Universidad del Valle de Guatemala

Facultad de Ingeniería

Ingeniería Química

Bioingeniería / sección 20

PRODUCCIÓN MICROBIANA DE BUTANOL

Integrantes:

Ana Silvia López

Mellado, Nidia 08580

Marilia Sic 07387

Ingrid Ibarra 09395

Carlos Ramos 09449

Pietro Pazzetti 07851

Guatemala, 19 de marzo de 2014

PRODUCCIÓN MICROBIANA DE BUTANOL

1. Características químicas y físicas del butanol.

Es un líquido incoloro e inflamable con un olor rancio y dulce. Forma un azeótropo con el agua (42.4% de agua) con un punto de ebullición de 92.6°C a presión atmosférica. Es miscible con la mayoría de disolventes orgánicos, tales como, alcoholes, cetona y ésteres, entre otros. En condiciones normales es un producto estable. Con oxidantes fuertes, como sulfúrico, nítrico o peróxido de hidrógeno, la reacción puede ser peligrosa. La mayoría de los metales son insensibles a la acción del n-butanol, pero en determinadas condiciones puede reaccionar con aluminio produciendo hidrógeno. (INSH, 2013)

Tabla no1. Propiedades físicas y químicas del Butanol (Perry, 2007 y Mauro C. 2006)

Sinónimos 1-Butanol, Alcohol butílico, n-butanol, propil carbinol

Fórmula estequiometrica C2H5CH2 CH2OH (C4H10O)Número de CAS 71-36-3Peso molecular 74.12 kg/molForma y color Líquido claro incoloro, con olor punzante no

residual (nivel de olor: 0.17 ppm)Gravedad específica 0.81020/4

Punto de Fusión -79.9 °CPunto de Ebullición 117 °CDensidad a 20°C 0.811g/cm3

Presión de Vapor 5mmHg (0.6 kPa) a 20°CSolubilidad en 100 partes En agua: 915, soluble en metanol, etanol y

otros solventes orgánicos

Tabla no2. Medidas contra-incendios (Dorwil, 2008)Temperatura de inflamabilidad 37°CTemperatura de auto-ignición 343°CLímites inflamables en el aire % por volumen

Límite inferior: 1.4%Límite superior 11.2%

2. Usos del butanol

Se utiliza como disolvente industrial, en procesos de cloración, en síntesis orgánicas de ésteres disolventes, plastificantes y otros compuestos, en microscopía se utiliza en la preparación de materiales de parafina, funciona como agente deshidratante y se utiliza en la manufactura de líquidos para frenos, formulaciones de detergentes, etc. Es altamente inflamable, es soluble en agua y miscible con la mayoría de solventes orgánicos (Cosmos 2010).

Se utiliza como disolvente para resinas y lacas de nitrocelulosa, así como componente de los ésteres, como del ácido acético (acetato de butílico) y del ácido ftálico (ftalato de butilo). (H. Beyer y W. Walter. 2004)

Se emplea como disolvente de pinturas, lacas, barnices, resinas naturales y sintéticas y como disolvente para la extracción y purificación de aceites vegetales, gomas, ceras, perfumes, alcaloides, antibióticos, hormonas, vitaminas, etc. Se utiliza como sustancia intermedia en la fabricación de productos químicos y farmacéuticos, y en la industria de cuero artificial, textiles, gafas de seguridad, pasta de caucho, impermeables, películas fotográficas y perfumes. (INSH, 2013)

Varios grupos de investigadores estudian las posibilidades del butanol como combustible de origen biológico. Debido a que el butanol es un hidrocarburo consistente en una cadena de cuatro átomos de carbono con una radial OH y el resto de las valencias cubiertas con átomos de hidrógeno, este alcohol se puede usar como combustible tanto en motores de ciclo Otto como motores ciclo Diesel actuales sin muchas modificaciones. No existen fuentes en la Naturaleza que produzcan butanol puro, pero éste se puede sintetizar a partir de otros compuestos.( A. Muerza. 2007)

En teoría sería posible usar como fuente de esos compuestos cultivos de microorganismos, lo que haría que este combustible fuera renovable y supuestamente más ecológico que otros biocombustibles obtenidos a partir de cultivos como el maíz. (A. Muerza. 2007)

3. Ruta metabólica para la producción de butanol.

Durante el proceso de producción de butanol con Clostridium se presenta, entre otros, un cambio fisiológico importante en la bacteria: los ácidos acético y butírico son liberados al medio durante la fase de crecimiento exponencial los cuales son reabsorbidos al interior de la célula, para ser metabolizados a butanol, acetona y, en mucho menor medida en etanol. Esto se debe a que C. acetobutylicum carece de homeostasis al nivel de pH, por lo que depende íntimamente del pH extracelular. La presencia de ácidos en el medio puede provocar una pérdida del potencial protónico de la célula, inactivándola. El pH es muy importante durante la fermentación acetona-butanol, ya que la solventogénesis inicia con un pH bajo; sin embargo si éste se encuentra por debajo de 4.5 (antes de que se forme una cantidad suficiente de ácidos orgánicos), la solventogénesis será disminuida e improductiva. Una forma sencilla de incrementar el crecimiento, utilización de los carbohidratos así como la producción de butanol es incrementando la capacidad amortiguante del medio. Dependiendo de las condiciones de cultivo y el tipo de sustrato empleado, las fermentaciones tipo lote toman de 2 a 6 días en completarse, la concentración final total de solventes producidos alcanza de 12 a 20 g/L, los cuales pueden ser separados por destilación del medio de fermentación (Lee, 2008).

El hierro es un importante componente en la dieta de Clostridium, ya que se requiere de una profusa producción de ferredoxina en la conversión de piruvato en acetil-CoA. También se ha demostrado que en condiciones limitantes de fosfato es posible prevenir la pérdida del plásmido pSOL1 que, como se mencionó anteriormente, es necesario para la síntesis fermentativa de butanol en cepas silvestres (Lee, 2008).

Vías fermentativas de C. acetobutylicum (Lee, 2008)

4. Microorganismos productores de butanol.

Las cepas más usadas para la fermentación industrial ABE son principalmente del género Clostridium: Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinkii, Clostridium saccharobutylicum y Clostridium saccharobutylacetonicum. Las especies de acetobutylicum y beijerinkii son adecuadas para la fermentación acetonabutanol a partir de maiz mientras que las saccharobutylicum y saccharobutylacetonicum utilizan melaza como sustrato (Ni & Sun, 2009).

Como se mencionó anteriormente, C. acetobutylicum es la especie más estudiada la secuencia completa de su genoma fue liberada en el 2001. Es una especie anaeróbica obligada, con forma de bastón, que posee un cromosoma de 3.94 Mbp y un plásmido de 192 Kbp. (Ni & Sun, 2009)

En cepas silvestres éste plásmido resulta indispensable para la solventogénesis C. acetobutylicum tiene la ventaja de ser muy diverso en los sustratos que metaboliza;

utilizando glucosa, galactosa, celobiosa, manosa, xilosa y arabinosa. Además, es también diversa la batería de enzimas que libera al medio, incluyendo: α y β-amilasas, α y β-glucosidasas, pululanasas, amilopululanasas, entre otras. (Ni & Sun, 2009)

En la búsqueda de nuevos microorganismos productores de butanol en el 2008 Steen et al., modificaron vías metabólicas en S. cerevisiae para la producción de n-butanol, ya que es un organismo bien caracterizado y genéticamente manejable. La única diferencia entre el butanol y el etanol son dos carbonos por lo que S. cerevisiae puede ser capaz de tolerar altas concentraciones de n-butanol por los mismos mecanismos que tolera el etanol. (Steen, 2008)

5. Sustratos utilizados.6. Descripción de las principales características del proceso de fermentación. 7. Características del proceso de separación y purificación del butanol.

Métodos para remover el butanol del caldo fermentativo.

El costo para la recuperación del butanol es bastante alto, esto se debe a que su concentración en el caldo fermentativo es relativamente baja debido a la inhibición del producto. La concentración total de solventes en el caldo de fermentación es de 20-30g/L, del cual 13-18g/L son butanol. El punto de ebullición del butanol es mayor que el del agua (118ºC), por lo que es posible teóricamente emplear una destilación. Por lo tanto, la recuperación del butanol por medio de destilación es poco rentable debido a la gran cantidad de energía que se debe emplear en dicho proceso. Por lo tanto, se han desarrollado y ejecutado otros métodos que permiten, a un menor costo, la separación y purificación del producto; entre ellos están adsorción, desorción, extracción líquido-liquido y ósmosis inversa (Pometto, Shetty, Paliyath, & Levin, 2005).

Recuperación de butanol por adsorción.

La separación de butanol del caldo fermentativo por medio de adsorción depende de la capacidad del absorbente. Una gran variedad de materiales pueden ser utilizados como absorbentes para la separación del butanol, la más utilizada es la silicalita. La silicalita es sílice estructurado como zeolita con propiedades hidrofóbicas, esta puede absorber selectivamente puede adsorber alcoholes de cadena corta (1 a 5 carbonos) en soluciones acuosas. Dicha práctica se ha realizado a nivel de laboratorio debido a la pequeña capacidad de los adsorbentes para separar el butanol. Por esta razón, este proceso de separación no es rentable para realizarlo a semi o gran escala (Kaminski, Tomczak, &Górak, 2011).

Recuperación de butanol utilizando un reactor de membrana.

Una de las opciones para remover el butanol es la utilización de métodos de inmovilización de microorganismos por medio de membranas o la utilización de reactores de membrana. Esta técnica tiene ciertas desventajas como baja resistencia mecánica e

incremento en la resistencia a la transferencia de masa; otro problema es el escape de células de las matrices (Kaminski, Tomczak, & Górak, 2011).

Recuperación de butanol por desorción.

Una de las técnicas emergentes para la recuperación de butanol y que promete mucho es la desorción. La separación de compuestos volátiles es posible mediante la disminución en la presión, aplicación de calor o utilización de gases inertes. Mediante la introducción de la solución en una columna en contracorriente en contacto con un gas inerte para efectuar la separación de los componentes. En este caso la separación de butanol, etanol y acetona (Kaminski, Tomczak, & Górak, 2011).

La desorción es una técnica simple para recuperar el butanol del caldo fermentativo. Nitrógeno o gases de fermentación (N, CO2) son burbujeadas a través del caldo fermentativo, seguido por el gas que pasa por un condensador. A medida que el gas es burbujeado a través del fermentador, se transfieren los solventes que son condensados por medio de un condensador y son recibidos en un contenedor (Pometto, Shetty,Paliyath, & Levin, 2005).

(Pometto, Shetty, Paliyath, & Levin, 2005)

Recuperación de butanol por pervaporación.

La pervaporación es un proceso utilizado para la remoción de solventes del caldo fermentativo utilizando una membrana selectiva. Los líquidos o solventes se difunden a través de una membrana sólida, separando así nutrientes, azúcar y microorganismos. La concentración de los solventes a través de la membrana depende de la selectividad de la membrana, que se encuentra en función de la concentración del solvente en la alimentación y la composición de la membrana. La pervaporación ha sido empleada para la remoción de butanol del caldo fermentativo en reactores de tipo fed-batch (Pometto,Shetty, Paliyath, & Levin, 2005).

La membrana utilizada generalmente es un polímero hidrofóbico, por lo que se utilizan membranas de polidimetilsiloxano. Uno de los inconvenientes del método es el alto costo del mantenimiento de condiciones, como por ejemplo la utilización de vacío. La selección del polímero para la membrana es crucial para la recuperación del butanol (Kaminski,Tomczak, & Górak, 2011).

Recuperación de butanol por aplicación de líquidos iónicos.

La separación de butanol del caldo fermentativo puede resultar bastante complicada. El proceso de extracción utilizando solventes convencionales puede ser bastante útil, es necesario tomar en cuenta sus volatilidad, toxicidad y peligrosidad. Los líquidos iónicos se caracterizan por ser no volátiles y como solventes “amigables” hacia el medio ambiente para su aplicación en varios procesos químicos. Los líquidos iónicos son sales orgánicas presentes en estado líquido a condiciones ambientales, éstos tienen una baja presión de vapor y baja solubilidad en agua (Kaminski, Tomczak, & Górak, 2011).

La utilización de líquidos iónicos para la extracción de butanol puede realizarse por aplicación directa en el bioreactor y por separación afuera del bioreactor. El líquido iónico debe ser analizado y se debe verificar que este no sea tóxico para la bacteria. El contacto entre el líquido iónico con el caldo fermentativo generará la extracción del biobutanol así como otros productos metabólicos como etanol y acetona. La poca solubilidad entre el líquido iónico y el caldo generará una separación de fases, se separarán y el líquido rico en butanol, acetona y etanol se procederá a destilar. El líquido iónico regenerado es reciclado e ingresado nuevamente al tanque de fermentación. La remoción de los productos de interés desplazará el equilibrio hacia la formación de productos, por lo tanto la transformación de materia prima en biobutanol (Kaminski, Tomczak, & Górak, 2011).

(Kaminski, Tomczak, & Górak, 2011)

Recuperación de butanol por extracción líquido-líquido.

La extracción líquido-líquido es otra técnica para remover butanol, acetona y etanol del caldo fermentativo. En este proceso el solvente de extracción se pone en contacto directo con el caldo fermentativo. El butanol, acetona y etanol se difunden en el solvente de

extracción y luego se separan por otra extracción líquido-líquido o por destilación (Pometto, Shetty, Paliyath, & Levin, 2005).

6. Descripción de las principales características del proceso de fermentación.

El medio a utilizar para el crecimiento de C. pasteurianum es “Clostridial Growth Medium” (CGM), cuando se utiliza como sustrato glicerol, el cual contiene: (Malaviya et al, 2012)

Contenido (g/L) Componente0.750 K2HPO4

0.750 KH2PO4

0.700 MgSO4*7H2O0.017 MnSO4*5H2O0.010 L FeSO4*7H2O2.000 (NH4)2SO4

1.000 NaCl2.000 Asparagine0.004 Ácido p-aminobenzoico5.000 Extracto de levadura

La fermentación se lleva a cabo en un proceso batch, en donde el biorreactor contiene 1.8 L de CGM suplementado con 80 g/L de glicerol. (Malaviya et al, 2012)

Se inocula 2 mL del cultivo de C. pasteurianum en un tubo de ensayo con 20mL de CGM. El pre inóculo se deja crecer hasta un OD600 de aproximadamente 2.5 y debe transferirse a un beaker de 500mL, con 200mL de CGM para preparación de cultivo. El cultivo se inocula en el biorreactor cuando el OD600 alcanza 3.5. (Malaviya et al, 2012)

Durante la fase acidogénica, el pH se controla a un valor de 4.5 ó 4.8 utilizando una solución de amoníaco. (Malaviya et al, 2012)

La velocidad de agitación se controla a 100 rpm. El fermentador se purga continuamente con gas N2 después de pasar por una trampa de oxígeno durante todo el período de fermentación. (Malaviya et al, 2012)

Se coloca un filtro HEPA de 0.2 mm en la entrada de la línea de gas del fermentador para mantener una condición estéril. (Malaviya et al, 2012)

La temperatura debe mantenerse alrededor de 37 oC, puede realizarse por medio de un enchaquetado con agua. El pH después de la fase acidogénica en la fermentación se mantiene a un valor de 6, puede realizarse por medio de adición de KOH en solución 1 M. (Olshoj et al, 2011)

Cuando se utiliza como fuente de carbono residuo de mazorca de maíz y microorganismo Clostridium beijerinckii, las condiciones en el fermentador deben ser temperatura a 37 oC, con una agitación de 120 rpm. Después de la hidrólisis enzimática el pH debe ser ajustado a 6.8, puede realizarse con solución de KOH. El tiempo de fermentación es de aproximadamente 96 horas. (Zhang et al, 2012)

8. Rendimiento de los procesos de producción de butanol por medio de procesos de fermentación.

El butanol (alcohol butílico o 1-butanol) es un alcohol primario constituido por 4 carbonos cuya formula es C4H10O; es un liquido que no tiene color, es inflamable con un caracteristico, su vapor irrita las membranas mucosas produciendo un efecto narcotico a altas concentraciones. El butanol es miscible en solventes orgánicos comunes y parcialemente miscible en agua. (Lee, 2008)

Hasta el día de hoy, el butanol es considerado una mejor alternatico que el etanol como biocombustible ya que es menos corrosivo y menos soluble en agua que el etanol, por lo que lo hace un combustible mas adecuado para las maquinas de combustion interna utilizas actualmente en los automoviles (Keasling, 2008)

El primer reporte que existe en la literatura sobre la produccion biologica del 1-butanol fue escrita por Louis Pasteur en 1862, es hasta 1915 con la patente de Chaim Weizmann donde se describe una idea clara del proceso de fermentación butílica. Apenas 35 años despues, en 1950, el 66% del butanol utilizado en el mundo provenia de procesos fermentativos. En años posteriores la industria petroquimica tomaria casi la totalidad del mercado del butano produciendolo industrialmente mediante la reacción oxo del propileno, con el intermediario butiraldehído.

La produccion biologica del butanol ocurre naturalmente en algunas especies de microorganismos, como las bacterias Butyribacterium methylophicum, Clostridium butylicus o a la arquea Hyperthermus butylicus. Sin embargo, el género mas estudiado es el de Clostridium ya que son capaces de convertir diversas fuentes de carbono, como la glucosa,galactosa, celobiosa, manosa, xilosa y arabinosa, en combustibles y químicos como el butanol, acetona y etanol. (Ezeji, 2007)

Las cepas mas usadas para la fermentacion industrial ABE (acetona-butanol-etanol) son principalmente del género Clostridium: Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinkii, Clostridium saccharobutylicum y Clostridium saccharobutylacetonicum. Las especies de acetobutylicum y beijerinkii son adecuadas para la fermentación acetona- butanol a partir de maiz mientras que las saccharobutylicum y saccharobutylacetonicum utilizan melaza como sustrato (Ni & Sun, 2009).

Durante el proceso de producción de butanol con Clostridium se presenta, entre otros, un cambio fisiológico importante en la bacteria: los ácidos acético y butírico son liberados al medio durante la fase de crecimiento exponencial los cuales son reabsorbidos al interior de la célula, para ser metabolizados a butanol, acetona y, en mucho menor medida en etanol. Esto se debe a que C. acetobutylicum carece de homeostasis al nivel de pH, por lo que depende íntimamente del pH extracelular. La presencia de ácidos en el medio puede provocar una pérdida del potencial protónico de la célula, inactivándola.

El pH es muy importante durante la fermentación acetona-butanol, ya que la solventogénesis inicia con un pH bajo; sin embargo si éste se encuentra por debajo de 4.5 (antes de que se forme una cantidad suficiente de ácidos orgánicos), la solventogénesis será disminuida e improductiva. Una forma sencilla de incrementar el crecimiento, utilización de los carbohidratos así como la producción de butanol es incrementando la capacidad amortiguante del medio. Dependiendo de las condiciones de cultivo y el tipo de sustrato empleado, las fermentaciones tipo lote toman de 2 a 6 días en completarse, la concentración final total de solventes producidos alcanza de 12 a 20 g/L, los cuales pueden ser separados por destilación del medio de fermentación (Lee, 2008).

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