comoHLA-DRB1*04011 + 0403 ó altern a t i v a m e n t eHLA-DRB1*0407 + 0413. Esta ambigüedad no sepodía resolver mediante secuenciación directa delexón 2 de los genes HLA-DRB1, pues nos encon-traríamos de nuevo con la misma ambigüedad.Utilizando células homocigotas de tipaje para losalelos HLA-DRB1*04011, 0403 y 0407 y utilizan-do la técnica RSCA, ambos individuos fueron tipa-dos como HLA-DRB104011 + 0403, sin ningúntipo de ambigüedad. De modo que ambos eranválidos como donantes, puesto que el receptor sehabía tipado mediante estudio familiar como HLA-DRB1*04011 + *0403 mediante estudio familiar.

En el segundo caso, un donante fue tipado comoHLA-DRB1*1102 + 1103 mediante la técnica SSP,y de modo contradictorio la técnica SSO excluíadel tipaje el alelo HLA-DRB1*1102. En tanto queel receptor se había tipado sin ambigüedades comoHLA-DRB1*1101 + *1103. Utilizando de nuevo latécnica RSCA y células homocigotas de tipaje paralos alelos HLA-DRB1*1101, *1102, *1104 y hete-rocigotas para HLA-DRB1*1101 + *1103, se pudod e t e rminar sin ambigüedades, que el donantepotencial era HLA-DRB1*1103 homocigoto.

Por lo tanto, y aunque esta técnica aún no estácompletamente desarrollada para realizar un tipa-je de alta resolución de los alelos de HLA-DRB1,en la actualidad puede ser empleada como unah e rramienta muy valiosa para resolver ambigüe-dades de tipaje generadas por otras técnicas, comoS S P, SSO o SBT (secuenciación directa) con unaelevadísima fiabilidad. Es necesario disponer decélulas homocigotas de tipaje con los alelos HLA-DRB1 involucrados en las ambigüedades.

O-43. BÚSQUEDA DE NUEVOS OLIMORFISMOS DEL GEN HLA-DRB1 EN LOS ALELOS SEROLÓGICOS MENOSPOLIMÓRFICOS: DR7, DR9 Y DR10MEDIANTE LA TÉCNICA RSCA

A. Corell, S. T. Cox, P. K. Chenery, A. L. Pay,R. J. Argüello, M. Pérez, J. Madrigal, S. G.E. MarshDepartamento de Pediatría, Inmunología, Obstetricia yGinecología, Facultad de Medicina, Universidad deValladolid. Anthony Nolan Research Institute, RoyalFree Hospital. London, Reino Unido

El motivo de este trabajo fue investigar la exis-tencia de nuevos polimorfismos moleculares dealelos del sistema HLA, y en concreto del locusHLA-DRB1. Se investigaron en particular los 3 ale-los con menos variantes moleculares: HLA-DR7,

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DR9 y DR10. Para ello se utilizaron DNAs de 400individuos no relacionados (de diferente pro c e-dencia étnica) y que habían sido previamente tipa-dos como HLA-DR7, DR9 o DR10 por técnicasrutinarias tanto serológicas, como moleculares.

Se amplificó el exón 2 de todos los DNAs y losamplificados se hibridaron con diferentes DNAsde re f e rencia (moléculas de tipaje conocido y quehan sido marcadas fluorescentemente en una delas 2 hebras). Además se utilizaron células homo-cigotas de tipaje para los alelos DR7, DR9 y DR10conocidos, como control de la técnica. El re s u l t a-do de las hibridaciones se separó electro f o r é t i c a-mente en un Secuenciador Automático de DNA( A L F e x p ress, Pharmacia) para realizar el análisisde los homo y heterodúplex formados.

El resultado obtenido fue que ninguno de losDNAs estudiados mostró nuevas movilidades(comparadas con los alelos previamente conoci-dos), y por lo tanto que no parece muy pro b a b l eque aparezcan un número elevado de alelos mole-c u l a res de estos 3 alelos serológicos (DR7, DR9 yDR10). Se analizaron en profundidad las caracte-rísticas genéticas y funcionales de estos 3 aleloscomparándolas con otros alelos del gen HLA-DRB1 en busca de alguna razón que pudiera justi-ficar esta diferencia en los polimorfismos del locusHLA-DRB1. Se concluye que la única relación apa-rente es la longitud de un microsatélite compues-to localizado en el segundo intrón del gen DRB1:a mayor longitud y complejidad del micro s a t é l i t e ,mayor polimorfismo exónico.

INMUNOLOGÍA TUMORAL Y CÉLULAS NK

O-44. CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVOANTÍGENO DE DIFERENCIACIÓN CONFUNCIÓN INHIBIDORA EN CÉLULAS NK

M.ª de Miguel, F. Navarro, M. López-Botet*Servicio de Inmunología. Hospital Universitario de LaPrincesa. Madrid. *Universidad Pompeu Fabra (CEXS).Barcelona

E n t re los re c e p t o res leucocitarios con funcióninhibidora, un grupo se adscribe a la superf a m i l i ade las Ig (Ig-SF), mientras que otros son molécu-las tipo lectina. El mecanismo de inhibición impli-ca en general la asociación del receptor a fosfata-sas con dominios SH2 (SHP-1 o SHIP). Algunosreceptores inhibidores reconocen moléculas cono-cidas (MHC de clase I, Fc de IgG, ácido siálico),aunque en muchos casos se ignora la naturalezade los ligandos.

A fin de identificar re c e p t o res de superf i c i eimplicados en la regulación funcional de las célu-las NK, generamos anticuerpos monoclonales(AcM) inmunizando con la línea NKL (CD3-

C D 1 6+ C D 9 4 / N K G 2 A+, ILT 2+). Se seleccionó unAcM (HP-F2) por su efecto inhibidor de la citoto-xicidad en ensayos de lisis redirigida de la NKLf rente a la línea P815. Por citometría de flujo lae x p resión de HP-F2 se detecta con intensidadvariable en células T (CD4+ y CD8+) y NK, acti-vadas in vitro, así como en neutrófilos. Por el con-trario, en células mononucleares de sangre perifé-rica el AcM HP-F2 sólo marca muy débilmentemonocitos y una subpoblación de linfocitos B. Enun panel de líneas tumorales de origen linfoide ymieloide/monocítico (n = 17), HP-F2 se detectaen algunas líneas T, NK y B. Este AcM inmunopre-cipita y reconoce en w e s t e rn blot una molécula deMr=150 kD (Mr=90 kD después de tratamientocon N-glicanasa). Por ensayos de w e s t e rn blot e ncélulas tratadas con pervanadato se ha observ a d oque, al igual que otros re c e p t o res inhibidores, elantígeno HP-F2 se fosforila en tirosina y copre c i-pita la tirosina fosfatasa SHP-1; por el contrario,no se ha detectado asociación con SHP-2. Actual-mente, se están desarrollando diferentes estudiosfuncionales en linfocitos T. Asimismo, como la dis-tribución y características bioquímicas de HP-F2no parecen coincidir con las de otros re c e p t o re sleucocitarios inhibidores bien caracterizados, seha emprendido el clonaje molecular aplicandodiferentes estrategias.

O-45. ANÁLISIS MUTACIONAL DEL TALLOCITOPLÁSMICO DEL RECEPTOR INHIBIDOR ILT2/LIR1

T. Bellón, J. Sayos*, F. Kitzig*, M. López-Botet* Servicio de Inmunología. Hospital de la Princesa. Madrid.*Universidad Pompeu Fabra (CEXS). Barc e l o n a

El receptor inhibidor ILT2/LIR-1 re c o n o c eespecíficamente moléculas HLA de clase I y re g u-la el umbral de activación de células linfoides ymieloides. En el tallo citoplásmico de ILT2 seencuentran cuatro ITIM (I m m u n o rreceptor Ty-rosine-based Inhibitory Motifs) que responden ala secuencia consenso I/V/LxYxxV/L. Tras la fos-forilación en tirosina, el receptor se une a la tiro-sina fosfatasa SHP-1, implicada en la señal nega-tiva. Con objeto de estudiar en detalle la basee s t ructural de la señal inhibidora mediada porI LT2, hemos realizado experimentos de deleciónp a rcial y de mutagénesis dirigida del tallo cito-plásmico, sustituyendo individualmente cadauno de los residuos tirosina por fenilalanina. Losdistintos mutantes se han transfectado de form aestable en la línea de basófilos de rata RBL, ana-

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lizando la fosforilación, asociación a SHP-1, y sucapacidad para inhibir la secreción de sero t o n i-na desencadenada a través del receptor de IgE(FceR-I). El análisis mutacional del tallo cito-plásmico de ILT2 demuestra que el residuo Y644, junto con el Y614, es el principal responsable dela unión a los dominios SH2 de SHP-1, y de latransmisión de la señal negativa. La mutación delresiduo Y533 impide la fosforilación de los re s-tantes ITIM de ILT2, anulando su capacidad inhi-bidora; ese residuo parece regular la actividad delreceptor sin participar de forma directa en la inte-racción con SHP-1.

O-46. EXPRESIÓN FUNCIONAL DE CD94 Y MOLÉCULAS NKG2 EN LINFOCITOS TCD4+ HUMANOS ACTIVADOS VÍA CD3

P. Romero, C. Ortega, A. Palma, I. J. Molina*, J. Peña, M. SantamaríaDepartamento de Inmunología. Facultad de Medicina.Hospital Universitario Reina Sofía. Universidad deCórdoba. Córdoba.*Unidad de Inmunología, Facultad deMedicina. Universidad de Granada. Granada

Hemos investigado la capacidad de linfocitosCD4+ humanos de sangre periférica para expre-sar CD94 y moléculas de la familia NKG2 en re s-puesta a su activación vía CD3, así como la fun-ción de estos re c e p t o res en esta subclase delinfocitos.

Usando células CD4+ purificadas de sangreperiférica reestimuladas mediante anti-CD3,encontramos expresión de CD94 y NKG2A haciael día 15 de cultivo. También hemos determ i n a-do mediante RT-PCR la presencia de genes deo t ros miembros de la familia NKG2, confirm á n-dose la expresión secuencial de NKG2ACD y Een células T CD4+. Por otro lado, hemos investi-gado el efecto de diferentes citocinas sobre lae x p resión de los re c e p t o res CD94/NKG2A,o b s e rvándose que TGF-β e IL-10 regulan positi-vamente la expresión de estos re c e p t o res en célu-las CD4+.

También hemos estudiado el papel funcional deNKG2A en células CD4+ , encontrándose que elc ro s s l i n k i n g del receptor NKG2A mediante mAbespecíficos modifica el perfil de citocinas secre t a-do por las células CD4+ activadas mediante CD3,de modo que la señalización a través del re c e p t o rNKG2A , no así de CD94, inhibe la secreción deIFN-γ y TNF-α.

La demostración de la expresión y función deestos re c e p t o res en linfocitos T CD4+ implica unpapel más general de las moléculas NKG2 en el sis-tema inmune, originalmente confinado a célulascitotóxicas.

O-47. EXPRESIÓN DE RECEPTORES ASOCIADOS A CÉLULAS NK EN LINFOCITOS T DE ANCIANOS

O. De la Rosa, R. Tarazona, J. G. Casado, E. Peralbo,J. Peña, R. SolanaDepartamento de Inmunología. Facultad de Medicina.Hospital Universitario Reina Sofía. Córdoba

El envejecimiento induce cambios en el fenoti-po y función de los linfocitos T, que están re l a c i o-nados tanto con la diferenciación de células memo-ria o células efectoras, como con el proceso desenescencia re p l i c a t i v a .

N u e s t ro grupo ha descrito que la expresión dere c e p t o res NK está aumentada en linfocitos T deindividuos ancianos.

El objetivo de este trabajo es analizar la expre-sión de re c e p t o res asociada a células NK (NK-Rs)en linfocitos T de ancianos sanos comparada conjóvenes. Hemos estudiado por fluorescencia mul-tiparamétrica la expresión de NK-Rs en linfocitosT obtenidos de ancianos sanos que reúnen los cri-terios Senieur y controles jóvenes sanos.

Se observó un aumento en la expresión deCD56, CD94, CD16 y CD244 en las células CD3+de ancianos, así como una expansión de la subpo-blación CD3+CD28-. La expresión de CD56 yCD16 estaba aumentada significativamente encélulas CD3+CD28- de ancianos mientras queCD161, CD45RA y perforina estaban disminuidasen esta subpoblación celular en comparación conc o n t roles jóvenes. La expresión de CD16, CD94 yCD244 también estaba elevada en las célulasCD3+CD28+ de forma significativa.

La elevada expresión de algunos NK-Rs en lin-focitos T en el envejecimiento apoya que existauna expansión de células T efectoras en ancianos,si bien la disminución de perforina intracelular enlinfocitos T CD3+CD28- podría explicar el defec-to de la respuesta inmune antiviral asociado alenvejecimiento.

O-48. ALTERACIONES FENOTÍPICAS Y FUNCIONALES EN LINFOCITOS T DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTESCON CARCINOMA GÁSTRICO

A. P. Valeri Lozano, M. Pérez Blas, N. AguileraMontilla, A. Gutiérrez*, J. Martín*, T. Ratia*, J. M.Muguerza*, A. López*, I. Lara*, M. Martín Villa Inmunología. Facultad de Medicina. UniversidadComplutense. Madrid. *Cirugía Digestivo. HospitalPríncipe de Asturias. Alcalá de Henares. Madrid

Se estudió la capacidad funcional in vitro de T-PBL y de líneas celulares T de pacientes con car-cinoma gástrico, tras su activación vía CD3, CD2

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y CD28, aisladamente o con otros mitógenos. Sep ro c e s a ron muestras de 7 controles y 6 pacien-tes. Además, se transform a ron T-PBL conH e r p e s v i rus saimiri (HVS) a fin de obtener líneasT estables. El estudio fenotípico de las células T-PBL muestra una disminución de las célulasCD3+ y de la expresión de CD28, así como unaumento de las células CD16+. Los datos funcio-nales de T-PBL re v e l a ron que la activación media-da por PHA, CD3, CD2 y CD28 es defectuosa,mientras que la combinación PMA + Ionomicinainduce una adecuada proliferación. La transfor-mación permitió obtener líneas celulares T- C D 8 .El fenotipo muestra expresión de TCRab, CD45,CD45RO, CD56, CD2, CD3, CD28, HLA-DR yCD86 similares a líneas T HVS control. La expre-sión de CD80 y CD25 se hallan disminuidas fre n-te al contro l .

Se constata una inadecuada proliferación trasactivación vía CD2, CD3 y CD28, defecto noc o rregible mediante la adición de IL2 . Por tan-to, las líneas T HVS+, pese a las alteraciones feno-típicas inherentes a la transformación, mantie-nen el defecto funcional básico vía CD3, CD2 yCD28 observado en las células T- PBL de losp a c i e n t e s .

O-49. ALTERACIONES FENOTÍPICAS Y FUNCIONALES EN LINFOCITOS T DEMUCOSA GÁSTRICA TUMORAL, TRANSFORMADOS CON HERPESVIRUSSAIMIRI

A. P. Valeri Lozano, M. Pérez Blas, N. AguileraMontilla, A. Gutiérrez*, J. Martín*, T. Ratia*, J. M.Muguerza*, A. López*, I. Lara*, J. M. Martín VillaInmunología. Facultad de Medicina. UniversidadComplutense. Madrid. *Servicio de Cirugía Digestivo.Hospital Universitario Príncipe de Asturias. Alcalá deHenares

Los linfocitos infiltrantes de tumor en el carc i-noma gástrico muestran diversas alteracionesfenotípicas (aumento de β1 integrinas, CD44,CD54, cadherinas E y P, menor expresión de FasLy CD80) y funcionales (mayor expresión de IL10,TGFβ, IL6, IL8, G-CSF, GM-CSF).

En este trabajo, tras procesar la muestra de teji-do tumoral gástrico, se aislan linfocitos T de lamucosa gástrica y se transforman con H e r p e s v i ru ss a i m i r i para disponer de un número suficiente decélulas sobre las que realizar estudios fenotípicos yfuncionales. Se obtuvieron así 7 líneas HVS-CD4+de pacientes. En paralelo, se utilizaron controles delinfocitos de mucosa de intestino delgado sanot r a n s f o rmados con HVS (n = 8) y células T de san-g re periférica también transformadas (n = 4).

El estudio fenotípico en las líneas T-HVS de lospacientes muestra un expresión de TCRαβ, CD54,CD2, CD3, CD45RO, CD28, CD80 y HLA-DRcomparables a las de las líneas control, mientrasque la expresión de CD86 y CD25 (p <0,01) esta-ba incrementada.

La respuesta proliferativa mostró que la acti-vación vía CD3, CD2 y CD28 eran defectuosas(CD2 + CD28, p <0,05; CD2 + CD3, p <0,05).

Por tanto, en los linfocitos de mucosa de carc i-noma gástrico existen importantes alteracionesfuncionales con distintos estímulos de membrana(CD3, CD2, CD28).

O-50. EXPRESIÓN DE MARCADORES NK ENLINFOCITOS T OBTENIDOS DE ENFERMOSDE MELANOMA

J. G. Casado, R. Soto, O. de la Rosa, E. Peralbo, R. Solana, L. Rioja, J. Peña, R. TarazonaDepartamento de Inmunología. Facultad de Medicina.Universidad Reina Sofía. Hospital de Córdoba. Córdoba

La expresión de re c e p t o res re g u l a d o res de lacitotoxicidad ha sido descrita en enfermos afec-tos de melanoma. El objetivo de este trabajo esestudiar la expresión de re c e p t o res NK y marc a-d o res de activación en diferentes subpoblacio-nes de linfocitos T obtenidos de pacientes demelanoma. Hemos estudiado mediante fluore s-cencia multiparamétrica la expresión de marc a-d o res NK y de activación en linfocitos TC D 8b r i g h t. Los resultados indicaron que ene n f e rmos de melanoma la subpoblación de célu-las CD8b r i g h t que expresa CD56, CD57 y p58.2,está incrementada mientras que en la subpobla-ción CD8b r i g h t CD28- existe un aumento en lae x p resión del p58.1 y un descenso en el marc a-dor NKG2A, que no se relacionó con cambios enla expresión de CD94. En células CD8b r i g h t l ae x p resión del marcador de activación CD244 yel contenido de perforina intracelular pre s e n t a-ron porcentajes más altos en enfermos de mela-noma que en individuos sanos, mientras que lae x p resión de CD45RA estaba descendida. Esi n t e resante indicar que el porcentaje de célulasC D 8b r i g h t CD28- y CD8b r i g h t CD27- tambiénse encontraba aumentado en enfermos de mela-noma. Estos resultados indican que en enferm o sde melanoma existe un predominio de célulasC D 8b r i g h tt con un fenotipo efector/memoria(CD28-, CD27-, CD56+, CD57+, CD244,CD45RA- y Perforina+). Sin embargo, la activi-dad citotóxica de estos linfocitos podría encon-trarse contrarrestada por la presencia de losre c e p t o res inhibidores de la citotoxicidad p58.1y p58.2.

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O-51. RESTAURACIÓN DE LA EXPRESIÓNDE MOLÉCULAS HLA DE CLASE I Y DE LARESPUESTA ESPECÍFICA DE LINFOCITOS TCITOTÓXICOS EN CÉLULAS DE MELANO-MA TRAS TRATAMIENTO CON 5-AZA-2DEO-XICITIDINA

R. Méndez, A. Serrano, C. Esparza, P. Jiménez, A. Clavero, A. García, F. Ruiz-Cabello, F. GarridoHospital Virgen de las Nieves. Granada

Las células T citotóxicas desempeñan un papelclave en la eliminación de células infectadas porv i rus y células tumorales, siendo necesario paraeste proceso, la expresión en superficie de lasmoléculas HLA de clase I. La disminución o per-dida de estas moléculas es muy frecuente en estosprocesos.

Tres mecanismos principales han sido descri-tos como responsables de la ausencia de expre-sión de las moléculas HLA de clase I: mutacionesen el gen de la -2microglobulina, deficiencias enlos genes TAP y baja afinidad de los factores detranscripción por elementos re g u l a d o res. El obje-tivo de este trabajo es la descripción de otro meca-nismo molecular generador de la ausencia demoléculas HLA de clase I en una línea (MSR3-mel) derivada de un paciente con melanomametastásico. La hipermetilación fue puesta demanifiesto con un ensayo de Southern Blot conDNA de la línea y DNA de PBLs autólogos, y conel tratamiento de la línea celular con el agentedesmetilante 5-aza-deoxicitidine (DAC). Tras eltratamiento con DAC se observa la re c u p e r a c i ó nde transcritos para HLA-A y HLA-B, re c u p e r a c i ó nde su expresión en superficie de estas moléculas,así como el reconocimiento por CTLs específicospara los antígenos tumorales MAGE. Este estu-dio muestra que la hipermetilación del DNApodría ser un mecanismo responsable de la per-dida de moléculas HLA de clase I, pro p o rc i o n a n-do una nueva ruta de escape al re c o n o c i m i e n t oi n m u n o l ó g i c o .

O-52. GENERACIÓN IN VIVO DE METÁSTA-SIS TAP POSITIVAS Y TAP NEGATIVAS DESDE UN CLON TUMORAL TAP NEGATIVO

A. García-Lora, P. Jiménez, I. Algarra, F. Ruiz-Cabello, F. GarridoServicio de Análisis Clínicos e Inmunología. HospitalUniversitario Virgen de las Nieves. Granada

En nuestro laboratorio hemos generado un sis-tema tumoral murino constituido por líneas celu-l a res derivadas de clonos de un tumor primario(GR9) inducido por metilcolantreno en ratones

BALB/c, y metástasis espontáneas generadas a par-tir de estos clonos en ratones inmunocompetentesy nude. El clon del tumor primario B9, no muestrae x p resión basal en superficie de moléculas H-2 declase I, pero sí son inducidas todas las moléculaspor tratamiento con IFN-γ. Mediante estudios deRT-PCR, con células en estado basal, detectamosniveles normales de mRNA de las moléculas K, Dy L. Análisis de la expresión de los genes TAP-1 yLMP-2 por RT-PCR, mostró una pérdida de expre-sión de estas moléculas en este clon.

El tratamiento con IFN recuperó la expre s i ó nde dichas moléculas.

En metástasis espontáneas obtenidas en rato-nes inmunocompetentes con este clon, encontra-mos el mismo fenotipo y el mismo defecto mole-cular que en el clon B9. Por el contrario, cuandogeneramos metástasis espontáneas en ratonesnude con el mismo clon, las metástasis encontra-das presentan expresión basal de moléculas H-2de clase I, recuperando la expresión de los genesTAP-1 y LMP-2. Estos resultados indican que enausencia de células T (ratones nude), las metásta-sis generadas "recuperaron" la expresión en super-ficie de moléculas H-2 de clase I, y la expresión delos genes TAP-1 y LMP-2.

O-53. RECHAZO TUMORAL POR LAINFILTRACIÓN DE CÉLULAS SUPRESORASNATURALES TRAS EL TRATAMIENTO CONINMUNOTERAPIA ADOPTIVACICLOFOSFAMIDA

B. Peláez, J.A. Campillo, J. A. López Asenjo, J. L. SubizaDepartamentos de Inmunología y Patología. HospitalClínico San Carlos. Madrid

Las células supresoras naturales (NS) son célu-las generadas durante el crecimiento tumoral.Estas células son progenitoras de la serie mieloideque producen grandes cantidades de óxido nítri-co (NO) e inhiben respuestas linfocitarias. Estap ropiedad inmuno-supresora se encuentra dentrode los mecanismos de escape tumoral.

Las células NS también son inducidas bajo elrégimen de quimioterapia con ciclofosfamida(Cy). Paradójicamente, la utilización de Cy poten-cia la respuesta antitumoral durante el tratamien-to con inmunoterapia adoptiva.

El o b j e t i v o de este trabajo fue investigar si den-t ro del sinergismo antitumoral que existe entre laCy y la terapia adoptiva estaban implicadas lageneración y activación de las células NS.

Se estudió la inducción de células NS por la Cyy su capacidad supresora. Se evaluaron cortes his-tológicos tumorales y la implicación del NO gene-

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rado por las NS en el rechazo tumoral tanto in vitrocomo in vitro.

Los re s u l t a d o s in vivo re v e l a ron que las célu-las NS ejerc i e ron una acción supresora antitu-moral sólo en presencia de señales T activadoras( I F Nγ + CD40). En las biopsias se identificaro ncélulas NS con el mAb ER-MP54 dentro de lareacción inflamatoria de rechazo tumoral, la cualsólo se desarrolló tras el régimen de terapia adop-tiva y Cy. La utilización de un inhibidor del NOtanto en cultivo como in vivo, demostró que estamolécula, generada por las células NS, era la re s-ponsable de rechazar la proliferación y el desa-rrollo de la masa tumoral. Las células NS intra-tumorales expre s a ron el enzima que sintetiza elN O .

L a conclusión de este estudio es que el sinerg i s-mo entre el tratamiento con Cy y terapia adoptivadepende por un lado, de la generación de célulasNS y por otro, de su activación, llegada al entorn otumoral y de su síntesis de NO. Estas dos últimascondiciones dependen de las señales linfocitariasprovenientes de la terapia adoptiva.

O-54. REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL RECEPTOR DE INTERLEUCINA-2(CD25) EN LA LEUCEMIA LINFOCÍTICACRÓNICA DE CÉLULAS B (LLC-B) PORINTERLEUCINA 2 (IL2) Y TRANSFORMINGGROWTH FACTOR-B (TGF-B)

Y. Romero, J. A. Vargas, M. Villarreal, R. Castejón,A. Gallego, J. García-Marco*, A. DurántezServicios de Medicina Interna I y *Hematología. ClínicaPuerta de Hierro. Madrid

I n t ro d u c c i ó n : la LLC-B es un proceso neoplási-co en el que se acumulan linfocitos B monoclona-les CD5+. In vitro se produce apoptosis que variascitocinas, como la IL-2, son capaces de pre v e n i r.Por otro lado, el TGF-β es un importante inmuno-rregulador de los linfocitos B normales, en los queinhibe proliferación dependiente de IL2 (modularespuesta a IL2), mientras que en la LLC-B tieneun efecto heterogéneo que parece depender de lae x p resión de sus propios re c e p t o res en la superf i-cie celular.

O b j e t i v o : analizar el efecto del TGF-β en la expre-sión de re c e p t o res de IL-2 (CD25) en la LLC-B.

Pacientes y métodos: analizamos 19 pacientes conLLC-B. Se obtuvieron las células leucémicas median-te centrifugación diferencial y selección negativa conhematíes de carn e ro. Se cuantificó la expresión delreceptor de IL2 mediante tinción con anticuerposmonoclonales (CD19, CD5, CD25) en células culti-vadas 24 y 48 horas con IL-2, con TGF-β, con ambascitocinas y en situación basal. Se utilizó un citóme-

t ro FA C S o rt (Becton Dickinson) y los pro g r a m a sLysis II y Paint-a-gate.

R e s u l t a d o s : la expresión de CD25 en linfocitosrecién obtenidos fue de 30,7%. Tanto la IL2 comoel TGF-β, como ambas citocinas juntas incre m e n-taron de forma significativa la expresión del recep-tor de IL2. La t de student para la diferencia de lasmedias fue significativa en todos los casos con unap <0,05. La combinación de ambas citocinas pro-dujo un incremento en la expresión de CD25 sig-nificativamente superior al de ambas citocinas porseparado.

Control IL2 TGF-β IL2+TFG-β% CD25 24H 58,1 ± 25,7 72,7 ± 20,1 69,8 ± 15,777,3 ± 15,7.% CD25 48H 65,4 ± 25,1 77,6 ± 15,7 77,2 ± 19,882,6 ± 14,5.

C o n c l u s i ó n : en la LLC-B existe una re s p u e s t aanómala al TGF-β que, en este caso, a través deli n c remento en la expresión del CD25 podríapotenciar el efecto de la IL2 como factor de super-vivencia de estas células.

ALERGIA, INFECCIÓN, INFLAMACIÓN Y COMPLEMENTO

O-55. ALTERACIONES FENOTÍPICAS Y FUNCIONALES EN LINFOCITOS T DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTESCON CARCINOMA GÁSTRICO

A. P. Valeri Lozano, M. Pérez Blas, N. AguileraMontilla, A. Gutiérrez*, J. Martín*, T. Ratia*, J. M.Muguerza*, A. López*, I. Lara*, A. Martín Villa Inmunología. Facultad Medicina. Universidad Com -plutense. Madrid. *Cirugía Digestivo. Hospital Príncipede Asturias. Alcalá de Henares. Madrid

Se estudió la capacidad funcional in vitro de T-PBL y de líneas celulares T de pacientes con carc i-noma gástrico, tras su activación vía CD3, CD2 yCD28, aisladamente o con otros mitógenos. Sep ro c e s a ron muestras de 7 controles y 6 pacientes.Además, se transform a ron T-PBL con H e r p e s v i ru ss a i m i r i (HVS) a fin de obtener líneas T estables. Elestudio fenotípico de las células T-PBL muestrauna disminución de las células CD3+ y de la expre-sión de CD28, así como un aumento de las célulasCD16+.

Los datos funcionales de T-PBL re v e l a ron quela activación mediada por PHA, CD3, CD2 yCD28 es defectuosa, mientras que la combina-ción PMA+Ionomicina induce una adecuada pro-l i f e r a c i ó n .

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La transformación permitió obtener líneas celu-l a res T-CD8. El fenotipo muestra expresión deT C Rα β, CD45, CD45RO, CD56, CD2, CD3,CD28, HLA-DR y CD86 similares a líneas T HVSc o n t rol. La expresión de CD80 y CD25 se hallandisminuidas frente al control.

Se constata una inadecuada proliferación trasactivación vía CD2, CD3 y CD28, defecto no corre-gible mediante la adición de IL2 .

Por tanto, las líneas T HVS+, pese a las altera-ciones fenotípicas inherentes a la transform a c i ó n ,mantienen el defecto funcional básico vía CD3,CD2 y CD28 observado en las células T- PBL de lospacientes.

O-56. ALTERACIONES FENOTÍPICAS Y FUNCIONALES EN LINFOCITOS T DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTESCON ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL

N. Aguilera Montilla, A. P. Valeri Lozano, M. PérezBlas, G. Castellano*, B. Casís*, F. Sanchez F*, J. M.Martín VillaInmunología. Facultad de Medicina. UCM. Madrid.*Servicio de Digestivo. Hospital 12 de Octubre. Madrid

Se estudió la capacidad funcional in vitro d ecélulas T de sangre periférica (T-PBL) y de líne-as celulares T de pacientes con enfermedad deC rohn (EC) y colitis ulcerosa (CU) tras su acti-vación vía CD3, CD2 y CD28, aisladamente o encombinación con otras sustancias mitogénicas.Se pro c e s a ron muestras de 60 controles y 6pacientes -3 CU y 3 EC-. Además, se transform a-ron las células T-PBL con Herpesvirus saimiri(HVS) para obtener líneas T estables. El estudiofenotípico de las células T-PBL muestra expre-sión comparable al control en CD2, CD3, CD4,CD8, CD45 y HLA-DR. La expresión de CD25 esmenor en CU que en controles. La activaciónmediada por CD3 se halla alterada en células T-PBL de pacientes con EC y CU (p <0,05), defec-to que no se corrige con la adición de IL2, PMAni CD28. La respuesta a PHA es menor que enc o n t roles, mientras que la activación mediantePMA+Ionomicina induce una adecuada re s p u e s-ta. Obtuvimos 4 líneas celulares T-CD8 HVS pro-cedentes de los pacientes con EC y 2 líneas T-HVS de controles. El fenotipo de las líneas T- H V Sde pacientes es similar al de líneas control. Laactivación de las líneas T-HVS de los pacientesmostró que la respuesta frente a CD2, CD3 yCD28 era mayor que en las líneas control, lo quepuede reflejar el estado de activación de las célu-las T-PBL de los pacientes. La discordancia conlas células T-PBL puede deberse al tratamientoi n m u n o s u p resor de los pacientes.

O-57. ALTERACIÓN DE LA RESPUESTAINFLAMATORIA Y AUMENTO DE LA NEURODEGENERACIÓN EN RATONESDEFICIENTES DE METALOTIONEÍNA I Y IICON ENCEFALITIS AUTOINMUNE EXPERIMENTAL

C. Espejo, M. Penkowa*, X. Montalbán, J. Hidalgo**, E. Martínez-CáceresUnitat Neuroinmunologia Clínica. Servei Neurologia.Hospital Universitario Vall d’Hebron. Barcelona. *ThePanum Inst. Departament Medical Anatomy.University Copenhagen. Dinamarca. **Departamento.Biología Celular, Fisiología e Inmunología, Universidadde Fisiología Animal, Facultad Ciencias. UAB,Barcelona

Las metalotioneínas (MT) I y II son pro t e í n a santioxidantes que tienen un papel pro t e c t o rdurante la inflamación en el sistema nerv i o s ocentral (SNC). Recientemente, se ha descrito quela administración exógena de MT-II disminuyesignificativamente los signos clínicos, mort a l i-dad e infiltración leucocitaria en el SNC durantela encefalitis autoinmune experimental (EAE),modelo animal de esclerosis múltiple (EM). Eneste trabajo hemos analizado la influencia de lasMT sobre la EAE en ratones deficientes de MT- Iy II (MT- I + I I- / -) .

Material y métodos: se inmunizaron 32 ratones129Sv y 30 ratones 129Sv-MT- I + I I- / - de 8-14 sema-nas de edad con 100 µg del péptido 40-55 de la gli-c o p roteína mielínica de los oligodendrocitos derata (MOG4 0 - 5 5). Se valoró diariamente el curso clí-nico. Los animales fueron sacrificados el día 37post-inmunización y se realizó estudio inmu-nohistoquímico de cere b ro y médula espinal paraanalizar la respuesta inflamatoria, de estrés oxida-tivo y apoptosis celular.

R e s u l t a d o s : se observó que los ratones MT- I + I I- / -

eran más susceptibles (70 vs 44%; p <0,05) y sufrí-an una enfermedad más grave (puntuación máxi-ma: 3,52 ± 2,09 vs 1,66 ± 2,15; p<0,05) que la cepac o n t rol. También se observó mayor re s p u e s t ainflamatoria, tanto a nivel de tamaño del infiltra-do celular como de producción de citocinas proin-flamatorias como IL-1β, IL-6 y TNF-α, en el SNCde ratones MT-I+II-/- respecto a ratones control. Losratones MT- I + I I- / - p re s e n t a ron niveles más eleva-dos de marcadores de estrés oxidativo como iNOS,NITT y MDA. La técnica de TÚNEL reveló quehabía más muerte neuronal y glial en ratones MT-I+II-/- que en la cepa control.

C o n c l u s i o n e s : estos resultados apoyan que MT-I y II pueden regular la respuesta inflamatoria yp roteger al SNC del daño tisular que se pro d u c edurante la EAE, por lo que estas proteínas antio-xidante podrían tener un papel importante en eltratamiento de la EAE/EM.

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O-58. ESTUDIO DEL INFILTRADO INFLAMATORIO DE LOS ANEURISMAS DE AORTA ABDOMINAL

E. Ocaña, J. C. Bohorquez*, J. A. Brieva, C. RodríguezServicios de Inmunología y *Cirugía Vascular. HospitalUniversitario Puerta del Mar. Cádiz

A n t e c e d e n t e s: los aneurismas de aorta abdomi-nal (AAA) son la forma más común de enferm e-dad aneurismática siendo causa de muerte en el1-2% de varones mayores de 65 años. Histo-lógicamente se caracterizan por fragmentaciónde la red de elastina, disminución en el númerode células musculares y existencia de un infiltra-do inflamatorio en las capas media y adventicia.Aunque la etiopatogenia de los AAA no es com-pletamente conocida, la inflamación de la pare dvascular ha sido propuesta como un factor cau-sal. La población linfoide infiltrante no ha sidoaún definida.

O b j e t i v o s : el objetivo del estudio fue la caracte-rización del infiltrado linfoide de los AAA y la iden-tificación de su estadio madurativo.

Material y métodos: se pro c e s a ron segmentosde AAA humanos obtenidos de pacientes some-tidos a cirugía reparadora .Como control seempleó sangre periférica. Se hizo un pro c e s a-miento independiente de las capas media yadventicia mediante disgregación mecánica,digestión con colagenasa y posterior separacióncelular mediante gradiente de densidad. El aná-lisis de las poblaciones linfoides se re a l i z ómediante citometría de flujo utilizando Acmoe s p e c í f i c o s .

R e s u l t a d o s : el infiltrado inflamatorio leucocita-rio de los AAA está formado fundamentalmentepor linfocitos T (CD45+CD3+) y, en menor canti-dad, por linfocitos B (CD45+CD19+). No apare-cen re p resentadas otras poblaciones celulare s(granulocitos, NK, células plasmáticas ).Los lin-focitos T infiltrantes tienen características dememoria (CD45RO+RA-, CD27+), con pre d o m i-nio CD4+ y expresión del TCR αβ, están activados(CD69+, DR+, CD71+, CD25+) y son no re c i rc u-lantes (CD62L-). El estado madurativo de los lin-focitos B que infiltran los AAA es el de linfocitos Bm a d u ros (kappa+/lambda+, CD34-). Además deuna población IgM+IgD+, se detectan poblacionesde linfocitos B con características de memoria(IgD-IgM+/IgA+, CD27+). No se detectan linfoci-tos B en estadio de centro germinal (CD38+,CD10). Los linfocitos B también expresan marc a-d o res de activación (CD69, CD80) y son no re c i r-culantes (CD62L-).

C o n c l u s i o n e s : la existencia de poblaciones lin-foides de memoria y activadas sugiere su posiblepapel patogénico en los AAA. La caracterizaciónde estas poblaciones permite la realización de estu-dios funcionales en este sentido.

O-59. DESCRIPCIÓN DEL INFILTRADO LINFOIDE T EN LAS LESIONES HEPÁTICASDE PACIENTES CON HEPATITIS CRÓNICAPOR VIRUS C

C. Serrano, S. Castañón, M. Rico*, J. A. Quiroga*, V. Carreño*, D. SubiráServicio de Inmunología de la Fundación Jiménez Díaz.Instituto de Hepatología. Hospital Pardo de Aravaca y*Fundación para el estudio de hepatitis virales. Madrid

Los mecanismos responsables de la lesión hepá-tica crónica en la infección por el virus C (HCVC)aún no están bien establecidos.

O b j e t i v o : definir las características fenotípicasdel infiltrado linfoide T de las lesiones hepáticasde pacientes con hepatitis crónica por virus C.

P a c i e n t e s : se sometió a biopsia hepática a 39pacientes con HCVC,16 presentaban niveles nor-males de transaminasas (Grupo I) y 23 tenían enzi-mas elevadas (Grupo II). El daño tisular se califi-có de 0 a 10.

M é t o d o s : los anticuerpos monoclonales CD3FITC/ CD4 PE/ CD8 RPE-Cy5 se utilizaron parad e t e rminar por citometría de flujo las caracterís-ticas de infiltrado linfoide de las biopsias y de lassubpoblaciones linfocitarias de sangre periférica.

Resultados:1. Los pacientes del Grupo I tienen menor daño

histológico que los del Grupo II.2. Los niveles de transaminasas y el re s u l t a d o

del cociente CD4/CD8 intrahepático perm i t eagrupar a los pacientes según la tabla adjunta.

3. Los 7 pacientes sin daño histológico están enel Grupo I. El infiltrado de la biopsia muestra unp romedio de linfocitos T CD4 de 20,2 y de linfo-citos T CD8 de 37,2.

4. Sólo hay pacientes con un cocienteCD4/CD8>1 en el Grupo II y todos ellos tienendaño histológico moderado o severo (entre 6 y 10).

5. En ambos grupos, a medida que el daño his-tológico es mayor aumenta la pro p o rción de linfo-citos T CD4 y disminuye la de los linfocitos TCD8.

C o n c l u s i o n e s : en la HCVC, existe una re l a c i ó nd i recta entre el infiltrado linfoide T CD4, el gradode daño hepático y los niveles séricos de transami-nasas. La relación es inversa para los linfocitos TCD8 sin que exista correlación con las subpobla-ciones linfocitarias en sangre periférica.

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Cociente CD4/CD8

0,3-0,6 0,6-1 >1

Grupo I 7 9Grupo II 10 8 5

Tabla I


O-60. LAS ESTATINAS POTENCIAN LA RESPUESTA IMMUNE FRENTE A MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS IN VITRO

J. Matilla, G. Carpeño, M.ª T. Montero, M. A.LasunciónServicio de Bioquímica-Investigación. Hospital Univer -sitario Ramón y Cajal y Universidad de Alcalá. Madrid

Antecedentes: el IFNγ es una citocina clave en laresolución de infección por M. tuberculosis.Recientemente, hemos descrito que la inhibición dela síntesis de colesterol con estatinas aumenta la acti-vidad de la caspasa-1, proteasa que procesa Il-1β e Il-18 a su forma madura, observándose un aumento enla secreción de IFNγ en respuesta a M. Tu b e rc u l o s i s.

Objetivo: estudiar el efecto de las estatinas sobrela cinética de secreción de las citocinas re g u l a d o-ras de la producción de IFNγ y determinar laspoblaciones celulares implicadas en el aumento.

M é t o d o s : PBMCs aisladas a partir de b u ffy coat,se cultivaron a 2 x 106/ml en medio completo, enp resencia o ausencia de fluvastatina 5mM. Ambascondiciones se activaron o no con M. tuberc u l o s i sH37RA. A distintos intervalos del proceso valora-mos la actividad enzimática por fluorometría y laproducción de citocinas por ELISA. Los efectos deIl-12, Il-1β e Il-18 sobre IFNγ f u e ron estudiadosañadiendo anticuerpos específicos o inhibiendola caspasa-1 con YVAD. Estudiamos, mediantecitometría de flujo, las poblaciones celulare simplicadas en el incremento de la secreción deIFNγ, así como la supervivencia celular.

R e s u l t a d o s : fluvastatina aumenta la pro d u c c i ó nde Il-1β y de Il-18 a lo largo del proceso sin afectar ala liberación de Il-12.YVAD, anti-Il-12, anti Il-1β yanti Il-18 re v i e rten el efecto de la estatina, sugirien-do que el aumento de IFNγ es inducido por Il-1β ypor Il-18, pero necesitan la Il-12. La estatina aumen-ta el IFNγ intracelular en células CD3+(CD8+ yCD8-), y en CD3-/CD56+. El número de célulasCD14+/CD36+ disminuye con la bacteria, efecto quees más intenso en combinación con el fárm a c o .

Conclusiones: la activación de caspasa-1 poten-cia la respuesta inmune contra M. tuberc u l o s i s,ofreciendo nuevas posibilidades terapéuticas.

O-61. ESTUDIO DEL POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL EN LINFOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA(LSP) DE INDIVIDUOS SANOS Y EN PACIENTES CON INFECCIÓN CRÓNICAPOR VIH- 1

P. Madrigal, S. Martínez-Rodríguez, R. Polo, J. Verdejo, M. González MuñozServicio de Inmunología. Servicio de EnfermedadesInfecciosas. Hospital Carlos III. Madrid

O b j e t i v o : comparación del potencial de mem-brana mitocondrial (PMm) de los LSP de indivi-duos sanos e infectados por VIH-1.

Sujetos del estudio y métodos: se extrajo sangreheparinizada de sujetos sanos (n = 16) e infecta-dos por VIH-1 (n = 70) y se procesó inmedia-tamente. El PMm se midió con un fluoro c ro m olipofílico catiónico (JC-1). El análisis de las mues-tras se realizó por citometría de flujo. Los LSP ses e l e c c i o n a ron según sus propiedades de disper-sión de luz (FSC/SSC). Mediante un agente des-polarizante (valinomicina) se ajustó los paráme-t ros del citómetro y se definió la región de análisisde la población linfocitaria con PMm alterado. Losresultados se expresan como el % de LSP con dis-minución del PMm (PMmL).

R e s u l t a d o s : el PMmL fue 1,19% (0,18-2,81) y2,08% (0,2-10,67) en individuos sanos e infectadospor VIH-l respectivamente (p = 0,007). De los VIH+,el 19,2% mostraron un PMmL >3,82% (media + 3 DEdel grupo control). El PMmL c o rrelaciona negativa-mente con el número de CD4 (r = -0,34; p = 0,004),positivamente con el %CD8 (r = 0,32; p = 0,007), yno correlaciona con la carga viral. El 28,3% depacientes tratados tenían el PMmL >3,82%, mientrasque ninguno de los no tratados tenían PMmL > 3 , 8 2 %(p = 0,01; test exacto de Fisher).

Conclusiones: se pueden valorar alteracionessignificativas en el PMm de los LSP de pacientesVIH-1+ sin necesidad de cultivo celular. La pre-sencia de PMmL puede ser la consecuencia de lainducción de apoptosis por el VIH-1 en órg a n o slinfoides secundarios, o puede estar re l a c i o n a d acon la toxicidad mitocondrial de los NRTls.

O-62. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DELDEFECTO DE LYST EN LÍNEAS DE LINFOCITOS T CD8+ TRANSFORMADAS CONHERPESVIRUS SAIMIRI PROCEDENTES DEPACIENTES CON EL SÍNDROME DE CHEDIAKH I G A S H I

J. M. Martín Fernández, J. García Cabanillas, P. R.Rodríguez Duque*, R. A. Spritz**, J. R. RegueiroInmunología. Universidad Complutense de Madrid.*Hospital Central de San Cristóbal, Ve n e z u e l a .**University of Colorado Health Sciences Center.Denver. EE.UU.

El síndrome de Chédiak Higashi (CHS) es unaanomalía humana de herencia autosómica re c e s i-va originada al mutar un gen (CHS1) que codificauna fosfoproteína (Lyst) relacionada con la re g u-lación del tráfico lisosómico.

Partimos de un modelo de linfocitos T transfor-mados con H e r p e s v i rus saimiri de 3 pacientes, 7portadores y líneas control.

Hemos confirmado mediante experimentos fun-cionales (actividad NK) y microscopía que las líneas

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de los pacientes poseían la marca diagnóstica (bajacitolisis NK y gránulos gigantes) y hemos intentadosin éxito caracterizar las mutaciones de cada líneapor secuenciación de sus 54 exones. Sólo apare c í aun raro polimorfismo consistente en una sustituciónen el aminoácido K590N, en un portador obligado(CH2) heterocigoto para esta sustitución.

En conclusión, la clínica, el diagnóstico pormicroscopía y los experimentos funcionales apun-tan a la presencia del síndrome, pero no hallamosmutaciones exónicas. Es posible que exista otrotipo de mutaciones en CHS1 o, lo que sería mási n t e resante, que Lyst sea normal y sea otra pro t e í-na de dicha ruta la afectada.

Este trabajo fue financiado por el MEC(CPR264/97-7415), utilizando instalaciones delCentro de Técnicas Inmunológicas de la U.C.M.).

O-63. CANDIDA ALBICANS INFECTIONENHANCE IMMUNOSUPPRESSION INDUCED BY CYCLOPHOSPHAMIDE BYSELECTIVE PRIMING OF SUPPRESSIVEMYELOID PROGENITORS

I. Angulo Barturen, B. Jiménez*, M. A. Muñoz-Fernández*, M. FresnoCentro de Biología Molecular, CSIC-UAM. *Depart -ment of Immunology. Hospital Gregorio Marañón.Madrid

Infections in immunocompromised patientsoftenly complicate chemotherapy.

In part i c u l a r, systemic infections caused by fungiafter cytoreductive therapies, mostly used in condi-tioning regimes for bone marrow transplantation orcancer treatment, are especially difficult to deal within spite of currently available antimicrobials. Thisfact has prompted re s e a rchers and clinicians to deve-lop suitable complementary immunotherapies.H o w e v e r, little is known about the effects of fungion the immune system of immunosuppressed hosts.We have addressed this by studying the in vitroT cellresponses after systemic infection with Candida albi-c a n s in cyclophosphamide-treated mice. Duringre c o v e ry from the cytotoxic effects of cyclophosp-hamide, a massive splenic colonisation by immatu-re myelomonocytic (Ly-6G+CD11b+) cells takesplace, which contribute to immunosuppression byinhibiting T proliferative responses via a nitric oxi-de (NO)-dependent mechanism. Systemic infectionof cyclophosphamide-treated mice with a sublethaldose of Candida albicans f u rther increased NO-dependent suppression by selective priming of mye-loid precursors (Ly-6G+CD31+) for iNOS pro t e i ne x p ression. The results indicate that systemic fun-gal infection can augment the effects of immuno-s u p p ressive therapies by promoting funtional chan-ges in immunosuppressive cell populations.

O-64. EL FACTOR Xa ACTÚA SOBRE EL TERCER COMPONENTE DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO

C. Pastor, L. Vidarte, S. Mas, A. B. Blázquez, C. Durán, F. VivancoDepartamento de Inmunología. Fundación JiménezDíaz. Madrid

Se han descrito múltiples relaciones entre el s i s-tema del Complemento y el sistema de la Coagulación.Dichas relaciones cubren un amplio rango, perobásicamente tienen como objetivo principal pro t e-ger las células endoteliales de una activación ines-pecífica del c o m p l e m e n t o. Esta protección va desdela secreción del C1 inhibidor, hasta el re c l u t a m i e n-to de leucocitos, previniendo una ampliación deldaño tisular.

El objetivo de este trabajo ha sido caracterizarla digestión que realiza el factor Xa del sistema dela coagulación s o b re tercer componente del s i s t e-ma del complemento (C3).

La secuencia de los extremos amino-terminal delos fragmentos generados por la digestión de C3 porel factor Xa da un patrón similar a los generados porel factor I (proteína reguladora del sistema del com-p l e m e n t o). Los resultados demuestran que el factorXa digiere C3, generando su forma activa C3b.Además el factor Xa es capaz de actuar sobre C3 uni-do a un activador generando la molécula de degra-dación C3dg, molécula ampliamente re l a c i o n a d acon la activación de la respuesta inmune.

Estos datos sugieren que la degradación porp a rte del factor Xa de C3 podría ser otro mecanis-mo de protección de las células endoteliales fre n-te a la activación inespecífica de complemento: eldaño tisular por la activación del sistema del com-plemento activaría las células del endotelio, provo-cando un aumento en la concentración de factorXa, el cual, actuaría como agente de control del C3evitando una ampliación del daño.

DIFERENCIACIÓN, CÉLULAS Y CITOQUINAS

O-65. CARACTERIZACIÓN Y ESTUDIO DELOS PRECURSORES DE LINAJE PRESENTESEN EL HÍGADO EMBRIONARIO

S. Minguet, J. A. Martínez*, P. Gonzalo*, B. deAndrés*, A. Izcue1, M. L. Gaspar*, M. A. R. MarcosCBM-SO. Universidad Autónoma de Madrid. *CNBF-ISCIII. Majadahonda. Madrid

Durante el desarrollo embrionario temprano,el hígado fetal (HF) es el principal órgano hema-topoiético. A 10.5-11 días de gestación (dpc), ya

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han tenido lugar los primeros cambios morf o l ó g i-cos y la formación del primordio hepático.

Basándonos en la expresión de marc a d o re sespecíficos de linaje y de células pre c u r s o r a s ,hemos caracterizado cuatro poblaciones celulare sque constituyen la totalidad del HF en la ventana10.5-13.5 dpc. Así tenemos, una población (A) defenotipo c-Kit+CD45+Ter119- que constituye elcomponente hematopoiético del HF y contienep re c u r s o res B, T y pre c u r s o res mieloides. En con-diciones que promueven el desarrollo linfoide, esla única capaz de originar colonias hematopoiéti-cas. Una población (B) de fenotipo c-Kit+C D 4 5 + Ter119+, formada por pre c u r s o res eritro i-des, que van perdiendo la expresión de c-Kit yCD45, maduran y se expanden formando el com-ponente eritroide definitivo del HF (población C,c - K i t - C D 4 5 - Ter119+). Por último, existe unapoblación de fenotipo c-Kit+CD45-Te r 1 1 9 - ,mayoritaria a 10.5-11.5 dpc, negativa para marc a-d o res hematopoiéticos. Considerando que estapoblación pudiera incluir pre c u r s o res hepáticos(hepatoblastos), se analizó la expresión de genesespecíficos de este linaje, siendo la única quee x p resa estos tránscritos (AFP, albúmina, TTR,HNF-4, c-met...). Trabajando con cultivos quef a v o recen la formación de colonias hepáticas, seanalizó la frecuencia de pre c u r s o res clonables y elfenotipo de las colonias obtenidas. Se compro b óque, exclusivamente las células de fenotipo c - K i t + C D 4 5 - Ter119- son capaces de establecercolonias, que tienen características tanto de hepa-tocitos como de colangiocitos. Por tanto, estapoblación contiene pre c u r s o res hepáticos bipo-tenciales (liver stem cells). Estos resultados com-pletan la identificación fenotípica de las poblacio-nes de pre c u r s o res, hematopoiéticos y hepáticos,p resentes desde las primeras etapas de form a c i ó ndel HF.

O-66. POTENCIAL DE DIFERENCIACIÓNDE POBLACIONES PROGENITORASEMBRIONARIAS (AA4.1+/ CD19+ Y AA4.1+/CD19-) DE HÍGADO FETAL A DÍA 11.5DPC

P. Gonzalo, B. de Andrés, S. Minguet, PG. Soro, M.A. R. Marcos, M. L. GasparCNBF, Instituto de Salud Carlos III. Majadahonda.Madrid

La diferenciación de un progenitor multipoten-cial a un linaje re q u i e re la aparición de determ i n a-dos factores intrínsecos (factores de transcripción ym i c roambientales (contactos interc e l u l a res, y facto-res solubles) los cuales coinciden en estadios tem-porales muy concretos durante la vida embrionaria.

Nuestra línea de trabajo ha descrito la existen-cia de una onda muy temprana de activación de

genes ligados a desarrollo B tales como rag1/2,V p reB y más recientemente CD19 y Pax5 a día 10-11 de gestación.

Con objeto de mostrar la existencia de pro g e-n i t o res unipotenciales B en estadios tan tempra-nos hemos desarrollado diversos sistemas de dife-renciación in vitro.

La evaluación del potencial linfoide/mieloide serealizó utilizando sistemas de expansión in vitro,con una línea estromal ST2 y la combinación decitoquinas (SCF stem cell factor, IL7 y IL11) depoblaciones purificadas por s o rting A A 4 . 1+ C D 1 9+

y AA4.1+ C D 1 9- a día 11 de gestación. Los re s u l t a-dos muestran que la población CD19+ exclusiva-mente genera células CD19, B220, Thy1, Mac1,mientras que la población AA4.1

+C D 1 9- c o n t i e n e

p ro g e n i t o res B (CD19+, B220+) y mieloide (CD19-,G r 1+, Mac1+). Además utilizamos el sistema de cul-tivo FTOC (fetal thymic organotipic culture ) p a r apoder estudiar la capacidad de generar células T i nv i t ro de ambas fracciones, obteniendo únicamentecélulas CD3+ en el caso de la fracción CD19-.

Así pues, presentamos de forma relevante lacaracterización de una población pro g e n i t o r ac o m p rometida al linaje linfoide B a tiempos tem-pranos en la gestación de ratón (11.5 pdc).

O-67. CARACTERIZACIÓN DE LOSPROCESOS DE DIFERENCIACIÓN DECÉLULAS DENDRÍTICAS INTRATÍMICASHUMANAS

V. G. de Yébenes, Y. R. Carrasco, A. R. Ramiro, M. L. ToribioCentro de Biología Molecular Severo Ochoa. Univer -sidad Autónoma. Madrid

Los procesos de diferenciación de células den-dríticas (DCs) intratímicas humanas no han sidocaracterizados hasta la fecha, aunque trabajosa n t e r i o res de nuestro y otros grupos, han demos-trado que los precursores más inmaduros del timohumano retienen el potencial de diferenciación acélulas dendríticas y a otros linajes linfoides comocélulas T y NK. Los estudios realizados en ratónhan relevado la existencia de una única poblaciónde células dendríticas de timo, relacionada con ellinaje linfoide, que se genera a partir de un precur-sor común a células T.

En este trabajo hemos analizado las células den-dríticas del timo humano y hemos identificado unasubpoblación nueva con características mieloides.Los objetivos fundamentales de este trabajo hansido la caracterización de los procesos de difere n-ciación de este nuevo subtipo de DCs re l a c i o n a-das con el linaje mieloide, así como determinar silas DCs mieloides tienen un origen intratímico, opor el contrario, se generan en periferia y poste-

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r i o rmente migran al timo. Para ello, se han esta-blecido sistemas in vitro,de diferenciación de DCsa partir de pre c u r s o res multipotenciales CD34++de timo humano que han permitido identificar losp re c u r s o res intermediarios que intervienen en elp rocesos de diferenciación. Durante la difere n-ciación, se generan dos pre c u r s o res interm e d i a-rios CD34+/- diferentes, que han sido caracteriza-dos por su expresión diferencial de los marcadoresCD44, CD5 y CD33. Dichos pre c u r s o res fuero naislados por separado para determinar su poten-cial de diferenciación a células T, células NK,monocitos y DCs de fenotipo mieloide (DC1).

Los resultados obtenidos demuestran que losp re c u r s o res CD34+/CD44++CD5-CD33- son pre-c u r s o res de monocitos, DCI y NKs que han perd i-do la capacidad de diferenciación a células T. Porel contrario, los pre c u r s o res CD34+/-CD44+/-CD5+CD33+ son pre c u r s o res de células T y célu-las NK, desprovistas del potencial de difere n-ciación a monocitos y DC1. La re l e v a n c i afisiológica de dichos pre c u r s o res interm e d i a r i o sfue demostrada al encontrar pre c u r s o res fenotípi-camente y funcionalmente equivalentes en pre p a-raciones de timo humano.

Por tanto, este trabajo ha permitido identificary caracterizar un proceso de diferenciación intra-tímico de un nuevo subtipo de células dendríticascon características mieloides.

0-68. EL ÁCIDO MICOFENÓLICO INDUCELA GENERACIÓN DE CÉLULASDENDRÍTICAS CD14+ Y CON POBRECAPACIDAD ESTIMULATORIA

M. Lejeune, F. García, C. Martínez, M. Plana, O. Millán, J. Martorell, J. M. Miró, J. M. Gatell, T. GallartInstitut Clínic d’Infeccions i Immunologia. IDIBAPS.Hospital Clínic. Barcelona

A n t e c e d e n t e s : el ácido micofenólico (MPA) es elmetabólito activo del mofetil micofenolato, un fár-maco immunosupressor ampliamente utilizado entrasplantes alogénicos que inhibe la pro l i f e r a c i ó nlinfocitaria. Recientemente se está utilizando tam-bién en enf. autoinmunitarias así como en pacien-tes VIH+ como un medio para reprimir la re p l i c a-ción vírica, al evitar la proliferación linfocitaria.No hay datos acerca de los efectos del MPA en lascélulas dendríticas (CD) humanas.

Objetivos: analizar si el MPA tiene un efectod i recto sobre la generación y funcionalidad de lasCD humanas derivadas de monocitos (CD-DM).

Resultados: la presencia de MPA durante la gene-ración de CD-DM con GM-CSF+IL-4 no afectaa p a rentemente al inmunofenotipo y morf o l o g í ade las CD-DM. Sin embargo, al sustituir a la IL-4

con MPA los monocitos se transforman en CD decaracterísticas morfológicas similares a las obte-nidas con GM-CSF+IL-4, pero con la diferencia deque son CD14+ y que muestran menor expre s i ó nde CD40, CD80 y CD86. Además, presentan unap o b re capacidad estimulatoria de las células Tautólogas frente a antígenos proteicos solubles. Lap resencia de TNF-α durante los 3 últimos días decultivo induce una fuerte activación de las CD-DMobtenidas con GM-CSF+IL-4 lo que se traduce porun aumento de CD83 y translocación hacia lamembrana del DR intracelular, unos efectos queno tienen lugar en las CD-DM CD14+. A pesar dee x p resar CD14, el LPS tampoco tiene efectos acti-vatorios en dichas CD-DM obtenidas con GM-CSF+MPA.

Conclusiones: los datos sugieren que los efectosi n m u n o s u p re s o res del MPA pueden no dependersólo de la inhibición de la proliferación linfocita-ria, sino también de sus efectos negativos sobre lageneración y funcionalidad de las CD mieloides(FIS99/0289).

0-69. OTPIMIZACIÓN DE LA MADURACIÓNDE CÉLULAS DENDRÍTICAS Y EL PULSADOANTIGÉNICO EN CONDICIONES GMPPARA USO CLÍNICO

M. Lejeune, F. García, C. Martínez, M. J. Maleno, M. Plana, J. M. Miró, J. M. Gatell, T. GallartInstitut Clínic d’Infeccions i Immunologia. IDIBAPS.Hospital Clínic Universitari. Barcelona

Antecedentes: el grado de maduración de lascélulas dendríticas y el momento apropiado parael pulsado antigénico son puntos esenciales parael uso de las CD-DM como adyuvante de una vacu-nación terapéutica. Algunos postulan que antesdel pulsado debe inducirse la maduración de lasCD-DM con un “monocyte-condicioned medium”,lo que complica el proceso según criterios GMP.

O b j e t i v o s: analizar la capacidad de las CD-DMde presentar el antígeno a las células T según elpulsado antigénico se haga antes o después de sumaduración inducida con TNF-α o IFN-α.

Resultados: el IFN-α es un medicamento y portanto cumple las condiciones GMP. Las CD-DMobtenidas tras 7-8 días de cultivo con GM-CSF+IL-4 pueden hacerse madurar en presencia de TNF-αdurante los 3 últimos días del cultivo, lo que se tra-duce por el aumento de la expresión de CD83 y latranslocación hacia la membrana del DR intrace-l u l a r. Estas CD-DM son poco eficaces para pre s e n-tar antígenos proteicos a las células T lo que pro-bablemente indica que su excesiva maduraciónimpide una buena captura del antígeno. Por el con-trario, las CD-DM obtenidas clásicamente con GM-CSF+IL-4 después de ser pulsadas durante 24 h con

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antígenos solubles en presencia de suero autólogocon anticuerpos IgG contra el antígeno, experi-mentan un proceso de maduración, medida portranslocación de HLA-DR a la membrana, siendocapaces de inducir potentes respuestas en las célu-las T. Esta maduración y eficiencia estimuladorapuede incrementarse si se añade IFN-α durante lasúltimas 20 horas del pulsado.

Conclusiones: el pulsado antigénico de las CD-DM debe realizarse en un estado re l a t i v a m e n t ei n m a d u ro. Dicho pulsado induce su activación/maduración si se realiza en presencia de sueroautólogo con anticuerpos IgG contra el antígeno,y la adición de IFN-α en las últimas 20 h perm i t ei n c rementar dicha maduración y capacidad esti-mulatoria.

0-70. CARACTERIZACIÓN DE LAS CÉLULASFOLICULARES DENTRÍTICAS

J. M. García Pacheco, F. J. Blanco*, M. Kimatrai*, E. García Olivares*Laboratorio de Inmunología. Hospital do Meixoeiro.Vigo. *Unidad de Inmunología. Facultad de Medicina.Universidad de Granada. Granada

Las células foliculares dentríticas (FDC, f o l l i -cular dendritic cells) desempeñan una función fun-damental en la respuesta secundaria de las célulasB, sin embargo, su origen y adscripción celular esi n c i e rto. En el presente trabajo hemos purificadoFDC y estudiado su fenotipo antigénico y funcio-nes.

Las FDC fueron purificadas por adhesividaddiferencial y por su capacidad de proliferar in vitro,obteniéndose al cabo de aproximadamente dossemanas, una población con una pureza superioral 97%. Las células crecen en cultivo con una mor-fología fibroblástica durante un periodo de dos at res meses, a partir del cual, dejan de multiplicar-se y mueren. Las células mantuvieron la capacidadde unir células B y una expresión antigénica cons-tante. El fenotipo antigénico de estas células fueestudiado mediante citometría de flujo y RT- P C R ,detectando, de acuerdo a la mayor parte de losa u t o res, la expresión de antígenos del linaje B,como el CD21 y CD23; antígenos específicos deFDC, como el HJ2 y DRC-1 (CD21L); HLA-II yausencia de CD45. Sin embargo, y en disconfor-midad con lo publicado previamente, observ a m o sque nuestras células expresaban CD10, pero noCD14. Estos datos, junto con el hecho de que lasFDC sean también positivas para CD34 y STRO-1, sugiere que las FDC aisladas por nosotros seencuentran en una etapa inicial de difere n c i a c i ó ny están relacionadas con el precursor estromal demédula ósea. También encontramos que las FDCexpresan alfa-smooth muscle actin.

O-71. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DEDLEC, UN NUEVO GEN MIEMBRO DE LAFAMILIA DE LAS LECTINASDEPENDIENTES DE CALCIO QUE SEEXPRESA PREFERENCIALMENTE ENCÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DEMONOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA

I. A rce, P. Roda-Navarro, M. C. Montoya*, P.Hernanz-Falcón, E. Fernández-RuizUnidad de Biología Molecular. *Servicio de Inmu -nología. Hospital Universitario de la Princesa. Madrid

El análisis de las bases de datos de EST nos hap e rmitido la identificación de un nuevo gen quecodifica para una proteína de membrana de tipoII que hemos denominado DLEC ( d e n d r i t i c - c e l ll e c t i n ) . Esta proteína pertenece a la familia de laslectinas dependientes de calcio. La región cito-plásmica de DLEC no presenta motivos con-senso de señalización mientras que la part eextracelular presenta un único dominio de re c o-nocimiento de carbohidratos (CRD). El genDLEC se encuentra situado en el cro m o s o m a12p13.2 en la zona telomérica del complejogénico NK y presenta una estructura genómicasimilar a otras lectinas relacionadas. La expre-sión de DLEC se detecta a nivel de mRNA porN o rt h e rn Blot únicamente en células dendríticasderivadas de monocitos de sangre periférica.DLEC es un nuevo gen que codifica para una lec-tina de tipo C y se expresa pre f e rencialmente encélulas dendríticas.

O-72. ESPECIALIZACIÓN FUNCIONAL DE CD3γ Y CD3δ EN LOS PROCESOS DESELECCIÓN TÍMICA

E. Fernández, P. Delgado, B. AlarcónCentro de Biología Molecular. Universidad Autónomade Madrid. Cantoblanco. Madrid

En ratones carentes de la subunidad CD3δ d e lTCR se produce una parada de la difere n c i a c i ó ntímica en el estadio de timocitos doble positivos(DP), resultando en un efecto diferencial sobre losprocesos de selección positiva y negativa. La selec-ción positiva está totalmente bloqueada, mientrasque la selección negativa está afectada sólo marg i-nalmente. Anteriormente demostramos que en laausencia de CD3δ se produce un defecto específi-co en la activación de la ruta Ras-ERK de transmi-sión de señales. Este defecto parecía originarse poruna fosforilación defectuosa de la subunidadC D 3ζ en microdominios de membrana ricos enc o l e s t e rol. Para tratar de corregir el defecto enselección positiva, hemos cruzado los ratones defi-cientes en CD3δ con ratones transgénicos para

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v-Raf, una forma activa de un miembro de la ru t aRas-ERK. La expresión de v-Raf no re v i e rte eldefecto en selección positiva, sin embargo sí queresulta aumento de la sensibilidad a la inducciónde apoptosis promovida por inyecciones de anti-cuerpos anti-CD3.

Contrariamente a los ratones deficientes enC D 3δ, los ratones carentes de CD3γ que estamosestudiando tienen un defecto en selección negati-va mucho más intenso que en selección positiva.Aunque en estos ratones la activación de ERK estádisminuida, el efecto es menor que el de timocitosc a rentes de CD3δ. Además, la ausencia de CD3γno causa sólo un defecto en la activación de ERKsino que la actividad de las otras MAP quinasas,JNK y p38 está también disminuida en el tiempo.P a rece que el defecto en maduración tímica en laausencia de CD3γ deriva no de la baja activaciónde una ruta específica, como en la ausencia deC D 3δ, sino más bien de una disminueión genera-lizada de varias rutas de señalización.

O-73. DINÁMICA DEL COMPLEJOTCR/CD3G EN LINFOCITOS T MADUROSCD3γ-/-CD4+ vs CD8+ INMORTALIZADOSCON HERPESVIRUS SAIMIRI (HVS)

P. S. To r res, D. A. Zapata, A. Pacheco-Castro, J. R. RegueiroInmunología. Facultad de Medicina. UniversidadComplutense. Madrid

El fenómeno de internalización del complejoTCR/CD3 es un proceso utilizado por las célulaspara reducir rápidamente el nivel de expre s i ó nsuperficial, en células estimuladas tiene una doblefinalidad: por un lado, favorece el encuentro entrelas moléculas señalizadoras y el receptor y poro t ro, contribuye a la terminación de la re s p u e s t ac e l u l a r. Las secuencias señalizadoras para la inter-nalización se encuentran caracterizadas en dosmotivos: los basados en tirosina (Tyr) existentesen las subunidades CD3-γ, -δ, -ε y ζ , y los basadosen leucina (Leu) existentes en CD3-γ y -δ. Ambosmotivos jugarían un papel en la internalización delcomplejo TCR/CD3 basal y/o tras la activación dela célula T.

N u m e rosos estudios apuntan que en células noestimuladas, la internalización y el reciclaje delcomplejo TCR/CD3 depende de la subunidadC D 3γ. En respuesta a ésteres de forbol, las célulasT humanas HVS deficientes de CD3γ no modulanel TCR/CD3 superficial, mientras que, en respues-ta a anticuerpos (anti-CD3), la modulación delTCR/CD3 es menos eficiente en que las célulasc o n t rol, sin embargo, los datos de ratonesKnockout de CD3γno modulan el TCR/CD3 en res-puesta a anti-CD3. Nuestro objetivo es determ i-

nar el papel de la cadena CD3γ en la dinámica delcomplejo TCR/CD3 tras estimulación celular. Paraello se analizó en células T HVS CD4+y CD8+defi-cientes de CD3γ los procesos de intern a l i z a c i ó n(por citometría), tráfico intracelular (por micro s-copia confocal), degradación (por inmunopre c i-pitación) y re e x p resión (por citometría) del com-plejo TCR/CD3 tras la estimulación con anti-CD3.

N u e s t ros datos apuntan que tras la activacióncelular con ésteres de forbol no hay intern a l i z a-ción del complejo TCR/CD3 en células γ-. Tras laactivación con anti-CD3, primero, la intern a l i z a-ción en células γ- es menor respecto a las γ+, segun-do, el tráfico intracelular del complejo TCR/CD3internalizado está alterado en las células γ- respec-to a las γ+ , la degradación y la expresión del com-plejo TCR/CD3 tras la modulación del receptor seencuentra retrasada en γ- respecto a las γ+. Por ello,la cadena CD3 γ está implicada en la intern a l i z a-ción (vía PKC y vía CD3), en el tráfico intracelu-lar endocítico y exocítico del complejo TCR/CD3en células estimuladas con anticuerpos anti-CD3.

Este trabajo fue financiado en parte por la CAM(13/97) y la DGES (PM 98/91) y MCT (HF-1999-0029) utilizando instalaciones del Centro deTécnicas Inmunológicas de la U.C.M.

O-74. APROXIMACIÓN PARA EL ESTUDIOFUNCIONAL DE LAS VARIANTES ISO YALOTÍPICAS CODIFICADAS POR LOS LOCIDE MIP-1β

R. Colobran, P. Adreani, I. Gómez, Y. Ashhab, P. Caro, O. Domínguez, R. Pujol Borrell, M. JuanUnidad de Inmunología. Hospital Universitari GermansTrias i Pujol. Badalona, Barcelona

La CC-quimiocina MIP-1β (o CCL4) seencuentra estrechamente relacionada con un grannúmero de funciones biológicas con interés inmu-nológico (entre ellas, MIP-1β se une a CCR5, unode los correceptores del HIV).

El MIP-1β p resenta dos isoformas codificadaspor dos loci genéticos (A y B), con ciertas difere n-cias en su secuencia. Además, uno de ellos (locusB) presenta un polimorfismo poblacional quecodifica para una aloforma con probable impor-tancia funcional. El polimorfismo, que altera ellugar de corte y unión (splicing site), se traduce enla generación de una nueva proteína con 5 amino-ácidos menos que la original y que llamamos MIP-1β t runcada. Recientemente en nuestro laborato-rio hemos encontrado otra variante del locus B delM I P - 1β no relacionada con el polimorfismo des-crito anteriormente. Se trata de un nuevo tránscri-to que presenta una secuencia nucleotídica corres-pondiente a la del locus B del MIP-1β pero con unadelección completa del segundo exón. Este hecho

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p rovoca una reducción muy importante del tama-ño de la proteína, con la pérdida del motivo CCcaracterístico de las β-quimiocinas. Además, a par-tir del punto donde se produce la deleción, encon-tramos un cambio en la pauta de lectura que haceque esta proteína solamente presente los 2 prime-ros aminoácidos iguales a los del locus B del MIP-1β. Hemos denominado a esta nueva varianteMBDSP (MIP-1 locus B Derived Small Protein).

Con el fin de estudiar las diferencias funciona-les que puedan existir entre estas variantes delMIP-1β (locus A, B, forma truncada y MBDSP), lashemos producido de forma recombinante en suf o rma nativa, fusionadas con la GFP y con colasde 6-HIS y HA, a través de transfectantes estables.Con los productos sintetizados re a l i z a remos estu-dios de unión a los receptores de membrana (espe-cialmente al CCR5), unión y valoración de la capa-cidad estimulatoria y/o quimiotáctica endiferentes células diana, capacidad de unión a pro-teoglicanos y análisis de la capacidad de las varian-tes en la inhibición de la entrada de virus HIV R5.

Proyecto financiado por el FIS (99/1063).

O-75. CUANTIFICACIÓN DE LOS DOS LOCIA Y R DE LA QUIMIOCINA MIP-1B PORMEDIO DE LA GENERACIÓN DE UNESTÁNDAR INTERNO

P. Adreani Rizo, I. Gómez Melé, R. Colobrán Oriol,Y. Ashhab. F. Pelusa, R. Pujol Borrell, M. Juan iOtero.Unidad de Inmunología. Hospital Universitari GermansTrias i Pujol. Badalona, Barcelona

D e n t ro del amplio grupo de citocinas quimio-tácticas, la β-quimiocina MIP-lβ, se encuentraimplicada en un gran número de funciones coninterés inmunológico; entre las cuales pudiéra-mos destacar el efecto quimioatrayente que ejer-ce sobre monocitos y linfocitos T CD4+. Por otrolado, trabajos previos realizados en nuestro labo-ratorio, nos han permitido demostrar que tantola quimiocina MIP-lα como la MIP-lβ se encuen-tran incrementadas en enfermedades autoinmu-nes. Habiendo descrito que esta quimiocina escodificada por 2 loci (a los cuales nos re f e r i re-mos como locus A y B) con ciertas diferencias enla secuencia, nos plantearemos estudiar la expre-sión de estas dos variantes mediante una RT-PCR. Debido a que es posible distinguir entreambos loci de MIP-lβ, mediante la digestiónenzimática con la enzima de restricción MspI,hemos diseñado una técnica de RT-AFLP semi-cuantitativa en relación con un Estándar Intern o(de mayor peso molecular) competitivo con elcDNA nativo, que permite evaluar la expre s i ó n

del mRNA. Para generar el Estándar Intern ocompetitivo, hemos escogido una secuencia norelacionada (insulina) que se amplifica con unmayor peso molecular y que a su vez presenta unpunto de corte para la endonucleasa Mspl. Alemplear oligonucleótidos híbridos, obtuvimosun producto de mayor peso molecular que seamplificaba con los cebadores del MIP-lβ y sedigería con MspI. Este amplímero crecido ysecuenciado post-clonación en un vector plas-mídico, se cuantifica al incluirlo en la re a c c i ó nde RT-AFLP de las muestras. Este EstándarI n t e rno, nos ha permitido conocer de una mane-ra rápida y eficaz la cantidad de transcrito pro-ducido tanto por el locus A como por el locus Bdel MIP-1β.

O-76. ANÁLISIS FENOTÍPICO Y PRODUCCIÓN DE CITOQUINAS ENCULTIVOS DE LA LÍNEA CACO-2:AUMENTO EN LA PRODUCCIÓN DERANTES Y EN LA TRANSCRIPCIÓN DE IL-2,TRAS ESTIMULACIÓN CON IL-1β

C. Rodríguez Juana, M. Pérez Blasa, A.F. Huerta*,A. P. Valeria, N. Aguilera*, M. J. Recio*, A. ArnaizVillena*, S. Ferré López**, A. Corell**, J. M. MartínVilla**Inmunología. Facultad Medicina. Universidad Com -plutense de Madrid. **Inmunología. Hospital 12 de Oc -tubre. Madrid

Caco-2 es una línea tumoral de origen colóni-co que cuando se cultiva muestra característicasfenotípicas de enterocito y puede ser un modeloadecuado para llevar a cabo experimentos que nosp e rmitan estudiar su función en respuestas inmu-nológicas locales, y su implicación en situacionespatológicas. Parece razonable obtener un análisisinmunológico de la línea y comparar los datosobtenidos con enterocitos.

Caco-2 se cultivó hasta su diferenciación y seanalizó la presencia de diferentes marc a d o res des u p e rficie, y la producción de citoquinas por PCRy ELISA tras estimularlas con IL-1β e IL-2.

El análisis de citometría reveló la presencia dem a rc a d o res leucocitarios presentes también ene n t e rocitos humanos: proteasas de superf i c i e(CD10, CD13 y CD26), marcadores de células pre-sentadoras de antígeno (CD13, CD14, CD35 yCD63) integrinas (CD18 y CD61), marc a d o re sepiteliales/endoteliales (CD21, CD31, CD47 yCD59) y CD25 y CD28. No se detectó la pre s e n-cia de moléculas HLA-II en células en reposo o esti-muladas con γ-IFN. Además, cultivos llevados acabo con linfocitos alogénicos, re v e l a ron que la

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línea celular era incapaz de inducir su pro l i f e r a-ción. El estudio de citoquinas mostró un aumentoen la síntesis de RANTES y en la trasncripción deIL-2, tras estimulación con IL1β-. CCR1 se expre-sa de forma constitutiva.

O-77. ESTUDIO DE LA ESPECIFICIDADANTIGÉNICA DE LOS LINFOCITOS BGENERADOS EN FOLÍCULOS LINFOIDESINTRATIROIDEOS

M. P. Armengol, M. Juan, C. B. Cardoso-Schmidt,A. Lucas*, T. Gallart**, R. Pujol BorrellUnitat d’Immunologia i *Endocrinologia. HospitalUniversitat Germans Trias i Pujol. Badalona. **Unitatd’Immunologia Hospital Clínic de Barcelona

El papel que desempeñan los folículos linfoi-des (FLs) intratiroideos en la generación de célu-las B autoreactivas en el tejido diana no se cono-ce bien ni la contribución relativa de éstas en lageneración de autoanticuerpos circ u l a n t e s .Datos de nuestro laboratorio (elevada expre s i ó nde mensaje para RAG1 y RAG2) sugieren que lascélulas B intratiroidales adquirirían caracterís-ticas de respuesta dirigida por antígeno en estosFLs por hipermutación somática y revisión delre c e p t o r. El objetivo es analizar la especificidadde las células B intratiroidales contra autoantí-genos caracterizados (Tg, TPO, TSHR) y otro sno descritos. La especificidad, número y tipo decélula se ha estudiado usando antígenos biotini-lados sobre secciones de tiroides de Graves yHashimoto. Se han observado numerosas célu-las pequeñas con distribución similar a la de loslinfocitos B y con un marcaje de membrana ycélulas grandes con una intensa tinción citoplas-mática distribuidas tanto en los FLs como en elinfiltrado difuso que re c u e rdan las células plas-máticas. La mitad de los FLs contienen hasta un30% de células Tg+ o TPO+ mientras que algu-nos son negativos. La mayoría son IgG+ aunqueuna pequeña pro p o rción son IgM+. Resultadoss i m i l a res se han obtenido de linfocitos B intrati-roidales aislados mediante citometría de flujo.Además se han generado heterohíbridos porfusión de linfocitos B intratiroideos con la líneaF3B6 obteniéndose 93 líneas que mantienen sucapacidad secretora de Igs y su reactividad con-tra Tg y TPO y 140 clones. Del cribaje por secre-ción de Igs (ELISA), reactividad específica detejido (d o t - b l o t s o b re extractos tisulares), re a c t i-vidad específica de antígeno (ELISA y IFL sobresecciones de tiroides) se han encontrado 8/30 y14/30 clones que reconocen Tg y TPO re s p e c t i-vamente. Los resultados parecen indicar que enlos FLs del tiroides tiene lugar la generación de

células B específicas de antígenos tiroideos diri-gida por antígeno, contribuyendo activamente ala patogenia de la enferm e d a d .

O-78. ¿CÓMO PARTICIPAN LASQUIMIOCINAS EN LA FORMACIÓN DEFOLÍCULOS LINFOIDES EN TIROIDESAUTOINMUNES?

M. P. Armengol, M. Plana*, T. Gallart*, R. Pujol-Borrell, M. JuanUnidad de Inmunología. Hospital Universitari GermansTrias i Pujol. Badalona. *Unidad de Inmunología.Hospital Clínic de Barcelona

La organización y mantenimiento de folículoslinfoides secundarios viene regulada, entre otro s ,por un patrón de quimiocinas determinado. Paraanalizar cómo las quimiocinas estructuran la re s-puesta autoinmune en el órgano diana, hemoscomparado mediante RT-PCR en tiempo real lae x p resión de: S t romal cell-Derived Factor 1 a( S D F 1α o CXCL12), S e c o n d a ry Lymphoid tissueC h e m o k i n e (SLC o CCL21) y B - c e l l - a t t r a c t i n gchemokine 1 (BCA-1 o CXCL13). Como muestrasse tomaron 2 tiroides de Hashimoto (HT), 7G r a v e s - B a s e d o w (GD) con centros germ i n a l e s(CGs), 4 GD sin CGs, 7 bocios multinodulare s(MNG) y dos glándulas de donantes sanos. Lacuantificación se ha realizado tomando comore f e rencia el nivel de expresión de las citadas qui-miocinas en amígdala palatina. Asimismo, se haestudiado el patrón de distribución de las tre squimiocinas en las glándulas mediante IFI y desus re c e p t o res (CXCR4 y CXCR5). Los re s u l t a-dos demuestran que SDF1α está presente entodas las muestras, aunque su nivel de expre s i ó ngénica está significativamente disminuido en GDsin CGs y en las muestras de controles. A nivelp roteico la IFI detecta SDF1α tanto en células deCG como en algunos tirocitos. SLC está incre-mentado en HTs y GD con CG y ausente en algu-nos tejidos controles. Por su distribución seencuentra restringida en células de endotelialesque constituyen las HEVs polarizándose intralu-minalmente. BCL se encuentra únicamentee x p resada en HTs y GD con CGs y sigue unpatrón de distribución similar al de las célulasdendríticas foliculares. CXCR4 (receptor deSDF1) está presente en los linfocitos que ro d e a nlos FLs mientras que está ausente en infiltradosdifusos. La mayoría de células CXCR5+ (re c e p-tor de BCA) están situadas en la zona del manto.La expresión diferencial y la compart i m e n t a l i z a-ción tisular de las quimiocinas y de sus re c e p-t o res sugiere la funcionalidad de los FLs intrati-ro i d a l e s .

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SIDA

O-79. PRODUCCIÓN DE CITOQUINASINTRACELULARES EN PACIENTES VIH+TRAS ESTÍMULO ANTIGÉNICO

L. Molero, A. Jiménez, P. Llorente, A. M. Jiménez,C. Serrano, M. de Górgolas*, M. Fernández-Guerrero*, R. GarcíaDepartamentos de Inmunología y *Enfermedades In -fecciosas. Fundación Jiménez Díaz. Madrid

O b j e t i v o : estudio de la producción de citocinasi n t r a c e l u l a res IL-2 e IFN-γ en linfocitos de pacien-tes VIH+ con diferentes estímulos: un estímulo ines-pecífico por forbol (PDBu) + ionóforo A23187, yestímulo antígeno específico por la proteína gag deV I H - 1 .

Material y métodos: 10 pacientes VIH+ (6 enestadio C y 4 en estadio A), todos con 12 meses detratamiento con terapia antirre t roviral de alta efi-cacia durante 1 año, y con cargas virales menore sde 3 log. en el momento del estudio. Se utilizaro n4 controles sanos VIH-. Se cultivaron 1 x 106 l i n-focitos en presencia de brefeldina A, con PDBu +A23187 o con el antígeno gag de VIH-1 + anti-CD28. Después de 4 horas las células se marc a ro ncon anticuerpos monoclonales anti-IL-2-FITC yanti IFN-γ-PE y se analizan en un citómetro de flu-jo Epics-Elite.

R e s u l t a d o s : en los pacientes VIH+ el porc e n t a j ede linfocitos pro d u c t o res de IL-2 (2,7 ± 1,8%) y deIFN-γ (2,2 ± 2,4%) bajo estímulo mitogénico es sig-nificativamente inferior al de los sujetos contro l e s(7,2 ± 6,1% y 6,5 ± 0,5%). No existen difere n c i a se n t re los grupos clínicos A y C, cuando se trata desíntesis de intracitocinas por estímulo específicocon gag-VIH (A: IL-2 1,3 ± 1,4%, I F N -γ 1,5 ± 1,4%.G rupo C: IL-2 1,8 ± 3% y I F N -γ 1,5 ± 2,1%) ni porestímulo forbol + ionóforo (A: IL-2 1,2 ± 1,2%, IFN-γ 2 ± 0,8%. Grupo C: IL-2 3,6 ± 1,5% y I F N -γ 2,3 ±3,2 %.

O.80. -QUIMIOCINAS Y SU RELACIÓN CONLA RESISTENCIA A LA INFECCIÓN POR VIHY SU PROGRESIÓN

C. Martínez, A. Soriano, E. Palou, M. Plana, F. Garc í a ,M. J. Maleno, A. García, J. I. Aróstegui, M. Leujeune,J. M. Miró, J. del Romero*, C. Rodríguez*, J. I.L o renzo**, J. M. Gatell, T. Gallart.Institut Clínic d’Infeccions i Immunologia. IDIBAPS.Hospital Clínic. Barcelona. *Centro Sandoval. Madrid.**Hospital La Fe. Valencia

A n t e c e d e n t e s : el hecho de que las β- q u i m i o c i n a sM I P - 1β, RANTES y MIP-1α inhiban la entrada de

las cepas VIH-1 NSI (R5) en las células diana al blo-quear CCR5, hace pensar que desempeñen un papelp rotectivo contra la infección, y la pro g resión de lam i s m a .

Objetivo: analizar los niveles plasmáticos dedichas quimiocinas y su posible relación con laresistencia a la infección y su pro g resión en lossiguientes grupos de individuos: expuestos noinfectados (ENI, n = 55), 55 individuos VHI+ nop ro g re s o res, (LTNP), 52 individuos VIH+ pro g re-s o res típicos (PT), y 70 donantes sanos como (GC).Ningún individuo era homocigoto para la delecciónCCR5∆32.

R e s u l t a d o s : los ENI presentaban niveles plasmá-ticos de MIP-1β significativamente superiore s(mediana = 401,4 pg/ml) a los del GC (mediana =97,8 pg/ml) (p <0,001), mientras que los niveles enLTNP y PT no diferían de los del GC (p >0,05). Losniveles de RANTES en ENI, LTNP y en PT eran infe-r i o res (mediana = 1.398,7; 1.468,5 y 1.269,0 pg/ml,respectivamente) a los del GC (mediana = 1601,4pg/ml), siendo las diferencias sólo significativaspara los PT (p <0,005) y los ENI (p = 0,004). Losindividuos VIH+, part i c u l a rmente los PT, pre s e n t a-ban niveles muy elevados de MIP-1α (medianas =LTNP 92,5 pg/ml; PT 923,4 pg/ml) respecto al GCy los ENI (medianas = 24,4 y 22,0 pg/ml, re s p e c t i-vamente)(p <0,001). No hubo diferencias signifi-cativas entre los distintos grupos respecto a la pro-p o rción de linfocitos T CD4+ que expre s a b a nC C R 5 .

Conclusiones: los datos indican que niveles ele-vados de MIP-1β se asocian con resistencia a lainfección, y sugieren que niveles muy aumentadosde MIP-1α podrían relacionarse con la pro g re s i ó ny/o activación linfocitaria. (FIS:99/0289).

O-81. AUMENTO DE LA EXPRESIÓN DE HLA-G EN MONOCITOS Y LINFOCITOSDE INDIVIDUOS HIV-1+

J. M. Lozano, R. González, J. M. Kindelán, G. Dueñas,R. Solana, R. Tarazona, I. Molina, M. Santamaría, N. Ballesteros, E. Vidal, R. Caballos, J. PeñaServicio de Inmunología y Unidad de Infecciosos,Hospital Reina Sofía, Universidad de Córdoba

En algunos casos el virus HIV trata de pro t e g e ra las células en donde se replica modificando lae x p resión de moléculas de histocompatibilidadclase I (HLA-I). Se ha publicado que el descenso dee x p resión de moléculas HLA protege a las célulasinfectadas por HIV de las células NK y CTL. Hemosestudiado la expresión de HLA-G en linfocitos ymonocitos de individuos HIV+. Se sabe que la molé-cula HLA-G tiene como función básica la de indu-cir tolerancia de la madre frente al feto y nuestroobjetivo ha sido ver si en la infección HIV-1, esta

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molécula puede desempañar alguna función pro-tectora del virus HIV frente al sistema inmune delhuésped. La expresión de HLA-G se ha medido pordoble fluorescencia utilizando anti HLA-G: MEM-G/9 y 87G.

Los resultados encontrados indican que lae x p resión de HLA-G aumenta en la superficie demonocitos y linfocitos T de individuos con infec-ción HIV-1.

La mayoría de los monocitos (92,9 ± 1,7%)obtenidos de individuos HIV-1+ expresan HLA-G,mientras sólo una pro p o rción muy baja de mono-citos de los individuos (14,2 ± 4,3%) sanos expre-san esta molécula. Cuando los linfocitos T se estu-d i a ron en individuos HIV- 1+, encontramos que el30% de ellos expresaban HLA-G, que en los indi-viduos sanos sólo expresó el 1%.También estudia-mos el mRNA de la molécula HLA-G en linfocitosT y monocitos. Se presentan estos resultados y sediscute la función del aumento HLA-G en la infec-ción HIV.

O-82. RESPUESTA INMUNE DE LINFOCITOST CITOTÓXICOS FRENTE A LA GLICO-PROTEÍNA DE LA ENVUELTA DE HIV-1

D. López, Y. Samino, M. del Val LatorreInstituto de Salud Carlos III. Madrid

La respuesta de CTL en ratones BALB/c frente ala cepa IIIB de HIV-1 está dirigida contra un epí-topo situado en el tercer dominio hipervariable dela glicoproteína de la envuelta, el cual es pre s e n t a-do en asociación al alelo Dd de MHC de clase I. Elnúcleo mínimo necesario para el re c o n o c i m i e n t opor CTL es el péptido 320-327, pero los de 9 y 10aminoácidos son más efectivos en generar re s-puesta. Este epítopo es presentado por diversasmoléculas de MHC de clase I tanto murinas, comohumanas.

Se obtuvo una línea de linfocitos hetero g é n e acapaz de reconocer el epítopo de env cuando esp resentado por los alelos Dd y Ld de clase I. A par-tir de ésta, y de forma espontánea, se obtuviero nsublíneas de CTL, cada una de las cuales re c o n o c eel epítopo de env en asociación a ambas molécu-las de forma independiente. Estos datos indican laexistencia de dos poblaciones de CTL, cada unade ellas con un TCR distinto, capaz de re c o n o c e rcada uno de los alelos por separado y de form asimilar, descartándose una respuesta cruzada.

La posterior caracterización molecular del epí-topo mostró la existencia de los péptidos de 9 y 10aminoácidos asociados, ambos, a los alelos Ld y Dd

de clase I en cantidades equivalentes en la célulainfectada. Adicionalmente, se detecta la pre s e n c i ade un péptido de longitud mayor en aquellas célu-las que poseen el alelo Ld de clase I.

En resumen, la respuesta generada frente a lag l i c o p roteína de la envuelta viene mediada porla presencia de varios péptidos antigénicos, loscuales están a su vez unidos a los dos alelos delhaplotipo H-2d analizados. Esta diversidadexcepcional de complejos péptido/MHC-I con-tribuiría a generar una respuesta T con unamayor diversidad de TCR, aumentando la posi-bilidad de controlar la infección viral por el sis-tema inmune.

O-83. LOS MARCADORES CELULARESCD4+CD38+DR+ Y CD8+CD38+ PREDICENCON MAYOR PRECISIÓN LA PROGRESIÓN A SIDA

J. Carbone, J. Gil, J. M. Benito, J. Bartolomé, J. Navarro, M.ª A. Muñoz-Fernández, E. Fernández-C ru zServicio de Inmunología. Hospital General Univer -sitario Gregorio Marañón. Madrid

Analizamos la asociación entre subpoblacionesfuncionales de linfocitos TCD4 y CD8, marc a d o-res solubles de activación, recuento de CD4 y vire-mia VIH plasmática, y el riesgo de pro g resión aSIDA. Realizamos un estudio prospectivo de segui-miento (media = 37 + 13 meses) de la evolución dela infección por el VIH en una cohorte de 85pacientes ADVP. Las subpoblaciones de linfocitosTCD4 y CD8 se cuantificaron mediante citometríade flujo de tres colores. La viremia VIH se deter-minó mediante técnica de PCR (U l t r a s e n s i t i v eAmplicor HIV Te s t). Los marc a d o res solublesincluidos fueron β-2 microglobulina, neopterina(radioinmunoanálisis) e IgA sérica (nefelometríacinética). Mediante análisis de re g resión bivarian-te de Cox ajustando por cifras de CD4 encontra-mos que incrementos en los porcentajes de célu-las T CD4+CD38+DR+ [riesgo relativo (RR), 3,82;P= 0,03], CD4+CD45RO+ (RR, 4,18; P = 0,03) yCD8+CD38+ (RR, 7,18; P= 0,01) mostraron valorp ronóstico adicional de pro g resión a SIDA. Tr a sajuste por viremia VIH, las subpoblacionesCD4+CD38+DR+ (RR, 4,36; P <0,02],CD4+CD45RO+DR+ (RR, 3,35; P = 0,04), CD8+CD38+ (RR, 5,10; P = 0,03) y CD8+ CD45RO+CD38+ (RR, 3,18; P = 0,02) retenían valor pronós-tico significativo. Ajustando por marc a d o res solu-bles de activación encontramos que incre m e n t o sen los porcentajes de células T CD4+CD38+DR+y CD8+CD38+ mostraron valor pronóstico adicio-nal de pro g resión a SIDA. El fuerte valor pre d i c t i-vo asociado a la determinación de linfocitos TCD4+CD38+DR+ y CD8+CD38+ sugiere que estosm a rc a d o res en combinación con el nivel de vire-mia VIH son útiles para identificar más pre c i s a-mente el riesgo de progresión a SIDA.

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O-84. INCREMENTO DE LAS RESPUESTAS TCOOPERADORA Y CITOTÓXICA FRENTE AL VIH-1 EN PACIENTES TRATADOS CONUNA VACUNA TERAPÉUTICA: RESULTADOSA LOS 36 MESES

J. Navarro, M. L. Abad, L. Díaz, C. Cantó, S. Resino,J. L. Jiménez, J.Carbone, M. A. Muñoz-Fernández,E. Fernández-Cruz* (STIR -2102)Servicio de Inmunología. Hospital Gregorio Marañón.Madrid

Hemos analizado las respuestas inmunológi-cas frente al VIH-1 en 54 pacientes VIH+ inclui-dos un ensayo clínico de REMUNE (un inmunó-geno VIH-1 sin gp120) v s I FA administrados cona n t i rre t rovirales. Los resultados fueron analiza-dos de forma blindada. Se observó una significa-tiva y sostenida respuesta linfoproliferativa (LPR)a antígenos HZ321 del VIH-1 (p <0,005) en el gru-po de REMUNE. La producción de IFN-γ y B-qui-miocinas se encontraba también elevada enREMUNE. Se encontró una fuerte corre l a c i ó ne n t re LPR a antígenos HZ321 del VIH (Subtipo A)y LPR a p24 (r = 0,86) y al antígeno BaL (SubtipoB) del VIH-1 (r = 0,81). Observamos en el mes 36un incremento de los linfocitos T CD4 y CD8 dememoria y T CD8+ efectores en REMUNE. Lacitotoxicidad frente a Gag/pol se incrementó enREMUNE (n = 13) comparado con IFA (n = 9),tanto al cuantificar la frecuencia de pre c u r s o re scomo las unidades líticas (CTLp: 2,294 vs 1 6 8cel/106 CMSP; 20,3 v s 1,9 UL /106 CMSP).O b s e rvamos en REMUNE un incremento menosacentuado de la citotoxicidad a env (CTLp: 744v s 100 cel/106 CMSP; 8,6 vs 1,8 UL/106 CMSP).

Encontramos correlación entre LPR a antíge-nos del VIH y citotoxicidad frente a Gag/pol.N u e s t ros resultados muestran que una vacunaterapéutica puede inducir respuestas coopera-doras y citotóxicas específicas de larga duración,además de inducir reactividad cruzada entre dife-rentes subtipos del VIH-1.

O-85. PAPEL DEL ÓXIDO NÍTRICO SOBRELA REPLICACIÓN DEL VIH-1 EN CÉLULAS T

J. L. Jiménez, S. Álvarez, J. González-Nicolás, M. Fresno*, M. A. Muñoz-FernándezInmunología. Hospital Gregorio Marañón. *CBM.Universidad Autónoma de Madrid

En cultivos de CMSP, infectadas in vitro por dis-tintas cepas del VIH-1 y activadas con mitógenos,la adición de donadores de óxido nítrico (NO) pro-dujo un aumento significativo en la re p l i c a c i ó nviral, no asociándose este efecto con cambios enla proliferación celular. Este efecto fue observ a d o

sólo con cepas de VIH-1 T-trópicas X4 o X4R5 perono con virus R5.

Por otro lado, la replicación del VIH-1 se inhi-bió parcialmente en cultivos estimulados conmitógenos y tratados con inhibidores específicosde la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). Losd o n a d o res de NO, también aumentaron la infec-ción de líneas T humanas, Jurkat y MT-2. Se obser-vó, también que el NO produce un aumento de lareplicación del VIH-1 en células T humanas noactivadas y transfectadas con un plásmido quecodifica para el genoma entero del VIH-1 y poste-r i o rmente activadas con ésteres de phorbol mási o n ó f o ro de calcio. Así, en estos cultivos losd o n a d o res de NO potenciaron la replicación delVIH-1 de forma dosis-dependiente, de modo simi-lar a una estimulación por TNF-α#61537. Ademásla replicación del VIH-1 inducía la transcripciónde iNOS y TNF-α tanto en células T como en líne-as celulares T.

Es interesante destacar que los donadores deNO también estimularon la transcripción del LTR-viral mientras que inhibidores de iNOS bloquea-ron parcialmente la transcripción del LTR induci-da por TNF-α. Por lo tanto, nuestros re s u l t a d o ss u g i e ren que el NO está implicado en la re p l i c a-ción del VIH-1, especialmente en la inducida porTNF-α.

O-86. A NOVEL POLYMORPHISM IN THE 5’ UNTRANSLATED REGION (5’URT) OFCD28 GEN IS ASSOCIATED WITH RESISTANCE TO HIV-1 INFECTION

A. Soriano, C. Martínez, M. Plana, F. García, J. Aróstegui, E. Palou, F. Lozano, S. Morillas, M. J.Maleno, A. García, M. Leujeune, J. M. Miró, J. delRomero, C. Rodríguez*, A. Barrasa*, J. I. Lorenzo**,J. M. Gatell, T. GallartInstitut Clínic d’Infeccions i Immunologia. IDIBAPS.Hospital Clínic, Barcelona. *Centro Médico Sandoval.Madrid. **Coagulopatías Congénitas. Hospital la Fe.Valencia

B a c k g ro u n d : CD28 plays an important role ind e t e rmining the T-cell immune responses and isalso specifically involved in down-regulating thee x p ression of CCR5, the main co-receptor of HIV-1 NSI (R5) strains, which transmit the infection.

O b j e c t i v e : to investigate the existence of gene-tic variants of CD28 that might be related to re s i s-tance/susceptibility to HIV infection and/or pro-gression to AIDS.

Material and methods: PCR-amplified 559bp 5’-end of CD28 5’UTR was analysed by S i n g l e - S t r a n dConformation-Polymorphism (SSCP) as a screeningmethod in 296 individuals: 77 healthy contro l s(HC), 57 uninfected highly exposed to HIV- 1

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(EU), and 160 HIV-1+ patients: 82 long-term nonp ro g ressors (LTNP) and 78 typical pro g re s s o r s(TP). Sequencing was also performed.

R e s u l t s : two main SSCP patterns, designated aand b were identified. The pattern a corre s p o n d sto a homozygous state of the wild type (wt) allele(GenBank sequence). The pattern b corre s p o n d sto a heterozygous combination of the wt allele witha new allele resulting from a 5bp repeat (CTTTT)deletion at the 5’ end region. There were no diff e-rences in the frequency of pattern b between HC(31%), LTNP (24%) and TP (28.5%), while it wassignificantly decreased (p <0.05) in EU (13.5%).

C o n c l u s i o n : data demonstrate the existence of anon previously re p o rted genetic variant of CD28consisting of a 5bp repeat deletion at the 5’ end of5’UTR, which is associated with resistance to HIV-1 infection. The functional consequences of thisdeletion need further investigations (Support e dby Grant FIS: 99/0289).

O-87. POLIMORFISMO SDF1-3’A Y NIVELESPLASMÁTICOS DE SDF-1 Y RESISTENCIA ALA INFECCIÓN POR VIH Y SU PROGRESIÓN

C. Martínez, A. Soriano, E. Palou, M. Plana, F. Garc í a ,M. J. Maleno, A. García, J. I. Aróstegui, M. Leujeune,J. M. Miró, J. del Romero*, C. Rodríguez*, A. Barrasa*,J. I. Lorenzo**, J. M. Gatell, T GallartInstitut Clínic d’Infeccions i Immunología. IDIBAPS.Hospital Clinic. Barcelona. *Centro Sandoval. Madrid.**Hospital La Fe. Valencia

Antecedentes: en población americana (USA), lah e t e rocigocia del polimorfismo SDF1-3’A se hallói n c rementada en homosexuales expuestos noinfectados, sugiriéndose un efecto protectivo con-tra la infección, mientras que la homocigocia seencontró asociada con pro g resión lenta en VIH+,c reyéndose que tal vez implicara una mayor pro-ducción de SDF1 que bloqueara la infección porcepas X4.

O b j e t i v o s: analizar la frecuencia de la mutaciónSDF1-3’A y su posible relación con los niveles plas-máticos de SDF-1 en una cohorte de expuestos noinfectados (ENI, n = 66; 31 por vía sexual; 35 porhemoderivados) en comparación con un grupo dec o n t roles (GC,n = 90) y con pacientes infectadosno pro g re s o res (LT N P, n = 67) y pro g re s o res típi-cos (PT, n = 57). Ningún individuo era homocigo-to para CCR5∆32.

R e s u l t a d o s : la frecuencia de homocigotos fue6,8% en GC, 2,4% en LT N P, 9% en PT y 6,4% enENI, y la de heterocigotos estaba incrementada (p = 0,05) en los pacientes VIH+ (51,3%) y dismi-nuida (p = 0,05) en los ENI (24,1%) respecto al GC(37,5%). Los niveles de SDF-1 estaban incre m e n-tados en LTNP y en PT sin infecciones oport u n i s-

tas (IO) (p <0,001), así como en los ENI por víasexual (p <0,001), mientras que en los PT con IOdichos niveles no diferían del GC. Los niveles deSDF1 en los homocigotos eran inferiores a los delos heterocigotos y no mutados (p = 0,04). Losniveles de SDF-1 plasmáticos se re l a c i o n a b a ninversamente con la expresión de CXCR4 en lin-focitos T CD4+ y CD8+.

C o n c l u s i o n e s : la homocigocia SDF1-3’A se re l a-ciona con niveles plasmáticos bajos de SDF-1 y nose asocia con pro g resión lenta a SIDA, y la hete-rocigocia tampoco se asocia con resistencia a lainfección. Niveles altos de SDF-1 plasmático seasocian con resistencia a la infección por vía sexualy pueden proteger frente a la pro g resión (FIS:99/0289).

TRASPLANTES

O-88. NITRIC OXIDE-PRODUCING CD11B +LY-6G (GR-1) + CD31 (ER-MP12) + CELLS INTHE SPLEEN OF CYCLOPHOSPHAMIDE-TREATED MICE

I. Ángulo Barturen, M. A. Muñoz-Fernández*, M. FresnoCentro de Biología Molecular, CSIC-UAM, *Inmuno -logía. Hospital Gregorio Marañon. Madrid

During re c o v e ry from intensive chemotherapywith cyclophosphamide (CTX), mice suffer a seve-re but transitory impairment in spleen cell (SC)p roliferation to T cell mitogens (Con A or anti-CD3 plus IL-2). Although CTX treatment reducedspleen T cell cellularity this cannot fully accountfor T cell unresponsiveness. The results showedthat CTX induces the colonization of spleen by ani m m a t u re myeloid CD11b+Ly-6G+CD31+ popu-lation. Its presence closely correlated with themaximum inhibition of proliferation of T cells.Moreover, this suppressive activity was dependenton NO production in cultures since: a) higheramounts of nitric oxide (NO) and inducible nitricoxide synthase (iNOS) mRNA were produced inCTX-SC than in control splenocyte cultures (SC),and b) NOS inhibitors greatly improved the pro l i-feration of T lymphocytes. NO production andsuppressive activity were also dependent on endo-genous IFN-g production since anti-IFN-γ a b ro-gated both effects. Finally, iNOS protein expre s-sion was restricted to a heterogeneous populationof CD31+ cells of which CD11b+Ly-6G+ werere q u i red to suppress T cell proliferation. Theseresults indicated that CTX might also cause immu-n o s u p p ression by a mechanism involving the pre-sence of immature myeloid cells with suppre s s o r

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activity. This may have implications in clinical pra-xis since inappropriate immunotherapies inpatients treated with intensive chemotherapycould lead to deleterious T cell responses.

O-89. CÉLULAS T CD4 MURINAS SE DIFERENCIAN EN UN XENOINJERTO DE TIMO PORCINO Y SOBREVIVEN EN LAPERIFERIA EN PRESENCIA DE UNCOMPLEJO DE HISTOCOMPATIBILIDADDISTINTO

J. I. Rodríguez-Barbosa, Y. Zhao, G. Zhao, S. Wang,D. H. Sachs, M. Sykes Bone Marrow Transplantation Section. TransplantationBiology Research Center. Massachusetts GeneralHospital/Harvard Medical School. Boston

P ropósito: n u e s t ro laboratorio ha demostradoque el injerto de timo fetal porcino (FPTHY) enratones inmunocompetentes tratados con un régi-men no mieloablativo de acondicionamiento, per-mite inducir tolerancia a xenoinjertos. Numerososg rupos han postulado recientemente que las célu-las T seleccionadas positivamente en un MHC,necesitan interaccionar con el mismo MHC en laperiferia para poder sobre v i v i r. El objetivo den u e s t ro trabajo fue estudiar la supervivencia peri-férica de células T CD4 murinas seleccionadas enun MHC xenogénico y compararla con células TCD4 seleccionadas en un MHC singénico.

Métodos: se re a l i z a ron injertos de FPTHY yNMTHY debajo de la cápsula renal de ratones B6de clase II WT (cepa salvaje) y de clase II KO (knoc-kout). A las 13 semanas después del trasplante, unavez que se observaba la reconstitución del com-p a rtimento de células T en la periferia, se eliminóel riñón que contenía el injerto tímico en la mitadde los ratones de cada grupo y la otra mitad se dejósin nefrectomizar como controles del experimen-to. Periódicamente después de la nefrectomía ydurante 15 semanas, los ratones se sangraron paraestudiar la cinética de decaimiento del %CD4+PBL (linfocitos de sangre periférica) y de célulasT CD4 naive.

Resultados: ratones de clase II WT y de clase II KOi n j e rtados con FPTHY o NMTHY reconstituían elc o m p a rtimento de células T CD4 en la periferia conuna eficiencia similar. Solamente a las 15 semanasdespués de la nefrectomia fue posible detectar uni n c remento estadísticamente significativo de la ciné-tica de decaimiento de células T CD4 en ratonesn e f rectomizados de clase II KO con respecto a losratones de clase II WT controles (p <0,05). Sine m b a rgo, el decaimiento del % CD4+ PBL y célulasT CD4 naive (CD4+ CD 44l o w) después de la nefre c-tomía era gradual y similar en ratones de clases IIWT injertados con FPTHY o NMTHY.

Conclusión: la expresión del mismo MHC a nivelperiférico que aquel donde las células T han sidoseleccionadas no juega un papel crítico en la super-vivencia a largo plazo de las células T CD4.

O-90. MODULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DERECEPTORES DE MONOCITOS/MACRÓFAGOS PORCINOS INDUCIDA PORCITOCINAS

B. Álvarez, S. Chamorro, C. Revilla M. P. Rodríguez-C a r reño, F. Alonso, A. Ezquerra, J. DomínguezDepartamento de Mejora Genética y Biotecnología.INIA. Madrid

Los macrófagos muestran una gran hetero g e n e i-dad en morfología y fenotipo. Las citocinas juntocon otros factores tisulares locales contribuyen engran parte a generar esta heterogeneidad. El objeti-vo de este estudio ha sido analizar en el modelo por-cino el efecto de diversas citocinas sobre la expre s i ó nde CD163, SWC9 y otros re c e p t o res reconocidos porlos Acmo BA4B12, BA1H1, BA1H8 y BA2H8, cone x p resión restringida a células del sistema mononu-c l e a r-fagocítico. La expresión de CD163 y SWC9,m a rc a d o res previamente asociados con un fenotipom a d u ro, se incrementó tras el tratamiento de losmonocitos con IL-10 recombinante porcina (rpIL-10), y cuando se añadió suero de cerdo al medio decultivo. Ambos tratamientos también indujeron unaumento de la expresión de los antígenos BA1H1,BA1H8 y BA2H8, mientras que disminuyeron la delBA4B12. En los monocitos tratados con rpIL-4,r p I F N -α y rpIFN-γ se observó una reducción de lae x p resión de CD163. La rp IL-4 y el rpIFN-α t a m-bién ejerc i e ron un efecto negativo sobre la expre s i ó nde BA1H1 y BA4B12 respectivamente; en cambioambas citocinas aumentaron la expresión de BA1H8.No se observó ningún efecto del TNF-α s o b re lae x p resión de estos marc a d o res. Los resultados obte-nidos reflejan la regulación de la expresión de losre c e p t o res analizados por señales derivadas dem e d i a d o res pro- y anti-inflamatorios.

O-91. LA XENORREACTIVIDAD DE CÉLULAS T GAMMADELTA ESTÁMEDIADA POR LA RUTA DE LAPERFORINA/GRANZIMA B

J. Yélamos López, M. Rodríguez-Gago, A. deH e redia, P. Ramírez, P. Parrilla, P. Aparicio, J.YélamosUnidad de Trasplante. Hospital Universitario Virgen dela Arrixaca. Murcia

I n t roducción: el papel jugado por los linfocitos Tgammadelta en la respuesta inmune es aún poco

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c l a ro aunque parecen estar implicados en la pri-mera línea de defensa junto con otras células delsistema inmune innato como macrófagos y célu-las NK. La respuesta celular innata juega un papelmuy importante en el rechazo de xenoinjertos.

Objetivo: estudiar la respuesta de linfocitos Tgammadelta humanos frente a células endotelia-les porcinas.

Métodos: se ha estudiado la xenorreactividad declones gammadelta humanos, obtenidos de dife-rentes fuentes (sangre periférica, bazo, cord ó numbilical y timo), frente a células endoteliales por-cinas utilizando la técnica clásica de liberación deC r-51 en presencia y ausencia de anticuerpos blo-queantes de diferentes moléculas.

Resultados: 38,9% de los clones gammadelta utili-zados fueron citotóxicos frente a las células porc i-nas. Esta respuesta citotóxica se bloqueó significati-vamente con OKT3. La incubación de los clones conconcanamicina A, un inhibidor de la ruta perf o r i-na/granzima B, inhibió la actividad lítica de los clo-nes gammadelta frente a endotelio porcino. Sine m b a rgo, esta inhibición no se observó trás la incu-bación con anticuerpos anti-TNF alfa y anti-FasL.

Conclusión: la actividad lítica de células T/ gam-madelta frente a células porcinas pro b a b l e m e n t eo c u rre a través de la ruta de la perf o r i n a / g r a n z i m aB y puede re p resentar un importante obstáculopara el xenotrasplante.

O-92. ACTIVACIÓN DEL ENDOTELIO EN EL XENOTRASPLANTE DE CERDOSTRANSGÉNICOS PARA hDAF EN BABUINOSEN AUSENCIA DE ANTICUERPOS ANTI-GAL

N. Doménech, C. Ruiz de Valbuena, T. Díez, A. Centeno, E. López-Peláez, R. MañezUnidad de Investigación. Complejo Hospitalario JuanCanalejo. ACoruña

I n t roducción: la supresión de los xenoanticuer-pos que reconocen mayoritariamente el antígenoGal1-3Gal(Gal) permite prolongar significativa-mente la supervivencia de los xenoinjertos porc i-nos trasplantados en babuino y prevenir el re c h a-zo vascular agudo, pero no evita totalmente eldepósito de xenoanticuerpos.

Métodos: seis babuinos re c i b i e ron un xenotras-plante de corazón heterotópico de cerdo transgé-nico hDAF y fueron tratados con una polilisina quelleva unido Gal (GAS 914) e inmunosupresión. Enmuestras del xenoinjerto obtenidas antes de lare p e rfusión y en el momento del fracaso del injer-to o muerte del animal, se analizó mediante inmu-nohistoquímica la expresión de marc a d o res decélulas endoteliales activadas. También se deter-m i n a ron los niveles de xenoanticuerpos totalespor citometría de flujo.

Resultados: a pesar de la depleción de anticuer-pos anti-Gal en el suero se detectó la presencia sig-nificativa de xenoanticuerpos frente a linfocitosp o rcinos que puede explicar el depósito de IgMdetectado en los xenoinjertos. En el momento delfracaso del injerto o muerte del animal se detectóla expresión de antígenos asociados con una acti-vación del endotelio como CD62 y CD106, y espe-cialmente el 5A6/8.

Conclusión: el depósito de xenoanticuerpos no-Gal en el xenoinjerto porcino se asocia con una acti-vación del endotelio, que aunque no causa un re c h a-zo vascular agudo, puede actuar de forma negativaen la supervivencia del injerto a largo plazo.

O-93. GAS 914, UNA POLILISINA QUECONTIENE GAL, PREVIENE EL RECHAZOVASCULAR AGUDO EN ELXENOTRASPLANTE HETEROTÓPICO DECORAZÓN DE CERDOS TRANSGÉNICOSHDAF EN BABUINOS

N. Doménech, C. Ruiz de Valbuena, A. Juffe, A. Centeno, E. López-Peláez, R. MañezUnidad de Investigación. Complejo Hospitalario JuanCanalejo. ACoruña

Introducción: el rechazo vascular agudo (RVA) esla causa más importante de fracaso en el xenotras-plante de órganos de cerdos transgénicos hDAF enprimates no-humanos. En el presente estudio seinvestiga la eficacia de GAS 914, una molécula depolilisina que contiene residuos de GAL en la pre-vención del rechazo vascular agudo producido enestos trasplantes.

Métodos: 19 babuinos fueron sometidos a unxenotrasplante heterotópico con órganos de cerd o stransgénicos para hDAF. Trece de éstos (grupo A)re c i b i e ron un protocolo de inmunosupresión queincluye 4 dosis-perioperatorias de ciclofosfamida,Neoral, ERL micofenolato sódico y esteriodes. Loso t ros seis babuinos (grupo B) re c i b i e ron la mismai n m u n o s u p resión y GAS 914 i.v o s.c.

Resultados: 4 xenotrasplantes del grupo A sufrie-ron rechazo hiperagudo, mientras que ese tipo derechazo no se dio en el grupo B. Excluyendo loscasos de rechazo hiperagudo, todos los xenotras-plantes del grupo A fracasaron debido a RVA conla excepción de dos animales que murieron porfallo renal. En el grupo B ningún injerto fallo porRVA, observándose únicamente mínimos depósi-tos de IgM y fibrina en los injertos en el momentodel fracaso del mismo o fallecimiento del animalpor diversas causas.

Conclusión: el tratamiento con GAS 914 por 17días antes y de forma continuada después del tras-plante, previene el rechazo hiperagudo y RVA delos xenotrasplantes porcinos hDAF en babuinos.

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O-94. ANÁLISIS DE LOS LINFOCITOSINTRAEPITELIALES INTESTINALES (i-LIE)COMO MARCADOR DE EVOLUCIÓN DELTRASPLANTE (Tx) DE INTESTINO CLÍNICO-EXPERIMENTAL

P. Eiras, Y. Quijano, C. Correa, G. Roy, F. León, C. Redondo, A. Bootello, E de VicenteInmunología y Unidad Tx Hepato-Intestinal. HospitalRamón y Cajal. Madrid

En 1995 comenzamos una línea experimental detrasplante intestinal con vistas a la re a l i z a c i ó n ,recientemente alcanzada, de Tx intestinales aisla-dos y combinados hepatointestinales por primeravez en España. Su objetivo era avanzar en el conoci-miento de los mecanismos inmunológicos implica-dos en el eventual rechazo o aceptación del injert o .

Material y métodos: Tx alogénico ortotópico, fun-cionalizado y bidireccional entre dos cepas de rata(DA/Lw) (n = 74), pauta corta de inmunosupre-sión (FK-506, 1 mg/kg 14 días). Análisis morf o l ó-gico y por citometría de flujo de los injertos trasmuerte o sacrificio.

Resultados: 5 ratas (todas DA con injerto Lw)a l c a n z a ron supervivencia indefinida (>1 año).Estos 5 injertos mostraron, como única caracte-rística distintiva, un importante aumento en elnúmero de i-LIE sin signos morfológicos de recha-zo crónico. El análisis fenotípico de los mismosdemostró que la gran mayoría de ellos re s u l t a b a nser la población N K - L i k e recientemente caracteri-zada en humanos, que desaparece en enferm o scelícos y que muestra una estrecha similitud feno-típica con otra población N K - L i k e descrita en ladecidua humana y posiblemente implicada en latolerancia materno-fetal (u-NK).

C o n c l u s i ó n : con independencia de la posibleimplicación funcional de esta población de i-LIEen el establecimiento del aparente estado de tole-rancia alogénica, consideramos que la determ i n a-ción fenotípica de los i-LIE tiene un probable valorcomo marcador evolutivo del Tx de intestino clí-nico-experimental

O-95. ACTIVIDAD CALCINEURINA Y PRODUCCIÓN IN VITRO DE IL-2 E IFNCOMO PARÁMETROS FA R M A C O D I N Á M I C O SEN EL TRATAMIENTO CON CsA

O. Millán, M. Brunet, J. M. Campistol, I. Rojo, E. Vidal, O. Jiménez, P. J. Iñigo, J. Corbella, F. Oppenheimer, J. MartorellInstitut Clinic Infeccions i Immunologia (ICII), ServeiToxicologia i Unitat de Trasplantament Renal. HospitalClinic, IDIBAPS. UB Barcelona

Objetivo: encontrar parámetros farm a c o d i n á-micos que pro p o rcionen información adicionals o b re la monitorización de inmunosupre s o re s ,

con el fin de valorar la variabilidad individual enel efecto biológico.

Métodos: hemos estudiado: a) actividad calci-neurina en linfocitos (aCN); b) producción in vitrode IL-2 e IFNγ; en sangre total activada con PHA,y c) niveles de CsA y de MPA. Todas las determ i-naciones se re a l i z a ron a 0 y 2 horas post-dosis entrasplantados renales estables tratados con CsA oMMF (12 + 10) y en 10 individuos sanos (NHC).La aCN se midió utilizando un péptido marc a d ocon 32P, introduciendo la fosfatasa alcalina comovalor interno de re f e rencia. La producción de IL-2e IFNγ en sangre total se determinó por ELISA.

Resultados: en el grupo de CsA la aCN estaba cla-ramente reducida a 0 y 2 horas, en relación con elg rupo de MMF y el NHC (p <0,001); la pro d u c-ción de IL-2 e IFNγ estaba reducida en el grupo deCsA en comparación con el NHC a 2 horas(p=0,017 & p=0,009) a pesar que no se han encon-trado diferencias con el grupo de MMF. En el gru-po de MMF la IL-2 estaba ligeramente reducida alas 2 horas (p=0,052) en comparación con el NHC.En el grupo de CsA se ha encontrado una corre l a-ción significativa entre: a) los niveles de CsA a 2horas y la producción de IFNγ; (p=0,037); b) aCNa 2 horas y producción de IL-2 tanto a 0 como 2horas (p=0,022 & p=0,020); y c) IL-2 e IFNγ; a 2horas (p = 0,033). No se encontró correlación deestos parámetros en el grupo de MMF.

C o n c l u s i o n e s : a) la capacidad predictiva de losniveles de CsA a 2 horas es mejos que a 0 horas; b)aCN a 2 horas correlaciona mejor con la pro d u c c i ó nde IL-2 que con la de IFNγ; c) pacientes con valore se x t remos para estos parámetros pueden ser de inte-rés para identificar la variabilidad interindividual.

O-96. RESPUESTAS ALOGÉNICAS EN TRASPLANTES RENALES: COMPARACIÓNDE LAS VÍAS DIRECTA E INDIRECTA EN ELRECHAZO CRÓNICO

M. P. Hernández-Fuentes, R. J. Baker, W. F. Ng, P. A.Brookes, A. N. Chaudhry, R. I. LechlerDepartamento de Inmunología. ICSM. HammersmithHospital. Londres, Reino Unido

A n t e c e d e n t e s : el rechazo crónico es una de lascausas más importantes de pérdida de trasplantesen la clínica. Es importante verificar qué vía deactivación están utilizando los linfocitos T CD4+

para originar rechazo crónico.O b j e t i v o s : este estudio pretende comparar re s-

puestas efectoras consecuencia de activación alo-génica tanto por la vía directa como por la indirec-ta en un grupo de pacientes re c e p t o res de untrasplante renal de larga evolución.

Métodos: hemos estudiado respuestas de linfo-citos T CD4+ a aloantígenos de los donantes pre-sentados por la vía directa (frecuencias de pre c u r-

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s o res secre t o res de citocinas o proliferantes) y porla vía indirecta (PBMCs estimulados con pro t e í-nas de membrana de células de donantes).

P a c i e n t e s : 22 recipientes de un trasplante re n a lde larga evolución cuyo donante es un familiarvivo (9 con rechazo crónico -CAN-; los 13 re s t a n-tes con buena función del trasplante).

Resultados: hemos encontrado hipo-re s p u e s t a sdonante-específicas por la vía directa de una for-ma generalizada en ambos grupos de pacientes(22/22 para producción de IL-2 y 17/22 para pro-liferación). No hemos encontrado evidencia depolarización Th1 o Th2 en estas respuestas. Lamediana de las frecuencias anti-donante por víai n d i recta era mayor en el grupo de pacientes quep resentaba rechazo crónico que en el grupo conbuen funcionamiento (p <0,05).

Conclusión: estos datos sugieren que las respues-tas anti-donante por vía directa están específica-mente inhibidas en los trasplantes renales de lar-ga evolución. La vía indirecta sería la principalresponsable de la activación inmune asociada alrechazo crónico.

INMUNODEFICIENCIAS

O-97. INMUNODEFICIENCIA VARIABLECOMÚN, EXPANSIÓN DE LINFOCITOSGRANDES GRANULARES, BICITOPENIARECURRENTE Y NEUMONÍA POR P. CARINII

I. Salcedo, J. Chamorro, A. Macías, J. A. Brieva, A. SampaloServicio de Inmunología. Hospital Universitario Puertadel Mar. Cádiz

Presentamos un caso de evolución tórpida agre-siva y atípica de IDVC, que además de su pro p i ointerés descriptivo, invita a una reflexión sobre lah e t e rogeneidad de manifestaciones clínicas einmunológicas de una entidad que empieza a serconsiderada más como un conjunto de síndro m e sa g rupables en categorías que como una únicaenfermedad (Immunol Today 1997; 18: 325).

Mujer de 26 años, diagnosticada en 1997 de IDVCpor infecciones otosinusales de repetición, IgG <250mg/dl, linfopenia B, baja respuesta proliferativa T yescasa producción de Igs en cultivo. Destacamoscomo antecedentes una mononucleosis infecciosade curso severo un año antes, y dos hermanos (v yh) con déficit de IgA. Durante 4 años se observa unarespuesta favorable a tratamiento sustitutivo con IgsI V. En junio del 2000 re q u i e re un primer ingreso porf i e b re elevada, neutropenia (150/mmc) y tro m b o-penia (11.000/mmc) severas, y gran esplenomega-lia; detectándose en SP una proliferación policlonalde LGGs CD3+ CD8+ CD57+ DR+ (70%;>7.000/mmc). Se realiza esplenectomía, punción de

MO y biopsia ganglionar, observándose una infiltra-ción T de idéntico fenotipo y la práctica ausencia delinfocitos B en todas estas localizaciones junto a unahematopoyesis conservada. El postoperatorio secomplica con una neumonía nosocomial y re a p a r i-ción de la bicitopenia tras una recuperación breve ytransitoria. Se observa además hepatomegalia e infil-tración nodular de ambas parótidas, riñones, colonascendente y transverso y adenopatías en re t ro p e r i-toneo y cadena yugular que impresionan de granu-lomas. Hasta la fecha la paciente ha sufrido re i t e r a-dos ingresos por complicaciones infecciosas y fiebre(con cultivos persistentemente negativos), linfoci-tosis, neutropenia y trombopenia. Desde hace 2meses se administran 30 mg/d de prednisona parac o n t rol de la bicitopenia. En la última quincena, pesea un recuento normal de CD4, la paciente desarro-lla neumonía intersticial por pneumocystis carinii.

Estos datos sugieren una forma granulomatosa( G rupo B) de IDVC, relacionada con hiperactiva-ción del sistema TNF-TNF-R. Nos planteamos elposible beneficio de otras opciones terapéuticasa l t e rnativas a los esteroides (AcMo anti-TNF,Metotrexate,...).

O-98. UN CASO DE INMUNODEFICIENCIA TPROBABLEMENTE PRIMARIA DE APARICIÓN EN LA EDAD ADULTA

R. Pena, F. León, C. Cámara, J. A. García, L. Sánchez, A. Bootello, J. L. CastañerServicio de Inmunología. Hospital Ramón y Cajal.Madrid

El diagnóstico y manejo de las inmunodeficien-cias primarias (IDP) combinadas en adultos escomplejo, tanto por su escasa frecuencia como porla imposibilidad de establecer su etiología enmuchos casos. Presentamos el caso de una mujerde 24 años, que debuta con neumonía por oportu-nistas y linfopenia severa. Descartadas causassecundarias se plantea la posibilidad de una IDP.La paciente carece de antecedentes clínicos deinterés salvo adenopatía 6 meses antes (diagnósti-co PAAF: linfadenitis inespecífica). Presenta his-toria familiar de autoinmunidad en varias muje-res de la rama materna. El inmunofenotipo de SPmostró linfopenia (300 linfocitos/µl), a expensasde la población T (CD3 17%), una población CD3+CD4-CD8- que re p resenta el 75% de las células Ty cociente CD4/CD8 invertido. No hubo re s p u e s-ta funcional a CD3, pero sí a mitógenos. Tanto lam a d re como una de las hermanas pre s e n t a b a nfenotipo y funcionalidad similares, aunque muchomenos severos. PNP, ADA, JAK-3 y cadena γc deIL-R normales. Durante dos años persistió inten-sa linfopenia con normalización paulatina de lapoblación DN, desarrollando entonces un linfo-ma anaplásico CD30+ por VEB. Tras tratamiento

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del tumor con quimioterapia y TMO de una her-mana sana, la paciente recuperó rápidamentepoblaciones linfocitarias hasta niveles actualmen-te normales. Este caso de probable IDP combina-da T-B+NK+ de etiología no aclarada ilustra lanecesidad de no descartar la presencia de una IDPen adultos con patología compatible y en los queno se halla una etiología secundaria.

O-99. DEFICIENCIA DE FACTOR I CON EPISODIOS DE MENINGITIS RECURRENTEASOCIADOS CON LA MENSTRUACIÓN

C. González-Rubio, A. Ferreira-Cerdán, J. Arpa, G. Fontán, M. López-TrascasaServicio de Inmunología. Hospital Universitario La Paz.Madrid

A n t e c e d e n t e s : la deficiencia total del inhibidorde la vía alternativa del complemento, el factor I,se asocia frecuentemente con infecciones pióge-nas re c u rrentes así como con una mayor inciden-cia de glomerulonefritis y fenómenos l u p u s - l i k e.Presentamos una paciente de 23 años que desarro-lló a los 16 años una sepsis meningocócica coinci-dente con la menstruación. Desde agosto de 1999comienza a tener episodios re c u rrentes de menin-gitis perimenstruales que se resuelven con trata-miento antibiótico. En su familia se documenta lamuerte de un hermano por meningitis.

O b j e t i v o s : diagnosticar y estudiar inmunoquí-micamente a la paciente y a su familia antes ydurante el tratamiento.

R e s u l t a d o s : el estudio inmunológico de la pacien-te muestra unos niveles bajos persistentes de C3,además de niveles disminuidos de factor B, factor Hy pro p e rdina. El factor I era indetectable por ELISAy We s t e rn-Blot. El resto del estudio únicamentemostró títulos elevados de inmunocomplejos y unaumento policlonal de IgM. Además, se detectaro nen suero niveles aumentados de complejos C3b/FH,C 3 b / P, C3b/IgG y P/IgG. El patrón analítico de losLCR en los episodios era de carácter infeccioso, aun-que no siempre se pudo detectar Neisseria meningi-t i d i s mediante PCR. El tratamiento profiláctico conantibióticos, anti-estrógenos, rifampicina, infusio-nes de plasma fresco ó gammaglobulina intraveno-sa no han podido eliminar los episodios mensualesde meningitis. En función de las concentraciones deFI en su familia, la herencia es compatible con unpatrón autosómico recesivo (padres y un herm a n ocon ~50% de los niveles, y una hermana con ~3% delos niveles).

C o n c l u s i o n e s : describimos la primera familiaespañola con deficiencia de factor I. Además de lapaciente, esta familia presenta padres sanos hete-rozigotos y dos hermanos sanos (un hetero z i g o t oy una homozigota). Actualmente hemos iniciadoel estudio molecular del gen del factor I.

O-100. IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONESEN EL SÍNDROME DE HIPER IgM LIGADOAL X (HIMX)

E. López Granados, R. Cambronero, A. Ferreira, G. Fontán, M. C. García RodríguezUnidad de Inmunología. Hospital La Paz. Madrid

I n t ro d u c c i ó n : el síndrome de HIMX es unainmunodeficiencia primaria causada por defectosen el gen del CD40L. Para el diagnóstico definiti-vo de la enfermedad es imprescindible la identifi-cación de la mutación responsable, ya que pacien-tes con Inmunodeficiencia Variable Común ( I D V C )pueden presentar anomalías en la expresión deesta proteína detectadas por citometría de flujo.

Materiales y métodos: estudiamos en dos familias(A y B), a tres varones afectos y a las posibles port a-doras. En una familia (C), con antecedentes de tre sv a rones fallecidos con sospecha de HIMX, estudia-mos a la madre como posible portadora obligada y auna hermana que solicitó consejo genético.Analizamos el gen mediante PCR y secuenciaciónautomática. En la familia A confirmamos la re p e r-cusión a nivel de ADNc mediante RT- P C R .

R e s u l t a d o s : en la familia A identificamos unamutación puntual en la posición +5 de la re g i ó ndonadora de “splicing” del intrón 3 que afecta alp rocesamiento de parte del ARNm perdiendo elexón 3. La familia B presentaba una mutación“missense” en el dominio extracelular de la pro t e-ína. En la familia C las dos mujeres estudiadas eranp o rtadoras de una deleción de 14 bases que con-dicionaría la síntesis de una proteína truncada enel dominio extracelular.

Conclusiones: el estudio del gen del CD40L per-mite confirmar el diagnóstico de HIMX en las fami-lias estudiadas. El tipo y localización de las muta-ciones encontradas, permiten la expresión dep roductos proteicos no funcionales en membranajustificando, en cada caso, las imágenes obtenidasmediante citometría de flujo en pacientes y port a-doras de la enfermedad.

O-101. ESTUDIO GENÉTICO E INMUNOLÓGICO EN INCONTINENCIAPIGMENTI

N. Martínez, J. Pons, J. Ferre r, D. Heine*, A. Etxagibel, A. Martín**, N. MatamorosServicio de Inmunología, Servicio de Genética*, Serviciode Dermatología**. Hospital Son Dureta. Palma deMallorca

La incontinencia pigmenti (IP) es un trastorn ogenético dermatológico dominante ligado a X,generalmente letal en varones durante periodo pre-natal. Produce alteraciones a distintos niveles: piel,pelo, uñas, dientes, ojos y sistema nervioso central.Varios de los casos padecen infecciones re c u rre n t e s

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y/o alteraciones en la quimiotaxis de los neutrófi-los. La proteína moduladora IKK; (NEMO) es nece-saria para la activación del factor de transcripciónNF-B, fundamental en numerosos procesos bioló-gicos. Mutaciones en el locus del gen IKKg pro d u-cen la mayoría de casos de IP, siendo el 80% de ellospor re o rdenamiento genómico incorre c t o .Mediante técnica de PCR y primers específicos delexón 3 y de una secuencia 3 del exón 10, se ampli-fica la secuencia del gen NEMO.

Se determinan poblaciones linfocitarias, inmu-noglobulinas séricas, y respuesta proliferativa adistintos estímulos. En controles y pacientes seamplifica una región de 13 Kb del gen NEMO. Enalgunos pacientes se amplifica además una secuen-cia de 2 Kb que corresponde a la deleción de losexones 4-10. Una de las pacientes padece infeccio-nes re c u rrentes graves asociadas a disgammaglo-bulinemia; la población CD3+CD8+ perm a n e c ede forma constante en el límite inferior de la nor-malidad. Los resultados demuestran una delecciónde los exones 4-10 del gen NEMO como la muta-ción más re p resentativa en las familias estudiada,tal y como se había descrito en el Consorcio de IPde mayo de 2000. Se describe la relación genoti-po/fenotipo de estos pacientes.

O-102. IDENTIFICACIÓN DEL PRIMERPACIENTE HETEROZIGOTO COMPUESTOPARA EL SÍNDROME PAPILLON-LEFÈVRE YDE UNA NUEVA MUTACIÓN ASINTOMÁTICAEN EL GEN DE LA CATEPSINA C

L. M. Allende, M. A. García-Pérez, A. Moreno, A. Corell, M. Carasol*, P. Martínez-Canut**, S. Ferre, A. Sotoca, M. A. Díaz-Espada, A. Arnaiz-VillenaDepartamento de Inmunología y Biología Molecular.Hospital 12 de Octubre. *Departamento de Odontología.Universidad Complutense. Madrid. **Departamento deOdontología. Universidad de Valencia

Recientemente se ha publicado que el gen de lacatepsina C es el responsable del síndro m eP a p i l l o n - L e f è v re (PLS), el cual se caracteriza porp rovocar keratosis palmoplantar asociada a unaa g resiva periodontitis donde en la mayoría de loscasos se complica con distintos tipos de infeccio-nes bacterianas. Hasta el momento, se han iden-tificado trece mutaciones homozigotas en el gende la catepsina C en pacientes PLS de distinto ori-gen étnico. En el presente estudio, se describe elprimer paciente heterozigoto compuesto para els í n d rome Papillon-Lefèvre (706G > T y 872G > A,mutación materna y paterna re s p e c t i v a m e n t e ) .Además, se describe la primera mutación asintó-mática (458C > T) en homozigosis en tres indivi-duos sanos. Por tanto, no todas las mutaciones

descritas deberían ser consideradas como causan-tes de enfermedad, sin realizar un estudio pobla-cional en individuos sanos, ya que pueden tratar-se de polimorfismos. También, se describe otramutación (857A>G) como causante de PLS en unafamilia española de Madrid, dicho cambio ya sehabía identificado en otros trabajos como el cau-sante del síndrome Haim-Munk (HMS, variantealélica del síndrome Papillon-Lefévre) en judíosde la India.

Por otra parte, se ha visto como los pacientesPLS mejoran empleando un tratamiento basado enretinoides (vitamina A), lo cual podría explicarsepor la existencia de elementos de respuesta a áci-do retinóico en la región promotora del gen de lacatepsina C.

O-103. ESTUDIO PRELIMINAR DE FOSFORILACIÓN TOTAL EN LINFOCITOS T CD4+ TRANSFORMADOS CONHERPESVIRUS SAIMIRI DE PACIENTES CON INMUNODEFICIENCIA COMÚNVARIABLE (CVID)

J. A. Cabanillas, A. Pacheco, J. R. RegueiroDepartamento de Inmunología. Facultad de Medicina.Universidad Complutense. Madrid

En la inmunodeficiencia común variable ( C V I D )se han postulado alteraciones primarias tanto encélulas B, como en células T, como en monocitos.Buscando pre s e rvar donde existan, defectosintrínsecos del linaje T, transformamos dichascélulas con H. saimiri (HVS) y exploramos su capa-cidad de inducción de factores solubles (IL-2,T N F -α e IFN-γ) y de membrana (CD154, CD69)relevantes en la cooperación T-B. Los re s u l t a d o si n d i c a ron que los linfocitos T de pacientes conCVID inmortalizados con H. saimiri no presentan,como grupo, alteraciones funcionales intrínsecassignificativas en los parámetros analizados. Sinembargo, se observó un defecto severo en la induc-ción de IL-2 y de CD154 en el linaje CD4+ tras estí-mulo con anti-CD3 en 3 de 10 pacientes analiza-dos, sugiriendo que quizá algunos pacientes sísufran disfunciones intrínsecas TCR/CD3-depen-dientes.

En el presente trabajo analizamos medianteWe s t e rn blot la fosforilación total tras activacióncon anti-CD3 en las 3 líneas precitadas y en un con-t rol sano. En uno de los pacientes se observó quefaltaba una banda constitutiva cuyo peso molecu-lar aparente era de 32 kDa. Se re q u i e ren estudiosp o s t e r i o res para tratar de identificar la proteína ala que corresponde dicha banda.

Este trabajo fue financiado por el FIS (96/0860)utilizando instalaciones del Centro de TécnicasInmunológicas de la U.C.M.

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O-104. DIFERENCIAS ESTRUCTURALES EN EL COMPLEJO TCR/CD3 DE LA MEM-BRANA DE LINFOCITOS T CD4+ Y CD8+

MADUROS TRANSFORMADOS DEFICIENTES DE CD3

D. A. Zapata, P. S. To r res, A. Pacheco-Castro, J. R. RegueiroDepartamento de Inmunología. Facultad de Medicina.Universidad Complutense. Madrid

El receptor para antígeno del linfocito T es unae s t ructura multimérica de membrana constituidapor dos tipos de cadenas: cadenas CD3 (CD3γ,C D 3ε, CD3δ y CD3ζ), invariables y re s p o n s a b l e sde la exportación/estabilización del receptor en lamembrana celular y de la transmisión de señalestras el reconocimiento antigénico, y cadenas TCR( T C Rα y TCRβ en linfocitos Tα β; TCRγ y TCRδen linfocitos Tγ δ), variables y responsables dedicho reconocimiento. La construcción del com-plejo TCR/CD3 tiene lugar en el retículo endoplás-mico de manera secuencial y ordenada, y sólo com-plejos completos se exportan a la membrana.Además se asume que los linfocitos Tα β C D 4+ yCD8+ construyen complejos bioquímica y confor-macionalmente idénticos. Sin embargo, nuestrotrabajo de caracterización bioquímica de un recep-tor mutante, deficiente de CD3γ, sugiere que lascélulas Tα β C D 4+ (γ-) y Tα β C D 8+ (γ-) constru-yen re c e p t o res estructuralmente distintos.Experimentos de inmunoprecipitación (con anti-cuerpos anti-CD3) del complejo TCR/CD3 ensam-blado en el citoplasma por estas células mostraronque: 1. tanto los linfocitos T CD4+ γ - como losC D 8+ γ - contenían cadenas CD3 (δ y ε) cualitati-va y cuantitativamente normales y con idénticoc o m p o rtamiento en términos de sensibilidad aEndo H y 2 tanto en las células CD8+ γ - como enlas CD4+ γ - las cadenas TCR coprecipitaban nor-malmente con el resto del complejo, si bien lascélulas CD8+ γ - contenían cadenas TCRβ y TCRαa n o rmales. Por otra parte, el estudio bioquímico -i n m u n o p recipitación con anticuerpos anti-CD3-del receptor mutante exportado a la superf i c i ecelular (receptor “funcional”) mostró: a) difere n-cias en el patrón de glicosilación de CD3δ en célu-las CD8+ γ- v s C D 4+ γ - (cadenas Endo H-re s i s-tentes y Endo H-sensibles, respectivamente) y b)prácticamente total ausencia de copre c i p i t a c i ó nde cadenas TCR con el resto del complejo tanto encélulas CD8+ γ - como CD4+ γ - . En este contexton u e s t ro trabajo pretendía encontrar y estudiar lasteóricamente exportadas -junto con el resto decomponentes CD3- cadenas TCR. Experimentosde inmunoprecipitación directa (anticuerpos anti-T C Rα y anti-TCRβ) de las cadenas TCRα y TCRβ

de la superficie de las células mutantes mostraro nque: a) las células CD4+ γ - e x p o rtaban cadenasT C Rα y TCRβ d i f e rentes a las de sus re s p e c t i v o sc o n t roles (¿diferentes patrones de glicosilación?)aunque reconocibles por los corre s p o n d i e n t e santicuerpos monoclonales pero que, b) las célulasC D 8+ γ - no exportaban cadenas TCR re c o n o c i-bles por esos anticuerpos. Estos resultados sugie-ren la existencia de importantes diferencias depen-dientes de linaje en los mecanismos dep rocesamiento postraduccional de los complejosTCR/CD3.

O-105. REGISTRO ESPAÑOL DE INMUNO-DEFICIENCIAS PRIMARIAS (REDIP).INFORME DE ACTUALIZACIÓN MARZO2001

A. Etxagibel, C. Crespí, N. Martínez, I. Muñoz, J. Milà, N. MatamorosServicio de Inmunología. Hospital Son Dureta. Palmade Mallorca

El papel de los re g i s t ros nacionales de inmuno-deficiencias primarias (IDP) está siendo funda-mental en el mejor conocimiento de este tipo depatologías que por su escasa incidencia precisa deestudios colaborativos. El REDIP, iniciado en mar-zo de 1993 recoge a marzo de 2001 un total de 2.087casos. Los diagnósticos están basados en la clasifi-cación y criterios establecidos por la IUIS, octubre1 9 9 9 .

En primer lugar y por grandes grupos se encuen-tran las inmunodeficiencias pre d o m i n a n t e m e n t ede anticuerpos con un 68,4% de casos. En segun-do lugar las deficiencias T y combinadas con un13% de los casos. A continuación le siguen los défi-cits del sistema complemento con un 10,1%, lasdeficiencias de la fagocitosis con un 5,1% y otro sdéficits primarios que suponen el 3,3% del total.

Además de la importancia epidemiológica de losdatos obtenidos, éstos son de utilidad para el mejorconocimiento de las enfermedades recogidas. Laaplicación de los mismos para el diagnóstico y tra-tamiento precoces puede en ocasiones curar alpaciente o mejorar sustancialmente su calidad yesperanza de vida.

Finalmente destacar la colaboración entre dife-rentes grupos de trabajo promovidos por el re g i s-t ro así como la elaboración de subre g i s t ros deinmunodeficiencias, todo ello encaminado a ofre-cer una mejor comprensión de este tipo de patolo-gías y atención a los pacientes con inmunodeficien-cias primarias.

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