Buku Pelajaran dari Reseptor Farmakologi

BUKU

PELAJARAN

dari

RESEPTOR

FARMAKOLOGI

Edisi Kedua

Diedit oleh

John C. Foreman, D. Sc, FRCP

Departemen Farmakologi

University College London

Inggris Raya

Torben Johansen, MD

Departemen Fisiologi dan Farmakologi

University of Southern Denmark

Denmark

CRC PRESS

Boca Raton London New York Washington, DC

Library of Congress dalam Katalog KDT

Textbook reseptor farmakologi / diedit oleh John C. Foreman, Torben

Johansen. â € "

2nd ed.

p. cm.

Termasuk referensi bibliografi dan indeks.

ISBN 0-8493-1029-6 (alk. kertas)

1. Reseptor obat. I. Foreman, John C. II. Johansen, Torben.

RM301.41. T486 2003

615 '.7 â € "DC21

2002067406

Buku ini berisi informasi yang diperoleh dari sumber-sumber otentik dan

sangat dihormati. Materi dicetak ulang dikutip dengan izin, dan sumber

ditunjukkan. Berbagai referensi yang terdaftar. Upaya-upaya masih dilakukan

untuk mempublikasikan data yang dapat dipercaya dan informasi, tetapi penulis

dan penerbit tidak dapat bertanggung jawab atas keabsahan semua bahan atau

konsekuensi dari penggunaannya. Baik buku ini atau bagian apapun dapat

direproduksi atau ditransmisikan dalam bentuk apapun atau dengan cara apapun,

elektronik atau mekanik, termasuk fotokopi, microï ¬ lming, dan rekaman, atau

oleh penyimpanan informasi atau sistem pencarian, tanpa terlebih dahulu izin

tertulis dari penerbit. All rights reserved. Otorisasi untuk memfotokopi artikel

untuk keperluan internal atau pribadi, atau penggunaan pribadi atau internal speciï

klien, dapat diberikan oleh CRC Press LLC, asalkan $ 1,50 per halaman

difotokopi dibayarkan langsung kepada Copyright Clearance Pusat, 222

Rosewood Drive, Danvers, MA 01923 USA Biaya kode untuk pengguna Layanan

Pelaporan Transaksional adalah ISBN 0-8493-1029-6/03 / $ 0,00 + $ 1,50. Biaya

dapat berubah tanpa pemberitahuan. Untuk organisasi yang telah diberikan lisensi

fotokopi oleh CCC, sistem pembayaran yang terpisah telah diatur. Persetujuan

dari CRC Press LLC tidak memperpanjang untuk menyalin untuk distribusi

umum, untuk promosi, untuk membuat karya-karya baru, atau untuk dijual

kembali. Harus mendapat ijin tertulis dari CRC Press LLC untuk menyalin

tersebut. Langsung semua pertanyaan untuk CRC Press LLC, 2000 NW Corporate

Blvd., Boca Raton, Florida 33431.

Pemberitahuan Merek: Produk atau nama perusahaan mungkin merupakan

merek dagang atau merek dagang terdaftar, dan hanya digunakan untuk

identifïkasi dan penjelasan, tanpa ada maksud untuk melanggar.

Kunjungi CRC Press situs Web di www.crcpress.com

© 2003 oleh CRC Press LLC

Tidak ada klaim Pemerintah AS asli bekerja

International Standard Book Number 0-8493-1029-6

Perpustakaan Kongres Kartu Nomor 2002067406

Dicetak di Amerika Serikat 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0

Dicetak di atas kertas bebas asam

Kata pengantar

Selama sekitar empat dekade sekarang, kursus di reseptor farmakologi telah

diberikan di University College London untuk mahasiswa di mereka ï ¬ nal tahun

penelitian untuk gelar Bachelor of Science dalam farmakologi. Baru-baru ini, tentu saja

juga telah diambil oleh siswa membaca untuk Sarjana yang of Science di bidang kimia

obat. Para siswa mengikuti kursus telah mengandalkan untuk mereka membaca pada

berbagai sumber, termasuk surat-surat asli, ulasan, dan berbagai buku teks, tetapi tidak

ada teks tunggal dibawa bersama materi termasuk dalam kursus tersebut. Juga, hampir

terus-menerus sejak Program 1993, kami telah diselenggarakan untuk mahasiswa

pascasarjana dan pekerja riset dari pharmaceu- industri vertikal dari negara negara Nordik

dan Eropa. Dalam banyak kasus, murah hati ï ¬ dukungan keuangan dari Akademi

Penelitian Denmark dan Penelitian Nordic Academy telah membuat ini mungkin. Kursus-

kursus ini juga didasarkan pada surat bagi mahasiswa di University College London, dan

kami berterima kasih atas kritik konstruktif dari banyak siswa pada semua program studi

yang telah membentuk buku ini.

Edisi pertama buku yang disediakan teks tunggal untuk siswa, dan antusiasme

dengan yang diterima mendorong kami untuk bekerja pada edisi kedua. Ada sangat signiï

¬ bisa langkah maju sejak edisi pertama buku ini, terutama dalam biologi molekuler

reseptor. Kemajuan ini REI ¬, ected dalam bab-bab ditulis ulang untuk bagian buku ini

yang berhubungan dengan biologi molekuler. Pada saat yang sama, kami menyadari

bahwa dalam edisi pertama terlebih dulu kita termasuk terlalu banyak materi yang jauh

dari reseptor sendiri. Untuk memasukkan semua biologi seluler yang konsekuen pada

aktivasi reseptor benar-benar di luar cakupan buku apa pun. Oleh karena itu, kita harus

dihilangkan dari edisi kedua bahan di messenger intraseluler kedua seperti kalsium,

nukleotida siklik, dan fosfolipid. Edisi kedua sekarang berkonsentrasi pada membran sel

reseptor sendiri, bersama-sama dengan sinyal langsung mereka transduser: saluran ion,

heterotrimeric G-protein, dan tirosin kinase.

Para penulis bab-bab dalam buku ini telah terlibat aktif dalam mengajar berbagai

kursus, dan tujuan bersama kami telah memberikan pengenalan logis untuk mempelajari

reseptor obat. Karakterisasi reseptor obat melibatkan sejumlah pendekatan yang berbeda:

deskripsi kuantitatif ion dari studi fungsional dengan agonis dan antagonis, deskripsi

kuantitatif mengikat ligan untuk reseptor, struktur molekul reseptor obat, dan unsur-unsur

yang mentransduksi sinyal dari reseptor teraktivasi ke kompartemen intraseluler.

Buku ini dimaksudkan sebagai teks pengantar pada reseptor farmakologi tetapi

bacaan lebih lanjut memiliki telah disediakan bagi mereka yang ingin menindaklanjuti

topik. Beberapa masalah juga disediakan untuk pembaca untuk menguji pemahaman

mereka tentang materi dalam beberapa bab.

John C. Foreman

Torben Johansen

Para Editor

John C. Foreman, B.Sc., Ph.D., D. Sc, MB, BS, FRCP, adalah Profesor

imunofarmakologi di University College London. Dia juga telah menjadi Visiting Professor di

University of Southern Denmark, Odense, Denmark, dan University of Tasmania, Hobart,

Australia. Dr Foreman adalah Dekan Mahasiswa di University College London dan juga Wakil

Dekan Fakultas Ilmu. Dia Tutor Senior dari University College London 1989-1996 dan

Admissions Tutor Kedokteran 1982-1993. Dr Foreman dibuat sebagai Fellow dari University

College London Tahun 1993 dan menerima gelar Doctor of Science dari University of London

yang sama tahun. Dia terpilih untuk Fellowship dari Royal College of Physicians pada tahun

2001. Dr Foreman awalnya belajar kedokteran di University College London, tapi terputus

studinya di bidang kedokteran untuk mengambil yang B.Sc. dan Ph.D. dalam farmakologi sebelum

kembali untuk menyelesaikan derajat kesehatan, MB, BS, yang ia peroleh pada tahun

1976. Setelah magang di Rumah Sakit Distrik Peterborough, ia menghabiskan dua tahun sebagai

Visiting Instruktur Kedokteran, Divisi Clinical Immunology, Johns Hopkins University Sekolah

Kedokteran, Baltimore, MD. Dia kemudian kembali ke University College London, di mana ia

tetap pada staf permanen.

Dr Foreman adalah anggota dari Farmakologi Masyarakat Inggris dan Physiological

Society dan menjabat sebagai editor dari British Journal of Farmakologi 1980-1987 dan lagi dari

1997-2000. Ia telah menjadi associate editor imunofarmakologi dan merupakan anggota dari

dewan redaksi INI ¬, ammation Penelitian dan Farmakologi dan Toksikologi. Dr Foreman

memiliki disajikan lebih dari 70 diundang ceramah di seluruh dunia. Dia adalah co-editor

dari Textbook of Immuno-farmakologi, sekarang dalam edisi ketiga, dan telah menerbitkan sekitar

170 makalah penelitian, serta ulasan dan kontribusi ke buku-buku. Kepentingan penelitian

utamanya saat ini meliputi bradikinin reseptor dalam saluran pernafasan manusia hidung,

mekanisme aktivasi sel dendritik, dan kontrol sirkulasi mikrovaskular pada kulit manusia.

Torben Johansen, MD, dr. med., adalah Docent Farmakologi, Departemen Fisiologi dan

Farmakologi, Institut Biologi Kedokteran, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Southern

Denmark. Dr Johansen memperoleh gelar MD pada tahun 1970 dari University of Copenhagen,

menjadi seorang peneliti di Departemen Farmakologi dari Odense University di tahun 1970, dosen

pada tahun 1972, dan dosen senior pada tahun 1974. Sejak 1990, ia telah Docent

Farmakologi. Pada tahun 1979, ia adalah sesama penelitian mengunjungi selama tiga bulan di

Departemen Klinis Universitas Pharma-cology, Oxford University, dan pada tahun 1998 dan 2001

ia adalah seorang peneliti tamu di Departemen Farmakologi, Universitas College London. Pada

tahun 1980, ia melakukan magang di bidang ilmu kedokteran dan bedah di Odense University

Hospital. Dia memperoleh gelar Dr Med. Sci. pada tahun 1988 dari Odense University. Dr

Johansen adalah anggota dari Farmakologi Masyarakat Inggris, Fisiologis Society, Masyarakat

Skandinavia Fisiologi, Denmark Medical Association, Denmark Farmakologi Masyarakat,

Denmark Society for Farmakologi Klinik, dan Denmark Society for Hipertensi. Dia telah

menerbitkan 70 makalah penelitian dalam jurnal wasit. Kepentingan penelitian utamanya saat ini

Reseptor NMDA dalam substantia nigra dalam kaitannya dengan kematian sel dalam Parkinsonâ €

™ s penyakit dan juga ion transportasi dan sinyal dalam sel mast dalam kaitannya dengan pH

intraseluler dan regulasi volume.

Kontributor

Sir James W. Black, Nobel Laureate,

James Hitam Yayasan

London, Inggris Raya

David A. Brown, FRS




Jan Egebjerg, Ph.D.

Aarhus University


Aarhus, Denmark

Steen Gammeltoft, MD

Departemen Biokimia Klinis

Rumah Sakit Glostrup

Glostrup, Denmark

Alasdair J. Gibb, Ph.D.



Dennis G. Haylett, Ph.D. FRS Departemen Farmakologi

University College London London, Inggris Raya

Birgitte Holst Departemen Farmakologi University of Copenhagen Panum Institute Copenhagen, Denmark

Donald H. Jenkinson, Ph.D. Departemen Molekuler dan

Struktural Departemen Farmakologi Biologi University College London

IJsbrand Kramer, Ph.D. Bagian Biologi Molekuler dan

Seluler Eropa Institut Kimia dan Biologi Universitas Bordeaux 1 Talence, Prancis

Thue W. Schwartz, MD Departemen Farmakologi University of Copenhagen Panum Institute

Copenhagen, Denmark

Isi

Bagian I: Drugâ € "Interaksi Reseptor

Bab 1

Pendekatan klasik untuk Studi Drugâ € "Interaksi Reseptor ....................................... ..........3

Donald H. Jenkinson

Bagian II: Struktur Molekul dari Reseptor

Bab 2

Struktur Molekul dan Fungsi 7tm G-Protein-Coupled Reseptor ......................................... 81

Thue W. Schwartz dan Birgitte Holst

Bab 3

Struktur Ligan-Gated Saluran Ion ............................................... ..................................... 111

Jan Egebjerg

Bab 4

Struktur Molekul Reseptor Tirosin Kinase ............................................ ................ .......... 131

Steen Gammeltoft

Bagian III: Studi Ligan-Pengikatan Reseptor

Bab 5

Pengukuran langsung Obat Mengikat Reseptor ........................................... .................... 153

Dennis G. Haylett

Bagian IV: Transduksi Sinyal Reseptor

Bab 6

Reseptor Terkait dengan Ion Channels: Mekanisme Aktivasi dan Blok ........................... 183

Alasdair J. Gibb

Bab 7

G-Proteins..................................................................................................................... ........................213

David A. Brown

Bab 8

Transduksi sinyal melalui Protein Kinase Tirosin ............................................ ............... 237

IJsbrand Kramer

Bagian V: Reseptor sebagai Target Farmasi

Bab 9

Reseptor sebagai Farmasi........................................................................................................271

James W. Hitam

INDEX

............................................................................................................................. .......................................

279

CHAPTER 1

CLASSICAL APPROACHES TO THE STUDY OF DRUG-RECEPTOR

INTERACTIONS

PENDEKATAN KLASIK UNTUK KAJIAN INTERAKSI OBAT-

RESEPTOR

1.1 INTRODUCTION

The term (ISTILAH)

Reseptor digunakan dalam farmakologi untuk menunjukkan kelas

makromolekul seluler yang bersangkutan secara khusus dan langsung dengan

sinyal kimia antara dan di dalam sel. Kombinasi hormon, neurotransmitter, atau

utusan intraseluler dengan reseptor (s) hasil dalam perubahan aktivitas selular.

Oleh karena itu, reseptor tidak hanya harus mengenali molekul tertentu yang

mengaktifkannya, tetapi juga, ketika pengakuan terjadi, mengubah fungsi sel

dengan menyebabkan, misalnya, perubahan dalam permeabilitas membran atau

perubahan dalam transkripsi gen/ gen turunan.

Konsep ini memiliki sejarah panjang. Manusia selalu tertarik dengan

kemampuan luar biasa dari hewan untuk membedakan zat yang berbeda dengan

mencicipi dan mencium/mengendus.Tertulis sekitar abad 50 SM, Lucretius (di

De Rerum Natura, Liber IV) berspekulasi bahwa bau dapat disampaikan oleh hal

kecil, "benih" tak terlihat dengan bentuk tersendiri yang harus masuk ke sela

"ruang dan bagian-bagian" dalam langit-langit mulut dan lubang hidung. Dalam

kata-katanya:

Beberapa pastinya lebih kecil, beberapa lebih besar, mereka bisa jadi

segitiga untuk beberapa makhluk, persegi untuk orang lain, banyak bundar, dan

beberapa banyak sudut dalam banyak cara.

Prinsip yang sama saling melengkapi antara zat dan pengakuan keberadaan

mereka yang tersirat dalam prediksi John Locke dalam Essay Concerning Human

Understanding (1690):

Apakah kita tapi tahu mekanisme afeksi dari partikel rhubarb, hemlock,

opium dan seorang pria, sebagai pembuat jam apakah orang itu terbuat dari jam,

... kita harus bisa memberitahu sebelumnya bahwa rhubarb akan membersihkan,

hemlock membunuh dan opium membuat pria tidur .

(Di sini, mekanisme afeksi bisa diganti dalam penggunaan saat ini oleh pertalian

kimia.)

Mengetahui apa yg terjadi sebagaimana mereka seharusnya, ide-ide awal ini

hanya bisa diambil lebih lanjut, pada awal abad ke-19, ini menjadi mungkin untuk

memisahkan dan memurnikan masing-masing komponen bahan asli dari tanaman

dan hewan. Terkesan sederhana namun teknik canggih dari kristalisasi fraksional

memungkinkan alkaloid tanaman seperti nikotin, atropin, pilocarpine, strychnine,

dan morfin untuk diperoleh dalam bentuk murni untuk pertama kalinya. Dampak

pada biologi adalah langsung dan jauh jangkauannya, untuk zat ini terbukti

menjadi alat yang berharga untuk mengungkap fungsi fisiologis. Untuk

mengambil satu contoh, JN Langley membuat penggunaan besar kemampuan

nikotin untuk mengaktifkan terlebih dahulu dan kemudian memblokir saraf yang

berasal di ganglia otonom. Hal ini memungkinkan dia untuk memetakan distribusi

dan divisi sistem saraf otonom.

Langley yang juga mempelajari tindakan atropin dan pilocarpine, dan pada

tahun 1878 ia menerbitkan (dalam volume pertama dari Journal of Physiology,

yang ia dirikan) penjelasan tentang interaksi antara pilocarpine (yang

menyebabkan salvias/keluar air liur) dan atropin (yang menghambat tindakan

pilocarpine ini). Memantapkan dan memperluas karya perintis Heidenhain dan

Luchsinger, Langley menunjukkan bahwa tindakan menghambat yang dilakukan

oleh atropin dapat diatasi dengan meningkatkan dosis pilocarpine. Selain itu,

respon yang dikembalikan ke pilocarpine pada gilirannya bisa dihapuskan oleh

atropin selanjutnya. Mengomentari hasil ini, Langley menulis:

Ŗsaya pikir, tanpa terlalu terburu-buru, Kita mungkin menganggap bahwa ada

beberapa bahan atau zat di ujung saraf atau [saliva] sel kelenjar baik oleh atropin

dan pilocarpine yang mampu membentuk senyawa. Pada asumsi ini, maka,

senyawa atropin atau pilocarpine dibentuk menurut beberapa hukum di mana

relatif massa dan kesamaan kimia mereka untuk substansinya adalah faktornya.ŗ

Jika kita mengganti massal dengan konsentrasi, kalimat kedua dapat

berfungsi sebaik sekarang seperti yang tertulis, meskipun hakikat hukum yang

telah disimpulkan oleh Langley harus ada dan bukanlah untuk dirumuskan

(dalam konteks ilmu farmasi) sampai hampir 60 tahun kemudian. Hal ini

dipertimbangkan dalam Section1.5.2 bawah.

JN Langley mempertahankan ketertarikannya pada aksi alkaloid tanaman

sepanjang hidupnya. Melalui karyanya dengan nikotin (yang dapat mengkontraksi

otot rangka) dan curare (yang menghapuskan tindakan nikotin ini dan juga

menghambat respon otot untuk stimulasi saraf, seperti pertama kali ditunjukkan

oleh Claude Bernard), ia mampu menyimpulkan pada tahun 1905 bahwa otot

harus memiliki "zat menerima/reseptif":

Karena dalam keadaan normal baik nikotin dan curari menghapuskan efek

stimulasi saraf, tetapi tidak mencegah kontraksi dari yang diperoleh oleh stimulasi

otot langsung atau dengan injeksi yang memadai nikotin selanjutnya, dapat

disimpulkan bahwa baik racun maupun saraf impuls tidak bekerja secara langsung

pada substansi kontraktil otot tetapi pada beberapa substansi tambahan. Karena

substansi tambahan ini adalah penerima rangsangan yang mentransfer ke bahan

kontraktil, kita dapat menyebut hal itu sebagai subtansi reseptif otot.

Pada saat yang sama, Paul Ehrlich, yang bekerja di Frankfurt, telah

mencapai kesimpulan yang sama, meskipun dari bukti yang cukup berbeda. Dia

adalah yang pertama yang membuat kajian menyeluruh dan sistematis tentang

hubungan antara struktur kimia dari molekul organik dan tindakan biologis

mereka. Hal ini dimanfaatkan dengan baik dalam kerjasama dengan kimiawan

organik A. Bertheim. Bersama-sama, mereka menyiapkan dan menguji lebih dari

600 senyawa organologam dilengkapi dengan merkuri dan arsen.

Di antara hasilnya adalah pengenalannya ke kedokteran tentang obat-obatan

seperti misalnya Salvarsan yang beracun bagi mikroorganisme patogen yang

bertanggung jawab untuk sifilis, pada dosis yang memiliki efek samping yang

relatif kecil pada manusia. Ehrlich juga meneliti seleksi pewarnaan sel dengan zat

pewarna serta tindakan sangat kuat dan spesifik dari racun bakteri. Semua studi

ini meyakinkannya bahwa molekul biologis aktif harus terikat untuk menjadi

efektif, dan setelah perubahan waktu ia menyatakan ini dengan rapi dalam bahasa

Latin:

Corpora non agunt nisi fixata.*

In Ehrlichřs words (Collected Papers, Vol. III,Chemotherapy):

Dengan kata Ehrlich (Collected Papers, Vol III, Kemoterapi.):

Ketika racun dan organ sensitif pada hal itu tidak datang untuk melakukan kontak,

atau ketika kepekaan organ tidak ada, tidak akan ada tindakan. Jika kita berasumsi

bahwa keanehan dari toksin itu yang menyebabkan distribusi mereka

dilokalisasikan ke dalam kelompok khusus dari molekul toksin dan kekuatan

organ dan jaringan untuk bereaksi dengan racun terlokalisasi dalam kelompok

khusus protoplasma, kita sampai pada dasar teori sisi rantai saya. Kelompok

distributif toksin yang saya sebut "kelompok haptophore" dan organ kimia sesuai

protoplasma sebagai 'reseptor.' ... Tindakan Beracun hanya dapat terjadi bila

reseptor dipasang untuk jangkar dari racun yang hadir.

Saat ini, sudah diakui bahwa Langley dan Ehrlich layak menerima

penghargaan sebanding untuk pengenalan konsep reseptor ini. Di tahun yang

sama, ahli biokimia mempelajari hubungan antara konsentrasi substrat dan

kecepatan enzim juga datang untuk berpikir bahwa molekul enzim harus memiliki

sebuah "tempat aktif" yang mendiskriminasikan antara berbagai substrat dan

inhibitor. Seperti yang sering terjadi, untaian bukti yang berbeda telah berkumpul

untuk menunjuk pada sebuah kesimpulan tunggal.

Akhirnya, perlu dicatat ada dua pengertian yang mana para ahli farmakologi

masa kini dan ahli biokimia menggunakan reseptor istilah Pengertian pertama,

seperti dalam kalimat pembukaan bab ini, adalah mengacu pada keseluruhan

reseptor makromolekul yang mengangkut tempat pengikatan agonis. Penggunaan

ini menjadi umum sebagai teknik biologi molekuler yang mengungkapkan urutan

asam amino dan makromolekul sinyal yang lebih banyak. Tapi, para ahli

farmakologi terkadang masih menggunakan istilah reseptor ketika mereka hanya

memikirkan daerah tertentu dari makromolekul yang bersangkutan dalam

pengikatan agonis dan antagonis molekul. Oleh karena itu, reseptor okupansi

sering digunakan sebagai singkatan nyaman bagi sebagian kecil dari tempat

pengikatan yang ditempati oleh ligan. **

1.2 PEMODELAN HUBUNGAN ANTARA KONSENTRASI AGONIS

DAN JARINGAN RESPON

Dengan konsep dari pembentukan reseptor, para ahli farmakologi kemudian

mengalihkan perhatian mereka untuk memahami hubungan kuantitatif antara

konsentrasi obat dan respon suatu jaringan. Ini mensyaratkan, pertama, mencari

tahu bagaimana fraksi tempat pengikatan diduduki dan diaktifkan oleh molekul

agonis yang bervariasi dengan konsentrasi agonis, dan, kedua, memahami

ketergantungan atas besarnya respon yang diamati pada tingkat aktivasi reseptor.

Saat ini, pertanyaan pertama kadang-kadang dapat dipelajari secara

langsung menggunakan teknik yang dijelaskan dalam bab-bab selanjutnya, tapi ini

bukanlah pilihan untuk para ahli farmakologi saat ini. Juga, satu-satunya

tanggapan yang kemudian bisa diukur (misalnya, kontraksi bagian otot polos yang

utuh atau perubahan dalam laju denyut jantung) yang tidak langsung, dalam arti

bahwa banyak kegiatan sel yang terletak di antara langkah awal (aktivasi dari

reseptor) dan respon yang diamati. Untuk alasan ini, para pekerjanya saat ini tidak

punya pilihan selain untuk merancang pendekatan tidak langsung yang cerdik,

beberapa di antaranya masih penting. Ini didasarkan pada "model" (yaitu,

membuat asumsi tertentu tentang) dua hubungan yang disebutkan di atas dan

kemudian membandingkan prediksi model dengan perilaku aktual dari jaringan

yang terisolasi. Ini sekarang akan digambarkan.

1.2.1 Hubungan Antara Konsentrasi Ligan dan Reseptor Okupansi

Kita mulai dengan kemungkinan representasi paling sederhana dari

kombinasi suatu ligan, A, dengan tempat pengikatan pada reseptor, R:

Di sini, pengikatan dianggap sebagai reaksi biomolekuler dan k +1 dan k-1

masing masing adalah tingkat penghubungan konstan (M-1 s-1) dan tingkat

pemisahan konstan (s-1).

Hukum aksi massa menyatakan bahwa laju reaksi sebanding dengan produk

dari konsentrasi reaktan. Kami akan menerapkannya ke skema sederhana ini,

membuat asumsi bahwa keseimbangan telah tercapai sehingga tingkat di mana

AR terbentuk dari A dan R adalah sama dengan tingkat di mana AR terpisahkan.

Hal ini memberikan:

di mana [R] dan [AR] menunjukkan konsentrasi reseptor di mana tempat

pengikatan untuk A bebas dan ditempati, masing-masing.

Ini mungkin tampak aneh untuk merujuk pada konsentrasi reseptor dalam

konteks ini ketika reseptor seringkali dapat bergerak hanya pada bidang membran

(dan bahkan kemudian mungkin tidak lebih dari batas tertentu, karena banyak

jenis reseptor yang berlabuh). Tetapi, model ini dapat dirumuskan sama baiknya

dalam hal proporsi populasi tempat pengikatan baik yang kosong atau yang

ditempati oleh suatu ligan. Jika kita mendefinisikan pR sebagai proporsi bebas, *

sama dengan [R] / [R] T, di mana [R] T menunjukkan konsentrasi total reseptor,

dan pAR sebagai [AR] / [R] T, kita memiliki:

Karena untuk saat ini kita hanya konsentrasi dengan kondisi kesetimbangan

dan tidak dengan tingkat di mana kesetimbangan tercapai, kita bisa

menggabungkan k +1 dan k-1 untuk membentuk sebuah konstanta baru, KA = k-1

/ k +1, yang memiliki unit konsentrasi. KA adalah konstanta kesetimbangan

disosiasi (lihat Lampiran 1.2A [Bagian 1.2.4.1]), meskipun hal ini sering disingkat

baik konstanta kesetimbangan pemisahan atau konstan. Mengganti k +1 dan k-1

memberikan:

Karena tempat pengikatan tersebut adalah kosong atau ditempati, kita bisa

menulis:

Menggantikan pR:

Oleh karena itu, *

Ini adalah persamaan penting Hill-Langmuir. AV Hill adalah yang pertama

(pada tahun 1909) untuk menerapkan hukum aksi massa dengan hubungan antara

lig dan konsentrasi dan reseptor okupansi pada kesetimbangan dan tingkat di

mana keseimbangan ini didekati. ** The fisik kimia I. Langmuir menunjukkan

beberapa tahun kemudian bahwa persamaan yang sama (Langmuir adsorpsi

isotermal) berlaku untuk adsorpsi gas pada permukaan (misalnya, dari logam atau

arang).

Dalam menurunkan persamaan. (1.2), kita telah mengasumsikan bahwa

konsentrasi A tidak berubah sebagai ligan reseptor kompleks yang terbentuk.

Akibatnya, ligan dianggap hadir dalam kelebihan tersebut sedemikian rupa

sehingga hampir habis oleh kombinasi sebagian kecilnya dengan reseptor,

sehingga [A] dapat dianggap sebagai konstan.

Hubungan antara nominal dan [A] diprediksi oleh Persamaan. (1.2)

diilustrasikan pada Gambar 1.1. Konsentrasi A telah direncanakan menggunakan

linier (kiri) dan skala logaritmik (kanan). Nilai KA telah diambil menjadi 1 M.

Catatan dari Persamaan. (1.2) bahwa ketika [A] = KA, Par = 0.5; yaitu, setengah

dari reseptor yang ditempati.

Dengan skala logaritma, kemiringan garis awalnya meningkat. Kurva

memiliki bentuk memanjang dan S dikatakan sigmoidal. Sebaliknya, dengan

(aritmatika) skala linier untuk [A], sigmoidisitas tidak diamati, kemiringan

menurun sebagai [A] meningkat, dan kurva merupakan bagian dari hiperbola

persegi panjang.

GAMBAR 1.1 Hubungan antara tempat pengikatan yang ditempati dan

konsentrasi ligan ([A], skala linear, kiri, skala log, kanan), seperti yang

diperkirakan oleh persamaan Hill-Langmuir. KA telah diambil menjadi 1 M untuk

kedua kurva.

Persamaan (1.2) dapat diatur kembali ke:

Dengan Mengambil log, kita memiliki:

Oleh karena itu, plot log (par / (1 - Par)) terhadap log [A] harus memberikan garis

lurus dengan kemiringan satu.

Grafik seperti ini digambarkan sebagai alur Hill, lagi setelah AV Hill, yang

pertama untuk menggunakannya, dan ini sering digunakan ketika pAR diukur

langsung dengan ligan radiolabeled (lihat Bab 5). Dalam prakteknya, kemiringan

garis tidak selalu satu kesatuan atau bahkan konstan, seperti yang akan dibahas.

Hal ini disebut sebagai koefisien Hill (NH); Istilah kemiringan Hill/ Hill slope

juga digunakan.

1.2.2 Hubungan Antara Reseptor Okupansi Dan Respon Jaringan

Ini adalah yang kedua dari dua pertanyaan yang diidentifikasi pada awal

Bagian 1.2, di mana itu dicatat bahwa para ahli farmakologi yang paling awal

tidak punya pilihan selain menggunakan metode tidak langsung dalam upaya

mereka untuk menjelaskan hubungan antara konsentrasi obat dan respon jaringan

yang muncul daripadanya. Pada waktu itu dengan tidak adanya setiap sarana

untuk memperoleh bukti langsung mengenai hal ini, AV Hill dan AJ Clark

menjelajahi konsekuensi asumsi: (1) bahwa hukum aksi massa berlaku, sehingga

Pers. (1.2), yang diturunkan di atas, berlaku, dan (2) bahwa respon dari jaringan

linear terkait dengan reseptor okupansi. Clark melangkah lebih jauh dan membuat

asumsi sementara bahwa hubungan mungkin menjadi salah satu proporsionalitas

langsung (meskipun ia sangat menyadari bahwa ini adalah hampir pasti terlalu

menyederhanakan, seperti yang kita ketahui biasanya).

Harus ada proporsionalitas langsung, dan menggunakan y untuk

menunjukkan respon dari sebuah jaringan (dinyatakan sebagai persentase dari

respon maksimum dicapai dengan konsentrasi besar agonis), hubungan antara

okupansi * dan respon menjadi:

Menggabungkan ini dengan Persamaan. (1.2) memberikan ekspresi yang

memprediksi hubungan antara konsentrasi agonis dan respon dihasilkannya:

Hal ini sering diatur ulang ke:

Mengambil log,

Penerapan ungkapan ini (. Dan dengan implikasi Persamaan (1.4)) dapat

diuji dengan mengukur serangkaian respon (y) dengan konsentrasi yang berbeda

dari A dan kemudian menaruh log (y / (100 - y)) terhadap log [A] (plot Hill). Jika

Persamaan (1.4) berlaku, garis lurus dengan kemiringan 1 harus diperoleh. Juga,

adalah dasar asumsi harus benar, nilai perpotongan dari garis pada absis (yaitu,

ketika respon adalah setengah maksimal) akan memberikan perkiraan KA. AJ

Clark adalah yang pertama untuk menguji ini dengan menggunakan respon

jaringan yang terisolasi, dan Gambar 1.2 menggambarkan beberapa hasil. Gambar

1.2A menunjukkan bahwa Pers. (1.4) menyediakan nilai-nilai eksperimental yang

cukup cocok.

Juga, kemiringan Hill plot pada Gambar 1.2b yang dekat dengan penyatuan

(0.9 serambi katak, 0.8 rektus abdominis). Sementara temuan ini sesuai dengan

model sederhana yang telah digariskan, mereka tidak cukup membuktikan bahwa

itu benar. Memang, kemudian penelitian dengan serangkaian jaringan yang lebih

luas telah menunjukkan bahwa banyak hubungan respon konsentrasi- tidak dapat

dipasangkan oleh Persamaan. (1.4). Sebagai contoh, koefisien Hill adalah hampir

selalu lebih besar daripada kesatuan untuk respon dimediasi oleh saluran ion

ligand-gated (lihat Lampiran 1.2c [Bagian 1.2.4.3] dan Bab 6). Terlebih lagi,

sekarang diketahui bahwa dengan banyak jaringan respon maksimal (misalnya,

kontraksi otot polos pencernaan) dapat terjadi ketika agonis seperti asetilkolin

menempati kurang dari sepersepuluh dari reseptor yang tersedia, daripada mereka

semua seperti didalilkan dalam Pers. (1.3). Dengan cara yang sama, ketika agonis

diterapkan pada konsentrasi (biasanya disebut [A] 50 atau EC50) yang diperlukan

untuk menghasilkan respon setengah-maksimal, reseptor okupansi mungkin

sesedikit 1% di beberapa dari jaringan, * daripada 50% diharapkan jika respon

berbanding lurus dengan okupansi. Sebuah komplikasi tambahan adalah bahwa

banyak jaringan mengandung enzim (misalnya, cholinesterase) atau proses

serapan (misalnya, untuk noradrenalin) di mana agonis adalah substrat. Karena

itu, konsentrasi agonis di daerah bagian dalam dari jaringan yang terisolasi

mungkin jauh sangat kurang dari yang ada dalam larutan eksternal.

Oleh karena itu ahli farmakologi harus meninggalkan (kadang-kadang agak

enggan dan terlambat) tidak hanya usaha mereka untuk menjelaskan bentuk kurva

dosis-respons dari jaringan yang kompleks dari segi model sederhana yang

terlebih dahulu dieksplorasi oleh Clark dan dengan Hill, tetapi juga harapan

bahwa nilai konsentrasi agonis yang memberikan respon setengah-maksimal

mungkin memberikan bahkan perkiraan jumlah KA. Namun demikian, sebagai

hasil kerja Clark menunjukkan, hubungan antara konsentrasi agonis dan respon

jaringan umumnya memiliki bentuk umum yang sama ditunjukkan pada Gambar

1.1. Sehubungan dengan hal ini, kurva konsentrasi-respon sering dapat dijelaskan

secara empiris, dan setidaknya untuk pendekatan pertama, dengan ungkapan

sederhana:

Hal ini biasanya digambarkan sebagai persamaan Hill (lihat juga Lampiran

1.2c [Bagian 1.2.4.3]). Di sini, nH sekali lagi adalah koefisien Hill, dan y dan

ymax masing-masing adalah, respon yang diamati dan respon maksimum

konsentrasi besar dari agonis, A. [A] 50 adalah konsentrasi A di mana y adalah

setengah maksimal. Karena ini adalah konstan untuk hubungan konsentrasi-

respon yang diberikan, kadang-kadang dilambangkan dengan K. Sementara ini

aljabar yang lebih rapi (dan merupakan simbol yang digunakan oleh Hill), harus

diingat bahwa K dalam konteks ini tidak selalu sesuai dengan suatu konstanta

kesetimbangan. Memanfaatkan [A] 50 daripada K dalam Pers. (1.6) membantu

untuk mengingatkan kita bahwa hubungan antara

[A] dan respon di sini jadi digambarkan daripada dijelaskan dalam kerangka

model tindakan reseptor. Ini merupakan perbedaan penting.

Di mana K adalah konstanta kesetimbangan disosiasi. Oleh karena itu, plot

Bukit akan menjadi garis lurus dengan kemiringan n. Namun, model ini sangat

tidak mungkin untuk diterapkan. Kondisi ekstrim samping, beberapa contoh ada

reaksi kimia di mana tiga atau lebih molekul (misalnya, dua A dan satu R) harus

menggabungkan secara bersamaan. Penjelasan lain harus dicari. Salah satu

kemungkinan muncul ketika respon jaringan diukur secara tidak langsung, dalam

arti bahwa urutan peristiwa seluler link reseptor aktivasi respon yang akhirnya

diamati. Koefisien Bukit tidak mungkin kemudian menjadi kesatuan (atau bahkan)

konstan karena hubungan nonlinier dan variabel antara proporsi reseptor

diaktifkan dan satu atau lebih peristiwa yang mengikuti. Bahkan ketika itu adalah

mungkin untuk mengamati aktivasi reseptor secara langsung, koefisien Bukit

mungkin masih ditemukan tidak menjadi kesatuan. Hal ini telah dipelajari secara

rinci untuk saluran ion ligand-gated seperti reseptor nikotinat untuk

asetilkolin. Berikut aktivitas reseptor individu dapat diikuti karena terjadi dengan

mengukur arus kecil arus listrik melalui saluran ion intrinsik reseptor (lihat

Bagian 1.4.3 dan Bab 6). Pada menentukan hubungan antara respon ini dan

konsentrasi agonis, koefisien Hill diamati lebih besar dari kesatuan (khas 1,3-2)

dan berubah dengan konsentrasi agonis. Penjelasannya dapat ditemukan dalam

struktur kelas ini reseptor. Setiap makromolekul reseptor terdiri dari beberapa

(seringkali lima) subunit, yang kedua membawa situs mengikat untuk

agonis. Kedua situs tersebut harus ditempati untuk reseptor untuk menjadi aktif,

setidaknya dalam mode normal. Skema ini diperkenalkan dalam Bagian 1.2.3

kemudian harus dijabarkan:

Misalkan dua situs yang identik (terlalu menyederhanakan) dan bahwa pengikatan

pertama molekul agonis tidak mempengaruhi afinitas dari situs yang masih

kosong. Disosiasi konstan untuk setiap situs ekuilibrium dinotasikan

dengan K A dan konstanta kesetimbangan untuk isomerisasi antara A 2 R dan

A 2 R * oleh E, sehingga [A 2 R *] = E [A 2 R]. Proporsi reseptor dalam keadaan

aktif (A 2 R *) kemudian diberikan oleh:

Ini memprediksi Bukit petak nonlinier. Kemiringan akan berbeda dengan [A]

sesuai dengan:

Ketika [A] kecil dalam kaitannya dengan K A, n H mendekati 2. Namun,

seperti [A] meningkat, n H cenderung menuju persatuan. Pada skema yang sama,

jumlah A yang terikat (dinyatakan sebagai fraksi, p terikat, dari maksimum

mengikat bila [A] sangat besar, sehingga semua situs yang diduduki) diberikan

oleh:

Alur Hill untuk berikatan akan nonlinear dengan koefisien hill yang didapatkan

dari:

Ini mendekati gabungan jika [ A] sangat besar maupun sangat kecil. Di

antaranya, nH mungkin bisa sebanyak 2 untuk nilai-nilai E yang sangat besar.

Sangat penting bahwa ini harus demikian meskipun nilai afinitas untuk langkah

pengikatan pertama dan kedua diasumsikan memiliki nilai yang sama, jika hanya

terdapat beberapa isomerasi dari reseptor untuk menjadi bentuk aktif. ini di

karenakan proses isomerasi meningkatkan jumlah total pengikatan dengan

memindahkan equilibria dalam Pers. (1.9) menuju sebelah kanan Ŕ ini adalah arah

bentuk terikat dari reseptor.

Sekarang kami mempertimbangkan apa yang akan terjadi jika pengikatan

molekul agonis pertama mengubah afinitas dari tempat kedua yang teridentifikasi.

disosiasi equilibrium konstan untuk pengikatan pertama dan kedua akan ditandai

oleh KA(1) and KA(2), berturut-turut, dan E digambarkan sebagaimana

sebelumnya.

Proporsi dari reseptor dan bentuk aktif (A2R*) kemudian didapatkan dari:

dan koefisien hill nH akan menjadi :

Hubungan tersebut akan dijelaskan lebih jauh pada Chapter 6 (lihat Pers. (6.4) dan

(6.5)).

Menggunakan skema yang sama, nilai dari A terikat didapatkan dari:

Alur Hill sekali lagi akan nonlinear dengan koefisien hill yang didapatkan dari:

Ini mendekati gabungan jika [ A] sangat besar maupun sangat kecil. Di

antaranya, nH mungkin lebih besar (diatas 2) atau kurang dari 1, tergantung pada

magnitude dan E dan pada nilai relative dari KA(1) dan KA(2). Jika, untuk

sederhana, kita atur E hingga 0 dan jika KA(2) < KA(1), maka nH > 1, dan

terdapat juga pendapat yang mengatakan bahwa akan jadi cooperativas positif.

cooperativas negative akan terjadi jika KA(2) > KA(1) dan nH akan < 1. Hal ini

akan dijelaskan lebih dalam pada Chapter 5 dimana alur dari Pers. (1.14) dan

(1.15) ditunjukkan (Gambar 5.3) untuk range yang lebih luas dari rasio KA(1) to

KA(2), dan dengan E menjadi 0.

1.2.4.4 Appendix 1.2D: Logits, Persamaan Logistic, dan hubungannya

dengan alur Hill dan Persamaannya

Transformasi logit dari variable p didefenisikan sevagai berikut:

Berdasarkan persamaan diatas, dapat dilihat bahwa alur Hill merupakan alur

dari logit (p) berlawanan dari konsentrasi logaritma. (meskipun demikian alur Hill

lebih sering menggunakan logs dasar 10 dari pada dasar e).

Sebagai catatan penting, pembedaan antara Hill persamaan dan persamaan

logistic, yang mana merupakan formula pertama di abad 19, sebagai maksud dari

penjelasan meningkatnya populasi dari waktu ke waktu. didefenisikan dengan

persamaan:

Disederhanakan menjadi:

maka,

jika kita menggambarkan kembali a sebagai Ŕloge K, dan x sebagai loge z, maka

dimana hal diatas merupakan bentuk dari persamaan Hill (lihat Pers. (1.8a)).

bagaimana juga, sebagai catatan bahwa Pers. (1.17) akan diperoleh dari dari

Pers.(1.16) hanya dengan mentransformasikan sati variable. hal ini juga

menjelaskan bahwa term persamaan logistic (atau kurva) dan Persamaan Hill

tidak boleh dianggap dapat ditukarkan. Untuk menjelaskan perbedaan, jika

variable bebas dari setiap persamaan di set ke angka nol, variable bebas akan

menjadi 1/(1 + e–a) pada Pers. (1.16) sebagai perbandingan dengan nol pada Pers.

(1.17).

1.3 KURUN WAKTU PERUBAHAN PADA PEMILIKAN RESEPTOR

1.3.1 Pendahuluan

Pada awalnya, pendekatan yang paling sedehana untuk menentukan

seberapa cepat suatu obat berikatan dengan reseptornya dijadikan patokan untuk

mengukur seberapa tingkat dimana obat itu bekerja pada jaringan yang telah

terisolasi, tapi kemuadian muncul dua permasalahan. yang pertama adalah

hubungan yang pasti antara efek pada jaringan dan proporsi dari reseptor yang

berikatan dengan obat yang tidak dapat dengan mudah diperkirakan, sebagaimana

seperti yang terlihat. Setengah dari jaringan hanya akan merespon sebagian dari

pengikatan pada reseptor. Kita dapat mengambil sebuah contoh aksi dari agen

tubocurarine penghambat neuromuscular pada kontraksi yang merupakan hasil

dari stimulasi pada suplai saraf motor untukotot skeletal in vitro. Saraf Phrenic

tikus yang biasa diguanakan sebagai percobaan. Hal ini karena transisi

neuromuscular normalnya memiliki batas margin aman yang besar, respon

berlawanan pada stimulasi saraf akan mulai rusak hanya jika tubocurarine

berikatan pada lebih dari rata-rata 80% dari area pengikatan pada nicotinic

asetilkolin pada otot superficial jaringan otot. Jadi, ketika kedua jaringan otot

sebagiannya rusak itu merupakan amplitude inisial, pengikatan pada reseptor oleh

tubocurarine pada permukaan serat adalah lebih besar dari 50%.

Masalah kedua yaitu tingkat dimana suatu ligand bekerja pada jaringan

terisolasi yang ditentukan oleh difusi molekul ligan melalui jaringan daripada

ikatannya pada reseptor. Sekali lagi sebagai contoh pada aksi dari tubocurarine

pada diaphragm terisolasi, perkembangan yang lambat dari reflex penghambat

tidak setingkat dengan pengikatan reseptor tetapi lebih buruk dari transmisi

neuromuscular dalam sebuah peningkatan angka serat otot individual sebagai

lambatnya tubocurarine berdifusi diantara paket serat ke dalam persiapan interior.

Lebih dari itu, sebagai sebuah molekul ligan individual yang melewati jauh

kedalam jaringan, itu mungkin saja terikat atau tidak sementara waktu (dan untuk

periode tertentu) untuk area yang bevariasi (termasuk reseptor). Pengikatan yang

berulang ini dan disosiasinya dapat berlangsung lambat dalam masuk dan keluar

dari jaringan. untuk alas an tersebut, besaran kinetic kini sering digunkan dengan

sel terisolasi (e.g., neuron bebas atau serat otot) atau meskipun sebuah patch dari

preparasi membran sel dan menguji secara langsung tingkat dimana suatu

kecocokan radioligan dapat berikatan, atau bentuk disosiasi, reseptor yang dibawa

oleh membrane. Tugas kami selanjutnya adalah mempertimbangkan apa kinetic

pengikatan yang dapat diharapkan pada kondisi tersebut.

1.3.2 PENINGKATAN PADA PENGIKATAN RESEPTOR

Pada diskusi sebelumnya, kita membahas model sederhana untuk kombinasi

dari sebuah ligan dengan area pengikatannya yang telah dijelaskan pada subbab

1.2.1 (Pers. (1.1)). berdasarkan perkiraan sebelumnya bahwa hukum penerapan

massa, pada tingkat dimana pengikatan reseptor (pAR) berdasarkan waktu

didapatkan persamaan dari:

Dengan kata lain, pada tahap ini tingkat dari perubahan pengikatan

sederhananya berbeda dengan tingkat dimana kompleks ligand-reseptor berubah

dan pada tingkat ini akan jatuh. Pada halaman sebelumnya, Pers. (1.18) terlihat

rumit untuk diselesaikan Karena terdapat tidak kurang dari 4 variabel.: pAR, t,

[A], dan pR. Bagaimanapun, kita tahu bahwa pR = (1 Ŕ pAR). Juga, kita

beramsumsi, sebagaimana seperti sebelumnya, bahwa [A] konstan; karena itu,

banyak A yang muncul dalam hubungan dengan angka dari area pengikatan yang

beberapa kombinasinya dengan area itu akan tidak mengunrangi konsentrasi

keseluruhannya. Oleh karena itu, hanya pAR adan t yang tersisa sebagai variable,

dan persamaan akan lebih mudah untuk digunakan.

Substitusi untuk pR,:

bentuk berurutnya,

Persamaan ini masih terlihat rumit, jadi kita akan menurunkan pangkat dari

pAR dan membuat substitusi selanjutnya konstan dalam persamaan.

maka,

Persamaan ini dapat disusun menjadi bentuk integral sederhana untuk

menentukan bagaimana pengikatan berubah berdasarkan waktu:

Integrasi,

Kini kita dapat memperkirakan bagaimana cepatnya pengikatan terjadi

setelah aplikasi pertama ligan, pada waktu 0 (t1 = 0). Pengikatan reseptor diawali

0, sehingga p1 adalah 0. setelah itu, pengikatan meningkat secara cepat dan akan

ditandai pAR(t) pada waktu t:

Maka,

mengganti a dan b dengan bentuk aslinya, sehingga:

dengan memasukkan k–1/k+1 = KA, kita dapatkan persamaan:

GAMBAR 1.3 Perkiraan waktu dari naiknya pengikatan reseptor berdasarkan

aplikasi dari ligand tampak pada tiga konsentrasi. Kurva terlihat menunjukkan

Pers. (1.22), dengan nilai 2. 106 M–1secŔ1 for k+1 and of 1 secŔ1 for k–1.

Ketika t sangat besar, ligand dan area pengikatannya akan menuju titik

equilibrium. Bentuk dalam kurung besar kemudian akan menjadi gabungan

(karena e–∞= 0) sehinnga,

Kemudian kita dapat menulis:

Ini merupakan hasil yang dibutuhkan. hal ini telah di gambarkan pada

Gambar 1.3 untuk tiga konsentrasi dai A. perlu dicatat bagaimana tingkat

pendekatan ke titik equilibrium meningkatkan [A] menjadi lebih besar. hal ini

dikarenakan kurun waktu ditentukan oleh (k–1 + k+1[A]). Kuantitas ini seringkali

digantikan oleh single konstan, karena itu Pers. (1.22) dan juga dituliskan sebagai

berikut:

atau

dimana

dimana (tau) merupakan waktu konstan dan memiliki unit waktu; time constant

and has the unit of time; (lambda) adalah nilai konstan, yang mana kadangkala

dituliskan sebagai kon (seperti pada Chapter 5) dan memiliki unit dari time–1.

GAMBAR 1.4 Perkiraan waktu dari penurunan pada aktivitas area pengikatan.

Garis kurva telah diramalkan Pers. (1.26), dengan kŔ1 menjadi 1 secŔ1 dan

pAR(0) menjadi 0.8. Skala linear untul r pAR(t) telah digunakan pada sisi kiri

dan logaritma pada sisi kanan.

1.3.3 PENURUNAN OKUPANSI RESEPTOR

Pada pembahasan sebelumnya, kita memiliki asumsi bahwa pengikatan

tidak berlangsung ketika ligan lebih dulu aktif. Itu merupakan langkah kedepan

untuk meluaskan derivasi untuk meprediksi bagaimana pengikatan akan berubah

seiring waktu meskipun jika hal itu tidak betul nol. kita mengubah batas dari

integrasi menjadi:

pAR(0) merupakan okupansi pada waktu 0, dan bentuk lainnya telah terlebih

dahulu dijelaskan. Persisnya langkah sama seperti yang sebelumnya kemudian

berdasarkan hasil tersebut untuk mengganti Pers. (1.22)

Kita dapat menggunakannya untuk menguji apa yang akan terjadi jika

ligand secara cepat dihilangkan. Hal ini seimbang untuk setting [A] ke angka nol,

pada waktu nol, dan p(∞) juga akan bernilai nol karena, keseluruhan kompleks

reseptor ligand akan terdisosiasi. Pers. (1.25) kemudian menjadi:

Hasil tersebut telah dijelaskan pada Gambar 1.4.

Waktu konstan, | , untuk kemunduran okupansi merupakan timbal balik

sederhana dari k–1. Hal yang berpengaruh adalah waktu paruh (t1/2). Ini adalah

saat dimana waktu dibutuhkan untuk quantitas (dalam contoh ini pAR(t)) untuk

mencapai setengahnya diantara nilai awal dan akhir dan didapatkan:

Sebagai contoh yang digambarkan pada Gambar 1.4 1.4, t1/2 = 0.693 sec.

Harap dicatat dan t1/2 memiliki unit waktu, sebagai perbandingan dengan timeŔ

1 untuk k–1.

Telah diasumsikan sebelumnya pada halaman pendahuluan bahwa terdapat

banyak area pengikatan yang memiliki rata-rata angka pengikatan yang akan

meningkat atau secara perlahan menurun seiring perubahan konsentrasi ligand;

aktivitas pada area bebas belum dipertimbangkan. Ketika ligand dihilangkan,

periode dimana sebuah area pengikatan bebas akan tetap berikatan, tentunya,

bertukar dari tempat ke tempat lain, sama halnya yang terjadi sepanjang waktu

dari atom bebae pada sampel yang diujikan melalui pembusukan radioaktif. Hal

tersebut dapat menunjukkan bahwa median waktu hidup dari okupansi dari area

bebas didapatkan dari 0.693/k–1. yang berarti waktu hidup adalah 1/k–1.

Pengenalan dari metode rekaman single-channel telah membuat hal ini mungkin

terjadi untuk memperoleh bukti langsung mengenai durasi okupansi reseptor (lihat

Chapter 6).

1.4 AGONIS PARSIAL

1.4.1 PENGENALAN DAN KONSEP AWAL

Pengembangan dari obat-obat baru pada dasarnya memerlukan bahan

sintesis dalam jumlah besar terkait struktur penyusunnya. Jika sebuah set agonis

dari bentuk ini diujkan pada jaringan tertentu, penyusunnya terkadang ditemukan

terbagi dalam dua kategori. Beberapa dapat menimbulkan respon maksimal pada

jaringan dan digambarkan sebagai full agonists dalam percobaan tersebut.

Ketegori lainnya yang tidak dapat menimbulkan respon maksimal, meskipun

memiliki konsentrasi yang tinggi, disebut dengan partial agonists. Contohnya

termasuk:

GAMBAR 1.5 menunjukkan kurva respon konsentrasi yang dibandingkan aksi

dari -adrenoceptor agonis parsial prenalterol dengan isoprenalin agonis penuh

pada range dari jaringan dan respon. Pada setiap kejadian, respon maksimal

menuju prenalterol lebih kecil, medkipun besar dari perbedaan sangat bervariasi.

Hal tersebut dapat diasumsikan bahwa agonis parsial tidak cocok dengan

respon dari agonis penuh karena agonis parsial gagal dalam berikatan dengan

semua reseptor. Hal ini dapat dengan mudah dijelaskan dengan menguji efek dari

kenaikan konsentrasi dari agonis parsial terhadap respon pada jaringan untuk

memperbaiki konsentrasi dari agonis penuh. Gambar 1.6 (kanan, diatas kurva)

menggambarkan percobaan untuk dua aksi agonis pada H2 Reseptor. Ketika

konsentrasi agonis parsial meningkat, respon dari jaringan akan menurun dari

angka terbesar yang dapat dilihat dari agonis penuh itu sendiri dan dan secara

cepat mencapai maksimal respon menuju agonis parsial. Implikasi dari hal

tersebut agonis parsial akan mampu bergabung dengan semua reseptor, dengan

ketentuan konsentrasi tinggi dibutuhkan, tetapi efek pada jaringan lebih sedikit

dari apa yang akan terlihat pada agonis penuh. Agonis parsial dalam beberapa hal

lebih kurang mampu untuk menimbulkan respon.

Pada percobaan dari Gambar 1.7 merujuk pada kesimpulan yang sama.

Ketika konsentrasi histamin sangat rendah dari konsentrasi relative terbesar dari

impromidin, keseluruhan respon akan dimiliki oleh impromidin. Bagaimanapun,

kurva respon konsentrasi pada konsentrasi histamin akan meningkat. Ini

dikarenakan adanya imopomidine yang mengurangi okupansi reseptor histamine

(pada semua konsentrasi) dan begitu pula sebaliknya. Ketika garis kurva tumpang

tindih, efek dari penurunan okupansi impromidin oleh histamine secara pasti

diluar jangkauan kontribusi dari okupansi reseptor histamine. Diluar hal tersebut,

rendahnya impromidin akan memberikan respon terhadap konsentrasi histamine.

Sekali lagi, implikasinya adalah bahwa agonis parsial dan bergabung dengan

keseluruhan reseptor tetapi lebih kurang mampu untuk menghasilkan respon.

Pendekatan klasik untuk mempelajari interaksi obat-reseptor

GAMBAR 1.5 Perbandingan hubungan log konsentrasi-respon untuk β-

adrenoreseptor-dimediasi tindakan pada enam jaringan penuh dan agonis parsial

(isoprenalin [lingkaran tertutup] dan prenalterol [lingkaran terbuka], masing-

masing). Ordinat menunjukkan respon sebagai fraksi dari respon maksimal untuk

isoprenalin. (Dari Kenakin, T. P. dan Beek, D., J. Pharmacol. Exp. Ther., 213,

406-413, 1980.)

GAMBAR 1.6 Interaksi antara agonis histamin penuh dan H2-reseptor agonis

parsial impromidine pada strip ventrikel terisolasi dari miokardium manusia.

Kurva konsentrasi-respon di sebelah kiri menunjukkan histamin saja, dan yang di

sebelah kanan menunjukkan respon terhadap impromidine yang bertindak dengan

sendirinya (terbuka kuadrat) atau di hadapan konsentrasi konstan (100 µM)

histamin (berlian terbuka). (Dari Inggris, T. A. et al., Br. J. Pharmacol., 89, 335-

340, 1986.)

GAMBAR 1.7 Kurva log konsentrasi-respon untuk histamin diterapkan sendiri

(lingkaran terbuka) atau dihadapan (kotak terbuka) dari konsentrasi konstan dari

agonis parsial impromidine (10 µM). kondisi jaringan dan eksperimental seperti

pada gambar 1.6. (Dari Inggris, T. A. H. et al., Br. J. Pharmacol., 89, 335Ŕ340,

1986.)

1.4.2 Mengungkapkan Tanggapan Maksimal Terhadap Agonis Parsial :

Kegiatan Intrinsik dan Efikasi.

Pada tahun 1954 farmakolog Belanda EJ ARIENS memperkenalkan

aktivitas intrinsik panjang, yang sekarang biasanya didefinisikan sebagai:

Untuk agonis penuh, aktivitas intrinsik (sering dilambangkan dengan α)

adalah kesatuan, menurut definisi, dibandingkan dengan nol untuk antagonis

kompetitif. Agonis parsial ini memiliki nilai antara batasan tersebut. Perhatikan

bahwa, definisi sepenuhnya deskriptif, tidak ada yang dianggap sebagai

mekanisme. Selain itu, intrinsik tidak boleh diartikan bahwa agonis yang

diberikan memiliki aktivitas karakteristik, terlepas dari keadaan eksperimental.

Sebaliknya, kegiatan intrinsik dari agonis parsial seperti prenalterol dapat sangat

bervariasi tidak hanya antar jaringan, seperti Gambar 1.5, tetapi juga dalam suatu

jaringan tertentu, tergantung pada kondisi eksperimental (lihat nanti diskusi).

Sebenarnya, senyawa yang sama dapat menjadi agonis penuh dengan satu

jaringan dan agonis parsial dengan yang lain. Untuk alasan ini, istilah efek agonis

maksimal mungkin lebih baik untuk kegiatan intrinsik.

Demikian pula, temuan bahwa sepasang agonis masing-masing bisa

mendapatkan respon maksimal dari sebuah jaringan (yaitu, mereka mempunyai

kegitan intrinsic yang sama, persatuan)tidak seharusnya dianggap untuk

meyiratkan bahwa mereka sama-sama mengaktifkan reseptor. Misalkan, jaringan

memiliki banyak reseptor cadang (lihat Bagian 1.6.3). Salah satu agonis mungkin

harus menempati 5% dari reseptor untuk menghasilkan respon maksimal,

sedangkan yang lain mungkin hanya membutuhkan 1% hunian. Terbukti, agonis

kedua lebih efektif, meskipun keduanya menjadi agonis penuh. Sebuah ukuran

yang lebih halus dari kemampuan agonis untuk mengaktifkan reseptor jelas

diperlukan, dan satu diberikan oleh RP Stephenson, yang menyarankan bahwa

aktivasi reseptor menghasilkan "stimulus" atau "sinyal" (S) yang dikomunikasikan

ke sel, dan bahwa besarnya stimulus ini ditentukan oleh produk dari apa yang

disebut efikasi (e) dari agonis dan proporsi, p, dari reseptor yang menempati. *

S = ep

Perbedaan yang penting dari konsep ARIENS tentang kegiatan intrinsik

adalah bahwa keberhasilan, tidak seperti kegiatan intrinsik, tidak memiliki batas

atas, selalu ada kemungkinan bahwa sebuah agonis dengan keberhasilan yang

lebih besar daripada senyawa yang mungkin ditemukan. Selain itu, usulan

Stephenson itu tidak terkait dengan asumsi spesifik tentang hubungan antara

reseptor hunian dan respon dari jaringan. (ARIENS, seperti AJ Clark, awalnya

memperkirakan proporsionalitas langsung, asumsi kemudian ditinggalkan.)

Menurut Stephenson,

Di sini, y adalah respon dari jaringan, dan eA adalah efektivitas agonis A. f

(SA) berarti hanya "beberapa fungsi SA" (yaitu, y tergantung pada SA dalam

beberapa cara yang belum ditentukan). Perhatikan bahwa, sesuai dengan

pemikiran pada saat itu, Stephenson menggunakan persamaan Bukit-Langmuir

untuk menghubungkan konsentrasi agonis, [A], untuk reseptor hunian, PAR.

Asumsi yang paling penting ini adalah mempertimbangkan kembali dalam bagian

berikutnya.

Untuk dapat membandingkan khasiat agonis yang berbeda yang bekerja

melalui reseptor yang sama, Stephenson mengusulkan konvensi bahwa stimulus S

adalah kesatuan untuk respon yaitu 50% dari maksimum yang dicapai dengan

agonis penuh. Ini sama dengan mendalilkan bahwa agonis parsial harus

menempati semua reseptor untuk menghasilkan respon setengah-maksimal yang

memiliki khasiat persatuan. Kita bisa melihat ini dari Persamaan. (1,27), jika

agonis parsial hipotetis kami harus menempati semua reseptor (yaitu, p = 1) untuk

menghasilkan respon setengah-maksimal, di mana titik S juga adalah kesatuan

(oleh konvensi Stephenson), maka e juga harus 1.

R.F Furchgott kemudian menyarankan penyempurnaan konsep Stephenson.

Menyadari bahwa respon dari sebuah jaringan untuk agonis dipengaruhi oleh

jumlah reseptor dan juga oleh kemampuan agonis untuk mengaktifkan mereka, ia

menulis:

Di sini, [R]T adalah total "konsentrasi" reseptor, dan ε (epsilon) adalah

efikasi intrinsik (jangan keliru dengan aktivitas intrinsik); ε dapat dianggap

sebagai ukuran kontribusi reseptor individu terhadap keseluruhan khasiat.

Kemanjuran agonis tertentu, seperti yang didefinisikan oleh Stephenson,

dapat bervariasi antara jaringan yang berbeda dengan cara yang sama seperti

kegiatan intrinsik, dan untuk alasan yang sama. Selain itu, nilai dari kedua

kegiatan intrinsik dan kemanjuran dari agonis dalam suatu jaringan tertentu akan

bergantung pada eksperimental.

* Tidak ada perbedaan yang dibuat di sini antara reseptor yang diduduki dan

diaktifkan. Hal ini adalah kunci penting, sebagaimana telah dicatat dalam Bagian

1.2.3, dan dibahas lebih lanjut di halaman berikut.

GAMBAR 1.8 Pengaruh carbachol di dua konsentrasi, 1 M (segitiga) dan 10

M (kotak), pada relaksasi otot polos trakea disebabkan oleh agonis parsial,

prenalterol, dan oleh agonis penuh, isoprenalin. Tanggapan diplot sebagai

sebagian kecil dari maksimum isoprenalin. (Dari Kenakin, T. P. dan Beek, D., J.

Pharmacol. Exp. Ther., 213, 406-413, 1980.)

Kondisi, seperti digambarkan pada Gambar 1.8. Relaksasi otot trakea dalam

menanggapi -adrenoceptor agonis isoprenalin dan prenalterol diukur pertama

dalam ketiadaan (lingkaran) dan kemudian di kehadiran (segitiga, bujur sangkar)

dari agonis muscarinic, carbachol, yang menyebabkan kontraksi dan sebagainya

cenderung untuk menentang -adrenoreseptor-dimediasi relaksasi. Oleh karena

itu, konsentrasi yang lebih besar dari -agonis dibutuhkan, dan kurva bergeser ke

kanan. Dengan isoprenalin, respon maksimal masih bisa diperoleh, meskipun

kehadiran carbachol pada konsentrasi baik. Pola ini sangat berbeda dengan

prenalterol. Ketidakmampuannya untuk menghasilkan relaksasi lengkap semakin

jelas di hadapan dari carbachol pada 1 M. Memang, bila diberikan dengan 10

M carbachol, prenalterol menyebabkan sedikit atau ada relaksasi, aktivitas

intrinsik dan efikasi (dalam penggunaan Stephenson) telah menjadi diabaikan.

Dengan cara yang sama, mengurangi jumlah reseptor yang tersedia

(misalnya, dengan menerapkan alkylating agen; lihat Bagian 1.6.1) akan selalu

mengurangi respon maksimal untuk agonis parsial. Sebaliknya, log kurva

konsentrasi-respon untuk agonis penuh pertama mungkin bergeser ke kanan, dan

respon maksimal akan menjadi lebih kecil hanya bila tidak ada reseptor cadang

yang tersedia untuk itu agonis (lihat Bagian 1.6.3). Sebaliknya, meningkatkan

jumlah reseptor (misalnya, dengan upregulation atau dengan sengaja overekspresi

gen yang mengkode reseptor) akan menyebabkan respon maksimal ke agonis

parsial untuk menjadi lebih besar, sedangkan log kurva konsentrasi-respon untuk

penuh agonis akan bergerak ke kiri.

1.4.3 INTERPRETASI AGONISM PARSIAL DALAM RANGKA ACARA

PADA INDIVIDU RESEPTOR

Konsep aktivitas intrinsik dan kemanjuran saja dijelaskan adalah murni

deskriptif, tanpa mengacu mekanisme. Kita sekarang beralih ke bagaimana

perbedaan dalam keberhasilan dapat dijelaskan dalam hal peristiwa molekuler

yang mendasari aktivasi reseptor, dan kita mulai dengan mempertimbangkan

beberapa bukti eksperimental yang telah memberikan bukti langsung sangat sifat

peristiwa ini.

Hanya setahun setelah kertas klasik Stephenson tahun 1956, J. del Castillo

dan B. Katz menerbitkan sebuah studi elektrofisiologi dari interaksi yang terjadi

ketika pasang agonis dengan terkait struktur yang diterapkan secara bersamaan

pada reseptor nicotinic di wilayah endplate skeletal otot. Temuan mereka bisa

menjadi yang terbaik dijelaskan dengan model untuk aktivasi reseptor yang

memiliki sudah diperkenalkan secara singkat dalam Bagian 1.2.3 (lihat (1.7)

khususnya Pers.). Dalam skema ini, reseptor diduduki dapat isomerize antara aktif

dan keadaan tidak aktif. Hal ini sangat berbeda dari model klasik Hill, Clark, dan

Gaddum di mana tidak ada perbedaan yang jelas dibuat antara pendudukan dan

aktivasi reseptor oleh agonis.

GAMBAR 1.9 Rekaman arus listrik menit (defleksi ke bawah) yang mengalir

melalui tunggal ligandgated saluran ion di wilayah junctional otot rangka katak.

Arus timbul dari transisi singkat reseptor nicotinic individual ke (saluran terbuka)

negara aktif dalam menanggapi adanya berbagai agonis (Ach = asetilkolin, SubCh

= suberyldicholine, DecCh = ester dicholine dari decan-1, 10 - asam dikarboksilat;

CCH = carbamylcholine). (Dari Colquhoun, D. dan Sakmann, B., J. Physiol., 369,

501-557, 1985. Dengan izin.)

Bukti langsung untuk tindakan ini adalah datang dari pengantar oleh E.

Neher dan B. Sakmann pada tahun 1976 dari single-channel teknik perekaman,

yang memungkinkan arus listrik menit melewati saluran ion intrinsik untuk

reseptor nicotinic, dan lainnya ion ligand-gated saluran, yang akan diukur secara

langsung dan ketika mereka terjadi. Untuk pertama kalinya menjadi mungkin

untuk mempelajari aktivitas reseptor individu dalam situ (lihat juga Bab 6). Ini

dengan cepat menunjukkan bahwa untuk berbagai agonis nicotinic, arus ini

memiliki amplitudo yang sama persis. Ini diilustrasikan selama empat agonis

seperti pada Gambar 1.9. Apa yang berbeda di antara agonis adalah sebagian kecil

dari waktu yang saat ini mengalir (yaitu, dimana saluran terbuka). Ini hanya apa

yang akan diharapkan dari skema Castillo-Katz del jika keadaan aktif (AR *) dari

reseptor diduduki adalah sama (dalam hal aliran ion melalui saluran terbuka)

untuk agonis yang berbeda. Namun, dengan agonis parsial yang lemah, reseptor

ini di negara * AR hanya sebagian kecil dari waktu, bahkan jika semua situs

mengikat ditempati.

Pertanyaan berikutnya yang perlu dipertimbangkan adalah interpretasi

keberhasilan (baik dalam arti tertentu diperkenalkan oleh Stephenson dan dalam

istilah yang lebih umum) dalam konteks model yang diusulkan oleh delCastillo

dan Katz.

1.4.4 THE DEL CASTILLO-KATZ MEKANISME: 1. HUBUNGAN

ANTARA AGONIS KONSENTRASI DAN FRAKSI RESEPTOR DALAM

BENTUK AKTIF

Tugas pertama kami adalah untuk menerapkan hukum aksi massa untuk

memperoleh hubungan antara konsentrasi agonis dan proporsi reseptor yang

berada dalam bentuk aktif pada kesetimbangan. Proporsi ini akan dilambangkan

dengan Par *.

Seperti dalam semua derivasi dalam bab ini, yang satu ini hanya

memerlukan tiga langkah. Yang pertama adalah untuk menerapkan hukum aksi

massa untuk setiap kesetimbangan yang ada. Yang kedua adalah untuk menulis

sebuah persamaan yang mengungkapkan fakta bahwa fraksi reseptor di setiap

kondisi yang dapat dibedakan harus menambahkan hingga 1 ("aturan

konservasi"). The del Castillo Skema-Katz dalam bentuk yang paling sederhana

(lihat Persamaan. (1,7) dalam Bagian 1.2.3) memiliki tiga kondisi seperti: R

(kosong dan tidak aktif), AR (tidak aktif, meskipun A adalah terikat), dan AR *

(terikat dan aktif). Fraksi yang sesuai reseptor dalam kondisi ini * adalah pR, Par,

dan Par *.

Menerapkan hukum aksi massa untuk masing-masing dua kesetimbangan

memberikan:

di mana KA dan E adalah konstanta kesetimbangan ditunjukkan dalam Pers.

(1,7).

Juga,

Kami sekarang dapat mengambil langkah ketiga dan terakhir. Apa yang kita

ingin tahu adalah Par *, jadi kita gunakan Pers. (1.29) dan (1,30) untuk

menggantikan pR dan nominal dalam Pers.

(1.31), memperoleh:

Ini adalah ekspresi kita butuhkan. Meskipun memiliki bentuk umum yang sama

seperti Bukit-Langmuir persamaan, dua perbedaan penting yang harus

diperhatikan:

1. Sebagai [A] meningkat, Par * cenderung tidak persatuan tetapi untuk

* Istilah "negara" daripada "kondisi" sering digunakan dalam konteks ini.

Namun, yang terakhir tampaknya lebih baik dalam pengantar akun. Hal ini karena

mekanisme Castillo-Katz del sering digambarkan sebagai "dua negara" model

tindakan reseptor, berarti di sini bahwa reseptor diduduki ada di dua yang berbeda

(meskipun menukar) bentuk, AR dan AR *, sedangkan tiga kondisi reseptor (R,

AR, dan AR *) harus diidentifikasi ketika menerapkan hukum aksi massa untuk

pengikatan ligan, A.

GAMBAR 1.10 Hubungan antara Par * dan [A] diprediksi oleh Persamaan. (1.32)

untuk berbagai nilai E (diberikan dengan tiap baris). Perhatikan bahwa sebagai E

naik di atas 10, kurva bergerak ke kiri meskipun nilai KA, yang kesetimbangan

disosiasi konstan untuk kombinasi awal A dengan situs mengikat, adalah 200

M untuk setiap kurva.

Dengan demikian, nilai E akan menentukan respon maksimal untuk A.

Hanya jika E adalah sangat besar dalam hubungannya dengan satu akan hampir

semua reseptor diaktifkan, seperti digambarkan pada Gambar 1.10, yang plot

Persamaan. (1.32) untuk berbagai nilai E.

2. Persamaan (1.32) memberikan proporsi reseptor aktif (PAR *), daripada

diduduki

reseptor (pocc = Par Par + *). Untuk mendapatkan hunian, kita dapat

menggunakan Persamaan. (1.30) untuk mengekspresikan

Par dalam hal Par *:

Hal ini dapat ditulis sebagai:

mana Keff, efektif kesetimbangan disosiasi konstan, didefinisikan sebagai:

Karena Keff berlaku untuk skema yang melibatkan lebih dari satu ekuilibrium

(lihat Persamaan. (1,7)), ini disebut sebagai konstanta kesetimbangan

makroskopik, untuk membedakannya dari mikroskopis kesetimbangan konstanta

KA dan E, yang menggambarkan kesetimbangan individu.

Hasil ini menunjukkan bahwa jika hubungan antara konsentrasi agonis dan

proporsi reseptor yang menempati diukur secara langsung (misalnya,

menggunakan radioligand mengikat Metode), hasilnya harus menjadi kurva

hiperbolik sederhana. Meskipun kurva describable oleh persamaan Bukit-

Langmuir, yang konstan untuk mengikat kesetimbangan disosiasi akan tidak KA

tapi Keff, yang ditentukan oleh kedua E dan KA.

1.4.5 THE DEL CASTILLO-KATZ MEKANISME: 2. INTERPRETASI

KEBERHASILAN UNTUK SALURAN ION LIGAND-GATED

Secara umum, mudah untuk melihat bahwa nilai konstanta E kesetimbangan

dalam Pers. (1.7) akan menentukan apakah ligan adalah agonis penuh, agonis

parsial, atau antagonis. Kami pertama kali ingat Konsep Stephenson bahwa respon

dari jaringan untuk agonis ditentukan oleh produk, S, dari efektivitas agonis dan

proporsi reseptor diduduki (lihat Persamaan. (1,27)). Untuk menghubungkan ini

dengan skema Castillo-Katz del, kita menulis ulang Persamaan. (1.33) untuk

menunjukkan hubungan antara proporsi reseptor aktif, Par * (yang menentukan

respon jaringan) dan total reseptor hunian:

PAR* = Pocc (1.37)

Dari sini kita bisa melihat bahwa istilah E / (1 + E) adalah setara, dalam arti

formal setidaknya, Khasiat Stephenson. Jika agonis diterapkan pada konsentrasi

yang sangat tinggi, sehingga semua reseptor yang diduduki, proporsi dalam

keadaan aktif E/ (1 + E). Jika agonis ini juga sangat efektif (Yaitu, jika E adalah

>> 1), proporsi reseptor aktif menjadi dekat dengan kesatuan, batas atas.

Pertimbangkan berikutnya agonis parsial hipotesis bahwa, bahkan ketika

menduduki semua reseptor (pocc = 1), menyebabkan hanya separuh dari mereka

berada dalam bentuk aktif (yaitu, Par Par = * = 0,5). Dari Persamaan. (1.37), kita

bisa melihat bahwa E harus menjadi kesatuan untuk agonis ini. Dalam skema

Stephenson, agonis seperti itu akan memiliki khasiat persatuan, asalkan respon

diukur merupakan indikasi langsung dari proporsi diaktifkan reseptor.

Kesadaran bahwa kemampuan agonis untuk mengaktifkan reseptor dapat

dinyatakan dengan cara ini telah menyebabkan minat yang besar dalam mengukur

konstanta laju (dua masing-masing untuk KA dan E, di sederhana)

yang menentukan tidak hanya nilai-nilai KA dan E tetapi juga kinetika tindakan

agonis. Single channel The teknik perekaman memungkinkan ini dicapai untuk

saluran ion ligand-gated, seperti yang dijelaskan dalam Bab 6. Catatan,

bagaimanapun, komplikasi bahwa reseptor tersebut umumnya membawa dua situs

mengikat untuk agonis, sehingga skema sederhana hanya dipertimbangkan,

Persamaan. (1.7), harus diuraikan (lihat Persamaan. (1.9) dalam Lampiran 1.2c

[Bagian 1.2.4.3] dan juga Bab 6).

Kesulitan yang dihadapi dalam pekerjaan tersebut, dan salah satu yang harus

dipertimbangkan dalam studi hubungan antara konsentrasi agonis dan aksinya,

adalah terjadinya desensitisasi. Tanggapan menurun meskipun kehadiran terus

agonis. Beberapa faktor dapat berkontribusi. Salah satu yang telah diidentifikasi

dalam pekerjaan dengan saluran ion ligand-gated adalah bahwa reseptor

ditempati oleh agonis dan dalam keadaan aktif (AR*) mungkin isomerize ke tidak

aktif, peka, negara, ARD. Hal ini dapat direpresentasikan sebagai:

KA E KD

A + R AR AR* ARD

(Tidak aktif) (Tidak aktif) (aktif) (Tidak aktif)

Sebagaimana dijelaskan dalam Bab 6, studi kuantitatif desensitisasi pada

saluran ion ligand-gated telah menunjukkan bahwa bahkan skema ini terlalu

menyederhanakan, dan perlu untuk menyertakan kemungkinan bahwa reseptor

tanpa ligan bisa eksis dalam keadaan peka.

Desensitisasi dapat terjadi dengan cara lain. Dengan reseptor G-protein-

coupled, dapat dihasilkan dari fosforilasi reseptor oleh satu atau lebih protein

kinase yang menjadi aktif setelah penerapan agonis. * Aktivasi ini kadang-kadang

diikuti dengan hilangnya reseptor dari permukaan sel. Pengurangan agonis-

induced dalam jumlah reseptor fungsional atas relatif jangka waktu yang lama

digambarkan sebagai downregulation. Reseptor upregulation juga dapat terjadi,

misalnya, setelah pemberian berkepanjangan antagonis in vivo.

1.4.6 INTERPRETASI KEBERHASILAN UNTUK BERTINDAK

MELALUI RESEPTOR G-PROTEIN

Beberapa studi yang paling mengungkapkan dari agonis parsial (termasuk

pekerjaan mani Stephenson) telah dilakukan dengan jaringan di mana G-protein

(lihat Bab 2 dan 7) memberikan hubungan antara reseptor aktivasi dan inisiasi

respon. Berbeda dengan situasi dengan "cepat" dengan reseptor saluran ion

intrinsik (lihat di atas), itu belum mungkin untuk mengamati aktivitas individu

Gprotein- reseptor ditambah (dengan pengecualian beberapa potensi yang terkait

dengan kalium saluran), namun cukup diketahui untuk menunjukkan bahwa

mekanisme yang kompleks. Interpretasi perbedaan khasiat untuk agonis yang

bekerja pada reseptor tersebut Sejalan kurang tertentu.

Model awal untuk aksi reseptor tersebut adalah sebagai berikut:

KA

A + R AR

KARG

AR + G ARG*

Di sini, kompleks agonis reseptor (AR) menggabungkan dengan G-protein

(G) untuk membentuk kompleks terner (ARG *), yang dapat memulai acara lebih

lanjut seluler, seperti aktivasi adenilat siklase. Namun, ini skema sederhana

(model terner kompleks) tidak sesuai dengan apa yang sudah diketahui tentang

pentingnya isomerisasi dalam aktivasi reseptor (lihat Bagian 1.2.3 dan 1.4.3), dan

juga gagal untuk menjelaskan temuan yang segera datang dari penelitian terhadap

reseptor bermutasi. Dalam semua model saat reseptor G-protein-coupled, aktivasi

reseptor dengan isomerisasi adalah diasumsikan terjadi sehingga model menjadi:

KA E

A + R AR AR*

(1.38)

KARG

AR* + G AR*G*

Di sini, kombinasi reseptor diaktifkan (AR*) dengan G-protein

menyebabkan kedua untuk memasukkan aktif negara (G*) yang dapat melakukan

respon jaringan melalui, misalnya, adenilat siklase, fosfolipase C, atau pembukaan

atau penutupan saluran ion. Dalam skema ini, apa yang akan menentukan apakah

agonis tertentu dapat menghasilkan penuh atau hanya respon terbatas? Misalkan

tinggi konsentrasi agonis yang diterapkan, sehingga semua reseptor yang

diduduki. Mereka kemudian akan didistribusikan di antara AR, AR*, dan AR* G*

kondisi, dimana AR*G* saja menyebabkan respon. Nilai-nilai dari kedua E dan

KARG kemudian akan mempengaruhi berapa banyak AR*G* terbentuk, dan

karenanya apakah agonis yang dimaksud adalah parsial atau sebaliknya. Pada

prinsipnya, masing-masing dua konstanta kesetimbangan

* Beberapa protein kinase yang spesifik untuk reseptor tertentu (misalnya, β-

adrenergik reseptor kinase [βARK], sekarang disebut sebagai GRK2) bisa

bervariasi dari agonist untuk agonis. Dengan analogi dengan saluran ion ligand-

gated, sangat menggoda untuk kira bahwa hanya E adalah agonis tergantung dan

bahwa afinitas aktif, AR*, keadaan reseptor untuk G-protein adalah sama untuk

semua agonis. Namun, dengan tidak adanya bukti langsung, ini harus tetap

merupakan pertanyaan terbuka. Perhatikan bahwa, dalam hal apapun, besarnya

respon mungkin juga tergantung pada ketersediaan G-protein. Jika tersedia sangat

sedikit, hanya sejumlah kecil Sejalan AR*G* dapat dibentuk, terlepas dari

konsentrasi agonis dan jumlah reseptor.

Demikian pula, jika beberapa reseptor yang hadir dalam kaitannya dengan

jumlah total G-protein, yang juga akan membatasi pembentukan AR*G*. Dengan

demikian, respon maksimal agonis dipengaruhi oleh jaringan faktor maupun oleh

KA, E, dan KARG. Hal ini dapat ditunjukkan secara lebih formal dengan

menerapkan hukum aksi massa ke tiga kesetimbangan ditunjukkan pada

Persamaan. (1.38). Hasilnya, dengan beberapa diskusi lebih lanjut, diberikan

dalam Lampiran 1.4B (Bagian 1.4.9.2).

Rumit meskipun skema ini mungkin tampak, mereka berada di

penyederhanaan fakta. Faktor yang belum dipertimbangkan termasuk:

1. Sangat mungkin bahwa beberapa reseptor yang digabungkan ke G-protein

bahkan tanpa adanya agonis.

2. Reseptor diaktifkan menggabungkan dengan G-protein dalam bentuk GGDP,

dengan konsekuensi bahwa guanosin trifosfat (GTP) dapat menggantikan

guanosin terikat sebelumnya difosfat (GDP). Sejauh mana hal ini dapat terjadi

akan dipengaruhi oleh lokal konsentrasi GTP.

3. Struktur G-protein heterotrimeric. Setelah aktivasi oleh GTP mengikat,

yang memisahkan trimer ke α dan subunit βγ, yang masing-masing dapat

menimbulkan tanggapan sel.

4. Aktivasi G-protein memiliki sifat siklus. The α subunit dapat menghidrolisis

GTP yang terikat untuk itu, sehingga memungkinkan heterotrimer untuk

reformasi. Masa pakai αGTP individu subunit akan bervariasi (lih. daya tahan

saluran ion terbuka).

5. Lebih dari satu jenis G-protein, masing-masing dengan tindakan seluler

karakteristik, mungkin hadir dalam banyak sel.

6. Beberapa reseptor G-protein-coupled telah ditemukan untuk menjadi

konstitutif aktif (lihat bagian berikut).

7. Hal ini dimungkinkan (meskipun belum terbukti) bahwa afinitas bentuk aktif

yang diduduki reseptor (AR *) untuk G-protein dapat bervariasi dari agonist untuk

agonis.

8. Bukti terbaru menunjukkan bahwa reseptor beberapa G-protein-coupled ada

sebagai dimer.

Pada prinsipnya, fitur ini dapat dibangun ke dalam model aktivasi reseptor,

meskipun besar jumlah parameter pakai membuat pengujian sulit. Beberapa

konstanta laju dan kesetimbangan harus diketahui terlebih dahulu. Salah satu

taktik eksperimental adalah untuk mengubah proporsi relatif dari reseptor dan G-

protein dan kemudian menentukan apakah kemanjuran agonis perubahan dalam

cara yang diharapkan dari model. Penemuan bahwa beberapa reseptor konstitutif

aktif telah memberikan lain pendekatan baru serta informasi tambahan tentang

fungsi reseptor, seperti sekarang kita akan lihat.

1.4.7 RESEPTOR KONSTITUTIF AKTIF DAN AGONIS TERBALIK

The del Castillo Skema-Katz (kesamaan, tentu saja, dengan model

sederhana dieksplorasi oleh Hill, Clark, dan Gaddum) mengandaikan bahwa

reseptor tidak aktif dalam ketiadaan agonis. Sekarang diketahui bahwa hal ini

tidak selalu begitu, beberapa jenis reseptor konstitutif aktif. Contoh termasuk

bermutasi reseptor bertanggung jawab untuk beberapa penyakit genetik

ditentukan. Dengan demikian, hipertiroidisme dapat hasil dari mutasi yang

menyebabkan reseptor untuk thyrotropin (TSH, atau thyroidstimulating hormone)

untuk aktif bahkan tanpa adanya hormon. Juga, varian reseptor yang secara

konstitutif aktif telah dibuat di laboratorium oleh situs-directed mutagenesis.

Akhirnya, berlebih sengaja reseptor oleh transfeksi gen reseptor-garis sel dan

bahkan laboratorium hewan telah mengungkapkan bahwa banyak "wild type"

reseptor juga menunjukkan beberapa aktivitas dalam ketiadaan agonis. Apa yang

mungkin menjadi mekanisme? Kemungkinan yang paling mungkin, dan satu yang

sesuai

Dengan apa yang telah dipelajari tentang bagaimana saluran ion bekerja,

adalah bahwa reseptor tersebut dapat isomerize

spontan ke dan dari bentuk aktif:

R R*

(Tidak aktif) (Aktif)

Pada prinsipnya, kedua bentuk dapat menggabungkan dengan agonis, atau

memang dengan ligan, L, dengan afinitas, seperti yang diilustrasikan pada

Gambar 1.11.

Misalkan L menggabungkan hanya dengan aktif, R, bentuk. Maka kehadiran

L, dengan mempromosikan pembentukan LR dengan mengorbankan spesies lain,

akan mengurangi proporsi reseptor di aktif, R *, besaran. L dikatakan agonis

terbalik atau antagonis negatif dan untuk memiliki negatif khasiat. Jika,

sebaliknya, L menggabungkan dengan bentuk R* saja, akan bertindak sebagai

konvensional atau positif agonis keberhasilan intrinsik yang sangat tinggi.

Menjelajahi skema lebih lanjut, agonis parsial akan mengikat kedua R dan

R* tetapi dengan beberapa afinitas khusus untuk satu atau yang lain dari dua

negara. Jika preferensi adalah untuk R, ligan akan menjadi agonis terbalik parsial,

karena kehadirannya akan mengurangi jumlah reseptor dalam keadaan aktif,

meskipun tidak sampai nol.

Seperti ditunjukkan dalam Bagian 1.10 (lihat solusi untuk Soal 1.4),

penerapan hukum massa tindakan untuk skema Gambar 1.11 memberikan

ekspresi berikut untuk sebagian kecil dari reseptor dalam keadaan aktif (yaitu, PR*

+ PLR*).

Di sini, E0 konstanta kesetimbangan didefinisikan oleh PR*/PR, KL

berdasarkan [L] PR / PLR, danberdasarkan [L] PR*/PLR*. Gambar 1.12 plot

hubungan ini selama tiga ligan hipotetis yang berbeda dalam afinitas relatif

mereka untuk aktif dan negara tidak aktif reseptor. Istilah α telah digunakan untuk

mengekspresikan rasio dari KL ke K*

L. Ketika α = 0,1, ligan merupakan agonis

terbalik, sedangkan bila α = 100, itu adalah agonis konvensional. Dalam contoh

ketiga, dengan ligan yang tidak menunjukkan selektivitas antara bentuk aktif dan

tidak aktif dari reseptor (α = 1), proporsi reseptor aktif tetap tidak berubah seperti

[L] (dan karena reseptor hunian) meningkat.

Ligan seperti ini, bagaimanapun, akan mengurangi tindakan baik

konvensional atau agonis terbalik, dan sebagainya berlaku adalah antagonis.

Lebih tepatnya, itu merupakan antagonis kompetitif netral. Jika besar

GAMBAR 1.11 Sebuah model untuk menunjukkan pengaruh ligan, L, pada

keseimbangan antara aktif dan bentuk aktif dari reseptor konstitutif aktif, R.

Perhatikan bahwa jika L, R, dan LR berada dalam kesetimbangan, dan juga L, R*

dan LR*, maka sama harus berlaku untuk LR dan LR* (lihat Lampiran 1.6b

(Bagian 1.6.7.2) untuk lebih lanjut penjelasan)

GAMBAR 1.12 Hubungan antara fraksi total reseptor dalam keadaan aktif (pR *

+ Par *) dan konsentrasi ligan ([L]) untuk reseptor konstitutif aktif. Kurva telah

ditarik menurut Eq. (1,39), menggunakan nilai berikut: E0 = 0,2, KL = 200 nM, α

= KL / = 0,1, 1, dan 100, seperti yang ditunjukkan. Perhatikan bahwa pada model

ini beberapa reseptor (sebagian kecil yang diberikan oleh E0 / (1 + E0) = 0.167)

yang aktif dengan tidak adanya ligan. * Kemungkinan bahwa depresi pada

aktivitas basal mungkin memiliki beberapa penjelasan lain (misalnya, aksi

penghambatan pada satu atau lebih peristiwa yang mengikuti aktivasi reseptor)

tidak boleh diabaikan. Jumlah antagonis kompetitif dari kelas farmakologis yang

sama (misalnya, β-adrenoreseptor bloker) hati-hati diuji pada baris jaringan atau

sel menunjukkan aktivitas konstitutif, beberapa akan ditemukan menyebabkan

peningkatan kecil dalam aktivitas basal. Mereka adalah, pada dasarnya, lemah

agonis parsial konvensional. Orang lain akan mengurangi aktivitas basal dan jadi

mungkin agonis terbalik dengan apa yang bisa menjadi besar tingkat keberhasilan

negatif.

Namun, beberapa senyawa semacam ini telah diidentifikasi, dan Gambar

1.13 menggambarkan efek satu di respon untuk kedua konvensional dan agonis

terbalik bertindak pada reseptor 5HT1A dinyatakan dalam baris sel.

Seperti dengan eksperimen dari Gambar 1.13, aktivitas konstitutif sering

diselidiki dalam berbudaya baris sel yang tidak normal mengekspresikan reseptor

untuk diperiksa tetapi telah dibuat untuk melakukannya oleh transfeksi dengan

gen coding untuk kedua reseptor asli atau varian mutasi dari itu. Itu jumlah

reseptor per sel (densitas reseptor) mungkin jauh lebih besar dalam situasi ini

daripada dalam sel yang mengekspresikan reseptor alami. Sementara berlebih

semacam ini memiliki keuntungan besar bahwa derajat kecil dari aktivitas

konstitutif dapat dideteksi dan dipelajari, perlu dicatat bahwa aktivitas konstitutif

sering kurang mencolok in situ daripada di sel transfected. Oleh karena itu,

sebagian tindakan agonis (konvensional atau inverse) dari antagonis mungkin jauh

kurang ditandai, atau bahkan diabaikan, bila dipelajari dalam jaringan utuh

sehingga antagonisme kompetitif sederhana diamati, sebagai dijelaskan dalam

Bagian 1.5.

Namun demikian, bukti bahwa beberapa reseptor memiliki aktivitas

konstitutif cukup untuk mempengaruhi fungsi sel in vivo bahkan tanpa adanya

agonis membuat perlu untuk memperpanjang model sederhana sudah dianggap

untuk aktivasi reseptor G-protein-coupled. Pada prinsipnya, reseptor dapat

sekarang ada di tidak kurang dari delapan kondisi yang berbeda (R, R*, LR, LR*,

RG, R* G, LRG, LR* G), yang terbaik diwakili grafis sebagai kubus dengan salah

satu kondisi pada setiap titik (lihat Gambar 1.14). Perhitungan proporsi reseptor

diaktifkan dan menduduki sangatlah mudah, jika panjang (lihat jawaban Soal 1.5

dalam Bagian 1.10). Menemukan proporsi dalam bentuk aktif lebih sulit jika

pasokan G-protein terbatas tetapi dapat dilakukan dengan menggunakan metode

numerik.

GAMBAR 1.13 Efek dari agonis konvensional, agonis terbalik, dan antagonis

netral pada aktivitas suatu konstitutif aktif G-protein-coupled 5HT1A reseptor.

Panel di sebelah kiri menunjukkan kurva konsentrasi-respon log untuk agonis

konvensional (lapangan terbuka) dan agonis terbalik (lingkaran terbuka). Tertutup

simbol menunjukkan bagaimana kurva berubah ketika antagonis (WAY 100.635

pada 10 nM) dimasukkan dalam cairan inkubasi. Perhatikan paralel, dan yang

sejenis, pergeseran garis. Panel di sebelah kanan menggambarkan efek dari

berbagai konsentrasi antagonis yang sama diterapkan sendiri (berlian terbuka)

atau di hadapan tinggi konsentrasi baik agonis konvensional (kotak tertutup) atau

agonis terbalik (lingkaran tertutup). Perhatikan bahwa antagonis dengan

sendirinya menyebabkan sedikit perubahan, menunjukkan bahwa ia tidak

memiliki preferensi untuk bentuk aktif atau tidak aktif reseptor. Sehubungan

dengan hal ini, konsentrasi tinggi antagonis menghapuskan respon terhadap kedua

jenis agonis (kurva konvergen). (Dari Newman-Tancredi, A. et al., Br. J.

Pharmacol., 120, 737-739, 1997

GAMBAR 1.14 Elaborasi dari model yang ditunjukkan pada Gambar 1.11, yang

direproduksi sebagai wajah depan kubus. Masing-masing empat elemen (R, R *,

LR, dan LR *) dapat menggabungkan dengan G-protein untuk membentuk RG, R

* G, LRG, dan LR * G, masing-masing. Dari jumlah tersebut, hanya R * G dan

LR * G menyebabkan respon jaringan. Wajah atas kubus menunjukkan negara

ligan yang terikat reseptor. Rincian lebih lanjut dapat ditemukan pada Bagian 1.10

(lihat solusi untuk Soal 1.5).

1.4.8 MENCOBA UNTUK ESTIMASI EFIKASI agonis parsial DARI

AKHIR TANGGAPAN DARI JARINGAN KOMPLEKS

Meskipun pengamatan fungsi reseptor pada tingkat molekuler (misalnya,

single-channel rekaman atau perubahan reseptor fluoresensi setelah pengikatan

ligan) menjadi semakin praktis, masih sering terjadi bahwa ukuran hanya tersedia

aktivasi reseptor adalah respon dari jaringan utuh. Ini bisa menjadi kontraksi atau

relaksasi sepotong otot polos, sekresi oleh kelenjar, atau perubahan dalam

sekejap. Bagaimana aksi dari agonis parsial terbaik akan ditandai dalam situasi

seperti ini? Jelas, aktivitas agonis maksimum (yang disebut intrinsik kegiatan;

lihat pembahasan sebelumnya) dan konsentrasi agonis yang menghasilkan

setengah maksimal respon yang agonis dapat menimbulkan adalah ukuran

deskriptif berharga. Seperti telah kita lihat, R.P. Stephenson mengambil hal-hal

lebih lanjut dengan mengandaikan bahwa respon terhadap agonis ditentukan

dengan produk dari kemanjuran agonis dan proporsi reseptor diduduki (lihat

Persamaan. (1.27)). Dia juga menggambarkan metode eksperimental yang

menjanjikan untuk memungkinkan khasiat agonis bertindak atas jaringan utuh

untuk dibandingkan. Prosedur ini kemudian diperpanjang oleh orang lain dan

cukup diterapkan secara luas. Sebuah contoh diberikan pada bagian antagonis

ireversibel.

Namun, seperti yang sudah dibahas, kini menjadi jelas bahwa hunian dan

aktivasi reseptor oleh agonis tidak setara, maka, penggunaan Stephenson dari

persamaan Bukit Langmuir untuk berhubungan konsentrasi agonis reseptor hunian

dalam Pers. (1.27) merupakan penyederhanaan yang berlebihan. Kami akhir tugas

dalam akun ini dari agonis parsial adalah untuk menguji kembali formulasi

Stephenson kemanjuran, dan Hasil eksperimen berdasarkan itu, dalam terang

pengetahuan baru tentang bagaimana reseptor berfungsi.

Langkah pertama adalah untuk menyusun kembali persamaan Stephensons

dalam hal total reseptor hunian (pocc, diduduki tapi tidak aktif ditambah diduduki

dan aktif). Mengambil kursus ini, dan dengan asumsi bahwa del Mekanisme

Castillo-Katz berlaku dalam bentuk yang paling sederhana (Persamaan (1.7)), kita

dapat menulis:

S = e* APooc(A) = e

*A (1.40)

Dimana Keff didefinisikan sebagai dalam Pers. (1.36) di Bagian 1.4.4. Sebelum

pergi lebih jauh, itu harus dibuat jelas bahwa modifikasi ini skema Stephenson

berangkat fundamental dari konsep aslinya yang efikasi dan afinitas dapat

dianggap sebagai jumlah yang dipisahkan dan berpotensi independen. Untuk

menekankan titik, simbol e* daripada e digunakan. Kami telah melihat di bagian

akhir.

GAMBAR 1.15 Memperkirakan efektivitas agonis parsial dengan

membandingkan kurva konsentrasi-respon dengan bahwa untuk agonis penuh

(lihat teks untuk rincian lebih lanjut).

bahwa makroskopik kesetimbangan disosiasi Keff konstan tidak hanya

ditentukan oleh nilai KA tetapi juga oleh E, yang secara langsung berkaitan

dengan keberhasilan. Dalam nada yang sama, baik efektivitas dan afinitas

makroskopik agonis bertindak melalui reseptor G-protein-coupled tergantung

pada jaringan faktor-faktor seperti jumlah relatif dan absolut dari G-protein dan

reseptor, serta pada konstanta kesetimbangan mikroskopis.

Dengan pemesanan ini dalam pikiran, kita selanjutnya akan

mempertimbangkan tiga pendekatan yang telah digunakan di masa lalu untuk

mengukur efektivitas agonis parsial bekerja pada sebuah jaringan utuh. Setiap

akan dianalisis dalam dua cara dengan rincian yang diberikan dalam Lampiran

1.4c (Bagian 1.4.9.3). Yang pertama adalah kepentingan sejarah saja dan

didasarkan pada formula awal Stephenson, seperti yang diungkapkan dalam Pers.

(1.27) (Bagian 1.4.2) dan dengan reseptor hunian diberikan oleh persamaan Bukit-

Langmuir di paling sederhana bentuk, yang kita telah melihat tidak memadai

untuk agonis. Analisis kedua mendefinisikan reseptor hunian karena semua

reseptor yang diduduki, aktif ditambah tidak aktif.

Dua yang pertama dari tiga metode mengandaikan bahwa pengukuran

dilakukan dengan tisu yang memiliki cadangan besar reseptor. Hal ini juga

diasumsikan bahwa agonis lengkap tersedia yang dapat membangkitkan respon

maksimal ketika menempati hanya sebagian kecil dari reseptor.

Metode 1. Kurva konsentrasi-respon yang dibangun untuk agonis penuh (A) dan

agonis parsial [P], efektivitas yang akan ditentukan (Gambar 1.15). Dua

konsentrasi yang membacakan kurva untuk agonis penuh. Yang pertama, [A] 1,

menyebabkan halfmaximal respon. Yang kedua, [A] 2, memunculkan respon yang

sama seperti yang terlihat dengan maksimal agonis parsial. Manfaat dari agonis

parsial diberikan oleh rasio [A] 2 sampai [A] 1 (Lihat Lampiran 1.4c, bagian A).

Metode 2. Tepat pengukuran dan asumsi yang sama dibuat seperti sebelumnya

(lihat lagi Gambar 1.15). Dari kurva konsentrasi-respon untuk agonis penuh dan

parsial, yang nilai [A] dan [P] yang mendapatkan respon yang sama dibaca off

untuk beberapa tingkat respon. Sebuah plot 1 / [A] terhadap 1 / [P] dibangun dan

harus menghasilkan garis lurus dari mana efektivitas agonis parsial dapat

diperoleh jika asumsi yang mendasarinya benar (lihat Lampiran 1.4c, bagian B).

Metode 3. Metode ini lebih umum daripada dua lainnya dalam arti bahwa hal

itu juga berlaku untuk agonis penuh, setidaknya pada prinsipnya. Misalkan kita

memiliki beberapa sarana yang dapat diandalkan untuk menentukan

kesetimbangan disosiasi konstan untuk kombinasi agonis dengan nya reseptor.

Salah satu prosedur yang telah digunakan di masa lalu adalah ireversibel Antag-

Furchgott yang metode onist, seperti yang dijelaskan dalam Bagian 1.6.4. Kita

kemudian dapat menerapkan hunian yang sesuai hubungan dengan menghitung

proporsi reseptor diduduki pada konsentrasi agonis yang menghasilkan respon

setengah-maksimal. Karena S kemudian kesatuan, menurut konvensi

diperkenalkan oleh Stephenson, kebalikan dari hunian ini memberikan nilai e

(dari Persamaan. (1.27)). Ini adalah dasar dari estimasi Furchgott tentang

kemanjuran histamin yang bekerja padaterisolasi hamster ileum (lihat Gambar

1.24 dalam Bagian 1.6.3.). Jelas, metode ini berdiri atau jatuh dengan validitas

prosedur yang digunakan untuk mengukur kesetimbangan disosiasi konstan dan

untuk menghubungkan konsentrasi agonis untuk hunian. Kita akan melihat dalam

Bagian 1.6.4 bahwa metode antagonis ireversibel Furchgott menyediakan

perkiraan, tidak, seperti yang pertama pemikiran, dari konstanta kesetimbangan

mikroskopis, KA, melainkan dari makroskopik konstanta kesetimbangan, Keff.

Oleh karena itu, tingkat hunian reseptor dihitung dari itu menggunakan Persamaan

bukit-Langmuir akan total hunian, aktif ditambah tidak aktif. Oleh karena itu,

khasiat dihitung dengan cara ini harus dianggap seperti yang didefinisikan oleh

Persamaan. (1,40) dan tidak Pers. (1.28), yang dirumuskan oleh Stephenson.

Apakah nilai-nilai keberhasilan yang diperoleh dengan cara ini berguna?

Mereka tentu ada pengganti untuk pengukuran, jika ini bisa dibuat, dari konstanta

kesetimbangan mikroskopis yang mengatur proporsi reseptor dalam bentuk

diduduki dan aktif. Juga, karena e* dipengaruhi oleh jaringan faktor (misalnya,

[G]T dan [R]T, serta E dan KARG untuk reseptor G-protein-coupled), tertentu nilai

dapat hasil dari beberapa kombinasi variabel-variabel ini, E, keseimbangan

isomerisasi konstan untuk pembentukan reseptor aktif, bukan satu-satunya

penentu. Oleh karena itu, nilai e* (Atau e) tidak dapat digunakan sebagai ukuran

yang dapat diandalkan E. Perbandingan e* nilai untuk agonis yang berbeda

bekerja pada jaringan tertentu lebih informatif karena faktor jaringan tergantung

seperti [G]T dan [R]T adalah sama. Rasio e* selama dua agonis kemudian harus

memberikan perkiraan rasio terbalik dari total hunian reseptor yang diperlukan

untuk mendapatkan respon tertentu. Namun, pertanyaan kunci tentang bagaimana

reseptor diduduki didistribusikan antara negara aktif dan tidak aktif tetap terjawab

dalam ketiadaan jenis lain bukti. Meskipun pentingnya besar Stephenson konsep

keberhasilan, kita harus menyimpulkan bahwa perkiraan numerik keberhasilan,

sebagai awalnya didefinisikan, dan didasarkan pada pengukuran respon dari

jaringan utuh, adalah sedikit lebih dari nilai deskriptif.

1.4.9 LAMPIRAN KE BAGIAN 1.4

1.4.9.1 Lampiran 1.4A: Definisi Agonis parsial

Istilah agonis parsial telah datang untuk digunakan dalam dua pengertian

yang sedikit berbeda. Yang pertama, seperti dalam akun, adalah untuk merujuk

agonis itu dalam sebuah jaringan tertentu atau organisme, di bawah kondisi

tertentu, tidak dapat menimbulkan efek sebagai besar (bahkan ketika diterapkan

dalam jumlah besar) seperti yang bisa agonis penuh bertindak melalui reseptor

yang sama. Yang kedua, lebih terbatas, penggunaan menambahkan kondisi bahwa

respon adalah submaximal karena tidak cukup dari reseptor ditempati oleh agonis

parsial dikonversi ke bentuk aktif.

Perbedaan dapat diilustrasikan dengan mempertimbangkan aksi

decamethonium pada nicotinic reseptor otot rangka. Seperti asetilkolin,

decamethonium menyebabkan saluran ion intrinsik reseptor ini untuk membuka,

sehingga konduktansi listrik dari wilayah endplate otot

serat meningkat. Namun, bahkan pada konsentrasi yang sangat tinggi,

decamethonium dapat tidak cocok konduktansi meningkatkan disebabkan oleh

asetilkolin. Ini bukan karena decamethonium jauh kurang mampu menyebabkan

reseptor untuk isomerize ke bentuk aktif, melainkan respon maksimal kecil

sebagian besar konsekuensi dari kecenderungan yang lebih besar dari

decamethonium untuk memblokir saluran ion reseptor nicotinic.

Oleh karena itu, decamethonium tidak akan dianggap sebagai agonis parsial

dalam arti kedua didefinisikan atas. Namun, jika dibandingkan dengan asetilkolin

karena kemampuannya untuk kontrak sepotong otot rangka, maka akan ditemukan

untuk menghasilkan respon maksimum yang lebih kecil sehingga akan

digambarkan sebagai agonis parsial pertama, lebih umum, masuk akal.

1.4.9.2 Lampiran 1.4B: Ekspresi untuk Fraksi G-Protein-Ditambah

Reseptor dalam Formulir Aktif

Penerapan hukum aksi massa untuk masing-masing tiga kesetimbangan

ditunjukkan pada Persamaan. (1.38) dan penggunaan aturan konservasi (lihat

sebelumnya) mengarah pada ekspresi * berikut untuk PAR*G*:

PAR*G* = (1.41)

Meskipun ini terlihat rumit, masih memprediksi hubungan hiperbolik

sederhana (seperti dengan Persamaan bukit-Langmuir, lihat Gambar 1.1 dan teks

yang menyertai) antara konsentrasi agonis dan proporsi reseptor di negara bagian

(AR*G*) yang mengarah ke respon. Jika sangat besar konsentrasi A diterapkan,

sehingga semua reseptor ditempati, nilai nominal PAR*G* asimtot ke:

Dengan demikian, efektivitas intrinsik** dari agonis dipengaruhi oleh KARG dan

[G]T serta, dari Tentu saja, oleh E.

Dalam menurunkan persamaan. (1.41), telah diasumsikan bahwa

konsentrasi G tidak jatuh sebagai konsekuensi dari pembentukan AR*G*. Ini akan

jadi jika konsentrasi total G, [G]T, sangat melebihi konsentrasi reseptor ([R]T),

sehingga konsentrasi G bisa dianggap sebagai konstan, kurang lebih sama dengan

[G]T. Tapi, bisa kita benar-benar menganggap [G] sebagai konstan? Misalkan,

sebaliknya, bahwa [R]T >> [G]T, bukan sebaliknya. Kemudian, Persamaan. (1.41)

harus diganti dengan:

PAR*G* = (1.42)

Respon maksimum sekarang akan menjadi:

sehingga efektivitas intrinsik agonis akan dipengaruhi oleh [R]T maupun oleh

KARG dan [G]T.

Jelas, akan lebih baik untuk menghindari kebutuhan harus membuat asumsi

tentang baik keajegan [G] atau ukuran relatif [R]T dan [G]T. Hal ini dapat

dilakukan untuk perancangan Persamaan. (1,38), dan hasilnya adalah ekspresi

agak lebih kompleks untuk konsentrasi AR*G*, yang diperoleh dari akar

persamaan kuadrat:

* Ungkapan ini berasal dalam Bagian 1.10, lihat solusi untuk Soal 1.3.

** Istilah ini telah semakin datang untuk dipekerjakan (seperti di sini) dalam arti

yang agak berbeda dari yang diperkenalkan oleh RF Furchgott (Bagian 1.4.2).

Dengan penggunaan yang lebih baru, keberhasilan intrinsik menunjukkan aktivasi

reseptor maksimum (sering dinyatakan sebagai fraksi dari reseptor dalam keadaan

aktif) yang dapat dicapai oleh agonis bertindak melalui mekanisme yang dapat

dirumuskan dan belajar di tingkat molekuler, seperti dalam contoh ini. Tujuan dari

redefinisi ini adalah untuk fokus pada reseptor itu sendiri dan mekanisme

transduksi terdekatnya (misalnya, aktivasi G-protein), bukan pada seluler

Peristiwa selanjutnya.

[AR*G*]2 Ŕ (Q + [G]T + [R]T)[AR*G*] + [R]T = 0 (1.43)

dimana

Q = 1 + (1 + )

Ini memprediksi hubungan antara nonhyperbolic [AR*G*] dan [A], serta

antara mengikat dan [A]. Secara umum, khasiat intrinsik ditentukan oleh E dan

KARG serta berdasarkan [R]T dan [G]T.

1.4.9.3 Lampiran 1.4c: Analisis Metode 1 dan 2 dalam Pasal 1.4.8

A. Analisis Metode 1 (Bagian 1.4.8) diusulkan untuk penentuan efektivitas agonis

parsial bekerja pada sebuah jaringan utuh:

Analisis mengikuti formulasi Stephenson efikasi, dan menggunakan asumsi nya

dan istilah. Untuk respon setengah-maksimal, S = 1 (dengan Stephenson

konvensi) dan Par ≈ [A] 1/KA. Pendekatan ini berlaku karena jika A menempati

beberapa reseptor (yaitu, [A] << KA), kemudian

Oleh karena itu, mengingat bahwa SA = eApAR, kita memiliki:

(1.44)

Ketika parsial agonis P menempati semua situs mengikat untuk menghasilkan

maksimal nya respon, PPR = 1. Oleh karena itu, stimulus (SP) disebabkan P

hanya eP. Dengan asumsi bahwa respon jaringan yang sama, apakah ditimbulkan

oleh A atau oleh P, sesuai dengan nilai yang sama dari S, kami dapat menulis:

SP = SA

ep = eA (1.45)

Membagi Persamaan. (1.45) dengan (1.44), kita memperoleh:

ep =

Analisis berdasarkan mendefinisikan stimulus sebagai produk keberhasilan (e*)

dan total reseptor hunian oleh agonis (yaitu, pocc).

Untuk respon setengah-maksimal, S = 1 (oleh Stephenson

konvensi) dan pocc (A) ≈ [A]1/Keff(A). Ini pendekatan depan karena jika A

menempati beberapa reseptor, maka

Oleh karena itu, mengingat redefinisi SA sebagai e* A pocc (A), kita memiliki:

1 = e*A (1.46)

Ketika agonis parsial menempati semua reseptor untuk menghasilkan respon

maksimalnya, pocc (P) = 1. Oleh karena itu, stimulus (SP) disebabkan

dengan P adalah e * P. Dengan asumsi bahwa jaringan yang sama

respon sesuai dengan nilai yang sama dari S, kita bisa menulis:

Sp = SA

e*p = e*p (1.47)

B. Analisa Metode 2 (Bagian 1.4.8) diusulkan untuk penentuan efektivitas

agonis parsial bekerja pada sebuah jaringan utuh:

Analisis mengikuti formulasi Stephenson keberhasilan. Sama seperti

sebelumnya, kita berasumsi bahwa SA = SP untuk

besarnya respon yang sama. Oleh karena itu,

eA e*p

Jika A menempati beberapa reseptor (sehingga [A] << KA;

lihat Metode 1), kita dapat menulis:

eA

Oleh karena itu, plot 1 / [A] terhadap 1 / [P] harus menyediakan garis lurus

dengan kemiringan eAKP / ePKA dan mencegat eA / ePKA. Rasio lereng untuk

mencegat harus memberikan perkiraan KP. Jika parsial agonis dapat

menghasilkan respon yang sama atau lebih besar dari 50% itu ke agonis penuh,

nilai eP kemudian dapat dihitung dengan menggunakan KP untuk bekerja di luar

proporsi reseptor diduduki oleh agonis parsial ketika memunculkan respon

setengah-maksimal, kebalikan dari ini hunian memberikan eP (karena S kemudian

kesatuan, oleh definition). Namun, jika agonis parsial dapat hanya menghasilkan

respon yang kecil, maka Metode 1 dapat diterapkan untuk memperkirakan eP.

Analisis berdasarkan mendefinisikan stimulus sebagai produk efikasi (e *) dan

total reseptor hunian oleh agonis, seperti sebelumnya. Kami lagi berasumsi bahwa

SA = SP, untuk hal yang sama besarnya respon. Oleh karena itu, Jika A

menempati beberapa reseptor (sehingga [A] <<

Keff (A), lihat Metode 1), kita dapat menulis: Oleh karena itu, plot 1 / [A]

terhadap 1 / [P] harus menyediakan garis lurus dengan kemiringan e * AKeff (P) /

e * PKeff (A) dan mencegat e * A / e * PKeff (A). Rasio lereng mencegat harus

memberikan perkiraan dari Keff (P). Nilai e * P kemudian dapat dihitung

seperti yang dijelaskan di sebelah kiri untuk eP.

1.5 TINDAKAN HAMBAT PADA RESEPTOR: I. DPT DIATASI

ANTAGONISME

1.5.1 GAMBARAN OBAT ANTAGONISME

Banyak obat yang paling berguna adalah antagonis: zat yang mengurangi

tindakan agen lain, yang sering agonis endogen (misalnya, hormon atau

neurotransmitter). Meskipun paling Mekanisme umum adalah kompetisi

sederhana, antagonisme dapat terjadi dalam berbagai cara.

1.5.1.1 MEKANISME TIDAK MELIBATKAN AGONIS RESEPTOR

MAKROMOLEKUL

1. Antagonisme kimia. Antagonis menggabungkan langsung dengan substansi

yang antagonized; reseptor tidak terlibat. Misalnya, pengkelat EDTA digunakan

untuk mengobati keracunan timbal (a khelat kurang beracun terbentuk dan

dikeluarkan).

2. Fungsional atau fisiologis antagonisme. The "antagonis" sebenarnya merupakan

agonis yang menghasilkan efek sebaliknya biologis untuk substansi yang

antagonized. Setiap substansi bertindak melalui reseptor sendiri. Lihat juga

langsung antagonisme (bawah). Sebagai contoh, adrenalin melemaskan otot polos

bronkus, sehingga mengurangi bronkokonstriksi yang disebabkan oleh histamin

dan leukotrien.

3. Antagonisme farmakokinetik. Di sini, "antagonis" efektif mengurangi

konsentrasi dari obat aktif di situs kerjanya. Misalnya, berulang administrasi

fenobarbital menginduksi peningkatan aktivitas enzim hati yang menonaktifkan

antikoagulan obat warfarin. Oleh karena itu, jika fenobarbital dan warfarin

diberikan bersama-sama, konsentrasi plasma warfarin berkurang, sehingga

menjadi kurang aktif.

4. Antagonisme tidak langsung. Antagonis bertindak pada kedua reseptor hilir

yang menghubungkan aksi agonis untuk respon akhir diamati. Misalnya, β-

adrenoreseptor bloker seperti propranolol mengurangi kenaikan detak jantung

yang disebabkan oleh tidak langsung bertindak simpatomimetik amina seperti

tyramine. Hal ini karena tyramine bertindak dengan melepaskan noradrenalin dari

ujung saraf noradrenergik, dan noradrenalin tindakan dirilis pada β-adrenoreseptor

untuk meningkatkan denyut jantung:

tyramine → pelepasan noradrenalin → aktivasi β-reseptor → respon

Kemungkinan lain adalah bahwa antagonis mengganggu peristiwa pasca-

reseptor lain yang berkontribusi pada respon jaringan. Misalnya, calcium channel

blockers seperti verapamil memblokir masuknya kalsium yang diperlukan untuk

mempertahankan kontraksi otot polos; karenanya, mereka mengurangi respon

kontraktil untuk asetilkolin. Beberapa ahli farmakologi lebih untuk

menggambarkan ini sebagai varian dari antagonisme fungsional (lihat di atas).

1.5.1.2 MEKANISME MELIBATKAN AGONIS RESEPTOR

MAKROMOLEKUL

1. Pengikatan agonis dan antagonis adalah saling eksklusif. Hal ini mungkin

karena agonis dan antagonis bersaing untuk situs pengikatan sama atau

menggabungkan dengan lokasi yang berdekatan yang tumpang tindih.

Kemungkinan ketiga adalah bahwa situs yang berbeda yang terlibat tetapi mereka

berinteraksi dalam sedemikian rupa sehingga agonis dan antagonis molekul tidak

dapat terikat pada reseptor makromolekul pada waktu yang sama. Jenis

antagonisme memiliki dua varian utama:

a. Agonis dan antagonis membentuk kombinasi hanya pendek-panjang dengan

reseptor, sehingga bahwa keseimbangan antara agonis, antagonis, dan reseptor

dapat dicapai selama kehadiran agonis. Interaksi antara antagonis dan situs

pengikatan adalah reversibel bebas. Oleh karena itu, aksi pemblokiran selalu dapat

diatasi dengan meningkatkan konsentrasi agonis, yang kemudian akan menempati

proporsi yang lebih tinggi mengikat situs. Hal ini digambarkan sebagai

antagonisme kompetitif reversibel (lihat nanti). Sebagai contoh, atropin kompetitif

menghambat aksi asetilkolin pada reseptor muscarinic.

b. Antagonis menggabungkan ireversibel (atau efektif sehingga dalam skala

waktu

aplikasi agonis) dengan tempat pengikatan agonis. Ketika reseptor cukup

memiliki telah ireversibel diblokir dengan cara ini, antagonisme ini dapat diatasi

(yaitu, tidak ada jumlah agonis dapat menghasilkan respon penuh karena terlalu

sedikit reseptor diblokir yang kiri). Perhatikan bahwa sebagian besar farmasi

sekarang menggambarkan ini sebagai ireversibel kompetitif antagonisme, yang

merupakan istilah yang digunakan dalam akun ini, yang lain menganggapnya

sebagai tidak kompetitif. Misalnya, phenoxybenzamine membentuk ikatan

kovalen pada atau dekat situs mengikat agonis pada α-adrenoreseptor,

menghasilkan antagonisme diatasi.

2. Antagonisme nonkompetitif terjadi ketika agonis dan antagonis dapat terikat,

pada saat yang sama, untuk wilayah yang berbeda dari makromolekul reseptor.

Hal ini kadang-kadang juga disebut sebagai allotopic atau alosterik antagonisme

(allotopic berarti "tempat yang berbeda" dalam Berbeda dengan syntopic, yang

berarti "tempat yang sama", karena catatan di alosterik, lihat Lampiran 1.6A

[Bagian 1.6.7.1]). Pada prinsipnya, antagonis kompetitif dapat berupa reversibel

atau

GAMBAR 1.16 Efek diprediksi dari tiga konsentrasi antagonis kompetitif

reversibel, B, pada log hubungan konsentrasi-respon untuk agonis. Perhitungan

rasio konsentrasi (r3) untuk konsentrasi tertinggi antagonis, [B] 3, diilustrasikan.

ireversibel. Sebuah contoh dari mantan adalah bahwa hexamethonium

reversibel mengurangi aksi asetilkolin pada reseptor nicotinic sel ganglion

simpatik dengan menghalangi saluran ion yang intrinsik dengan reseptor nicotinic.

Perhatikan bahwa istilah kompetitif kadang-kadang diperluas untuk mencakup

bentuk antagonisme yang tidak melibatkan agonis reseptor makromolekul (lihat,

misalnya, antagonisme langsung di bagian sebelumnya).

1.5.2 REVERSIBEL ANTAGONISME KOMPETITIF

Kita mulai dengan meneliti bagaimana antagonis kompetitif reversibel

(misalnya, atropin) mengubah hubungan konsentrasi-respon untuk tindakan

agonis (misalnya, asetilkolin). Sekarang ditemukan eksperimental bahwa

kehadiran antagonis seperti menyebabkan log konsentrasi-respon kurva untuk

agonis akan bergeser ke kanan, sering tanpa perubahan kemiringan atau respon

maksimal. Antagonisme ini diatasi, umumnya melalui berbagai konsentrasi

antagonis, sebagai diilustrasikan pada Gambar 1.16.

Luasnya pergeseran paling dinyatakan sebagai rasio konsentrasi, * yang

didefinisikan sebagai faktor dimana konsentrasi agonis harus ditingkatkan untuk

mengembalikan respon yang diberikan di hadapan dari antagonis. Perhitungan

rasio konsentrasi dilakukan sebagai berikut. Pertama, tertentu besarnya respon

yang dipilih. Hal ini sering 50% dari maksimum dicapai, tetapi pada prinsipnya

nilai apapun yang akan dilakukan; ** 40% telah diambil dalam ilustrasi. Dengan

tidak adanya antagonis, ini respon ditimbulkan oleh konsentrasi agonis, [A].

Ketika antagonis hadir, agonis konsentrasi harus ditingkatkan dengan faktor r

(yaitu, r[A]). Dengan demikian, untuk konsentrasi antagonis [B]3 pada Gambar

1.16, rasio konsentrasi r3 = r3[A]/[A]). Logaritma negatif dari konsentrasi

antagonis yang menyebabkan rasio konsentrasi x biasanya dilambangkan dengan

pax. Istilah ini diperkenalkan oleh H.O. Schild sebagai ukuran empiris dari

aktivitas antagonis. Nilai yang paling sering dikutip adalah pA2, di mana

* Atau dosis rasio - kedua istilah yang digunakan.

** Jelas itu masuk akal untuk menghindari ujung ekstrim dari jangkauan.

Rasio konsentrasi juga dapat diperkirakan dengan menggunakan leastsquares

Prosedur minimalisasi agar sesuai dengan persamaan Hill (lihat Bagian 1.2.2 dan

1.2.4.3), atau beberapa fungsi lain yang cocok, untuk masing-masing kurva

konsentrasi-respon. Hal ini juga memungkinkan paralelisme dari kurva yang akan

dinilai. Lebih lanjut kemungkinan adalah untuk cocok untuk semua kurva (yaitu,

dengan dan tanpa antagonis) bersamaan dengan mengasumsikan bahwa

persamaan Gaddum memegang (lihat halaman berikutnya) dan dengan

memanfaatkan persamaan Hill, atau fungsi lain, untuk berhubungan aktivasi

reseptor untuk diukur respon jaringan.

pA2 = -log [B] r = 2

Untuk menggambarkan notasi ini kita mempertimbangkan kemampuan

atropin untuk memblokir reseptor muscarinic untuk asetilkolin. Kehadiran atropin

pada konsentrasi hanya 1 nM membuat perlu untuk melipatgandakan konsentrasi

asetilkolin yang dibutuhkan untuk mendapatkan respon submaximal tertentu tisu.

Oleh karena itu, pA2 = 9 untuk tindakan ini atropin (-log (10-9) = 9).

Kami selanjutnya melihat mengapa pergeseran paralel dalam kurva terjadi,

dan pada saat yang sama kita akan memperoleh hubungan sederhana namun yang

paling penting antara jumlah shift, seperti yang diungkapkan oleh rasio

konsentrasi, dan konsentrasi antagonis. Kami akan menganggap bahwa untuk

kesederhanaan ketika jaringan terkena agonis dan antagonis pada saat yang sama,

kedua obat datang dalam keseimbangan dengan situs mengikat reseptor. Pada saat

tertentu, sebuah situs individu dapat ditempati oleh salah satu agonis atau

antagonis molekul, atau mungkin kosong. Relatif proporsi dari total populasi situs

mengikat ditempati oleh agonis dan antagonis diatur, seperti Langley duga (lihat

Pendahuluan (Bagian 1.1)), dengan konsentrasi agonis dan antagonis dan dengan

afinitas dari situs masing-masing. Karena agonis dan antagonis mengikat

reversibel, meningkatkan konsentrasi agonis akan meningkatkan proporsi situs

diduduki oleh agonis, dengan mengorbankan antagonis hunian. Oleh karena itu,

respons akan menjadi lebih besar.

Hukum aksi massa pertama kali diterapkan pada antagonisme kompetitif

dengan Clark, Gaddum, dan Schild pada waktu sebelum pentingnya aktivasi

reseptor dengan isomerisasi didirikan. Itu diasumsikan, karena itu, bahwa

keseimbangan antara agonis, antagonis, dan mengikat bersama mereka situs dapat

diwakili cukup hanya dengan reaksi:

A + R AR

B + R BR

Seperti ditunjukkan dalam Bagian 1.5.5, penerapan hukum aksi massa

terhadap kesetimbangan simultan mengarah pada ekspresi berikut untuk proporsi

dari situs mengikat ditempati oleh agonis:

PAR = (1.48)

Di sini, KA dan KB adalah konstanta kesetimbangan disosiasi untuk

pengikatan agonis dan antagonis, masing-masing. Ini adalah persamaan Gaddum,

dinamai J. H. Gaddum, yang pertama untuk mendapatkan dalam konteks

antagonisme kompetitif. Perhatikan bahwa jika [B] diatur ke nol, kita memiliki

Bukit-Langmuir Persamaan (Bagian 1.2.1).

Jika, sebaliknya, kita mengambil sebagai titik awal mekanisme Castillo-

Katz del untuk aktivasi reseptor (Lihat Persamaan (1.7)), tiga kesetimbangan

harus dipertimbangkan:

KA E

A+R AR AR*

Menerapkan hukum aksi massa (lihat Bagian 1.5.5), kita memperoleh

ekspresi berikut untuk proporsi reseptor dalam keadaan aktif:

PAR* = (1.49)

Di sini, KA dan E sebagaimana disebutkan dalam Pasal 1.2.3, dan KB,

seperti sebelumnya, adalah konstanta untuk kombinasi antagonis dengan situs

pengikatan kesetimbangan disosiasi. Jika [B] diatur ke nol, kita punya persamaan.

(1,32).

Persamaan (1,48) dan (1,49) mewujudkan hukum yang Langley

menyimpulkan harus berhubungan jumlah dari "senyawa" ia mendalilkan dengan

konsentrasi agonis dan antagonis (lihat Bagian 1.1). Namun, dalam rangka untuk

menerapkan hukum ini untuk masalah praktis memahami bagaimana kompetitif

antagonis akan mempengaruhi respon terhadap agonis, kita perlu membuat

beberapa asumsi tentang hubungan antara respon dan proporsi reseptor aktif.

Gaddum dan Schild diakui bahwa cara terbaik untuk melanjutkan adalah untuk

menganggap bahwa respon yang sama (katakanlah, 30% dari maksimum dicapai)

berhubungan dengan aktivasi reseptor yang sama dengan agonis apakah agonis

bertindak sendiri atau pada konsentrasi tinggi di hadapan antagonis kompetitif.

asumsi ini membuat tidak perlu untuk mengetahui bentuk yang tepat dari

hubungan antara aktivasi reseptor dan respon. Ini adalah kemajuan yang paling

penting, namun yang jelas mungkin tampak pada melihat ke belakang.

Kita sekarang dapat mempertimbangkan sebuah percobaan di mana respon

tertentu (misalnya, 30% dari maksimum) ditimbulkan pertama dengan konsentrasi

agonis, [A], bertindak sendiri dan kemudian dengan konsentrasi yang lebih besar

(r [A]), jika A diterapkan di hadapan antagonis. Di sini, r adalah rasio konsentrasi,

sudah didefinisikan. Karena Par * diasumsikan sama dalam dua situasi, kita

kemudian dapat menulis, dari Persamaan. (1.49): *

Di sini, sisi kiri memberikan fraksi reseptor dalam keadaan aktif ketika A

diterapkan pada perusahaan sendiri. Fraksi ini diasumsikan sama ketika respon

identik ditimbulkan dengan menerapkan agonis pada peningkatan konsentrasi (r

[A]) di hadapan antagonis pada konsentrasi [B] (sisi kanan dari persamaan).

Membagi setiap istilah di sisi kanan dengan r, kita memiliki:

Jika ekspresi di sebelah kiri dan kanan untuk mengambil nilai yang sama,

persamaan berikut harus memegang:

Oleh karena itu,

Ini adalah persamaan Schild, yang pertama kali dinyatakan dan diterapkan

pada studi antagonisme kompetitif dengan HO Schild pada tahun 1949. Ini

mungkin hubungan kuantitatif yang paling penting dalam farmakologi dan telah

terbukti berlaku untuk tindakan banyak antagonis kompetitif atas berbagai

konsentrasi. Meskipun awalnya berasal berdasarkan skema sederhana untuk

aktivasi reseptor dijelaskan dalam Bagian 1.2.1 dan 1.2.2, memegang sama untuk

del Castillo-Katz skema, seperti yang kita baru saja menunjukkan, serta untuk

model yang lebih kompleks di mana reseptor adalah konstitutif aktif.

Salah satu prediksi dari persamaan Schild adalah bahwa antagonis

kompetitif reversibel harus menyebabkan pergeseran paralel dalam log agonis

kurva konsentrasi-respon (seperti yang diilustrasikan pada Gambar 1.16; lihat juga

Gambar 1.18). Hal ini karena jika persamaan memegang, rasio konsentrasi,r,

Ditentukan hanya dengan nilai-nilai [B] dan KB , Terlepas dari konsentrasi dan

bahkan identitas agonis (asalkan bertindak melalui reseptor yang sama seperti

antagonis). Dengan logaritmik skala, nilai konstan r sesuai dengan pemisahan

konstan konsentrasi-respon kurva, yaitu, paralelisme, karena log ( r [A]) - log [A]

= log r + Log [A] - log [A] = log r , apa pun nilai [A].

Mungkin aplikasi yang paling penting dari persamaan Schild adalah bahwa

ia menyediakan cara memperkirakan konstanta kesetimbangan disosiasi untuk

kombinasi antagonis dengan nya situs pengikatan. Serangkaian agonis kurva

konsentrasi-respon didirikan, fi rst tanpa dan kemudian dengan meningkatnya

konsentrasi antagonis ini, dan diuji untuk paralelisme. Jika kondisi ini terpenuhi,

nilai ( r- 1) diplot terhadap konsentrasi antagonis, [B]. Ini harus memberikan garis

lurus dengan kemiringan sama dengan kebalikan dari KB.

Lebih biasanya, keduanya (r- 1) dan [B] diplot pada skala logaritmik (yang

Schild petak). Itu hasil harus menjadi garis lurus dengan kemiringan kesatuan, dan

mencegat di x sumbu menyediakan perkiraan log KB. Dasar pernyataan ini dapat

dilihat dengan mengekspresikan persamaan Schild dalam bentuk logaritmik :

log(rŔ 1) = log[B] Ŕ log KB```

(1.51)

Sebuah plot Schild (berdasarkan hasil eksperimen siswa kelas pada efek

atropin pada respon kontraktil hamster ileum ke asetilkolin) ditunjukkan pada

Gambar 1.17. Perhatikan bahwa garis lurus, dan kemiringannya dekat dengan

persatuan, seperti Pers. (1.51) memprediksi.

GAMBAR 1.17 Schild plot untuk aksi atropin dalam pertentangan aksi asetilkolin

pada kelinci-babi ileum. Setiap titik memberikan mean ± standard error dari mean

dari jumlah observasi ditampilkan.

Bagaimana mungkin nilai pA2 ditafsirkan dalam istilah-istilah ini? Jika

persamaanSchild dipatuhi, pA 2 kemudian memberikan perkiraan-log KB , Karena,

dari Persamaan. (1.51):

Istilah pKB bsering digunakan untuk menunjukkan-log KB.*

Untuk meringkas ke titik ini, antagonisme kompetitif reversibel memiliki

karakteristik sebagai berikut :

1. Tindakan antagonis dapat diatasi oleh suffi peningkatan koefisien dalam

konsentrasi agonis (yaitu, antagonisme ini dpt diatasi).

2. Di hadapan antagonis, kurva berkaitan log dari konsentrasi agonis dengan

ukuran respon digeser ke kanan secara paralel.

3. Hubungan antara besarnya pergeseran (seperti yang diungkapkan oleh

konsentrasi rasio) dan konsentrasi antagonis mematuhi persamaan Schild

1.5.3 APLIKASI PRAKTIS DARI STUDI REVERSIBEL KOMPETITIF

ANTAGONISME

Penelitian kuantitatif antagonisme kompetitif dengan metode yang baru saja

dijelaskan memiliki kegunaan penting:

1. The identifikasikation dan karakterisasi reseptor. Mengukur nilai KB untuk

aksi antagonis kompetitif baik ditandai dapat memungkinkan identifikasifi

kation dari jenis tertentu dari reseptor dalam persiapan jaringan atau sel.

Misalnya, jika jaringan adalah ditemukan untuk menanggapi asetilkolin, dan

jika respon antagonized oleh atropin dengan ap KB nilai sekitar 9, maka

reseptor yang terlibat cenderung muscarinic. Sebaiknya, lebih dari satu

antagonis harus digunakan, yang dapat memungkinkan subtipe reseptor untuk

diidentifikasikanfied. Misalnya, jika respon hanya disebutkan diblokir oleh

antagonis muscarinic pirenzepine dengan pKB dari 7,9-8,5, dan nilai yang

sesuai untuk antagonis himbacine ditemukan menjadi 7-7,2, maka reseptor ini

sangat mungkin dari M1 subtipe.

2. Penilaian antagonis kompetitif baru. Prosedur yang dikembangkan oleh

Gaddum dan Schild amat berharga bagi pengembangan antagonis kompetitif

baru. Contohnya termasuk H2 antagonis reseptor seperti cimetidine yang

mengurangi lambung sekresi asam (lihat di bawah), dan 5HT 3 antagonis

reseptor seperti ondansetron, yang dapat mengontrol mual dan muntah yang

disebabkan oleh obat sitotoksik. ini kompetitif antagonis, dan lain-lain, yang

ditemukan oleh pemeriksaan yang cermat dari hubungan antara struktur kimia

dan aktivitas biologis, sebagaimana dinilai oleh metode Gaddum dan Schild.

Memiliki ukuran yang dapat diandalkan perubahan affinity akibat

memodifikasi struktur kimia obat yang potensial memberikan ahli kimia obat

dengan kuat alat untuk menemukan senyawa dengan aktivitas yang lebih besar

dan selectivit.

3. Klasifikasi agonis. Pada pandangan pertama, ini mungkin tampak sebuah

aplikasi mengejutkan dari metode yang dikembangkan terutama untuk studi

antagonis. Namun, ingat bahwa hanya

* Perbedaan antara pKB dan pA2 halus tetapi dapat menjadi penting. pA2,

Sebagai Schild defined itu, merupakan empiris mengukur dari aksi antagonis,

tanpa mengacu pada teori. Hal ini dapat diukur apakah prediksi Schild persamaan

telah dipenuhi. Dengan demikian, mencegat dari plot Schild pada absis

memberikan perkiraan pA2 bahkan jika kemiringan garis tidak kesatuan. Namun,

jika garis adalah memadai defined eksperimen dan lurus (tapi memiliki

kemiringan yang tidak kesatuan, meskipun tidak berbeda signifi signifikan dari

itu), maka itu adalah umum, dan tepat, untuk membatasi lereng untuk persatuan.

Itu mencegat pada absis kemudian memberikan perkiraan bukan dari pA2 tapi pKB

, Sebagai defined atas. pKB dan pA2 bertepatan hanya jika lereng adalah persis

kesatuan dan tidak ada faktor rumit yang hadir. Jika kemiringan plot Schild

berbeda signifi signifikan dari kesatuan, sehingga persamaan Schild tidak

tahan,KB tidak dapat diperkirakan.

GAMBAR 1.18 Tanggapan hamster ileum untuk histamin (H) dan

pyridylethylamine (P) dalam ketiadaan dan Kehadiran diphenhydramine (D, pada

3,3 ng / ml). Pergeseran yang sama dalam baris (dari H ke H + D dan dari P ke P

+ D) menunjukkan bahwa kedua agonis bertindak pada reseptor yang sama. (Dari

Arunlakshana, O. dan Schild, H. O., Br.J. Pharmacol, 14, 48-58, 1959).

Rasio konsentrasi agonis muncul dalam persamaan Schild, bukan nilai yang

sebenarnya dari konsentrasi. Maka, agar antagonis kompetitif diberikan bertindak

difixed konsentrasi, rasio konsentrasi harus sama untuk semua agonis bertindak

melalui reseptor di mana antagonis bertindak. Jadi adalah mungkin untuk menguji

apakah suatu agonis baru bertindak pada reseptor yang diberikan oleh memeriksa

apakah rasio konsentrasi adalah sama untuk Novel agonis seperti itu untuk agonis

baik ditandai dikenal untuk bertindak di reseptor itu. Gambar 1,18, dari karya

Arunlakshana dan Schild, menggambarkan pendekatan. Hal ini dapat dilihat

bahwa diphenhydramine antagonis kompetitif, yang bertindak di H1-reseptor,

menyebabkan persis pergeseran yang sama (yaitu, rasio konsentrasi yang sama)

log konsentrasi kurva tion-respon untuk pyridylethylamine seperti untuk histamin.

Hal ini sangat menyarankan bahwa pyridylethylamine bertindak melalui reseptor

yang sama seperti histamin, meskipun hampir 100 kali lebih aktif sebagai agonis.

Penerapan prinsip-prinsip ini juga digambarkan oleh karya klasik JW Hitam

dan rekan, yang menyebabkan penemuan fiantagonis kompetitif rst bertindak di

H2-reseptor untuk histamin. Meskipun tujuan utama dari penelitian ini adalah

untuk mengembangkan senyawa yang akan mengurangi sekresi asam lambung

pada penyakit, banyak pekerjaan dilakukan tidak dengan jaringan sekretori tetapi

dengan dua terisolasi persiapan jaringan: hamster atrium dan uterus tikus. Ini

dapat digunakan karena mereka terbukti memiliki reseptor histamin dari jenis

yang sama (H2) Seperti dalam sekresi asam lambung. Juga, mereka tanggapan

terhadap histamin (tingkat peningkatan kontraksi atrium dan relaksasi rahim tikus)

yang lebih mudah diukur daripada yang sekresi lambung. Hal ini memungkinkan

sejumlah besar senyawa yang akan diuji.

Hasil yang sukses termasuk sintesis burimamide, yang first H2-receptor

antagonist untuk diuji pada manusia. Tabel 1.1 membandingkan kemampuannya

untuk memusuhi tindakan tiga agonis pada hamster atrium: histamin, 4

methylhistamine, dan 2-methylhistamine. Itu KB nilai-nilai yang hampir sama,

meskipun potensi yang berbeda-beda dari agonis, menunjukkan bahwa ketiga

agonis yang bertindak melalui reseptor yang sama (lihat butir 3 dalam daftar di

atas).

Tabel 1.2 menunjukkan bahwa nilai KB untuk blokade oleh burimamide dari

aksi histamin pada rahim tikus hampir sama seperti untuk hamster atrium, seperti

yang diharapkan jika reseptor dalam dua jaringan yang sama (lihat butir 1 dalam

daftar di atas). Sebaliknya, ketika burimamide diuji untuk tindakan penghambatan

terhadap H1-dimediasi tindakan kontraktil histamin pada hamster ileum,

ditemukan menjadi sekitar 40 kali lipat kurang aktif (sebagaimana dinilai oleh

jelas KB value). Selain itu, karakteristik penghambatan tidak lagi serupa dengan

prediksi antagonisme kompetitif. Dengan demikian, kemiringan plot Schild,

sebesar 1,32, adalah signifisignifikan lebih besar daripada satu. Selanjutnya,

ketika burima-mide telah diuji terhadap carbachol (karbamoil kolin), yang juga

kontrak guinea-pig ileum.

TABEL 1.1 Perbandingan Antagonisme dengan Burimamide dari

Tindakan

Histamin dan Dua Agonis Terkait di Guinea-Pig Atria.

Agonis

Histamine

4-Methylhistamine

2-Methylhistamine

EC50 pada Guinea Pig-

Atria (µM)

1.1

3.1

19.8

Disosiasi Equilibrium

Konstan (KB) untuk

blokir

Burimamide

(µM)

7.8

7.2

6.9

Sumber: Dari Black, JW et al, Nature, 236, 385-390, 1972

TABEL 1.2 Perbandingan Kemampuan Burimamide untuk Menghalangi

Tindakan Histamin di Guinea-Pig (G.-P.) ileum dan Atrium pada rat uterus

Jaringan

G.-P.atrium

(H2)

Rat uterus (H2)

G.-P.ileum (H1)

G.-P. ileum

agonis

Histamine

Histamine

Histamine

Carbachol

ns

(kemiringan Schild

Plot)

0.98

0.96

1.32

1.44

Jelas Disosiasi

Equilibrium

Konstan (KB) untuk

Pemblokiran Aksi

Burimamide

(µM)

7.8

6.6

288

174

Sumber: Dari Black, JW et al, Nature, 236, 385-390, 1972

GAMBAR 1.19 plot Schild untuk antagonisme noradrenalin oleh phentolamine,

terisolasi di membran cat. Nilai-nilai diplot adalah sarana (± SE) selama empat

sampai lima percobaan. Tertutup lingkaran, denervated membran pengerjap,

lingkaran terbuka, membran normal, b menunjukkan lereng. Kemiringan nilai

untuk membran normal dihitung untuk tiga konsentrasi terendah dan dua

konsentrasi tertinggi dari phentolamine. (Dari Furchgott, RF, Handbook of

Experimental Farmakologi, Vol. 23, 1972, hlm 283-335, berdasarkan hasil

Langer, SZ dan Trendelenburg, U., J. Pharmacol. Exp. Ther., 167, 117-142,

1969.)

Temuan ini menyarankan penjelasan dalam hal kehadiran di normal tetapi

tidak otot denervated dari mekanisme pengambilan neuronal (uptake1) untuk

noradrenalin. Proses ini serapan bisa sangat efektif sehingga, ketika noradrenalin

ditambahkan ke cairan mandi, konsentrasi dicapai di pedalaman persiapan

(terutama jika itu adalah relatif tebal) mungkin jauh kurang dari itu diterapkan.

Sebagai berdifusi noradrenalin di, sebagian diambil oleh saraf adrenergik,

sehingga gradien konsentrasi besar dipertahankan. Sehubungan dengan hal ini,

blokade uptake1 (misalnya, dengan kokain) dapat sangat mempotensiasi aksi

noradrenalin, seperti digambarkan secara skematik pada Gambar 1.20. Garis

paling kiri penuh menunjukkan kontrol kurva konsentrasi-respon untuk jaringan

adrenergically diinervasi. Garis putus-putus (ekstrim kiri) merupakan konsekuensi

dari menghalangi proses penyerapan, konsentrasi yang lebih rendah dari

noradrenalin sekarang cukup untuk mendapatkan respon yang diberikan * Garis

penuh pada sebelah kanan menunjukkan perpindahan kurva kontrol yang

disebabkan oleh penerapan phentolamine. , dan garis putus-putus hanya untuk kiri

menggambarkan efek memblokir penyerapan ketika phentolamine hadir.

Perhatikan bahwa garis putus-putus ini lebih dekat ke garis penuh daripada yang

terlihat dengan sepasang kurva di sebelah kiri. Hal ini karena pengaruh serapan

(yang merupakan proses saturable) pada konsentrasi lokal noradrenalin akan

secara proporsional lebih kecil ketika konsentrasi noradrenalin besar diterapkan,

seperti yang diperlukan untuk mengembalikan respon di hadapan phentolamine.

Oleh karena itu, rasio konsentrasi akan lebih besar jika uptake1 kurang, seperti di

jaringan kronis denervated.

contoh 2

Gambar 1.21, seperti Gambar 1.19, menunjukkan dua plot Schild, salah

satunya (lingkaran terbuka) berangkat sangat dari perilaku yang diharapkan.

Penyimpangan terjadi ketika noradrenalin adalah agonis dan lagi dapat

dipertanggungjawabkan dalam hal pengurangan konsentrasi lokal yang

disebabkan oleh proses uptake1

GAMBAR 1.20 kurva konsentrasi-respon hipotetis untuk menggambarkan

bagaimana proses uptake1 dapat mempengaruhi studi tentang antagonisme

noradrenalin oleh phentolamine. Dua baris penuh menunjukkan respon terhadap

noradrenalin, pertama dalam ketiadaan dan kemudian di hadapan phentolamine.

Jika percobaan ini diulang, tapi dengan proses serapan diblokir, garis putus-putus

akan diperoleh. Noradrenalin telah menjadi lebih aktif, dan phentolamine

sekarang menyebabkan pergeseran besar (bandingkan panjang dari dua panah

horisontal), seperti yang dijelaskan dalam teks.

Penyimpangan dari perilaku yang diharapkan juga akan terlihat saat

antagonis memiliki tindakan tambahan pada konsentrasi diperiksa. Contoh

disediakan oleh kemampuan reversibel tubocurarine antagonis kompetitif untuk

memblokir saluran ion yang terbuka saat reseptor nicotinic diaktifkan. Hal ini

dijelaskan dalam Bab 6, seperti komplikasi diperkenalkan oleh kehadiran pada

seperti saluran ion ligand-gated dari dua situs agonis mengikat yang mungkin atau

mungkin tidak memiliki afinitas yang sama untuk antagonis. Nonlinier Schild plot

dapat muncul dalam banyak cara lain. Salah satu penyebab adalah kegagalan

untuk memberikan waktu yang cukup untuk antagonis untuk mencapai

kesetimbangan dengan reseptor. Sebagaimana dibahas di Bagian 1.3.2, tingkat di

mana ligan menyeimbangkan dengan situs mengikat menjadi lebih lambat pada

konsentrasi yang lebih rendah (lihat Gambar 1.3). Oleh karena itu, jika paparan

yang terlalu pendek, rasio konsentrasi akan proporsional rendah pada konsentrasi

tersebut, dan plot Schild akan lebih tinggi di daerah ini dari yang diperkirakan.

Nonlinier Schild plot juga bisa terjadi ketika respon jaringan yang ditengahi oleh

lebih dari satu reseptor dengan afinitas yang berbeda untuk antagonis. Komplikasi

ini, dan beberapa lainnya, telah dijelaskan oleh TP Kenakin, yang account rinci

tentang analisis antagonisme kompetitif dianjurkan (lihat bagian Bacaan lebih

lanjut).

GAMBAR 1.21 Schild plot untuk antagonisme dengan propranolol dari tindakan

noradrenalin (lingkaran terbuka) dan isoprenalin (lingkaran tertutup) pada

kekuatan kontraktil atrium terisolasi marmot. × menunjukkan nilai yang diperoleh

dengan noradrenalin sebagai agonis tetapi dengan adanya kokain (20 M). (Dari

Furchgott, RF, Buku Pegangan Farmakologi Eksperimental, Vol 23, 1972, hlm

283-335, Berdasarkan hasil Berkedip, JR, Ann NY Acad Sci, 139, 673-685,

1967).

1.5.5 LAMPIRAN BAGIAN 1.5: PENERAPAN HUKUM MASSA AKSI

UNTUK ANTAGONISME KOMPETITIF REVERSIBEL

Analisis klasik antagonisme kompetitif, menyusul Gaddum dan Schild. Kita

mulai dengan asumsi bahwa baik agonis (A) dan antagonis (B) bergabung dengan

situs mereka mengikat menurut hukum aksi massa dan dengan cara yang dapat

diwakili oleh dua reaksi

Tugas kita adalah untuk mengetahui bagaimana proporsi reseptor ditempati

oleh agonis bervariasi dengan konsentrasi agonis dan antagonis. Equilibrium

diasumsikan. Menerapkan hukum aksi massa memberikan:

Antagonisme kompetitif di del Castillo skema-Katz untuk aktivasi reseptor

(lihat Bagian 1.2.3, Persamaan. (1,7)).

Reseptor isomerisasi ke bentuk aktif terjadi ketika situs pengikatan ditempati

oleh A tetapi tidak oleh antagonis B:

Menerapkan hukum aksi massa untuk masing-masing tiga kesetimbangan, kita

memiliki :

Seperti dalam Bagian 1.2.1, persamaan ini dapat ditulis ulang dalam hal

proporsi situs mengikat yang bebas (pR) atau diduduki oleh salah A (PAR) atau B

(pBR):

Sebuah reseptor individu baik kosong atau diduduki oleh agonis atau

antagonis molecule.Hence,

Kita perlu tahu Par, jadi kita gunakan Pers. (1,52) dan (1,53) untuk

menggantikan pR dan pBR dalam Pers. (1.54):

Di mana KB adalah konstan untuk kombinasi B dengan situs pengikatan

kesetimbangan disosiasi, dan KA dan E sebagai didefinisikan sebelumnya.

Persamaan ini dapat ditulis dalam bentuk pecahan reseptor dalam kondisi yang

berbeda:

Menjumlahkan fraksi reseptor, kita memiliki:

Mengganti mendapatkan PAR * memberikan:

1.6 TINDAKAN HAMBAT AT RESEPTOR: II. DIATASI ANTAGONISME

1.6.1 IREVERSIBEL ANTAGONISME KOMPETITIF

Dalam bentuk antagonisme obat, antagonis membentuk kombinasi bersama

abadi atau bahkan ireversibel dengan baik situs pengikatan agonis atau wilayah yang

berhubungan dengan itu sedemikian rupa sehingga agonis dan antagonis molekul

tidak dapat terikat pada waktu yang sama. Ireversibel dalam konteks ini berarti bahwa

pemisahan antagonis dari tempat ikatannya sangat lambat dalam kaitannya dengan

durasi aplikasi agonis. Ini merupakan kualifikasi penting karena laju disosiasi dapat

sangat bervariasi dari antagonis ke antagonis. Untuk beberapa, jam atau bahkan

berhari-hari mungkin diperlukan sehingga tidak ada penurunan berarti dalam hunian

selama 60 detik atau lebih yang agonis mungkin diterapkan. Orang lain mungkin

memisahkan lebih cepat dan surmountability blok kemudian akan tergantung pada

berapa lama agonis hadir dan juga pada seberapa baik respons terhadap agonis

dipertahankan dalam jaringan tertentu. Dalam kondisi fisiologis, agonis alami

(misalnya, neurotransmitter) dapat hadir untuk waktu yang sangat singkat memang -

hanya milidetik atau kurang untuk asetilkolin dilepaskan dari ujung saraf motorik

pada otot rangka. Ini tidak mungkin cukup lama untuk memungkinkan penurunan

yang cukup dalam reseptor hunian oleh antagonis kompetitif seperti tubocurarine,

yang karenanya akan efektif ireversibel pada skala Timen ini. Namun, jika interaksi

antara asetilkolin dan tubocurarine dipelajari dengan cara farmakologis klasik, di

mana kedua agen diterapkan untuk waktu yang cukup untuk ekuilibrium yang akan

dicapai, tindakan memblokir kemudian menunjukkan semua karakteristik dari

antagonisme kompetitif reversibel (meskipun dengan tambahan fitur yang

tubocurarine juga blok saluran ion terbuka). Sebuah contoh dari antagonis ireversibel

dengan tindakan yang sangat panjang (biasanya banyak jam) adalah

phenoxybenzamine, yang menghambat α-adrenoseptor dan, kurang potently, reseptor

H1-histamin dan muscarinic. Strukturnya ditunjukkan di bawah ini. Juga

digambarkan adalah benzilylcholine mustard, blocker ireversibel sangat aktif dan

selektif reseptor muscarinic.

Kedua senyawa tersebut adalah β-haloalkylamines, yaitu, mereka mengandung

pengelompokan:

di mana X adalah atom halogen. Sekali dalam larutan berair, agen tersebut cyclize

membentuk ion ethyleneiminium tidak stabil (Gambar 1.22). * Ion ini cenderung

memiliki afinitas yang lebih besar dari molekul induk untuk situs mengikat reseptor,

karena ikatan ion sekarang dapat terbentuk. Ketika dermaga ion ethyleneiminium

dengan situs pengikatan, dua hasil yang mungkin. Salah satunya adalah bahwa

setelah interval pendek, yang memisahkan ion dari situs. Yang lain adalah bahwa

cincin ethyleneiminium terbuka untuk menciptakan perantara yang reaktif, dengan

konsekuensi bahwa ikatan kovalen antara molekul obat dan situs mengikat dapat

dibentuk. Akibatnya, reseptor menjadi dialkilasi, seperti digambarkan pada Gambar

1.22. **

Kelompok-kelompok yang dapat dialkilasi dengan cara ini meliputi-SH,-OH,

=NH, dan-COOH, namun tidak semua antagonis ireversibel bertindak dengan

membentuk ikatan kovalen. Beberapa orang mungkin "cocok" tempat pengikatan

dengan baik sehingga kekuatan gabungan dari jenis lain dari interaksi antarmolekul

(ion, hidrofobik, van der Waals, ikatan hidrogen) yang ikut bermain pendekatan yang

dari link kovalen.

1.6.2 BEBERAPA APLIKASI ANTAGONIS IREVERSIBEL

1.6.2.1 Reseptor Pelabelan

Alkilasi semacam itu diilustrasikan pada Gambar 1.22, tetapi menggunakan

ligan radiolabeled, menyediakan sarana pelabelan situs pengikatan (s) makromolekul

reseptor. *** Jaringan yang terkena antagonis berlabel cukup lama untuk

memungkinkan dikombinasikan dengan sebagian besar reseptor. Hal ini kemudian

dicuci dengan larutan ligan bebas sehingga terikat atau antagonis longgar terikat

dapat berdifusi pergi, meninggalkan (idealnya) hanya reseptor kovalen berlabel.

Sebuah pendekatan yang terkait adalah dengan menggunakan label foto-afinitas. Ini

adalah senyawa yang tidak hanya afinitas untuk reseptor tetapi juga milik mogok

untuk membentuk penyerapan berikut antara reaktif energi cahaya dengan panjang

gelombang yang tepat. Sensitivitas cahaya semacam ini sering dapat dicapai dengan

melampirkan kelompok azido (-N3) ke molekul obat. Label foto-afinitas yang

dihasilkan diperbolehkan untuk menyeimbangkan dengan tisu atau membran

persiapan, yang kemudian terkena cahaya yang kuat. Hasil (untuk azida) adalah

pembentukan nitrene sangat reaktif yang menggabungkan dengan segera struktur

yang berdekatan (termasuk, diharapkan, para

GAMBAR 1.22 alkilasi dari reseptor oleh β-haloalkylamine.

mengikat wilayah reseptor), untuk membentuk ikatan kovalen, sehingga "tagging"

tempat pengikatan (s). * Ini dapat memberikan langkah pertama menuju isolasi

reseptor.

1.6.2.2 Menghitung Reseptor

Jika antagonis dapat radiolabeled, prosedur umum yang sama dapat digunakan

untuk memperkirakan jumlah reseptor dalam jaringan utuh, sepanjang kegiatan-

kegiatan tertentu (misalnya, radioaktivitas dinyatakan dalam jumlah material) ligan

dikenal. Sebuah contoh awal adalah penerapan 125I-atau 131I-berlabel α-

bungarotoxin untuk menentukan jumlah reseptor nicotinic di wilayah endplate otot

rangka. Hal ini menunjukkan bahwa kelemahan otot yang mencirikan myasthenia

gravis, penyakit yang mempengaruhi transmisi impuls dari saraf motorik ke otot

rangka, hasil dari pengurangan jumlah reseptor nicotinic. Sebuah varian dari teknik,

menggunakan α-bungarotoxin berlabel dengan kelompok neon, memungkinkan

reseptor untuk bisa divisualisasikan dengan mikroskop cahaya.

1.6.2.3 Percobaan Perlindungan Receptor

Tingkat di mana antagonis ireversibel menginaktivasi reseptor akan dikurangi

dengan kehadiran simultan agonis reversibel atau antagonis kompetitif yang bertindak

di situs pengikatan yang sama. Agen reversibel, oleh situs pendudukan, menurunkan

jumlah ireversibel diblokir dalam suatu periode tertentu, reseptor dikatakan ini bisa

menjadi alat yang berguna untuk karakterisasi obat serta reseptor "dilindungi.".

Misalnya, RF Furchgott (yang memperkenalkan metode) menguji kemampuan tiga

agonis (noradrenalin, adrenalin, dan isoprenalin) untuk melindungi terhadap agen

alkylating dibenamine (senyawa phenoxybenzamine seperti) diterapkan pada strip

aorta kelinci. Setiap agonis dilindungi respon terhadap dua lainnya. Dengan

demikian, setelah jaringan telah terkena dibenamine dengan adanya konsentrasi besar

noradrenalin, diikuti oleh periode cuci bebas narkoba, adrenalin dan isoprenalin serta

noradrenalin masih bisa menyebabkan kontraksi. Sama paparan dibenamine sendiri

dihapuskan respon terhadap aplikasi berikutnya dari masing-masing agonis yang

sama. Hal ini memberikan bukti bahwa ketiga agonis menyebabkan kontraksi dengan

bertindak pada reseptor umum (sekarang mapan untuk menjadi subtipe α-

adrenoseptor), yang pasti pada saat itu.

Contoh lain dari perlindungan reseptor, tetapi menggunakan antagonis

kompetitif daripada agonis, disediakan oleh kemampuan tubocurarine untuk

memperlambat terjadinya aksi pemblokiran α-bungarotoxin pada sambungan

neuromuskuler. Perhatikan bahwa tingkat perlindungan reseptor akan tergantung

tidak hanya pada konsentrasi relatif dan kedekatan satu antagonis reversibel dan

ireversibel, tetapi juga pada waktu yang diizinkan untuk interaksi mereka dengan

reseptor, seperti dijelaskan dalam Bab 5. Mengingat waktu yang cukup, antagonis

sepenuhnya ireversibel akhirnya akan menempati semua situs mengikat, bahkan di

hadapan konsentrasi tinggi ligan reversibel.

1.6.3 PENGARUH ANTAGONIS KOMPETITIF TAK DAPAT DIUBAH PADA

TANGGAPAN UNTUK AGONIS

Sebuah eksposur yang memadai jaringan ke sebuah hasil antagonis ireversibel

dalam antagonisme diatasi - respon tidak dapat sepenuhnya pulih dengan

meningkatkan konsentrasi agonis, diterapkan untuk periode biasa. Hal ini karena situs

mengikat individu, sekali tegas ditempati oleh antagonis, adalah "keluar dari

bermain," berbeda dengan keseimbangan dinamis antara agonis dan antagonis yang

merupakan karakteristik dari antagonisme kompetitif reversibel. Oleh karena itu,

biasanya dalam pekerjaan dengan antagonis ireversibel yang membentuk ikatan

kovalen untuk menerapkan senyawa untuk cukup lama untuk itu untuk menempati

fraksi yang dibutuhkan dari situs mengikat, dan kemudian untuk mencuci jaringan

dengan larutan obat bebas sehingga terikat .

GAMBAR 1.23 Pengaruh paparan 10-menit untuk dua konsentrasi senyawa

phenoxybenzamine seperti, dibenamine (DB), pada respon kontraktil strip kelinci

aorta ke adrenalin (epinefrin). (Dari Furchgott, RF, Adv Drug Res.., 3, 21-55, 1966.).

antagonis dapat menyebar jauh. Perubahan respon terhadap agonis sekarang dapat

dipelajari. Hasil percobaan semacam ini diilustrasikan dalam Gambar 1,23 dan 1,24.

Keluarga kurva konsentrasi-respon pada Gambar 1.23 menunjukkan efek dari

agen alkilasi pada respon kontraktil kelinci aorta adrenalin. Perhatikan penurunan

respon maksimal, keberangkatan dari paralelisme, dan fakta bahwa waktu pemaparan

serta konsentrasi antagonis telah diberikan untuk masing-masing kurva.

Gambar 1.24 menggambarkan pengaruh antagonis ireversibel sama pada

kontraktil respon dari ileum guinea-babi untuk histamin. Garis penuh adalah kontrol

konsentrasi-respon kurva, dan garis putus-putus menunjukkan konsekuensi dari lima

eksposur berturut-turut untuk 1 M dibenamine, dengan pengujian histamin setelah

setiap eksposur. Sebuah fitur mencolok adalah bahwa aplikasi pertama dari antagonis

menyebabkan pergeseran hampir sejajar kurva. Hanya setelah aplikasi lebih lanjut

dari dibenamine melakukan respon maksimal menjadi lebih kecil dengan cara yang

diharapkan (bandingkan Gambar 1.23). yang paling penjelasan yang mungkin adalah

sebagai berikut. Meskipun aplikasi pertama dibenamine diblokir banyak reseptor,

cukup tetap untuk memungkinkan histamin (meskipun pada konsentrasi yang lebih

tinggi) untuk menghasilkan penuh respon. Hanya ketika jumlah reseptor telah

berkurang lebih jauh oleh berikutnya aplikasi dibenamine ada penurunan yang berarti

dalam respon maksimal dicapai. Itu Implikasinya adalah bahwa dalam jaringan ini,

tidak semua reseptor harus ditempati oleh histamin dalam rangka mendapatkan

respon maksimal. Akibatnya, reseptor cadang yang tersedia, dan jaringan dikatakan

memiliki cadangan reseptor untuk agonis ini. Ini tidak, tentu saja, berarti kita

memiliki dua jenis reseptor, cadang dan digunakan, reseptor tidak berbeda. Namun,

hanya beberapa harus diaktifkan untuk menyebabkan besar atau bahkan respon

maksimal. Hal ini dapat terjadi ketika respon dari jaringan dibatasi bukan oleh jumlah

reseptor aktif tetapi oleh satu atau lebih peristiwa yang mengikuti aktivasi reseptor.

Untuk Misalnya, pemendekan maksimal sepotong otot polos dapat terjadi sebagai

respon terhadap kenaikan kalsium sitosol yang jauh lebih sedikit daripada yang dapat

diperoleh dengan mengaktifkan semua reseptor.

Situasi ini berbeda dengan agonis parsial (lihat Bagian 1.4.1). Inaktivasi salah

satu reseptor, misalnya, dibenamine atau phenoxybenzamine sekarang akan

mengurangi respon maksimal terhadap agonis parsial, tanpa pergeseran paralel awal

dalam log kurva konsentrasi-respon yang akan terlihat (misalnya, Gambar 1,24)

dengan penuh agonis jika jaringan memiliki cadangan reseptor substansial.

Adanya cadangan reseptor dalam banyak jaringan memiliki implikasi bahwa

nilai EC50 untuk agonis penuh tidak dapat memberikan bahkan perkiraan perkiraan

konstan untuk kombinasi dari agonis dengan situs mengikat kesetimbangan disosiasi,

sebagaimana telah disebutkan, ketika respon setengah maksimal, hanya sebagian

kecil dari reseptor dapat ditempati.

GAMBAR 1.24 Pengaruh blokade reseptor progresif dengan dibenamine pada respon

hamster ileum untuk histamin. Lima eksposur berturut-turut untuk 1 M dibenamine,

masing-masing selama 10 menit, digunakan, dan respon terhadap histamin diuji

setelah setiap eksposur. Hasilnya dianalisis seperti yang dijelaskan dalam Bagian

1.6.4, dan nilai q terdaftar untuk setiap kurva memberikan perkiraan fraksi reseptor

tersisa diblokir. Kurva putus-putus dibangun dari aslinya, kurva pra-dibenamine

dengan menyisipkan dengan perkiraan q, dan juga nilai KA ditampilkan, ke dalam

persamaan yang diatur dalam Pasal 1.6.4 (yang melihat, bersama dengan diskusi

terkait). (Dari Furchgott, RF, Adv Res Narkoba, 3, 21-55, 1966; Berdasarkan data

yang diperoleh oleh ARIENS, EJ et al, Arch Int Pharmacodynamie, 127, 459-478,

1960).

50% digambarkan dalam Clark asumsi tentatif proporsionalitas langsung antara

hunian dan respon. Jadi, farmasi harus mencari pendekatan lain untuk menentukan

afinitas reseptor untuk agonis penuh. Salah satu kemungkinan disarankan oleh

ketersediaan antagonis kompetitif ireversibel, dan ini adalah topik berikutnya yang

harus dipertimbangkan.

1.6.4 BISA ANTAGONIS KOMPETITIF IREVERSIBEL DIGUNAKAN

UNTUK TEMUKAN KESETIMBANGAN DISOSIASI KONSTAN UNTUK

AGONIS?

Karakteristik perubahan (lihat Gambar 1.24) dalam bentuk dan posisi agonis

konsentrasi-hubungan respon disebabkan oleh terbatasnya eksposur jaringan untuk

antagonis ireversibel menyarankan cara yang mungkin untuk memperkirakan

kesetimbangan disosiasi konstan untuk agonis. Itu pertama kali dijelaskan oleh R.F.

Furchgott. Prosedur eksperimental adalah membandingkan konsentrasi agonis yang

diperlukan untuk menghasilkan respon yang dipilih (katakanlah, 40% dari

maksimum) sebelum dan sesudah jaringan telah terkena\ antagonis ireversibel. Dalam

jaringan segar, respons ini ditimbulkan oleh konsentrasi yang kami hadirkan

berdasarkan [A], setelah antagonis telah bertindak, ini harus ditingkatkan untuk [A] '.

Fraksi reseptor dibiarkan bebas setelah penerapan antagonis dilambangkan dengan q.

(Jika hanya 10% dari reseptor tetap diblokir, q akan menjadi 0,1.) Kita sekarang

bertanya apa hubungan akan diharapkan untuk terus antara [A], [A] ', dan q.

Pertanyaan ini akan didekati dengan dua cara. Pertama kita ikuti Furchgott dalam

mengambil sebagai titik awal model yang paling sederhana untuk agonis tindakan,

yaitu Hill dan Clark (lihat Bagian 1.2.1 dan 1.2.2). Meskipun kami telah melihat

bahwa skema ini kekurangan kegagalan untuk membedakan antara pekerjaan dan

aktivasi reseptor, itu termasuk untuk kepentingan sejarah. Pendekatan kedua

didasarkan pada lebih realistis, jika masih dasar, representasi aktivasi reseptor. Ini

adalah del Castillo Katz Model (lihat Bagian 1.2.3 dan 1.4.4-1.4.6). Penerapan

metode Furchgott untuk reseptor G-protein-coupled adalah secara singkat dalam

Bagian 1.10 (lihat jawaban Soal 1.3).

Pendekatan klasik, mengikuti Furchgott, dan didasarkan pada pandangan awal

bahwa semua reseptor ditempati oleh agonis diaktifkan: Pertama, kita ingat salah satu

dari dua definisi sebelumnya Par, proporsi situs mengikat diduduki oleh A:

Di sini, NAR adalah jumlah reseptor di mana A menempati tempat ikatannya,

dan N mengacu pada jumlah. Oleh karena itu,

dari persamaan Bukit-Langmuir. Setelah antagonis ireversibel telah bertindak,

N reducedn ke QN, dan konsentrasi yang lebih besar dari agonis, [A] ', sekarang

harus diterapkan untuk mencapai nilai yang sama seperti sebelumnya NAR:

Furchgott kemudian melanjutkan untuk berasumsi bahwa respon dari jaringan

sebelum dan sesudah penerapan antagonis yang sama (submaksimal) sesuai dengan

yang sama reseptor hunian oleh agonis. Oleh karena itu, ia disamakan:

Oleh karena itu, plot 1 / [A] terhadap 1 / [A] 'harus memberikan garis lurus

dengan kemiringan 1 / q dan intercept dari (1 - q) / q.KA. Nilai q diperoleh

dari timbal balik lereng, dan bahwa KAdari (kemiringan - 1) / mencegat.

Analisis berdasarkan del Castillo-Katz model aktivasi reseptor (lihat Bagia

1.2.3 dan 1.4.4): Fraksi reseptor dalam keadaan aktif didefinisikan oleh:

Di sini, NAR adalah jumlah reseptor di aktif (AR *) berupa total N. Oleh karena

itu,

dari Persamaan. (1,32). Setelah antagonis ireversibel telah bertindak, N direduksi

menjadi QN, dan konsentrasi yang lebih besar dari agonis, [A] ', diperlukan untuk

mencapai nilai yang sama dari NAR * seperti sebelumnya:

Kami selanjutnya berasumsi bahwa respon yang sama (submaksimal) dari

jaringan sebelum dan sesudah antagonis sesuai dengan jumlah yang sama, NAR *,

reseptor diaktifkan. Jadi kita menyamakan:

Oleh karena itu, plot 1 / [A] terhadap 1 / [A] 'harus memberikan garis lurus

dengan kemiringan 1 / q dan intercept dari:

Nilai q diperoleh dari kebalikan dari lereng, dan KA / (1 + E) dari (kemiringan -

1) / mencegat.

Menerapkan analisis di kolom kiri untuk hasil Gambar 1.24, Furchgott

diperkirakan K A menjadi 10 µM untuk kombinasi histamin dengan reseptornya. Dia

menggunakan gurasi ini, dan nilai-nilai q diperoleh sebagai hanya dijelaskan, untuk

membangun kurva putus-putus dalam gambar. Ketidakpastian ini dekat dengan titik

percobaan, yang tentunya sesuai dengan prediksi dari pendekatan diambil. Sama

seperti tentu, hal ini tidak memberikan bukti yang menentukan bahwa baik

eksperimental atau anggapan teoretis yang mendasari hal itu benar. Sebuah asumsi

penting, dan salah satu yang Difi ¬ kultus untuk menguji, adalah bahwa antagonis

ireversibel telah ada tindakan lain selain untuk menonaktifkan reseptor yang

diteliti. Apakah, misalnya, telah mengganggu satu atau lebih dari langkah-langkah

yang link reseptor aktivasi respon yang diamati, pendekatan akan menjadi tidak

valid. Furchgott kemudian menunjukkan bahwa ini bukan komplikasi di bawah

kondisi yang digunakan.

Melanjutkan Furchgottâ analisis percobaan Gambar 1.24, kita perhatikan

bahwa, dalam jaringan segar, konsentrasi histamin yang diperlukan untuk

menghasilkan kontraksi maksimal setengah adalah sekitar 180

nM. Nilai K A diperkirakan 10µM, sebagaimana telah kita lihat. Furchgott diganti

angka yang pasti di Hilla persamaan Langmuir untuk mendapatkan nilai untuk hunian

reseptor yang diperlukan untuk memperoleh setengah respon maksimal. Ini datang

hanya 0,0177, menunjukkan cadangan reseptor besar. Furchgottâ adalah langkah

menggunakan nilai ini untuk mendapatkan perkiraan EFI ¬ berikan advokasi

histamin, di arti digunakan oleh Stephenson. Karena respon setengah-maksimal,

œstimulusâ Sebagai Dei ¬ ned oleh Stephenson adalah kesatuan, sehingga, dari

Persamaan. (1,27), EFI ¬ berikan advokasi adalah 1/0.0177 = 57, nilai yang diberikan

dalam Gambar 1.24 (lihat juga Metode 3 dalam Bagian 1.4.8).

Validitas perkiraan tersebut dan penafsiran mereka, bagaimanapun, sangat

bergantung pada kesesuaian model untuk aktivasi reseptor yang analisis

didasarkan. Hal ini penting untuk menghargai bahwa memuaskan ï ¬ t â €

œtheoreticalâ (titik-titik) baris pada Gambar 1.24 tidak memungkinkan satu untuk

membedakan antara dua model tindakan reseptor (Hill dan Clark vs del Castilloâ €

"Katz) yang telah digunakan untuk menganalisis hasil ini. Kedua model membuat

persis sama tentang prediksi bentuk hubungan antara [A], [A]ř , dan q. Juga,

penafsiran nilai q adalah sama untuk setiap model. Apa yang berbeda, dan ini adalah

isu utama, adalah bahwa penerimaan konsep bahwa reseptor harus isomerize ke

bentuk aktif membawa implikasi bahwa Furchgottâ ireversibel Metode antagonis

menghasilkan perkiraan makroskopik kesetimbangan disosiasi konstan (K eff = K A /

(1 + E), lihat Bagian 1.4.4) daripada dari kesetimbangan mikroskopis

konstan, K A, untuk Langkah awal mengikat. Hanya jika E adalah sangat kecil dalam

kaitannya dengan kesatuan (yaitu, A merupakan agonis parsial sangat lemah)

apakah K eff perkiraan untuk K. Perhatikan juga, bahwa pengukuran radioligand

mengikat langsung (dalam tidak adanya desensitisasi dan setiap komplikasi lain) juga

akan menghasilkan perkiraan K eff dan tidak K A. Mencari K A membutuhkan jenis

lain dari pengukuran dan sejauh ini telah dicapai hanya untuk saluran ion ligand-

gated mana metode pencatatan single-channel memungkinkan mengikat dan langkah

aktivasi harus dibedakan, seperti dijelaskan pada Bab 6.

Kesadaran bahwa Furchgottâ metode antagonis ireversibel

memperkirakan K eff * daripada K A memiliki implikasi yang mendalam untuk

perhitungan EFI ¬ berikan advokasi Sebagai Stephenson. Seperti yang telah kita

hanya dilihat, percobaan Gambar 1.24, yang telah dianalisa oleh Furchgott, telah

menyarankan bahwa ketika histamin menyebabkan kontraksi setengah-maksimal

hamster ileum, hanya 1,77% dari reseptor ditempati. Mengingat pembahasan

sebelumnya, ada kemungkinan bahwa gurasi mengacu pada total reseptor hunian oleh

agonis yaitu, œoccupied tapi inactiveâ ditambah œoccupied dan active. Oleh karena

itu, nilai â dari 57 (Kebalikan dari 0,0177) untuk EFI ¬ berikan advokasi histamin

yang ditunjukkan pada Gambar 1.24 harus dianggap sebagai berdasarkan

Persamaan. (1.40) daripada Persamaan. (1.27), sebagai Furchgott semula

dibayangkan. Keterbatasan kegunaan ini dari EFI ¬ berikan advokasi, e *, telah

dibahas dalam Bagian 1.4.8.

1.6.5 REVERSIBLE NONCOMPETITIVE ANTAGONISM

Dalam varian ini antagonisme diatasi, antagonis bertindak dengan menggabungkan

dengan terpisahsitus penghambatan pada makromolekul reseptor. Agonis dan

antagonis molekul dapat terikat pada saat yang sama, meskipun reseptor menjadi aktif

hanya jika situs agonis saja diduduki (Gambar 1.25). Ini kadang-kadang disebut

sebagai alosterik atau allotopic antagonisme (lihat Lampiran1.6A [Bagian 1.6.7.1]

untuk komentar lebih lanjut mengenai hal ini).

GAMBAR 1,25 antagonisme tidak kompetitif. Sebuah reseptor bergaya membawa

dua situs, salah satunya dapat menggabungkan dengan agonis (A) dan yang lainnya

dengan antagonis (B). Empat kondisi yang mungkin, hanya satu yang (agonis situs

diduduki, situs antagonis kosong, lihat kanan atas) aktif.

Di hadapan konsentrasi cukup besar antagonis seperti itu, penghambatan akan

menjadi dapat diatasi, terlalu sedikit reseptor tetap bebas dari antagonis untuk

memberikan tanggapan penuh, bahkan jika semua situs agonis ditempati. Titik di

mana hal ini terjadi dalam jaringan tertentu akan tergantung pada jumlah reseptor

cadang, seperti halnya dengan antagonis kompetitif ireversibel (lihat Bagian 1.6.3.).

Jika agonis penuh digunakan dan jaringan yang memiliki cadangan reseptor besar,

efek awal dari reversibel antagonis nonkompetitif akan bergeser log concentrationâ

Kurva respons ke kanan. Akhirnya, bila tidak ada reseptor cadangan tetap, maksimum

akan berkurang. Sebaliknya, tanpa reseptor cadangan, antagonis akan menekan

maksimal dari awal.

Jika kita menerapkan hukum aksi massa untuk bentuk antagonisme, proporsi

hambat situs ditempati oleh antagonis akan diberikan oleh Hilla persamaan

Langmuir:

Oleh karena itu, proporsi bebas antagonis akan:

Kita sekarang membuat asumsi tambahan berikut: (1) Setiap makromolekul

reseptor membawa satu agonis dan satu antagonis (penghambatan) situs. (2)

Pekerjaan dari situs penghambatan oleh antagonis tidak mengubah baik affnity situs

lain agonis atau keseimbangan antara aktif dan negara tidak aktif reseptor menurut

del Castilloâ skema Katz;

Namun, jika antagonis terikat, tidak ada respon terjadi kemudian bahkan jika reseptor

telah diisomerisasikan kebentuk aktif. (3) affinity untuk antagonis tidak terpengaruh

oleh pengikatan agonis.

Berdasarkan asumsi tersebut agak luas dan tidak sepenuhnya realistis, * fraksi

reseptor di AR * negara diberikan oleh Persamaan. (1,32), namun hanya beberapa

agonis-gabungan,diisomerisasikan, makromolekul reseptor bebas antagonis dan

dengan demikian dapat memulai respon. Untuk

GAMBAR 1.26 Efek dari antagonis nonkompetitif reversibel pada respon terhadap

agonis, A. Setiap set kurva telah dibangun menggunakan Persamaan. (1,55) dan

menunjukkan efek dari empat konsentrasi antagonis (5, 20, 50, dan

300 µM). K A, K B, dan E telah diambil menjadi 1, 10, dan 50 µM, masing-

masing. Untuk (A), respon telah diasumsikan berbanding lurus dengan fraksi reseptor

dalam keadaan aktif. (B) memiliki telah dibangun dengan menggunakan nilai yang

sama, tapi sekarang mengasumsikan adanya cadangan reseptor besar. Kondisi ini

telah dimodelkan dengan mengandaikan bahwa hubungan antara respon, y, dan

proporsi reseptor aktif diberikan oleh y = 1,01 µ aktif / (0,01 + p aktif), sehingga

respon setengah-maksimal terjadi ketika hanya di bawah 1% dari reseptor diaktifkan.

mendapatkan proporsi (p aktif) dalam kondisi ini, kita cukup mengalikan fraksi di

negara * AR oleh fraksi bebas antagonis:

GAMBAR 1.26 menunjukkan log concentrationâ € "kurva respon ditarik sesuai

ungkapan ini. Di A, respon telah diasumsikan berbanding lurus dengan p aktif, tidak

ada reseptor cadangan. Di B, reseptor cadang telah dianggap ada, dan sesuai

kehadiran relatif konsentrasi rendah antagonis menyebabkan pergeseran hampir

sejajar sebelum maksimum berkurang.

Awal perpindahan hampir paralel kurva pada Gambar 1.26B menimbulkan

pertanyaan apakah persamaan Schild akan dipatuhi di bawah kondisi ini. Jika kita

mempertimbangkan dua konsentrasi agonis yang memberikan respon yang sama

sebelum dan selama tindakan antagonis ([A] dan r [A], masing-masing, di

mana r adalah rasio konsentrasi) dan ulangi derivasi diatur dalam Bagian 1.5.2 (tapi

menggunakan Persamaan. (1,55) daripada (1,49)), kami bahwa ekspresi setara dengan

persamaan Schild adalah:

Di sini, K eff adalah sebagai dalam Bagian 1.4.4. Jika r [A] / K eff << 1 (yaitu,

jika proporsi reseptor diduduki oleh agonis tetap kecil bahkan ketika konsentrasi

agonis telah ditingkatkan untuk mengatasi efek antagonis kompetitif reversibel),

ungkapan ini mendekati ke:

Oleh karena itu, persamaan Schild akan berlaku, meskipun di atas rentang yang

terbatas konsentrasi yang ditentukan oleh reseptor cadangan. Selain itu,

nilai K B diperoleh dalam kondisi seperti itu akan

GAMBAR 1.27 Kurva digambar menggunakan Persamaan. (1.57) untuk

menggambarkan pengaruh tiga konsentrasi saluran terbuka blocker, C, respon

terhadap agonis yang bekerja pada saluran ion ligand-gated. Nilai 100 nM dan 100

dan 10 µM diambil untuk K A, E, C dan K, masing-masing. Panah vertikal

menunjukkan konsentrasi agonis menyebabkan respon setengah-maksimal dalam

ketiadaan dan kehadiran C pada 50 µM.

memberikan perkiraan kesetimbangan disosiasi konstan untuk kombinasi antagonis

dengan situs mengikat.

Konsekuensinya adalah demonstrasi dari persamaan Schild memegang pada

rentang kecil Konsentrasi tidak boleh diambil sebagai bukti bahwa aksi antagonis

kompetitif. Jelas, selebar praktis berbagai konsentrasi antagonis harus diuji, terutama

jika ada bukti kehadiran reseptor cadang.

Buka Saluran Blok

Studi tindakan saluran ion ligand-gated telah dibawa ke cahaya yang menarik

dan penting varian dari antagonisme nonkompetitif reversibel. Telah ditemukan

bahwa beberapa antagonis hanya memblokir saluran-saluran yang terbuka dengan

memasukkan dan occluding saluran itu sendiri. Akibatnya, antagonis menggabungkan

hanya dengan reseptor diaktifkan. Contohnya termasuk blok reseptor nicotinic

neuronal oleh hexamethonium, dan N-methyl-D-aspartate (NMDA) reseptor oleh

dizocilpine (MK801).

Antagonis tersebut menyebabkan perubahan karakteristik dalam log

concentrationâ kurva respon untuk agonis. Berbeda dengan apa yang diamati dengan

jenis lain dari antagonisme sejauh dipertimbangkan, nilai [A] 50 akan menjadi lebih

kecil daripada yang lebih besar di hadapan antagonis. Ini diilustrasikan pada Gambar

1.27 dan paling baik dipahami dalam hal del Castilloâ mekanisme Katz. Memasukkan

kemungkinan bahwa antagonis, C, hadir yang menggabungkan speciï ¬ Cally dengan

reseptor aktif, kita memiliki:

Oleh karena itu, reseptor memiliki empat kondisi: R, AR, AR *, dan AR * C,

yang hanya satu, AR *, aktif. Skema ini memprediksi bahwa pada kesetimbangan

proporsi reseptor aktif diberikan oleh:

Di mana K c adalah kesetimbangan disosiasi konstan untuk

kombinasi C dengan diaktifkan reseptor, AR *. Persamaan ini telah digunakan untuk

menggambar kurva yang ditunjukkan pada Gambar 1.27. Perhatikan bagaimana

[A] 50 menurun sebagai konsentrasi antagonis meningkat. Akibatnya, kombinasi dari

antagonis dengan AR * menyebabkan pergeseran ke kanan pada posisi

kesetimbangan yang lainnya disajikan dalam Persamaan. (1.56).

Perhatikan juga, konvergensi pada konsentrasi agonis rendah kurva diplot pada

Gambar 1.27. Antagonis menjadi kurang aktif ketika respon kecil, karena ada sedikit

reseptor dalam AR * formulir yang tersedia untuk menggabungkan dengan C. Sekali

lagi, berbeda dengan jenis lain dari antagonisme yang telah dijelaskan, tidak ada

perpindahan paralel awal kurva (bahkan jika banyak cadangan reseptor yang hadir),

dan persamaan Schild tidak pernah dipatuhi.

Beberapa antagonis menggabungkan kemampuan untuk memblokir saluran ion

terbuka dengan tindakan kompetitif di atau dekat situs pengikatan agonis. Sebuah

contoh yang baik ditandai adalah blocker tubocurarine nicotinic (Lihat Bab

6). Agonis juga mungkin terbuka channel blockers, sehingga membatasi respon

maksimal bahwa mereka dapat menimbulkan. Agen tersebut (misalnya,

decamethonium) sehingga dapat berperilaku sebagai agonis parsial saat diuji pada

jaringan utuh. *

Skema diilustrasikan pada Gambar 1,25 mengasumsikan bahwa situs aksesori

adalah penghambatan. Sekarang diketahui bahwa beberapa agonis (misalnya,

glutamat) hanya dapat efektif dengan adanya ligan lain (Misalnya, glisin dalam kasus

reseptor NMDA untuk glutamat) yang mengikat ke situs sendiri di reseptor

makromolekul. Glutamat ini kemudian disebut sebagai agonis primer, dan glisin

sebagai co-agonis. Pada prinsipnya, antagonis dapat bertindak dengan bersaing

dengan baik agonis primer atau co-agonis.

1.6.6 A MORE GENERAL MODEL FOR THE ACTION OF AGONISTS, CO-

AGONISTS, AND ANTAGONISTS

Kesadaran bahwa banyak reseptor menunjukkan beberapa tingkat aktivitas

konstitutif (yaitu, mereka dapat isomerize ke keadaan aktif bahkan tanpa adanya

agonis) menunjukkan lebih umum dan pada saat yang sama model yang lebih fisik

realistis untuk aksi antagonis kompetitif. Sekarang diilustrasikan pada Gambar 1.28

dan dapat dianggap sebagai perpanjangan langsung dari skema untuk aktivitas

konstitutif diperkenalkan dalam Bagian 1.4.7 (lihat Gambar 1.11). Dua ligan, A dan

B, dapat mengikat ke situs yang berbeda pada reseptor sehingga pada prinsipnya

keduanya bisa hadir pada saat yang sama, seperti yang ditunjukkan pada Gambar

1.25, yang merupakan titik awal untuk diskusi kita tentang antagonisme

kompetitif. Skema pada Gambar 1.28 mencakup jangkauan yang lebih luas

kemungkinan dan juga memiliki jasa yang menunjukkan mekanisme molekuler tidak

hanya untuk antagonisme nonkompetitif tetapi juga, seperti yang akan kita lihat,

beberapa pola lain dari kerja obat. Konsep yang mendasarinya adalah bahwa zat yang

menggabungkan dengan situs aksesori (allotopic, alosterik) dapat diharapkan untuk

mengubah keseimbangan antara negara aktif dan tidak aktif dari reseptor sehingga

mempengaruhi tindakan agonis.

Empat kasus membatasi skema umum akan dipertimbangkan. Masing-masing

mengandaikan bahwa A adalah konvensional, œpositiveâ agonis, yaitu, kehadirannya

meningkatkan proporsi reseptor aktif karena preferensial AFI ¬ nity untuk bentuk

aktif.

1. Ligan B memiliki jauh lebih besar AFI ¬ nity untuk tidak aktif (R, AR) daripada

aktif (R *,

AR *) menyatakan reseptor. Sedikit BR * atau * ABR terbentuk. Di hadapan besar

GAMBAR 1.28 Perpanjangan dua ligan, A dan B, dari skema untuk kegiatan

konstitutif ditunjukkan dalam Gambar 1.11, yang direproduksi sebagai wajah depan

kubus. Kami menduga bahwa A dan B menggabungkan dengan terpisah situs di

makromolekul reseptor, R, sehingga keduanya dapat hadir pada waktu yang sama

(tepi atas belakang wajah kubus). Negara aktif dan tidak aktif reseptor diwakili oleh

kanan dan sisi kiri wajah masing-masing.

Konsentrasi dari kedua A dan B, sebagian besar reseptor akan di aktif, ABR

Kondisi (atas, kiri, belakang simpul kubus). B kemudian bertindak sebagai antagonis

nonkompetitif (Lihat Gambar 1.29A).

2. Disosiasi konstanta kesetimbangan yang menentukan pembentukan ABR dan ABR

* begitu besar (yaitu, sesuai AFI ¬ nities sangat kecil) bahwa jumlah tersebut bentuk

ganda liganded diabaikan. Akibatnya, pengikatan A dan B adalah saling

eksklusif. Jika, di samping itu, AFI ¬ nity B untuk bentuk aktif dari reseptor yang

sangat rendah, B kemudian akan bertindak sebagai antagonis kompetitif (lihat

Gambar 1.29B). *

3. B mengikat terutama untuk negara-negara aktif dari reseptor (R * dan AR *) dan

dalam sedemikian rupa sehingga kompleks yang dihasilkan (BR * dan ABR *) tidak

aktif. Kurva diprediksi akan ditampilkan pada Gambar 1.29C. Buka blok saluran

(lihat Bagian 1.6.5) memberikan contoh (bandingkan Gambar 1.27).

4. Meskipun A mengikat R dan R *, posisi kesetimbangan antara A, R, dan R *

sekarang diasumsikan sedemikian rupa sehingga sedikit AR * terbentuk dalam

ketiadaan B. Namun, jika B juga hadir, banyak reseptor memasuki ABR aktif * CONI

¬ guration. Di bawah ini keadaan, B bertindak sebagai co-agonis untuk A; aktivasi

penuh memerlukan simultan Kehadiran A dan B (lihat Gambar 1.29D).

1.6.7 APPENDICES TO SECTION 1.6

1.6.7.1 Lampiran 1.6A: Sebuah catatan tentang alosterik Term

Alosterik telah datang untuk digunakan dalam reseptor farmakologi dalam

setidaknya tiga arti yang berbeda, membuat konsep Difi ¬ kultus untuk pemula

setidaknya. Para penggunaan utama adalah:

1. Untuk menunjukkan baik situs pengikatan selain itu untuk agonis atau ligan yang

bertindak dengan menggabungkan dengan situs lain ini. Misalnya, œallosteric

antagonistâ gallamine influences aktivasi dari reseptor muscarinic dengan mengikat

ke daerah yang berbeda (suatu œallosteric * Di sini, kompetitif didefinisikan sebagai

dalam Bagian 1.5.1.2 untuk memasukkan kemungkinan bahwa A dan B dapat

menggabungkan dengan berbeda situs mengikat yang berinteraksi sedemikian rupa

bahwa jika A hadir, B tidak bisa, dan sebaliknya. Pendekatan klasik untuk Studi

Drugâ Interaksi Reseptor

GAMBAR 1.29 Pengaruh ligan kedua pada hubungan antara konsentrasi agonis

([A]) dan proporsi reseptor aktif, seperti yang diperkirakan oleh skema yang

ditunjukkan pada Gambar 1.28. Setiap panel menggambarkan efek ligan tambahan,

B, pada empat konsentrasi µM) ditunjukkan dengan jumlah yang diberikan dengan

masing-masing garis. Untuk panel A, B, dan C, tapi tidak D, agonis telah

diasumsikan memiliki intrinsik berikan advokasi tinggi sehingga hampir semua

reseptor dapat diaktifkan dengan itu. Sebuah asumsi tambahan sepanjang adalah

bahwa konstitutif aktivitas reseptor rendah, sehingga tanpa adanya ligan, beberapa

reseptor yang aktif.

A. Di sini, ligan kedua, B, telah diasumsikan memiliki preferensial AFI ¬ nity

tinggi untuk bentuk tidak aktif reseptor. Hasilnya erat meniru klasik,

antagonisme kompetitif.

B. Kedua ligan A dan B telah diasumsikan untuk bergabung dengan reseptor

dalam hampir saling secara eksklusif. Akibatnya, A dan B berada dalam

persaingan, dan model kemudian memprediksi bahwa peningkatan

konsentrasi trations dari B menyebabkan pergeseran hampir paralel dalam

kurva.

C. Di sini, B diasumsikan untuk menggabungkan terutama dengan bentuk aktif

reseptor untuk membentuk kompleks (BR *, ABR *) yang sudah tidak

aktif. Sebuah contoh adalah tindakan blocker saluran terbuka. Perhatikan

konvergensi dari kurva pada konsentrasi agonis rendah (kontras dengan pola

yang diharapkan untuk antagonisme kompetitif, seperti dalam Panel A dan

seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1,26).

D. Untuk simulasi ini konstanta kesetimbangan untuk isomerisasi antara AR dan

AR * telah ditetapkan sehingga beberapa reseptor dalam keadaan aktif bahkan

di hadapan konsentrasi besar A pada perusahaan sendiri. Namun, dengan B

juga hadir pada peningkatan konsentrasi, kesetimbangan yang ditampilkan

pada Gambar 1.28 dialihkan menuju bentuk aktif sehingga respon maksimum

ke A naik ke titik di mana hampir semua reseptor dapat diaktifkan. Akibatnya,

B bertindak sebagai co-agonis. Perhatikan bahwa hal itu menyebabkan

aktivasi reseptor kecil ketika [A] kecil.

Kolom angka yang diberikan dengan setiap panel menunjukkan sebagian kecil

dari reseptor dalam setiap kondisi dikonsentrasi tertentu dari A ditunjukkan

oleh salah satu kurva. Nilai-nilai konstanta kesetimbangan digunakan dalam simulasi

yang tercantum dalam Tabel 1.4.

Sitea dari makromolekul reseptor. Beberapa penulis telah diperpanjang dengan

mendeskripsikan situs agonis sebagai œorthosteric. antagonisme alosterik dapat

dianggap sebagai bentuk non- antagonisme kompetitif DEI ¬ ned dan dibahas dalam

bab ini.

2. Untuk menggambarkan semua-atau-tidak ada transisi antara negara konformasi

berbeda enzim atau reseptor sebuah œallosteric transition. Sesuai dengan penggunaan

ini, ketetapan yang menggambarkan posisi keseimbangan antara negara

(misalnya, E 0 dalam skema Angka 1,11 dan 1,28) kadang-kadang digambarkan

sebagai alosterik konstan.

3. Untuk menunjukan mekanisme dimana posisi keseimbangan antara dua yang

berbeda bentuk perubahan reseptor di hadapan ligan (agonis atau antagonis) untuk

yang affinity berbeda.

Meskipun masing-masing penggunaan ini adalah konsisten diri dan dapat justiï ¬ ed,

mudah untuk melihat bahwa alosterik, jika dapat berarti hal yang berbeda untuk

orang yang berbeda. Sebagai contoh, aktivasi nicotinic dan reseptor muscarinic oleh

asetilkolin dapat dianggap sebagai contoh mekanisme alosterik Sebagai Dei ¬ ned

dalam penggunaan 3 di atas. Tapi, asetilkolin tidak bertindak melalui situs alosterik,

Sebagai dalam penggunaan 1. Jelas, istilah harus qualiï ¬ ed dalam konteks di mana

ia digunakan. Untuk lebih lanjut diskusi, lihat account oleh Colquhoun (1998), yang

menggambarkan asal-usul istilah dan evolusi cara digunakan.

Dalam upaya untuk mengurangi potensi kebingungan,

istilah allotopic dan syntopic telah disarankan sebagai sebutan untuk situs yang

berbeda dan situs yang sama, masing-masing, meskipun mungkin terlalu terlambat

untuk berharap untuk merasionalisasi penggunaan dalam konteks ini.

1.6.7.2 Lampiran 1.6b: Menerapkan Hukum Aksi Massa untuk Skema

Pertama asumsi adalah bahwa reaksi reversibel belas diwakili dalam Gambar

1.28 telah mencapai ekuilibrium. Dari konstanta kesetimbangan dua belas yang

menentukan berapa banyak reseptor dalam setiap kondisi, hanya tujuh perlu

diketahui, sisanya ditentukan oleh orang lain. Hal ini dapat terbaik dipahami dengan

kembali ke skema sederhana ditunjukkan pada Gambar 1.11. Menerapkan hukum

aksi massa untuk tiga dari empat kesetimbangan dalam skema itu, kita harus:

Oleh karena itu, untuk keseimbangan yang tersisa,

Kita bisa melihat bahwa nilai konstanta kesetimbangan keempat (untuk

isomerisasi antara bentuk aktif dan tidak aktif dari reseptor diduduki) ditentukan oleh

tiga lainnya, E 0, K L, dan K L *. Kembali ke skema Gambar 1.28 dan berpikir

tentang pilihan dari tujuh konstanta yang harus speciï ¬ ed, hal ini menguntungkan

untuk memisahkan tujuh menjadi tiga œprimaryâ dan empat œsecondaryâ

konstanta. Yang utama yang diambil untuk menjadi E 0, K A, B dan K, dan lain-lain

disajikan sebagai kelipatan dari mereka. Keempat pengganda yang diperlukan untuk

ini ditujukan a, b, d, dan g, untuk konsistensi dengan account sebelumnya skema ini

untuk aktivasi reseptor (lihat, misalnya, Colquhoun [1998] dan referensi di

dalamnya).

Tabel 1.3 menetapkan hubungan antara tiga primer dan keseimbangan lainnya

sembilan konstanta yang muncul pada Gambar 1.28. Tabel 1.4 daftar nilai-nilai

tertentu yang digunakan untuk menghitung set

Kurva yang ditunjukkan pada Gambar 1.29. Perhitungan tersebut dapat

dilakukan dengan beberapa cara, beberapa yang lebih baik untuk eksposisi dan lain-

lain membuat untuk evaluasi lebih mudah dengan spreadsheet. Pendekatan yang

mengikuti lebih , fleksibel, meskipun kurang ringkas, dibandingkan alternatif yang

diberikan dalam jawaban dalam Bagian 1.10 ke Soal 1.5 (Bagian 1.8).

Kita mulai dengan menggunakan hukum aksi massa untuk memungkinkan kita untuk

berhubungan fraksi reseptor di setiap dari berbagai kondisi (R *, * AR, BR *, * ABR,

AR, dll) untuk fraksi (p R) dalam keadaan tidak aktif (R) dengan kedua situs

mengikat kosong:

Juga,

Menggantikan p R *, p * AR, dll, dalam ungkapan ini, kita memiliki:

Oleh karena itu,

Ungkapan ini, bersama-sama dengan persamaan kesetimbangan massa hukum

hanya terdaftar, sekarang dapat digunakan untuk menghitung proporsi reseptor dalam

setiap kondisi atau kombinasi kondisi. Sebagai contoh, fraksi di negara aktif

diberikan oleh:

Menggantikan p R menggunakan Persamaan. (1.58) memberikan ekspresi yang

berkaitan fraksi reseptor dalam bentuk aktif dengan konsentrasi A dan B:

Ini telah digunakan untuk membangun set kurva pada Gambar 1.29. *

Dengan cara yang sama, proporsi reseptor di mana A menempati tempat ikatannya

diberikan oleh:

Menggunakan Persamaan. (1,58) untuk menggantikan p R, kita memiliki:

Menggunakan hubungan

Kita melihat bahwa hubungan antara konsentrasi A dan jumlah itu yang terikat harus

mengikuti Hilla persamaan Langmuir. K eff, makroskopik disosiasi konstanta

kesetimbangan, diberikan oleh: * Untuk panel C, bagaimanapun, hal aktif yang

dianggap p R * + p * AR, sesuai dengan hipotesis bahwa dalam hal ini BR * dan

ABR * tidak memberikan kontribusi terhadap respon.

Istilah dalam kurung besar dapat lebih besar atau kurang dari satu, tergantung pada

nilai-nilai dari enam konstanta. Oleh karena itu, kehadiran B dapat meningkatkan atau

mengurangi pengikatan A.

1.7 KESIMPULAN

Pemodelan aksi reseptor dengan cara yang diuraikan dalam bab ini

kemungkinan akan terus menjadi nilai. Secara khusus, memungkinkan tindakan obat

yang akan lebih baik dijelaskan, quantiï ¬ ed dan dianalisis. Ini tidak boleh dilupakan,

bagaimanapun, bahwa setiap kemajuan penting dalam pemahaman tentang reseptor

tindakan yang tidak datang dari pemodelan dan persamaan menulis melainkan dari

eksperimental teknologi baru- tehnik seperti metode radioligand mengikat, rekaman

single-channel, dan, terakhir, yang prosedur biologi molekuler yang memungkinkan

struktur reseptor menjadi tidak hanya ditentukan dengan cara yang tepat. Ini dan

lainnya uang muka yang dibahas dalam bab-bab berikutnya.

1.8 MASALAH

Soal 1.1

Sebuah antagonis kompetitif (B) diterapkan pada jaringan dan menghasilkan

konsentrasi rasio r B . Sedetik antagonis kompetitif (C) bekerja pada reseptor yang

sama menghasilkan konsentrasi rasio r C di bawah kondisi yang sama. Jaringan

tersebut selanjutnya terkena kedua antagonis bersama-sama, pada saat yang sama

konsentrasi trations seperti dalam aplikasi terpisah. Rasio konsentrasi sekarang

diamati r B + C . Apa Hubungan mungkin diharapkan untuk terus

antara r B , r C , dan r B + C ? (Asumsikan bahwa del Castilloâ "Katz mekanisme

aktivasi reseptor memegang dalam bentuk yang paling sederhana (Persamaan (1.7).)

Soal 1.2

Ketika mempelajari antagonisme kompetitif, kadang-kadang perlu untuk

memasukkan inhibitor serapan atau blocker ganglion dalam semua solusi mandi yang

digunakan. Jika senyawa ini memiliki di samping beberapa tindakan memblokir

kompetitif pada reseptor yang dipelajari, apa efek ini akan memiliki estimasi dari

konstanta kesetimbangan disosiasi untuk antagonis kompetitif?

Soal 1.3

Apa kuantitas akan Furchgottâ € ™ s metode antagonis ireversibel (Bagian 1.6.4)

memperkirakan jika reseptor diduduki, AR, harus ï ¬ rst isomerize ke bentuk kedua,

AR *, yang kemudian menempel ke yang lain entitas, seperti G-protein, dalam rangka

untuk memperoleh tanggapan (seperti dalam Pers. (1,38))? Asumsikan bahwa G-

protein hadir lebih besar dalam kaitannya dengan reseptor.

Soal 1.4

Turunkan persamaan. (1.39) dalam Bagian 1.4.7, yang mengungkapkan bagaimana

proporsi reseptor aktif bervariasi dengan konsentrasi ligan yang menggabungkan

dengan reseptor dengan aktivitas konstitutif.

Soal 1.5

Terapkan hukum aksi massa untuk bekerja di luar proporsi reseptor dalam bentuk

aktif ( p aktif ) untuk mekanisme untuk aktivasi reseptor ditunjukkan pada Gambar

1.14. Apa yang akan menjadi nilai EC 50 di bawah keadaan ini? (Asumsikan bahwa

respon diukur berbanding lurus dengan p aktif dan konsentrasi protein G dapat

dianggap sebagai konstan.)

1,9 RUJUKAN MATERI

Umum

Pekerjaan awal (Sekarang Terutama Tujuan Historical)

EFFIKASI

Contoh aplikasi praktis dari Schildâ pendekatan studi antagonisme

Contoh Tambahan analisis penyimpangan dari persamaan Schild

.

Penerapan antagonis ireversibel (percobaan perlindungan reseptor, berusaha

penentuan K A untuk agonis)

1.10 SOLUSI UNTUK MASALAH

Soal 1.1

Kami memiliki tiga situasi eksperimental untuk dipertimbangkan:

(1) dan (2) yang langsung (lihat Bagian 1.5.2), sedangkan (3) istirahat tanah baru.

Ketika B dan C diterapkan bersama-sama, seperti dalam (3) di atas, dan agonis A

juga hadir, kami memiliki empat kesetimbangan simultan (setidaknya secara prinsip):

Menerapkan hukum aksi massa:

Juga (lihat Bagian 1.5.2),

Dari persamaan tersebut,

Oleh karena itu, menyamakan aktivasi reseptor yang sama dengan agonis (di mana

diasumsikan bahwa tanggapan juga akan sama), dalam ketiadaan antagonis apapun

dan kemudian di hadapan simultan B dan C:

Hubungan ini telah sering digunakan untuk memperoleh bukti bahwa dua

antagonis bertindak di situs yang sama. Hal ini juga dapat diturunkan dengan

mengambil persamaan Gaddum sebagai titik awal daripada ekspresi berdasarkan del

Castilloâ mekanisme Katz.

Soal 1.2

Kami akan menggunakan B untuk menunjukkan antagonis kompetitif sedang

diselidiki dan C untuk mewakili substansi dengan beberapa tindakan memblokir

kompetitif yang hadir di semua solusi mandi yang digunakan dalam

percobaan. Ketika kurva kontrol ditentukan, jaringan terkena kedua agonis A dan C

zat pada konsentrasi [A] dan [C], masing-masing. Dengan asumsi ekuilibrium,

proporsi reseptor dalam keadaan aktif maka:

(Lihat Persamaan. (1,49).)

Ketika kompetitif antagonis B juga diterapkan, konsentrasi A harus ditingkatkan

dengan faktor r , rasio konsentrasi, untuk mengembalikan respons yang

sama. Proporsi reseptor di keadaan aktif maka:

(Lihat jawaban Soal 1.1.)

Dengan asumsi bahwa respons yang sama sesuai dengan aktivasi reseptor yang sama

dalam dua situasi(Yaitu, dengan dan tanpa B sekarang), kita dapat menulis:

sehingga

Oleh karena itu, plot Schild berdasarkan hasil percobaan tersebut akan memberikan

perkiraan bukan dari K B tapi K B (1 + [C] / K C ).

Problem 1.3

Berikut skema untuk aktivasi reseptor seperti yang ditunjukkan dalam Pers. (1.38) di

Bagian 1.4.6. Menerapkan hukum aksi massa masing-masing dari tiga kesetimbangan

memberikan:

Juga,

Menggunakan persamaan kesetimbangan hukum massa untuk

menggantikan p R , p AR , dan p * AR dalam ekspresi ini, kami memperoleh:

Telah diasumsikan di sini bahwa G hadir lebih sehingga jumlah konsentrasi

[G] T tidak jatuh lumayan ketika AR * G * terbentuk. [G] dalam persamaan hukum

massa kemudian dapat digantikan oleh [G] T.

Jika kita sekarang mempertimbangkan Furchgottâ analisis pengaruh antagonis

ireversibel pada respon untuk agonis dan membuat asumsi yang sama seperti di

Bagian 1.6.4, kita dapat menulis:

Di sini, sama seperti sebelumnya, [A] dan [A]ř adalah konsentrasi agonis A

yang menghasilkan sama respon (diasumsikan sesuai dengan konsentrasi yang sama

dari reseptor di aktif, AR * G *,bentuk) sebelum dan setelah penurunan total â €

œconcentrationâ € reseptor dari [R] T ke q [R] T .

Membatalkan E , [G] T , dan [R] T dalam pembilang, dan pembalik, kita

memperoleh:

Oleh karena itu, plot 1 / [A] terhadap 1 / [A]ř lagi harus memberikan garis lurus

dengan kemiringan 1 / q , dan kuantitas diperkirakan oleh (kemiringan slope-1) /

mencegat akan:

Ini hanya akan diperkirakan oleh eksperimen ligan mengikat langsung adalah

skema ini untuk reseptor pekerjaan dan aktivasi untuk menerapkan.

Soal 1.4

Model ini:

di mana kita melihat bahwa tiga kesetimbangan harus diperhatikan (keempat

ditentukan oleh posisi dari tiga lainnya, lihat Lampiran 1.6b). Menerapkan hukum

aksi massa untuk tiga kesetimbangan tersebut, kita memiliki:

di mana konstanta kesetimbangan E 0 , K L , dan K L * adalah sebagai arti dalam

Bagian 1.4.7.

Juga,

Dengan menggunakan ekspresi kesetimbangan hukum massa untuk

menggantikan p R , p R* , dan p LR dalam persamaan terakhir, kita memperoleh:

Dari ini, dan menggunakan sepertiga dari ekspresi kesetimbangan, kami juga

memiliki:

Kita ingin mengetahui fraksi total reseptor dalam keadaan aktif:

Derivasi ini telah mengikuti prosedur umum yang sama diterapkan di seluruh bab

ini. Lain rute, bagaimanapun, adalah instruktif:

Mengingat hanya istilah dalam kurung dan memanfaatkan tiga persamaan

kesetimbangan, kita memiliki:

Oleh karena itu, Persamaan. (1.39) telah diturunkan.

Soal 1.5

Di sini, model ini bentuknya mirip dengan yang dibahas dalam Lampiran 1.6b,

yang menggambarkan penerapan hukum aksi massa untuk skema (Gambar 1.28) di

mana setiap reseptor macromolecule membawa situs pengikatan terpisah untuk

masing-masing dua ligan. Namun, dalam mekanisme untuk aksi dari reseptor G-

protein-coupled diilustrasikan pada Gambar 1.14, hanya dua (R * G dan LR * G) dari

delapan kondisi kemungkinan reseptor aktif. Diagram di bawah mereproduksi

Gambar 1.14 dengan penambahan konstanta kesetimbangan 12:

Menggunakan pendekatan kedua diperkenalkan pada solusi untuk masalah terakhir,

kita dapat menulis fraksi reseptor aktif sebagai:

Dengan menggunakan hubungan yang diperoleh dari penerapan hukum aksi

massa ke kesetimbangan individu dalam skema (lihat Lampiran 1.6b), ini dapat

ditulis sebagai:

Penataan ulang dan memanfaatkan hubungan antara konstanta kesetimbangan

ditetapkan dalam Tabel 1.3 (lihat Lampiran 1.6b untuk lebih detail) memberikan

ekspresi kita butuhkan:

Dengan tidak adanya ligan L, Persamaan. (1.60) tereduksi menjadi:

Ini memprediksi aktivitas konstitutif reseptor G-protein-coupled. Perhatikan

ketergantungan pada konsentrasi efektif dari G-protein.

Jika konsentrasi L dibuat sangat besar, proporsi reseptor dalam keadaan aktif

naik ke:

Dengan asumsi bahwa kita cukup beruntung untuk berurusan dengan tanggapan

sederhana yang secara langsung sebanding dengan fraksi reseptor dalam kondisi aktif,

kita bisa melanjutkan untuk memprediksi EC 50 . Ini adalah konsentrasi L yang

menyebabkan respon meningkat dari nilai y min dalam ketiadaan L

untuk y min ditambah 50% dari kenaikan maksimum ( y maks - y min ) bahwa L

dapat menginduksi. Lebih formal, dan asumsi proporsionalitas langsung antara y dan

p aktif , kita bisa menulis:

Menggunakan Persamaan. (1. 60) dan ekspresi untuk p aktif (min) dan p aktif

(max) hanya diturunkan, kami bahwa nilai EC 50 diberikan oleh:

Dalam Lampiran 1.6b kami memperoleh ekspresi untuk makroskopik

kesetimbangan disosiasi konstan, K eff , untuk pengikatan ligan pada skema yang

sama seperti pada Gambar 1.14. Memungkinkan untuk perbedaan dalam

hal, K eff dan EC 50 terlihat menjadi identik.

ISI

2.1 Reseptor G-Protein-Coupled Merupakan sebuah Unifying Signal-Transduksi

2. 1.1 GTP Binding Protein Bertindak sebagai transduser antara Reseptor dan Efektor

2.1.2 Reseptor G-Protein-Coupled Terdiri superfamili Very Large Protein dengan

Tujuh Segmen transmembran .............................................. ......................... 83

2.1.3 Ragam Messenger kimia yang sangat berbeda Act melalui 7tm Reseptor

2.2 Reseptor G-Protein-Coupled Apakah Protein Bundle Tujuh-spiral Tertanam

dalam Selaput

2.2.1 Struktur X-Ray dari Rhodopsin ........................................ ...................................

84

2.3 Reseptor G-Protein-Coupled Apakah Terdiri dari Beberapa Keluarga

...................................... 84

2. 3.1 Banyak Reseptor 7tm Masih Reseptor Orphan ........................................ ...........

84

2.3.2 Subtipe Reseptor yang Bind Ligan Sama Memiliki Mei Evolved untuk

Beberapa Alasan, Beberapa Yang Masih Tidak Jelas ......................................... ........

87

2.4 Rhodopsin-Seperti Reseptor 7tm Apakah keluarga kuantitatif Dominan

...................... 88

2. 4.1 Lindung Disulï ¬ de Bridge Menciptakan Dua Loops ekstra dari Atas TM-III

2.4.2 Jaringan Loops relatif pendek dan Kesehatan Lindung Tampaknya Dua Domain

Intramolekuler ............................................ ............................. 89

2.4.3 Beberapa Reseptor Memiliki Disulï ¬ de-Kaya, Ligan-Binding, N-Terminal

2.4.4 glikosilasi Penting untuk Protein Folding dan intraselular

2.4.5 Residu prolin Lindung di Transmembranes Mungkin Fungsional Pentingnya

2.4.6 Interhelical Kendala melalui Jaringan Hidrogen-Bond dan Lainnya Interaksi

Nonhydrophobic ................................................ ..................................... 91

2.4.7 Sebuah Helix amphipathic intraselular Menghubungkan TM-VII yang

Palmityolation Situs

2.4.8 Agonis-Dependent Fosforilasi Alters Interaksi dengan intraselular Protein

2.5 Keluarga B Adalah Keluarga Perbedaan Glukagon / VIP / Kalsitonin 7tm

Reseptor ...................... 91

2. 5.1 Farmakologi Fenotip Tertentu Reseptor Family B Ditetapkan oleh Interaksi

dengan landai .............................................. ......................................... 93

2.5.2 Anggota dari Subfamili dari Reseptor Family B Apakah struktural Mirip

Molekul Adhesi untuk your .............................................. .........................................

93

2.6 Sebuah Keluarga Ketiga Reseptor Glutamat metabotropic dan chemosensors

........................ 93

2.6.1 Struktur X-Ray dari Domain Ekstraseluler Ligan-Pengikatan mGluR1 Dikenal

dengan dan tanpa Glutamat ............................................ .......................... 94

2.7 Reseptor 7tm Menjalani Dimer-dan oligomerisasi ......................................

............... 94

2.7.1 Keluarga C Reseptor Fungsi sebagai Homo-atau heterodimer

................................... 94

2.7.2 Fungsional Signiï ¬ signifikansi dari dimerisasi Lebih Jelas antara Reseptor

rhodopsin-Seperti .............................................. ................................. 96

2.8 Reseptor 7tm Apakah dalam Equilibrium Dinamis antara aktif dan tidak aktif

Konformasi

2.8.1 agonis dan agonis Inverse Apakah Properties Dasar Ligan Sendiri pada reseptor

tersebut

2.8.2 Mutasi Sering Pergeseran Equilibrium ke arah konformasi aktif ................ 98

2.8.3 TM-VI Terutama Tampaknya Menjalani Perubahan konformasi Mayor pada

Receptor

2.9 Reseptor 7tm Memiliki Beberapa Agonis Mode Binding ............................

............ 99

2.9.1 retina, Monoamina, dan Rasul Kecil lainnya Bind antara Segmen transmembran

................................................ .......................................... 99

2.9.2 Peptida Bind di Beberapa Mode dengan Situs Interaksi Mayor di Eksterior

2.9.3 Agonis Nonpeptide Bind di Bagian Deep Utama Ligan-Binding Celah

2.10 Antagonis Mei Mengikat Seperti Agonis atau Mereka Mei Bind Sangat Berbeda

........................................... 103

2.10.1 Antagonis monoamine Sering Bind Dekat Dimana Agonis yang Mengikat

(Isosterically)

2.10.2 Antagonis Nonpeptide Mei Bind Sebaliknya Berbeda dari Agonis ..............

103

2.11 Reseptor 7tm Tampak Fungsi di Kompleks Protein Bersama Lainnya

Protein Sinyal-Transduksi .................................. ................................................. 104

2.12 7tm Receptor Signaling Apakah Turned Off, atau Switched, berdasarkan

Desensitisasi Mekanisme

2.12.1 Reseptor 7tm terfosforilasi oleh Kedua Kinase Kedua-Messenger dan Speciï ¬

c Kinase Reseptor ............................................ ..................................... 106

2.12.2 Arrestin Blok Signaling dan Fungsi sebagai Protein Adaptor untuk clathrin

......... 108

2.12.3 Internalisasi Apakah Dilanjutkan dengan Target untuk Lisosom atau dengan

Daur Ulang .............. 108

2.13 Bacaan lebih lanjut

2.1 RESEPTOR G-PROTEIN-COUPLED MERUPAKAN SEBUAH

UNIFYING SIGNAL-TRANSDUKSI

2. 1.1 GTP BINDING PROTEIN BERTINDAK SEBAGAI TRANSDUSER

ANTARA RESEPTOR DAN EFEKTOR

Sudah pada tahun 1969 itu menyarankan oleh Martin Rodbell dan rekan kerja

bahwa serangkaian hormon, semua yang dirangsang adenilat siklase, bertindak

dengan mengikat speciï ¬ c reseptor ( diskriminator ), yang terkait dengan intraseluler

adenilat siklase (yang ampliï ¬ er ) melalui apa yang disebut transduser

sistem. Transduser umum untuk semua hormon ini kemudian ditandai sebagai salah

satu dari beberapa heterotrimeric guanin mengikat protein nukleotida, G-

protein. Dalam sinyal-trans- mekanisme produksi, aktivasi reseptor menyebabkan

pertukaran difosfat guanosin (PDB) dengan guanosin trifosfat (GTP) dalam G-

protein, yang kemudian menjadi aktif dan dapat merangsang intraseluler sistem

efektor sampai aktivitas GTPase yang mengarah ke hidrolisis GTP terhadap PDB,

yang ternyata sistem off lagi (lihat Bab 7). Selain adenilat siklase, sejumlah ampli

atau efektor sistem, seperti phospholipases dan phosphodiesterases, serta saluran ion,

diatur oleh subunit G-protein dalam sistem pengolahan sinyal canggih. Jumlah

hormon penerimaan tor dan reseptor untuk utusan kimia lainnya bertindak melalui G-

protein yang sekarang dikenal sangat besar. Hal ini jelas bahwa reseptor G-protein-

coupled merupakan salah satu produsen utama sinyal-transduksi sistem dalam sel

eukariotik.

2.1.2 RESEPTOR G-PROTEIN-COUPLED TERDIRI SUPERFAMILI VERY

LARGE PROTEIN DENGAN TUJUH SEGMEN TRANSMEMBRAN

Pada tahun 1983, rhodopsin, molekul cahaya-sensing yang mengikat kromofor

retina, adalah pertama protein-coupled molekul akan di kloning. Fitur struktural yang

paling mencolok ini photore-Ceptor adalah tujuh segmen hidrofobik diyakini

merupakan tujuh transmembran (7tm) heliks, dengan analogi dengan heliks

transmembran tujuh pompa proton, bacteriorhodopsin. Ketika reseptor adrenergik,

sebagai pertama neurotransmitter / hormon reseptor, dikloning, ini protein ternyata

mengejutkan homolog dengan rhodopsin, dan memiliki struktur keseluruhan yang

sama, dengan tujuh segmen transmembran. Kloning berikutnya dari banyak reseptor

yang berbeda dan karakterisasi dari genom manusia telah menunjukkan bahwa

reseptor 7tm merupakan superfamili terbesar protein dalam organisme kita. Meskipun

sebagian besar reseptor telah ternyata menjadi homolog dengan rhodopsin, beberapa

keluarga jauh terkait reseptor G-protein-coupled yang ditemukan, dengan hanya

terlihat, fitur struktural umum menjadi tujuh seg-hidrofobik Yang penting, telah

menjadi semakin jelas bahwa reseptor 7tm mungkin sinyal melalui G- protein-

independen jalur, dan oleh karena itu lebih cocok menggunakan nama reseptor 7tm

dari reseptor G-protein-coupled .

2.1.3 RAGAM MESSENGER KIMIA YANG SANGAT BERBEDA ACT

MELALUI 7TM RESEPTOR

Spektrum hormon, neurotransmiter, mediator parakrin, dll, yang bertindak

melalui G-protein- reseptor digabungkan mencakup semua jenis kurir kimia: ion (ion

kalsium yang bekerja pada paratiroid dan chemosensor ginjal), asam amino (glutamat

dan asam aminobutyric, atau GABA),monoamina (katekolamin, asetilkolin,

serotonin, dll), utusan lipid (prostaglandin, tromboksan, anandamide, endogen

cannabinoid, platelet-activating factor, dll), purin (adenosine dan adenosin trifosfat

[ATP]), neuropeptida (tachykinins, neuropeptide Y, endogen opioid, cholecystokinin,

polipeptida intestinal vasoaktif [VIP], dll), hormon peptida (Angio- tensin,

bradikinin, glukagon, kalsitonin, hormon paratiroid, dll), kemokin (interleukin-8 [IL-

8], RANTES, makrofag INI ¬, ammatory peptida 1 Ã ¡ [MIP-1 Ã ¡ ], dll), hormon

glikoprotein (Mu- Roid-stimulating hormone [TSH], follicle-stimulating hormone

[FSH], hormon luteinizing [LH] / chorionic gonadotropin, dll), serta protease

(trombin). Dalam sistem sensorik kita, G- reseptor protein-coupled terlibat baik

sebagai molekul cahaya-sensing di mata (rhodopsin dan protein pigmen warna) dan

karena beberapa ratusan reseptor bau yang berbeda dalam penciuman sistem, di

samping sejumlah besar reseptor rasa.

2.2 RESEPTOR G-PROTEIN-COUPLED APAKAH PROTEIN BUNDLE

TUJUH-SPIRAL TERTANAM DALAM SELAPUT

Masalah karakteristik struktur tiga dimensi dari reseptor G-protein-coupled oleh

kristalografi sinar-x atau resonansi magnetik nuklir (NMR) telah sangat Difi kultus

untuk memecahkan. Reseptor yang rumit protein membran yang Difi ¬ kultus untuk

memproduksi dalam Sufisien jumlah besar. Ketika mereka telah tersedia, telah Difi ¬

kultus untuk membuat mereka berguna membentuk kristal. Namun, berdasarkan

terutama pada analisis mikroskopis cryoelectron (elektron crystallogra- phy) kristal

dua dimensi dan sistematis elektron resonansi paramagnetik (EPR) studi spin-label

rhodopsin, sejumlah model molekul reseptor 7tm dikembangkan selama tahun 1990

yang ditambahkan ke sejumlah besar mutasi dan lainnya jenis data biokimia tersedia.

2.2.1 STRUKTUR X-RAY DARI RHODOPSIN

Pada tahun 2000, pertama struktur x-ray berdasarkan kristal tiga dimensi dari

reseptor 7tm adalah diterbitkan, menunjukkan sapi rhodopsin di aktif, negara gelap

dan memiliki bundel tujuh heliks erat sesuai dengan yang dijelaskan dalam sebagian

besar model molekul. Yang penting, 11 - cis -retina, kromofor atau ligan, terletak

hampir persis seperti yang diharapkan, jelas yang melekat LysVII: 10 di TM-VII

melalui basis linkage Schiff dan dari sini melewati antara TM-III dan TM-VI,

berjalan agak paralel sepanjang TM-III, yang memungkinkan cincin Ionone untuk

berinteraksi terutama dengan residu selama di TM-V dan TM-VI (Gambar 2.1 dan

2.2). Anehnya, ligan itu erat tertutup dari sisi ekstraseluler, tidak hanya oleh rantai

samping dari heliks transmembran tetapi juga oleh terdiri dari lembar dibentuk oleh

ekstraseluler lingkaran-2 (menghubungkan TM-IV dan TM-V), yang, seperti yang

diharapkan, diadakan ke atas TM-III oleh disulï ¬ de obligasi. Di sisi intraseluler,

lebih atau kurang tertata loop diamati, tapi bukannya loop antara akhir TM-VII dan

situs .almitoylation (lihat nanti), yang amphipathic tertata alpha helix (heliks VIII)

telah ditemukan berjalan sejajar dengan membran bawah TM-VII, TM-I, dan TM-II.

Struktur ini adalah ï ¬ rst gambar reseptor 7tm, tapi sayangnya hanya tidak aktif

negara. Perlu dicatat bahwa meskipun lebih struktur, termasuk konformasi aktif dan

Hormon / reseptor pemancar, akan tersedia di tahun-tahun mendatang, ini hanya akan

memberi kita gambar statis. Di masa depan, pertukaran dinamis antara konformasi

yang berbeda dari protein harus dipahami. Pertanyaan ini mulai dibenahi melalui

berbagai biofisik berarti misalnya, percobaan menggunakan spin-label atau uorescent.

2.3 RESEPTOR G-PROTEIN-COUPLED APAKAH TERDIRI DARI

BEBERAPA KELUARGA

Sebagian besar reseptor G-protein-coupled homolog dengan rhodopsin, namun

lainnya karak-keluarga tatively kecil serta beberapa reseptor individu tidak berbagi

salah satu struktur fitur umum untuk keluarga rhodopsin (Gambar 2.3). Yang paling

dominan ini adalah glukagon / VIP / kalsitonin keluarga reseptor, atau œfamily BA

(yang memiliki sekitar 65 anggota), dan glutamat metabotropic keluarga reseptor,

atau œfamily Ca (yang memiliki sekitar 15 anggota), serta keluarga frizzled /

dihaluskan reseptor. Dengan demikian, satu-satunya fitur struktural bahwa semua

reseptor G-protein-coupled memiliki kesamaan adalah bundel heliks tujuh-

transmembran.Namun demikian, sebagian besar reseptor non-rhodopsin-seperti

memang memiliki fitur struktural minor tertentu dalam com-mon dengan reseptor

rhodopsin seperti "misalnya, jembatan antara bagian atas TM-III dan tengah

ekstraseluler lingkaran-3, dan sekelompok residu dasar yang terletak tepat di bawah

TM-VI.

2. 3.1 BANYAK RESEPTOR 7TM MASIH RESEPTOR ORPHAN

Jumlah konsensus mengenai jumlah reseptor 7tm belum tercapai. Namun,

jelaslah bahwa di antara anggota dari dua keluarga besar, hampir setengah dari

reseptor masih anak yatim yaitu, ligan endogen belum identiï ¬ ed. Meskipun proses

de-orphanization menjadi lebih dan lebih efi sien ¬, diharapkan masih beberapa tahun

lagi sebelum ini ratusan reseptor yatim telah ditandai, termasuk menentukan ligan

mereka mungkin mengikat, jika ada. Setelah itu, peran fisiologis dan potensi

farmakologi dari banyak

GAMBAR 2.1 Sebuah pandangan sisi struktur prototipe G-protein-coupled, 7tm

reseptor rhodopsin. Itu struktur x-ray sapi rhodopsin ditunjukkan dengan garis-garis

abu-abu horisontal, yang menunjukkan batas-batas seluler membran lipid. Ligan

retina akan ditampilkan di ruang-ï ¬ Model lling sebagai awan di tengah struktur.

Tujuh transmembran (7tm) heliks ditunjukkan dalam bentuk pita padat. Perhatikan

bahwa TM-III agak miring (lihat TM-III pada akhir ekstraseluler dan intraseluler

helix) dan bahwa Kinks yang hadir dalam beberapa lainnya heliks, seperti TM-V (ke

kiri), TM-VI (di depan retina), dan TM-VII. Dalam semua kasus ini, ini Kinks adalah

karena adanya residu prolin baik dilestarikan, yang menciptakan titik lemah dalam

heliks struktur. Kinks ini diyakini penting fungsional dalam mekanisme aktivasi

untuk 7tm reseptor pada umumnya. Juga perhatikan amphipathic helix-VIII yang

terletak sejajar dengan membran di antarmuka membran.

GAMBAR 2.2 Sebuah pandangan atas struktur prototipe G-protein-coupled reseptor

rhodopsin 7tm. Itu struktur x-ray sapi rhodopsin ditampilkan sebagai dilihat dari

ruang ekstraseluler. Ujung ekstraseluler dari masing - masing transmembran heliks

itunjukkan. Perhatikan bagaimana ligan retina benar-benar tertutup oleh plugâ terdiri

dari struktur lembaran dibentuk oleh perpanjangan ekstraseluler N-terminal dan

ekstraseluler lingkaran-2. A garis abu-abu padat dari ujung ekstraseluler TM-III ke

untai di ekstraseluler lingkaran-2 menunjukkan lokasi struktural yang sangat penting

disulï ¬ de jembatan, yang dilestarikan tidak hanya di kalangan keluarga A,

rhodopsin-like receptors tetapi juga di antara semua reseptor 7tm (lihat teks untuk

beberapa pengecualian).

GAMBAR 2.3 Tiga keluarga utama mamalia G-protein-coupled reseptor 7tm pada

mamalia. Tidak urutan identitas jelas yang ditemukan antara rhodopsin-seperti

keluarga A, glukagon / VIP / kalsitonin keluarga B, dan glutamat metabotropic /

chemosensor keluarga C reseptor 7tm G-protein-coupled, dengan pengecualian dari

jembatan antara bagian atas TM-III dan tengah ekstraseluler lingkaran-2 (lihat

Gambar 2.2). Demikian pula, tidak ada identitas urutan jelas ada di antara anggota

dari tiga keluarga dan, misalnya reseptor 7tm rasa pahit, reseptor feromon V1R, dan

protein frizzled 7tm, yang semuanya baik diketahui atau diyakini reseptor G-protein-

coupled. Bacteriorhodopsins, yang tidak G-protein- protein ditambah tapi pompa

proton, sama sekali berbeda dalam hal urutan asam amino tetapi memiliki tujuh

heliks bundel diatur agak mirip dengan yang untuk reseptor G-protein-coupled.

GAMBAR 2.4 Bagian dari rhodopsin-like receptors 7tm. Hanya beberapa cabang

dari pohon ditunjukkan untuk menyoroti prinsip-prinsip tertentu. Urutan skala

kesamaan mulai dari tengah pohon tidak linear dan tidak dimulai dari nol. Semua

reseptor rhodopsin seperti setidaknya 15 sampai 20% homolog untuk Misalnya,

rhodopsin vs reseptor monamine atau rhodopsin vs reseptor peptida. Daerah yang

diarsir menunjukkan identitas lebih dari 70% urutan, yang mencakup sebagian besar

subtipe reseptor seperti, reseptor muscarinic dan reseptor endotelin. Namun, perlu

diketahui bahwa untuk subtipe ligan lain, seperti di Y neuropeptida dan reseptor

angiotensin, identitas urutan bisa sangat terbatas, meskipun mereka mengikat

endogen yang sama hormon atau pemancar dengan nanomolar AFI ¬ syarakat. Juga

mencatat bahwa subtipe reseptor tertentu tampaknya berasal dari cabang yang

berbeda (di sini, histamin, dopamin, dan angiotensin), menunjukkan evolusi

konvergen mungkin di mana reseptor mungkin memiliki œpicked upa ligan. target

obat baru yang potensial akan harus clariï ¬ ed. Dalam hubungan ini, perlu dicatat

bahwa peran fisiologis dan potensi farmakologis yang belum hanya ditandai dengan

tingkat yang wajar untuk reseptor beberapa, terutama karena kurangnya berguna,

selektif farmakologis alat. Ini adalah kasus bahkan untuk banyak subtipe reseptor

monoamine terkenal.

2.3.2 SUBTIPE RESEPTOR YANG BIND LIGAN SAMA MEMILIKI MEI

EVOLVED UNTUK BEBERAPA ALASAN, BEBERAPA YANG MASIH

TIDAK JELAS

Banyak hormon dan pemancar memiliki beberapa subtipe reseptor dan subtipe

lebih dari diharapkan dari studi fisiologis dan farmakologis klasik. Secara struktural,

ini subtipe reseptor mungkin atau mungkin tidak sangat mirip. Sebagai contoh,

sebagian besar subtipe dalam sistem monoamine atau, misalnya, endotelin ET-A dan

reseptor ET-B lebih dari 70 atau 80% identik dalam urutan asam amino mereka

(Gambar 2.4). Di sisi lain, beberapa anggota dari empat yang berbeda reseptor

histamin dan ï ¬ ve berbeda neuropeptide Y (NPY) reseptor hampir sama renggang

berhubungan satu sama lain karena mereka adalah untuk setiap rhodopsin-like

receptor 7tm lainnya (yaitu, sekitar suhu 25 - 30% identitas), yang berhubungan

dengan terjadinya residu umumnya dilestarikan dalam transmembran daerah. Namun,

subtipe reseptor yang berbeda, apakah atau tidak mereka sangat erat terkait di urutan

asam amino, biasanya semua mengikat ligan alami mereka dengan tinggi dan setara

Afinity, dan awalnya mereka identiï ¬ ed terutama melalui reaksi yang berbeda

dengan agonis sintetik atau antagonis. Dalam beberapa kasus, fungsional signiï ¬

signifikansi dari subtipe reseptor agak jelas; misalnya, subtipe reseptor sering

memberikan pemancar atau hormon kesempatan untuk pasangan melalui berbagai G-

protein dan dengan demikian mengaktifkan sistem efektor yang berbeda. Namun,

dalam banyak kasus, fungsional signiï ¬ signifikansi subclass reseptor lebih halus

misalnya, di mana subtipe hanya menampilkan sedikit perbedaan dalam sifat

desensitisasi atau perbedaan dalam kemampuan mereka menjadi konstitutif aktif

(lihat pembahasan di bawah).

GAMBAR 2.5 Beberapa karakteristik struktural dari keluarga rhodopsin-like A

reseptor 7tm. Residu yang terletak di heliks transmembran berbayang abu-abu terang.

Subunit dari heterotrimeric G-protein diyakini berinteraksi terutama dengan residu

yang terletak di segmen intraseluler, yang dinaungi abu-abu gelap. Dalam setiap

segmen transmembran, satu atau lebih residu tertinggal antara hampir semua anggota

keluarga. Residu sidik jari transmembran utama ini yang disorot: AsnI:18, AspII:10,

CysIII:01, ArgIII:26, TrpIV:06, ProV:16, ProVI:15, and ProVII:17. Struktural dan /

atau fungsional pentingnya bagian tertentu dari struktur reseptor ditunjukkan pada

gambar.

2.4 RHODOPSIN-LIKE RESEPTOR 7TM ADALAH KELUARGA

KUANTITATIF DOMINAN

Pola dasar G-protein-coupled reseptor rhodopsin. Serangkaian residu "sidik

jari", yang sebagian besar terletak di dalam segmen transmembran, telah tersimpan

antara reseptor rhodopsin-like, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2.5. Ini residu

sidik jari tersimpan pada 95 sampai 98% dari reseptor, dan setiap reseptor yang

diberikan akan berisi sebagian besar dari mereka. * Namun, di antara semua

rhodopsin-like reseptor G-protein-coupled tidak ada residu benar-benar tersimpan.

Yang paling kekal adalah satu ArgIII: 26 terletak di kutub intraseluler TM-III di

urutan KERING (hanya kurang dalam beberapa reseptor). Residu ini diyakini terlibat

dalam signaling untuk Gprotein (lihat pembahasan di bawah). Namun demikian,

beberapa fitur struktural membedakan antara subfamilies, misalnya, reseptor kemokin

dari reseptor rhodopsin-like lainnya.

2.4.1 JEMBATAN DISULFIDA YANG TERSIMPAN MENCIPTAKAN

DUA LOOP EXTRA DARI PUNCAK TM-III

Salah satu fitur yang paling sangat tersimpan antara reseptor 7tm adalah

jembatan disulfida antara Cys di atas TM-III dan a Cys terletak di suatu tempat di

tengah-tengah loop ekstraselular kedua. Lingkaran ini dengan demikian berubah

menjadi dua loop yang menghubungkan bagian atas TM-III dengan bagian atas dari

kedua TM-IV dan TM-V. Kedua loop ekstra mengikat TM-IV dan TM-V erat dengan

TM-III, yang umumnya dianggap kolom tengah dalam ikatan tujuh heliks. Dalam

rhodopsin, loop ini membentuk lembaran-β "tertutup" di atas kantung ikatan ligan di

mana retina berada (lihat Gambar 2.1 dan 2.2). Dalam MSH / adrenocorticotrophic

hormone (ACTH) dan cannabinoid CB1 dan CB2 reseptor, disulfide jembatan ini

tidak ada. Namun, dalam kasus reseptor MSH / ACTH, hanya dua residu hidrofilik

terpisah TM-IV dan TM-V, yang hanya merupakan cara lain untuk memegang TM-V

erat dengan sisa A-domain.

2.4.2 JARINGAN LOOP YANG RELATIF PENDEK DAN TERSIMPAN

BAIK TAMPAKNYA MENJELASKAN DUA DOMAIN INTRAMOLEKULAR

Terlepas dari kenyataan bahwa urutan asam amino reseptor 7tm agak kurang

tersimpan, terutama di luar segmen transmembran, panjang sebagian besar loop

adalah secara mengejutkan tersimpan baik. Loop yang menghubungkan TM-I dan

TM-II dan yang menghubungkan TM-II dan TM III pendek dan hampir sama panjang

dalam semua reseptor rhodopsin-like, meskipun perbedaan besar dalam urutan asam

amino yang sebenarnya (Gambar 2.6). Sebagaimana dibahas di atas, jembatan

disulfida tersimpan menciptakan dua loop pendek, yang menambatkan TM-IV dan

TM-V erat dengan tiga segmen transmembran. Kedua segmen transmembran C-

terminal, TM-VI dan VII TM-, juga dihubungkan dengan loop intraselular singkat

sekitar sepuluh residu (Gambar 2.6). Namun, loop menghubungkan TMV dan TM-VI

sangat buruk tersimpan dalam hal berurutan dan panjang dan sering relatif lama,

dalam beberapa kasus hingga beberapa ratus residu. Dengan demikian, tampak bahwa

reseptor rhodopsinlike secara struktural terdiri dari dua domain intramolekul

diselenggarakan bersama oleh jaringan loop yang relatif singkat: domain A-yang

terdiri dari TM-I sampai TM-V dan-domain B yang terdiri dari TM-VI dan TM -VII.

Bahkan, dua domain hipotetis dapat membentuk splitreceptor berfungsi penuh pada

co-ekspresi dua plasmid, yang masing-masing kode untuk salah satu domain.

GAMBAR 2.6 Panjang segmen intra dan ekstraseluler rhodopsin-like keluarga

reseptor. Kolom menunjukkan median segmen intra dan ekstraseluler dari 29

monoamine manusia dan 29 hormon peptida manusia atau reseptor neuropeptida. N-

panjang, N-terminal ekstensi ekstraselular, IC, intraseluler loop; EC, ekstraseluler

loop; C-panjang, ekstensi intraseluler C-terminal. Yang sangat kekal disulfida

jembatan dari ujung ekstraseluler TM-III ke tengah ekstraseluler lingkaran-2 (lihat

Gambar 2.2) membagi lingkaran ini menjadi dua loop, ditunjuk EC2A dan EC2B.

Perhatikan seberapa baik-tersimpan sebagian besar loop dalam hal jumlah residu

asam amino, yang tidak kasus untuk identitas urutan, kecuali intraseluler lingkaran-3,

yang lebih panjang dari yang lain dan yang bervariasi sangat panjang antara reseptor .

Ini bisa menunjukkan bahwa reseptor secara struktural dan fungsional mungkin

terdiri dari dua domain: A domain yang terdiri dari TM-I ke TM-V dan domain B

yang terdiri dari TM-VI dan VII-, masing-masing dihubungkan dengan singkat, dan

panjang namun tidak berurutan, loop baik tersimpan. (Angka ini didasarkan pada data

yang disajikan dalam Nielsen, SM et al., Eur. J. Biochem., 251, 217-226, 1998.)

Dalam rhodopsin, studi EPR telah menunjukkan periodisitas heliks jelas di

sebagian besar intraseluler lingkaran-3, kecuali untuk beberapa residu di tengah

(ditunjukkan dalam Gambar 2.5). Ini akan menunjukkan bahwa TM-V dan TM-VI

memperpanjang jalan ke sitosol dan hanya loop yang sangat singkat menghubungkan

dua ekstensi heliks. Namun, dalam kristal tiga dimensi, kebanyakan intraseluler

lingkaran-3 adalah loop yang agak terstruktur. Dengan demikian, dalam kasus ini, ada

kemungkinan bahwa studi EPR memberitahu kita sesuatu tentang "solusi" struktur

reseptor, yang mungkin tidak jelas dalam struktur sinar-x.

2.4.3 BEBERAPA RESEPTOR MEMILIKI DISULFIDE-KAYA, IKATAN-

LIGAND, DOMAIN N-TERMINAL

N-terminal segmen ekstraseluler cukup bervariasi baik panjang dan urutan.

Dalam subfamili reseptor yang mengikat glikoprotein hormon TSH, FSH, LH dan

chorionic gonadotropin, segmen ini sangat panjang dan berisi satu set sistein kokoh,

yang diharapkan dapat membentuk jaringan jembatan disulfida, sehingga

menciptakan definisi yang baik, domain globular yang homolog dengan faktor

transkripsi dengan struktur tiga dimensi yang jelas. Dalam subfamili ini reseptor,

hormon glikoprotein memperoleh sebagian besar energi yang mengikat mereka

dengan interaksi dengan domain N-terminal besar, yang dalam beberapa kasus,

bahkan dalam bentuk yang larut terpotong, mampu mengikat hormon.

2.4.4 GLIKOSILASI PENTING UNTUK PELIPATAN PROTEIN DAN

TRANSPORTASI INTRASELULAR

Hampir semua reseptor 7tm yang terglikosilasi. Biasanya beberapa urutan

pengenalan Asn-X-Thr/Ser untuk glikosilasi N-linked ditemukan di segmen amino-

terminal tapi kadang-kadang juga di tempat lain. Glikosilasi ini secara tidak langsung

penting bagi ikatan ligan atau fungsi reseptor. Namun, seperti halnya bagi sebagian

besar protein membran lain yang diungkapkan pada permukaan sel, glikosilasi

tampaknya menjadi modifikasi pasca-translasi, yang melalui pengenalan oleh protein

spesifik dalam retikulum endoplasma, calnexin, memastikan bahwa protein disimpan

dalam mesin ekspor seluler sampai benar-benar terlipat. Dari fungsi derajat calnexin

sebagai pendamping, "foldase," atau hanya protein retensi masih belum jelas. Bagi

banyak reseptor, fraksi yang relatif besar dari molekul tidak pernah sampai ke

membran plasma dalam sistem ekspresi heterolog. Ligan sintetik tertentu, disebut

sebagai molekular atau farmakologikal caperone, dapat, melalui difusi ke dalam

retikulum endoplasma, mengikat dan menstabilkan reseptor yang baru disintesis

tersebut dan membantu membawa mereka ke permukaan sel. Senyawa tersebut bisa

menjadi obat yang berguna (orphan) untuk mengobati penyakit yang disebabkan oleh

mutasi pada reseptor 7tm yang menyebabkan malfolding dan kurangnya ekspresi

permukaan reseptor yang dinyatakan fungsional, seperti, misalnya, dalam kasus

diabetes insipidus.

2.4.5 SISA PROLIN KOKOH DALAM TRANSMEMBRAN MUNGKIN

MEMILIKI KEPENTINGAN FUNGSIONAL

Karena cincin pyrolidine dari asam amino prolin melibatkan nitrogen backbone,

mencegah pembentukan salah satu ikatan hidrogen menstabilkan tulang punggung α-

helix. Dengan demikian, prolines jarang terjadi pada α-heliks dalam protein globular.

Namun demikian, residu prolin adalah salah satu residu sidik jari tersimpan baik di

beberapa heliks transmembran. Dalam bacteriorhodopsin, rhodopsin, dan protein

membran lainnya, prolines di beberapa tapi tidak semua kasus menyebabkan

kekakuan dalam heliks transmembran. Para prolines kokoh di TM-V, TM-VI, dan VII

TM-reseptor 7tm akan menciptakan "titik lemah" dalam heliks tersebut. Dengan

demikian, dapat dispekulasi bahwa residu prolin tersimpan memberi peran penting

dalam fungsi dinamis dari reseptor, mungkin dengan memfasilitasi pertukaran antara

konformasi yang berbeda dan / atau dengan membiarkan selain heliks transmembran

yang sangat stabil untuk "goyah" dalam rangka untuk mengasosiasikan dan

memisahkan ligan dan subunit G-protein. Dalam hal ini, perhatian khusus telah

terbayarkan untuk penyediaan: 15 di TM-VI, berkenaan dengan keterlibatan yang

penting dalam proses aktivasi. Namun, ProVII: 17 di TM-VII yang tersimpan baik

sangat mungkin juga akan terlibat dalam proses ini.

2.4.6 KENDALA INTERHELICAL MELALUI JARINGAN HIDROGEN-

BOND DAN INTERAKSI NONHYDROPHOBIC LAINNYA

Sama seperti protein larut, kemasan rhodopsin dan membran protein umumnya

terjadi interaksi throughhydrophobic dalam inti molekul. Namun, struktur sinar-x

rhodopsin menegaskan asumsi bahwa serangkaian residu kutub (misalnya, Asni: 18,

AspII: 10, dan AsnVII: 18), sering bersama-sama dengan molekul air interkalat,

membentuk jaringan ikatan hidrogen di pusat reseptor. Di beberapa reseptor, kation

(terutama Na+) akan memodulasi afinitas pengikatan agonis, mungkin karena

interaksi dengan jaringan-ikatan hidrogen ini terletak relatif jauh di tengah reseptor,

menghadap ke arah permukaan intraselular membran. Seperti kebanyakan ligan yang

mengikat baik ke luar bagian dari reseptor atau antara bagian luar segmen

transmembran, tergantung pada ukuran dan struktur kimia dari ligan (lihat di bawah),

efek dari kation dianggap alosterik di alam .

2.4.7 HELIX AMPHIPATHIC INTRASELULER MENGHUBUNGKAN TM-

VII KE TEMPAT PALMITOYLASI

Dalam struktur sinar-x rhodopsin, sebuah helix amphipathic berjalan sejajar

dengan membran dari ujung intraseluler TM-VII di bawah rangkaian tujuh heliks ke

sisi lain dari TM-I dan TMII. Pada titik ini, satu atau lebih residu Cys sering

ditemukan dan dikenal untuk menjadi subyek modifikasi posttranslasional dinamis

dengan residu asam palmitat. Seperti proses fosforilasi, proses palmitoylasi

tampaknya secara dinamis diatur oleh reseptor hunian dan juga terlibat dalam

fenomena desensitisasi. Kedua modifikasi pascatranslasinya dapat mempengaruhi

satu sama lain. Sebagai contoh, kendala konformasi yang diinduksi oleh palmitoylasi

dapat mengubah aksesibilitas situs fosforilasi tertentu. Seperti proses fosforilasi,

konsekuensi fungsional palmitoylasi juga tampak bervariasi dari reseptor ke reseptor.

2.4.8 FOSFORILASI AGONIS-DEPENDENT MENGUBAH INTERAKSI

DENGAN PROTEIN INTRASELULER

Seperti dijelaskan lebih rinci di bawah, ikatan agonis akan menyebabkan sinyal

serta fosforilasi Ser dan residu THr, terutama, tetapi juga, dalam kasus-kasus tertentu,

residu Tyr terletak di intraseluler lingkaran-3 dan pada perpanjangan C-terminal.

Modifikasi pasca-translasi ini mengubah afinitas reseptor untuk berbagai protein

intraseluler, termasuk arrestin, yang sterik mencegah mengikat Gprotein lanjut dan

berfungsi sebagai protein adaptor. Juga, interaksi dengan jenis protein perancah lain

seperti protein PSD-95-like, yang dipengaruhi oleh keadaan fosforilasi reseptor.

2.5 KELUARGA B ADALAH KELUARGA DISTINCT GLUKAGON / VIP

/ KALSITONIN 7TM RESEPTOR

Reseptor untuk serangkaian hormon peptida dan neuropeptida merupakan

keluarga terpisah reseptor Gprotein-coupled sering disebut keluarga B, anggota yang

tak seperti residu sidik jari klasik dari reseptor rhodopsin-like. Keluarga ini termasuk

reseptor untuk hormon yang terlibat dalam metabolisme kalsium (kalsitonin dan

hormon paratiroid [PTH]), metabolisme glukosa (glukagon, glucagon-like peptide I

[GLP-I]), pencernaan saluran-fungsi (secretin, lambung hambat polipeptida [GIP] ,

GLP-II), serta neurohormonnya yang terlibat dalam fungsi hipofisis (growthhormone-

releasing factor [GHRH], ACTH-releasing factor [CRF]), dan neuropeptida penting

(polipeptida intestinal vasoaktif [VIP], hipofisis adenilat siklase stimulasi peptida

[PACAP ]) (Gambar 2.7). Mengingat pentingnya fisiologis peptida ini, ada

kemungkinan bahwa reseptor keluarga ini akan menjadi target utama untuk

pengembangan obat nonpeptide di tahun-tahun mendatang.

GAMBAR 2.7 glukagon / VIP / kalsitonin keluarga B dari 7tm reseptor. Ke

kanan adalah pohon evolusi untuk reseptor keluarga ini. Daerah yang diarsir

menunjukkan identitas urutan 70%. Dua-heliks konformasi ligan menunjukkan

bahwa beberapa dari ligan peptida untuk reseptor keluarga B tampaknya memiliki

struktur sekunder umum pada aktivitas air rendah, sebagaimana ditentukan oleh

eksperimen NMR. Hanya beberapa dari residu sidik jari umum keluarga ini

ditunjukkan dalam model serpentine. Perhatikan bahwa anggota keluarga ini tidak

berbagi dari residu sidik jari transmembran dari keluarga rhodopsin-like, namun

mereka memiliki potensi untuk membentuk sebuah jembatan disulfida dari puncak

TM-III dan tengah ekstraseluler lingkaran-2. Sebagai reseptor rhodopsin-lilke,

anggota keluarga B juga telah tersimpan prolines di transmembranes mereka, tetapi

tidak pada posisi yang sesuai dengan prolines keluarga A.

Selain tujuh segmen transmembran mereka, fitur umum yang paling mencolok di

antara reseptor ini adalah domain ekstraseluler N-terminal besar mereka. Segmen ini

berisi satu set enam residu Cys tersimpan, secara masuk akal terinterkoneksi oleh

sejumlah jembatan disulfida, sehingga membentuk domain globular yang diduga

terlibat dalam pengikatan ligan. Dua residu Cys lain, di bagian atas TM-III dan di

tengah lingkaran ekstraseluler-2, juga disimpan dan bisa membentuk jembatan

disulfida mirip dengan yang ditemukan di reseptor rhodopsin-like. Pertama

ekstraseluler loop variabel panjang dan bisa sampai 30 residu panjang. Seperti di

keluarga besar rhodopsin-like, sejumlah residu prolin tersimpan di segmen

transmembran reseptor keluarga B (Gambar 2.7). Namun, dalam keluarga ini prolines

terletak di TM-IV, TM-V, dan TM-VI dan tidak dalam TM-VII. Dalam TM-V dan

TM-VI, prolines berada pada posisi yang berbeda dari prolines kokoh reseptor

rhodopsin-like. Semua reseptor dari keluarga ini merangsang adenilat siklase dan,

oleh karena itu, beberapa melalui protein Gs. Mekanisme perpasangan termasuk

molekul Gs muncul untuk dibagikan dengan reseptor rhodopsin-like, meskipun

kurangnya urutan homologi.

2.5.1 FENOTIPE FARMAKOLOGI TERTENTU RESEPTOR KELUARGA B

DITENTUKAN OLEH INTERAKSI DENGAN RAMPS

Anggota keluarga kecil fungsi satu-transmembran protein sebagai protein

pemodifikasi aktivitas reseptor (RAMPs), yang berinteraksi dengan reseptor tertentu

dari keluarga B: reseptor kalsitonin dan kalsitonin reseptor-like receptor (CRLR).

RAMPs melayani dua tujuan. Dalam kasus CRLR, mereka berfungsi sebagai

pendamping, memastikan bahwa reseptor ditargetkan pada membran sel bukan

terakumulasi dalam retikulum endoplasma. Kedua, CRLR dalam kompleks dengan

RAMP-1 berfungsi sebagai peptida gen terkait kalsitonin (CGRP) reseptor,

sedangkan CRLR dalam kompleks dengan RAMP-2 berfungsi sebagai reseptor untuk

peptida pengirim pesan lain, adrenomodulin. Reseptor kalsitonin tiba di permukaan

sel sendiri dan di sini mengikat hormon kalsitonin. Namun, ketika dinyatakan dalam

sel yang juga mengekspresikan RAMP-1, reseptor kalsitonin bukan berfungsi sebagai

reseptor amylin. Untuk saat ini, tampak bahwa RAMPs kita kenal sekarang agak

selektif untuk kalsitonin dan reseptor CRLR. Namun, pengamatan reseptor ini jelas

menunjukkan bahwa molekul, farmakologi fenotip dari reseptor tertentu dapat secara

dramatis dipengaruhi oleh interaksi dengan mitra protein lainnya (lihat nanti diskusi

tentang dimerisasi dan perancah / adaptor protein).

2.5.2 ANGGOTA SUBFAMILI RESEPTOR KELUARGA B SECARA

STRUKTURAL MIRIP DENGAN MOLEKUL ADHESI SEL

Sejumlah besar reseptor orphan (sekitar 40), karena terjadinya residu tersimpan

dalam domain tujuh heliks mereka, jelas milik keluarga B dan ditandai dengan N-

terminal domain ekstraselulernya yang sangat besar. Alih-alih karakteristik domain

peptide-hormone/neuropeptideikatan, segmen N-terminal dari reseptor ini klasik

terdiri dari, misalnya, sejumlah faktor pertumbuhan epidermal (EGF) domain

ditempatkan pada tangkai musin-seperti, seperti dalam reseptor EMR-1, EMR-2, dan

EMR-3 dan CD97. Namun, perpanjangan N-terminal lactophilin, misalnya, dihiasi

oleh domain adhesi sel lainnya seperti lektin-like domain. Hanya dalam beberapa

kasus memiliki ligan atau pasangan untuk adhesi / reseptor sel molekul diduga telah

diidentifikasi. Sebagai contoh, CD97 reseptor telah terbukti secara khusus

berinteraksi dengan CD55, yang bukan merupakan kasus untuk homolog EMRs.

Banyak dari adhesi / reseptor molekul sel diekspresikan pada leukosit, tetapi beberapa

juga diungkapkan, misalnya, dalam SSP.

2.6 KELUARGA KETIGA RESEPTOR GLUTAMAT METABOTROPIC DAN

CHEMOSENSORS

Anggota ketiga, keluarga struktural berbeda dari reseptor-G protein-coupled,

keluarga C, mengikat baik glutamat atau GABA, atau mereka bertindak sebagai

sensor kimia untuk ion kalsium atau komponen rasa (Gambar 2.3). Glutamat dan

GABA merupakan pemancar asam amino penting dalam sistem saraf, bereaksi baik

dengan saluran ion ligand-gated (lihat Bab 3 dan 6) dan dengan serangkaian reseptor

G-proteincoupled disebut reseptor glutamat metabotropic dan reseptor GABAB. Di

antara sensor kimia yang dikenal dengan pasangan melalui G-protein, sensor kalsium

dari paratiroid dan ginjal yang homolog dengan reseptor glutamat metabotropic.

Secara struktural, reseptor ini ditandai dengan memiliki N-terminal ekstraseluler

segmen yang sangat besar (500 sampai 600 residu) dan sering juga intraseluler

domain C-terminal sama besar dipisahkan oleh segmen transmembran tujuh. Segmen

transmembran dihubungkan dengan loop pendek dan berbeda dalam urutan yang

benar dari dua keluarga lainnya yang disajikan di atas. Menariknya, beberapa

informasi yang paling rinci yang tersedia mengganggu struktur anggota keluarga C

dibandingkan dengan reseptor 7tm lainnya, sehubungan dengan ikatan ligan, aktivasi

reseptor, reseptor dimerisasi, dan interaksi dengan perancah / adaptor protein (lihat

diskusi nanti).

2.6.1 STRUKTUR X-RAY IKATAN-LIGAND DOMAIN

EXTRACELLULAR DARI MGLUR1 DIKENAL DENGAN DAN TANPA

GLUTAMAT

Domain ekstraseluler besar reseptor keluarga C secara struktural terkait dengan

keluarga protein yang mengikat bakteri yang berfungsi sebagai transporter untuk

asam amino dan molekul kecil lainnya di seluruh ruang periplasmic. Analisis

struktural X-ray telah menunjukkan bahwa glutamat dalam mGluR1 mengikat dalam

celah interdomain antara yang disebut LB1 dan LB2 domain dalam cara yang mirip

dengan, misalnya, asam amino mengikat dalam protein transpor bakteri (Gambar

2.8). Ikatan didominasi oleh interaksi dengan residu kutub pada LB1 dan LB2, yang

dibawa ke dekat dengan penutupan celah antara LB1 dan LB2 - dua domain

"sandwich" ligan. Dalam dimer disulfida yang terhubung, masing-masing monomer

mengikat glutamat a. Tidak hanya mengikat ligan terkait dengan perubahan

konformasi dalam setiap monomer (penutupan celah mengikat ligan dalam domain

ekstraselular bi-lobed), namun perubahan konformasi utama juga terjadi antara dua

protomers sebagai dua LB2 yang terbawa, rata-rata , 26 Å dekat satu sama lain pada

saat pengikatan ligan. Karena seiring rotasi, residu hadir dalam dua LB2s yang ,

dalam keadaan tidak aktif, bentuk tak terligan, adalah 43 Å jauhnya dan, dalam

bentuk glutamat terikat, ditemukan hampir menyentuh satu sama lain (Gambar 2.8).

Bahkan, dua struktur kristal tak terligat ditentukan, dan salah satunya hampir identik

dengan bentuk glutamat terikat dalam hal interdomain dan interaksi intersubunit,

menunjukkan bahwa reseptor dapat mengadopsi konformasi aktif dengan sendirinya.

Dengan demikian, tampak bahwa reseptor berada dalam keseimbangan dinamis

antara terbuka dan bentuk tertutup, antara domain ligan mengikat dalam setiap

monomer, dan antara kedua monomer dari dimer hubungan disulfida. Ligan agonis

muncul untuk bertindak hanya dengan menstabilkan yang tertutup, konformasi aktif,

reseptor mengadopsi dengan sendirinya (lihat pembahasan di bawah ini tentang hal

umum dari tema ini). Bisa dibayangkan bahwa dua gulungan tujuh heliks masing-

masing monomer (yang belum menjadi bagian dari struktur sinar-x) ditahan terpisah

dalam bentuk terbuka tak terligat tapi dibawa dekat satu sama lain dalam aktif, bentuk

tertutup. Seperti penataan ulang struktur monomer dalam dimer preformed juga

ditemukan dalam sistem reseptor sitokin satu-transmembran seperti yang dijelaskan

untuk reseptor eritropoietin, di mana ligan mengikat dalam hasil cara yang sangat

serupa dalam penutupan kesenjangan spasial antara segmen transmembran dan

dibayangkan intraseluler, domain enzym terhubung.

2.7 RESEPTOR 7TM MENJALANI DIMER-DAN OLIGOMERISASI

Banyak bukti biokimia menunjukkan \ika tidak semua reseptor 7tm memiliki

kecenderungan kuat untuk teragregat baik dengan dirinya sendiri dan dengan reseptor

7tm lainnya, paling jelas terlihat di beberapa pita berberat molekul besar dari sodium

dodesil sulfat (SDS) gel. Pita-pita yang tidak berarti terbatas pada dimer seperti,

dalam banyak kasus, beberapa struktur oligomer tatanan yang lebih tinggi yang

diamati. Ini adalah poin penting untuk dipertimbangkan kapan korelasi fungsional

pembentukan dimer dibahas dalam reseptor C non-keluarga.

2.7.1 KELUARGA C RESEPTOR FUNGSI SEBAGAI HOMO-ATAU

HETERODIMER

Bukti struktural dan fungsional jelas menunjukkan bahwa keluarga reseptor C

berfungsi sebagai dimer, baik sebagai homodimers atau sebagai heterodimer.

Reseptor glutamat metabotropic dan sensor kalsium, seperti dibahas dalam Bagian

2.6.1, ditemukan sebagai dimer kovalen terhubung di mana ada jembatan disulfida

antara residu Cys yang terletak di lingkaran dalam domain ekstraseluler N-terminal

masing-masing monomer. Jembatan Disulfida ini tampaknya hanya berfungsi untuk

menahan monomer dalam jarak dekat, seperti loop yang begitu terstruktur sehingga

tidak terselesaikan dalam struktur sinar-x.

GABA reseptor B bukanlah reseptor 7tm tunggal melainkan sebuah heterodimer

yang dibentuk oleh dua reseptor 7tm dari keluarga C. reseptor GABA B-R1, yang

awalnya dikloning, mengikat ligan GABA, tapi ketika diekspresikan sendiri itu

adalah untuk sebagian besar dipertahankan dalam retikulum endoplasma, itu sinyal

buruk, dan tidak memberikan profil farmakologis yang tepat. Sebaliknya, reseptor

GABAB-R2 tidak mengikat ligan dengan sendirinya, namun reseptor ini berfungsi

sebagai pendamping yang menahan ekspresi permukaan sel dari subunit GABAB-R1.

Heterodimer menampilkan profil farmakologis yang benar sesuai dengan reseptor

GABAB dari SSP dan sinyal sebagai reseptor GABAB alam melalui saluran kalium,

yang bukan kasus untuk monomer. Sinyal ini, menariknya, dimediasi melalui subunit

R2. Dasar struktural untuk pembentukan dimer pada reseptor GABAB terutama

struktur coil-coil yang terbentuk antara segmen ekor C-terminal dari subunit R1 dan

R2.

GAMBAR 2.8 aktif (bawah) dan tidak aktif (atas) struktur dari domain ekstraselular

dari reseptor glutamat metabotropic mGluR1 dari keluarga C. Sebuah diagram

skematik serpentine menunjukkan keseimbangan dasar reseptor penuh antara

konformasi aktif dan tidak aktif dan lokasi bagian dari reseptor yang telah struktural

ditandai dengan dan tanpa ligan yang terikat, glutamat. Reseptor Keluarga B

umumnya berfungsi sebagai dimer - dalam kasus mGluRs, sebagai dimer disulfida-

linked, seperti yang ditunjukkan. Ikatan Ligan domain masing-masing adalah "fly-

trap" terdiri dari dua domain yang lebih kecil, LB1 dan LB2, yang ditemukan dalam

konfigurasi terbuka di keadaan tidak aktif tapi dekat sekitar dan distabilkan oleh ligan

glutamat dalam keadaan aktif . Perhatikan perubahan konformasi yang cukup besar,

yang terjadi tidak hanya di dalam tetapi juga antara dua domain ekstraselular dari

dimer. Beberapa residu yang lebih dari 40 Å terpisah dalam keadaan tidak aktif tetapi

saling berhadapan langsung dalam keadaan aktif ditunjukkan. Perubahan konformasi

antara dua bagian dari dimer di mGluR1 ini agak mirip dengan perubahan konformasi

yang terjadi antara monomer dari reseptor erythropoietin pada saat aktivasi, yang

membawa transmembran dan domain intraseluler ke dalam kontak dekat.

2.7.2 FUNGSI SIGNIFIKAN DARI DIMERISASI LEBIH TIDAK JELAS

ANTARA RESEPTOR RHODOPSIN-LIKE

Untuk sebagian besar anggota keluarga A, berbeda dengan reseptor keluarga C,

telah sulit untuk membuktikan bahwa dimerisasi, atau lebih tepatnya oligomerisasi,

memiliki konsekuensi fungsional dan itu, sebagai fenomena umum, terkait erat

dengan proses aktivasi seperti itu. Tidak ada keraguan bahwa homo dan hetero-

oligomerisasi reseptor 7tm merupakan fenomena umum seperti yang ditunjukkan

oleh, misalnya, co-immunoprecipisasi menggunakan berbagai kontrol yang tepat.

Beberapa penelitian menggunakan transfer energi lightresonance (baik dalam bentuk

fluoresensi [fret] atau bioluminescence [Bret]) telah meyakinkan menunjukkan bahwa

homo dan hetero-oligomer seperti yang ditemukan pada permukaan sel-sel hidup utuh

tanpa adanya ligan, yaitu , dimer / oligomer konstitutif terbentuk. Catatan,

bagaimanapun, bahwa tidak ada efek agonis terbalik telah ditunjukkan untuk

fenomena ini. Efek agonis pada konstitutif fret atau sinyal Bret tidak jelas, dan

bervariasi dari studi ke studi dan dari sistem reseptor ke sistem reseptor. Namun

demikian, dalam beberapa sistem reseptor, heterodimerisasi / - oligomerisasi telah

diamati, dengan profil farmakologi yang berbeda dari profil diamati pada homo-

oligomer dinyatakan dalam sistem ekspresi heterolog yang sama.

Keluarga prototipe reseptor A, rhodopsin sendiri, jelas berfungsi sebagai

monomer meskipun kejadian dalam kepadatan yang sangat tinggi dalam membran

peka cahaya, namun dapat dikatakan bahwa rhodopsin tidak boleh digunakan sebagai

contoh untuk reseptor pada umumnya karena memiliki persyaratan yang sangat

istimewa dalam hal sinyal karena fungsinya sebagai sensor cahaya ultra-cepat.

2.8 RESEPTOR 7TM ITU DALAM EKUILIBRIUM DINAMIS ANTARA

KONFORMASI AKTIF DAN TIDAK AKTIF

Struktur kristal mGluR1 secara jelas menunjukkan bahwa aktivasi reseptor 7tm

dapat terjadi melalui pertukaran antara dua konformasi utama protomers dalam dimer

preformed. Hal ini mungkin bisa mewakili mekanisme aktivasi untuk reseptor 7tm

pada umumnya. Tapi, diyakini bahwa perubahan konformasi dalam gulungan tujuh

heliks dikaitkan dengan aktivasi reseptor, yang jelas sangat penting dalam reseptor-

reseptor yang berfungsi sebagai monomer, yang bisa menjadi mayoritas. Yang

penting, rangkaian struktur mGluR1 memang menunjukkan bahwa konformasi aktif

tidak disebabkan oleh ligan mengikat per se, tetapi bahkan perubahan konformasi

sangat besar dapat terjadi secara spontan. Dengan demikian, konformasi aktif reseptor

tersebut tidak disebabkan oleh ligan, reseptor dapat melipat ke dalam konformasi

aktif dengan sendirinya. Reseptor adalah protein membran dinamis yang ada secara

alami dalam keseimbangan antara konformasi aktif dan inaktif. Jika sebagian kecil

dari populasi reseptor pada waktu tertentu dalam konformasi aktif tanpa kehadiran

ligan, maka 7tm reseptor harus menampilkan beberapa derajat aktivitas sinyal

konstitutif. Artinya, pada kenyataannya, kasus tersebut. Dalam sel transfected dengan

reseptor 7tm, tingkat yang sesuai pembawa pesan kedua intraseluler umumnya

meningkat, tanpa hadir agonis (Gambar 2.9). Selain itu, semakin tinggi tingkat

ekspresi reseptor, semakin tinggi tingkat pengantar pesan intraselular kedua. Tingkat

aktivitas konstitutif bervariasi dari reseptor reseptor. Beberapa reseptor, seperti virally

dikodekan 7tm onkogen ORF74, dapat menampilkan hingga aktivitas konstitutif

50%. Dalam reseptor lain, tingkat aktivitas konstitutif sangat rendah sehingga hampir

mustahil untuk ditunjukkan. Dalam reseptor asetilkolin nikotinat, saluran ion ligand-

gated, diperkirakan bahwa hanya satu dalam satu juta reseptor pada waktu tertentu

dalam konformasi aktif tanpa kehadiran ligan. Seperti tingkat rendah aktivitas

konstitutif tidak akan terdeteksi dalam reseptor 7tm. Namun demikian, reseptor 7tm

adalah, seperti saluran ion ligand-gated dan kebanyakan protein lainnya, protein

alosterik yang mematuhi prinsip dasar jenis bersama allosterynya dari Monod,

Wyman, dan Changeux, yaitu, mereka pertukaran antara konformasi yang berbeda

yang dapat distabilkan oleh ligan.

GAMBAR 2.9 agonism vs agonis terbalik dan antagonisme. Meningkatnya tingkat

pengantar pesan kedua dalam sel mengekspresikan reseptor 7tm ditampilkan.

Kegiatan sinyal konstitutif ini dapat berkisar dari terukur sampai 50% atau lebih dari

kapasitas sinyal maksimal, tergantung pada reseptor dan jumlah reseptor yang

diekspresikan oleh sel-sel. Agonis dan agonis terbalik adalah properti dari ligan

sendiri dalam interaksi dengan reseptor. Agonis akan meningkatkan tingkat pembawa

pesan kedua lebih lanjut, sedangkan agonis terbalik akan menurunkan secara spontan

tingkat peningkatan pembawa pesan kedua kembali ke tingkat sel untransfected.

Ligan yang menunjukkan keberhasilan sinyal kurang dari agonis penuh (yaitu, agonis

parsial dan agonis terbalik) akan berfungsi sebagai antagonis dalam kompetisi untuk

reseptor hunian dengan agonis penuh (perhatikan bahwa antagonisme bukanlah milik

ligan dengan sendirinya pada reseptor). Ligan netral sering kali, namun tidak selalu,

juga antagonis.

2.8.1 AGONISM DAN AGONIS INVERS SIFAT DASAR LIGAN MANDIRI

TERHADAP RESEPTOR

Dalam sistem di mana reseptor berada dalam keseimbangan dinamis antara

aktif dan bentuk tidak aktif, ligan yang mengikat reseptor akan menggeser

kesetimbangan ini ke satu sisi, tergantung pada afinitas relatif senyawa baik aktif

maupun konformasi inaktif . Dengan demikian, ligan disebut agonis baik karena akan

meningkatkan sinyal jika memiliki afinitas tertinggi untuk konformasi aktif atau

menurunkan aktivitas sinyal jika memiliki afinitas tertinggi untuk konformasi aktif,

ligan kemudian disebut agonis terbalik (Gambar 2.9). Sebuah ligan yang memiliki

afinitas yang sama untuk konformasi aktif dan tidak aktif, yang tidak terlalu sering

diamati, tidak akan menggeser kesetimbangan dan dengan sesuai tidak akan

mengubah sinyal dan disebut ligan netral (atau antagonis netral ). Dengan demikian,

agonis dan agonis terbalik adalah sifat ligan sendirian di reseptor, sedangkan

antagonisme adalah properti yang diamati dari ligan dengan adanya agonis. Di

hadapan agonis penuh, agonis terbalik, ligan netral, dan agonis parsial akan, ketika

bersaing untuk hunian reseptor dengan agonis penuh, membawa sinyal ke aktivitas

yang diamati dengan ligan ini saja, dan mereka semua akan sesuai fungsi sebagai

antagonis. Bahkan, ligan netral, secara umum, juga akan memusuhi efek agonis

terbalik dan membawa kembali sinyal ke tingkat konstitutif normal.

Perlu dicatat bahwa agonis terbalik hanya dapat dihargai dalam sistem reseptor

mana aktivitas konstitutif yang terukur dan karenanya dapat diamati menurun. Jadi,

antagonis netral dan agonis terbalik hanya dapat dibedakan dalam suatu sistem di

mana reseptor menunjukkan aktivitas konstitutif. Pada pengaturan in vivo, agonis

alam akan paling sering hadir, dan untuk semua tujuan praktis sulit untuk

membedakan antara agonis terbalik dan efek pada aktivitas spontan yang disebabkan

oleh nada dari ligan endogen pada reseptor.

Dalam model matematika yang digunakan untuk menjelaskan hubungan ikatan

dan aktivitas yang diamati, fenomena ini dijelaskan dalam apa yang disebut alosterik

terner Model kompleks Lefkowitz dan Costa dan versi selanjutnya dari buku ini.

Menurut model ini, bentuk sinyal utama reseptor adalah salah satu yang terjadi di

kompleks terner terdiri dari agonis, reseptor, dan G-protein. Kedua agonis dan G-

protein akan memiliki afinitas tinggi untuk bentuk "terisomerisasikan" dari reseptor.

Penting untuk dicatat bahwa dalam 7tm reseptor, agonis akan memiliki afinitas

signifikan lebih rendah untuk bentuk G-protein-uncoupled reseptor, yaitu, mereka

mengikat dengan cara G-protein-dependen. Hal ini menjadi semakin jelas bahwa

antagonis, pada kenyataannya, memiliki afinitas tertinggi untuk konformasi reseptor

G-proteinuncoupled. Dengan kata lain, agonis dan antagonis mengikat istimewa

untuk populasi konformasi yang berbeda dan saling melengkapi target reseptor

bersama mereka.

2.8.2 MUTASI SERING MENGGESER KESEIMBANGAN TERHADAP

KONFORMASI ACTIVE

Rupanya, hambatan struktural menjaga reseptor 7tm dalam konformasi inaktif

yang mencegah interaksi produktif antara urutan di bagian sitoplasma dari segmen

transmembran dan loop intraseluler dan G-protein. Gangguan dari kendala ini akan

menggeser kesetimbangan ke arah konformasi aktif dan menyebabkan aktivitas

spontan atau konstitutif. Dengan demikian, di beberapa reseptor jelas bahwa reseptor

ini sangat mudah bergeser ke arah aktif, sinyal konformasi, karena banyak yang

berbeda mutasi eksperimen diinduksi akan menghasilkan peningkatan sinyal

konstitutif. Misalnya, dalam beberapa reseptor pengenalan monoamin pada posisi

tertentu tepat di bawah TM-VI dari setiap 19 residu asam amino lain dari yang dipilih

oleh evolusi akan meningkatkan aktivitas konstitutif di atas tingkat normal. Meskipun

hot spot tertentu untuk lokasi mutasi menyebabkan aktivitas konstitutif tinggi

(misalnya, Asp dalam urutan KERING), mengaktifkan mutasi tersebut telah

ditemukan di seluruh struktur reseptor 7tm, termasuk loop ekstraselular. Secara

umum, bentuk sinyal aktif reseptor agak tidak stabil, yang telah diamati secara

langsung di reseptor fluorescently label dan juga tercermin dari rendahnya tingkat

ekspresi permukaan mutan konstitutif aktif.

Mutasi yang menggeser kesetimbangan ke arah bentuk konstitutif aktif akan

sering menyebabkan penyakit. Misalnya, mengaktifkan mutasi pada TSH atau

reseptor LH bertanggung jawab untuk pengembangan adenoma tiroid dan

perkembangan pubertas pada anak-anak kecil, masing-masing. Dalam kasus adenoma

tiroid, reseptor TSH normal dinyatakan dalam sekitarnya jaringan tiroid normal.

2.8.3 TM-VI TERUTAMA MUNCUL UNTUK MENJALANI PERUBAHAN

KONFORMASI UTAMA PADA RESEPTOR AKTIVASI

Beberapa jenis bukti biokimia dan biofisik menunjukkan bahwa TM-VI

melakukan perubahan konformasi yang paling penting selama induksi agonis aktivasi

reseptor. Misalnya, percobaan EPR menggunakan label berputar sistematis

diperkenalkan telah menunjukkan bahwa akhir intraseluler TM-VI bergerak keluar

dan jauh dari pusat reseptor. Bukti juga menunjukkan bahwa helix VI dapat menjalani

rotasi berlawanan selama gerakan ini. TM-VI hanya berinteraksi dengan TM-II, TM-

III, dan TM-V melalui interaksi van der Waals dan bukan interaksi-ikatan hidrogen.

Selain itu, bagian sitoplasma dari TM-VI bawah baik tersimpan penyediaan: 15 tidak

dikemas sangat efisien untuk segmen transmembran tetangga. Dengan demikian,

hambatan energi untuk gerakan rigidbody ini bagian dari TM-VI jauh dari gulungan

heliks tidak besar seperti umumnya dibayangkan pada protein padat. Ia telah

mengemukakan bahwa penyediaan: 15 sangat penting untuk mekanisme aktivasi dan

bahwa gerakan TM-VI terjadi sekitar ini titik lemah, atau sendi, di heliks.

Melalui gerakan yang disarankan dari TM-VI, spasi dihasilkan antara TM-III

dan TM-VI yang bisa diharapkan menjadi situs interaksi yang penting untuk bagian

dari G-protein, yang berinteraksi dengan ujung intraseluler TM-III, TM-V, dan TM-

VI, serta helix VIII horizontal (lihat Gambar 2.5). Pengikatan G-protein jelas

diketahui menginduksi tinggi afinitas agonis keadaan ikatan reseptor 7tm pada

umumnya. Pengikatan arrestin, agak mengherankan, seperti Gprotein tersebut, juga

menginduksi keadaan ikatan agonis afinitas tinggi, dan karena itu dapat dibayangkan

bahwa arrestin mampu menempati beberapa ruang yang sama di bagian intraseluler

dari reseptor sebagai G -protein. Ruang ini bisa antara TM-III dan TM-VI, sehingga

menstabilkan konformasi aktif sesama reseptor, yang tetap tidak memberi sinyal

karena G-protein dicegah membentuk dengan kehadiran arrestin.

GAMBAR 2.10 Ikhtisar pola yang berbeda dari ikatan ligan pada reseptor 7tm

ditunjukkan secara skematis pada model serpentine dua dimensi. Tampaknya ada

beberapa cara berbeda untuk ligan untuk mengikat dan mengaktifkan reseptor 7tm,

dibayangkan karena agonis ini terutama hanya berfungsi untuk menstabilkan

konformasi aktif, dimana reseptor dapat melipat ke dalam dengan sendirinya (lihat

Gambar 2.8 dan teks). Dalam reseptor trombin, ditunjukkan ke kanan, enzim

memotong segmen N-terminal dan dengan demikian mengungkapkan (kotak abu-

abu) oligopeptida, yang kemudian mengaktifkan reseptor yang sementara masih

secara kovalen tertambat ke domain transmembran.

2.9 RESEPTOR 7tm Memiliki Beberapa Mode Ikatan Agonis

Pada awalnya orang percaya bahwa akan ada "kunci" umum di semua reseptor

homolog 7tm, sesuai dengan identifikasi awal situs ikatan monoamina, di mana

semua agonis dalam beberapa cara akan cocok. Saat itu dibayangkan bahwa dalam

7tm reseptor yang berbeda kunci ini berada, selama evolusi, secara khusus dilengkapi

untuk mengenali agonis tertentu. Namun, seperti ditunjukkan secara skematis pada

Gambar 2.10, analisis mutasi dan cross-linking percobaan telah menunjukkan bahwa

ligan kimiawi sangat berbeda ternyata mengikat dalam mode agak berbeda.

Sayangnya, sebagian besar pengetahuan kita tentang interaksi ligan-reseptor masih

didasarkan pada percobaan kehilangan fungsi (yaitu, mutasi atau substitusi yang

merusak mengikat atau kopling). Sangat sedikit dari titik-titik yang diduga interaksi

pada faktanya telah dipelajari secara rinci besar menggunakan alternatif, metode

tambahan.

2.9.1 RETINA, MONOAMINA, DAN IKATAN PEMBAWA PESAN KECIL

LAINNYA ANTARA SEGMEN TRANSMEMBRAN

Pengikatan ligan ini tidak terjadi dalam "cekung groove" yang terletak di

permukaan protein reseptor seperti yang sering dibayangkan. Seperti dijelaskan

dalam Bagian 2.2.1, struktur sinar-x rhodopsin menunjukkan bahwa retina terikat

jauh di dalam struktur tujuh heliks dengan poin interaksi utama dalam TM-III dan

TM-VI, serta titik lampiran kovalen di TM- VII. Bahkan, rhodopsin berinteraksi pada

dasarnya dengan semua segmen transmembran. Yang penting, rantai samping dari

heliks transmembran menutupi molekul retina di semua sisi, dan tempat ikatan yang

ditemukan di dalam protein tersebut yang tengah, ditutupi oleh plug loop

ekstraseluler yang teratur (Gambar 2.1 dan 2.2). Dengan demikian, gerakan utama

bagian yang signifikan dari reseptor harus terjadi agar ligan untuk bergerak kedalam

atau keluar dari situs mengikat, yang tidak terjadi karena "back-isomerisasi" dari

retina terjadi pada sel lain. Ini agak analog dengan pengikatan hormon steroid dan

ligan lainnya di reseptor nuklir, di mana panjang, helix yang tertata meliputi saku

mengikat terletak hampir di tengah-tengah dari protein reseptor.

Monoamina muncul untuk mengikat dalam cara yang agak mirip dengan retina.

Dalam sistem katekolamin, interaksi spesifik dan langsung dari gugus amina ligan

dengan kelompok karboksilat dari residu asam aspartat benar-benar tersimpan dalam

transmembran segmen III (AspIII: 08) telah dibuktikan secara detail melalui

penggunaan gabungan biologi molekuler dan kimia obat. Interaksi diselidiki baik

dengan menghancurkan mengikat dan aktivasi reseptor dengan bermutasi Asp untuk

Ser (mengubah asam karboksilat dengan gugus hidroksil) dan dengan

menghancurkan pengikatan ligan dengan mengubah amina ke keton atau ester.

Berbeda dengan reseptor wildtype, reseptor mutan, yang memiliki residu sering

diperkenalkan di tempat aspartat di TM-III, ligan terikat dengan afinitas tinggi ketika

keton atau ester diganti amina. Dengan kata lain, interaksi spesifik antara amina dan

gugus karboksilat asam-reseptor dapat ditukar dengan jenis lain dari interaksi kimia

melalui kecerdasan, modifikasi pelengkap dari kedua ligan dan reseptor.

Dengan demikian, gambar yang disukai saat ini dari pengikatan isoproterenol

ke reseptor β-adrenergik adalah bahwa ligan mengikat dalam kantung yang berpusat

antara TM-III, TM-V, dan TM-VI. Amina ligan berinteraksi dengan kelompok

karboksilat-asam dari Asp tersimpan di TM-III, sedangkan cincin katekol yang

berorientasi melalui interaksi-ikatan hidrogen dengan dua residu serin pada akhir

ekstraseluler TM-V. Cincin itu sendiri mengalami interaksi aromatik-aromatik

dengan residu fenilalanin di TM-VI terletak satu putaran heliks bawah sebuah Asn,

yang mengarah ke interaksi hidrogen-ikatan dengan kelompok β-hidroksi (Gambar

2.11). Asetilkolin, histamin, dopamin, serotonin, dan lainnya amina diyakini

mengikat dengan cara yang sama dengan berinteraksi dengan residu terletak pada

posisi yang sesuai dan / atau tetangga di reseptor target mereka. Amina titik interaksi,

AspIII: 08, kekal antara semua reseptor monoamin dan juga ditemukan dalam,

misalnya, opioid, somatostatin, dan KIA reseptor.

2.9.2 PEPTIDA TERIKAT DALAM BEBERAPA CARA DENGAN SITUS

INTERAKSI UTAMA DI SEGMEN EXTERIOR

Hormon-hormon glikoprotein besar, seperti TSH dan LH, mencapai sebagian

besar energi yang mengikat mereka dengan interaksi dengan segmen N-terminal

besar reseptor mereka. Menengah dan kecil ukuran neuropeptida dan hormon peptida

seperti substansi P dan angiotensin biasanya juga memiliki poin utama interaksi

terletak di segmen N-terminal reseptor mereka, tetapi dengan tambahan titik kontak

penting dalam loop dan di bagian terluar dari segmen transmembran. Titik-titik

kontak, yang tersebar dalam struktur primer, tampaknya berada dalam jarak relatif

dekat spasial dalam model terlipat reseptor (Gambar 2.12). Dalam beberapa kasus,

hubungi poin untuk peptida juga terletak lebih dalam di reseptor. Misalnya,

angiotensin muncul untuk berinteraksi dengan residu Lys dalam posisi V: 05. Mutasi

dalam beberapa studi telah menunjukkan bahwa peptida besar seperti NPY harus

berinteraksi dengan residu yang mendalam di tengah reseptor, bahkan lebih dalam

daripada terletak saku monoamina-mengikat, namun ada kemungkinan bahwa hit

mutasi tersebut mempengaruhi pengikatan peptida tidak langsung. Untuk peptida

yang lebih kecil seperti TRH, tampak bahwa sebagian besar titik interaksi yang

berlokasi lebih dekat ke tempat titik kontak untuk monoamina ditemukan: di sama

dalam saku bagian dari celah ligan mengikat reseptor utama.

Protease diaktifkan reseptor PAR-1 sampai PAR-4, yang PAR-1 adalah

reseptor trombin dan PAR-2 dibayangkan reseptor Faktor-VIIA, adalah kasus yang

sangat menarik. Ligan untuk reseptor ini merupakan bagian dari perpanjangan N-

terminal reseptor. Enzim (misalnya, trombin) akan mengikat dan membelah dari

sebagian besar segmen ini ekstraseluler dan dengan demikian mengungkapkan baru,

gratis N-terminus, sebuah pentapeptide kecil yang masih kovalen terikat ke seluruh

reseptor. Ini kecil, ditambatkan peptida "ligan" akan mengaktifkan reseptor dengan

cara mengikat terutama ke bagian lain dari domain eksterior reseptor, termasuk sisa-

sekarang terpotong segmen N-terminal (Gambar 2.10). Dengan demikian, reseptor ini

memiliki terlindung atau dikurung peptida ligan sudah kovalen ditambatkan ke

ekstensi N-terminal. Bisa dibayangkan bahwa beberapa ligan peptida lainnya

(misalnya, dalam keluarga kemokin atau glukagon GLP-1 keluarga) bertindak

sebagai "pseudo-ditambatkan" ligan. Mereka akan, melalui pengikatan awal untuk

segmen N-terminal reseptor target mereka, menjadi ditambatkan dan kemudian,

melalui interaksi sekunder dengan domain utama reseptor, menyelesaikan proses

aktivasi.

GAMBAR 2.11 Binding situs untuk katekolamin dalam reseptor adrenergik. Residu

kontak utama untuk isoproterenol agonis ditunjukkan dalam hitam putih monoamina

agonis diyakini untuk berinteraksi terutama dengan AspIII: 08, serv: 09, serv: 12,

PheVI: 17, dan AsnVI: 20. Yang ditunjukkan interaksi antara gugus amina ligan dan

kelompok karboksilat-asam AspIII: 08 secara meyakinkan telah ditunjukkan oleh

modifikasi gabungan dari reseptor dengan modifikasi mutagenesis dan saling

melengkapi dari ligan yang dilakukan oleh kimia obat. (Dari Strader, CD et al., J.

Biol. Chem., 266, 5-8, 1991. Dengan izin.)

2.9.3 NONPEPTIDE AGONIS TERIKAT DI BAGIAN DALAM DARI CELAH

IKATAN-LIGAND UTAMA

Tidak banyak agonis nonpeptide yang belum tersedia, tetapi senyawa tersebut

telah dijelaskan - misalnya, dalam angiotensin, CCK, dan sistem reseptor opioid.

Bahkan, untuk beberapa reseptor, seperti somatostatin, ghrelin, dan melengkapi

reseptor C5A, pada dasarnya semua senyawa yang ditemukan oleh pemeriksaan

menggunakan tes mengikat adalah agonis. Sebaliknya, bagi mayoritas reseptor yang

senyawa yang ditemukan dengan cara ini, mereka adalah antagonis. Alasan untuk ini

tidak diketahui. Tidak ada studi pemetaan rinci agonis nonpeptide telah menunjukkan

saku mengikat yang sebenarnya, tetapi jelas bahwa peta hits mutasi jauh dari

bertepatan dengan bahwa dari peptida agonis yang sesuai dan bahwa agonis

nonpeptide muncul untuk mengikat dalam gulungan tujuh heliks. Mekanisme

mengikat dan aktivasi alosterik tersebut telah dengan jelas telah ditunjukkan untuk

agonis nonpeptide untuk reseptor glutamat metabotropic dan sensor kalsium, di mana

glutamat atau kalsium mengikat keluar dalam domain ekstraselular, sedangkan agonis

nonpeptide kecil mengaktifkan reseptor ini dengan mengikat dalam gulungan tujuh

heliks . Untuk substansi P NK-1 reseptor, sebuah saklar logam-ion mengaktifkan

telah dibangun antara TM-III dan TM-VII (residu III: 08 dan VII: 06) tanpa

mempengaruhi substansi P mengikat dan aktivasi (Gambar 2.12). Dalam kasus ini,

jelas pula bahwa reseptor yang sama dapat diaktifkan baik dengan mengikat peptida

sampai di ujung loop dan ekstraseluler dari heliks atau kecil, yang jelas-ion logam

mengikat mendalam antara heliks, yang cocok baik dengan mekanisme aktivasi

alosterik dijelaskan di atas.

GAMBAR 2.12 situs pengikatan berbeda untuk agonis dan antagonis nonpeptide di

NK-1 (substansi P) reseptor. (A) Titik kontak diduga untuk agonis alami, substansi P,

ditunjukkan pada lingkaran putih pada abu-abu yang terletak di bagian yang lebih

ekstraseluler dari celah-ligan mengikat utama. Lokasi dua residu, yang ketika

bermutasi menjadi residu mengikat logam-ion dapat membentuk saklar logam-ion

mengaktifkan, yang menunjukkan untuk ditempatkan satu putaran heliks bawah dua

poin interaksi untuk agonis peptida dalam TM-III dan TM-VII, masing-masing.

Dengan demikian, agonis oleh ligan tampaknya diperoleh terutama melalui stabilisasi

suatu konformasi aktif antara segmen luar TM-III, TM-VI, dan VII TM-. (B)

Diagram roda heliks menunjukkan residu kontak diduga untuk quinuclidine

nonpeptide antagonis CP96, 345 di putih abu-abu yang terletak di saku dari celah-

ligan mengikat utama. Situs ini mengikat secara struktural dan fungsional juga dapat

berubah menjadi saklar ion logam-antagonis melalui pengenalan ion logam-residu

yang mengikat, seperti yang ditunjukkan. Perhatikan perbedaan yang cukup besar

dalam situs mengikat untuk agonis dan antagonis, yang dalam kasus situs ion logam-

antagonis tidak memiliki tumpang tindih. Hal ini menunjukkan bahwa ligan bertindak

sebagai "alosterik kompetitif" ligan, bersaing untuk mengikat reseptor dengan cara

mengikat ke situs yang berbeda ditampilkan dalam konformasi yang berbeda dari

reseptor: sebuah konformasi aktif dan salah satu dari banyak konformasi aktif,

masing-masing (lihat juga Gambar 2.8) . Dengan cara ini, mengikat satu ligan tidak

termasuk pengikatan jenis lainnya. (Bagian A dari Holst, B. et al., Mol. Pharmacol.,

58, 263-270, 2000. Dengan izin Bagian. B dari Elling, CE et al., Nature, 374, 74-77,

1995. Dengan izin .)

2.10 ANTAGONIS MUNGKIN TERIKAT SEPERTI AGONIS ATAU

MUNGKIN MEREKA TERIKAT SECARA SANGAT BERBEDA

Awalnya diyakini bahwa antagonis kompetitif akan mengikat ke situs yang

sama sebagai agonis dan fungsi hanya dengan menghalangi pengikatan agonis pada

reseptor, namun, jelas hari ini bahwa antagonis, apakah atau tidak mereka berperilaku

dengan cara kompetitif klasik, dapat bertindak secara independen dari agonis.

Kebanyakan jika tidak semua antagonis adalah agonis terbalik, yang merupakan

properti itu sendiri independen dari kehadiran agonis, sebagai ligan menghambat

aktivitas konstitutif reseptor dan karena itu tidak hanya menghambat akses agonis

untuk reseptor. Sesuai dengan ini, tidak mengherankan bahwa antagonis sering

memiliki situs mengikat mereka sendiri, yang mungkin atau mungkin tidak

bertepatan dengan bahwa dari agonis yang sesuai.

2.10.1 ANTAGONIS MONOAMIN SERING TERIKAT DEKAT DENGAN

DIMANA AGONIS MENGIKAT (ISOSTERICALLY)

Banyak antagonis untuk reseptor monoamine secara kimiawi mirip dengan

agonis yang sesuai sehubungan dengan memperlihatkan nitrogen bermuatan positif.

Dalam sistem reseptor, agonis sering dapat dikonversi menjadi antagonis melalui

modifikasi kimia relatif kecil. Dalam sebagian besar sistem ini, telah dibuktikan atau

diasumsikan bahwa antagonis, seperti agonis, berinteraksi dengan Asp tersimpan di

TM-III dan bahwa mereka menempati banyak ruang yang sama, yang biasanya

menempati agonis, dalam saku antara TM-III, TM-V, dan TM-VI. Namun, beberapa

antagonis, banyak yang agonis parsial, telah terbukti memiliki titik interaksi

tambahan - misalnya, di bagian atas TM-VII. Jadi, antagonis untuk monoamina, yang

dalam banyak kasus juga antagonis kompetitif klasik, mengikat sebagian besar ke

situs yang sama sebagai agonis yang sesuai dan berfungsi sebagai antagonis

kompetitif isosteric.

2.10.2 ANTAGONIS NONPEPTIDE MUNGKIN TERIKAT AGAK BERBEDA

DARI AGONIS

Selama bertahun-tahun, analog peptida telah dikenal yang bertindak sebagai

antagonis atau agonis parsial. Properti antagonis diperoleh dengan substitusi dengan

asam D-amino, pengenalan ikatan peptida berkurang, atau penggantian dengan

conformationally dibatasi analog asam amino. Antagonis peptida tersebut berbagi

banyak situs mengikat mereka dengan agonis peptida alami dan oleh karena itu juga

antagonis kompetitif isosteric.

Baru-baru ini, senyawa nonpeptide telah dikembangkan untuk banyak sistem

reseptor peptida. Senyawa ini, yang biasanya ditemukan melalui pemeriksaan file

kimia, umumnya tidak menyerupai ligan peptida yang sesuai kimia. Namun

demikian, mereka bertindak sebagai antagonis spesifik dan sering bersaing untuk

ligan peptida pada reseptor peptida. Pemetaan situs mengikat bagi antagonis

nonpeptide telah mengungkapkan bahwa mereka sering mengikat agak berbeda dari

agonis peptida. Senyawa nonpeptide biasanya memiliki titik interaksi yang letaknya

relatif jauh di dalam saku antara TM-III, TM-V, TM-VI, dan VII TM-, sesuai dengan

mana agonis dan antagonis untuk reseptor mengikat monoamine (Gambar 2.12).

Sebagaimana dibahas di atas, banyak agonis peptida ternyata tidak mencapai ke

bagian bawah saku ini. Dengan demikian, dalam beberapa kasus, antagonis reseptor

peptida nonpeptide untuk dapat bertindak sebagai antagonis kompetitif alosterik,

mengikat epitop berbeda dari agonis, namun, dua ligan masih bersaing untuk hunian

reseptor. Kinetika kompetitif dalam kasus tersebut adalah akibat dari fenomena yang

mengikat satu ligan termasuk pengikatan ligan lainnya. Peptida agonis dan antagonis

mengikat nonpeptide saling eksklusif dan dengan demikian bersaing untuk seluruh

reseptor, meskipun belum tentu situs mengikatumum. Secara matematis, ini mirip

dengan model klasik mengikat kompetitif. Pola mengikat saling eksklusif mungkin

akibat dari fakta bahwa agonis dan antagonis istimewa mengikat negara konformasi

yang berbeda dari reseptor (yaitu, aktif dan konformasi aktif, masing-masing). Dalam

P reseptor substansi, tempat pengikatan antagonis nonpeptide bahkan telah diterima

oleh suatu situs pengikatan logam-ion tanpa efek pada pengikatan agonis. Dalam

reseptor mutan, ion seng telah menggantikan antagonis nonpeptide dalam

pertentangan baik mengikat dan fungsi substansi P. Hal ini diyakini bahwa senyawa

nonpeptide dan ion seng bertindak sebagai antagonis dengan memilih dan

menstabilkan suatu konformasi aktif dan bahwa mereka demikian mencegah

pengikatan dan tindakan agonis.

Meskipun kantong mengikat telah diidentifikasi selama beberapa ligan, hanya

dalam sedikit kasus bahwa interaksi spesifik antara bagian kimia khusus pada ligan

dan Sidechain tertentu reseptor telah diidentifikasi oleh bukti biokimia keras.

Sebagaimana dibahas di atas, pemetaan interaksi tersebut harus didasarkan pada nyata

gain-of-fungsi percobaan. Dengan demikian, kita masih mengejutkan jauh dari

mengetahui orientasi sebenarnya dari pembawa pesan alami dan obat-obatan dalam

kantong mengikat mereka.

2.11 RESEPTOR 7TM MUNCUL UNTUK FUNGSI DI KOMPLEKS

PROTEIN BERSAMA PROTEIN SIGNAL-TRANSDUKSI LAINNYA

Hal ini sering membayangkan bahwa reseptor 7tm melayang di membran

menunggu hormon untuk mengikat dan bahwa kompleks hormon-reseptor kemudian

harus berbenturan dengan tepat G-protein. Aktif G-protein subunit kemudian akan

berdifusi pergi untuk menghadapi sebuah molekul efektor hilir, yang misalnya akan

menghasilkan pembawa pesan kedua, yang pada gilirannya diyakini menyebar jauh

ke dalam sel untuk akhirnya menemukan sebuah molekul efektor hilir lebih lanjut.

Namun, tampak bahwa sebagian besar proses ini terjadi dalam kompleks preformed

protein sinyal transduksi, termasuk reseptor hormon diadakan di dekat oleh perancah

khusus atau protein adaptor. Contoh protein tersebut adalah yang disebut protein

multi-PDZ, yang menyatakan jumlah domain PDZ yang berbeda, masing-masing

mengikat protein sinyal transduksi yang berbeda, biasanya melalui urutan

oligopeptide C-terminal yang jauh. Dengan membawa sinyal protein berurutan

berdekatan, kecepatan, selektivitas, dan efisiensi tercapai karena keterbatasan difusi

dieliminasi. Kedekatan ini sangat penting dalam komunikasi saraf, di mana protein

adaptor menciptakan sinaps yang 7tm reseptor, saluran ion, dan protein sinyal

sitoplasma dilokalisasi dalam struktur fokus diskrit dalam membran, terkait erat

dengan sitoskeleton. Sejumlah besar protein yang terlibat dalam menciptakan

sinapsis, termasuk protein multi-PDZ seperti PSD-95 (postsynaptic density-95)

(Gambar 2.13).

Untuk reseptor keluarga C, pentingnya dan dasar struktural untuk interaksi

dengan adaptor intraseluler atau protein perancah telah ditandai dengan sangat rinci,

seperti isu pembentukan dimer agak jelas untuk reseptor ini. Keluarga utama protein

adaptor, yang menjamin penargetan sel dan fungsi sinyal yang benar untuk reseptor

glutamat metabotropic, appearto menjadi apa yang disebut protein Homer, yang

sebagian besar terdiri dari dua domain: (1) sebuah EHV domain N-terminal yang

dapat mengikat kedua ujung C-terminal mGluRs atau ke inositol-1 ,4,5-fosfat (IP3)

reseptor / ryanodine reseptor pada membran retikulum endoplasma, dan (2) leusin

motif ritsleting C-terminal yang bertanggung jawab untuk kumparan -coil interaksi.

Seperti ditunjukkan dalam Gambar 2.13, domain EHV akan mengikat ekor C-

terminal dari reseptor mGluR dan IP3 reseptor, dan homodimerizasi dari domain

kumparan-kumparan dari protein Homer kemudian akan memastikan dekat antara

kedua sinyal protein , yang tidak akan berada jauh dari satu sama lain dalam sel. Ini

adalah sistem yang dinamis, sebagai upregulasi protein Homer-1a, yang penting tidak

memiliki domain motif leusin ritsleting, akan bersaing untuk mengikat dengan

protein Homer bifunctional dan mengakibatkan terganggunya signa l

transductosomes.

GAMBAR 2.13 Contoh interaksi reseptor dengan adaptor dan perancah protein. (A)

Interaksi reseptor glutamat metabotropic dengan protein Homer, yang melalui EVH1

mengikat domain mereka baik ekor reseptor yang terletak di membran sel dan IP3

reseptor yang terletak di membran toko kalsium dari retikulum endoplasma. Melalui

ritsleting leusin domain dari protein Homer, dimerisasi Homers dalam struktur

kumparan-kumparan terjadi. Dengan cara ini, komponen utama dari mesin sinyal

transduksi yang diadakan di dekat untuk menciptakan mekanisme sinyal yang efisien

melalui protein G, fosfolipase C, dan IP3. (B) Sistem yang sama menunjukkan bahwa

upregulasi protein Homer-1a, yang hanya memiliki satu EVH1 domain dan tidak ada

ritsleting leusin domain, akan, melalui kompetisi, memecahkan hubungan erat antara

reseptor dan molekul sinyal transduksi hilir, di kasus ini IP3 reseptor. (C) Ilustrasi

bagaimana PSD-95 (postsynaptic density protein 95) melalui PDZ domain dapat

memegang kedua reseptor 7tm dan saluran ion ligand-gated di daerah sinaptik.

Seperti dengan banyak protein perancah lainnya, PSD-95 memiliki beberapa domain

mengikat yang berbeda, dalam hal ini tiga domain yang berbeda PDZ, sebuah SH3

domain, dan domain Guk. Sebagai PSD-95 dapat berinteraksi baik dengan PSD-95

protein lainnya serta dengan protein perancah lain dan dengan protein dalam

sitoskeleton, mikro-arsitektur kompleks sinyal transduksi dapat dibangun.

Diharapkan bahwa reseptor 7tm diberikan dalam sel yang diberikan akan dapat

berpartisipasi dalam tidak hanya satu tapi juga lebih dari satu jenis sinyal

transductosome. Dengan demikian, reseptor akan menampilkan yang berbeda

fenotipe farmakologi molekuler dalam hal sinyal dan mungkin juga dalam hal sifat-

sifat ligan mengikat. Sangat mungkin bahwa hal itu tidak akan menjadi proses yang

sederhana untuk reseptor untuk berpindah dari satu jenis sinyal kompleks yang lain,

dan dapat dibayangkan bahwa reseptor bahkan mungkin harus pergi melalui siklus

internalisasi dan daur ulang dalam rangka untuk mengubah sinyal mitra.

2.12 SIGNAL RESEPTOR 7Tm MATI, ATAU DIAKTIFKAN, OLEH

MEKANISME DESENSITISASI

Tujuh transmembran reseptor sinyal diatur secara ketat dalam rangka untuk

memungkinkan penyesuaian terhadap perubahan lingkungan dan sehingga dapat

beradaptasi dengan situasi stimulasi lanjutan dan melindungi sel dari overstimulasi.

Sejumlah proses yang berbeda yang terlibat dalam 7tm reseptor desensitisasi.

Fosforilasi reseptor oleh kedua kinase kedua-messenger dan apa yang disebut G-

protein-coupled reseptor kinase (GRKs) akan terjadi dalam hitungan detik, diikuti

dalam beberapa menit dengan pengikatan arrestin, yang mencegah mengikat G-

protein dan berfungsi sebagai adaptor untuk selanjutnya mengikat clathrin, dan

kemudian oleh endositosis (Gambar 2.14). Lebih downregulasi jangka panjang

dikendalikan melalui ekspresi gen reseptor diubah, yang akan terjadi dalam beberapa

jam.

2.12.1 RESEPTOR 7TM YANG TERFOSFORILASI OLEH KINASE

KEDUA KEDUA-MESSENGER DAN KINASE RESEPTOR KHUSUS

Fosforilasi adalah cara yang paling cepat desensitizing reseptor 7tm dengan

uncoupling itu dari G-protein, dibayangkan melalui mengubah sifat elektrostatik dari

daerah yang terlibat dalam Gprotein mengikat. Kinase kedua pembawa pesan-

diaktifkan PKA (protein kinase A, kinase cAMP-dependent) dan PKC (protein kinase

C, terutama diaktifkan oleh diasilgliserol [DAG]) akan memfosforilasi Ser dan residu

THR di intraseluler lingkaran-3 dan ekor C-terminal dari 7tm reseptor dekat TMVII

terlepas dari keadaan aktivasi reseptor. Kinase kedua-messenger karena itu terutama

yang terlibat dalam apa yang disebut desensitisasi heterolog, di mana stimulasi dari

satu jenis reseptor 7tm dapat menurunkan rasa mudah terpengaruh sejumlah reseptor

lain dalam sel yang sama. Menariknya, setidaknya untuk β2-adrenoreseptor,

fosforilasi PKA Gαs-dimediasi tidak hanya Memisahkan reseptor dari Gs tapi

rupanya sekaligus menggeser sinyal ke Gi.

Berbeda dengan kinase kedua pembawa pesan-diatur, para GRKs selektif

memfosforilasi agonis reseptor-diaktifkan 7tm dan dengan demikian meningkatkan

afinitas reseptor untuk protein signalblocking, arrestin. Target residu untuk GRKs

berada di intraseluler lingkaran-3, terutama di ekor C-terminal dan sering dalam

urutan asam. GRKs merupakan keluarga setidaknya tujuh protein yang terdiri dari (1)

suatu receptor ikatan domain N-terminal (sering termasuk domain RGS terlibat dalam

mematikan Gi dan fungsi protein Gq), (2) bagian tengah, domain kinase katalitik; dan

(3) membran C-terminal domain penahan. Dinamis dan diatur membran asosiasi

adalah bagian penting dari fungsi yang paling GRKs, karena membawa mereka ke

dekat dengan substrat mereka, reseptor. Pada GRK1 dan GRK7 (visual GRKs),

membran asosiasi dicapai melalui farnesylasi C-terminal urutan CAAX mereka. Pada

GRK2 dan GRK3, yang secara historis disebut kinase reseptor β-adrenergik (atau

βARKs) tapi yang sebenarnya didistribusikan secara luas dan bertindak pada banyak

reseptor 7tm, 125-asam amino domain homologi pleckstrin C-terminal khusus akan

mengikat subunit β-γ dari heterotrimeric G-protein dan dengan demikian

mengamankan dekat dengan membran-terkait kompleks reseptor-G-protein. GRK4

dan GRK6 adalah membran terkait bahkan tanpa adanya reseptor 7tm diaktifkan

melalui palmitoylasi, yang merupakan modifikasi posttranslasial diatur. Pengaruh

fosforilasi oleh GRKs tidak identik, karena keduanya GRK2 dan GRK5 akan

mengikat dan phosphorylate β1-adrenoreseptor, tetapi hanya GRK5 fosforilasi

menyebabkan reseptor uncoupling dari protein perancah PSD-95.

GAMBAR 2.14 Agonis-induced desensitisasi reseptor dan internalisasi.

Mengikat agonis akan menstabilkan konformasi aktif dari reseptor yang akan

berinteraksi dengan heterotrimeric G-protein, yang menyebabkan sinyal transduksi

(pojok kiri atas). Sinyal ini dimatikan oleh fosforilasi reseptor oleh GRK dan

mungkin PKA, yang meningkatkan afinitas untuk β-arrestin. fungsi β-Arrestin

sebagai protein adaptor sambungan ke clathrin dan AP2 (dilambangkan oleh

pentamers abu-abu), dan ini mendorong pembentukan lubang dilapisi (di tengah

gambar), yang mencubit off oleh GTPase tersebut, dynamin, sehingga vesikel

dilapisi. Vesikula bergerak secara intraseluler melalui jalur endocytotic, di mana

perubahan dalam lingkungan (termasuk, misalnya, pengasaman) menyebabkan ligan

disosiasi dan detasemen β-arrestin. Agonis ini passaged untuk degradasi, dan reseptor

dephosphorylated. Tergantung pada jenis reseptor, itu kemudian rusak atau baik,

lebih sering, didaur ulang kembali ke permukaan sel, siap untuk pertemuan baru

dengan agonis.

2.12.2 SIGNAL BLOK ARESTIN DAN FUNGSINYA SEBAGAI ADAPTOR

PROTEIN UNTUK CLATHRIN

Inaktivasi penuh 7tm reseptor sinyal dicapai melalui pengikatan salah satu

keluarga molekul arrestin, yang sterik menghambat pengikatan G-protein. Arrestins

adalah protein sitosol, yang, setelah agonis mengikat reseptor 7tm, translokasi ke

diaktifkan, reseptor terfosforilasi dalam beberapa menit. Perbedaan afinitas arrestin

untuk reseptor terfosforilasi vs Nonphosphorylated hanya 10 - sampai 30 kali lipat.

Meskipun elemen kunci untuk arrestin mengikat diyakini terletak terutama di

perpanjangan C-terminal dari reseptor 7tm, arrestins berinteraksi juga dengan

intraseluler lingkaran-2 dan -3. Arrestins secara struktural terdiri dari dua domain

utama, masing-masing terdiri dari tujuh terdampar β-sandwich yang diikuti dengan

ekstensi C-terminal. Mengikat reseptor dimediasi terutama melalui paling N-terminal

β-roti domain arrestin, sedangkan bagian Cterminal protein bertanggung jawab untuk

membawa reseptor untuk lubang clathrin berlapis dan peristiwa endocytotic

berikutnya. Dengan demikian, fungsi arrestin sebagai protein adaptor

menghubungkan reseptor ke subunit β2-adaptin dari heterotrimeric AP-2 adapter

kompleks dan untuk clathrin sendiri.

2.12.3 INTERNALISASI DIIKUTI PENARGETAN KE LISOSOM ATAU

DENGAN DAUR ULANG

Reseptor internalisasi melalui lubang berlapis clathrin membawa reseptor

melalui kompartemen endocytotic mana ligan biasanya akan memisahkan dari

reseptor karena pH rendah untuk akhirnya terdegradasi pada akhir endosomes dan

lisosom. diasingkan reseptor baik mengikuti rute yang sama dan nasib fatal seperti

ligan, yang merupakan kasus, misalnya, untuk reseptor protease-diaktifkan dengan

ligan ditambatkan mereka, atau reseptor dephosphorylated oleh reseptor spesifik

fosfatase dan kemudian didaur ulang ke membran vesikel daur ulang. Tingkat dan

kecepatan resensitizasi dan daur ulang bervariasi antara reseptor 7tm. Dalam

beberapa kasus, sinyal dari reseptor 7tm dapat beralih dari G-protein-mediated

signaling dengan protein microtubuleassociated (MAP)-kinase-mediated signaling

oleh proses internalisasi, namun dalam kasus lain, reseptor 7tm mungkin sinyal

melalui MAP kinase independen internalisasi.

2.13 BACAAN

Rhodopsin-like 7TM receptor structure

Ballesteros, J. A., Shi, L., and Javitch, J. A., Structural mimicry in G-protein-coupled

receptors: implications of the high-resolution structure of rhodopsin for

structureŔfunction analysis of rhodopsin-like receptors, Mol. Pharmacol.,

60(1), 1Ŕ19, 2001.

Palczewski, K., Kumasaka, T., Hori, T., Behnke, C. A., Motoshima, H., Fox, B. A.,

Le, T. I., Teller, D. C., Okada, T., Stenkamp, R. E., Yamamoto, M., and

Miyano, M., Crystal structure of rhodopsin: a Gprotein- coupled receptor,

Science, 289(5480), 739Ŕ745, 2000.

Teller, D. C., Okada, T., Behnke, C. A., Palczewski, K., and Stenkamp, R. E.,

Advances in determination of a high-resolution three-dimensional

structure of rhodopsin, a model of G-protein-coupled receptors (GPCRs),

Biochemistry, 40(26), 7761Ŕ7772, 2001.

Orphan 7TM receptor

Stadel, J. M., Wilson, S., and Bergsma, D. J., Orphan G-protein-coupled receptors: a

neglected opportunity for pioneer drug discovery, Trends Pharmacol. Sci.,

18(11), 430Ŕ437, 1997.

Wilson, S., Bergsma, D. J., Chambers, J. K., Muir, A. I., Fantom, K. G., Ellis, C.,

Murdock, P. R., Herrity, N. C., and Stadel, J. M., Orphan G-protein-

coupled receptors: the next generation of drug targets?, Br. J. Pharmacol.,

125(7), 1387Ŕ1392, 1998.

Family B and C 7TM receptors

Bockaert, J. and Pin, J. P., Molecular tinkering of G-protein-coupled receptors: an

evolutionary success, EMBO J., 18(7), 1723Ŕ1729, 1999.

7TM receptor dimerization

Bouvier, M., Oligomerization of G-protein-coupled transmitter receptors, Nat. Rev.

Neurosci., 2(4), 274Ŕ286, 2001.

Milligan, G., Oligomerisation of G-protein-coupled receptors, J. Cell. Sci., 114(pt. 7),

1265Ŕ1271, 2001.

7TM receptors in equilibrium between active and inactive conformations

Elling, C. E., Thirstrup, K., Holst, B., and Schwartz, T. W., Conversion of agonist site

to metal-ion chelator site in the beta(2)-adrenergic receptor, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 96(22), 12322Ŕ12327, 1999.

Gether, U., Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-

coupled receptors, Endocr. Rev., 21(1), 90Ŕ113, 2000.

Gether, U. and Kobilka, B. K., G-protein-coupled receptors. II. Mechanism of agonist

activation, J. Biol. Chem., 273(29), 17979Ŕ17982, 1998.

Kenakin T., Inverse, protean, and ligand-selective agonism: matters of receptor

conformation, FASEB J., 15(3), 598Ŕ611, 2001.

Lefkowitz, R. J., Cotecchia, S., Samama, P. S., and Costa, T., Constitutive activity of

receptors coupled to guanine nucleotide regulatory proteins, Trends

Pharmacol. Sci., 14, 303Ŕ307, 1993.

Ligand binding in 7TM receptors

Elling, C. E., Nielsen, S. M., and Schwartz, T. W., Conversion of antagonist-binding

site to metal-ion site in the tachykinin Nk-1 receptor, Nature, 374(2), 74Ŕ

77, 1995.

Kunishima, N., Shimada, Y., Tsuji, Y., Sato, T., Yamamoto, M., Kumasaka, T.,

Nakanishi, S., Jingami, H., and Morikawa, K., Structural basis of

glutamate recognition by a dimeric metabotropic glutamate receptor,

Nature, 407(6807), 971Ŕ977, 2000.

Schwartz, T. W., Locating ligand-binding sites in 7TM receptors by protein

engineering, Curr. Opin. Biotechnol., 5, 434Ŕ444, 1994.

Schwartz, T. W. and Rosenkilde, M. M., Is there a Ŗlockŗ for all Ŗkeysŗ in 7TM

receptors?, Trends Pharmacol. Sci., 17, 213Ŕ216, 1996.

Strader, C. D., Gaffney, T., Sugg, E. E., Candelore, M. R., Keys, R., Patchett, A. A.,

and Dixon, R. A. F., Allele-specific activation of genetically engineered

receptors, J. Biol. Chem., 266, 5Ŕ8, 1991.

7TM scaffolding and adaptor proteins

Milligan, G. and White, J. H., ProteinŔprotein interactions at G-protein-coupled

receptors, Trends Pharmacol. Sci., 22(10), 513Ŕ518, 2001.

Xiao, B., Tu, J. C., and Worley, P. F., Homer: a link between neural activity and

glutamate receptor function, Curr. Opin. Neurobiol., 10(3), 370Ŕ374,

2000.

7TM receptor desensitization

Ferguson, S. S., Evolving concepts in G-protein-coupled receptor endocytosis: the

role in receptor desensitization and signaling, Pharmacol. Rev., 53(1), 1Ŕ

24, 2001.

Krupnick, J. G. and Benovic, J. L., The role of receptor kinases and arrestins in G-

protein-coupled receptor regulation, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 38,

289Ŕ319, 1998.

Pierce, K. L., Lefkowitz, R. J., and Lefkowitz, R. J., Classical and new roles of beta-

arrestin in the regulation of G-protein-coupled receptors, Nat. Rev.

Neurosci., 2(10), 727Ŕ733, 2001.

3 Struktur Ligan-gated

Ion Saluran

Jan Egebjerg

ISI

3.2 Reseptor 4TM .................................................... ..........................................

112

3.2.1 Kloning Molekuler .......................................... ......................................... 112

3.2.2 Tiga-Dimensi Struktur ........................................................ ..................... 114

3.2.3 Lubang pori .................................................. ............................................ 115

3.2.4 Ligan-Binding Site .............................................. ..................................... 118

3.3 rangsang Reseptor Amino-Asam: 3TM Reseptor ........................................ 119

3.3.1 Kloning Molekuler ............................................. ...................................... 120

3.3.1.1 AMPA Reseptor ............................................. ....................................... 120

3.3.1.2 Reseptor kainate ............................................. ....................................... 122

3.3.1.3 NMDA Reseptor ............................................. ...................................... 122

3.3.1.4 Reseptor Orphan ............................................. ...................................... 124

3.3.2 Reseptor Topologi ............................................. .......................................

124

3.3.3 Ekstraseluler Bagian Reseptor: The Agonist Binding Site ....................... 124

3.3.4 Modifikasi posttranscripsional ............................................... .................. 125

3.3.5 Pori Region ............................................ .................................................. 126

3.3.6 intraselular Site of Reseptor ini .......................................... ............... 126

3.4 ATP Reseptor: 2TM Reseptor .............................................. .......................

127

3.5 Masalah

3.6 Bacaan lebih lanjut ........................................ ..............................................

129

3.7 Solusi untuk Masalah ............................................. ..................................... 129

3.1 PENDAHULUAN

Saluran ion ligand-gated merupakan glikoprotein integral yang melintang

membran sel. Semua molekuler ditandai saluran ion ligand-gated adalah kompleks

multisubunit. Saluran ion ligand-gated umumnya ada di salah satu dari tiga negara

fungsional: istirahat (atau tertutup), terbuka, atau peka. Setiap negara fungsional

mungkin mencerminkan banyak negara konformasi diskrit dengan sifat farmakologi

yang berbeda. Reseptor dalam keadaan istirahat, berdasarkan atas permohonan dari

agonis, akan mengalami transisi cepat untuk keadaan terbuka, disebut Gating, dan

sebagian agonis juga akan mengalami transisi ke negara peka. Karena negara peka

sering menunjukkan afinitas agonis lebih tinggi dari keadaan terbuka, sebagian besar

reseptor akan berada dalam keadaan peka setelah terpapar agonis berkepanjangan.

Reseptor memiliki tiga sifat penting: (1) mereka aktif dalam menanggapi ligan

tertentu, (2) mereka melakukan ion melalui membran sel dinyatakan kedap air, dan

(3) mereka memilih di antara ion yang berbeda.

Kloning molekuler, dikombinasikan dengan berbagai teknik yang berbeda, telah

mengungkapkan keberadaan setidaknya tiga keluarga struktural berbeda saluran

ligand-gated. Keluarga-keluarga ini dapat diklasifikasikan sebagai reseptor empat

transmembran (4TM), reseptor asam amino rangsang (3TM), dan adenosin trifosfat

(ATP) reseptor (2TM). Reseptor ini merupakan kelas utama saluran ion ligand-gated

dalam membran plasma. Reseptor lain, seperti capsaicinactivated vallinoid reseptor

(6TM), yang tidak ada ligan endogen telah diidentifikasi, sedangkan intraseluler C2 +

diaktifkan ryanodine reseptor, dan inositol 1,4,5-trifosfat (IP3 α-diaktifkan reseptor,

juga ligan- gated saluran ion tetapi tidak akan dibahas dalam bab ini.

3.2 RESEPTOR 4TM

4TM keluarga reseptor terdiri dari reseptor asetilkolin nikotinat (nAChR),

serotonin reseptor (5HT3 α, glisin reseptor, dan reseptor asam b-aminobutyric

(GABAA dan GABAC). Yang nAChRs adalah reseptor rangsang utama dalam otot

rangka dan sistem saraf perifer vertebrata. Dalam sistem saraf pusat, nAChRs hadir

dalam jumlah yang jauh lebih kecil dari reseptor glutamat. 5HT3receptors juga kation

selektif tetapi terletak secara eksklusif pada neuron. Glisin dan GABA adalah

neurotransmitter penghambatan utama. GABA menonjol dalam korteks dan

cerebellum, sedangkan glisin yang paling melimpah di sumsum tulang belakang dan

batang otak. Kedua ligan mengaktifkan arus klorida. Sebagian besar agonis juga

mengaktifkan reseptor G-protein-coupled.

3.2.1 KLONING MOLEKULER

Reseptor 4TM yang pentameric kompleks terdiri dari subunit dari 420 ke

55amino asam. Subunit menunjukkan identitas urutan 25-75%, dengan distribusi

yang sama dari hidrofobik dan hidrofilik domain (Tabel 3.1). Hidrofilik 210-230

asam amino domain N-terminal diikuti oleh tiga berjarak dekat hidrofobik dan diduga

domain transmembran, maka intraseluler lingkaran variabel-panjang, dan akhirnya

sebuah daerah transmembran diduga keempat sesaat sebelum C-terminus (Gambar

3.1). Dari empat calon daerah transmembran, bukti menunjukkan bahwa TM2 bentuk

ana-helix, sementara daerah hidrofobik lainnya lebih cenderung dilipat sebagai β-

sheet. Kloning molekuler telah menghasilkan identifikasi nAChR subunit otot α1, β1,

y, , dan e dan α2 struktural terkait saraf untuk α10 dan β2 untuk β4. neuronal

nAChR subunit α2 α4 untuk dapat berkumpul dengan β2 atau β4 dan menghasilkan

reseptor heteromeric fungsional , yang merupakan 7 sampai dengan 9 subunit dapat

menghasilkan reseptor homomerik fungsional, dan α10 subunit hanya membentuk

saluran fungsional dalam kombinasi dengan α9 subunit. Para nAChRs saraf merakit

sesuai dengan stoikiometri umum α2 β3 dengan subunit β antara subunit α (Gambar

3.2). Jelas, sifat-sifat reseptor tergantung pada komposisi subunit. Sebuah proses

perakitan yang tidak dikontrol dalam sel mengekspresikan lebih dari dua subunit

yang berbeda akan menghasilkan jumlah yang sangat besar jenis reseptor yang

berbeda. Setidaknya dalam sel otot di mana empat subunit yang berbeda disajikan

pada saat yang sama, subunit dirakit di urutan memerintahkan untuk mencapai

stoikiometri yang benar dan hubungan lingkungan.

GAMBAR 3.1 representasi Schematic dari topologi transmembran dari keluarga

reseptor 4TM. Hanya TM2 menunjukkan struktur α-heliks dalam studi mikroskopis

elektron, daerah TM tersisa dapat melipat dalam struktur lembar-β. Kedua N-

terminus (ditandai dengan NH2) dan C-terminus berada ekstrasel. Loop sitoplasma

antara TM3 dan TM4 variabel dalam ukuran dan berisi situs fosforilasi diduga.

Empat glisin reseptor subunit telah diidentifikasi: tiga subunit α dan subunit β

satu. Ketika dinyatakan dalam sistem heterolog, reseptor α homomerik menghasilkan

saluran fungsional, dan strychnine dan picrotoxin menghambat arus. Sebuah analisis

yang lebih rinci telah mengungkapkan bahwa subunit β, mungkin di stoikiometri α3

β2, diperlukan untuk menghasilkan sifat saluran mirip dengan saluran dipelajari

dalam neuron sumsum tulang belakang dewasa, sedangkan reseptor glisin embrio

lebih seperti reseptor α homomerik.

GAMBAR 3.2 Skema representasi dari organisasi subunit yang paling melimpah

kompleks reseptor heteromeric: (a) embrio otot nikotinat nAChR otot AchR memiliki

stoikiometri (α1) 2 βγε (dewasa), (b) AchR nikotinat neuronal, (c) reseptor glisin, dan

(d) GABA A reseptor. Lingkaran menunjukkan lokasi dari situs agonis mengikat pada

antarmuka antara subunit di nAChR dan GABA A reseptor. Alun-alun menunjukkan

lokasi situs pengikatan benzodiazepine. digambarkan GABA A reseptor Model

adalah model umum dengan setidaknya satu GABA dan satu situs pengikatan

benzodiazepin. Jumlah situs mengikat berbeda pada GABA A reseptor tergantung

pada stoikiometri akhir kompleks pentameric.

Keragaman GABA A subunit (Gambar 3.2D) tercermin dalam farmakologi yang

sangat kompleks. Ekspresi subunit dalam sistem heterolog menunjukkan bahwa

kombinasi α, β, dan γ dapat menghasilkan reseptor fungsional, menunjukkan bahwa

pembatasan dalam kombinasi subunit didefinisikan oleh tingkat ekspresi dan

mekanisme perakitan sel-dependent kemungkinan besar juga. ρ1 untuk ρ3 subunit

terutama co-merakit satu sama lain untuk membentuk GABA C reseptor.

Reseptor GABA dapat dimodulasi, dengan cara subtipe-selektif, oleh sejumlah

agen yang baik meningkatkan arus (benzodiazepin, barbiturat) atau mengurangi arus

(bicuculline, β-carbolines, picrotoxin). Situs pengikatan GABA sangat dipengaruhi

oleh subunit β, tapi ekspresi gabungan dengan subunit α diperlukan untuk ekspresi

fungsional yang signifikan. Kompleksitas farmakologi benzodiazepine diilustrasikan

oleh pengamatan bahwa α / β reseptor heteromeric tidak potensial oleh

benzodiazepin. Hal ini mengejutkan, karena silang percobaan ditugaskan situs

pengikatan benzodiazepin dengan subunit α. Hanya co-ekspresi subunit α dan β

dengan subunit γ menghasilkan reseptor yang potensial oleh benzodiazepin. Dengan

demikian, farmakologi benzodiazepin tergantung pada subunit α, tetapi dalam rangka

untuk memiliki implikasi fungsional, kompleks reseptor juga harus mengandung

subunit γ. Mayoritas reseptor GABAA mengandung α, β, dan subunit γ dengan situs

mengikat GABA dan benzodiazepin pada α-β dan α-γ interface, masing-masing.

Farmakologi reseptor akan tergantung tidak hanya pada tiga subunit tetapi juga pada

sisa dua subunit.

Kontribusi dari subtipe reseptor yang berbeda dalam aktivitas neuronal

merupakan masalah sangat kompleks. Kemajuan terbaru dalam genetika tikus telah

memberikan metode untuk menggunakan informasi rinci diperoleh oleh studi dari

reseptor rekombinan dalam sistem heterolog. Sebuah contoh yang elegan telah

penjelasan kontribusi dari berbagai GABAA α subunit pada spektrum yang luas dari

tindakan ditimbulkan oleh benzodiazepin klinis digunakan. Seperti disebutkan,

benzodiazepin mengikat pada antarmuka antara α dan subunit γ, tetapi benzodiazepin

dikenal menunjukkan selektivitas rendah di antara α1, α2, α3, dan α5 subunit. Studi

molekuler telah menunjukkan bahwa substitusi histidin-to-arginin dalam subunit α

menghapuskan interaksi benzodiazepine. Mengganti bagian dari gen pengkodean α1

subunit dengan-Nya-to-Arg mutan pada tikus menghasilkan tikus yang efek

benzodiazepine pada reseptor α1 mengandung dihilangkan. Pada tikus mutan, efek

dikenal benzodiazepin seperti myorelaxasi, gangguan motorik, anxiolysis, dan etanol

potensiasi tetap, sedangkan efek benzodiazepin lainnya seperti sedasi dan amnesia

tidak diinduksi, menunjukkan bahwa reseptor α1 mengandung berkontribusi terhadap

perilaku ini.

3.2.2 STRUKTUR TIGA DIMENSI

Para nAChRs otot rangka dan organ listrik ikan adalah yang terbaik ditandai

saluran ion ligandgated 4TM. Reseptor adalah kompleks kDa 290 terdiri dari empat

subunit yang berbeda dirakit menjadi heterolog (α1) 2β1γδ pentameric kompleks.

Dalam otot rangka, γ subunit embrio digantikan oleh subunit ε dalam jaringan

dewasa. Dalam mikrograf elektron dari situs sinaptik, dilihat tegak lurus terhadap

bidang membran, kompleks reseptor, dalam keadaan istirahat, muncul sebagai

partikel cincin seperti dengan diameter luar 80 Å dan ban dalam 20 sampai 25 Å.

Dilihat dari sisi (Gambar 3.3), reseptor tampak seperti silinder 125-Å-panjang

menonjol 60 Å ke celah sinaptik dan 20 Å ke dalam sitoplasma, dengan kepadatan

persegi seperti terletak di bawah ruang depan cytoplasmatic. Kation-budidayanya

jalur terdiri dari tiga bagian. Di bagian sinaptik, membentuk sebuah tabung berisi air

20 Å dan diameter 60 Å panjang. Bagian berikutnya, melintasi membran, dibentuk

oleh daerah lebih terbatas sekitar 30 Å panjang (pori-pori). Dekat tengah membran,

jalur menjadi terbatas di daerah di mana jalur tersebut akan diblokir bila saluran

ditutup (pintu gerbang). sitoplasma bagian dari jalur membentuk silinder 20 Å dan

diameter 20 Å panjang. Tutup pemeriksaan mikrograf elektron menunjukkan bahwa

masing-masing subunit memiliki heliks-α seperti segmen lapisan pori-pori. Segmen

ini terdiri dari dua heliks α dipisahkan oleh suatu ketegaran di sekitar titik tengah

menunjuk ke pori-pori (dalam keadaan istirahat), memberi pori-pori yang "jam pasir"

bentuk dengan ketegaran terletak pada titik yang paling terbatas. Ketika reseptor

diaktifkan oleh asetilkolin, masing-masing segmen heliks berputar, membuka pintu

gerbang. Dalam keadaan terbuka, pori-pori menyempit dari luar ke situs sitoplasma,

di mana diameter kira-kira 11 Å. Dengan demikian, lentur antara dua α heliks

memberikan cara yang efektif untuk mengubah bentuk dan ukuran pori-pori (Gambar

3.4)

GAMBAR 3.3 (a) Model reseptor 4TM. Model ini menunjukkan situs ligan

mengikat, bilayer membran, dan posisi saluran gerbang. (B) Elektron kepadatan peta

dari nAChR dalam profil sebesar 4,6 Data Å. Kerapatan elektron ditunjukkan melalui

penampang sebuah subunit α dan antarmuka antara subunit α lain dan subunit δ.

Asterisk menunjukkan situs pengikatan Ach diusulkan. (C) Model dari AchR

menunjukkan: (1) bahwa Ach memasuki ruang depan ekstraseluler sebelum mengikat

ke situs mengikat, (2) yang memasuki kation akan melewati vestibulum ekstraseluler,

pori-pori, dan pada situs sitoplasma akan disaring melalui pembukaan bermuatan

negatif dalam reseptor (courtesy of N. Unwin).

GAMBAR 3.4 orientasi TM2 heliks segmen di negara tertutup dan terbuka dari

saluran. Di sebelah kiri adalah pandangan dari dua dari lima heliks dari sisi, di mana

segmen heliks digambarkan sebagai dua heliks (batang) yang dipisahkan oleh

ketegaran mana leusin (elips) terletak. Di sebelah kanan, lima heliks dipandang dari

sisi sinaptik, di mana leucines akan memblokir pori-pori. Pengikatan agonis

menyebabkan segmen heliks memutar, dan wilayah tersempit kemudian dalam

keadaan terbuka di bagian sitoplasma dari pori-pori.

3.2.3 PORI RESEPTOR

Kemampuan saluran reseptor untuk melakukan ion, yang diukur sebagai

konduktansi (kebalikan dari resistansi) saluran, tergantung pada TM2. Percobaan

yang menunjukkan hal ini didasarkan pada pengamatan bahwa reseptor yang terbuat

dari Torpedo α, β, γ, dan subunit δ memiliki konduktansi yang berbeda dari reseptor

yang terbuat dari Torpedo α, β, γ, dan subunit δ betis. Ketika subunit δ chimeric di

bagian mana dari urutan Torpedo digantikan oleh urutan betis yang sesuai, yang

diekspresikan bersama dengan Torpedo α, β, dan γ subunit, itu menunjukkan bahwa

perbedaan keseluruhan dalam konduktansi dapat dikaitkan dengan wilayah TM2 .

Struktur wilayah TM2 jelas bukan α helix yang sempurna, namun asumsi

distribusi pentameric simetris α heliks memberi kita sebuah model struktural yang

berguna untuk menggambarkan lingkungan molekuler melalui mana ion harus lulus

ketika menyerap saluran reseptor. Karena distribusi simetris di sekitar pori-pori, asam

amino ditugaskan untuk posisi yang sama dalam keberpihakan urutan akan

membentuk cincin dalam model tiga dimensi (Gambar 3.5).

Petunjuk penting tentang bagaimana pori-pori diatur struktural diperoleh

dengan memeriksa distribusi dari residu diisi dan bermuatan dalam subunit nAChR

Torpedo. Seperti yang diharapkan untuk segmen hidrofobik, TM2 beruang tidak ada

residu dibebankan, namun, sejumlah residu bermuatan dan kutub yang terletak di

kedua ujung TM2 (Gambar 3.5). Menurut model 4TM, residu dibebankan dalam loop

TM1-TM2 akan berlokasi di pintu masuk ke pori-pori dari sisi cytoplasmatic,

sedangkan residu dibebankan dalam TM2-TM3 loop terletak di pintu masuk pori dari

sisi ekstraseluler. Karena nAChR melakukan kation, cincin bermuatan negatif

diharapkan untuk berbaris saluran dan menarik kation permeant ke pori-pori.

Memang, ketika jumlah dibebankan asam amino dalam cincin menengah berkurang

dari empat tuduhan negatif pada reseptor Torpedo asli, penurunan yang jelas dalam

konduktansi saluran diamati. Mutasi yang mengubah muatan dari cincin dalam dan

luar juga mengubah konduktansi tetapi pada tingkat yang jauh lebih rendah. Dengan

demikian, residu ini harus terkena lumen pori-pori, meskipun percobaan tambahan

menunjukkan bahwa cincin dalam dan luar lebih terlibat dalam mengatur akses kation

ke saluran daripada berada dalam kontak langsung dengan ion menyerap. Efek

optimal dari cincin bermuatan negatif pada saat ini adalah keseimbangan halus antara

menarik ion monovalen dan meningkatkan arus, di satu sisi, dan, di sisi lain, menarik

ion divalen yang mengikat residu dalam cincin dibebankan dengan tinggi afinitas,

sehingga mengurangi arus. Efek menangkal mungkin menjelaskan mengapa beberapa

subunit nAChR fungsional menyandikan asam amino bermuatan positif di posisi

cincin.

GAMBAR 3.5 Pengaturan TM2 urutan asam amino . Nomenklatur cincin

didasarkan pada urutan α7. Selektivitas menunjukkan muatan ion permeant. Mut1 dan

Mut2 adalah mutan situs-diarahkan (ditandai dengan tanda bintang) dari α7 subunit

(lihat teks).

Dalam GABA dan reseptor glisin, dimana ion permeant bermuatan negatif,

cincin bagian dalam tetap bermuatan negatif, dan luar adalah baik negatif atau netral.

Pertanyaannya, kemudian, adalah apa yang menentukan selektivitas ion saluran?

Sebuah keselarasan wilayah TM2 antara nAChR α7 subunit dan glisin dan GABA

subunit menunjukkan perbedaan asam amino di lima posisi yang melapisi pori, di

samping itu, asam amino tambahan hadir di ujung N-terminal dari segmen TM2 di

saluran anion-selektif (Gambar 3.5). Studi menunjukkan bahwa mutagenesis

substitusi asam amino yang melapisi pori-pori tidak mempengaruhi selektivitas

kation α7 nAChR (Gambar 3.5, Mut1), namun penyisipan prolin menjadi Mut1 di N-

terminus TM-II, seperti untuk GABA reseptor, mengubah saluran menjadi anion

selektif. Dengan demikian, pori-pori bisa ditembus untuk kedua kation dan anion,

akibatnya, selektivitas ion tidak terkait langsung dengan urutan asam amino dalam

pori-pori. Sedikit perubahan dalam posisi TM2 atau asam amino sekitarnya, namun,

tampaknya menentukan selektivitas ion.

Adalah penting bahwa kesimpulan berdasarkan studi mutagenesis sudah

dikonfirmasi oleh eksperimen lain, karena mutasi yang melibatkan residu di posisi

kunci untuk struktur atau fungsi mungkin memiliki efek tidak hanya sebagai akibat

dari perubahan di lokasi substitusi tetapi juga sebagai akibat dari nonlocalized

gangguan struktural dibuat untuk mengakomodasi perubahan itu. Bahkan, sebagian

besar residu menghadap lumen pori-pori juga diidentifikasi dalam label percobaan

menggunakan antagonis kompetitif dikenal untuk mengikat di pori-pori. Ketika

antagonis nonkompetitif [3H] klorpromazin itu photolabeled ke reseptor, asam amino

cross-linked yang terletak di serin, treonin, leusin dan cincin (Gambar 3.5). Bukti

untuk perubahan struktural dalam pori-pori diperoleh oleh antagonis trifluorometil-

iodophenyldiazirine yang, tanpa adanya agonis, cross-linked untuk asam amino setara

dengan valin dan cincin leusin. Namun, dengan adanya agonis, pola pelabelan meluas

ke treonin dan cincin serin, menunjukkan bahwa valin pusat, leusin, treonin dan

cincin mungkin sesuai dengan wilayah terbatas diamati dalam mikrograf elektron.

Leusin ini disarankan untuk menjadi gerbang pembentuk residu menunjuk ke pori-

pori dari ketegaran di TM-II. Hal ini didukung oleh studi mutagenesis, yang

menunjukkan bahwa substitusi leusin dengan asam amino yang lebih kecil

mempengaruhi kemampuan reseptor untuk menutup di negara peka.

3.2.4 TEMPAT IKATAN LIGAN

Untuk mempelajari sifat dari situs mengikat, penting untuk diingat bahwa

reseptor yang ada di sejumlah konformasi yang mungkin menunjukkan sifat mengikat

yang berbeda. Seperti disebutkan, afinitas untuk ligan dalam keadaan terbuka

biasanya jauh lebih rendah (10 - sampai 1000 kali lipat) dibandingkan dengan afinitas

untuk negara peka. Dengan demikian, dalam percobaan biokimia di mana reseptor

terkena ligan untuk jangka waktu yang lama, interaksi agonis reseptor akan

mencerminkan konformasi reseptor negara peka, sedangkan interaksi antagonis

mungkin mencerminkan konformasi baik keadaan istirahat atau negara peka.

Sebaliknya, evaluasi elektrofisiologi interaksi agonis mencerminkan konformasi-

afinitas rendah mengikat keadaan terbuka kecuali untuk mutan tertentu. Sebagai

contoh, dalam studi mutan α7 subunit yang cincin leusin (di pintu gerbang)

digantikan untuk asam amino yang lebih kecil, potensi untuk Ach diukur dalam

rekaman elektrofisiologi meningkat 150 kali lipat. Data bisa ditafsirkan sebagai leusin

mengganggu langsung dengan pengikatan Ach, namun single-channel konduktansi

negara diaktifkan pada konsentrasi rendah Ach berbeda dari negara-negara diaktifkan

pada konsentrasi yang lebih tinggi. Penjelasan alternatif adalah bahwa mutasi leusin

di gerbang tidak dapat menutup di salah satu konformasi di negara peka, yang

mengikat ACh dengan afinitas tinggi.

Wawasan ke dalam struktur tiga dimensi dari situs agonis pengikatan reseptor

4TM telah diperoleh dari perbandingan dengan struktur kristal protein asetilkolin

mengikat larut (AChBP) ditemukan di siput Lymnaea stagnalis. AChBP pameran

identitas urutan tertinggi dengan domain N-terminal nAChR α7 subunit (24%). Jelas,

perbandingan antara protein dengan identitas urutan rendah harus diperlakukan

dengan hati-hati. Namun, residu yang tersimpan antara anggota dari superfamili 4TM

yang hampir semua kekal dalam AChBP, dan sejumlah agonis dan antagonis

kompetitif juga mengikat AChBP, menunjukkan bahwa struktur keseluruhan

mungkin mirip. Pemeriksaan struktur tiga dimensi mendukung kesamaan struktural

(lihat di bawah).

Asetilkolin protein pengikat mengkristal sebagai kompleks pentameric, dengan

dimensi yang mirip dengan bagian ekstraseluler reseptor nicotinic (Gambar 3.6).

Subunit membentuk cincin, sehingga menghasilkan pori hidrofilik pusat, diamati

sebagai ruang depan ekstraseluler dalam studi mikroskopis elektron. Bagian tengah

dari masing-masing subunit dibentuk oleh sepuluh β-lembar, membentuk β-roti

(Gambar 3.6). Lima situs ikatan-ligand dalam kompleks pentameric yang terletak di

antara subunit, di mana lingkaran daerah, antara β-helai, bentuk satu sisi antarmuka

mengikat. Residu dari subunit garis berdekatan bagian lain dari situs mengikat, yang

terletak baik di daerah lingkaran dan di β-sheet. Semua residu yang terlibat dalam

mengikat ligan juga telah diidentifikasi dalam mutagenesis atau cross-linking

percobaan pada nAChR tersebut. Terlepas dari satu residu, semua residu ligan-

berinteraksi potensial tersimpan antara nAChR, namun, seperti yang diharapkan,

residu ini variabel antara kelas farmakologis yang berbeda dalam superfamili 4TM.

Pembentukan situs ligan mengikat pada antarmuka antara subunit yang berdekatan

memberikan penjelasan sederhana untuk keragaman farmakologis diamati pada

reseptor terbentuk dari subunit yang berbeda. Menariknya, residu tersimpan, yang

sebagian besar adalah hidrofobik, yang terlibat dalam mempertahankan struktur

keseluruhan dari subunit, lebih lanjut mendukung struktur tiga dimensi yang sama

dengan anggota dari superfamili 4TM.

GAMBAR 3.6 Struktur kristal protein asetilkolin-ikatan (AChBP). (A)

Kompleks, seperti yang terlihat dalam pori-pori yang dibentuk oleh subunit.

Kompleks ini terdiri dari lima subunit identik. Salah satu subunit disorot (seperti yang

ditunjukkan dalam insert), dan panah menunjukkan situs pengikatan agonis. (B) Lihat

dari agonis mengikat yang diusulkan dari situs pori (sepanjang panah di A). Struktur

ini karena kondisi kristalisasi, dikristalisasi dengan HEPES di situs pengikatan.

Ach rongga mengikat terletak sekitar 30 Å atas membran. Hal ini masih belum

jelas bagaimana pengikatan agonis mungkin mengaktifkan reseptor. Setidaknya dua

model yang berbeda telah diusulkan: (1) mengikat agonis mempromosikan sebuah

"intersubunit geser," di mana posisi relatif dari subunit perubahan, dan (2) perubahan

agonis-induced terjadi dalam subunit (intrasubunit), mungkin sebagai gangguan dari

loop antara β-lembar, yang mungkin dikirim langsung ke daerah pori atau tidak

langsung melalui perubahan di daerah-lembar β. Saat ini, bukti-bukti tidak cukup

untuk memutuskan antara ini atau model tambahan, namun subunit reseptor chimeric

yang berisi situs pengikatan agonis dari subunit 5HT3 dan daerah pori dari nAChR α7

subunit dapat diaktifkan dengan 5HT. Ini mendukung gagasan bahwa keseluruhan

struktur dan perubahan konformasi selama aktivasi anggota dari superfamili 4TM

sangat tersimpan. Selain itu, setiap subunit reseptor dapat dibayangkan sebagai

protein dua domain, dengan situs pengikatan agonis N-terminal dan daerah pori C-

terminal.

3.3 RANGSANGAN RESEPTOR ASAM AMINO: RESEPTOR 3TM

L-Glutamat bertindak sebagai neurotransmitter rangsang di banyak sinapsis

dalam sistem saraf pusat mamalia. Pengukuran elektrofisiologi dan penggunaan

berbagai agonis selektif dan antagonis menunjukkan bahwa reseptor glutamat yang

berbeda hidup berdampingan pada banyak neuron.

Eksogen agonis N-methyl-D-aspartate (NMDA) mengaktifkan reseptor yang

ditandai dengan kinetika lambat dan tinggi Ca2 + permeabilitas (lihat Gambar 3.8).

Selain glutamat (atau NMDA), reseptor ini memerlukan glisin sebagai agonis co.

Arus yang dilakukan oleh reseptor NMDA yang diblokir oleh ekstraseluler Mg2 +

dalam mode tegangan-dependent (Gambar 3.7). Pada membran istirahat potensial (-

70 mV), aktivasi saluran akan menghasilkan hanya dalam arus rendah karena

masuknya Mg2 + ion ke saluran akan memblokir arus. Afinitas untuk ion Mg2 + akan

menurun pada potensial membran negatif kurang sebagai pendorong listrik untuk

Mg2 + berkurang dan blok menjadi tidak efektif (Gambar 3.7).

Kelas lain dari reseptor glutamat ionotropic menunjukkan kinetika cepat dan,

dalam banyak neuron, sebuah Ca2 + rendah permeabilitas ketika diaktifkan oleh

glutamat. Selektif agonis α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoxazole propionat (AMPA)

mengaktifkan cepat desensitizing saat ini, seperti halnya glutamat, di sebagian besar

reseptor. Akibatnya, subtipe ini disebut sebagai reseptor AMPA. Kainate

mengaktifkan arus nondesensitizing bila diterapkan pada reseptor AMPA, tetapi

mengaktifkan arus fastdesensitizing pada jenis reseptor lain, reseptor kainate. Jenis

reseptor glutamat mengikat kainate dengan afinitas tinggi (Gambar 3.8). Selain tiga

kelompok reseptor ionotropic, glutamat juga mengaktifkan reseptor G-protein-

coupled disebut reseptor glutamat metabotropic.

Reseptor AMPA memediasi mayoritas neurotransmisi rangsang cepat dalam otak

mamalia. Kinetika cepat dan permeabilitas Ca rendah membuat reseptor ini ideal

untuk neurotransmisi cepat tanpa perubahan yang cukup dalam konsentrasi kalsium

intraseluler untuk mengaktifkan proses Ca2 +-tergantung. Reseptor NMDA adalah

co-dilokalisasi dengan reseptor AMPA pada banyak sinapsis, tetapi kinetika lambat

dari reseptor NMDA meminimalkan aktivasi reseptor glutamat setelah rilis

presynaptic tunggal di mana neuron cepat repolarizes, sehingga Mg2 + blok reseptor

NMDA. Namun, reseptor NMDA akan sepenuhnya diaktifkan setelah stimulasi luas

sinaps ketika aktivasi berulang reseptor AMPA membangkitkan depolarisasi cukup

membran postsynaptic untuk meringankan reseptor NMDA dari Mg2 + blok.

Penggunaan tergantung Ca2 + masuknya ini telah ditafsirkan menjadi salah satu

mekanisme yang mendasari untuk banyak proses saraf yang berbeda, termasuk

belajar dan memori.

GAMBAR 3.7 Hubungan Lancar-tegangan untuk N-methyl-D-aspartate (NMDA)

dan reseptor glutamat non-NMDA. (A) hubungan Lancar-tegangan dari reseptor

NMDA direkam di hadapan Mg2 +. Arus yang melalui saluran menjadi semakin kecil

pada potensial membran negatif akibat Mg2 + blok. (B) Ekspresi AMPA dan subunit

reseptor kainate menghasilkan baik linear (tipe I) atau (tipe II) hubungan arus-

tegangan dalam hati perbaikan, tergantung pada komposisi subunit reseptor. Jika

reseptor mengandung subunit diedit di Q / R situs (yaitu, GluR2 untuk reseptor

AMPA, GluR5R atau GluR6R untuk reseptor kainate), hubungan arus-tegangan

adalah linear. Reseptor terbuat dari subunit diedit sendiri atau dalam kombinasi

dengan satu sama lain dalam hati pameran perbaikan hubungan arus-tegangan.

3.3.1 KLONING MOLEKULER

Tujuh belas gen penyandi subunit reseptor glutamat telah diidentifikasi (Tabel

3.2). Ini subunit didasarkan pada identitas urutan dikelompokkan menjadi tujuh kelas

yang berbeda. Semua subunit memiliki profil serupa di plot hidrofobik dan mungkin

topologi yang sama dengan 400 - 500 - asam amino ekstraseluler N-terminal bagian

diikuti oleh wilayah 400-asam amino pengkodean domain transmembran (Gambar

3.9). C-terminus adalah intraseluler dan bervariasi dalam ukuran 50-750 asam amino.

reseptor glutamat subunit pameran, berbeda dengan reseptor 4TM, urutan variabilitas

tertinggi antara subunit pada daerah N-terminal, sedangkan domain transmembran

sangat kekal.

Masih belum bukti kuat pada stoikiometri dari kompleks reseptor. Berbagai

pendekatan telah ditunjukkan baik struktur pentameric atau tetrameric, namun data

yang lebih baru mendukung konfigurasi tetrameric (Gambar 3.10d), dan beberapa

bukti menunjukkan bahwa reseptor dapat diselenggarakan sebagai dua pasang.

3.3.1.1 Reseptor AMPA

GluR1 ke GluR4 subunit (juga bernama GluRA-GluRD) co-merakit satu

dengan yang lain tapi tidak dengan subunit dari kelas-kelas lain. Profil fungsional

reseptor kloning menunjukkan respon desensitizing ke AMPA, atau glutamat, tapi

respon nondesensitizing untuk kainate (EC50> 30 M), fitur mirip dengan penelitian

reseptor AMPA dari otak. Afinitas untuk AMPA dalam percobaan yang mengikat

juga menyerupai afinitas diamati dalam jaringan otak.

GAMBAR 3.8 kainate dan AMPA mengaktifkan respon saat yang berbeda dalam

kelas yang berbeda dan reseptor AMPA kainate: (a) reseptor AMPA, GluR1, (b) dan

(c) kainate reseptor, (d) glutamat + glisin aktivasi reseptor NMDA. Respon saat ini

ditandai dengan onset lambat dan mengimbangi dibandingkan dengan kainate dan

reseptor AMPA.

GAMBAR 3.9 (a) Diagram menunjukkan daerah reseptor glutamat yang

menunjukkan homologi urutan ke bakteri peri-plasma 2 protein yang mengikat asam

amino. (B) Skema representasi dari topologi transmembran dari reseptor asam amino

rangsang. Daerah ekstraseluler gelap menunjukkan dua lobus membentuk situs

pengikatan agonis. Daerah gelap mewakili elemen alternatif disambung (sandal /

kegagalan) di kelas reseptor AMPA. Situs diedit ditandai dengan kotak.

3.3.1.2 Reseptor kainate

Reseptor kainate terdiri dari subunit dari GluR5-GluR7 kelas dan kelas KA1-

KA2 subunit. Reseptor homomerik dari mantan kelas menghasilkan reseptor

fungsional dan mengikat kainate dengan afinitas dari 50 sampai 100 nM. KA1 atau

KA2 tidak menghasilkan saluran fungsional, tetapi reseptor mengikat kainate dengan

afinitas dari 5 sampai 10 nM. Homomerik GluR6 dan KA2 reseptor tidak diaktifkan

oleh AMPA, juga tidak mengikat AMPA. Menariknya, ketika mereka diekspresikan

bersama, reseptor AMPA heteromeric menanggapi.

3.3.1.3 Reseptor NMDA

Fungsional kompleks reseptor NMDA mengandung setidaknya satu NR1 dan

satu subunit NR2. Komposisi heteromeric menuntut dua agonis untuk aktivasi karena

glisin mengikat ke subunit NR1 dan glutamat mengikat subunit NR2. Subunit NR2

memiliki struktur dasar yang sama dengan subunit glutamat lain, kecuali untuk 400

besar - untuk domain C-terminal 630-asam amino. Banyak reseptor fitur seperti Mg2

+ blok, glisin sensitivitas, kinetika penonaktifan, dan konduktansi single-channel

berbeda, tergantung pada subunit NR2 co-merakit dengan NR1.

GAMBAR 3.10 (a) Skema ilustrasi dari model yang diusulkan untuk aktivasi

subunit. Mengikat agonis menstabilkan konformasi tertutup lobus dalam domain

mengikat. (B) Struktur co-kristal kainate dan bentuk yang larut dari domain ligan

mengikat GluR2. Backbone akan ditampilkan di "pita" format, dan residu dari asam

amino berinteraksi dengan kainate yang akan ditampilkan. (C) Ilustrasi agonis

menjembatani antara lobus. Arg485, Thr480, Pro478, dan Thr480 terletak di lobus A,

sedangkan Glu705, Ser654, dan Thr655 terletak di lobus B. (d) Model untuk aktivasi

reseptor. Aktivasi reseptor diusulkan untuk meminta aktivasi dari dua subunit, dan

aktivasi lebih subunit membuka saluran untuk tingkat konduktansi tinggi.

3.3.1.4 Reseptor Orphan

Dua subunit tambahan, δ1 dan δ2, telah diidentifikasi. Berdasarkan kesamaan

urutan, mereka milik keluarga reseptor glutamat, meskipun mereka tidak dapat

diaktifkan oleh glutamat atau yang umum agonis reseptor glutamat. Setidaknya dua

baris bukti mendukung pentingnya fungsional saluran ini: (1) KO genetik dari δ2

hasil dalam gangguan fungsi sel Purkinje cerebellum, dan (2) lurcher mutan tikus,

yang menunjukkan atrofi cerebellum yang signifikan, adalah hasil dari mutasi pada

bagian ekstraseluler dari segmen transmembran yang kedua yang membuat reseptor

konstitutif aktif.

3.3.2 Topologi RESEPTOR

Hasil dari sejumlah studi biokimia dan mutagenesis mendukung topologi tiga

transmembran dari reseptor glutamat. Daerah antara pertama dan kedua daerah

transmembran membentuk loop ulang peserta, dengan kesamaan struktural yang

diusulkan untuk P-lingkaran yang ditemukan di saluran tegangan-gated. Namun, loop

memasuki membran dari sisi cytoplasmatic di reseptor glutamat, sementara itu

terletak di sisi ekstraseluler dari saluran tegangan-gated. Transmembran nomenklatur

dalam literatur didominasi oleh awalnya diusulkan topologi empat transmembran

(Gambar 3.9).

3.3.3 BAGIAN DARI RESEPTOR EXTRACELLULAR: Tempat Ikatan Agonis

Urutan perbandingan antara reseptor glutamat dan protein lain mengungkapkan

bahwa bagian Nterminal reseptor menunjukkan tingkat rendah kesamaan urutan ke

bakteri periplasmatic ikatan protein leucine-isoleusin-valin, sementara wilayah N-

terminal M1 (130 asam amino) dan wilayah antara M3 dan M4 menunjukkan

kesamaan urutan ke protein lain bakteri: mengikat protein lisin-arginin-ornithine

(Gambar 3.9). Kesamaan urutan dan kemiripan segmen M1-M3 dengan wilayah pori

saluran tegangan-gated menunjukkan bahwa reseptor glutamat mungkin telah

berevolusi sebagai chimera dari dua modul evolusioner kuno. Telah diusulkan bahwa

subunit reseptor mungkin telah berevolusi dari penyisipan gen pengkodean segmen

pori menjadi pengkodean gen mengikat protein periplasmatic. Identifikasi reseptor

glutamat bakteri kalium-selektif, GluR0, hanya berisi domain mengikat berpotongan

dengan wilayah pori, sangat mendukung teori evolusi.

Urutan kesamaan dengan larut protein mengikat periplasmatic dan sejumlah

reseptor chimeric terbentuk antara AMPA dan reseptor kainate menunjukkan bahwa

bentuk yang larut dari domain pengikatan bisa direkayasa dengan mengganti segmen

M1-M3 dengan linker hidrofilik dan dengan truncating N -bagian terminal dan M4

dan ekor C-terminal. Ketika diperiksa, protein ini dipamerkan karakteristik

farmakologis yang sama seperti reseptor, dan itu mungkin untuk cocrystallize domain

mengikat GluR2 dengan ligan yang berbeda.

Strukturnya sangat mirip dengan protein yang mengikat periplasmatic. Struktur

keseluruhan dari domain mengikat adalah dua wilayah (disebut lobus A dan B) di

mana agonis mengikat antara lobus. Dalam kondisi terikat (bentuk apo), lobus

dipisahkan. Pengikatan agonis menstabilkan penutupan domain, yang dapat

digambarkan sebagai rotasi domain relatif satu sama lain, di mana tingkat rotasi

tergantung pada agonis. Kainate menginduksi rotasi 8 derajat, sedangkan agonis

seperti glutamat AMPA dan menginduksi penutupan ketat yang dihasilkan dari rotasi

20 derajat. Menariknya, antagonis seperti DNQX juga menginduksi penutupan lobus

tetapi hanya dengan 3 derajat, ternyata tidak cukup untuk membuka pori-pori.

Kekuatan yang menstabilkan penutupan bisa, untuk kesederhanaan, dibagi menjadi

tiga kategori yang berbeda dari kontribusi. Pertama, glutamat seperti bagian

ditemukan di semua agonis membentuk jembatan antara lobus (Gambar 3.10), dan,

kedua, struktur unik dari agonis, seperti cincin pirolidin dan isopropenil di kainate

(Gambar 3.10c), berkontribusi untuk mengikat selektif baik dengan interaksi

langsung dengan domain mengikat atau dengan membatasi konformasi gugus

glutamat. Akhirnya, kedekatan lobus dalam bentuk tertutup mempromosikan interaksi

langsung antara lobus.

Residu yang terletak di saku mengikat agonis sangat tersimpan. Antagonis

kompetitif dan agonis memilih antara reseptor NMDA dan AMPA yang / reseptor

kainate telah diidentifikasi, di mana AP-V dan NBQX atau CNQX adalah NMDA

yang paling umum digunakan selektif dan AMPA / antagonis reseptor kainate,

masing-masing. Namun, tingkat tinggi konservasi di saku mengikat telah membuat

identifikasi antagonis kompetitif subtipe-selektif sangat sulit. Akibatnya, hampir

semua senyawa selektif dikenal bertindak melalui mekanisme kompetitif - misalnya,

AMPA reseptor-selektif GYKI-53.655, cyclothiazide, yang potentiates reseptor

AMPA dengan cara sambatan-varian-dependent, atau poliamina, yang blok AMPA

dan kainate reseptor tergantung pada kehadiran subunit diedit (lihat di bawah).

Sebuah pertanyaan penting adalah bagaimana perubahan dalam domain

mengikat agonis mungkin disebarkan ke daerah pori dan menyebabkan pembukaan

saluran. Pengetahuan kita sangat terbatas, dan belajar terisolasi domain ligandikatan

memiliki keterbatasan yang jelas, namun, ada beberapa korelasi yang mencolok

antara tingkat penutupan dan modus aktivasi. Kainate, yang menginduksi penutupan

kecil, mengaktifkan arus nondesensitizing, sementara AMPA mengaktifkan lebih

besar tapi sementara saat sebelum masuk ke dalam keadaan peka (Gambar 3.8). Hal

ini telah mendorong hipotesis bahwa domain mengikat sebagian ditutup akan

menimbulkan pembukaan penuh saluran sementara domain mengikat tertutup (20

derajat memutar) akan menghasilkan keadaan peka. Menurut model ini, pembukaan

singkat yang disebabkan oleh AMPA atau glutamat mencerminkan transisi molekul

cepat dari konformasi terbuka negara mengikat bentuk tertutup rapat. Model alternatif

mengusulkan bahwa pembukaan saluran (konduktansi) meningkat sebagai domain

mengikat menutup, dan desensitisasi adalah hasil penyusunan ulang struktural antara

subunit. Hipotesis terakhir ini didukung oleh mutasi tunggal (L507Y di GluR3), yang

benar-benar menghapuskan desensitisasi. Dalam mutan ini, arus maksimal yang

ditimbulkan oleh glutamat atau AMPA adalah tiga besar daripada arus kainate-

induced. Dalam struktur kristal, L507 terletak pada antarmuka antara subunit. Selain

itu, aksi senyawa yang mengurangi tingkat desensitisasi, seperti cyclothiazide,

dipengaruhi oleh mutasi pada antarmuka subunit. Perlu diingat, bagaimanapun,

bahwa kedekatan antara domain mengikat larut sangat rendah dalam larutan, berbeda

dengan AChBP tersebut. Oleh karena itu, antarmuka diamati dalam kristal mungkin

sedikit berbeda dari interaksi dalam reseptor.

Karena reseptor glutamat dapat membentuk reseptor homomerik, sebuah

pertanyaan yang jelas adalah berapa banyak subunit harus mengikat ligan untuk

mengaktifkan saluran? Studi pada chimera nondesensitizing telah menunjukkan

bahwa aktivasi reseptor membutuhkan pengikatan dua agonis. Menariknya,

pengikatan agonis tambahan mengakibatkan konduktansi meningkat, menunjukkan

bahwa masing-masing subunit dapat diaktifkan secara independen dan dengan

demikian mengubah pembukaan saluran (Gambar 3.10d). Dalam rangka

menyelesaikan negara konduktansi yang berbeda, percobaan telah dilakukan di

hadapan antagonis perlahan memisahkan. Studi lebih lanjut diperlukan untuk

mengevaluasi pentingnya negara subconductance dalam ketiadaan antagonis. Jika,

memang, subunit diaktifkan secara independen dan pengikatan agonis hasil yang

lebih dalam meningkatkan konduktansi, kurva dosis-respons harus ditafsirkan dengan

hati-hati (lihat Masalah).

Ukuran saat agonis-diaktifkan tidak semata-mata tergantung pada tingkat

penutupan domain, seperti, terutama untuk reseptor NMDA, sejumlah situs modulator

telah terletak di bagian N-terminal reseptor. Ion seng menghambat reseptor NR2A

mengandung, sementara sejumlah senyawa, seperti ifenprodil, selektif menghambat

reseptor NR2B mengandung. Sebuah varian sambatan di bagian N-terminal NR1

mempengaruhi pH dan spermidine-sensitivitas reseptor. Modus tindakan dari

inhibitor kompetitif tidak jelas, walaupun beberapa studi menunjukkan bahwa mereka

mungkin berbagi mekanisme umum.

3.3.4 MODIFIKASI Posttranscripsional

Salah satu bentuk penting dari peraturan dicapai dengan varian sambatan

menunjukkan perbedaan fungsional dan regulasi diferensial. Misalnya, segmen 38-

asam amino sebelumnya TM-IV hadir dalam salah satu dari dua bentuk disambung

alternatif (disebut "flip" atau "gagal") di GluR1-GluR4. Amplitudo saat ini lebih kecil

di reseptor gagal dibandingkan dengan reseptor sandal. Ini mungkin menjadi

mekanisme yang bisa memungkinkan neuron untuk beralih dari gain rendah versi

flop ke reseptor high gain lain, hanya dengan splicing alternatif transkrip.

Bentuk lain dari regulasi yang mengedit dari transkrip RNA. Ketika GluR1,

GluR3, atau GluR4 dinyatakan secara individual atau dalam kombinasi, hubungan

arus-tegangan menunjukkan bentuk hati meluruskan, dan saluran reseptor yang

permeabel terhadap Ca2 +. Namun, jika subunit GluR2 merupakan bagian dari

reseptor, hubungan arus-tegangan adalah linear, dan saluran tidak tembus Ca2 +.

Situs-directed mutagenesis menunjukkan bahwa sifat saluran ditentukan oleh

perbedaan asam amino tunggal dalam diduga M2. GluR2 mengkodekan arginin (R)

pada posisi itu, sedangkan reseptor AMPA subunit lainnya menyandikan glutamin

(Q), maka nama Q / R situs. Analisis urutan genom mengungkapkan bahwa GluR2,

seperti pada reseptor AMPA subunit lainnya, mengkode glutamin (kodon GAC),

tetapi cDNA mengkodekan arginin (GGC) pada posisi itu. A-to-G transisi dikatalisis

oleh enzim yang mengenali elemen struktur RNA dalam transkrip GluR2 dan

kemudian secara khusus deaminates adenosin ke inosin (yang setara dengan G).

Kehadiran subunit diedit di kompleks reseptor mencegah interaksi dengan channel

blockers seperti Joro laba-laba racun dan philantotoxins. Selain editing di Q / R di

situs M2, GluR6 suntingan di dua lokasi di M2 yang juga mempengaruhi

permeabilitas Ca2 +. Hal ini menunjukkan M1 yang mungkin berkontribusi terhadap

pori-pori di reseptor glutamat.

Lain editing A-to-G, di sebuah situs yang ditunjuk situs R / G, dapat terjadi

segera sebelum segmen flip-flop di GluR2-GluR4. Flip-flop segmen mempengaruhi

laju desensitisasi, sedangkan laju pemulihan dari negara peka tergantung pada situs R

/ G di mana bentuk diedit, G, pulih lebih cepat dari bentuk diedit, R.

3.3.5 DAERAH PORI

Wilayah pori telah dipelajari secara ekstensif menggunakan metode

aksesibilitas sistein diganti (SCAM) mutagenesis dan dalam kombinasi dengan

pengukuran elektrofisiologi. Studi ini telah memberikan beberapa wawasan ke dalam

arsitektur dari reseptor glutamat pori, dan data untuk sebagian besar kompatibel

dengan keseluruhan struktur mirip dengan struktur tiga-dimensi dari mengkristal

saluran kalium KCSA. Pori-pori membentuk struktur mirip kerucut, di mana ujung

terletak di permukaan ekstraseluler dan wilayah M2 dimasukkan dari sisi

cytoplasmatic. Reaktivitas dari residu terletak hanya di N-terminal perubahan M1,

tergantung pada aktivasi reseptor, dan mutasi pada C-terminal bagian dari M3

membuat reseptor konstitutif aktif, menunjukkan bahwa pintu gerbang mungkin

terletak di cytoplasmatic permukaan, antara M1 dan M3.

Data eksperimental juga mendukung struktur yang mirip untuk wilayah M2 dan

P-elemen dalam KCSA, dimana bagian N-terminal bentuk M2 struktur α-heliks

terletak sejajar dengan dinding kerucut dibentuk oleh daerah transmembran. Struktur

α-heliks diikuti oleh struktur melingkar acak menunjuk ke arah pusat pori-pori.

Wilayah yang membentuk filter selektif untuk kalium dalam saluran KCSA, namun

kurangnya diskriminasi antara kalium dan natrium arus dalam saluran reseptor

glutamat berpendapat untuk struktur yang berbeda. Q / R situs (lihat di atas) terletak

di ujung loop masuk kembali. Posisi yang menentukan permeabilitas ion divalen

relatif terhadap ion monovalen. Posisi yang setara pada reseptor NMDA ditempati

oleh aspargine, yang terlibat dalam diskriminasi antara kedap Mg2 + dan ion Ca2 +

permeabel. Asam amino tambahan juga terlibat, tetapi mereka tidak berada pada

posisi setara pada NR1 dan subunit NR2, menunjukkan asimetri dalam pori-pori pada

posisi itu.

Daerah-daerah yang terlibat dalam kation anion vs selektivitas tidak didefinisikan

dengan baik, karena mereka adalah untuk nAChR tersebut. Namun, berbeda dengan

nAChR itu, residu dalam pori-pori berkontribusi terhadap selektivitas, sebagai

reseptor AMPA sepenuhnya terbentuk dari diedit atau reseptor kainate (misalnya,

memiliki R di situs Q / R) juga permeabel terhadap klorida.

3.3.6 TEMPAT INTRASELULAR DARI RESEPTOR

Potensiasi jangka panjang dan depresi sinapsis glutamatergic terlibat dalam

banyak model untuk fungsi dan perkembangan otak. Faktor kunci dalam plastisitas

adalah perubahan dalam AMPA dan kegiatan reseptor kainate diinduksi NMDA

setelah peningkatan reseptor-tergantung dari Ca2 + intraseluler konsentrasi. Bukti

kuat ada untuk keterlibatan dua mekanisme yang tergantung reseptor pada perubahan

dalam aktivitas reseptor. Reseptor glutamat adalah, seperti untuk saluran ion yang

paling, diatur oleh fosforilasi. Fosforilasi dan defosforilasi telah ditunjukkan untuk

mengubah baik kemungkinan untuk membuka dan distribusi berbagai negara

konduktansi. Mekanisme kedua melibatkan perubahan dinamis dalam jumlah reseptor

AMPA pada sinapsis. Keempat asam amino di bagian paling C-terminal GluR1-

GluR3 mengikat sejumlah penahan protein, di samping itu, GluR2 mengikat, pada

ekor cytoplasmatic, sebuah ATPase (NSF) yang terlibat dalam fusi membran.

Akibatnya, AMPA reseptor perdagangan pameran kinetika subtipe tertentu,

tergantung pada kehadiran GluR2 di kompleks reseptor.

3.4 ATP RESEPTOR: 2TM RESEPTOR

Ekstraseluler ATP telah ditunjukkan untuk mengaktifkan arus depolarizing

dalam jenis sel saraf dan non-saraf yang berbeda. Reseptor ini juga disebut sebagai

P2 reseptor. Reseptor selanjutnya dapat dibagi ke dalam reseptor P2Y G-protein-

coupled dan ion channelsP2X ligand-gated. Saat ini, tujuh reseptor P2X (P2X1-

P2X7) telah diklon (Tabel 3.3). receptorsexhibit antara 26 dan 50% identitas asam

amino secara keseluruhan, dengan tingkat tertinggi dari konservasi di daerah

ekstraseluler dan transmembran. P2X7 (juga disebut P2Z) adalah anggota yang paling

jauh dari keluarga.

Reseptor berbagai ukuran 379-595 asam amino. Reseptor memiliki dua wilayah

transmembran dengan intraseluler N-dan C-termini (Gambar 3.11). Analisis SCAM

ekstensif menunjukkan bahwa TM2 membentuk pori, dan glisin residu tersimpan di

tengah TM2 baris bagian tersempit dari saluran. Struktur pori dan lokasi gerbang

masih belum ditentukan.

Pendekatan yang berbeda telah digunakan untuk menentukan stoikiometri

reseptor. Saat ini, trimer adalah model yang disukai. Semua subunit kecuali P2X6

dapat membentuk reseptor homomerik fungsional, dan, kecuali untuk P2X7, semua

(saat diuji) subunit dapat membentuk kompleks heteromeric. Namun, in vivo,

perakitan tampaknya akan dipandu oleh mekanisme yang membatasi jumlah

kombinasi dibandingkan dengan kemungkinan teoritis.

Jumlah senyawa selektif yang bekerja pada subtipe P2X yang berbeda sangat

terbatas. Saluran P2X dapat dibedakan dari reseptor P2Y oleh banyak kinetika

mereka lebih cepat. Sifat kinetik, seperti desensitisasi, juga dapat digunakan dalam

rekaman elektrofisiologi untuk membedakan antara subtipe yang berbeda. Misalnya,

P2X1 dan P2X3 rasa mudah terpengaruh cepat pada konsentrasi ATP jenuh,

sementara P2X2 dan P2X4 rasa mudah terpengaruh sangat lambat. Namun,

desensitisasi umumnya bukan merupakan kriteria yang optimal untuk karakterisasi

dari reseptor. Pertama, mekanisme receptorindependent berbeda (fosforilasi,

mengikat protein, dll) mungkin mempengaruhi desensitisasi tersebut. Kedua,

desensitisasi sulit untuk mengukur secara akurat dalam sistem multisel dan dengan

metode selain elektrofisiologi. Ketiga, substates saluran yang berbeda mungkin

memiliki sifat yang berbeda desensitisasi.

GAMBAR 3.11 Skema representasi dari topologi transmembran dari adenosin

trifosfat (ATP) reseptor.

Reseptor P2X adalah kation selektif saluran, dan secara umum diasumsikan

bahwa selektivitas ion tersimpan untuk saluran tertentu. Studi pada P2X2, P2X4, dan

P2X7 reseptor, bagaimanapun, telah mengungkapkan pergeseran dalam selektivitas

ion setelah aktivasi reseptor berkepanjangan. Sebuah aplikasi agonis singkat

membuka pori saluran menjadi permeabel hanya untuk kation kecil, sedangkan

aktivasi lagi (ratusan milidetik ke detik) menginduksi konformasi pori permeabel

terhadap pewarna besar (> 630 Da). Semakin besar konformasi pori dapat diperoleh

oleh aplikasi berkelanjutan atau pulsa berulang. Menariknya, meskipun perubahan

ukuran pori, saluran tetap kation selektif. Perubahan serupa di tingkat konduktansi

telah diamati selama beberapa saluran lainnya, tetapi tetap harus menunjukkan

bagaimana umum fenomena ini dan apakah itu pameran agonis spesifisitas.

3.5 MASALAH

Soal 3.1

Model lazim reseptor untuk asam amino rangsang adalah kompleks tetrameric.

Seperti disebutkan dalam teks, ada bukti bahwa konduktansi saluran tergantung pada

jumlah subunit yang mengikat ligan. Memperkirakan nilai EC50 dan koefisien Hill

untuk kurva dosis-respons mengasumsikan bahwa pendudukan pada masing-masing

subunit memiliki nilai Kd dari 1 M, seorang nH dari 1, dan aktivasi yang

menginduksi transisi ke keadaan aktif independen dari keadaan lainnya subunit:

a. Pengikatan dua atau lebih agonis mengaktifkan negara yang melakukan arus

yang sama.

b. Mengikat pada dua subunit yang berdekatan diperlukan untuk membuka

saluran.

c. Seperti yang diusulkan, reseptor terdiri dari dua dimer dan hanya mengikat

pada kedua subunit dalam hasil dimer dalam aktivasi reseptor.

d. Mengikat pada dua subunit mengadakan saya saat ini, di tiga subunit, 2 saat ×

I, dan mengikat semua empat subunit, arus 3 × I.

Soal 3.2

Asumsikan perakitan reseptor asetilkolin nikotin (nAChR) subunit benar-benar

permisif. Berapa banyak reseptor yang berbeda dapat dirakit dalam sel

mengekspresikan α3, β2, dan β4? Grup reseptor sesuai dengan mana yang cenderung

memiliki serupa konduktansi single-channel dan / atau aktivasi kinetika.

3.6 BACAAN

Armstrong, N. and Gouaux, E., Mechanisms for activation and antagonism of the

AMPA-sensitive glutamate receptor: crystal structures of the GluR2 ligand

binding core, Neuron, 28, 165Ŕ181, 2000.

Brejc, K., van Dijk, W. J., Klassen, R. V., Schuurmans, M., van der Oost, J., Smit, A.

B., and Sixma, T. K., Crystal structures of an ACh-binding protein reveal the

ligand-binding domain of nicotinic receptors, Nature, 411, 269Ŕ276, 2001.

Corringer, P. J., Le Novere, N., and Changeux, J. P., Nicotic receptors at the

aminoacid level, Annu. Rev. Phamacol. Toxicol., 40, 431Ŕ458, 2000.

Dingledine, R., Borges, K., Bowie, D., and Traynelis, S. F., The glutamate receptor

ion channels, Pharmacol. Rev., 51, 7Ŕ61, 1999.

Egebjerg, Schousboe, and Krogsgaard-Larsen, Eds., Glutamate and GABA Receptors

and Transporters: Structure, Function and Pharmacology, Taylor & Francis,

London, 2001.

Khakh, B. S., Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at

synapses, Nat. Rev. Neurosci., 2, 165Ŕ174, 2001.

Khakh, B. S., Burnstock, G., Kennedy, C., King, B. F., North, R. A., Seguela, P.,

Voigt, M., and Humphrey, P. P., International union of pharmacology.

XXIVC. Current status of the nomenclature and the properties of P2X

receptors and their subunits, Pharmacol. Rev., 53, 107Ŕ118, 2001.

Kuner, T., Beck, C., Sakmann, B., and Seeburg, P. H., Channel-lining residues of the

AMPA receptor M2 segment: structural environment of the Q7R site and

identification of the selective filter, J. Neurosci., 21, 4162Ŕ4172, 2001.

North, R. A. and Surprenant, A., Pharmacology of cloned P2X receptors, Annu. Rev.

Pharmacol. Toxicol., 40, 563Ŕ580, 2000

Rudolph, U., Crestani, F., and Mohler, H., GABAA receptor subtypes: dissecting

their pharmacological functions. Trends Pharmacol. Sci., 22, 188Ŕ194, 2001.

Sheng, M. and Lee, S. H., AMPA receptor trafficking and the control of synaptic

transmission, Cell, 105, 825Ŕ828, 2001.


Soal 3.1

Hunian pada setiap subunit p = [L] / Kd + [L], di mana [L] adalah konsentrasi

ligan. Jika aktivasi subunit independen, seperti yang diasumsikan, jumlah subunit

diaktifkan pada kompleks reseptor akan mengikuti distribusi binomial, yaitu

kemungkinan untuk aktivasi n subunit adalah K4, NP4-n (1 - p) n. Saat ini akan

sebanding dengan:

a. 6 * p2 (1 - p) 2 + 4 * (p) 3 (1 - p) + p4, Kd = 0,62; nH = 1.70

b. 4 * p2 (1 - p) 2 + 4 * (p) 3 (1 - p) + p4, Kd = 0,84; nH = 1.57

c. 2 * p2 (1 - p) 2 + 4 * (p) 3 (1 - p) + p4, Kd = 1,17; nH = 1.56

d. 1/3 * (6 * p2 (1 - p) 2 + 2 * 4 * (p) 3 (1 - p) + 3 * p4), Kd = 1,67; nH = 1.23

Kd dan nH nilai-nilai yang diperoleh dengan menggunakan prosedur pas normal.

Soal 3.2

Jawabannya adalah delapan. Dalam representasi linear:

1. α3-β2-α3-β2-β2

2. α3-β2-α3-β2-β4

3. α3-β2-α3-β4-β2

4. α3-β4-α3-β2-β2

5. α3-β2-α3-β4-β4

6. α3-β4-α3-β2-β4

7. α3-β4-α3-β4-β2

8. α3-β4-α3-β4-β4

Kombinasi dengan stoikiometri serupa akan cenderung memiliki konduktansi

yang sama (misalnya, empat kelompok 1, 2-4, 5-7, dan 8), sedangkan pengaturan

subunit mungkin lebih penting untuk kinetika reseptor karena situs pengikatan agonis

berada antara α dan subunit β. Jika situs pengikatan diasumsikan antara subunit α dan

subunit β di sebelah kanan (dalam representasi ini linier), ada tiga kelompok: (1) 1-2,

2 × (α3 - β2), (2) 3 -6, (α3 - β2) (α3 - β4), dan (3) 7-8, 2 × (α3 - β2).

4 Struktur Molekul dari

Reseptor Tirosin Kinase

Steen Gammeltoft

ISI

4.1. Pengenalan....................................................................................................131

4.2. Keluarga Reseptor Tirosin Kinase .............................................. ............... 132

4.3. Identifikasi Reseptor Tirosin Kinase ............................................. .....132

4.4. Paradigma untuk Aktivasi Receptor Tyrosine Kinase ............................... 133

4.4.1. Aktivasi oleh dimerisasi ............................................... ....................... 133

4.4.2. Autofosforilasi tirosin ................................................ .................. 135

4.5. Studi Struktural Reseptor Tirosin Kinase ........................................... 136

4.5.1. Domain Ligan-Binding .............................................. ............................ 136

4.5.2. Domain Protein Kinase ............................................... ........................... 142

4.5.3. Struktur Receptor Tyrosine Kinase Aktiv......................................... 146

4.5.4. Reseptor Tirosin Kinase Inhibitor .............................................. ........... 148

4.6. Bacaan lebih lanjut ................................................ .....................................

149

4.1 PENDAHULUAN

Reseptor permukaan sel yang terlibat dalam transmisi sinyal ekstraseluler

melintasi membran plasma dan regulasi jalur sinyal transduksi intraseluler-mediasi

pembangunan dan komunikasi multiseluler dalam semua organisme hidup. Reseptor

ini mengikat berbagai macam ligan watersoluble, termasuk amina, asam amino, lipid,

peptida, dan protein. Untuk kenyamanan, mereka dapat diurutkan ke dalam empat

kelas utama dengan mekanisme yang berbeda sinyal: reseptor G-protein-coupled,

reseptor ion-channel, tyrosine kinase sitoplasma (CTK)-linked reseptor, dan reseptor

dengan aktivitas enzimatik intrinsik. Di kelas kedua, reseptor tirosin kinase (RTKs)

yang dominan, sedangkan reseptor adenilat guanylate dan serin / treonin kinase

reseptor kelompok kecil. Reseptor CTK-linked memediasi respon terhadap sitokin

dan hormon seperti erythropoietin (EPO), interferon, dan hormon pertumbuhan (GH).

RTKs mengikat berbagai faktor pertumbuhan dan hormon, seperti faktor

pertumbuhan epidermal (EGF), faktor pertumbuhan fibroblast (FGF), dan insulin.

Meskipun RTKs dan reseptor CTK-linked resmi milik kelas yang berbeda,

mekanisme signaling menunjukkan kesamaan mengenai dimerisasi reseptor dan

fosforilasi tirosin.

Para RTKs mengkatalisis transfer γ-fosfat adenosin trifosfat (ATP) terhadap

gugus hidroksil dari tyrosines pada protein target. RTKs memainkan peran penting

dalam pengendalian proses dasar yang paling, termasuk siklus sel, migrasi sel,

metabolisme sel, dan kelangsungan hidup, serta proliferasi sel dan diferensiasi.

Semua RTKs mengandung domain ikatan-ligand ekstraseluler yang biasanya

glikosilasi. Ligan-ikatan domain terhubung ke domain sitoplasmik oleh heliks

transmembran tunggal. Dalam reseptor dengan aktivitas enzimatik intrinsik, domain

sitoplasmik mengandung protein kinase tirosin tersimpan (PTK) inti dan urutan

peraturan tambahan yang dikenakan autofosforilasi dan fosforilasi oleh protein kinase

heterolog. Dalam reseptor CTK-linked, domain sitoplasma yang relatif singkat

berinteraksi melalui interaksi noncovalent dengan anggota Janus kinase (JAK)

keluarga CTKs. Terlepas dari kurangnya ikatan kovalen ke kinase, mekanisme kerja

reseptor ini biner sebagian besar menyerupai RTKs. Tujuan dari kajian ini adalah

untuk menggambarkan struktur molekul RTKs dengan penekanan pada konsep-

konsep umum yang mendasari aktivasi reseptor dan transduksi sinyal faktor

pertumbuhan, sitokin, dan hormon.

4.2 KELUARGA RESEPTOR TIROSIN KINASE

Upaya urutan genom organisme eukariotik telah mengungkapkan bahwa

sampai sekitar 20% dari 6200 sampai 32.000 gen penyandi di Saccharomyces

cerevisiae, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana,

dan Homo sapiens mengkodekan protein yang terlibat dalam transduksi sinyal,

termasuk reseptor transmembran , subunit G-protein, dan enzim sinyal yang

menghasilkan. Dalam genom manusia, lebih dari 520 protein kinase dan protein

fosfatase 130 melakukan kontrol reversibel fosforilasi protein. Kedua kategori enzim

dapat dibagi lagi menjadi tirosin-atau serin / treonin spesifik, berbasis pada

spesifisitas katalitik mereka. Selain itu, beberapa memiliki ganda kekhususan untuk

kedua tirosin dan serin / treonin, dan beberapa anggota keluarga kinase

phosphatidylinositol juga menunjukkan aktivitas protein kinase. Ada lebih dari 90

gen PTK dikenal dalam genom manusia; 59 menyandikan RTKs transmembran

didistribusikan di antara 20 subfamilies, dan 32 encode sitoplasma, nonreceptor

PTKS di 10 subfamilies. Penting untuk dicatat bahwa dari 30 gen pertumbuhan

suppresser dan lebih dari 100 onkogen dominan, protein kinase, di PTKS tertentu,

terdiri dari sebagian besar dari kelompok kedua. PTKS berevolusi untuk memediasi

aspek komunikasi multisel dan pembangunan di metazoa, di mana mereka terdiri dari

sekitar 0,3% dari gen. Mutasi somatik dalam kelompok yang sangat kecil gen

menyebabkan fraksi yang signifikan dari kanker pada manusia, menekankan

hubungan terbalik antara regulasi perkembangan normal dan oncogenesis.

Kelompok PTK mencakup sejumlah besar enzim dengan domain kinase terkait

erat yang secara khusus phosphorylate residu tirosin dan melakukan serin tidak

memfosforilasi atau treonin. Ini enzim, pertama dikenal di kalangan oncoproteins

retroviral, telah ditemukan hanya dalam sel metazoan, di mana mereka secara luas

diakui untuk peran mereka dalam transducing pertumbuhan dan diferensiasi sinyal.

Termasuk dalam kelompok ini adalah lebih dari 20 keluarga reseptor yang berbeda

terdiri dari membran-spanning molekul yang berbagi sama keseluruhan struktur

topologi. Semua anggota dari superfamili RTK memiliki domain ekstraseluler besar

dengan tingkat tinggi keragaman dalam urutan primer dan struktur tersier. -rantai

tunggal domain membran-spanning tidak menunjukkan konservasi antara berbagai

RTKs. sitoplasma domain berisi entitas katalitik terdiri dari PTK baik tersimpan.

Urutan asam amino menunjukkan homologi yang signifikan mencerminkan tersimpan

protein kinase lipat, secara umum, dan struktur PTK, pada khususnya. eukariotik

protein kinase superfamili dapat dibagi lagi menjadi keluarga yang berbeda yang

berbagi sifat struktural dan fungsional. Pohon filogenetik berasal dari penyelarasan

kinase-domain, urutan asam amino berfungsi sebagai dasar untuk klasifikasi. Dengan

demikian, satu-satunya pertimbangan kesamaan kinase-domain, urutan asam amino.

Kekhususan penentu sekitar situs phospho-akseptor tirosin telah ditentukan

oleh berbagai prosedur. Dalam PTK tes menggunakan berbagai substrat, ditetapkan

bahwa residu glutamat dari N-terminal atau C-terminal sisi akseptor sering disukai.

Substrat spesifisitas PTK domain katalitik telah dianalisis dengan skrining

perpustakaan peptida untuk prediksi peptida substrat yang optimal. Akhirnya,

bioinformatika telah diterapkan untuk mengidentifikasi situs phospho-akseptor dalam

protein PTKS dengan penerapan algoritma neural network.

4.3 IDENTIFIKASI RESEPTOR TIROSIN KINASE

Tiga puluh tahun yang lalu, reseptor untuk hormon polipeptida seperti insulin

dan GH diidentifikasi sebagai kegiatan mengikat dalam sel, membran, atau protein

membran dilarutkan menggunakan protein radiolabeled sebagai ligan. Namun,

transduksi sinyal dari reseptor ini tetap sebuah "kotak hitam" selama sekitar 10 tahun

sebelum kegiatan PTK mereka ditunjukkan. RTK pertama diidentifikasi fungsional

dan struktural adalah faktor pertumbuhan epidermal (EGF) reseptor. Stanley Cohen

dan rekan kerja mengisolasi reseptor EGF dan menunjukkan bahwa itu adalah

glikoprotein membran intrinsik dari 170 kDa, bahwa itu berisi situs pengikatan

spesifik untuk EGF, dan bahwa kegiatan PTK EGF-aktif adalah intrinsik ke reseptor.

Struktur utama dari reseptor EGF, ditentukan oleh kloning cDNA dan urutan reseptor

mRNA, PTK urutan lokal di bagian sitoplasma dari rantai polipeptida reseptor.

Mengikat ligan menginduksi dimerisasi reseptor EGF dan aktivasi cepat PTK dengan

autofosforilasi beberapa residu tirosin terletak di C-terminus reseptor. Ini residu

phosphotyrosine bertindak sebagai situs mengikat untuk Src homologi 2 (SH2)

domain atau phosphotyrosine-ikatan (PTB) domain dari berbagai sinyal protein.

Selanjutnya, RTKs milik 20 subfamilies telah diklon (Gambar 4.1). Struktur ini

sangat tersimpan dalam domain PTK katalitik tetapi menunjukkan variasi yang besar

dalam domain ekstraselular serta juxtamembrane dan C-terminal bagian dari domain

sitoplasmik. Klasifikasi RTK subfamilies didasarkan pada dasar-homologi urutan dan

persamaan dalam struktur sekunder. Sistein kaya domain, imunoglobulin-seperti (Ig-

seperti) domain, domain leusin kaya, cadherin-seperti domain, fibronektin tipe III

domain, EGF-seperti domain, dan kringle-seperti domain mencirikan bagian

ekstraseluler RTKs (Gambar 4.1) .

4.4 PARADIGMA UNTUK AKTIVASI RESEPTOR TYROSINE KINASE

Studi fungsi reseptor EGF didefinisikan dua paradigma umum dalam aktivasi

RTK dan transduksi sinyal. Pertama, RTKs diaktifkan oleh dimerisasi diinduksi oleh

pengikatan ligan. Dengan pengecualian dari keluarga reseptor insulin RTKs, semua

RTKs dikenal (misalnya, reseptor EGF atau faktor pertumbuhan platelet-derived

[PDGF] reseptor) adalah monomer dalam membran. Mengikat ligan menginduksi

dimerisasi reseptor, sehingga autofosforilasi domain sitoplasma mereka. Reseptor

insulin adalah disulfida-linked dimer dari dua rantai polipeptida membentuk α2 β2

heterotetramer. Insulin mengikat subunit α ekstraseluler menginduksi penataan ulang

dalam struktur heterotetrameric kuartener yang menyebabkan aktivasi dari PTK

intraseluler dan peningkatan autofosforilasi domain sitoplasma. Bentuk aktif reseptor

insulin dan RTK monomer keduanya dimer, dan mekanisme aktivasi reseptor

cenderung sangat mirip. Kedua, reseptor autofosforilasi menghasilkan situs

phosphotyrosine di bagian sitoplasma reseptor yang berfungsi sebagai docking situs

untuk mengikat SH2 domain dan domain PTB. Selain peran sentral dalam

mengendalikan aktivitas PTK, autofosforilasi tirosin RTK sangat penting untuk

perekrutan dan aktivasi berbagai sinyal protein. Kebanyakan situs autophosphorylated

tirosin berada di daerah noncatalytic dari bagian sitoplasma dari molekul reseptor.

Daerah ini termasuk ekor C-terminal, seperti pada reseptor EGF, dan wilayah insert

kinase, seperti pada reseptor PDGF. Interaksi antara SH2 domain dan motif

phosphotyrosine menyediakan mekanisme untuk perakitan dan perekrutan sinyal

kompleks oleh RTK diaktifkan. Dengan demikian, setiap RTK harus

dipertimbangkan tidak hanya sebagai reseptor dengan aktivitas PTK tetapi juga

sebagai platform untuk pengakuan dan perekrutan pelengkap spesifik protein

signaling.

4.4.1 AKTIVASI OLEH DIMERISASI

Selama dekade terakhir, kemajuan signifikan telah dicapai dalam memahami

dasar molekuler untuk dimerisasi RTKs. Studi biokimia ligan mengikat dan aktivasi

RTK telah menyebabkan hipotesis bahwa RTKs diaktifkan oleh dimerisasi (Gambar

4.2). Dasar molekuler yang tepat untuk pembentukan oligomer masih belum jelas,

namun. Studi struktur ligan dalam kompleks dengan domain reseptor-ikatan telah

memberikan wawasan tentang sifat mekanisme dimerisasi. Beberapa struktur kristal

dari reseptor di kompleks dengan ligan mereka telah dipecahkan, termasuk sitokin

serta reseptor faktor pertumbuhan. Ligan yang berbeda menggunakan mekanisme

yang berbeda untuk menginduksi dimer keadaan aktif RTK

.

\

GAMBAR 4.1 RTK superfamili. Gambar menunjukkan representasi skematik dari

struktur domain dari 20 RTK keluarga. (Courtesy of SUGEN, Inc)

GAMBAR 4.2 Reseptor tirosin kinase dimerisasi. Pengikatan ligan monomer atau

dimer ke RTK monomer mengarah pada pembentukan dan stabilisasi diaktifkan RTK

dimer. Domain sitoplasmik dari RTK adalah trans-terfosforilasi oleh PTK aktif.

Struktur kristal ligan monomer seperti GH dan EPO dalam kompleks dengan

reseptor masing-masing menunjukkan bahwa hormon ini bivalen dan ligan yang

mengikat secara bersamaan untuk dua molekul reseptor untuk membentuk 01:02

(ligan: reseptor) kompleks. Reseptor dimerisasi lebih stabil oleh interaksi reseptor-

reseptor tambahan.

Beberapa faktor pertumbuhan yang homodimers, seperti faktor pertumbuhan

endotel vaskular (VEGF) dan PDGF, dan memberikan dasar yang sederhana untuk

ligan-induced dimerisasi reseptor. VEGF reseptor yang berisi tujuh Ig-seperti domain

dalam domain ekstraselular mereka, yang hanya Ig domain 2 dan 3 diperlukan untuk

mengikat ligan. Struktur kristal VEGF dalam kompleks dengan Ig-seperti domain 2

dari reseptor FLT-1 VEGF memberikan pandangan ligan-induced dimerisasi reseptor.

Struktur menunjukkan bahwa satu molekul reseptor mengikat masing-masing dua

persimpangan antara VEGF protomers untuk menghasilkan sebuah kompleks yang

dekat dengan dua kali lipat simetris dan berisi dua protomers VEGF ditambah dua Ig-

seperti domain.

Fibroblast growth factor (FGF) adalah ligan monomer yang mengaktifkan

reseptor FGF dengan kerjasama dari molekul aksesori, heparin sulfat proteoglikan.

Struktur kristal dari FGF dalam kompleks dengan domain ligan-mengikat reseptor

FGF (terdiri dari Ig-seperti domain 2 dan 3) memberikan pandangan molekul reseptor

FGF dimerisasi. Setiap struktur menunjukkan 2:2 FGF: FGF reseptor kompleks, di

mana FGF berinteraksi secara ekstensif dengan Ig-seperti domain 2 dan 3 dan dengan

linker yang menghubungkan dua domain dalam satu reseptor. Dimer distabilkan oleh

situs pengikatan sekunder yang melibatkan interaksi antara FGF dan D2 dari reseptor

kedua di kompleks serta interaksi reseptor-reseptor. Berbeda dengan disulfida-linked

VEGF homodimer, dua molekul FGF di 02:02 FGF: FGF reseptor kompleks tidak

melakukan kontak apapun. FGF dan FGF reseptor tidak cukup untuk menstabilkan

dimer reseptor FGF pada permukaan sel. Heparin atau heparan sulfat proteoglikan

sangat penting untuk dimerisasi stabil FGF: kompleks reseptor FGF. Heparin

mengikat ke canyon bermuatan positif dibentuk oleh sekelompok terkena Lys dan

residu Arg yang meluas di domain D2 dari dua reseptor di dimer dan sebelah molekul

FGF terikat.

4.4.2 AUTOFOSFORILASI TIROSIN

Aktivasi RTKs dilakukan dengan autofosforilasi pada residu tirosin,

konsekuensi dari ligan-dimediasi dimerisasi (Gambar 4.2). Dua proses yang terlibat:

peningkatan aktivitas katalitik PTK dan penciptaan situs mengikat dalam domain

sitoplasmik untuk merekrut protein sinyal hilir. Secara umum, autofosforilasi

tyrosines di loop aktivasi dalam hasil domain PTK di stimulasi aktivitas kinase, dan

autofosforilasi tyrosines di juxtamembrane tersebut, kinase insert, dan wilayah

karboksil-terminal menghasilkan situs docking untuk domain modular yang

mengakui phosphotyrosine dalam konteks tertentu. Kedua modul phosphotyrosine

mengikat mapan hadir dalam protein sinyal adalah domain SH2 dan domain PTB.

Semua RTKs mengandung antara satu dan tiga tyrosines dalam aktivasi

lingkaran kinase, yang terdiri dari subdomain VII dan VIII dari protein kinase

katalitik inti. Fosforilasi tyrosines ini telah terbukti menjadi penting untuk stimulasi

aktivitas katalitik dan fungsi biologis untuk sejumlah RTKs, termasuk reseptor

insulin, FGF reseptor, reseptor VEGF, PDGF reseptor, Met (reseptor faktor

pertumbuhan hepatosit), dan TrkA (NGF reseptor ). Sebuah pengecualian utama

adalah reseptor EGF, yang autofosforilasi dari tirosin tersimpan dalam loop aktivasi

tampaknya tidak terlibat dalam signaling. Pergantian tirosin dengan fenilalanin tidak

berpengaruh pada aktivitas RTK atau sinyal hilir.

Pada prinsipnya, RTK autofosforilasi dapat terjadi dalam cis (dalam monomer

reseptor) atau trans (antara dua reseptor di dimer). Dalam kasus pertama, mengikat

ligan akan menyebabkan perubahan konformasi reseptor yang akan memfasilitasi cis-

autofosforilasi residu tirosin terletak di dalam atau di luar domain PTK. Dalam kasus

kedua, tidak ada perubahan konformasi harus jatuh setelah dimerisasi. Efek

kedekatan sederhana akan memberikan kesempatan yang cukup untuk trans-

fosforilasi tyrosines dalam domain sitoplasmik oleh RTK kedua.

Struktur kristal bentuk unphosphorylated dari reseptor insulin telah

memberikan rincian tentang mekanisme molekul dengan yang RTKs disimpan dalam

keadaan aktivitas rendah sebelum autofosforilasi tyrosines di aktivasi. Dalam struktur

reseptor insulin, salah satu dari tiga tyrosines di loop aktivasi, Tyr1162, terikat dalam

situs aktif, tampaknya dalam posisi untuk autophosphorylated (di cis). Namun,

Asp1150 dari PTK-tersimpan urutan Asp-Phe-Gly pada awal loop aktivasi tidak

dalam posisi yang tepat untuk mengkoordinasikan MgATP tetapi mengganggu ATP

mengikat. Ini konsisten dengan data biokimia untuk fosforilasi Tyr1162 (dan

Tyr1158 dan Tyr1163) terjadi di trans (oleh molekul reseptor insulin kedua). Selain

itu, substitusi Tyr1162 dengan hasil fenilalanin dalam peningkatan aktivitas kinase

basal konsisten dengan peran otoinhibitor untuk Tyr1162.

Struktur kristal dari PTK domain tris-terfosforilasi dari reseptor insulin

mengungkapkan peran fosforilasi lingkaran aktivasi dalam stimulasi aktivitas

katalitik. Autofosforilasi reseptor insulin membawa tentang reposisi dramatis loop

aktivasi. Konformasi dari insulin tris-terfosforilasi RTK aktivasi loop stabil sebagian

oleh interaksi yang melibatkan phosphotyrosines, terutama terfosforilasi Tyr1162,

yaitu hidrogen terikat pada arginin tersimpan pada awal loop aktivasi (Arg1155) dan

tulang punggung nitrogen amida dalam setengah latter dari loop. Dengan demikian,

reseptor insulin cis-dihambat oleh pengikatan Tyr1162 di situs aktif yang bersaing

dengan substrat protein tetapi tidak cis-autophosphorylated karena kendala sterik

yang mencegah pengikatan MgATP. Reseptor insulin adalah trans-diaktifkan oleh

molekul reseptor kedua yang phosphorylates Tyr1162. Faktor suhu (B-faktor) yang

diperoleh selama perbaikan kristalografi menunjukkan bahwa bagian-bagian dari

insulin terfosforilasi RTK aktivasi lingkaran cukup seluler, menunjukkan bahwa

keseimbangan antara beberapa konformasi ada dalam larutan. Sebuah subset dari

(misalnya, diamati dalam struktur kristal aktif RTK insulin) akan menghambat

substrat (protein dan ATP) yang mengikat, sedangkan konformasi lain (misalnya,

diamati dalam aktif insulin RTK struktur kristal) akan memfasilitasi pengikatan

substrat dan fosforilasi.

4.5 STUDI STRUKTUR RESEPTOR TIROSIN KINASE

4.5.1 Domain Ikatan-Ligand

Beberapa struktur domain ligan-mengikat RTKs telah dilaporkan dalam 10

tahun terakhir, menyediakan dasar untuk mekanisme dimerisasi pemahaman dan

ligan-reseptor spesifisitas (Tabel 4.1). Struktur meliputi reseptor untuk sitokin seperti

hormon pertumbuhan, prolaktin, dan eritropoietin, serta reseptor untuk faktor

pertumbuhan seperti insulin-seperti faktor pertumbuhan I, faktor pertumbuhan

fibroblast, faktor pertumbuhan saraf, dan faktor pertumbuhan endotel vaskular.

Secara umum, hanya subset dari domain di bagian ekstraseluler dari RTK terlibat

dalam mengikat ligan. Semua RTKs terdiri dari beberapa domain ekstraseluler yang

mewakili lipatan protein umum seperti sistein kaya, fibronektin-III-seperti, Ig-seperti,

dan EGF-seperti domain (Gambar 4.1).

GAMBAR 4.3 Pertumbuhan hormon reseptor. Monomer rekan GH dengan dua

monomer reseptor. Activated kinase JAK2 transphosphorylate reseptor JAK2 dan

GH, dan faktor transkripsi STAT terfosforilasi oleh JAK2.

Pengikatan GH dengan reseptornya diperlukan untuk regulasi pertumbuhan

manusia normal dan pengembangan, termasuk pertumbuhan dan diferensiasi otot,

tulang, dan sel-sel tulang rawan. GH reseptor, anggota dari kelas 1 hematopoietik

reseptor superfamili adalah reseptor transmembran single-pass yang tidak memiliki

wilayah kinase. Klasifikasi ini didasarkan pada kesamaan urutan dalam domain

ekstraselular, terutama yang pentapeptide sangat lestari, yang disebut "kotak

WSXWS," fungsi yang kontroversial. Signaling terjadi melalui JAK / sinyal

transduser dan aktivator transkripsi (STAT) jalur, di mana ligan-induced

homodimerizasi telah diusulkan untuk mempromosikan hubungan stabil JAK2,

dengan fosforilasi JAK2, reseptor, dan STAT (Gambar 4.3). Dalam kasus GH,

aktivasi melibatkan reseptor homodimerizasi dalam proses berurutan. Asosiasi

hormon dan satu molekul reseptor perantara 01:01 kompleks membentuk kompleks

terner aktif terdiri dari satu ligan dan dua molekul reseptor. GH mengikat baik untuk

reseptor GH dan reseptor prolaktin.

GAMBAR 4.4 Struktur kompleks antara domain GH dan ekstraseluler manusia

reseptornya. GH terdiri dari empat heliks α padat yang ditampilkan dalam abu-abu

gelap. Dua protein yang mengikat terdiri dari lembaran β dan mereka akan

ditampilkan dalam terang dan abu-abu menengah, masing-masing. PDB id: DHHR.

Angka-angka dengan struktur molekul yang dibuat menggunakan Molscript Program.

(Vos, AM dkk., Sains, 255, 306-312, 1992.)

Pemeriksaan struktur kristal kompleks antara hormon dan domain ekstraseluler

reseptor telah menunjukkan bahwa kompleks terdiri dari satu molekul GH per dua

molekul reseptor. GH adalah gulungan empat-helix dengan topologi biasa (Gambar

4.4). ikatan protein mengandung dua domain yang berbeda, mirip dalam beberapa

hal ke domain imunoglobulin. Kedua domain mengikat GH berkontribusi residu yang

berpartisipasi dalam mengikat GH. Dalam kompleks, kedua reseptor

menyumbangkan dasarnya residu yang sama untuk berinteraksi dengan hormon,

meskipun dua situs mengikat GH tidak memiliki kesamaan struktural. Selain

interface hormon-reseptor, permukaan kontak substansial hadir antara domain

karboksil-terminal dari reseptor. Luasan relatif dari area kontak mendukung

mekanisme berurutan untuk dimerisasi yang mungkin penting bagi transduksi sinyal.

Struktur kompleks 1:1 GH terikat pada domain ekstraseluler reseptor prolaktin

mengungkapkan bagaimana hormon dapat mengikat dua reseptor jelas berbeda.

Akhirnya, struktur kompleks terner antara laktogen plasenta yg berhubung dgn

domba dan domain ekstraselular dari reseptor prolaktin tikus menunjukkan bahwa

dua reseptor mengikat ke sisi berlawanan dari laktogen plasenta dengan semu dua

kali lipat simetri. Dua situs mengikat reseptor berbeda secara signifikan dalam

topografi dan karakter elektrostatik. Mengikat interface juga melibatkan ikatan

hidrogen yang berbeda dan pola kemasan hidrofobik dibandingkan dengan kompleks

reseptor GH struktural terkait. Erythropoietin adalah hormon glikoprotein yang

mengatur proliferasi, diferensiasi, dan pematangan sel erythroid. EPO reseptor adalah

anggota dari kelas 1 sitokin reseptor superfamili. Struktur kristal dari peptida EPO-

mimesis dan bagian ekstraseluler reseptor EPO mengungkapkan dimer asimetris

dengan dua protein yang mengikat EPO. Setiap monomer protein pengikat EPO

terdiri dari dua fibronektin-III lipatan (D1 dan D2) yang terhubung sekitar di sudut

kanan, seperti dalam reseptor sitokin lainnya (Gambar 4.5). Di kompleks ligan-

reseptor, ligan menginduksi pembentukan dimer dekat dari kedua D1 dan D2 domain

dipisahkan oleh 39 Å, sehingga daerah intraseluler menjadi substrat untuk fosforilasi

oleh dua molekul JAK2. Sebaliknya, struktur asli, unligated ikatan protein EPO

menunjukkan dimer berbentuk salib di mana ujung membran-proksimal domain D2

dipisahkan oleh 73 Å, dan D1 domain setiap titik monomer dalam arah yang

berlawanan. Gunting-seperti konfigurasi dimer terus ujung intraseluler cukup jauh

terpisah sehingga autofosforilasi JAK2 tidak dapat terjadi. Dengan demikian,

peristiwa fosforilasi lainnya, seperti pada domain sitoplasmik dari reseptor EPO,

tidak terjadi. Dua struktur reseptor EPO menunjukkan bahwa reseptor unligated akan

diri-asosiasi pada permukaan sel dan membentuk dimer tidak aktif. Binding EPO ke

dimer reseptor menginduksi konformasi aktif. Sebuah dimer diri terkait akan

menjelaskan bagaimana EPO bisa mengaktifkan secara efisien pada permukaan sel di

mana relatif sedikit reseptor (<1000) yang hadir. Tanpa beberapa pengelompokan

reseptor, bahkan sementara, monomer kompleks reseptor-erythropoietin akan lazim,

terutama dalam kelebihan EPO.

GAMBAR 4.5 Unligated dan diikat erythropoietin reseptor konfigurasi dimer.

Dengan tidak adanya ligan, domain D2 dan akibatnya domain sitoplasmik dari dua

reseptor monomer EPO yang berorientasi dengan 73-Å pemisahan antara mereka. Di

hadapan ligan, jarak antara dua reseptor monomer EPO berkurang menjadi 39 Å

sehingga aktivasi JAK2 dan Trans-fosforilasi JAK2 dan domain sitoplasmik dari

reseptor EPO dapat terjadi. (Dimodifikasi setelah Livnah, O. et al., Sains, 273, 464-

471, 1996. Dengan izin.)

Faktor pertumbuhan endotel vaskular adalah hormon yang menginduksi

proliferasi homodimerik o sel endotel dan angiogenesis melalui mengikat RTKs

tertentu. Dua RTKs telah dijelaskan: kinase reseptor domain (KDR) dan Fms seperti

tirosin kinase (FLT-1), yang keduanya terletak pada permukaan sel endotel vaskular.

Bagian ekstraseluler terdiri dari tujuh Ig domain, dan domain kedua dan ketiga dari

FLT-1 yang perlu dan cukup untuk mengikat VEGF dengan afinitas dekat-asli,

domain 2 saja mengikat hanya 60 kali lipat lebih kuat daripada tipe liar. Struktur

kristal kompleks antara VEGF dan domain kedua FLT-1 menunjukkan bahwa domain

2 berinteraksi dengan "kutub" dari dimer VEGF secara dominan hidrofobik (Gambar

4.6).

Mamalia FGF keluarga reseptor mencakup setidaknya empat produk gen yang

berbeda, dengan keragaman tambahan yang dihasilkan oleh splicing alternatif.

Sampai saat ini, 18 FGFs mamalia telah diidentifikasi dan telah terbukti terlibat

dalam pengendalian berbagai respons biologis yang sangat penting untuk

perkembangan dan kelangsungan hidup. Keempat reseptor afinitas tinggi, reseptor

FGF 1 sampai 4, terdiri dari domain ligan-mengikat ekstraselular yang berisi tiga Ig-

seperti domain (D1 ke D3), heliks transmembran tunggal, dan sebuah domain

sitoplasmik yang berisi kegiatan PTK. Dimerisasi reseptor merupakan langkah

penting dalam FGF sinyal dan membutuhkan heparin sulfat proteoglikan. Struktur

kristal FGF2 terikat dengan varian alami dari FGF reseptor 1 yang terdiri dari Ig-

seperti domain D2 dan D3 menunjukkan bahwa FGF2 berinteraksi secara ekstensif

dengan dua D domain serta dengan linker antara dua domain. Dimer ini distabilkan

oleh interaksi antara FGF2 dan D2 dari kompleks sebelah dan oleh interaksi langsung

antara D2 masing-masing reseptor (Gambar 4.7). Struktur kristal FGF1 dan FGF2

kompleks dengan ligan-ikatan domain D2 dan D3 dari FGF reseptor 1 dan 2

mengungkapkan penentu ligan-reseptor spesifisitas. Daerah sangat tersimpan reseptor

FGF termasuk D2 dan linker antara D2 dan D3 menentukan situs mengikat umum

untuk semua FGFs. Kekhususan dicapai melalui interaksi antara daerah N-terminal

dan pusat FGFs dan dua daerah loop dalam D3 yang memiliki splicing alternatif.

GAMBAR 4.6 Struktur kompleks antara VEGF dan FLT-1. Dua monomer VEGF

terdiri dari lembaran β paralel dan mereka akan ditampilkan dalam terang dan abu-

abu menengah, masing-masing. Dua salinan FLT-1 dalam abu-abu gelap. PDB id:

1FLT. (Wiesmann, C. et al., Cell, 91, 641, 1997.)

Struktur kristal dari terner FGF2-FGF reseptor kompleks 1-heparin terdiri dari

dimer dengan 02:02:02 stoikiometri. Dalam setiap 01:01 FGF: FGF reseptor

kompleks, heparin membuat banyak kontak dengan kedua FGF dan FGF reseptor,

sehingga memperlebar FGF-FGF mengikat reseptor. Heparin juga berinteraksi

dengan reseptor FGF di sebelah 01:01 FGF: FGF reseptor kompleks untuk

mempromosikan FGF reseptor dimerisasi. Kelompok 6-O-sulfat heparin memainkan

peran penting dalam mediasi kedua interaksi. Atas dasar struktur kristal adalah

mungkin untuk merancang analog heparin mampu aktivitas FGF modulasi.

Mengingat peran penting FGF bermain di angiogenesis dan pertumbuhan sel, agonis

heparin sintetis dan antagonis mungkin memiliki nilai terapi yang potensial.

Ephrin (Ef) reseptor terbagi dalam dua kelompok, A dan B, berdasarkan

kemampuan mereka untuk mengikat ligan (ephrins), yang dengan sendirinya protein

permukaan sel berlabuh ke membran plasma baik melalui

glycosylphosphatidylinositol (GPI) linkage (tipe A) atau sebuah daerah

transmembran (tipe B). Sinyal antara reseptor Ef dan ephrins umumnya melibatkan

interaksi sel-sel langsung dan sering mengakibatkan tolakan sel. Reseptor Ef

Vertebrata memiliki banyak fungsi dalam gerakan sel, pembentukan batas sel, dan

morfogenesis dari jaringan kompleks seperti otak dan sistem kardiovaskular.

Reseptor Ef adalah RTKs dengan wilayah ekstraselular, daerah membran-spanning

singlechain, dan daerah sitoplasma dengan domain PTK. Wilayah ekstraseluler terdiri

dari dua tipe III fibronektin mengulangi: daerah kaya sistein dan 180 tersimpan -

asam amino N-terminal globular domain, yang baik perlu dan cukup untuk

pengikatan reseptor untuk ligan ephrin mereka. Reseptor Ef mengikat ligan ephrin

mereka dengan afinitas tinggi dan dengan satu-ke-satu stoikiometri. Struktur kristal

dari domain amino-terminal dari reseptor lipatan EphB2 menjadi jellyroll kompak β-

sandwich yang terdiri dari 11 antiparalel β-helai. Menggunakan mutagenesis berbasis

struktur, loop diperpanjang yang penting bagi ligan mengikat dan spesifisitas kelas

telah diidentifikasi.

GAMBAR 4.7 Struktur kompleks dimer antara FGF2 dan FGF reseptor 1. Ig-seperti

domain 2 dan 3 dari dua FGF reseptor 1 molekul terdiri dari lembaran β paralel dan

mereka akan ditampilkan dalam medium dan abu-abu muda, masing-masing. Dua

molekul FGF2 terdiri dari seikat lembaran β yang ditampilkan dalam abu-abu gelap.

PDB id: 1CVS. (Plotnikov, AN dkk., Cell, 98, 641, 1999.)

Faktor pertumbuhan saraf yang terlibat dalam berbagai proses yang melibatkan

sinyal, seperti diferensiasi sel dan kelangsungan hidup, penghentian pertumbuhan,

dan apoptosis neuron. Peristiwa ini dimediasi oleh NGF sebagai akibat dari mengikat

untuk reseptor permukaan sel-nya dua, TrkA dan P75. TrkA adalah reseptor dengan

aktivitas PTK yang membentuk situs tinggi afinitas mengikat bagi NGF. Dari lima

domain yang terdiri dari bagian ekstraseluler, yang Ig-seperti D5 domain proksimal

membran perlu dan cukup untuk mengikat NGF. Struktur kristal NGF manusia dalam

kompleks dengan D5 domain TrkA manusia menunjukkan bahwa NGF dimer

mengikat dua reseptor dengan antarmuka yang terdiri dari dua patch dengan ukuran

yang sama (Gambar 4.8). Satu patch merupakan motif mengikat umum untuk semua

anggota keluarga, sedangkan patch kedua adalah khusus untuk interaksi antara NGF

dan TrkA.

GAMBAR 4.8 Struktur NGF di kompleks dengan domain ligan-mengikat reseptor

TrkA. Kedua monomer NGF terdiri dari lembaran β paralel dan mereka akan

ditampilkan dalam terang dan abu-abu menengah, masing-masing. Kedua TrkA D5

domain terdiri dari lembaran β yang ditampilkan dalam abu-abu gelap. PDB id:

1WWW. (Wiesmann, C. et al., Nature, 401, 184, 1999.)

Insulin-like growth factor I terlibat dalam kedua pertumbuhan normal dan

pengembangan banyak jaringan dan transformasi maligna. IGF-I reseptor adalah

molekul heterotetrameric terdiri dari dua rantai α dan dua rantai β dihubungkan oleh

ikatan disulfida. Rantai α ekstraseluler terdiri dari beberapa domain dengan wilayah

ligan mengikat terletak di amino-terminus. Rantai β terdiri dari domain pendek

ekstraseluler, domain transmembran, dan domain PTK sitoplasma. Struktur kristal

pertama tiga domain reseptor IGF-I, termasuk L1, sistein kaya, dan L2 domain,

menunjukkan bahwa setiap domain L terdiri dari tangan kanan β heliks beruntai

tunggal. Wilayah cysteinerich terdiri dari delapan modul disulfida-berikat, tujuh di

antaranya membentuk domain berbentuk batang dengan modul terkait dalam cara

yang tidak biasa. Tiga domain mengelilingi ruang tengah dengan ukuran yang cukup

untuk mengakomodasi molekul ligan. Meskipun fragmen (residu 1-462) tidak

mengikat ligan, banyak faktor penentu yang bertanggung jawab untuk mengikat

hormon dan ligan spesifisitas peta ke situs ini pusat.

4.5.2 DOMAIN PROTEIN KINASE

Struktur kristal dari domain PTK dari beberapa RTKs telah dilaporkan (Tabel

4.2). Ini mengikuti penentuan struktur beberapa protein serine / threonine kinase

terkait, yang pertama adalah siklik AMP-dependent protein kinase (PKA). Domain

PTK secara keseluruhan mirip dengan yang ada pada serin / treonin kinase (Gambar

4.9). Hal ini terdiri dari lobus amino-terminal, terdiri dari lima untai β-sheet dan satu

heliks α, dan C-terminal lobus besar yang terutama α heliks. ATP mengikat di celah

antara dua lobus, dan peptida substrat tirosin yang mengandung mengikat lobus C-

terminal. Beberapa residu sangat tersimpan dalam semua PTKS, termasuk beberapa

glycines dalam lingkaran nucleotideikatan, lisin dalam β-untai 3, asam glutamat di α

helix C, asam aspartat dan asparagin di loop katalitik, dan Asp-Phe-Gly motif pada

awal loop aktivasi. Protein kinase adalah mampu berbagai konformasi karena

fleksibilitas yang interlobe melekat yang memungkinkan untuk konformasi terbuka

dan tertutup. Namun, konformasi katalis kompeten umumnya merupakan struktur

tertutup di mana dua lobus menjepit bersama untuk membentuk situs pengikatan

nukleotida antarmuka dan catalytic sumbing. N-terminal lobus protein kinase terdiri

minimal dari lima untai β-sheet memutar (dilambangkan β1 ke β5) dan αC heliks

tunggal. Fungsi N-terminal lobus untuk membantu dalam mengikat dan koordinasi

ATP untuk transfer produktif dari γ-fosfat ke berorientasi oleh lobus C-terminal

substrat. Dalam hal ini, β-helai 1 dan 2 dan glisin-kaya menghubungkan bentuk

segmen flap fleksibel yang berinteraksi dengan basis adenin, gula ribosa, dan gugus

fosfat nonhydrolyzable ATP. Selanjutnya, jembatan garam invarian antara lisin rantai

samping di β-untai 3 dan asam glutamat rantai samping di helix αC

mengkoordinasikan β-fosfat dari ATP.

C-terminal lobus protein kinase terdiri minimal dari dua β-helai (β7 dan β8) dan

serangkaian heliks α (αD ke αI). Strands β7 dan β8 mencari ke daerah sumbing antara

N-dan lobus Cterminal mana mereka berkontribusi rantai samping yang berpartisipasi

dalam katalisis dan mengikat magnesium untuk koordinasi gugus fosfat ATP.

Aktivasi segmen, yang juga terletak di lobus katalitik besar, yang teratur dalam

struktur protein kinase di mana segmen aktivasi tidak terfosforilasi. Sisanya elemen

lobus C-terminal, termasuk heliks α αD ke αI, yang diperintahkan dengan baik, dan

kinase berakhir dengan αJ singkat. Aktivitas katalitik RTK dirangsang oleh

autofosforilasi tyrosines di aktivasi. Dalam keadaan unphosphorylated, RTK tidak

aktif.

Struktur kristal bentuk unphosphorylated dari RTK domain reseptor insulin,

FGF reseptor, reseptor VEGF 2, Tie2 reseptor, dan reseptor EphB2 memberikan

dasar molekuler untuk memahami bagaimana aktivitas katalitik direpresi sebelum

aktivasi reseptor. Masing-masing dari lima struktur RTK mengungkapkan mekanisme

yang berbeda dari inaktivasi. Aktivasi loop reseptor insulin berisi tiga situs

autofosforilasi tirosin. Dalam struktur kristal unphosphorylated reseptor insulin, salah

satu tyrosines terikat dalam situs aktif, hidrogen terikat pada asam aspartat tersimpan

dan arginin dalam lingkaran katalitik. Tyr1162 adalah tampaknya dalam posisi untuk

autophosphorylated di cis, tetapi asam aspartat lestari motif DFG (Asp1150) pada

awal loop aktivasi, yang terlibat dalam Mg-ATP mengikat, tidak diposisikan dengan

benar untuk katalisis (Gambar 4.9 ). Data struktural menunjukkan bahwa sebelum

autofosforilasi, Tyr1162 bersaing dengan substrat protein untuk situs aktif. Studi

biokimia mendukung mekanisme trans-fosforilasi untuk Tyr1162 serta Tyr1158 dan

Tyr1163 di aktivasi. Substitusi Fenilalanin dari Tyr1162 menghasilkan peningkatan

aktivitas katalitik RTK dalam ketiadaan insulin mendukung peran otoinhibitor untuk

Tyr1162.

GAMBAR 4.9 Struktur dari domain PTK dari reseptor insulin. N-terminal kinase

lobus terdiri dari satu heliks α dan lima lembar β yang ditampilkan dalam media abu-

abu dengan loop nukleotida-mengikat dalam abu-abu gelap. C-terminal kinase lobus

terdiri dari heliks α dan lembaran β yang ditampilkan dalam abu-abu terang dengan

loop katalitik abu-abu menengah. Aktivasi loop ditunjukkan dalam abu-abu gelap

dengan Tyr1162 abu-abu menengah. PDB id: 1IRK. (Hubbard, SR et al., Nature, 372,

746, 1994.)

Struktur kristal dari domain PTK FGF reseptor 1 telah ditentukan. Aktivasi

loop domain kinase reseptor FGF berisi dua situs autofosforilasi tirosin, Tyr653 dan

Tyr654, sesuai dengan Tyr1162 dan Tyr1163 pada reseptor insulin. Konformasi dari

unphosphorylated FGF RTK aktivasi lingkaran seperti yang terlihat dalam struktur

kristal secara signifikan berbeda dari yang ditemukan pada insulin RTK (Gambar

4.10). Dalam FGF RTK struktur, baik dari activationloop tyrosines terikat di situs

aktif. Sebaliknya, prolin pada akhir loop aktivasi dan terdekat residu tirosin-kinase-

invarian diposisikan untuk mengganggu pengikatan substrat tirosin. Selanjutnya,

berbeda dengan insulin RTK, awal loop aktivasi tidak menghalangi situs pengikatan

ATP di FGF RTK.

GAMBAR 4.10 Struktur dari domain PTK dari FGF reseptor 1. N-terminal kinase

lobus terdiri dari satu heliks α dan lima lembar β yang ditampilkan dalam warna abu-

abu menengah. C-terminal lobus terdiri dari heliks α dan lembaran β yang

ditampilkan dalam abu-abu terang dengan loop katalitik abu-abu menengah. Aktivasi

loop abu-abu gelap dengan Tyr653, Tyr654 dan Pro663 abu-abu menengah. PDB id:

1FGK. (Mohammadi, M. et al., Cell, 86, 577, 1996.)

Struktur kristal dari domain PTK dari VEGF reseptor 2 KDR mengungkapkan

persamaan dan perbedaan dengan insulin dan FGF RTKs. Reseptor VEGF (KDR dan

FLT-1), seperti reseptor PDGF, memiliki kinase insert yang besar antara heliks D dan

E di lobus karboksil-terminal. Kinase insert berisi beberapa situs autofosforilasi

tirosin yang berfungsi sebagai docking situs untuk protein SH2 domain. Upaya untuk

mengkristal VEGF RTK dengan insert gagal, tapi kristal protein kurang 50 residu

insert diperoleh. VEGF RTK memiliki dua situs tirosin autofosforilasi di loop

aktivasi, Tyr1054 dan Tyr1059, yang sesuai dengan Tyr1158 dan Tyr1163 pada

reseptor insulin. Namun, residu tirosin sesuai dengan otoinhibitor Tyr1162 pada

reseptor insulin tidak hadir dalam reseptor VEGF. Struktur kristal, ditentukan dalam

unligated, negara terfosforilasi, mengungkapkan posisi residu keseluruhan lipat dan

catalytic serupa dengan yang diamati dalam struktur tirosin kinase lainnya. Kinase

aktivasi lingkaran, autophosphorylated pada Tyr1059 sebelum kristalisasi, sebagian

besar teratur. Namun, sebagian dari loop aktivasi di sekitar tersimpan Pro1168

mengadopsi konformasi penghambatan yang sama seperti yang terlihat dalam struktur

unphosphorylated FGR RTK: wilayah ini menempati posisi inhibitor untuk mengikat

substrat. Ujung-ujung kinase bentuk insert struktur β-seperti, tidak diamati dalam

struktur tirosin kinase yang dikenal lainnya, yang kemasan dekat dengan kinase C

terminus. Struktur yang unik juga dapat terjadi pada anggota keluarga reseptor PDGF

lain dan dapat berfungsi untuk benar orientasi insert kinase untuk autofosforilasi

residu tirosin dan mengikat protein adaptor dalam struktur tirosin kinase lainnya.

Pada aktivasi loop kinase, autofosforilase pada Tyr1059

sebelum kristalisasi sebagian

besar teratur. Namun, sebagian aktivasi loop dari Pro1168

mengadopsi konformasi

penghambatan seperti yang terlihat pada struktur yang tidak terfosforilasi FGR RTK:

wilayah ini menempati posisi hambatan untuk binding substrat. Ujung dari

pemasukan kinase membentuk struktur seperti struktur α, β, tidak diamati pada

struktur tirosin kinase yang dikenal lainnya, yang terdekat dengan kinase C terminus.

Struktur yang unik juga dapat terjadi pada reseptor PDGF yang lain dan dapat

memberikan fungsi orientasi pada pemasukan kinase untuk autofosforilasi residu

tirosin dan mengikat protein adaptor.

Tie2 juga dikenal sebagai Tek) adalah RTK endotelium spesifik yang terlibat

dalam angiogenesis dan pemeliharaan pembuluh darah. Struktur Kristal domain RTK

dari Tie2 berisi katalitik inti, domain insert kinase, dan ekor C-terminal. Pengikatan

nukleotida Tie2 adalah sebuah konformasi hambatan, yang tidak terlihat oleh struktur

kinase yang lain, sedangkan lingkaran aktivasi mengadopsi "diaktifkan-seperti"

konformasi dalam ketiadaan fosforilasi. Tyr897

, terletak di N-terminal domain

kemungkinan kecil mengatur aktivitas Tie2 dengan mencegah dimerisasi

domain kinase atau dengan merekrut fosfatase ketika terfosforilasi. Aktivasi RTK

pada aktivasi Tie2 adalah proses yang kompleks yang memerlukan perubahan

konformasi dalam mengikat lingkaran nukleotida , aktivasi lingkaran, C helix, dan

ekor karboksil-terminal untuk ATP dan mengikat substrat.

Struktur kristal dari domain katalitik EphB2 dan wilayah paruh kedua

juxtamembran, termasuk dua situs fosforilasi Tyr604

dan Tyr610

yang bermutasi

fenilalanin, telah dipecahkan. Struktur dari domain katalitik sesuai dengan yang

umumnya diamati untuk protein kinase, yang terdiri dari dua lobus, lobus N-terminal

yang lebih kecil dan lobus C terminal yang lebih besar. Autoinhibitor EphB2 domain

katalitik mengadopsi konformasi tertutup yang dangkal menyerupai keadaan aktif

(Gambar 4.11). Wilayah juxtamembran EphB2 memerintah katalitik domain, terdiri

dari untai diperpanjang segmen Ex 1, sebuah turn tunggal 3/10 helix αAř dan turn

empat helix αBř. Unsur-unsur ini berhubungan erat dengan helix αC dari lobus

katalitik N-terminal dan juga berinteraksi secara terbatas dengan lobus C-terminal.

Segmen juxtamembrane mengadopsi konformasi heliks yang mendistorsi lobus kecil

N-terminal kinase domain dengan menerapkan kelengkungan pada helix αC.

Pasangan distorsi ini untuk distorsi lokal dalam elemen lobus N-terminal lain, paling

kritis loop kaya-glisin dan invarian jembatan garam. lisin-glutamat. Bersama-sama,

distorsi N-terminal tampaknya berpengaruh pada fungsi katalitik dengan dapat

mempengaruhi koordinasi gula dan fosfat kelompok yang terikat nukleotida. Dengan

kontak terbatas pada lobus bawah dari domain katalitik, segmen juxtamembrane yang

juga sterik menghambat aktivasi dari segmen mengadopsi konformasi produktif yang

menggambarkan keadaan aktif PTK. Bersama-sama, efek pada koordinasi nukleotida

dan aktivasi bentuk segmen dasar untuk autoinhibition dari EphB2 RTK oleh segmen

juxtamembran. Pada EphB2, dan kemungkinan besar Eph RTKs secara umum,

beralih ke keadaan aktif dikoordinasikan oleh fosforilasi di lokasi sangat dilestarikan

dalam kedua wilayah juxtamembrane dan katalitik domain. Fosforilasi EphB2 di

Tyr788 kemungkinan mempromosikan Urutan segmen aktivasi ke konformasi

katalitik kompeten. Sebaliknya, fosforilasi pada Tyr604

dan Tyr610

mungkin berfungsi

untuk mengacaukan struktur juxtamembrane dan menyebabkannya untuk

memisahkan dari domain katalitik. Hal ini akan memungkinkan untuk kembali dari

lobus N-terminal ke konformasi aktif terdistorsi.

4. 5. 3 STRUKTUR DARI AKTIVASI RESEPTOR TIROSIN KINASE

Struktur kristal terfosforilasi, bentuk aktif dari insulin RTK yang membentuk

kompleks dengan substrat peptidase dan sebuah analog ATP telah ditentukan.

Aktivasi lingkaran mengalami perubahan konformasi utama pada autofosforilasi

Tyr1158

, Tyr1162

, dan Tyr1163

dalam lingkaran., mengakibatkan akses tidak terbatas

ATP dan substrat protein ke situs aktif kinase (Gambar 4.12). Fosforilasi Tyr1163

(pTyr1163

) adalah kunci phospotirosine dalam menstabilkan konformasi dari aktivasi

lingkaran tris-terfosforilasi, sedangkan pTyr1158

telah melarut sempurna,

menunjukkan ketersediaan interaksi dengan sinyal protein hilir. YMXM mengandung

substrat peptide yang mengikat untai pendek antiparallel B ke ujung C-terminal

aktivasi lingkaran (loop), dengan metionin rantai samping menduduki dua kantong

hidrofobik pada lobus C-terminal kinase. Berdasarkan struktur tersebut menunjukkan

dasar molekul untuk aktivasi reseptor insulin melalui autofosforilasi, dan memberikan

gambaran ke substrat spesifik RTK dan mekanisme phosphotransfer.

GAMBAR 4.11 Struktur domain autoinhibited EphB2 PTK. Wilayah

jukstamembran terdiri dari dua heliks α yang bewarna abu-abu gelap dengan Tyr604

dan Tyr610 abu-abu sedang. Lobus N-terminal kinase terdiri dari satu heliks α dan

lima lembar β yang ditampilkan dalam media abu-abu dengan lingkaran pengikat

nukleotida dalam abu-abu gelap. Adenin dari AMP-PNP dalam abu-abu terang.

Lobus C terminal kinase terdiri heliks α dan lembaran β yang ditampilkan dalam abu-

abu terang. PDB id: IJPA (Wybenga-Groot, L. E, et al, Cell, 106, 745, 2001).

Insulin, seperti faktor pertumbuhan reseptor I berkaitan erat dengan reseptor

insulin. Aktivitas RTK dari reseptor IGF diatur oleh autofosforilasi antarmolekul di

tiga lokasi dalam loop aktivasi. Struktur kristal bentuk trisphosphorylated IGF-I RTK

domain dengan analog ATP dan substrat peptida tertentu menunjukkan

autofosforilasi yang menstabilkan aktivasi lingkaran dalam konformasi yang

memfasilitasi katalisis. Selanjutnya, struktur mengungkapkan bagaimana RTK

mengakui tirosin yang mengandung peptida dengan residu hidrofobik pada posisi

P+1 dan P +3. Secara keseluruhan pada aktivasi IGF-I, struktur RTK mirip dengan

struktur RTK insulin yang telah aktif, walaupun perbedaan urutan berpotensi

dimanfaatkan untuk desain obat antikanker.

GAMBAR 4.12 Struktur reseptor insulin tris-terfosforilasi. Lobus N-terminal

kinase terdiri satu heliks α dan lima lembar β yang ditampilkan dengan media abu-

abu dengan lingkaran binding- nukleotida dalam abu-abu gelap. AMP-PNP adalah

abu-abu terang dengan tiga residu fosfat abu-abu gelap. Lobus C-terminal kinase

terdiri dari heliks α dan lembaran β yang ditampilkan dalam abu-abu terang dengan

loop katalitik dalam medium abu-abu dan substrat peptida dalam abu-abu gelap.

(Hubbard, S. R., J. EMBO, 16, 5572, 1997.)

Kelompok lain memecahkan struktur kristal dari IGF-I RTK domain

terfosforilasi di duaresidu tirosin dalam loop aktivasi dan terikat ke analog ATP.

Ligan tidak dalam konformasi kompatibel dengan transfer fosforil dan loop aktivasi

sebagian teratur. IGF-I RTK terperangkap dalam setengah tertutup, sebelumnya

konformasi teramati . konformasi ini mungkin diperantarai oleh konformasi aktif dan

tertutup, konformasi aktif oleh insulin dan IGF-I RTKs.

4. 5. 4 INHIBITOR RESEPTOR TIROSIN KINASE

Reseptor tirosin kinase merupakan komponen penting dari jalur sinyal yang

mengontrol proliferasi sel dan diferensiasi. Peningkatan aktivitas RTK karena

mengaktifkan mutasi atau ekspresi berlebih yang mengimplikasikan kanker pada

manusia. Dengan demikian, inhibitor selektif RTKs memiliki nilai cukup. Meskipun

sejumlah senyawa telah diidentifikasi sebagai efektif inhibitor RTKs, mekanisme

molekuler yang tepat dimana agen ini menghambat aktivitas RTK belum dijelaskan.

Dua penelitian telah melaporkan struktur Kristal dari inhibitor RTK membentuk

kompleks dengan reseptor 1 FGF domain kinase tirosin. Satu kelas dari inhibitor

RTK didasarkan pada inti oxindole (indolinones). Dua senyawa pada kelas ini

menghambat aktivitas kinase dari reseptor FGF 1 dan menunjukkan spesifisitas

diferensial terhadap RTKs lainnya. Struktur kompleks mengungkapkan bahwa

oxindole menempati lokasi di mana adenin ATP mengikat, sedangkan gugus yang

memperpanjang dari residu kontak oxindole di daerah engsel antara dua lobus dari

kinase. Inhibitor spesifik yang lain dari reseptor 1 FGF menginduksi perubahan

konformasi dalam lingkaran binding nukleotida. Kelas lain dari inhibitor RTK

termasuk senyawa sintetis dari kelas pyrido-2, 3 -d-pirimidin yang selektif

menghambat aktivitas PTK pada reseptor FGF dan VEGF. Struktur kompleks dari

senyawa domain kinase dari reseptor FGF 1 menunjukkan tingkat tinggi permukaan

komplementaritas antara analog pirimidin dan ATP binding hidrofobik reseptor 1

FGF. Inhibitor adalah kandidat yang menjanjikan untuk terapi inhibitor angiogenesis

dan obat antiproliferatif yang akan digunakan dalam pengobatan kanker dan

gangguan pertumbuhan lainnya.

4. 6 BACAAN LEBIH LANJUT

de Vos, A. M., Ultsch, M., and Kossiakoff, A. A., Human growth hormone and

extracellular domain of its

receptor: crystal structure of the complex, Science, 255, 306Ŕ312, 1992.

Favelyukis, S., Till, J. H., Hubbard, S. R., and Miller, W. T., Structure and

autoregulation of the insulin-like

growth factor 1 receptor kinase, Nat. Struct. Biol., 8, 1058Ŕ1063, 2001.

Gammeltoft, S., Insulin receptors: binding kinetics and structure-function relationship

of insulin, Physiol. Rev.,

64, 1321Ŕ1378, 1984.

Gronborg, M., Wulff, B. S., Rasmussen, J. S., Kjeldsen, T., and Gammeltoft, S.,

StructureŔfunction relationship

of the insulin-like growth factor-I receptor tyrosine kinase, J. Biol. Chem., 268,

23435Ŕ13440, 1993.

Heldin, C. H., Dimerization of cell surface receptors in signal transduction, Cell, 80,

213Ŕ223, 1995.

Hubbard, S. R., Crystal structure of the activated insulin receptor tyrosine kinase in

complex with peptide

substrate and ATP analog, EMBO J., 16, 5572Ŕ5581, 1997.

Hubbard, S. R. and Till, J. H., Protein tyrosine kinase structure and function, Annu.

Rev. Biochem., 69, 373Ŕ398,

2000.

Hubbard, S. R., Wei, L., Ellis, L., and Hendrickson, W. A., Crystal structure of the

tyrosine kinase domain of

the human insulin receptor, Nature, 372, 746Ŕ754, 1994.

Hubbard, S. R., Mohammadi, M., and Schlessinger, J., Autoregulatory mechanisms in

protein-tyrosine kinases,

J. Biol. Chem., 273, 11987Ŕ11990, 1998.

Hunter, T., The Croonian Lecture 1997. The phosphorylation of proteins on tyrosine:

its role in cell growtH

and disease, Philos. Trans. Roy. Soc. London B (Biol. Sci.), 353, 583Ŕ605, 1998.

Jiang, G. and Hunter, T., Receptor signaling: when dimerization is not enough, Curr.

Biol., 9, R568ŔR571,

1999.

Kossiakoff, A. A. and De Vos, A. M., Structural basis for cytokine hormone-receptor

recognition and receptor

activation, Adv. Protein Chem., 52, 67Ŕ108, 1998.

Kuriyan, J. and Cowburn, D., Modular peptide recognition domains in eukaryotic

signaling, Annu. Rev.

Biophys. Biomol. Struct., 26, 259Ŕ288, 1997.

Livnah, O. et al., Functional mimicry of a protein hormone by a peptide agonist: the

EPO receptor complex

at 2.8 Å, Science, 273, 464Ŕ471, 1996.

Mohammadi, M., Schlessinger, J., and Hubbard, S. R., Structure of the FGF receptor

tyrosine kinase domain

reveals a novel autoinhibitory mechanism, Cell, 86, 577Ŕ578, 1996.

Pawson, T. and Scott, J. D., Signaling through scaffold, anchoring, and adaptor

proteins, Science, 278,

2075Ŕ2080, 1997.

Plotnikov, A. N., Schlessinger, J., Hubbard, S. R., and Mohammadi, M., Structural

basis for FGF receptor

dimerization and activation, Cell, 98, 641Ŕ650, 1999.

Schlessinger, J., Cell signaling by receptor tyrosine kinases, Cell, 103, 211Ŕ225,

2000.

BAGIAN III

STUDI RESEPTOR

PENGIKATAN-LIGAN

PENGUKURAN LANGSUNG PADA PENGIKATAN OBAT-RESEPTOR

5

Dennis G. Haylett

ISI

5. 1 Pendahuluan

5. 1. 1 Tujuan Studi Pengikatan Radioligand

5. 1. 2 Tatanama

5. 1. 3 Spesifitas Pengikatan

5.2 Model Pengikatan Radioligan

5. 2. 1 Saturasi

5. 2. 1. 1 Beberapa Situs Pengikatan

5. 2. 1. 2 Interaksi Situs

5. 2. 1. 3 Agonis

5. 2. 1. 3. 1 Aktivasi Reseptor Model del Castillo-Katz

5. 2. 1. 3. 2 Aktivasi Reseptor Model Ternary Kompleks

5. 2. 2 Studi Kinetik

5. 2. 2. 1 Pengukuran Konstanta Disosiasi, k-1

5. 2. 2. 2 Pengukuran Konstanta Disosiasi, k+2

5. 2. 3 Percobaan Kompetisi

5. 2. 3. 1 Hubungan antara K1 dan IC50

5. 2. 3. 2 Beberapa Situs Binding

5. 2. 3. 3 Link Reseptor G-Protein

5. 2. 4 Percobaan Retardasi

5. 3 Aspek Praktis Studi Pengikatan Ligan

5. 3. 1 Persiapan Reseptor

5. 3. 2 Radioligan

5. 3. 3 Kondisi Inkubasi

5. 3. 3. 1 Inkubasi Medium

5. 3. 3. 2 Suhu

5. 3. 3. 3 Lama Inkubasi

5. 3. 3. 4 Jumlah Jaringan

5. 3. 4 Metode Pemisahan Bagian Terikat Dari Ligan Bebas

5. 3. 4. 1 Penyaringan

5. 3. 4. 2 Sentrifugasi

5. 3. 5 Penentuan Pengikatan Non Spesifik

5. 4 Analisis Data Pengikatan

5. 4. 1 Plot Scatchard

5. 4. 2 Plot Lineweaver-Burk

5. 4. 3 Plot Hill

5. 4. 4 Analisis Percobaan Kompetisi

5. 4. 5 Analisis Data Metode Kuadrat Non Linear

5. 5 Relevansi Hasil Studi Pengikatan

5. 6 Masalah

5.7 Bacaan Lebih Lanjut

5. 8 Solusi Terhadap Masalah

5. 1 PENDAHULUAN

Dalam bab ini, kita melihat cara dimana pengikatan ligan dengan

makromolekul bisa langsung diselidiki. Meskipun sebagian besar pusat perhatian

pada interaksi obat-obatan dan hormon dengan reseptor, pendekatan yang dilakukan

di sini dapat diterapkan untuk setiap proses yang sama - misalnya, kombinasi obat

dengan saluran ion atau sistem transportasi membran. Pengikatan ligan, termasuk

obat, pada protein plasma telah dipelajari selama lebih dari 50 tahun, namun studi

pengikatan sangat sedikit dari protein (misalnya, reseptor) dalam membran sel yang

lebih baru, setelah menjadi layak hanya bila cocok ligan berlabel radioaktif menjadi

tersedia. Penelitian ketat pertama pengikatan obat pada reseptor oleh Paton dan Rang

(1965), yang menyelidiki pengikatan 3 H-atropin pada reseptor muskarinik dalam

otot polos. Penggunaan obat radiolabel pada studi pengikatan radioligand sekarang

menjadi umum dan bagi banyak produsen farmasi merupakan hal penting untuk

melakukan proses penyaringan, menyediakan sarana cepat menentukan afinitas obat

baru untuk berbagai reseptor. Pelabelan obat dengan radioisotope adalah hal menarik

karena sangat kecil jumlah, sering serendah 1 fmol, dapat mudah dan diukur akurat.

Reseptor farmakologi juga tertarik dalam pengukuran konsentrasi ligan dengan

fluoresensi, tapi ini, tentu saja, membutuhkan ketersediaan atau sintesis ligan dengan

gugus yang sesuai, dan saat ini metode ini memerlukan konsentrasi ligan jauh lebih

tinggi. Fluoresensi dilakukan, Namun, memiliki utilitas tertentu dalam percobaan

kinetik, dimana perubahan fluoresensi yang terjadi pada pengikatan adalah langsung,

yang memungkinkan pengikatan untuk terus dipantau.

5. 1. 1 TUJUAN STUDI PENGIKATAN RADIOLIGAND

Ini termasuk:

Pengukuran konstanta kesetimbangan disosiasi yang merupakan nilai tertentu

dalam klasifikasi reseptor dan dalam studi struktur / kegiatan hubungan, di mana

dampak perubahan struktur kimia pada afinitas dapat diketahui

Pengukuran asosiasi dan tetapan laju disosiasi

Pengukuran kepadatan reseptor, termasuk perubahan dalam kepadatan reseptor

yang terjadi di bawah kondisi fisiologis atau patologis yang berbeda. Contohnya

termasuk pengurangan densitas adrenoreseptor-B yang terjadi dengan penggunaan

β agonis dalam pengobatan asma (down-regulation) dan peningkatan

adrenoreseptor B di otot jantung sebagai respon tiroksin. Kepadatan reseptor dapat

diukur baik secara langsung dalam jaringan sampel atau dalam jaringan utuh

dengan kuantitatif autoradiografi. Autoradiografi, di mana gambaran tentang

distribusi radiolabel di bagian jaringan yang diperoleh dengan menempatkan film

fotografi dalam kontak dengan jaringan, telah memberikan informasi yang

berharga pada pendistribusian berbagai reseptor di otak. Positron emission

tomography (PET) dan Single-photon-emission computerized tomography

(SPECT) memanfaatkan ligan berlabel dengan emitter positron lainnya

(misalnya, C) atau emitter gamma yang digunakan untuk menyelidiki kepadatan

reseptor atau reseptor hunian oleh obat secara vivo.

Pengakuan dan kuantifikasi subtipe reseptor yang mungkin jika ligan

subtypeselektif tersedia

Penggunaan radioligands dalam pemurnian kimia reseptor. Di sini, radioligand

terikat memungkinkan reseptor untuk dilacak melalui berbagai langkah pemurnian

- misalnya, dalam fraksinasi eluen dari kolom pemisahan. Dalam percobaan

tersebut, penting untuk radioligand yang akan terikat ireversibel pada reseptor.

Akhirnya, dimungkinkan untuk mendapatkan beberapa informasi yang tak

terbatas mengenai mekanisme aksi agonis dari bentuk kurva pengikatan. Misalnya,

seperti yang dibahas kemudian, pengikatan beberapa agonis dipengaruhi oleh

guanosin trifosfat (GTP), segera menunjukkan keterlibatan dari G-protein dalam

mekanisme transduksi.

5. 1. 2 TATA NAMA

Dibandingkan dengan konvensi yang diadopsi untuk membahas hubungan

antara konsentrasi obat dan respon (Bab 1), Sebuah terminologi yang agak berbeda

telah berkembang untuk studi pengikatan ligan.

R : Situs pengikatan , paling sering reseptor sesungguhnya (tapi cukup sering dengan

istilah reseptor-diterapkan pada situs pengikatan)

L: ligan radiolebel yang mengikat secara langsung diukur, L bisa menjadi agonis

atau antagonis atau bahkan saluran blocker, dll

I : Sebuah inhibitor pengikatan L, I bisa menjadi agonis atau antagonis

B : Sering digunakan untuk menunjukkan jumlah radioligand terikat, Bmax,

Kapasitas pengikatan maksimum K1, K1 : Konstanta kesetimbangan disosiasi untuk

pengikatan L dan saya (konstanta afinitas s) Kd : Digunakan lebih umum untuk

konstanta kesetimbangan disosiasi ligan apapun

5. 1. 3 SPESIFITAS PENGIKATAN

Satu pertimbangan yang sangat penting dalam studi pengikatan adalah sejauh

mana pengikatan diukur dari radioligand mewakili asosiasi dengan reseptor atau situs

lain yang menarik. (Dalam studi fungsional, ini tidak sulit, karena respon hanya dapat

ditimbulkan oleh pengikatan agonis pada reseptor dan, untuk antagonisme kompetitif,

setidaknya, ada kemungkinan bahwa antagonis juga berikatan dengan reseptor.)

Selalu pada studi pengikatan, penyerapan radioligand dengan komponen jaringan

lainnya terjadi (kecuali, pengikatan dimurnikan, protein terlarut sedang diselidiki).

Pengikatan pada reseptor biasanya disebut pengikatan spesifik , sedangkan

pengikatan pada komponen non-reseptor disebut sebagai pengikatan non spesifik.

Pengikatan non spesifik mungkin disebabkan:

1. Ligan terikat ke situs lain dalam jaringan (misalnya, reseptor lain, enzim atau

membrane transpor). Sebagai contoh, beberapa antagonis muskarinik juga akan

mengikat reseptor histamine dan beberapa ligan adrenoreseptor juga akan

mengikat neuronal dan extraneuronal mekanisme penyerapan untuk noradrenalin.

Serapan tersebut mungkin akan dianggap benar "spesifik," tetapi tidak mengikat

kepentingan utama kepada penyidik. Tidak seperti sumber pengikatan non

spesifik, pengikatan ini akan saturable, meskipun mungkin diharapkan menjadi

afinitas rendah dan akan meningkat dalam mode sekitar linier selama rentang

konsentrasi ligan yang digunakan. Jika karakteristik pengikatan non spesifik

semacam ini yang mapan, dimungkinkan untuk menghilangkannya dengan

menggunakan selektif bloker (misalnya, dengan menggunakan inhibitor spesifik

dari proses serapan-1 noradrenalin).

2. Distribusi ligan ke dalam komponen lipid (misalnya, membran sel) atau

penyerapan ke dalam sel utuh atau vesikel membrane.

3. Ligan bebas yang tak lepas dari ligan terikat selama percobaan fase pemisahan,

termasuk ligan terikat dengan pelet filter atau terjebak dalam membran atau sel

selama sentrifugasi

Tidak seperti kategori 1 di atas, pengikatan non spesifik yang timbul dari

kategori 2 dan 3 akan nonsaturabel dan akan meningkat secara linear dengan

konsentrasi radioligand. Pengikatan non spesifik tipe 1, 2 dan radioligand terjebak

dalam pelet harus meningkat secara proporsional dengan jumlah jaringan yang

digunakan dalam reaksi pengikatan, pengikatan pada filter dan tidak Seharusnya

pada dinding tabung sentrifugasi. Jika penyidik beruntung, dalam pengikatan non

spesifik kategori 1 adalah linier selama rentang konsentrasi radioligand digunakan,

maka jenis pengikatan untuk semua kategori hanya bergabung membentuk satu,

komponen non spesifik. Pengikatan non spesifik biasanya diperkirakan dengan

mengukur pengikatan radioligand di hadapan agen yang diyakini mengikat selektif

pada reseptor, pada konsentrasi yang ditentukan untuk mencegah semua pengikatan

spesifik tanpa modifikasi yang cukup oleh pengikatan non spesifik mengikat (rincian

lebih lanjut dijelaskan pada Bagian 5.3.5).

5.2 MODEL PENGIKATAN RADIOLIGAND

Empat jenis studi ikatan-ligand akan dibahas: (1) saturasi, (2) kinetik, (3)

kompetisi,

dan (4) retardasi

5. 2. 1 SATURASI

Percobaan ini memeriksa pengikatan radioligand pada kesetimbangan langsung

dan dapat memperkirakan KL dan Bmax. Awalnya, kami menganggap reaksi

sederhana:

Ini merupakan pengikatan terisolasi dan akan berlaku untuk pengikatan

kompetitif antagonis (atau penghambat saluran) yang menghasilkan perubahan

struktural signifikan pada reseptor. (kasus ini untuk agonis harus menghasilkan

perubahan seperti ini, sering kali merupaka isomerisasi, untuk mengaktivkan). Ikatan

pada kesetimbangan diberikan oleh persamaan berikut (setara dengan Pers. (1.2)):

Atau,

Satuan B adalah pmol.mg protein-1, pmol.mg dry tissue-1, dll. Sebuah kurva B

dan [L] membentuk hiperbola persegi panjang, persis sama dengan kurva

menggambarkan reseptor hunian disajikan dalam Bab 1, Gambar 1.1. Mudah pada

poin ini untuk mempertimbangkan pengikatan non spesifik. Idealnya, pengikatan non

spesifik harus sepenuhnya independen dengan pengikatan spesifik, sehingga total

penyerapan radioligand oleh jaringan harus merupakan jumlah sederhana dari dua.

Jika kita bisa berasumsi bahwa pengikatan nonspesifik adalah fungsi linier dari

konsentrasi ligan, maka pengikatan yang diamati dapat diberikan oleh:

Dimana c adalah konstan. Hubungan antara total spesifik, dan pengikatan non

spesifik diindikasikan pada Gambar 5.1.

Dalam prakteknya, total dan pengikatan non spesifik diukur rentang konsentrasi L

yang

akan memungkinkan pengikatan spesifik dengan pendekatan kejenuhan. Analisis

percobaan saturasi untuk mendapatkan perkiraan KL dan Bmax dijelaskan kemudian.

GAMBAR 5.1 Pengikatan radioligand pada persiapan reseptor biasanya

melibatkan komponen non spesifik di samping komponen spesifik, pengikatan

reseptor. Pada prinsipnya, setidaknya, pengikatan spesifik dapat diperkirakan dari

total pengikatan (T) dengan mengurangkannya dengan pengikatan non spesifik (NS).

(Kurva adalah teoritis, dengan Bmax = 5,6 fmol.mg protein-1

,KL= 45 nM, dan c = 0,0083 fmol.nM-1

.)

Sekarang ini berguna untuk mengingat koefisien Hill, yang telah dibahas secara

rinci dalam Bab 1. Dalam studi pengikatan, koefisien Hill,nH umumnya merupakan

cara mudah untuk menggambarkan langkah-langkah plot pengikatan spesifik

terhadap log dari konsentrasi ligan, umumnya tanpa ada upaya untuk menentukan

mekanisme yang mendasari. Dalam kasus yang paling sederhana, sebuah plot

pengikatan spesifik terhadap [L] dianalisa yang cocok dari persamaan berikut (setara

dengan Persamaan (1.6).):

Untuk reaksi biomolekuler sederhana mengikuti hukum aksi massa, nH, akan

menjadi kesatuan. Jika nH lebih besar dari 1, plot pengikatan spesifik terhadap log [L]

akan menjadi curam, jika kurang dari 1, maka akan dangkal. Dalam keadaan ini, plot

Hill (lihat Bab 1) akan memiliki slop yang lebih baik dari satu.

5. 2. 1. 1 Beberapa Situs Pengikatan

Hal ini, tentu saja, sangat mungkin bahwa ada lebih dari satu jenis situs

pengikatan spesifik untuk radioligand. Sebagai contoh, subtipe reseptor mungkin ada

(subtipe reseptor 5HT, adrenoreseptor, dll) atau fungsi situs pengikatan sangat

berbeda. Beberapa reseptor ligan mungkin juga saluran bloker (misalnya,

tubokurarine) atau inhibitor serapan pemancar (misalnya, phenoxybenzamine).

Pertanyaan yang kemudian muncul, apakah situs berinteraksi atau tidak. Dalam kasus

ini hanya dua situs yang tidak berinteraksi, istilah tambahan hanya dapat ditambahkan

ke persamaan mengikat. Untuk jumlah pengikatan,

dimana subskrip 1 dan 2 menentukan dua situs (istilah lebih lanjut dapat ditambahkan

untuk komponen tambahan).

GAMBAR 5.2 Kurva teoritis untuk pengikatan spesifik persiapan radioligand

mengandung dua kelas situs pengikatan. Sebuah komponen berafinitas tinggi yaitu

Bmax dengan 25 fmol.mg-1

memiliki KL 20 nM. Komponen kedua, dengan Bmaks 45

fmol.mg-1

diberikan nilai KL bervariasi antara 20 dan 10.000 nM, seperti yang

ditunjukkan. Nilai KL untuk ke dua situs harus berbeda jauh sebelum dua komponen

menjadi jelas. (Data ditampilkan menggunakan skala konsentrasi baik linier dan

logaritmik.) Kurva tersebut untuk pengikatan spesifik tidak akan memanjang

menjadi hiperbola persegi panjang sederhana, meskipun dengan komponen yang

berbeda dapat dibedakan oleh mata akan tergantung pada perbedaan nilai KL dan

jumlah observasi serta keakuratannya. Teori kurva ditunjukkan pada Gambar 5.2.

untuk perbedaan yang relatif kecil pada nilai-nilai KL dari dua lokasi, kurva

tampaknya memiliki satu komponen, tetapi analisis akan menunjukkan koefisien Hill

rendah. Komponen terpisah yang terungkap lebih jelas ketika skala logaritmik

digunakan untuk konsentrasi radioligand. Dengan demikian, dua komponen yang

sangat jelas di panel sebelah kanan dari Gambar 5.2.

5. 2. 1. 2 INTERAKSI SITUS

Dalam beberapa kasus (misalnya, reseptor asetilkolin nikotin), situs pengikatan

diduplikasi pada subunit identik dimasukkan ke dalam protein multimerik, yang

memungkinkan untuk mengikat satu situs yang dapat mempengaruhi untuk mengikat

lainnya. Pada prinsipnya kedua tempat tersebut dapat berperilaku cara yang identik,

tetapi lebih mungkin penggabungan subunit ke multimer assimetrikal (sebuah

heteropentamer untuk reseptor nikotinik) memperkenalkan kendala yang

menyebabkan perbedaan afinitas untuk ligan. Yang paling penting adalah

kemungkinan bahwa kedudukan suatu situs oleh ligan akan meningkatkan atau

menurunkan afinitas untuk pengikatan lainnya (yaitu, menunjukkan kooperasi positif

atau negatif). Berikut ini memberikan representasi paling sederhana dari model dua-

pengikatan-situs:

Skema ini juga dibahas dalam Bab 1 (pada Lampiran 1.2C) dan dalam Bab 6.

Pada skema ini, dua binding site dianggap identik. adalah keadaan aktif

diproduksi ketika L adalah agonis. Bentuk kurva binding tergantung pada ukuran

relatif K1 dan K2. Ketika K1 > K2, kooperatifitas positif akan terjadi (yaitu,

pengikatan ke situs pertama akan meningkatkan kedua); ketika K1 < K2 ,

Kooperatititas negatif akan terjadi. Gambar 5.3 menggambarkan bentuk kurva

pengikatan diprediksi oleh Persamaan. (1.14) untuk berbagai rasio dari K1 ke K2.

Dalam percobaan, adalah mungkin bahwa pengikatan radioligand yang dihambat

tidak terjadi persaingan di lokasi umum, tetapi dengan inhibitor mempengaruhi

pengikatan jarak jauh melalui interaksi dengan bagian yang berbeda dari molekul

reseptor .

GAMBAR 5.3 Pengikatan radioligand untuk reseptor mengandung dua situs pengikat

identik (skema yang ditunjukkan pada Persamaan. (5.7) tetapi mengabaikan

isomerisasi). Pengikatan molekul ligan pertama diberi K1 dengan 20 nM. Nilai K2

untuk mengikat molekul ligan kedua diberikan rentang nilai untuk mewakili berbagai

tingkat kooperatititas, dari sangat positif (0,05 nM) ke sangat negatif (2000 nM).

Seperti digambarkan dalam A, untuk skala logaritmik konsentrasi, kooperatititas

positif mencuramkan kurva, sedangkan kooperatititas negatif membuatnya dangkal.

Dua komponen menjadi sangat jelas untuk nilai yang lebih besar dari K2. Dalam

panel B, skala konsetrasi linear telah diperluas untuk menunjukkan kaki S-berbentuk

kurva pengikatan, indikasi positif kooperatititas. Plot Hill C menunjukkan bahwa

dengan perbandingan besar positif kooperatititas nH mendekati 2 untuk

konsentrasi menengah radioligand, menjadi kesatuan pada kedua konsentrasi yang

sangat tinggi atau sangat rendah (lihat Persamaan. (1.15)).

5. 2. 1. 3 Agonis

Pembahasan sebelumnya dari percobaan saturasi dianggap sebagai langkah

pengikatan dalam isolasi, namun, untuk agonis agar menghasilkan respon jaringan,

harus ada perubahan dalam reseptor (isomerisasi) - Misalnya, perubahan konformasi

untuk membuka saluran ion integral atau untuk mempromosikan hubungan dengan

G-protein. Komplikasi yang timbul dengan agonis akan dibahas saat ini

5. 2. 1. 3. 1 Aktivasi Reseptor Model del Castillo-Katz

Model ini di bawah ini telah dibahas dalam Bab 1, Bagian 1.4.4 ke 1.4.5.

Dalam sebuah studi pengikatan ligan, pengikatan meliputi AR * serta AR. Persamaan

yang relevan kemudian adalah:

Dalam persamaan ini, A telah digunakan dalam preferensi untuk L untuk

menekankan bahwa agonis sedang dipertimbangkan. Persamaan mempertahankan

bentuk hiperbola persegi panjang, 50% hunian terjadi ketika [A] = KA / (1 + E). KA /

(1 + E) dengan demikian keseimbangan yang efektif konstan dan sesuai disebut

sebagai Keff. Hal yang penting untuk dicatat adalah bahwa pengukuran pengikatan

tidak memberikan perkiraan KA sendiri. Keff lebih kecil dari KA, sehingga langkah

isomerisasi meningkatkan afinitas (berlaku menempatkan reseptor pada tempat

utama).

Komplikasi lain adalah desensitisasi reseptor. Desensitisasi dari reseptor

asetilkolin nikotin dikaitkan dengan reseptor, terutama dalam bentuk aktif nya,

berubah secara spontan bentuk tidak aktif. Berikut ini adalah skema menggabungkan

kemungkinan kepekaan daerah reseptor

(Skema ini didasarkan model siklik desensitisasi Katz-Thesleff , dimodifikasi untuk

menggabungkan pengikatan dua molekul asetilkolin dan termasuk langkah

isomerisasi.) Jelaslah dari skema ini bahwa kompleks agonis reseptor terdiri dari

berbagai bentuk dan persamaan menggambarkan bahwa pengikatan yang sejalan

kompleks. Untuk reseptor asetilkolin nikotinik ditemukan bahwa pengikatan agonis

dengan reseptor peka (RD) dengan afinitas tinggi)

5. 2. 1. 3. 2 RESEPTOR AKTIVASI MODEL TERNARY KOMPLEKS

Model berikut telah diperkenalkan pada Bab 1 (Bagian 1.4.6):

ARX, tiga spesies bereaksi, adalah kompleks ternery. Skema ini sering

digunakan untuk menggambarkan tanggapan G protein mediasi, ketika X digantikan

oleh G, tetapi jelas merupakan penyederhanaan yang berlebihan. Untuk misalnya,

tidak termasuk lokasi tambahan diperkenalkan oleh pengikatan GTP atau guanosin

difosfat (GDP). Dari sudut pandang penelitian pengikatan ligan, kita perlu mencatat

bahwa pengukuran pengikatan akan mencakup baik AR dan ARX. Persamaan yang

memberikan konsentrasi terikat (AR + ARX) pada kesetimbangan kompleks (dan

dalam kasus respon pasangan G-protein juga harus memperhitungkan konsentrasi

reseptor dan G-protein, seperti dibahas dalam Bab 1, dan GTP dan PDB). Sebuah

fitur khusus dari pengikatan agonis pada reseptor yang bergabung dengan G proteins

adalah bahwa konsentrasi GTP akan mempengaruhi kurva pengikatan. Pengikatan

agonis sering menunjukkan komponen dengan afinitas tinggi dan afinitas rendah, dan

GTP ditemukan untuk meningkatkan proporsi pada daerah afinitas rendah. Ini akan

dipertimbangkan lebih lanjut ketika membahas percobaan kompetisi.

5. 2. 2 STUDI KINETIK

Kedua onset pengikatan, ketika radioligand ini pertama kali diterapkan, dan

offset ketika disosiasi dipromosikan, dapat dipelajari secara langsung. Persamaan

kinetik yang relevan berkaitan dengan Bimolekular sederhana interaksi ligan dengan

reseptor disajikan dalam Bab 1, Bagian 1.3.

5. 2. 2. 1 Pengukuran Konstanta Disosiasi, k-1

Untuk mengukur konstanta tingkat disosiasi, semua yang diperlukan, pada

prinsipnya, adalah pertama untuk mengamankan hunian dari reseptor oleh radioligand

dan kemudian untuk mencegah hubungan lebih lanjut, baik dengan menambahkan

agen bersaing dalam konsentrasi yang cukup atau dengan menurunkan [L] substansial

oleh dilusi. Jumlah obat yang terikat pada reseptor diukur pada waktu tertentu setelah

memulai disosiasi bersih dan, untuk model sederhana dibahas dalam Bagian 1.2 dan

1.3 dari Bab 1 yang akan menunjukkan penurunan eksponensial.

B0 dan Bt adalah jumlah terikat awalnya (pada t = 0) dan pada waktu tertentu (t)

setelah memulai disosiasi. Sebuah plot logeBt terhadap t adalah linier dengan

kemiringan -k-1 ; k-1 dengan demikian dapat diperkirakan langsung dari kemiringan

plot ini atau dapat diperoleh dengan nonlinier kuadrat-kurva pada Persamaan. (5.12).

Itu selalu diinginkan untuk kemiringan logeBt terhadap t untuk mendeteksi non-linear

yang mungkin mencerminkan beberapa situs pengikatan atau adanya lebih dari satu

tempat yang diduduki reseptor.

5. 2. 2. 2 Pengukuran Konstanta Disosiasi, k+2

Untuk reaksi biomolekuler sederhana yang melibatkan kelas tunggal situs

pengikatan, onset pengikatan juga harus mengandung istilah eksponensial. Demikian

di mana Bt adalah pengikatan pada waktu t, B ∞ adalah pengikatan pada saat

kesetimbangan, dan kon adalah onset laju konstanta. Namun, seperti yang ditunjukkan

dalam Bab 1, kon bukan merupakan ukuran sederhana k +1, melainkan:

Persamaan (5.15) dapat diubah menjadi bentuk linear:

dan kon dapat diperoleh dari kemiringan plot sisi kiri dari persamaan terhadap t.

Setelah kon diketahui, k+1 dapat diperkirakan setidaknya melalui tiga cara yang

berbeda. Pertama, perkiraan independen k-1 dapat diperoleh dari studi pemisahan

seperti dijelaskan di atas, di mana, dari Persamaan. (5.15), k +1 = (kon - k-1) / [L].

Kedua, kon dapat diukur pada beberapa konsentrasi L yang berbeda dan sebidang kon

terhadap [L] didasarkam pada Pers. (5.15), k +1 diberikan langsung oleh kemiringan.

Plot ini juga akan memberikan perkiraan k-1. Ketiga, adalah kemungkinan untuk

melakukan simultan nonlinier kuadrat-fit dari keluarga kurva onset (diperoleh dengan

menggunakan konsentrasi berbeda dari L), memberikan perkiraan k +1, k-1, dan Bmax

(Soal 5.2 memberikan kesempatan untuk menghitung konstanta laju peningkatan).

Dalam beberapa kasus pengikatan situs atau jika isomerisasi kompleks ligan-

reseptor , onset dan kurva akan mengimbangi multiexponential. Secara umum

diasumsikan bahwa pengikatan spesifik akan terjadi dengan cepat, dan ini tentu harus

jadi untuk penarapan sederhana dalam membran sel atau pelet. Namun, jika

pengikatan spesifik sangat cepat atau pengikatan nonspesifik sangat lambat (mungkin

mencerminkan penyerapan ligan oleh sel), maka waktu pengikatan spesifik juga harus

memperlihatkan kemungkinan penilaian yang akurat tentang terjadinya pengikatan

spesifik. Perhatikan juga, bahwa onset pengikatan ligan akan diperlambat dengan

adanya inhibitor, sebuah fenomena yang didapatkan pada percobaan retardasi

(dibahas dalam Bagian 5.2.4).

GAMBAR 5.4 Dalam ilustrasi ini dari sebuah percobaan kompetisi, konsentrasi

tetap radioligand, dengan tidak adanya inhibitor, menghasilkan pengikatan spesifik

B0. Pengikatan spesifik pada kompetitif inhibitor dilambangkan oleh BI. Jumlah

konstan pengikatan non spesifik diasumsikan ada. Konsentrasi inhibitor yang

mengurangi pengikatan spesifik sebesar 50% disebut sebagai IC50

5. 2. 3 PERCOBAAN KOMPETISI

Tentu saja, percobaan saturasi hanya mungkin bila bentuk radiolebel dari ligan

tersedia. Percobaan Kompetisi, di sisi lain, sangat berguna dalam memungkinkan

penentuan konstanta disosiasi untuk obat yang tidak berlebel yang bersaing untuk

situs pengikatan dengan ligan yang tersedia dalam bentuk label. Pendekatan ini telah

banyak diadopsi oleh industri farmasi sebagai sarana cepat menentukan afinitas

senyawa baru untuk reseptor khusus untuk itu suatu radioligand yang ditandai

tersedia.

Pada percobaan kompetisi, jumlah tetap radioligand, umumnya pada konsentrasi di

bawah KL, adalah diseimbangkan dengan persiapan reseptor pada berbagai

konsentrasi inhibitor yang tidak ditandai I. Dalam studi ini, jumlah radioligand terikat

biasanya diplot terhadap log [I]. Gambar 5.4 memberikan contoh untuk kasus

sederhana dimana radioligand dan inhibitor bersaing secara reversibel untuk situs

kelas tunggal. Dalam ilustrasi ini, tingkat konstan pengikatan nonspesifik belum

dikurangi, sedangkan di sebagian besar studi yang dipublikasikan itu akan. Jumlah

pengikatan non spesifik tentu saja bisa didefinisikan dengan menerapkan konsentrasi

tinggi inhibitornya, tetapi jika agen bersaing untuk pasokan pendek, mungkin untuk

menggunakan inhibitor karakteristik lain untuk tujuan yang sama. Dua fitur utama

kurva ini adalah posisi sepanjang sumbu konsentrasi dan kemiringannya. Posisi

sepanjang sumbu konsentrasi konvensional ditunjukkan oleh IC50, konsentrasi

inhibitor yang mengurangi pengikatan spesifik sebesar 50%. Diprediksi hubungan

(lihat juga pers. (1.48)) antara jumlah pengikatan spesifik pada I (BI) dan [I]

diberikan oleh:

Asalkan nilai untuk KL tersedia, adalah mungkin untuk menggunakan persamaan ini

untuk mendapatkan nilai untuk KI, kesetimbangan disosiasi konstan untuk inhibitor,

dengan nonlinier analisis kuadrat- dari kurva perpindahan. Atau, KI dapat dihitung

dari IC50, yang dapat diperoleh dengan interpolasi sederhana dengan mata dari plot

Hill atau dengan fitting kurva untuk persamaan dari jenis:

di mana B0 adalah pengikatan spesifik yang diamati tanpa adanya persaingan ligand

6. 2. 3. 1 Hubungan antara K1 dan IC50

B0 diberikan oleh persamaan (5.3):

dan, menurut definisi, ketika [I] = IC50, BI = 0.5B0, sehingga dari Persamaan. (5.17):

dengan pembatalan dan penataan ulang:

Istilah 1 + ([L] / KL) sering disebut sebagai koreksi Cheng-Prusoff. Hal ini jelas dari

analisis ini bahwa IC50 tidak memberikan perkiraan langsung KI kecuali [L]

sangat rendah, ketika IC50 cenderung ke KI. Sama seperti dengan percobaan saturasi,

situasi akan menjadi lebih rumit oleh kehadiran kelas yang berbeda dari situs

pengikatan (misalnya, subtipe reseptor) dan dengan keterlibatan G-protein dalam

pengikatan agonis.

5. 2. 3. 2 Beberapa Situs Binding

Pengaruh beberapa situs pengikatan pada kurva perpindahan akan ditentukan

oleh afinitas relatif dari radioligand dan penggantian agen untuk berbagai situs.

Mengingat situasi sederhana dimana radioligand untuk afinitas yang sama pada

masing-masing situs (misalnya, propranolol untuk adrenoreseptor-β), perpindahan

kurva untuk inhibitor akan menampilkan dua komponen hanya jika nilai KI untuk

pengikatan inhibitor untuk dua situs yang cukup berbeda dan jika pengukuran

perpindahan akurat dan membuat lebih dari satu rentang konsentrasi I (lihat Gambar

5.2 dan Bagian 5.4.4).

GAMBAR 5.5 Pengaruh GTP pada kurva pengikatan kompetisi isoprenalin dan

propranolol. Membran disiapkan dari L6 mioblas yang diinkubasi dengan 125I-

iodopindolol (50 pM) pada isoprenalin atau propanolol dengan atau tanpa 100 µM

GTP selama 90 menit pada suhu 25 °C. GTP tidak berpengaruh pada pengikatan

antagonis tapi menggeser kurva untuk perpindahan oleh agonis ke kanan (dengan

menghapuskan komponen pengikatan afinitas tinggi). (Digambar ulang menggunakan

data Wolfe, BB dan Molinoff, PB, dalam Buku Pegangan Farmakologi

Eksperimental, Trendelenburg, U. dan Weiner, N., Eds., Springer-Verlag, Berlin,

1988, bab 7.)

5. 2. 3. 3 Link Reseptor G-Protein

Seperti telah disebutkan, GTP mempengaruhi pengikatan agonis pada reseptor

pasangan G-protein, yang telah banyak diteliti karena cahaya itu bisa melempar pada

mekanisme kerja reseptor tersebut. Reseptor ini sering menunjukkan dua daerah yang

mengikat agonis dengan afinitas yang berbeda. Interaksi G-protein dengan reseptor

dibahas dalam Bab 7, dan di sini hanya perlu dicatat bahwa bentuk afinitas tinggi

reseptor bergabung dengan G-protein. Dalam model yang paling sederhana, ketika

GTP menggantikan GDP pada subunit α, G-protein pecah melepaskan α-GTP dan βγ

subunit, yang memediasi efek seluler agonis. Reseptor kemudian berdisosiasi,

kembali kepada daerah afinitas rendah. Oleh karena itu, dengan tidak adanya GTP,

proporsi yang signifikan dari reseptor akan berada pada daerah afinitas tinggi, tetapi

kehadirannya akan mengadopsi daerah-afinitas rendah. Hasil "pergeseran GTP"

diilustrasikan pada Gambar 5.5. Perhatikan bahwa ini hanya berlaku untuk

pengikatan agonis, seperti antagonis tidak mempromosikan sambungan pada reseptor

G-protein. Jika ada konsentrasi yang relatif rendah dari G-protein sehingga habis oleh

asosiasi dengan reseptor, maka kurva persaingan untuk agonis tanpa GTP mungkin

menunjukkan dua komponen, seperti pada gambar.

5. 2. 4 PERCOBAAN RETARDASI

Hal ini berguna untuk mempertimbangkan varian tertentu dari percobaan

pengikatan kompetitif yang telah digunakan terutama untuk menyelidiki reseptor

asetilkolin nikotin. Pada intinya, adalah mungkin untuk menentukan konstanta

kesetimbangan disosiasi inhibitor kompetitif irreversibel dengan pengurangan

produksi dalam tingkat pengikatan suatu radioligand ireversibel (misalnya α-

bungarotoxin). Dalam prakteknya, waktu pengikatan ligan ireversibel dipelajari

dengan ada atau tidaknya inhibitor. Hasil yang diharapkan ditunjukkan pada Gambar

5.6.

GAMBAR 5.6 percobaan Retardasi. Sebuah inhibitor reversibel akan memperlambat

laju asosiasi ligan ireversibel dengan reseptor. Kurva ini telah dibangun sesuai

dengan Persamaan. (5.26) dengan menggunakan nilai numerik yang ditunjukkan

dalam gambar. Ini telah dipilih untuk menggambarkan efek antagonis, seperti

tubokurarine, pada pengikatan α-bungarotoxin pada reseptor nikotin otot rangka.

Ketika ligan ireversibel diterapkan dengan sendirinya, perubahan proporsi situs

diduduki, PLR, dengan waktu akan diberikan oleh:

di mana 1 - PLR (t) adalah proporsi reseptor yang tersisa bebas dan tersedia untuk

mengikat dengan L. Jika PLR = 0 pada t = 0, solusinya adalah:

Persamaan ini adalah aplikasi dari Pers. (1.22) ke ligan ireversibel (yaitu, k-1 = 0), dan

dalam jangka panjang menjalankan semua reseptor akan ditempati sehingga PLR (∞)

adalah kesatuan. Konstanta untuk tingkat equilibrium demikian diberikan oleh k+1

[L]. Untuk kasus di mana pengikatan dipelajari dengan adanya inhibitor, Persamaan.

(5.21) menjadi:

Disubstitusi ke dalam persamaan (5.23):

Solusi untuk PLR = 0 pada t = 0 adalah:

Onset laju konstanta (. Lihat Persamaan (5.22)) dikurangi dengan faktor 1 - [I] / (KI +

[I]). Jika tingkat konstanta untuk pengikatan ligan ireversibel ditentukan dengan

ketiadaan dan adanya inhibitor dan dilambangkan masing-masing k0 dan kI maka:

Dengan demikian, perkiraan konstanta kesetimbangan dapat ditentukan dengan

memberikan konsentrasi tertentu I

5. 3 ASPEK PRAKTIS STUDI PENGIKATAN LIGAND

Mayoritas studi pengikatan memperkirakan jumlah pengikatan oleh pemisahan

terikat dari ligan bebas, baik menggunakan sentrifugasi maupun penyaringan, diikuti

dengan pengukuran kuantitas terikat. Tahap pemisahan, bagaimanapun, dapat

dihindari dalam tes kedekatan kilau (SPA). Tes berlaku untuk ligan yang

mengandung radioisotop (misalnya tritium) yang menghasilkan energi rendah partikel

β yang berjalan pada jarak yang sangat pendek (kurang dari 10 m) dalam cairan.

Dalam satu bentuk SPA, persiapan reseptor amobil pada mikrobeads mengandung

molekul skintillant. Molekul-molekul skintillant mampu mendeteksi radiasi β yang

berasal dari radioligand terikat pada reseptor yang terletak pada permukaan manik-

manik tetapi tidak akan menanggapi radiasi dari molekul bebas radioligand relatif

lebih jauh dalam larutan. Untuk teknik ini agar dapat bekerja, itu harus mungkin

untuk beberapa persiapan reseptor untuk manik-manik dengan cara yang tidak

mengganggu pengikatan ligan. Asalkan hal ini dapat dilakukan, penghitungan

kedekatan kilau menyediakan metode sederhana untuk mendeteksi pengikatan,

selanjutnya akan digunakan untuk mengikuti waktu pengikatan sedangkan campuran

reaksi tetap dalam pencacah sintilasi. Teknik menggunakan fluoresense berlabel ligan

(misalnya, polarisasi fluoresensi dan teknik resonansi fluoresen transfer energi)

sedang dikembangkan dan juga tidak perlu memisahkan ikatan dari ligan bebas.

Teknik ini memiliki keuntungan tambahan untuk menghindari bahaya yang

berhubungan dengan penggunaan dan pembuangan radioisotop.

5. 3. 1 PERSIAPAN RESEPTOR

Kebanyakan reseptor (pengecualian PADA reseptor steroid yang

mempengaruhi transkripsi DNA) terletak pada permukaan sel, dan dimurnikan

membran sel dengan demikian pilihan persiapan. Ketika sebuah jaringan

dihomogenisasi, bagaimanapun, setiap fraksi membran baik terisolasi mungkin berisi

membran dari organel intraseluler selain membran sel dari semua jenis sel dalam

jaringan. Dengan demikian, membran otak akan berisi membran tidak hanya dari

neuron tetapi juga dari glia, serta otot polos dan sel endotel pembuluh darah. Ini

mungkin, bagaimanapun, mungkin untuk mempersiapkan membran dari persiapan sel

murni (misalnya, baris sel atau sel diperoleh bukan dari agregasi jaringan dengan

enzim dan kemudian mengalami pemurnian dengan sentrifugasi diferensial). Semakin

banyak penelitian tentang pengikatan situs dilakukan pada membran dari baris sel

transfer dengan kloning gen reseptor manusia, dan berbagai reseptor kloning tersebut

sekarang tersedia untuk skrining obat secara rutin.

Sebuah fitur pada gangguan sel adalah bahwa hal itu dapat mengekspos

reseptor yang tidak original pada permukaan sel. Beberapa reseptor akan telah

melewati proses penyisipan sementara yang lain mungkin telah terendositosis. Hal ini

akan mengarah pada kepadatan reseptor permukaan sel. Sebaliknya, membran sel

dapat membentuk vesikel yang dapat memiliki baik di luar atau di dalam-orientasi.

Reseptor permukaan sel di dalam vesikel tidak akan mengikat ligan kecuali dapat

menembus vesikel tersebut. Hal ini biasanya diperlukan untuk mencuci persiapan

membran beberapa kali untuk menghilangkan endogen yang mungkin mempengaruhi

pengikatan (misalnya, enzim proteolitik, ligan endogen). Salah satu keuntungan

penting dari membran sel yang sering dipersiapkan dapat disimpan dibekukan selama

berminggu-minggu tanpa perubahan apapun dalam sifat pengikatan.

Penggunaan membran sel dapat dikritik atas dasar bahwa reseptor telah berganti

dari lingkungan alami mereka dan tidak akan lagi tunduk pada mekanisme kontrol

selular, karena Misalnya, fosforilasi domain intraseluler dapat dimodifikasi. Masalah-

masalah ini dapat dihindari dengan menggunakan sel utuh untuk studi pengikatan

situs. Irisan jaringan (misalnya, otak, jantung) yang digunakan, seperti sel diisolasi

dari jaringan yang dipotong oleh kolagenase atau tripsin pencernaan. Baris sel

permanen juga dapat digunakan. Namun, kemungkinan bahwa aplikasi enzim

proteolitik untuk membantu disagregasi jaringan dapat memodifikasi reseptor adalah

beberapa kekhawatiran. Bila menggunakan sel utuh, juga mungkin bahwa beberapa

ligan akan diangkut ke dalam sel, yang mengarah ke pengikatan non spesifik. Selain

itu, beberapa sel dapat mengandung enzim yang memetabolisme radioligand tersebut.

Di sisi lain, karena sel-sel harus dijaga dalam kondisi fisiologis yang cocok, hasil

pengikatan adalah mungkin, lebih mungkin untuk situasi in vivo sesungguhnya. Studi

pemurnian , reseptor larut kurang dan perhatian ketidakpastian bahwa penghilangan

dari lingkungan lipid dari membran sel dapat mengubah pengikatan.

5. 3. 2 RADIOLIGAN

Meskipun metode kuadrat-kurva nonlinear memungkinkan kurva pengikatan

kompleks untuk dianalisis, komponen tunggal kurva akan menghasilkan perkiraan

yang lebih tepat pada parameter pengikatan. Jika, bagaimanapun, adalah tidak

mungkin untuk menghindari beberapa komponen, kurva akan lebih memuaskan jika

dianalisis pada masing-masing komponen disosiasi konstanta kesetimbangan yang

berbeda. Demikian, ada keuntungan yang jelas dalam menggunakan radioligands

selektif yang memiliki afinitas yang lebih besar untuk satu jenis situs pengikatan.

Sebuah afinitas tinggi juga diinginkan, karena memungkinkan pengikatan untuk

dipelajari pada konsentrasi rendah, yang hal lain dianggap sama, akan mengurangi

pengikatan non spesifik. Tingginya rasio spesifik dengan pengikatan non spesifik

akan mengurangi kesalahan dalam parameter estimasi. Sebuah afinitas tinggi,

Namun, juga memiliki konsekuensi bagi tingkat di mana pengikatan mencapai

keseimbangan. Asosiasi laju konstanta , k +1, memiliki batas atas, ditentukan oleh

teori tabrakan, dari sekitar 108 M-1sec-1, dari yang berikut bahwa ligan dengan

afinitas tinggi harus memiliki nilai k-1 sangat rendah. Dari Pers. (5.12) dan (5.15),

terlihat bahwa ini akan mengakibatkan kedua onset lambat (pada konsentrasi rendah

L yang digunakan) dan offset pengikatan lambat. Tingkat lambat offset

menguntungkan dalam pemisahan bagian dari ligan bebas dengan penyaringan,

dimana hal ini penting untuk memastikan bahwa langkah-langkah pencucian yang

dilakukan tidak menyebabkan disosiasi signifikan.

Radioligand juga harus memiliki aktivitas spesifik tinggi sehingga jumlah yang

terikat ligan yang sangat kecil dapat diukur secara akurat. Aktivitas spesifik, hanya

didefinisikan sebagai jumlah radioaktivitas, dinyatakan dalam becquerels (Bq) atau

curie (Ci) per mol ligan, tergantung pada paruh isotop yang digunakan dan jumlah

atom radioaktif dimasukkan ke dalam molekul ligan. Sebuah radioisotop dengan

waktu paruh pendek meluruh cepat sehingga banyak disintegrasi terjadi dalam satuan

waktu, menghasilkan aktivitas spesifik yang tinggi. Isotop yang paling sering

digunakan untuk pelabelan adalah 125I dan 3H, dengan waktu paruh 60 hari dan 12,3

tahun, masing-masing (label dengan 14C, dengan waktu paruh dari 5760 tahun, akan

menghasilkan aktivitas spesifik rendah). Ligan berlabel dengan atom tunggal baik 125I

atau 3H akan memiliki aktivitas maksimum masing-masing 2200 dan 29 Ci per

mmol,. Sebuah dasar berbeda antara label dengan 3H dengan 125I. Dengan 3H,

radioisotop dapat menggantikan atom hidrogen dalam molekul dengan hanya

perubahan signifikan dalam sifat kimia, memang, akan ada kemungkinan untuk

mengganti beberapa H oleh 3H tanpa perubahan signifikan dalam sifat kimia tapi

dengan keuntungan yang berguna dalam kegiatan tertentu. Sebaliknya, beberapa ligan

alami dan hampir semua obat tidak mengandung atom yodium yang dapat diganti

oleh 125I. Sebaliknya, perlu untuk menghasilkan derivat iodinasi yang akan memiliki

sifat kimia yang berbeda dan sangat mungkin afinitas yang berbeda untuk reseptor.

(Untuk alasan ini, biasanya untuk menggabungkan hanya satu atom 125I di masing-

masing molekul ligan.) Oleh karena itu, perlu untuk memeriksa bahwa turunan

diinginkan mempertahankan sifat dari senyawa induk. Dengan radioiodine, adalah

mungkin untuk mencapai 100% pelabelan isotop, karena mungkin untuk

mendapatkan 125I murni dan untuk memisahkan ligan berlabel dari kedua

uninkorporasi 125I-dan senyawa induk noniodin. Hal ini jelas penting untuk

memastikan bahwa label dikaitkan hanya dengan ligan dimaksud. Potensi masalah

termasuk kemungkinan yang mencemari zat mungkin juga telah diberi label dan

radioligand mungkin telah mengalami perubahan kimia selama penyimpanan. Ligan

radioaktif tinggi dapat mengalami kerusakan radiasi, dan adanya kotoran radioaktif

hampir pasti akan mengakibatkan penurunan rasio tertentu pengikatan spesifik dan

pengikatan non spesifik.

Bagi kebanyakan reseptor, baik radioligands hidrofilik dan hidrofobik yang

tersedia. Dalam beberapa kasus, ligan hidrofobik telah ditemukan untuk memberikan

perkiraan yang lebih tinggi Bmax, menunjukkan bahwa mereka memiliki akses ke

reseptor dalam sel yang menolak ligan hidrofilik. Ini dicontohkan oleh semakin besar

nilai Bmax yang diamati (dalam membran neuroblastoma) untuk reseptor muskarinik

ligan 3H-skopolamin (amina tersier) dibandingkan dengan 3H-N-methilskopolamin

(kuartener amonium). Perbedaan-perbedaan dalam akses terhadap reseptor

sebenarnya dapat dimanfaatkan untuk mempelajari internalisasi reseptor.

5. 3. 3 KONDISI INKUBASI

5. 3. 3. 1 INKUBASI MEDIUM

Pengikatan sel-sel utuh mesti dilakukan dalam larutan fisiologis, dan hasil

diperoleh maka sangat mungkin begisrkorelasi dengan studi fungsional. Ini mungkin

dapat untuk menghindari dimasukkannya protein (misalnya, albumin), karena protein

dapat juga mengikat radioligand tersebut sampai batas yang signifikan yang tidak

akan terdeteksi oleh pengukuran radioaktivitas supernatan yang diperoleh dari

sentrifugasi. Pengikatan pada membran, sebaliknya, cukup sering dilakukan dalam

larutan buffer sederhana (misalnya, 20 - atau 50-mM buffer Tris atau HEPES). Hal

ini jelas, bagaimanapun, bahwa afinitas beberapa ligan untuk reseptor meningkat

dalam larutan dengan kekuatan ionik yang rendah. Efek ini telah jelas menunjukkan

untuk reseptor kolinergik muskarinik. Pada prinsipnya, hal itu bisa dihindari dengan

memasukkan cukup NaCl untuk membuat inkubasi medium isotonik dengan kondisi

larutan fisiologis. Ion tertentu telah terbukti memiliki efek pada sistem reseptor

tertentu. Mg2 +, untuk misalnya, sering mempengaruhi pengikatan reseptor pasangan

G-protein, yang sesuai dengan yang efek yang dikenal pada aktivasi G-protein.

Ionisasi kelompok asam lemah atau basa di kedua reseptor dan ligan akan

dipengaruhi oleh pH dan kemungkinan untuk memodifikasi pengikatan. Oleh karena

itu, jika mungkin penelitian pengikatan dapat dilakukan pada pH fisiologis,

5. 3. 3. 2 SUHU

Suhu memiliki efek pada kedua tingkat reaksi dan konstanta kesetimbangan

disosiasi. kenaikan suhu akan meningkatkan tingkat kedua asosiasi dan disosiasi,

seperti yang ditunjukkan pada Tabel 5.1

untuk mengikat 3H-flunitrazepam untuk membran otak tikus. Efek pada

kesetimbangan disosiasi konstan kurang karena perubahan k +1 dan k-1 berada di

arah yang sama. Telahnditemukan untuk beberapa reseptor yang pengaruh suhu pada

afinitas lebih besar untuk agonis daripada antagonis. Tabel 5.2 menggambarkan hasil

untuk pengikatan adrenoreseptor β diperoleh Weiland et al. (1979). Disarankan

bahwa perbedaan dalam pengaruh suhu pada agonis dibandingkan dengan pengikatan

antagonis mencerminkan perubahan struktural dalam reseptor (isomerisasi) yang

terjadi dengan agonis tapi tidak antagonis. Belum diiadakan penyelidikan lebih baru

dari masalah ini, bagaimanapun, menegaskan umum adalah kesimpulannya.

Kejelasan hasil ini, mungkin tampak terbaik untuk mengukur pengikatan hanya

pada suhu fisiologis yang relevan, namun melakukan inkubasi pada suhu rendah

memiliki beberapa keuntungan. Misalnya, kerusakan proteolitik pada reseptor dan

pemecahan ligan, jika kondisi kimia tidak stabil, akan berkurang selama inkubasi

yang lama (meskipun keuntungan ini mungkin diimbangi dengan waktu inkubasi

yang lama).

5. 3. 3. 3 LAMA INKUBASI

Studi Equilibrium jelas memerlukan masa inkubasi yang cukup lama untuk

memungkinkan equilibrium yang ingin dicapai. Sebagaimana dibahas di atas, waktu

yang dibutuhkan akan lebih lama pada suhu yang lebih rendah. Sekarang sangat

tergantung pada afinitas ligan untuk reseptor. Seperti diuraikan sebelumnya, tingkat

konstan untuk awal pengikatan diberikan oleh k-1 + k +1 [L]. Jika k +1 diberi nilai 107

M-1

sec-1

, dapat diperkirakan bahwa untuk mencapai 97% dari kesetimbangan untuk

ligan dengan KL dari 100 pM, pada konsentrasi yang sesuai, akan membutuhkan

sekitar 1 jam pada suhu 37oC dan sebanyak 58 jam pada suhu 0

oC. Pengaruh

persaingan obat adalah untuk memperlambat laju equilibrium. Pertimbangan ini

menunjukkan keinginan untuk melaksanakan percontohan studi kinetik sebelum

pengukuran kesetimbangan rinci dibuat.

5. 3. 3. 4 JUMLAH JARINGAN

Tujuannya harus menggunakan materi yang cukup untuk memberikan rasio

spesifik untuk pengikatan nonspesifik tanpa menyebabkan deplesi signifikan dari

radioligand tersebut. Pengikatan non spesifik terkait dengan pengikatan pada filter

yang cenderung menjadi jumlah yang tetap pada setiap diberikan konsentrasi ligan,

sehingga meningkatkan jumlah reseptor sehingga meningkatkan rasio signal.

Konsentrasi tinggi reseptor mungkin, bagaimanapun, mengikat sebagian besar

radioligand yang ada dan mengurangi konsentrasi bebas. Deplesi tersebut merupakan

pertimbangan penting. Jika konsentrasi ligan bebas dapat akan diukur secara

langsung, ini harus dilakukan, dan konsentrasi yang diperoleh berlaku untuk

persamaan yang disajikan dalam bab ini. Sebuah alternatif, jika [L] tidak dapat

diukur, adalah untuk memperoleh persamaan yang memungkinkan untuk deplesi

yang timbul dari kedua pengikatan spesifik dan nonspesifik. Persamaan tersebut telah

disajikan oleh Hulme dan Birdsall (1992), tetapi beberapa asumsi yang dibuat selalu

mengalami penyederhanaan. Adalah lebih baik untuk mencoba merancang penelitian

sehingga deplesi yang tidak signifikan (katakanlah, <5%) sehingga dapat diabaikan.

5. 3. 4 METODE PEMISAHAN BAGIAN TERIKAT DARI LIGAN BEBAS

Untuk persiapan partikulat reseptor (sel utuh atau membran), biasanya untuk

memisahkan bagian terikat dari ligan bebas oleh salah satu sentrifugasi atau

penyaringan. (Untuk persiapan larutan reseptor, kesetimbangan dialisis,

menggunakan membran semipermeabel, atau filtrasi gel dapat digunakan.)

5. 3. 4. 1 PENYARINGAN

Pada waktu yang tepat, campuran reaksi baik tip atau ditarik oleh penghisap ke

filter dan supernatan segera disaring di bawah vakum. Filter, sering dibuat dari fiber

glass, harus mempertahankan semua reseptor persiapan, sementara pada saat yang

sama memungkinkan pemisahan yang cepat. Hal ini juga diperlukan untuk

memeriksa pengikatan ligan ke filter. Beberapa contoh "spesifik," pengikatan

saturable dari radioligand untuk filter dapat ditemukan dalam literatur. Persiapan

reseptor ditahan oleh filter biasanya dicuci dua sampai tiga kali dengan inkubasi

buffer volume kecil yang tidak mengandung radioligand untuk menghilangkan

radiolabel dangkal. Hal ini penting untuk meminimalkan disosiasi ligan terikat

selama pencucian ini. Hal ini dapat dicapai dengan menggunakan hanya beberapa,

mencuci cepat dan mencucinya dengan penyangga pada suhu rendah. Sistem filtrasi

komersial yang tersedia saat ini memungkinkan banyak sampel yang harus ditangani

secara bersamaan. Umumnya tidak digunakan peralatan filtrasi, bagaimanapun,

memungkinkan supernatan dikumpulkan untuk penentuan konsentrasi ligan bebas.

5. 3. 4. 2 SENTRIFUGASI

Inkubasi sering dilakukan dalam tabung plastik kecil, yang dapat disentrifugasi

langsung ke bentuk sel atau membran pelet dalam hitungan detik. Supernatan

kemudian dapat baik tipped off atau dihapus dengan pengisapan. Radioaktivitas

supernatan dapat diukur untuk menentukan konsentrasi ligan bebas. Setiap

supernatan yang tersisa pada permukaan pelet atau tabung dapat dikurangi dengan

mencucinya sekali lagi menggunakan penyangga dingin. Kebanyakan reseptor akan

berada dalam pelet dan tidak akan terkena larutan pencuci, sehingga disosiasi harus

dibatasi. Hal ini jelas penting bahwa pencucian tidak mengganggu pelet,

menyebabkan hilangnya reseptor. Dalam beberapa eksperimen yang menggunakan

sel utuh, pemisahan telah dicapai dengan melakukan inkubasi selama lapisan minyak

dengan kepadatan yang tepat. Pada waktu yang diinginkan, sel-sel sentrifugasi

melalui lapisan minyak, dengan hampir semua supernatan yang tersisa berada di

lapisan atas. Supernatan dan minyak kemudian dihilangkan oleh penghisap dan tidak

diperlukan langkah pencucian. Jika tabung plastik digunakan, ujung tabung berisi

pelet dapat dipotong, sehingga mengurangi perhitungan lebih lanjut karena

radioligand melekat pada dinding tabung. Akhirnya, radioligand terikat (pada filter

atau pelet) yang dihitung dengan menggunakan metode standar untuk pengukuran

radioaktivitas (biasanya perhitungan skintilasi).

5. 3. 5 PENENTUAN PENGIKATAN NONSPESIFIK

Pengikat non spesifik diperkirakan dengan mengatur campuran inkubasi

tambahan yang, di samping untuk radioligand tersebut, juga mencakup penggantian

agen untuk hampir menghilangkan reseptor pengikatan nonspesifik. Karena sebagian

besar penggantian agen yang digunakan untuk mendefinisikan pengikatan nonspesifik

bertindak kompetitif, perlu untuk menggunakan konsentrasi 100 sampai 1000 kali

lebih besar dari Kd nyauntuk memastikan bahwa konsentrasi yang lebih tinggi

radioligand yang tidak mengatasi hambatan tersebut. Hal ini juga penting untuk

memeriksa bahwa penggantian agen tidak mengurangi pengikat nonspesifik. Hal ini

mungkin lebih dari masalah jika bentuk yang tidak terlabeli dari radioligand sendiri

digunakan, karena itu, preferensi harus diberikan kepada penggantian agen kimia

yang berbeda. Ekstra kepastian bisa diperoleh jika nilai yang sama untuk pengikatan

non spesifik diperkirakan menggunakan lebih dari satu agen pengganti. Ini sering

terjadi dalam percobaan kompetisi dimana beberapa obat bersaing menghasilkan

penghambatan pengikatan maksimal identik, sehingga memberikan perkiraan yang

dapat diandalkan dari residu pengikat nonspesifik.

5. 4 ANALISIS DATA PENGIKATAN

Analisis percobaan pengikatan pada dasarnya memiliki dua langkah:

1. Pemeriksaan awal dan analisis data dengan mencoba untuk menetapkan model

yang cukup menggambarkan pengikatan. Misalnya, beberapa komponen atau

kooperatititas dapat diidentifikasi.

2. Estimasi model parameter (misalnya, Bmax, KL) dengan beberapa indikasi

kesalahan terkait dengan perkiraan.

Itu selalu diinginkan untuk plot data dalam jumlah radioligand terikat sebagai

fungsi salah satu dari konsentrasi radioligand (percobaan saturasi) atau konsentrasi

inhibitor (percobaan kompetisi). Sebuah skala konsentrasi logaritmik biasanya

memberikan gambaran yang lebih jelas dari hubungan, dengan penyimpangan dari

kurva monoton sederhana menjadi lebih jelas. Hal serupa juga terjadi untuk

menggunakan transformasi linear dari kurva pengikatan, baik untuk mengungkapkan

kompleksitas pengikatan dan untuk memberikan perkiraan awal parameter

pengikatan. Berbagai transformasi linear telah digunakan untuk menganalisis

percobaan saturasi, seperti sekarang akan diuraikan.

5. 4. 1 PLOT SCATCHARD

Persamaan (5.3) dapat disusun kembali untuk memberikan:

Plot Scatchard yang terikat bebas (B / [L], sumbu y, dengan terikat (B, sumbu

x) (plot Eadie-Hofstee adalah terikat dengan terikat/bebas). Jika persamaan ini

berlaku (yaitu interaksi pengikat bimolekular sederhana) ), titik data akan jatuh pada

garis lurus, lereng -KL-1

, Dan ditandai pada sumbu x (bila B / [L] = 0) akan

memberikan Bmax. (Lihat Gambar 5.10 untuk plot Scatchard dari data diberikan pada

Soal 5.1.). Kurva plot Scatchard dapat menunjukkan kooperatititas positif atau negatif

atau adanya situs (misalnya, subtipe reseptor) dengan afinitas yang berbeda untuk

ligan. Plot Scatchard, pada awalnya, telah menjadi sarana utama untuk memperoleh

perkiraan KL dan Bmax, tetapi hanya dapat digunakan jika data sangat baik dan

diperoleh garis lurus. Perlu dicatat bahwa regresi linier sederhana tidak harus

diterapkan dengan plot Scatchard, sebagai B dengan kesalahan yang terkait terjadi di

kedua nilai x dan y. Regresi linier plot Scatchard secara sistematis untuk Kd dan Bmax.

Karena nonlinear plot Scatchard bahkan lebih sulit untuk ditangani, sering ada

godaan kuat untuk menyesuaikan garis lurus untuk plot yang jelas tidak lurus.

Metode Nonlinear least-square (lihat di bawah) jauh lebih disukai untuk estimasi

parameter dengan batas kepercayaannya.

5. 4. 2 PLOT Lineweaver-Burk

Plot ganda timbal balik didasarkan pada penataan ulang lain dari Pers. (5.3):

Sebuah plot 1 / B vs 1 / [L] akan memberikan garis lurus menyediakan bahwa

Pers. (5.3) berlaku, ketika 1 B / = 0, maka 1 / [L] = -1/KL, dan ketika 1 / [L] = 0,

maka 1 / B = 1/Bmax. Sebuah plot Lineweaver-Burk ditunjukkan pada Gambar 5.10,

di mana ia dapat dibandingkan dengan plot Scatchard dari data yang sama. Plot

ganda -timbal balik menyebar data sangat kurang dan kalah dengan plot Scatchard.

5. 4. 2 PLOT HILL

Plot ini telah dibahas secara rinci dalam Bab 1 dan sebelumnya dalam bab ini. Namun

penataan lain Pers. (5.3) memberikan:

Plot Hill adalah log (B / (Bmax - B)) vs log [L]. Seperti disebutkan

sebelumnya, kemiringan plot Hill (koefisien Hill, nH) adalah utilitas tertentu. Jika

persamaan dipegang, garis lurus dengan kemiringan = 1 harus diperoleh. Sebuah nilai

yang lebih besar dari 1 dapat menunjukkan kooperatititas positif, dan kemiringan

kurang dari 1 baik kooperatititas negatif atau yang biasa adanya situs dengan afinitas

yang berbeda. Data Soal 5.1 juga disajikan sebagai plot Hill pada Gambar 5.10

5. 4. 4 ANALISIS PERCOBAAN KOMPETISI

Persamaan (5.18), yang menggambarkan pengikatan kompetitif, juga dapat diubah

menjadi bentuk Plot Hill:

Untuk interaksi kompetitif sederhana pada situs kelas tunggal , sebidang log

(BI / (B0 - BI)) vs log [I] akan linear dengan kemiringan -1 dan mencegat pada sumbu

x log (IC50). Perkiraan IC50 dapat digunakan untuk memperoleh nilai KI seperti yang

dibahas sebelumnya. Sebuah plot yang berbeda, setara dengan plot Eadie-Hofstee

untuk percobaan saturasi, juga telah digunakan untuk mengungkapkan karakteristik

pengikatan lebih kompleks dalam percobaan kompetisi. Gambar 5.7 memberikan

contoh analisis dari studi kompetisi. di mana dua situs yang ditunjukkan.

GAMBAR 5.7 Analisis percobaan kompetisi di mana pengikatan radiolabelel

adrenoreseptor-β antagonis (125I-iodopindolol) dihambat oleh antagonis selektif -β1

β2. Keempat panel menunjukkan berbagai cara di mana data dapat dianalisis (lihat

teks). (Data untuk gambar telah diambil dari Gambar. 4, Bab 7, dari Wolfe, BB dan

Molinoff, PB, dalam Buku Pegangan, Farmakologi Eksperimental, Trendelenburg, U.

dan Weiner, N., Eds., Springer-Verlag, Berlin, 1988.)

Sebuah plot B vs log [I] (Gambar 5.7A dan B) awalnya mungkin menyarankan

dua komponen, tetapi harus hati-hati. Plot Hill (Gambar 5.7D) mengungkapkan

kemiringan (oleh regresi linier) dari -0,629 (signifikan berbeda dari -1), yang tidak

konsisten dengan sederhana 1:1 kompetisi di situs pengikatan tunggal tetapi bukan

beberapa situs pengikatan atau kooperatititas negatif. Plot Eadie-Hofstee (Gambar

5.7C) jelas nonlinear. Analisis data kuadrat Nonlinier (lihat bagian berikutnya)

ditunjukkan pada Gambar 5.7A dan B. Pada B, komponen tunggal yang dipasang

menggunakan Persamaan. (5.18), tetapi dengan syarat pangkat nH. Pemasangannya

cukup masuk akal dan menghasilkan sebuah nH dari -0,648, dekat dengan nilai dari

plot Hill. Sebuah nilai cocok lebih dekat (Gambar 5.7a) (diduga) diperoleh dengan

model dua komponen (di mana nH terkendala satu) menurut:

Konversi setiap IC50 ke KI untuk dua situs tergantung pada pengetahuan

tentang afinitas dari radioligand untuk situs. Perhatikan juga bahwa rasio B0(1) ke

B0(2) hanya akan memberikan proporsi relatif dari dua situs dalam jaringan jika situs

memiliki afinitas identik untuk radioligand tersebut.

5. 4. 5 ANALISIS DATA METODE KUADRAT NONLINEAR

Seperti telah dicatat, dengan munculnya mikrokomputer kuat dan perangkat

lunak menggabungkan rutinitas pas, data pengikatan dapat segera dianalisis dengan

cara prosedur kuadrat nonlinier . Ini di luar lingkup dari catatan ini untuk

memberikan keterangan lengkap tentang metode ini. Pada intinya, bagaimanapun,

prosedur pertama membutuhkan pemilihan ekspresi yang diyakini mewakili sistem

yang sedang diselidiki. Tebakan awal yang kemudian dibuat dari parameter yang

tidak diketahui (misalnya, KL, Bmax), dan dengan menggunakan penebakan

pengikatan diharapkan dihitung sesuai dengan konsentrasi ligan pada setiap titik.

Penyimpangan dari titik-titik diamati yang dihitung dan ditambahkan bersama-sama.

Dengan demikian,

dimana Bobs adalah pengikatan yang diukur, Bcalc adalah pengikatan yang

dihitung dengan menggunakan tebakan, dan w adalah faktor bobot. Hal ini

memungkinkan peneliti untuk memberikan bobot lebih atau kurang untuk titik data

tertentu menurut kehandalan mereka. Dimana setiap titik datum memiliki standard

error yang terkait, sangat umum, misalnya, untuk berat terbalik dengan varians.

Program ini kemudian membuat perubahan sistematis dengan nilai-nilai yang

ditebak dan menghitung ulang kuadrat jumlah tersebut, mengulangi proses ini sampai

kuadrat jumlah mencapai minimum (yaitu, perkiraan kuadrat yang diperoleh). Banyak

program juga akan menghasilkan perkiraan standar deviasi dari nilai taksiran. Proses

ini dijelaskan secara lebih rinci dalam buku ini Colquhoun, Kuliah biostatistik, dan

aplikasi untuk studi pengikatan telah dianggap khusus oleh Wells (lihat bagian

Bacaan lebih lanjut). SigmaPlot (Jandel) dan Origin (Microcal) adalah contoh

komersial grafik yang tersedia dan program kurva-fitting. Program yang dirancang

khusus untuk analisis pada eksperimen pengikatan ligan adalah Ligan (Biosoft) dan

Prisma (GraphPad Software).

Bentuk kuadrat yang cocok jelas dapat diperoleh dengan mengadopsi model

yang lebih rumit melibatkan parameter tambahan. Penggunaan model yang lebih

rumit tentu saja, akan lebih mudah dibenarkan jika ada bukti yang mendukung

independen tersedia (misalnya, pengetahuan tentang beberapa pengikatan situs dari

studi fungsional).

5. 5 RELEVANSI HASIL DARI STUDI PENGIKATAN

Studi pengikatan dilakukan secara independen dari setiap respon biologi, dan

itu jelas diinginkan pemeriksaan untuk memastikan bahwa pengikatan terjadi pada

situs yang relevan atau dapat diidentifikasi. Dengan demikian, sedapat mungkin, hasil

pengikatan harus dibandingkan dengan hasil dari studi fungsional. Hal ini dapat

dicapai paling mudah untuk antagonis kompetitif. Dalam kasus ini, Schild plot (lihat

Bab 1) dapat memberikan perkiraan afinitas dari pergeseran kurva konsentrasi-respon

yang seharusnya sesuai dengan Kd yang diperoleh dalam studi pengikatan. Hulme

dan Birdsall (1992) memberikan ilustrasi terbaik dari korelasi tersebut untuk reseptor

muskarinik, dan contoh lebih lanjut diberikan dalam Gambar 5.8, yang

membandingkan studi fungsional dan mengikat kalium channel bloker. Ini jelas akan

lebih sulit untuk membangun hubungan seperti ketika ada subtipe reseptor dalam

jaringan. Dalam keadaan ini, ketersediaan agen yang menunjukkan selektivitas untuk

subtipe akan membantu penafsiran.

5. 6 MASALAH

Masalah-masalah ini disediakan untuk memberi kesempatan bagi pembaca

untuk menganalisis macam data pengikatan. Masalah tidak memerlukan analisis

kuadrat nonlinier, tetapi ini akan dianjurkan untuk mereka yang memiliki akses ke

fasilitas yang tepat.

Gambar 5.8 korelasi antara kemampuan berbagai senyawa untuk menghambat

125l-monoiodapamin mengikat hepatosit untuk hamster (nilai KI, absis) dan

kemampuan mereka untuk menghambat K+ peningkatan permeabilitas diinduksi oleh

angiotensin II dalam sel-sel (nilai IC50, ordinat). Garis lurus yang diharapkan untuk

kesetaraan langsung. Pengukuran sangat berkoreasi, menunjukkan bahwa senyawa

memang menghasilkan efek mereka dengan mengikat ke apamin-sensitif K+ channel.

(data dari Cook, NS dan Haylett, DG, J. Physiol., 358, 373, 1985. Dengan izin)

Masalah 5.1: ukuran kejenuhan

Data pada tabel. 5.3 berasal dari sebiah percobaan pengukuran 125l-

monoidoapamin mengikat GuineaPig Hepatosit. Kondisi itu sedemikian rupa

sehingga penipisan radiologand diabaikan atas seluruh konsentrasi belajar.

TABEL 5.3

Data permasalah 5.1

Jumlah Bound

Radiologand Konsentrasi [L] (fmol. Mg kering jaringan-1)

(pM) jumlah Noninhibitable

20 0.110 0.018

50 0.224 0.046

100 0.351 0.071

150 0.495 0.143

200 0.557 0.180

300 0.708 0.275

500 0.942 0.462

1000 1.530 0.900

1500 1.920 1.310

1. Gambaran tertentu (inhibitabel) mengikat terhadap [L]. Membuat perkiraan

awal terhadap KL dan Bmax dari grafik ini

2. Buatlah plot Scatchard dari data yang diperoleh dari perkiraan yang baru dari

KL dan Bmax

3. Buatlah sebuag gambar bukit kecill ). Apa

yang dapat disimpulkan dari kemiringan gambar ini?

TABEL 5.4

DATA UNTUK PERMASALAHAN 5.2

GAMBAR 5.9 gambar dari data untuk permasalahan 5.2

Permasalahaan 5.2: kinetik

pada mulanya pengikatan apamin radiolabeled untuk hipotesis hamster dipelajari

selama tiga konsentrasi dari ligan selama 200 detik dan memberikan hasil dalam tabel

5.4. Data ini di gambarkan pada gambar 5.9 dan menunjukkan bagaimana tingkat

konstan untuk terjadinya kenaikan ikatan dengan konsentrasi ligan. Untuk setiap

rangkaian ikatan diharapkan diberikan oleh :

Perkiraan k+1 dan k-1 dari data (lihat bagian 5.2.2.2).

Permasalahan 5.3: percobaan kompetisi

Pengikatan tiga konsentrasi125

I berlabel iodohydroxybenzylpindolol(IHYP) dari

sel darah merah kalkun dipelajari tidak ada dan adanya serangkaian konsentrasi

satalol. Tabel 5.5 menunjukkan hasil. Gambaran jumlah total IHYP menuju pada log

[satolol] dan gambaran kurva halus dengan mata melalui setiap set poin. Perkiraan

IC50 untuk masing-masing garis.

TABEL 5.5

DATA UNTUK PERMASALAHAN 5.3

Mengingat bahwa KL pada IHYP adalah 37pM, dihitung KI dari setiap IC50

(lihat persamaan. (5.20)). Mentabulasi pengikatan spesifik untuk setiap set data dan

membangun gambaran bukit (persamaan (5.31)). Apakah hasil sesuai dengan

populasi tunggal dari reseptor? Bandingkan setiap IC50 gambaran ini dengan

perkiraan anda sebelumnya.

5.7 BACAAN LEBIH LANJUT

Penelitian pertama tepatnya pengikatan radioligand

Paton, W. D. M. and Rang, H. P., The uptake of atropine and related drugs by

intestinal smooth muscle of the guinea-pig in relation to acetylcholine

receptors, Proc. Roy. Soc. London Ser. B, 163, 1, 1965.

Metode kedekatan sintilasi

Udenfriend, S., Gerber, L., and Nelson, N., Scintillation proximity assay: a sensitive

and continuous isotopic method for monitoring ligand/receptor and

antigen/antibody interactions, Anal. Biochem., 161, 494,1987.

Pengaruh kekuatan ion pada pengikatan ligan

Birdsall, N. J. M., Burgen, A. S. V., Hulme, E. C., and Wells, J. W., The effects of

ions on the binding of agonists and antagonists to muscarinic receptors, Br. J.

Pharmacol., 67, 371, 1979.

Pengobatan komprehensif aspek teoritis dan praktis dari radioligan

eksperimen

Hulme, E. C. and Birdsall, N. J. M., Strategy and tactics in receptor binding studies,

in Receptor–Ligand Interactions: A Practical Approach, Hulme, E. C., Ed.,

IRL Press, Oxford, 1992, chap. 4.

Penaksiran parameter mencakup nonlinear metode kuadrat

Colquhoun, D., Lectures on Biostatistics, Clarendon Press, Oxford, 1971.

Wells, J. W., Analysis and interpretation of binding at equilibrium, in Receptor–

Ligand Interactions: A Practical Approach, Hulme, E. C., Ed., IRL Press,

Oxford, 1992, chap. 11.

GAMBAR 5.10 Analisis data saturasi yang disediakan untuk Soal 5.1 (lihat teks

yang menyertai).

5.8 SOLUSI UNTUK PERMASALAHAN

Permasalahan 5.1: Saturasi data

Data kasar yang digambarkan pada Gambar 5.10A. Dua poin dari data tertentu

mungkin menunjukkan bahwa Bmax telah dicapai oleh sekitar 1000 pM, dengan nilai

antara nilai-nilai diukur pada 1000 dan 1500 pM, katakanlah 0.62 fmol / mg berat

kering. Perkiraan KL dapat diperoleh dengan membaca dari grafik konsentrasi ligan

yang menghasilkan pengikatan 0,5 Bmax (yaitu, 0,31 fmol / mg berat kering;. lihat

Persamaan (5.3).). Perkiraan ini akan tergantung bagaimana kurva telah ditarik tetapi

mungkin sekitar 120 pM.

Sebuah plot Scatchard dari data yang ditunjukkan pada Gambar 5.10C. Untuk

kenyamanan, garis dipasang adalah regresi B / F pada B (meskipun, seperti

disebutkan sebelumnya, ini adalah statistik tidak kokoh) dan memberikan suatu

perkiraan untuk Bmax (x-intercept) dari 0,654 fmol / mg berat kering. dan perkiraan

untuk KL (-1/slope) dari 132 pM. Sebuah Lineweaver-Burk (double-timbal balik)

gambaran disediakan untuk perbandingan pada Gambar 5.10D. Regresi linear

memberikan perkiraan lain untuk Bmax (1/y-intercept;. Lihat Persamaan (5.29)) dari

0,610 fmol / mg kering berat. Perkiraan KL dari komplotan ini (kemiringan × Bmax)

adalah 114 pM.

Untuk mengkonstruksikan gambaran (Gambar 5.10E), diasumsikan bahwa Bmax

adalah 0,654 fmol / mg berat kering., nilai Scatchard. Kemiringan gambar adalah

1,138 dengan standar deviasi 0,12, sehingga akan tidak masuk akal untuk menduga

nH memang 1 dan begitu konsisten dengan biomolekuler sederhana interaksi. Gambar

5.10B menunjukkan nonlinier kuadrat-fit dari Persamaan. (5.3) dengan data spesifik

mengikat (memberikan semua titik berat yang sama). Perkiraan kuadrat-adalah 0.676

fmol / mg berat kering. untuk Bmax dan 150 pM untuk KL. (Perkiraan kesalahan

standar nilai-nilai ini dicatat pada gambar.) nonlinier kuadrat-cocok dari total data

yang mengikat dengan Persamaan. (5.4) memberikan Bmax = 0,686 fmol / mg berat

kering. dan KL = 151 pM. Data untuk permasalahanl 5.1. Pada kenyataannya

dihasilkan dengan menetapkan poin secara acak tentang kurva dengan Bmax = 0,68

fmol / mg berat kering. dan KL = 150 pM. Baik Scatchard dan double-timbal balik

gambaran , dalam hal ini, meremehkan kedua parameter, gambaran terakhir menjadi

sangat tidak akurat.

GAMBAR 5.11 Analisis data kinetik disediakan untuk Soal 5.2 (lihat yang

menyertai teks).

Permasalahan 5.2 Data kinetik

Sebuah analisis grafis, yang memungkinkan penentuan k +1 dan k-1 dari data

yang diberikan, dijelaskan dalam Bagian 5.2.2.2. Untuk setiap set data, perlu untuk

menentukan kon+. Nilai-nilai ini dapat diperoleh dari gambaran semilog dari ln ((B ∞ -

Bt) / B ∞) vs t. Tapi, nilai apa yang harus diambil untuk B ∞?

Perkiraan dapat dilakukan dengan mata dari data, dan Gambar 5.11c B ∞ selama

30 dan 100 pM telah diambil sebagai yang tertinggi dan tercatat nilai 300 pM

sebagai nilai rata-rata pada 100 dan200 detik.

Dalam merencanakan Gambar 5.11c, poin lebih dari 50 detik telah diabaikan

karena kesalahan dalam (B ∞- Bt) menjadi proporsional sangat besar. Regresi linier

telah dilengkapi dengan tiga baris, memberikan perkiraan kon dari 0,0377 detik-1 (

30

pM), 0,0572 detik-1

(100 pM), dan 0,0765 detik-1

(300 pM).

Nonlinier kuadrat-cocok, menggunakan Persamaan. (5.14), juga terbuat dari

masing-masing set data (menggunakan Origin), dan kurva dipasang ditunjukkan pada

Gambar 5.11a. Nilai-nilai pas untuk B ∞ adalah 0.110 ± 0.005, 0.269

± 0,006, dan 0,494 ± 0,006 fmol.mg kering wt.-1 dan untuk kon 0,0351 ± 0,004,

0,0518 ± 0,003, dan 0,0828 ± 0,003 detik-1.

Nilai-nilai yang terakhir telah diplot

terhadap [L] pada Gambar 5.11B, dan linier regresi memberikan kemiringan (≡ k +1

)

dari 1,72 × 10-4 pM-1 detik-1 (= 1,7 × 108 M-1 detik-1) dan intercept (≡ k-1

)

0,032 detik-1

. (Ketiga kurva juga dipasang secara bersamaan untuk Pers. (5.14)

dan (5.15) menggunakan Program nonlinier kuadrat-(D. Colquhoun, tidak

diterbitkan) dan memberikan nilai untuk k +1

dan k-1

langsung:. k +1

= 1,63 × 10-4

pM-1 detik-1, k-1

= 0,034 detik-1

)

Permasalahan 5.3 Data Kompetisi

Gambaran individual data akan menghasilkan kurva setara dengan yang di

Gambar 5.4, yang tidak spesifik mengikat, tentu saja, meningkat dengan konsentrasi

radioligand. IC50 dapat dibaca dari kurva langsung (dengan mempertimbangkan

mengikat spesifik) atau dapat diperoleh dari gambaran bukit untuk spesifik mengikat

(lihat Persamaan. (5.31)). Bukit gambaran dari data yang disajikan pada Gambar

5.12, poin untuk konsentrasi luar 3 × 10-8

sampai 3 × 10-4

M yang dikeluarkan karena

kesalahan besar yang terkait dengan mereka. Garis terlihat menjadi lurus, dan regresi

linier menunjukkan lereng tidak signifikan berbeda dari -1. Garis dipasang karena itu

telah dibatasi untuk memiliki kemiringan -1. The xintercepts sesuai dengan IC50

sebesar 1,43 M, 2,48 µM, dan 5,74 mM. (Bandingkan ini dengan perkiraan yang

diperoleh dengan interpolasi langsung pada plot dari data kasar.) nonlinear kuadrat-

cocok dari masing-masing set data untuk Persamaan . (5.18) memberikan IC50

memperkirakan 1,20 ± 0,07 µM, 2,51 ± 0,13µM, dan 6.17 ± 0.45 µM. KI dapat

diperoleh dari IC50 menggunakan Persamaan. (5.20). Pengambilan KL 37 pM

memberikan Nilai KI 0,66, 0,68, dan 0,68 µM, masing-masing, yang mana seperti

yang diharapkan sangat mirip. Data untuk masalah ini benar-benar dihasilkan

menggunakan nilai awal untuk KI 0,68 µM.

GAMBAR 5.12 gambaran Bukit hasil percobaan kompetisi digunakan untuk

permasalahan 5.3. Garis pasang telah dibatasi agar mempunyai kemiringan -1. Nilai

IC50 yang diberikan oleh x-penyadapan dan dapat digunakan untuk menentukan KI

untuk mengikat sotalol (lihat teks yang menyertainya). Nilai-nilai IC50, seperti yang

diharapkan dari Persamaan. (5.20), meningkat dengan konsentrasi radioligand.

Bagian IV

Transduksi Sinyal Reseptor

6 Reseptor Terkait dengan Ion

Saluran: Mekanisme

Aktivasi dan Blok

Alasdair J. Gibb

ISI

6.1pendahuluan....................................................................................................184

6.1.1 Respon untuk aktivitas reseptor..............................................................184

6.2 Mekanisme

Agonis.........................................................................................184

6.2.1 Bukti untuk nonidentical Agonis Situs

Bindin…...................................185

6.2.2 Penerapan Mekanisme Dua-Binding-Site…..........................................186

6.2.3 Bukit Koefisien kooperatitit……...........................................................186

6.2.4 Bukit Koefisien untuk homomerik Saluran Receptor............................188

6.2.5 Reseptor Desensitisasi............................................................................188

6.2.6 Penentuan pbuka curve...........................................................................190

6.2.7.Analisis Single-Channel Rekaman.........................................................192

6.2.8 Analisis Semburan Ion-Channel Bukaan...............................................192

6.3Antagonisme Ion-Channel Reseptor...............................................................193

6.3.1Antagonisme kompetitif dan Persamaan Schild

.....................................193

6.3.2 Ion-Channel Blok...................................................................................197

6.3.3Mekanisme untuk Channel Blok ...........................................................197

6.3.4 Kinetika makroskopik: relaksasi (seperti Arus Synaptic) dan Kebisingan

...............198

6.3.5 Saluran Blok di Equilibrium

..................................................................199

6.3.6 Analisis Single-Channel Kanal Blok

.....................................................200

6.3.6.1 waktu pembukaan …….............................................................200

6.3.6.2 waktu penutupan........................................................................200

6.3.6.3 frekuensi penyumbatan..............................................................200

6.3.6.4 Ledakan Panjang........................................................................200

6.3.6.5 Pembukaan Ledakan .................................................................202

6.3.7 Skala waktu kanal

blok………………..................................................202

6.3.8Menggunakan Ketergantungan

ChanneBlocker......................................203

6.3.9 ketergantungan tegangan kanalblok………….......................................203

6.4 Penutup…………..........................................................................................205

6.5 Masalah..........................................................................................................206

6.6 Bacaan lebih lanjut .......................................................................................208

6.7 Solusi untuk masalah ....................................................................................209

6.1 PENDAHULUAN

Banyak pengukuran dalam farmakologi bergantung pada serangkaian peristiwa

setelah aktivasi reseptor menghasilkan respon yang dapat diukur - misalnya,

kontraksi otot polos seekor hamster ileum dalam menanggapi aktivasi reseptor

muskarinik oleh asetilkolin. Ini berarti bahwa hubungan antara reseptor hunian dan

respon cenderung menjadi kompleks, dan mekanismekerja obat dalam sistem

tersebut seringkali sulit untuk ditentukan.

Berbeda dengan ini, respon agonis pada saluran ion ligand-gated dan efek obat

pada saluran ion sering lebih setuju dengan pemeriksaan mekanistik karena respon

(arus ion melalui membuka saluran ion bila diukur dengan tegangan atau tekhnik

patch-clamp) berbanding lurus untuk aktivasi reseptor. Ini adalah keuntungan besar

dan telah memungkinkan teknik elektrofisiologi yang akan digunakan untuk

mempelajari aktivasi ion-channel dan blok obat reseptor ion-channel dengan sangat

rinci.

Bab ini terutama berkaitan dengan informasi yang dapat diperoleh dari

keseimbangan, atau setidaknya steady-state, rekaman aktivitas reseptor ion-channel.

Namun, banyak informasi memiliki juga diperoleh dari studi kinetik saluran ion di

mana tujuannya adalah untuk menentukan nilai untuk konstanta laju mekanisme

reseptor. Secara umum, hanya konstanta kesetimbangan dapat

ditentukan dari studi keseimbangan.

6.1.1 Tanggapan Terhadap Aktivasi Reseptor

Aktivasi ligand-gated ion-channel reseptor menyebabkan pembukaan saluran

ion, yang membentuk pori pusat melalui struktur reseptor. Ion seperti Na + dan K

+.

Dan sering juga Ca2

+(tergantung pada selektivitas ion saluran), mengalir melalui

saluran kationik yang dibentuk oleh nicotinic acetylcholine reseptor (nAChRs),

reseptor glutamat ionotropic, 5HT3 reseptor, atau P2X adenosine trifosfat (ATP)

reseptor. Ini arus ionik umumnya rangsang menyebabkan depolarisasi sel. Ion

klorida, dengan beberapa kontribusi dari HCO3- ion, adalah pembawa muatan utama

melalui γ -aminobutyric acid (GABAA) Dan saluran reseptor glisin, dan arus ini

umumnya tidak selalu, menghambat.

Reseptor ion-channel ligand-gated perantara cepat transmisi sinaptik pada

neuromuscular sambungan seluruh sistem saraf pusat dan perifer. Reseptor ini juga

terletak presynaptically pada terminal saraf di banyak sinapsis di mana mereka

mempengaruhi pelepasan transmitter. Selain itu, di mana saluran reseptor yang

permeabel terhadap Ca2+

, Mereka terlibat dalam mengendalikan Ca2+

intraseluler

konsentrasi dan karenanya menjadi masukan banyak mekanisme transduksi yang

melibatkan Ca2 +

sebagai utusan kedua. Ca2+

Masuk melalui reseptor glutamat dari N-

metil-D aspartat (NMDA) subtipe (Ascher dan Nowak, 1988) sangat penting terutama

dalam proses synaptogenesis dan pengendalian kekuatan koneksi sinaptik dalam otak,

sedangkan kelebihan CA2 +

menyebabkan masuknya melalui saluran reseptor NMDA

diperkirakan menjadi penyebab utama kematian sel saraf selama hipoksia atau

iskemia di otak.

Selama 50 tahun terakhir, perkembangan teknik elektrofisiologi telah

memungkinkan efek agonis dan antagonis pada reseptor ion-channel ligand-gated

untuk dipelajari dengan ketelitian tinggi. Ini terutama berguna dalam pembelajaran

mekanisme kerja obat karena hasil aktivasi reseptor (aktif melalui saluran ion) dapat

diukur secara langsung, dan membuka saluran secara langsung terkait dengan aktivasi

reseptor. Jadi, seharusnya tidak mengejutkan bahwa pertama kali mekanisme fisik

yang masuk akal untuk aktivasi reseptor adalah hasil dari elektrofisiologi studi

aktivasi AChR. Percobaan itu dilakukan oleh Katz dan rekan kerjanya di Biofisika

Departemen di University College, London, lebih dari 40 tahun yang lalu.

6.2 MEKANISME AGONIS

Mekanisme agonis sederhana yang dapat digunakan untuk menggambarkan

aktivasi ionchannel ligand-gated reseptor itu pertama kali diusulkan oleh del Castillo

dan Katz (1957) untuk aktivasi nAChRs

pada sambungan neuromuskuler:

Mekanisme ini membuat titik penting bahwa aktivasi reseptor harus merupakan

langkah yang berbeda (kebanyakan kemungkinan beberapa langkah) selanjutnya

mengikat agonis (lihat juga Bab 1). Namun, mekanisme ini tidak memungkinkan

untuk fakta bahwa bukti fungsional, biokimia, dan struktural yang cukup sekarang

menunjukkan bahwa ada dua situs mengikat ACh pada reseptor nicotinic

acetylcholine otot dan organ listrik (Unwin, 1996), dan mungkin kasus yang lain

empat transmembran. Reseptor subunit (4TM)-domain (lihat Bab 3) seperti glisin dan

reseptor GABA juga membutuhkan mengikat dua molekul agonis untuk aktivasi

efisien reseptor. Saat ini, Mekanisme yang paling umum (misalnya, Colquhoun dan

Sakmann, 1981) digunakan untuk menggambarkan AchR aktivasi adalah sebagai

berikut:

Di sini, asosiasi mikroskopis dan konstanta laju disosiasi untuk setiap langkah

dalam reseptor mekanisme aktivasi yang diberikan, di mana k+1 dan k+2 lihat

mengikat agonis, k-1 dan k-2 lihat agonis disosiasi, dan β dan α adalah konstanta laju

untuk membuka saluran dan penutupan, masing-masing. Faktor 2 sebelum k+1 dan k-

2 terjadi karena mekanisme berasumsi bahwa salah satu dari dua situs pengikatan

agonis bisa ditempati atau dikosongkan terlebih dahulu. Selain itu, perhatikan bahwa

dua situs diasumsikan untuk menjadi setara sebelum mengikat agonis.

6.2.1 Bukti Untuk Nonidentical Agonis Situs Mengikat

Situs agonis mengikat reseptor adalah beberapa jarak dari saluran ion dan di

luar membran. Mereka terbentuk di saku dalam setiap α-Subunit (Unwin, 1996).

Lingkungan dua situs mengikat tidak bisa, pada prinsipnya, identik karena subunit

yang berdekatan nonidentical dan fakta bahwa reseptor adalah pentamer a. Namun,

bukti fungsional menunjukkan nonequivalance dari dua situs mengikat belum

konsisten antara spesies. Bukti terbaik bahwa situs mengikat berbeda berasal dari

studi tentang Torpedo AChR, yang kedua studi mengikat reseptor asli dan studi

patch-clamp reseptor kloning diekspresikan dalam fibroblas menunjukkan bahwa ada

di urutan perbedaan 100 kali lipat dalam afinitas untuk Ach antara dua lokasi (Lingle

et al., 1992). Eksperimen serupa pada garis sel BC3H1 juga menunjukkan

heterogenitas situs agonis mengikat ini embrio AChR otot tikus. Di

Sebaliknya, beberapa eksperimen tidak menemukan bukti untuk perbedaan yang

besar antara Ach mengikat pada dua situs di katak endplate AChRs (Colquhoun dan

Ogden, 1988). Saat ini, masalah ini belum diselesaikan, dan lebih fungsional dan

struktural bekerja terus untuk menjawab pertanyaan ini. Namun, perlu dicatat bahwa

kehadiran pada reseptor dari dua agonis / antagonis situs mengikat, yang mungkin

berbeda, cukup untuk menambah kompleksitas hasil yang diharapkan dari studi

mengikat atau percobaan dosis-rasio seperti metode Schild, sebagai dijelaskan

kemudian dalam bab ini. Hal ini juga dapat dicatat di sini bahwa reseptor homomerik

(seperti neuronal nicotinic α 7 reseptor AMPA reseptor atau homomerik, lihat Bab 3)

akan memiliki setara situs pengikatan agonis sebelum mengikat agonis. Titik menarik

lebih lanjut adalah bahwa jika glutamat reseptor subunit stoikiometri adalah

tetrameric, maka heteromeric non-NMDA reseptor terdiri dari,

misalnya, dua GluR1 dan dua GluR2 subunit akan, pada prinsipnya, memiliki situs

pengikatan nonidentical pada subunit setara jika subunit yang berdekatan satu sama

lain dalam molekul, tetapi mereka akan memiliki situs mengikat setara ketika GluR1

dan GluR2 subunit alternatif dalam posisi sekitar saluran pusat ion. Ini adalah contoh

yang sangat baik tentang bagaimana informasi mengenai struktur reseptor dapat

sangat diperlukan dalam menafsirkan hasil studi fungsional kerja obat.

6.2.2 Penerapan Dua-Mengikat-Situs Mekanisme

Persamaan (6.2) telah terbukti menjadi penjelasan yang baik dari aktivitas

AchR di berbagai eksperimental situasi (ditinjau oleh Edmonds et al., 1995) dan lebih

baru-baru ini telah digunakan sebagai titik awal dalam mekanisme berkembang untuk

menggambarkan aktivasi saluran ion lainnya ligand-gated seperti reseptor glutamat,

5HT3 reseptor, dan reseptor GABA.

Ekspresi yang berkaitan dengan hunian keseimbangan negara apapun dalam

mekanisme ini untuk agonis Konsentrasi dapat diturunkan seperti yang dijelaskan

dalam Bab 1. Jika kita mendefinisikan konstanta kesetimbangan untuk agonis

mengikat sebagai K1= k-1 / k+1 dan K2 = k-2 / k+2 dan konstanta E menggambarkan

efisiensi saluran pembukaan (setara dengan kemanjuran) sebagai E=β/α, Maka hunian

keseimbangan keadaan terbuka (A2R *) akan:

Ini adalah pelajaran untuk menulis persamaan ini dalam bentuk analog dengan

untuk mekanisme situs pengikatan agonis tunggal,

sebagai formulir ini menggambarkan ketergantungan konsentrasi rendah pA2R *

di alun-alun dari konsentrasi agonis, yang steepens kurva dosis-respons.

Ekuilibrium hunian keadaan terbuka saluran ion biasanya disebut sebagai

p terbuka dan merupakan sebagian kecil dari waktu itu satu saluran terbuka atau,

sama, fraksi populasi saluran yang terbuka pada kesetimbangan. Untuk mekanisme

agonis situs dua mengikat, hubungan antara p terbuka dan konsentrasi agonis (kurva

terbuka p) memiliki bentuk sigmoid akrab (ketika konsentrasi agonis diplot pada

skala logaritmik) dari kurva dosis-respons, tetapi lebih curam dibandingkan

mekanisme situs tunggal mengikat.

6.2.3 Hill Koefisien Dan Kooperatititas

Dalam Bab 1 (Bagian 1.2.4.3), persamaan Hill dan koefisien Hill, NH,

dijelaskan. Bukit koefisien lebih besar dari atau kurang dari satu sering ditafsirkan

sebagai menunjukkan kooperatititas positif atau negatif, masing-masing, dalam

hubungan antara reseptor hunian dan respon. Misalnya, kooperatititas positif bisa

muncul akibat amplifikasi dalam mekanisme transduksi dimediasi oleh G-protein dan

perubahan konsentrasi kalsium sel.

Jika reseptor memiliki dua situs mengikat agonis, muncul pertanyaan, apakah

pengikatan agonis pada satu situs bisa mempengaruhi pengikatan agonis di situs lain,

disebut sebagai kooperatititas antara situs pengikatan agonis. Kooperatititas negatif

terjadi ketika mengikat pada satu situs mengurangi afinitas di lokasi kedua, sementara

kooperatititas positif terjadi jika mengikat pada satu situs meningkatkan afinitas di

lokasi kedua. Perhatikan bahwa mungkin ada kooperatititas antara situs pengikatan

agonis meskipun situs kosong memiliki afinitas yang sama untuk agonis. Namun,

juga mungkin bahwa kedua situs agonis mengikat yang berbeda sebelum mengikat

agonis terjadi (rata-rata, satu situs yang kemudian lebih mungkin untuk ditempati

sebelum yang lain), dan dalam hal ini masih mungkin untuk mengikat agonis satu

situs untuk mempengaruhi mengikat di situs lain. Kemiringan kurva p terbuka untuk

Pers. (6.2) lebih kompleks daripada untuk situs pengikatan agonis tunggal;

Persamaan. (6.4) tidak memiliki bentuk yang sama dengan persamaan Bukit-

Langmuir, dan plot Hill adalah tidak

GAMBAR 6.1 tanggapan AchR Makroskopik dan lereng Bukit untuk aktivasi

AChR. (Kiri) saat melalui saluran ion AChR dalam menanggapi meningkatnya

konsentrasi Ach tercatat dari Xenopus oosit yang telah disuntikkan 3 hari sebelumnya

dengan Crna (courtesy of Prof SF Heinemann, Salk Institute) untuk α tersebut, β, γ,

dan δ subunit dari AChR otot tikus. Arus ke dalam melalui saluran AchR ion

ditampilkan sebagai defleksi ke bawah jejak. Artefak kecil pada jejak menunjukkan

waktu ketika solusi yang mengalir ke dalam bak mandi diubah dari kontrol ke

konsentrasi Ach ditunjukkan dan kemudian kembali untuk mengontrol. Arus yang

direkam dengan dua microelectrode tegangan klem. Potensi membran -60 mV dan

rekaman dilakukan pada suhu kamar. (Kanan) Tanggapan (dalam nA) untuk

meningkatkan konsentrasi Ach diplot terhadap konsentrasi Ach (di nM) pada skala

log-log. Kemiringan garis (1,92) adalah pendekatan untuk koefisien Hill (ketika

reseptor hunian kecil) dan menunjukkan bahwa dua agonis molekul harus mengikat

reseptor untuk menghasilkan aktivasi reseptor efisien.

garis lurus (seperti yang disebutkan dalam Bab 1, Bagian 1.2.4.3). Hal ini karena

untuk mekanisme situs pengikatan dua agonis Hill coefficientnH tergantung pada

konsentrasi agonis:

Ketika [A] << K1, maka nH = 2 tapi jatuh ke nH = 1 ketika [A] >> K1. Dalam

sebuah studi aktivasi AChR pada endplate katak, perkiraan terbuat dari EC 50 = 15

M, K1 = K2 = 77 M, dan nH = 1,6 pada respon setengah-maksimal, EC50,

konsentrasi.

Sebuah pendekatan untuk plot Hill sering digunakan dengan data agonis-respon

untuk saluran ion ligand-gated menyarankan batas bawah untuk jumlah situs agonis

mengikat reseptor. Ternyata, bagi banyak (tapi tidak semua) mekanisme, jika [A] <<

KA, maka kemiringan plot log (respon) vs log [A] mendekati jumlah reaksi agonis

mengikat diperlukan untuk aktivasi reseptor .

Gambar 6.1 mengilustrasikan hal ini dengan menggunakan data yang tercatat dari

oosit Xenopus mengekspresikan reseptor AChR otot embrio tikus. Dalam contoh ini,

respon yang diukur adalah arus dijumlahkan.

6.2.4 Hill Koefisien Untuk Saluran Reseptor Homomerik

Beberapa reseptor fungsional telah dijelaskan dalam sistem ekspresi mana

reseptor adalah diungkapkan dari subunit reseptor tunggal. Subunit reseptor yang

membentuk homomerik fungsional saluran termasuk neuronal nicotinic α7 subunit,

subunit reseptor 5HT3, beberapa non-NMDA subunit reseptor, embrio glisin reseptor

α subunit, dan P2X ATP reseptor subunit. Berdasarkan analogi dengan struktur yang

dikenal dari AChRs Torpedo, diasumsikan bahwa AChRs, 5HT3 reseptor, dan

reseptor glisin memiliki struktur pentameric lima subunit yang mengelilingi sebuah

pusat saluran ion pori. Struktur seperti menunjukkan bahwa akan ada lima situs

agonis mengikat pada reseptor homomerik. Apa, kemudian, harus kita harapkan

koefisien Hill bagi reseptor ini? Bukit koefisien untuk reseptor ini umumnya

ditemukan dalam kisaran dari 1 sampai 3. Demikian pengukuran ini dipersulit oleh

reseptor desensitisasi (lihat di bawah). Namun, hasil ini dapat diartikan sebagai

menunjukkan bahwa, dalam situasi dengan lima situs agonis mengikat reseptor,

mungkin hanya ada dua harus diduduki untuk aktivasi reseptor penuh.

6.2.5 Desensitisasi Reseptor

Desensitisasi dapat didefinisikan sebagai kecenderungan respon berkurang,

meskipun kehadiran stimulus intensitas konstan (misalnya, konstan konsentrasi

agonis). Dalam kasus nicotinic ACh reseptor, bukti yang baik menunjukkan bahwa

hasil desensitisasi dari perubahan reseptor konformasi ke keadaan tidak aktif

refraktori (Rang dan Ritter, 1970). Untuk menggambarkan hal ini dalam hal

mekanisme aktivasi AChR, kita bisa menambahkan keadaan peka terhadap skema

yang ditunjukkan pada Persamaan. (6.2) untuk memberikan:

Di sini, k + D dan k-D adalah konstanta laju untuk masuk ke dan keluar dari

A2RD negara peka. Investigasi penerapan berbagai mekanisme seperti skema linier

dalam Pers.(6.6) ke AchR desensitisasi (Katz dan Thesleff, 1957; Rang dan Ritter,

1970) memberikan bukti yang baik bahwa skema linier tidak bisa cukup menjelaskan

AchR desensitisasi. Secara khusus, itu mencatat bahwa onset sering lambat

dibandingkan dengan offset desensitisasi pada konsentrasi agonis memproduksi

sekitar 50% tunak desensitisasi, dan, sementara tingkat onset tergantung pada sifat

agonis, Offset adalah independen dari agonis. Hasil ini tidak diharapkan dari skema

linear seperti Pers. (6.6). Disimpulkan bahwa skema siklik seperti berikut itu

diperlukan:

Di sini, konstanta kesetimbangan untuk setiap reaksi yang diberikan dan hanya

langkah mengikat agonis tunggal ditampilkan untuk kesederhanaan.

GAMBAR 6.2 Aktivasi saluran AchR tunggal dalam patch membran luar-out dan

tanggapan terhadap meningkatnya konsentrasi ACh dari sebuah patch membran yang

berisi beberapa AChRs. Sebuah artefak kecil dekat awal dari setiap jejak

menunjukkan waktu ketika solusi yang mengalir ke dalam ruang rekaman diubah

menjadi solusi mengandung konsentrasi tercantum Ach. Dengan meningkatnya

konsentrasi Ach, dapat dilihat bahwa saluran diaktifkan lebih cepat, dan bahwa

desensitisasi reseptor menjadi semakin lebih cepat seperti bahwa respon puncak

berkurang pada konsentrasi Ach tinggi. Setelah respon terhadap agonis telah

mencapai steady state, mungkin lebih dari 90% dari reseptor di patch yang peka. Hal

ini kemudian memungkinkan untuk melihat kelompok individu bukaan saluran, yang

mencerminkan periode ketika AChRs tunggal sebentar keluar dari negara peka dan

mengalami aktivasi ulang oleh agonis ACh, sebelum memasuki kembali negara peka

lagi. Identifikasi kelompok ini menyediakan sarana langsung mengamati dan

mengukur popen untuk reseptor pada konsentrasi agonis tinggi, seperti digambarkan

pada Gambar 6.3.

Peka keadaan reseptor memiliki afinitas sangat tinggi untuk agonis (KA '<<

KA) dan reseptor lebih mungkin untuk menurunkan rasa mudah terpengaruh ketika

diduduki oleh agonis (KD KD << '). pengamatan ini memiliki konsekuensi penting

untuk studi radioligand mengikat memanfaatkan ligand-gated ion-channel agonis

reseptor. Umumnya, karena desensitisasi cepat relatif terhadap skala waktu mengikat

eksperimen, apa yang diukur akan didominasi oleh konstanta kesetimbangan untuk

mengikat dari agonis ke negara peka reseptor, dan ini mungkin afinitas yang lebih

tinggi dengan beberapa kali besarnya dari afinitas agonis untuk beristirahat, reseptor

nondesensitized. Ini hanyalah kasus lain dari hasil yang dikembangkan dalam Bab 1

menunjukkan bahwa, secara umum, afinitas jelas agonis diperkirakan dengan metode

seperti mengikat radioligand akan menjadi fungsi dari semua kesetimbangan

konstanta dalam mekanisme reseptor.

Desensitisasi mungkin fenomena reseptor cukup umum, meskipun bervariasi

secara luas di cakupan dan tingkat onset dan offset. Skala dan waktu perjalanan AchR

desensitisasi diilustrasikan pada Gambar (6.2), yang menunjukkan respon sepetak

membran sel mengandung beberapa AChRs untuk meningkatnya konsentrasi Ach.

Dua hal yang jelas: pertama, selama setiap aplikasi Ach, yang respon cepat naik ke

puncak dan kemudian berkurang ke tingkat di mana jejak dapat dilihat melangkah

GAMBAR 6.3 Pengukuran reseptor popen selama cluster bukaan saluran AchR

di patch luar-out mengekspresikan AChR otot tikus seperti yang dijelaskan untuk

Gambar 6.1. Atas jejak menunjukkan satu cluster dari AchR bukaan saluran

diaktifkan oleh 10 pM Ach. Semakin rendah jejak menunjukkan jejak output dari

analog rangkaian integrator. Lamanya cluster adalah 275 msec, dan biaya berlalu

adalah 295 fC. rata-rata arus saluran tunggal adalah 2,2 pA, memberikan popen untuk

clusterini0,49. antara tingkat single-channel saat ini. Kedua, dapat dilihat bahwa

dengan meningkatnya konsentrasi Ach respon puncak tidak hanya menjadi lebih

besar, melainkan kenaikan pertama dan kemudian menurun karena tingkat

peningkatan timbulnya desensitisasi.

6.2.6 Penentuan Kurva Popen

Karena terjadinya desensitisasi, bentuk hubungan penuh antara konsentrasi

agonis dan respon tidak dapat ditentukan dari eksperimen seperti itu diilustrasikan

dalam Gambar 6.1A. Di prakteknya, bagian yang paling akurat ditentukan dari kurva

dosis-respons makroskopik sering di batas konsentrasi rendah, di mana efek

desensitisasi pada kurva dosis-respons yang kecil.

Rekaman Single-channel menyediakan cara sekitar masalah desensitisasi

karena periode ketika semua reseptor di patch membran peka yang jelas pada

konsentrasi agonis tinggi sebagai membentang panjang rekaman di mana tidak ada

bukaan saluran terjadi, karena itu, desensitisasi telah digunakan untuk menyediakan

sarana untuk memperoleh kelompok bukaan berturut-turut, semua karena aktivitas

dari AchR tunggal, disebut sebagai cluster. Periode peka hanya dibuang, dan channel

popen diukur selama kelompok kegiatan antara periode peka.

Dalam setiap jejak pada Gambar 6.2, setelah beberapa detik terpapar ACh

menjadi mungkin untuk mengidentifikasi kelompok individu bukaan saluran AChR.

Analisis kelompok ini saluran bukaan, seperti digambarkan pada Gambar 6.3,

memungkinkan hubungan antara konsentrasi ACh dan p terbuka

akan ditentukan.

Gambar 6.3 menunjukkan contoh dari sekelompok bukaan saluran AchR

direkam dari outsideout Patch membran di hadapan 10 pM Ach. The popen selama

cluster, pada prinsipnya, sederhana untuk menghitung, fraksi waktu saluran terbuka

adalah total waktu yang dihabiskan dalam keadaan terbuka

dibagi dengan durasi cluster. Namun, bandwidth terbatas dari setiap sistem

pencatatan berarti bahwa beberapa bukaan singkat akan terlalu singkat untuk diukur.

Oleh karena itu, lebih baik untuk mengukur muatan disahkan selama cluster (karena

muatan tidak hilang dengan penyaringan) dan menggunakan akumulasi muatan

(integral dari arus selama cluster) untuk menghitung popen tersebut:

P terbuka (6.8)

GAMBAR 6.4 popen kurva untuk AChR otot tikus dinyatakan dalam Xenopus

oosit. (a) Sekelompok AchR bukaan saluran aktif dalam menanggapi 200 mM Ach

ditampilkan, cluster popen = 0,87. (b) Hubungan antara klaster popen dan Ach

konsentrasi ditampilkan. Titik data menunjukkan rata-rata ± S.E. (n = 8-82 cluster)

pada setiap konsentrasi Ach. Garis padat menunjukkan kecocokan data dengan

mekanisme reaksi yang diberikan dalam Pers. (6.24), di mana agonis dapat keduanya

mengaktifkan reseptor dan memblokir saluran ion terbuka. Kesetimbangan konstanta

untuk agonis mengikat dua situs mengikat reseptor itu diasumsikan sama (KA) dan

diperkirakan 22 M, rasio pembukaan saluran untuk menutup konstanta laju (β / α)

adalah 7,9, dan kesetimbangan konstan untuk membuka blok saluran (KB) adalah 4,9

mM. (Diadaptasi dari Gibb et al., Proc. Roy. Soc. London Ser.

Menggunakan metode mengintegrasikan muatan berlalu selama setiap cluster

aktivitas saluran, itu mungkin untuk secara akurat menentukan kurva popen pada

konsentrasi agonis tinggi. Namun demikian, perhatikan bahwa metode ini tergantung

pada identifikasi kelompok bukaan saluran dimana setiap segmen dapat ditugaskan

jelas sebagai akibat dari aktivitas saluran reseptor tunggal: pada popen rendah, adalah

mungkin untuk dua saluran menjadi aktif selama cluster tanpa memberikan bukaan

ganda yang jelas tapi, tentu saja, memberikan sekitar dua kali lipat popen berlaku

untuk reseptor tunggal. Oleh karena itu, bagian bawah kurva popen tidak dapat

ditentukan jenis percobaan. Idealnya, kurva popen seluruh harus ditentukan dari

percobaan di mana hanya ada satu reseptor hadir di patch membran direkam. Dalam

prakteknya, ini sangat sulit dicapai karena kepadatan reseptor terlalu tinggi di

sebagian besar membran sel dan tidak mungkin untuk menentukan berapa banyak

reseptor dalam patch.

Gambar 6.4 menunjukkan contoh dari sekelompok bukaan saluran AChR dan

kurva popen diperolehdari patch yang sama. Itu mungkin untuk mengidentifikasi

kelompok dengan jelas ketika popen yang lebih besar darisekitar 0,4. Hasil ini

dipersulit oleh adanya saluran terbuka blok saluran AchR oleh agonis, Ach (lihat

Bagian 6.3.3 dan Persamaan. (6.24)). Hal ini menyebabkan p terbuka untuk secara

bertahap menurun pada konsentrasi agonis tinggi, terutama di atas 1 mM. P terbuka

maksimum untuk patch diilustrasikan pada Gambar 6.4a adalah 0,83 ± 0,01 (n = 45

cluster) dan terjadi pada 200 M Ach (Gambar 6.4b). bagaimana hasil ini harus

ditafsirkan? The p terbuka kurva pada Gambar 6.4b yang dilengkapi dengan

hubungan antara p terbuka dan konsentrasi Ach diprediksi untuk mekanisme situs

pengikatan dua-agonis diperpanjang untuk memungkinkan blok saluran ion terbuka

oleh Ach (Persamaan (6.34)). Pas ini memungkinkan perkiraan harus dibuat untuk

masing-masing konstanta kesetimbangan dalam mekanisme reaksi.

Ada, bagaimanapun, satu kesulitan dengan menafsirkan hasil pas kurva p

terbuka. Itu kesulitan adalah bahwa ketika pendekatan p terbuka maksimum kesatuan,

meningkatkan β / α atau menurunkan KA memiliki efek yang sangat mirip pada

kurva p terbuka, baik perubahan hanya menggeser ke kiri. Dengan demikian, β / α

dan KA tidak dapat diperkirakan secara independen (E = β / α dan KA berkorelasi)

ketika p terbuka maksimum adalah tinggi. Salah satu solusi untuk ini adalah untuk

memperkirakan β / α secara terpisah dan kemudian memperbaiki nilai ini ketika pas p

terbuka yang kurva untuk memperkirakan KA. Untungnya, perkiraan β dan α dapat

diperoleh dari analisis semburan bukaan single-channel direkam pada konsentrasi

agonis rendah seperti yang dijelaskan di bawah ini.

6.2.7 Analisis Rekaman Satu-Channel

Pengembangan teknik rekaman single-channel adalah suatu kemajuan besar

untuk studi fungsi reseptor ion-channel (Neher dan Sakmann, 1976). Untuk pertama

kalinya menjadi mungkin untuk mengajukan pertanyaan rinci tentang mekanisme

aktivasi dan blok ligan-gated ion-channel reseptor. Ini menjadi mungkin untuk

mengukur secara langsung durasi bukaan ion-channel dan penutupan dan

menghindari beberapa asumsi yang paling membatasi yang telah diperlukan ketika

menafsirkan catatan saat makroskopik. Hal yang menarik adalah bahwa, meskipun

rekaman single-channel yang umumnya dibuat pada kesetimbangan, adalah mungkin

untuk memperoleh informasi rinci tentang tingkat saluran membuka dan menutup.

Hal ini karena, dalam arti, setiap molekul tunggal tidak pernah pada kesetimbangan,

tetapi menghabiskan acak kali didistribusikan di negara-negara konformasi yang

berbeda. Panjang rata-rata waktu yang dihabiskan dalam masing-masing negara

adalah sama dengan kebalikan dari jumlah tingkat semua rute yang mungkin untuk

meninggalkan menyatakan bahwa, sehingga pengukuran saluran kali terbuka dan

tertutup kali memberikan informasi tentang konstanta laju untuk transisi dalam

mekanisme reaksi. Penjelasan lengkap penafsiran data single-channel adalah di luar

lingkup bab ini

.

6.2.8 Analisis Semburan Openings Ion-Channel

Persamaan (6.2) memprediksi bahwa bukaan saluran akan terjadi pada

kelompok atau semburan. Semburan bukaan terjadi karena setiap kali reseptor

mencapai keadaan A2R saluran dapat membuka atau molekul agonis dapat

memisahkan dari reseptor. Ketika agonis disosiasi tingkat k-2 mirip dengan saluran

membuka tingkat β, saluran dapat membuka dan menutup beberapa kali sebelum

agonis disosiasi terjadi, menghasilkan ledakan bukaan. Ledakan pembukaan dan

penutupan juga disebut sebagai aktivasi, yang dapat didefinisikan sebagai segala

sesuatu yang terjadi dari pembukaan pertama setelah mengikat agonis sampai akhir

pembukaan terakhir sebelum semua molekul agonis memisahkan dari reseptor (jelas,

kesempatan di mana agonis mengikat dan kemudian memisahkan tanpa membuka

saluran tidak terlihat). Itu diperkirakan bahwa ligand-gated ion-channel aktivasi

reseptor akan menghasilkan semburan saluran bukaan mengingat apa yang diketahui

tentang cepat transmisi sinaptik (ditinjau oleh Edmonds et al.,

1995), dan ide ini telah digunakan untuk menginterpretasikan data dari rekaman

single-channel dari channel AchR bukaan pada katak neuromukular (Colquhoun dan

Sakmann, 1985).

Dari Persamaan. (6.2), waktu buka rata-rata diperkirakan menjadi kebalikan

dari tingkat konstan untuk Saluran penutupan (τopen = 1 / α). Untuk semburan

tercatat pada konsentrasi agonis yang sangat rendah, mean Waktu tertutup dalam

semburan, τg, adalah sama dengan 1 / (β + 2k-2), dan jumlah rata-rata kesenjangan

per meledak, Ng, sama dengan β/2k-2. Dengan menggunakan dua persamaan

simultan, itu kemudian memungkinkan untuk menghitung β dan k-2.

Dari rekaman semburan rekombinan embrio otot bukaan saluran AchR tikus

pada konsentrasi rendah dari Ach (kurang dari 1 M), durasi pembukaan dan

penutupan dan jumlah penutupan per meledak diukur. Rata-rata τopen = 3,0 msec, τg

= 94 κsec, dan Ng = 0.86, memberikan α = 333 detik-1, β = 4919 detik-1, dan k-2 =

2.860 sec-1. Jika kita asumsikan k +2 = 2 × 108 M-1sec-1, kemudian KA = 14 pM.

Dengan demikian, β / α = 15 dan popen maksimum = β / (α + β) = 0,94. Nilai-nilai ini

konsisten dengan yang diperoleh dari pas kurva p terbuka pada Gambar 6.4. Rasio β /

(α + β) menunjukkan bahwa Ach adalah agonis-efficacy tinggi, sedangkan nilai yang

besar untuk β menunjukkan bahwa [Ach] tinggi akan sangat cepat (dalam beberapa

ratus mikrodetik) mengaktifkan saluran, seperti yang diamati selama transmisi

neuromuskular (Edmonds et al., 1995).

6.3 Antagonisme Dari Reseptor Ion-Channel

Penggunaan metode Schild untuk estimasi kesetimbangan disosiasi konstan

kompetitif antagonis dijelaskan secara rinci dalam Bab 1. Keuntungan besar dari

metode Schild terletak pada Fakta bahwa itu adalah metode nol: agonis hunian

dengan atau tanpa kehadiran antagonis diasumsikan harus sama ketika tanggapan

dalam ketiadaan atau adanya antagonis yang sama. Bahkan ketika

hubungan antara hunian dan respon yang kompleks, metode Schild telah ditemukan

untuk bekerja dengan baik.

6.3.1 Antagonisme Kompetitif Dan Persamaan Schild

Menggunakan prosedur yang diuraikan dalam Bab 1, itu sangat mudah untuk

menunjukkan bahwa persamaan Schild juga diperoleh untuk antagonisme kompetitif

reseptor ion-channel dalam kasus agonis tunggal situs pengikatan. Namun, ketika

mempertimbangkan dua situs mengikat agonis, situasinya lebih rumit

karena beberapa pertanyaan baru tentang mekanisme harus dijawab:

• Apakah afinitas antagonis untuk kedua situs mengikat yang sama? Hal ini sangat

mungkin bahwa bahkan jika agonis memiliki afinitas yang sama untuk kedua situs,

antagonis tidak akan.

• Dapatkah dua molekul antagonis menempati reseptor pada saat yang sama?

• Apakah pengikatan antagonis di satu lokasi mempengaruhi afinitas dari situs

lain baikagonis atau antagonis?

Situasi dapat disederhanakan dengan asumsi:

• Agonis afinitas di setiap situs adalah sama.

• Antagonis afinitas di setiap situs adalah sama.

• Hunian satu situs dengan baik agonis atau antagonis tidak mempengaruhi

afinitas

situs kedua baik untuk agonis atau antagonis.

Bahkan dengan asumsi menyederhanakan, mekanisme untuk menggambarkan

tindakan simultan dari kedua agonis dan antagonis pada reseptor dua-mengikat-situs

yang kompleks:

Sebuah ekspresi untuk hunian kesetimbangan pA2R * dapat lagi diperoleh

dengan menggunakan metode diuraikan dalam Bab 1. Sebuah komplikasi yang

potensial adalah bahwa mekanisme ini mengandung sebuah siklus, sehingga produk

dari laju reaksi di kedua arah searah jarum jam dan berlawanan harus sama dalam

Untuk memastikan prinsip reversibilitas mikroskopis dipertahankan. Dalam kasus ini,

mikroskopis reversibilitas dipertahankan. Dengan demikian.

Di hadapan kedua-duanya agonis A dan B musuh, pA2R* bergantung pada

kedua-duanya agonis dan musuh konsentrasi di dalam benar-benar pertunjukan yang

diperrumit; bagaimanapun, hubungan itu adalah sangat utama satu perluasan dari Eq.

(63) dan adalah tiba di sebagai berikut:

1. Ukuran semua wujud dari sel yang peka rangsangan itu harus menjumlahkan

kepada nya:

2. Ketika sistim adalah di keseimbangan, masing-masing reaksi yang individu masuk

Eq. (69) dapat digunakan untuk menulis ungkapan-ungkapan untuk masing-

masing wujud dari sel yang peka rangsangan dalam kaitan dengan?dengan

menggunakan istilah bentuk aktif dari sel yang peka rangsangan, A2R*:

Hubungan antara pA2R* dan kedua-duanya konsentrasi agonis dan musuh kemudian

bisa ditulis sebagai:

Itu telah jelas dari perbandingan dari Eq. (614) dengan Eq. (63), direproduksi di

bawah seperti(ketika Eq. (615) dengan KA = K1 =K2,

bahwa ada sekarang tanpa ungkapan yang sederhana yang berhubungan perbandingan

dosis kepada konsentrasi musuh. Setelah penyamaan pemilikan-pemilikan di dalam

ketidakhadiran dan kehadiran dari blok dan mengalikan konsentrasi agonis di Eq.

(614) oleh perbandingan dosis, r dapat ditemukan dari ungkapan:

Ungkapan ini dapat diatur kembali untuk memberi suatu persamaan quadrat di dalam

r

dan ini dapat diatur kembali untuk memiliki wujud patokan:

dua solusi siapa ditemukan dari penyamaan:

Satu solusi adalah hal negatif dan yang lain adalah (barangkali anehnya!) penyamaan

Schild yang terbiasa:

Lebih secara langsung, mungkin saja dilihat oleh pemeriksaan Eqs. (614) dan (615)

itu:

maka untuk kiri kanan(di mana-mana sisi-sisi dari penyamaan untuk bersifat sama

ini,

dan penyamaan Schild menerapkan. Jadi; Dengan demikian, jika kita berasumsi

bahwa kedua tapak pengikat bersifat mandiri dan serupa, lalu Schild penyamaan

pegang(jaga untuk mekanisme two-binding-site. Jika bagaimanapun, musuh mengikat

dengan yang yang berbeda [gaya gabung/ hubungan dekat] kepada masing-masing

lokasi, lalu perbandingan dosis menjadi suatu fungsi kompleks kedua-duanya agonis

dan musuh konsentrasi-konsentrasi dan tetapan keseimbangan (Colquhoun, 1986). Itu

adalah, oleh karena itu, tidak mengejutkan bahwa a pergeseran paralel dari meletus

kurva dengan meningkatkan konsentrasi musuh adalah yang diramalkan untuk

menjadi tidak mengamati ketika tapak pengikat itu bersifat yang berbeda, sehingga

perbandingan dosis akan bergantung pada tingkatan tanggapan di mana itu

di/terukur. Bagaimanapun, beberapa pengandaian sederhana dapat masih sebagai

dibuat. Jika itu letus adalah kecil ([ Suatu] <<KA), lalu satu pergeseran kira-kira

paralel dari kurva doseŔresponse terjadi dan perbandingan dosis adalah:

Di sini, KB1 dan KB2 adalah tetapan keseimbangan untuk blok di dua lokasi.

Di dalam situasi ini, alur cerita Schild bukanlah linear; itu mempunyai suatu

keserongan dari kurang dari kesatuan pada konsentrasi-konsentrasi musuh di

sekeliling SEMBUR (di mana KB = (KB1KB2)1/2) dan menuju ke kepada kesatuan

pada ketinggian atau pada konsentrasi-konsentrasi musuh yang rendah (Colquhoun,

1986).

Satu contoh dari pemakaian alur cerita Schild di dalam menguji tindakan

tubokurarina musuh di AChRs di sambungan neuromuskulus kodok (Colquhoun et

al., 1979) ditunjukkan di dalam Gambar 65. Figur ini menggambarkan satu

eksperimen di mana jaring dalam batin arus mengukur sebagai jawaban atas yang

yang berbeda konsentrasi-konsentrasi carbachol adalah yang direncanakan pertama

di dalam ketidakhadiran (kendali) dan lalu di hadapan meningkatkan konsentrasi-

konsentrasi tubokurarina. Perekaman-perekaman diserang dua potensi membran yang

berbeda dan Schild merencanakan karena masing-masing potensi membran dibangun.

Hasil-hasil menggambarkan itu, pada Ŕ70 mV, alur cerita Schild adalah linear dan

mempunyai suatu keserongan dekat dengan kesatuan, mengusulkan pertentangan

kompetitif

GAMBAR 65 Use dari metoda Schild untuk penilaian KB dari suatu akting musuh

yang kompetitif pada suatu ion yang ligand-gated menggali sel yang peka

rangsangan. (suatu) Bukukan concentrationresponse membengkok karena

keseimbangan menjaring dalam batin arus (.Aku‡) yang ditimbulkan oleh carbachol

di hadapan meningkatkan konsentrasi-konsentrasi tubokurarina (TC) pada suatu

potensi membran dari .70 mV (atas panel) dan pada suatu potensi membran dari .120

mV (panel lebih rendah). Itu dapat dilihat itu, kecuali konsentrasi yang paling tinggi

TC ( 5 ƒÊM), pada .70 musuh mV ini menghasilkan satu pergeseran kira-kira paralel

dari carbachol doseresponse membengkok sebagai yang diharapkan untuk

pertentangan yang kompetitif. Bagaimanapun, di dalam eksperimen yang sama pada

suatu potensi membran dari .120 mV, pergeseran dari doseresponse membengkok

adalah jauh dari paralel. Ini adalah karena molekul tubokurarina yang bermuatan

positif sedang tertarik ke dalam AChR menggali ketika di dalam dari sel itu dibuat

lebih hal negatif. Garis putus di dalam atas dan menurunkan diskusi beregu yang

tanggapan-tanggapan meramalkan untuk pertentangan murni kompetitif dengan KB =

027 ƒÊM. Perbandingan-perbandingan dosis dihitung pada suatu tanggapan tingkat

.8 nA pada .70 mV dan .24 nA pada .120 mV. (b) Schild alur cerita dari batang kayu (

r . 1)melawan terhadap batang kayu (konsentrasi tubokurarina). Pertunjukan

lingkaran-lingkaran yang diisi perbandingan-perbandingan dosis keseimbangan pada

.70 mV, perbandingan-perbandingan dosis keseimbangan pertunjukan segi tiga yang

diisi pada .120 mV, dan membuka segi tiga menunjukkan tanggapan puncak pada

.120 mV. Karena blok salur terbuka oleh tubokurarina adalah secara relatif melambat

untuk berkembang, ketika tanggapan puncak pertentangan kompetitif sebagian besar

yang di/terukur dilihat dan keserongan Schild adalah dekat dengan kesatuan. Fakta

bahwa kedua-duanya kurva-kurva bersamaan waktu pada konsentrasi-konsentrasi

musuh yang rendah (perbandingan-perbandingan dosis kecil) nyatakan bahwa KB

untuk pengikatan bersaing kepada sel yang peka rangsangan itu tidak terikat pada

potensi membran, seperti(ketika boleh jadi diharapkan jika tapak pengikat agonis di

luar ladang potensi membran itu. ( Yang diadaptasikan dari Colquhoun, D.et al.,

J.Physiol., 293, 247284, 1979.)

6.3.2 BLOK ION-CHANNEL

Mekanisme ganjal saluran ion mempunyai secara luas diuji dan yang ditemukan

untuk bersifat penting di dalam kedua-duanya ilmu farmasi dan ilmu faal. Contoh-

contoh adalah blok dari sodium syaraf dan berhubungan dengan jantung menggali

oleh anestetik lokal, atau blok dari sel yang peka rangsangan NMDA menggali oleh

Mg2+ dan ketamine yang anesthetic. saluran menghalangi mekanisme pertama

digunakan menurut banyaknya untuk menguraikan blok dari K akson ikan cumi-

cumi+ arus oleh tetraethylammonium (TEH) notulen. Barang kepunyaan dari saluran

blockers di potensi-potensi yang synaptic dan arus-arus synaptic diselidiki, terutama

sekali di sambungan neuromuskulus, dan pengembangan dari teknik perekaman

saluran tunggal mengizinkan kemacetan-kemacetan saluran untuk mengamati secara

langsung untuk pertama kali.

6.3.3 SUATU MEKANISME UNTUK BLOK SALURAN

Gagasan di mana narkoba bisa bertindak oleh secara langsung menghalangi alir

notulen melalui ion menggali mungkin dimulai, seperti umumnya hipotesis, sebagai

suatu semacam gagasan abstrak? ringkasan tanpa dasar secara fisik. Adalah mudah ke

[menggambar/ menarik] suatu rencana bahwa termasuk kira-kira menyambungkan

suatu muara, menghalangi alir mempermudah saluran (saluran ion); bagaimanapun,

untuk maju, perlu mengkonversi gambar? penarikan ke dalam suatu mekanisme yang

secara phisik masuk akal (yaitu., tidak melanggar manapun hukum yang diterima

yang dari ilmu fisika) dan sediakan ramalan-ramalan kwantitatif bahwa dapat diuji

secara eksperimen. Idealnya, tujuan itu adalah untuk menaksir tetapan laju asosiasi

dan pemisahan untuk obat/racun ganjal saluran. Ini akan lalu memberi tetapan

keseimbangan pemisahan (MENYEMBUR) untuk obat/racun jilid. Seperti halnya

dalam pemakaian metoda Schild untuk mengukur pertentangan kompetitif, suatu

yang kwantitatif perkiraan dari KB untuk blok saluran mengizinkan [membiarkan

perbandingan dari berbagai narkoba dan suatu yang pharmakologis penggolongan

ion menggali kepada mana mereka mengikat. Dengan kata lain, kita bisa berkata

bahwa ketika satu ion menggali bersikap terbuka, lokasi pengikatan obat diunjukkan.

Jika suatu obat/racun mengikat kepada lokasi itu, arus notulen melalui saluran itu

dihalangi. Kita mungkin lebih lanjut mengira bahwa obat/racun harus melepas blok

sebelum saluran itu dapat menutup secara normal. Suatu mekanisme yang standar

menggunakan untuk menguraikan blok saluran dari ion yang ligand-gated menggali

sel yang peka rangsangan kemudian adalah:

di mana â dan á adalah pembukaan saluran dan kurs penutup, dan k+B dan kŔB

adalah yang mikroskopis tetapan laju asosiasi dan pemisahan untuk menghalangi

saluran oleh obat/racun B. Di sini, [B] adalah yang ditandai di transisi ke dalam

keadaan terblok itu untuk mengingatkan pembaca yang tingkat reaksi ini bergantung

pada [B]. Kenali bahwa ini mekanisme tidak mempertimbangkan kemungkinan

bahwa suatu obat/racun bisa mengikat kepada saluran di dalam yang tertutup

(menduduki atau tak terpakai) penyesuaian. Dengan mekanisme-mekanisme seperti

ini semua, itu sering mungkin untuk menyederhanakan analisa dari tindakan a

saluran menghalangi dengan mengira bahwa jilid agonis adalah banyak lebih cepat

dari pembukaan saluran dan menutup dan lalu mengkombinasikan beberapa negara

yang tertutup bersama-sama sehingga mekanisme mendekati suatu tiga status(negara

sistim:

Kenali bahwa tingkat pembukaan saluran kini ditandai ƒÀŒ.Karena saluran itu

hanya dapat membuka dari status(negara A2R, tingkat pembukaan yang efektif,

ƒÀŒ,diperoleh dengan perkalian tingkat pembukaan yang riil ƒÀoleh pemilikan

keseimbangan dari A2R:

6.3.4 ILMU GERAK YANG MAKROSKOPIK: RELAKSASI-RELAKSASI

(Seperti ARUS-ARUS SYNAPTIC) DAN SUARA GADUH

Berubah di dalam pemilikan dari status(negara salur terbuka dari sel yang peka

rangsangan sebagai suatu fungsi waktu ( pA2R*(t sebagai jawaban atas suatu

gangguan keseimbangan sel yang peka rangsangan dapat digunakan untuk

memperoleh informasi tentang daftar biaya pengiriman barang-barang dari saluran

gating dan interaksi narkoba dengan ion menggali sel yang peka rangsangan. Sistim

itu adalah yang dikatakan kepada kendur ke arah suatu keseimbangan yang baru.

Waktu sepanjang relaksasi itu digunakan untuk mengukur daftar biaya pengiriman

barang-barang dari perilaku rerata dari banyak ion menggali di suatu perekaman,

selagi analisa suara gaduh menggunakan frekuensi dari fluktuasi-fluktuasi moment-

to-moment di dalam pemilikan dari status(negara salur terbuka pada keseimbangan

untuk menyediakan informasi tentang daftar biaya pengiriman barang-barang di

dalam mekanisme sel yang peka rangsangan. Untuk negara kali 1000, suatu relaksasi

(atau menyiarkan spektrum) akan berisi k1 bersifat exponen (atau Lorentzian)

komponen-komponen. Jadi; Dengan demikian, mekanisme di Eq. (625) di atas akan

memiliki dua negara di dalam ketidakhadiran dari blok dengan demikian

mengakibatkan relaksasi-relaksasi (atau menyiarkan spectra) bahwa dapat dicoba

dengan bersifat exponen yang tunggal (atau Lorentzian) berfungsi. Penambahan blok

menciptakan satu status(negara yang tambahan (keadaan terblok), memberi kali 1000

=3. Untuk kali 1000 =3, pemilikan dari tempat terbuka menyatakan sebagai suatu

fungsi waktu akan digambarkan oleh dua bersifat exponen:

Timbal-balik dari tetapan-waktu, ƒÑ1 dan ƒÑ2, adalah tetapan laju ƒÉ1 dan

ƒÉ2. Timbangan dari yang bersifat exponen (w1 dan obligasi pangkalan) diper;rumit

fungsi-fungsi laju alihan di Eq. (625).

Bagaimanapun, tetapan laju itu adalah eigennilai-eigennilai yang ditemukan

dengan pemecahan sistern persamaan diferensial bahwa menguraikan mekanisme

tersebut. ƒÉ 1 dan ƒÉ2 adalah kedua solusi-solusi persamaan quadrat:

di mana

dan

Pemberitahuan bahwa ketika ƒÀŒ kecil (yaitu., ketika pemilikan dari A2R adalah

sangat kecil,karena akan jika konsentrasi agonis adalah rendah), lalu

dan

Dengan pengandaian sederhana suatu yang kecil ƒÀŒ,jumlahan dan produk

dari tetapan laju yang di/terukur dalam satu eksperimen dapat digunakan untuk

mengkalkulasi kB dan k+B jika ƒ¿dikenal dari eksperimen-eksperimen di dalam

ketidakhadiran dari blok. Hal ini yang hanyalah dilaksanakan dengan merencanakan

jumlahan atau produk dari yang di/terukur tetapan laju melawan terhadap konsentrasi

blok. Dari Eq. (632) di atas, produk dari tetapan laju harus tidak terikat pada

konsentrasi blok dengan suatu nilai sepadan dengan ƒ¿kB, selagi jumlahan dari

tetapan laju ( Eq. (631)) akan memberi suatu garis lurus dengan keserongan sepadan

dengan k+B dan perpotongan dari ƒ¿ +kB. Jika data yang bersifat percobaan adalah

konsisten dengan ramalan-ramalan ini, lalu data menunjuk yang direncanakan di

dalam ini cara perlu [berada/dusta] di suatu garis lurus, dan ini adalah bukti baik

yang mekanisme tindakan obat/racun untuk menghalangi saluran ion tempat terbuka.

Asumsi yang ƒÀŒsangat kecil sudah digunakan ketika mempelajari barang

kepunyaan dari saluran blockers di arus-arus yang synaptic, seperti(ketika

konsentrasi pemancar (dan karenanya pA2R) mungkin kecil selama tahap kebusukan

dari arus. Selama analisa suara gaduh mengadakan percobaan, suatu konsentrasi

agonis yang rendah digunakan sehingga, lagi; kembali, di bawah kondisi-kondisi ini

ƒÀŒharus kecil.

6.3.5 SALURAN MENGHALANGI PADA KESEIMBANGAN

Hubungan antara meletus (pcontrol) dan konsentrasi agonis untuk dua tapak

pengikat agonis mekanisme disampaikan dalam Eq. (64) dan reproduksi di bawah di

suatu wujud sedikit yang berbeda:

Ketika satu blok salur terbuka ditambahkan, masuk dengan tiba-tiba kehadiran dari

blok (pblocker) memberi di bawah adalah suatu fungsi kedua-duanya agonis (Suatu)

dan blok (B) konsentrasi:

Mengambil rasio pcontrol/pblocker memberi hasil sederhana ini:

Karena arus merekam di suatu eksperimen pengapit volt adalah berbanding

lurus kepada saluran meletus, rasio arus di dalam ketidakhadiran dari blok kepada

arus di hadapan meningkatkan konsentrasi-konsentrasi blok dapat digunakan untuk

mengkalkulasi KB. Rancangan percobaan itu diharapkan untuk memperoleh suatu

tanggapan yang cukup besar kepada agonis sendirian dan lalu mengkalkulasi rasio

reaksi kontrol ini untuk tanggapi kepada konsentrasi yang sama agonis di hadapan

meningkatkan konsentrasi-konsentrasi blok saluran. Perbandingan pcontrol/pblocker

ketika yang direncanakan melawan terhadap [B] akan merupakan suatu garis lurus

bahwa menginterupsi sumbu-y pada 1 dan mempunyai suatu keserongan dari

pcontrol/KB. Jika pcontrol =1, lalu keserongan =1/KB. Jika pcontrol dikenal untuk

konsentrasi agonis tertentu, lalu sungguh-sungguh KB dapat masih sebagai

diperkirakan. Jika kita mengasumsikan pcontrol = 1, lalu KB yang dihitung akan

lebih besar dari KB yang benar: sebagai contoh, oleh suatu faktor dari 2 jika pcontrol

= 05 dan oleh suatu faktor dari 10 jika pcontrol =01.

6.3.6 ANALISA SINGLE-CHANNEL DARI BLOK SALURAN

Di bawah adalah satu garis besar dari sebagian dari informasi bahwa dapat

diperoleh dari data saluran tunggal menggunakan pengukuran-pengukuran sederhana

[secara] wajar seperti rata-rata membuka waktu dan nilai-tengah menutup waktu.

Analisa ini adalah yang digambarkan di dalam Gambar 66 karena blok dari sel yang

peka rangsangan NMDA menggali oleh Mg2+ notulen.

6.3.6.1 Waktu Yang Terbuka

Gali blockers akan menghasilkan suatu pengurangan rata-rata membuka waktu

dari:

di dalam kendali itu untuk:

di hadapan blok, yang yang dihitung dari aturan yang umur purata tentang segala

status(negara memadai;sama dengan yang timbal balik dari jumlahan dari daftar

biaya pengiriman barang-barang untuk meninggalkan bahwa status(negara

(Colquhoun dan Hawkes, 1982). Suatu alur cerita dari 1/ƒÑ melawan terhadap [B]

perlu, oleh karena itu, memberi suatu garis lurus dari keserongan k+B. Ini

digambarkan di dalam Gambar 66C, di mana untuk bidang potensi membran dan

Mg2+ konsentrasi- konsentrasi kebalikan NMDA saluran nilai-tengah membuka

waktu mengikuti hubungan linier ini, memberi k+B nilai-nilai di dalam cakupan 66

•~106 M.1sec.1 pada .40 mV kepada 84•~107 M.1sec.1 pada .80 mV.

6.3.6.2 Waktu Yang Tertutup

Periode-periode tertutup karena kemacetan-kemacetan saluran mempunyai, dari

aturan yang sama, suatu umur purata dari:

Catat bahwa jangka waktu kemacetan-kemacetan saluran diramalkan untuk

menjadi tidak terikat pada konsentrasi blok, seperti yang digambarkan di dalam

Gambar 66D, di mana jangka waktu kemacetan menunjukkan tidak ada

ketergantungan yang jelas bersih di Mg2+ konsentrasi.

6.3.6.3 Frekuensi Kemacetan

Frekuensi dari kemacetan-kemacetan, per detik dari waktu yang terbuka, adalah

k+B[B], sehingga nomor nilai-tengah dari kemacetan-kemacetan pada setiap

pembukaan saluran hanyalah frekuensi kemacetan dikalikan dengan rata-rata

membuka waktu:

6.3.6.4 Bursts dari Openings

Di mana blok saluran mengkonversi tunggal membuka ke dalam yang jelas

nyata meledak (eg., blok anestetik lokal dari nicotinic menggali), nomor rata-rata

tentang membuka per meledak adalah satu lagi dibanding nomor rata-rata dari

kesenjangan; celah; jurang (kemacetan-kemacetan):

GAMBAR 66 analisa Single-channel blok saluran ion. Perekaman-perekaman wakil

arus-arus saluran tunggal melalui sel yang peka rangsangan NMDA menggali

direkam digambarkan pada potensi membran dari .20 mV, .50 mV, dan .80 mV

terkendali merekam (Suatu) dan di hadapan magnesium 40-ƒÊM (B). Ganjal yang

cepat dan lepas blok tentang saluran itu terutama sekali jelas pada voltase-voltase

lebih negatif. Nilai-tengah kebalikan membuka waktu dan kebalikan berarti jangka

waktu penutupan-penutupan saluran yang tambahan disebabkan oleh Mg2+

direncanakan melawan terhadap Mg2+ konsentrasi di dalam (C) dan (D). Hasil-hasil

ini mengkonfirmasikan hubungan yang linier antara Mg2+ konsentrasi dan kebalikan

berarti waktu terbuka dan ketiadaan Mg2+ ketergantungan konsentrasi dari saluran

yang diramalkan oleh salur terbuka yang sederhan mekanisme blok. Garis utuh di

dalam (C) gambarkan regresi linier data merekam pada masing-masing selaput

potensi. Keserongan-keserongan bentuk ini beri perkiraan-perkiraan dari nilai dari

k+B dari 66, 157, 266, 404, dan 840 •~106 M1 sec1 pada . 40-, . 50-, . 60-, .70-, dan

.80-mV potensi membran.

Kenali bahwa jumlah keseluruhan nilai-tengah membuka waktu per meledak akan :

Ini adalah satu hasil yang penting. Salur terbuka yang sederhana menghalangi

mekanisme meramalkan bahwa jumlah keseluruhan membuka waktu per meledak

adalah sama ketika rata-rata membuka waktu di dalam ketidakhadiran dari blok

(Neher, 1983), bahkan meskipun [demikian] membuka kini dipotong-potong oleh

kemacetan-kemacetan saluran. Sebenarnya, karena saluran-saluran bahwa memberi

meledak tentang membuka terkendali merekam, jumlah keseluruhan membuka waktu

per meledak konstan di dalam kehadiran atau ketidakhadiran dari blok.

Hasil ini adalah juga dari arti penting karena itu menunjukkan salur terbuka

sederhana itu blockers tidak kurangi beban?tugas lewat saluran selama masing-

masing pengaktifan sehingga mereka tidak akan mengurangi beban? tugas yang

disuntik pada suatu sinapsis oleh suatu arus yang synaptic. Sebagai gantinya, mereka

memperpanjang waktu di mana beban? Tugas disuntik yang dapat mempunyai barang

kepunyaan sungguh dramatis di transmisi yang synaptic.

6.3.6.5 Meledak Panjangnya

Rata-rata meledak panjangnya ditemukan seperti yang ditunjukkan di bawah:

Jadi; Dengan demikian suatu alur cerita dari rata-rata meledak panjangnya

melawan [B] akan memberi suatu garis lurus dari perpotongan 1/á dan keserongan

1/(áKB).

6.3.7 SKALA WAKTU DARI BLOK SALURAN

Gali blockers sering digolongkan sebagai yang lambat, intermediate/antara, atau

blockers cepat, yang yang didasarkan pada sangat lebar cakupan berharga yang telah

ditemukan untuk tetapan laju pemisahan yang mikroskopis dari gali blockers. Hampir

semua saluran blockers telah ditemukan untuk memiliki asosiasi yang mikroskopis

tetapan laju (k+B) di dalam cakupan di sekitar 107 MŔ1secŔ1. Di dalam kontras,

tingkat pemisahan mikroskopis tetap (kŔB) mencakup (di) atas beberapa

order(pesanan dari besaran dari di sekitar 105 secŔ1 (eg., blok dari nicotinic sel yang

peka rangsangan menggali oleh ACh) kepada 001 secŔ1 untuk MK-801 (dizocilpine)

blok dari NMDA menggali. panjangnya-panjangnya nilai-tengah dari kesenjangan;

celah; jurang kemacetan dapat oleh karena itu mencakup dari 10 ìdetik sampai

dengan 100 detik. Hanyalah ketika kemacetan-kemacetan itu di dalam cakupan

intermediate/antara, menyerupai 1 msec di dalam jangka waktu, bahwa kesenjangan;

celah; jurang adalah dengan mudah mendeteksi di dalam perekaman-perekaman

saluran tunggal. Jika blok itu adalah suatu blok yang lambat dengan kemacetan yang

sangat panjang kesenjangan; celah; jurang, catatan data kelihatan seolah-olah

frekuensi dari pembukaan-pembukaan saluran sudah berkurang. Jika blok adalah

puasa, amplitudo saluran tunggal muncul dikurangi karena ganjal dan melepas blok

juga puasa untuk dipecahkan.

6.3.8 KETERGANTUNGAN PENGGUNAAN DARI SALURAN BLOCKERS

Itu mengikuti dari fakta yang blok diasumsikan untuk mengikat hanya untuk

keadaan teraktif dari saluran bahwa derajat tingkat dari blok akan bukanlah hanya

konsentrasi tergantung tetapi juga menggunakan tergantung; di dalam yang lain kata-

kata, semakin banyak saluran-saluran itu diaktipkan, semakin banyak mereka menjadi

dihalangi Itu mengikuti dari di atas diskusi di timbangan waktu dari saluran

menghalangi bahwa derajat tingkat berguna ketergantungan akan dengan kritis

tergantung pada tetapan laju pemisahan yang mikroskopis. Lambat blockers

tunjukkan ketergantungan penggunaan ekstrim, yang ditambahkan dengan blockers

mempertunjukkan peristiwa penjeratan. Menjerat terjadi ketika saluran itu dapat

menutup dan agonis memisahkan dengan blok masih yang terbelenggu di dalam

saluran. Blok itu kemudian adalah menjerat di dalam saluran sampai lain waktu sel

yang peka rangsangan diaktipkan. Contoh-contoh penting tentang blok penjeratan

termasuk tindakan hexamethonium pada yang autonomic ganglia dan blok dari sel

yang peka rangsangan NMDA menggali oleh MK801 atau ketamine yang anesthetic.

6.3.9 KETERGANTUNGAN VOLTASE DARI BLOK SALURAN

Salah satu [dari] hasil-hasil yang menarik timbul dari awal pengapit volt

mengadakan percobaan dengan ganjal saluran narkoba adalah bahwa/karena potensi

dari blok itu tergantung pada voltase selaput. Di dalam kontras, ini ditemukan untuk

menjadi tidak kasus untuk pertentangan yang kompetitif pada pelat ujung nicotinic

sel yang peka rangsangan (Gambar 65). Hasil ini ditafsirkan sebagai menunjukkan

bahwa tapak pengikat asetilkolina di sel yang peka rangsangan (- dan blok kompetitif

oleh karena itu pada lokasi itu oleh tubokurarina) tidak dipengaruhi oleh potensi

perbedaan ke seberang selaput; sedangkan, jika jilid dimakan karat oleh potensi

membran, lalu tapak pengikat harus pada suatu daerah protein yang menjadi bagian

dari cara ke seberang medan elektrik dari selaput. Jilid suatu obat/racun yang

dibebankan pada suatu lokasi di dalam satu medan elektrik akan dipengaruhi oleh

bahan kimia interaksi-interaksi (seperti ikatan hidrogen, umum kepada semua

interaksi drugŔreceptor) dan oleh medan elektrik dan beban?tugas di obat/racun.

Tetapan laju yang mikroskopis untuk asosiasi dan pemisahan pada suatu lokasi di

dalam satu medan elektrik (- karena blok oleh narkoba yang dibebankan) adalah

fungsi eksponensial voltase selaput:

Di sini, dilihat pada pecahan voltase selaput yang pikiran sehat obat/racun ganjal di

jilid lokasi, dan memulai siaran äditentukan oleh apakah obat/racun ganjal mendekati

tapak pengikat dari di dalam atau di luar selaput. Seperti yang dinyatakan di sini,

penyamaan-penyamaan ini menguraikan tingkat konstan-konstan untuk blok dari di

luar. Valensi dari obat/racun ganjal diberi sebagai z, dan F, R, dan T adalah konstanta

Faraday (9,65 × 104c mol-1), tetapan gas (8.32 JK-1mol-1), dan absolutetemperature

(293 K pada suhu kamar), masing-masing. Tegangan ketergantungan konstanta

kesetimbangan disosiasi diberikan oleh:

Dari hubungan ini dapat dilihat bahwa plot semilog dari LNK (V) vs membran

potensial akan memberikan garis lurus dengan kemiringan δzF / RT dan intercept dari

LNK (0). Kebalikan dari lereng memberikan perubahan tegangan membran yang

diperlukan untuk memberikan perubahan e-kali lipat dalam konstanta kesetimbangan.

Hal ini dapat dilihat bahwa kemiringan maksimum akan diperoleh ketika δ = 1.

Untuk blocker dengan satu biaya, ini akan memberikan kemiringan maksimum 25

mV untuk perubahan e-lipat sedangkan untuk ion divalen, kemiringan maksimum

akan 13 mV untuk perubahan e-lipat. Analisis ini diilustrasikan pada Gambar 6.7

untuk blok saluran reseptor NMDA oleh ion Mg2+.

Gambar 6.7A menunjukkan bahwa sebidang log k+B terhadap potensial

membran memberikan hubungan linier dengan kemiringan yang sesuai dengan δ =

0,76, sementara plot log k-B melawan potensial membran (Gambar 6.7B) juga linear

tetapi bukan sebagai tajam tegangan tergantung dengan δ = 0,21. Bagaimana

seharusnya hasil ini ditafsirkan? Mereka mungkin juga berarti bahwa hambatan

energi untuk Mg2+

mendekati tempat ikatannya dan disosiasi dari situs mengikat

kembali ke solusi ekstraseluler tidak simetris, atau bahwa proporsi Mg2+

ion

meninggalkan situs mengikat mereka dengan menyerap melalui saluran ke dalam

membran sel. Tegangan ketergantungan konstanta kesetimbangan, K+B, menunjukkan

bahwa afinitas Mg2+

untuk saluran tersebut curam tegangan tergantung dengan δ =

0,97, menyiratkan bahwa ion Mg2+

merasakan hampir 100% dari medan listrik

membran di situs mereka mengikat (Ascher dan Nowak, 1998).

Mengingat bahwa saluran blocking obat, menurut definisi, bertindak dalam

jalur perembesan saluran, tidaklah mengherankan untuk menemukan bahwa interaksi

antara obat saluran-blocking dan ion permeant normal dapat mempengaruhi perilaku

blocker saluran. Ini adalah kasus untuk reseptor NMDA, di mana pendudukan situs

mengikat ion permeant memiliki dampak yang signifikan terhadap ketergantungan

tegangan diamati Mg2+

blok. Antonov dan Johnson (1999) telah menunjukkan bahwa

mengambil efek ini mempertimbangkan menempatkan Mg2+

yang situs pengikatan

ion pada posisi yang lebih dangkal (δ = 0,47) dalam medan listrik membran, yang

konsisten dengan posisi yang diprediksikan dua asparagin residu dekat puncak loop

M2 dari subunit reseptor NMDA, yang telah diidentifikasi dari modifikasi struktural

reseptor NMDA sebagai penting bagi Mg2+

blok saluran.

Ketergantungan tegangan curam blok saluran mendasari peran penting yang

Mg2+

blok saluran NMDA memainkan dalam memberikan reseptor NMDA milik

menjadi "detektor kebetulan" dalam sistem saraf. Properti ini mungkin mendasari

perilaku Hebbian sinapsis rangsang di otak dan dapat, pada prinsipnya,

memungkinkan jaringan neuron untuk menyesuaikan perilaku mereka sesuai dengan

pengalaman, maka, pada dasarnya, properti ini memungkinkan sistem saraf untuk

belajar dari pengalaman. Sebuah simulasi efek Mg2+

blok pada kondisi mapan saat ini

melalui saluran reseptor NMDA diilustrasikan pada Gambar 6.7D. Hal ini dapat

dilihat bahwa hubungan linier antara potensial membran dan arus reseptor NMDA

menjadi curam tegangan tergantung dengan meningkatnya Mg2+

konsentrasi-tion.

Pada tingkat fisiologis Mg2+

(1 mM), arus melalui saluran meningkat antara -80 dan -

20 mV mV sebagai Mg2+

yang blok lega dengan depolarisasi. Hal ini penting untuk

menghargai bahwa jenis efek juga akan terjadi pada tingkat yang lebih besar atau

lebih kecil dengan obat yang bertindak untuk memblokir saluran ion dan membuat

memprediksi aksi saluran-blocking obat, terutama pada sistem saraf, sangat rumit.

Gambar 6.8 menunjukkan representasi diagram dari hambatan energi bahwa

obat saluran-blocking mungkin seharusnya untuk mengatasi untuk membuka situs

yang mengikat di dalam saluran. Diagram ini memungkinkan untuk kemungkinan

bahwa obat memblokir benar-benar bisa menembus channel setelah mengikat

daripada kembali setelah disosiasi ke sisi yang sama seperti yang mereka berasal.

Mekanisme umum dapat digunakan untuk menggambarkan saluran blok dari kedua

sisi membran, akses ke Reseptor Terkait dengan Saluran Ion: Mekanisme Aktivasi

dan Blok

GAMBAR 6.7 Analysis dari tegangan-ketergantungan dari blok saluran reseptor

NMDA oleh Mg2+

. (A) Saluran-blocking rate, k+B, Diperkirakan dari kemiringan

garis dipasang ke data pada Gambar 4A, diplot terhadap potensial membran. Garis

padat menunjukkan fit dari Pers. (6.48) ke data dengan δ = 0,76 (mencerminkan e-

lipat peningkatan menghalangi laju untuk setiap 16,6 mV hyperpolarization dari

potensial membran) dan tingkat memblokir 2,66 × 107M

-1 detik

-1 pada -60 mV. (B)

Saluran tingkat blokir, k-B, Diperkirakan sebagai rata-rata nilai disetiap Mg2+

konsentrasi, menunjukkan ketergantungan tegangan dangkal daripada saluran

memblokir tingkat. Itu garis utuh menunjukkan cocok dengan data dari Pers. (6.49)

dengan δ = 0,21 (mencerminkan peningkatan e-kali lipat dalam tingkat memblokir

untuk setiap hyperpolarization mV 61 dari potensial membran) dan menghalangi laju

2,66 × 107M

-1 detik

-1 di -60 MV. (C) Tegangan ketergantungan konstanta

kesetimbangan, KB, untuk blok saluran, dihitung dari rasio k-B / k+B. Garis padat

menunjukkan kecocokan data dengan Pers. (6.50) dengan δ = 0,97 dan

menggambarkan tegangan curam ketergantungan KB yang meningkatkan e-lipat

untuk setiap 13 depolarisasi mV. (D) Simulasi arus-tegangan Hubungan dengan

adanya saluran blok curam tegangan yang tergantung. Saat ini kontrol adalah linier

fungsi dari tegangan membran, namun, dengan adanya konsentrasi rendah (60 M)

atau fisiologis Konsentrasi (1 mM) Mg2+,

Arus melalui saluran rectifies tajam pada

potensial negatif, mencerminkan ketergantungan tegangan curam konstanta

kesetimbangan, KB situs pengikatan tergantung pada ketinggian hambatan energi

yang molekul obat harus menyeberang. Lebih umum, Gambar 6.8 membantu untuk

menggambarkan gagasan bahwa perbedaan antara permeasi dari ion melalui saluran

dan blok saluran mungkin salah satu derajat dan belum tentu sebuah refleksi dari

perbedaan mendasar dalam cara ion permeant atau blocker berinteraksi dengan

protein channel.

6.4 KESIMPULAN

Materi dalam bab ini telah berpusat di sekitar efek obat pada reseptor di ligand-

gated ion channel kelas. Secara khusus, tujuannya adalah untuk menekankan bahwa

pengobatan kuantitatif

GAMBAR 6.8 Tampil merupakan representasi dari model dua-energi-penghalang

yang dapat digunakan untuk menggambarkan energi hambatan obat saluran-blocking

mungkin harus diatasi untuk mencapai tempat ikatannya dalam saluran. Itu hambatan

ditampilkan sebagai simetris dalam kasus ini, meskipun mereka tidak perlu selalu

begitu, dalam hal ini δ Nilai untuk akses ke situs mengikat tidak akan sama besarnya

dengan δvalue untuk mengikat dan kembali ke sisi yang sama dari membran.

Diagram ini memungkinkan untuk kemungkinan bahwa obat memblokir benar-benar

bisa menembus channel setelah mengikat daripada kembali ke sisi yang sama dari

membran itu awalnya berasal. Mekanisme umum dapat digunakan untuk

menggambarkan saluran blok dari kedua sisi membran, akses ke situs mengikat

tergantung pada ketinggian hambatan energi bahwa obat harus menyeberang. Energi

bebas, G, ditampilkan relatif terhadap luar membran. Tingkat transisi k1, K-1, K2, dan

k-2 akan tergantung pada kedua ketinggian penghalang energi dan potensi membran

dan dapat dihitung sebagai dijelaskan dalam Hille (1992). (Diadaptasi dari Hille, B.,

Saluran ionik dari Membran bersemangat, 2nd ed., Sinauer, Sunderland, MD, 1992,

ara. 5, chap. 14.).

Dari beberapa mekanisme sederhana dapat memungkinkan prediksi

eksperimental diuji harus dibuat untuk efek dari obat dan perkiraan afinitas obat

untuk situs / situs di reseptor mengikat. Karena mengukur interaksi obat dengan

reseptor mereka di jantung kemajuan dalam devel-bangan obat selektif dan klasifikasi

reseptor, pendekatan ini kemungkinan akan terus menjadi bagian penting dari

farmakologi. Hal ini khususnya terjadi untuk studi saraf pusat sistem, di mana

membingungkan subtipe reseptor menunggu perkembangan subtipe-selektif obat

sehingga makna fungsional dan terapi reseptor ini keragaman dapat ditentukan.

6.5 MASALAH

Masalah 6.1

Sebuah percobaan di mana AchR ion-channel arus tunggal dicatat pada potensial

membran -60 mV menunjukkan bahwa durasi bukaan saluran individu mengikuti

eksponensial tunggal distribusi. Waktu rata-rata terbuka adalah 5,0 msec. Ketika

percobaan diulang di hadapan dari antagonis, obat B, dalam konsentrasi 10 µM,

ditemukan bahwa waktu buka rata-rata adalah dikurangi menjadi 2,5 msec dan bahwa

bukaan saluran disela oleh periode singkat menutup dengan berarti durasi 1,0 msec

sehingga bukaan dikelompokkan ke semburan. Ketika percobaan itu diulang pada

potensial membran dari -120 mV, waktu buka rata-rata adalah 10 msec dalam

ketiadaan obat B tetapi hanya 2 msec dalam kehadirannya, interupsi dari bukaan

saluran telah menjadi lagi, berlangsung 2 msec rata-rata pada -120 mV. Hasil ini

konsisten dengan obat B menjadi membuka channel blocker.

a. Hitung asosiasi mikroskopis dan konstanta laju disosiasi dan konstanta

kesetimbangan untuk aksi obat B.

b. Apa yang bisa Anda katakan tentang situs kemungkinan kerja obat B yang

diberikan bahwa obat memiliki muatan positif tunggal?

Petunjuk: Kebalikan dari mean negara individu adalah jumlah tingkat (dalam detik-1

)

untuk meninggalkan negara itu.

Masalah 6.2

Dengan reseptor nicotinic endplate telah menemukan bahwa, serta mengaktifkan

reseptor, asetil-choline (Ach) blok saluran ion. Sebuah mekanisme yang mungkin

untuk menggambarkan situasi ini (dengan asumsi Oleh karena itu untuk

kesederhanaan hanya mengikat agonis tunggal diperlukan untuk mengaktifkan

reseptor) mungkin:

a. Menyatakan semua asumsi Anda butuhkan untuk membuat, menurunkan

ekspresi untuk kesetimbangan hunian AR * negara (PAR *) Dalam Pers.

(6.51).

b. Tuliskan ekspresi untuk waktu buka rata-rata (τo) dan durasi rata-rata yang

diblokir negara (τb). (Petunjuk: rata-rata seumur hidup negara manapun

adalah sama dengan kebalikan dari jumlah tarif untuk meninggalkan negara

itu.) Dalam percobaan yang dirancang untuk menguji mekanisme dalam

skema (6.51), dua konsentrasi tinggi Ach (300 dan 800 µM) diuji dalam

single-channel rekaman percobaan, dan τo, τb, Dan saluran terbuka

probabilitas (Pterbuka) Diukur. Hasilnya adalah sebagai berikut:

c. Menggunakan plot 1/τo vs. [Ach], menghitung k-2 dan k+3. Selain itu, hitung k-

3 dari durasi penyumbatan (τb) dan kemudian menghitung konstanta

kesetimbangan (K3) untuk blok dari saluran oleh Ach. Dalam percobaan lain,

nilai 107

M-1

sec-1

, 104 sec

-1, dan 10

4 sec

-1 ditemukan untuk k

1, k

-1, dan k

2.

d. Menggunakan ekspresi yang Anda turunkan dalam (a), menghitung nominal

PAR * Anda harapkan pada 300 dan 800 mM Ach. Bagaimana hal ini

dibandingkan dengan p eksperimen diamati membuka diberikan dalam tabel

di atas? Sarankan alasan mengapa dihitung dan diamati p terbuka mungkin

berbeda.

Masalah 6.3

Sebuah mekanisme sederhana untuk antagonisme kompetitif dari ligand-gated ion-

channel reseptor akan sebagai berikut:

a. Turunkan ekspresi untuk hunian keseimbangan negara AR diberikan

konsentrasi antagonis [B] dan agonis [A] dan konstanta laju mikroskopis

mereka untuk asosiasi dan disosiasi dengan reseptor. Dalam sebuah percobaan

yang dirancang untuk mengukur k-B dan k+B, agonis itu diterapkan pada

konsentrasi 100 µM (konstanta kesetimbangan untuk agonis diketahui 11

µM). Kemudian, langkah perubahan dalam konsentrasi antagonis dibuat dari

nol sampai [B] dan kembali ke nol lagi. Pada penerapan antagonis, respon

diamati menurun (rileks) secara eksponensial menuju tingkat kondisi mapan

blok dengan waktu pada τ konstan. Jika diasumsikan bahwa equilibrium

dengan agonis jauh lebih cepat daripada equilibrium dengan antagonis, maka

relaksasi waktu τ konstan pada dapat ditampilkan untuk skema (6.52) yang

akan dijelaskan oleh persamaan:

dimana Pbebas adalah bagian dari reseptor di negara R sebelum antagonis yang

diterapkan. Antagonis itu diuji pada tiga konsentrasi dan hasilnya adalah

sebagai berikut:

b. Hitung tingkat mikroskopis konstanta k+B dan k-B dan KB konstanta

kesetimbangan. Menggunakan dan persamaan Anda diturunkan pada bagian

(a), menghitung blok persen diharapkan pada kesetimbangan untuk masing-

masing konsentrasi antagonis yang digunakan. Seberapa baik nilai-nilai

dihitung sesuai dengan mereka amati dalam eksperimen? Sarankan

kemungkinan alasan mengapa dihitung keseimbangan blok mungkin tidak

setuju dengan itu teramati dalam eksperimen. Jelaskan apa rekaman saluran

tunggal dari aktivitas reseptor akan terlihat seperti pada kesetimbangan di

hadapan agonis sendirian dan dengan adanya agonis ditambah antagonis.

6.6 BACAAN

Buku teks dengan materi yang relevan:

Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes, 2nd ed., Sinauer, Sunderland, MD,

1992 (see chap. 7, Endplate channels and kinetics; chap. 15, Channel-block

mechanisms).

Ogden, D. C., Microelectrode Techniques: The Plymouth Workshop Handbook, 2nd

ed., The Company of Biologists, Ltd., Cambridge, U.K., 1994 (excellent

discussion of both methods and principles).

Sakmann, B. and Neher, E., Single Channel Recording, 2nd ed., Plenum Press, New

York, 1995 (many good articles that discuss methods and principles).

kertas asli:

Antonov S. M. and Johnson J. W., Permeant ion regulation of N-methyl-D-aspartate

receptor channel block by Mg(2+). Proc. Natl. Acad. Sci., 96, 14571Ŕ14576,

1999.

Ascher P. and Nowak L., The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate

responses of mouse central neurones in culture, J. Physiol., 399, 247Ŕ266,

1988.

Colquhoun, D., On the principles of postsynaptic action of neuromuscular blocking

agents, in New Neuro-muscular Blocking Agents, Kharkevich, D. A., Ed.,

SpringerŔVerlag, Berlin/New York, 1986.

Colquhoun, D. and Ogden, D. C., Activation of ion channels in the frog end-plate by

high concentrations of acetylcholine, J. Physiol., 395, 131Ŕ159, 1988.

Colquhoun, D. and Sakmann, B., Fluctuations in the microsecond time range of the

current through single acetylcholine receptor ion channels, Nature, 294, 464Ŕ

466, 1981. (The full version of this paper can be found in J. Physiol., 369,

501Ŕ557, 1985.)

Colquhoun, D., Dreyer, F., and Sheridan, R. E., The actions of tubocurarine at the

frog neuromuscular junction, J. Physiol., 293, 247Ŕ284, 1979. del Castillo, J.

and Katz, B., Interaction at endplate receptors between different choline

derivatives, Proc. Roy. Soc. London Ser. B, 146, 369Ŕ381, 1957.

Edmonds, B., Gibb, A. J., and Colquhoun, D., Mechanisms of activation of muscle

nicotinic acetylcholine receptors and the time course of endplate currents,

Annu. Rev. Physiol., 57, 469Ŕ493, 1995.

Katz, B. and Thesleff, S., A study of the Řdesensitizationř produced by acetylcholine

at the motor end-plate, J. Physiol.,138, 63Ŕ80, 1957.

Lingle, C. L., Maconochie, D., and Steinbach, J. H., Activation of skeletal muscle

nicotinic acetylcholine receptors, J. Memb. Biol., 126, 195Ŕ217, 1992

(excellent review of much of the evidence concerning the mechanism of

receptor activation).

MacDonald, J. F. and Nowak, L. M., Mechanisms of blockade of excitatory amino

acid receptor channels, TIPS, 11(4), 167Ŕ172, 1990.

Neher, E., The charge carried by single-channel currents of rat cultured muscle cells

in the presence of local anaesthetics. J. Physiol., 339, 663Ŕ678, 1983.

Rang, H. P. and Ritter, J. M., On the mechanism of desensitization at cholinergic

receptors, Mol. Pharmacol., 6, 357Ŕ382, 1970.

Triggle, D. J., Desensitization, Trends Pharmacol. Sci.,14, 395Ŕ398, 1980.

Unwin, N., Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels, Neuron,

10 (Suppl. 1), 31Ŕ41, 1993.

Unwin, N., Projection structure of the nicotinic acetylcholine receptor: distinct

conformations of the alpha subunits, J. Mol. Biol., 257, 586Ŕ596, 1996.


Masalah 6.1

Perhatikan bahwa masalah menyatakan bahwa distribusi kali terbuka adalah

eksponensial tunggal. Ini memberitahu Anda bahwa mekanisme yang berisi keadaan

terbuka tunggal reseptor dapat menggambarkan data. Menggunakan petunjuk di atas,

tingkat penutupan saluran (panggilan α ini) karena itu adalah kebalikan dari waktu

rata-rata terbuka. Dengan demikian, pada -60 mV, α = 1/5 msec, atau 200 detik-1

,

pada -120 mV, α = 1/10 msec, atau 100 detik-1

. Hal ini menunjukkan bahwa saluran

penutupan perubahan konformasi dipengaruhi oleh medan listrik melintasi membran.

Di hadapan obat B, durasi rata-rata penyumbatan (dengan asumsi keadaan

diblokir tunggal) akan menjadi kebalikan dari tingkat untuk meninggalkan negara

diblokir (katakanlah, k-B). Dengan demikian, pada -60 mV, k-B = 1/1.0 msec, atau

1000 detik-1

, pada -120 mV, k-B = 1/2.0 msec, atau 500 detik-1

. Rupanya, laju

disosiasi obat B dari saluran diperlambat ketika potensi membran dibuat lebih negatif.

Untuk obat bermuatan positif, ini merupakan temuan umum dan menunjukkan obat

ini mengikat dalam medan listrik membran. Namun, bisa juga bahwa perubahan

potensial membran telah mengubah protein konformasi reseptor dan dengan demikian

mempengaruhi pengikatan obat pada reseptor.

Untuk menghitung tingkat asosiasi mikroskopis untuk obat B, gunakan

petunjuk di atas untuk menunjukkan bahwa waktu rata-rata terbuka di hadapan obat B

akan sama dengan 1 / (α + [B] k+B). Jadi, kebalikan dari waktu rata-rata terbuka di

hadapan obat B akan sama dengan (α + [B] k+B), jadi (α + [B] k+B) = 400 detik-1

pada

-60 mV dan 500 detik-1

pada -120 mV. adalah 200 detik-1

pada -60 mV dan 100 detik-

1 pada -120 mV, jadi [B] k+B = 200 detik

-1 pada -60 mV dan 400 detik

-1 pada -120

mV. Membagi angka-angka ini dengan [B] memberikan k+B = 2 × 107 M

-1 sec

-1 pada

-60 mV dan 4 × 107

M -1

sec-1

pada -120 mV. Konstanta kesetimbangan, oleh karena

itu, 50 µM di -60 mV dan 12,5 pM pada -120 mV.

Jika ketergantungan tegangan k+B digambarkan oleh Persamaan. (6.48), maka

plot ln (k+B(V)) vs potensial membran (V) akan menjadi garis lurus dengan

kemiringan -δzF/RT. Dalam hal ini, kemiringan plot ini adalah -11,6 V-1

, dan timbal

balik ini menunjukkan peningkatan yang kali lipat k+B untuk setiap hyperpolarization

0.086-V (86 mV) dari potensial membran. Pada suhu kamar (293 K), F / RT = 39,6

V-1, maka untuk obat dengan satu muatan positif, δ = 11.6/39.6 = 0,29, menunjukkan

bahwa saat berada di tempat ikatannya, obat telah melewati 29% dari medan listrik

membran (catatan bahwa ini mungkin tidak sama dengan 29% dari jarak melintasi

membran, sebagai medan listrik membran tidak mungkin jatuh linear seluruh protein

channel).

Perlu diperhatikan bahwa dalam contoh ini kemiringan hubungan antara

potensial membran dan ln (k-B) adalah sama besarnya tetapi berlawanan tanda bahwa

untuk k+B dan δ = 0,58 untuk ketergantungan tegangan KB, seperti yang diharapkan

jika melintasi blocker penghalang energi simetris (Gambar 6.8) ketika keluar dari

saluran seperti ketika memblokir saluran. Sebuah ketergantungan tegangan untuk k-B

dari tanda yang sama seperti untuk k+B akan menyarankan bahwa blokir terjadi oleh

perembesan blocker ke sisi lain dari saluran. Perbedaan antara besaran δ untuk k+B

dan k-B bisa berarti bahwa energi penghalang untuk akses ke dalam dan keluar dari

saluran tidak simetris atau bisa berarti bahwa obat itu sebagian menembus saluran

dan sebagian keluar kembali ke luar membran.

Masalah 6.2

Untuk bagian (a), menganggap bahwa sistem ini pada kesetimbangan dan

bahwa hukum aksi massa memegang. Gunakan prosedur yang dijelaskan dalam Bab

1 untuk menurunkan ekspresi untuk PAR* pada kesetimbangan. Pada keseimbangan,

tingkat maju dan mundur untuk setiap reaksi dalam mekanisme harus sama. Tingkat

maju dan mundur didefinisikan menggunakan hukum aksi massa:

Untuk bagian (c), 1/τo = 5000 sec-1

ketika [Ach] = 300 M dan 1/τo = 10000

detik-1

ketika [Ach] = 800 pM. Dari jawaban untuk bagian (b), kita tahu bahwa 1/τo =

(k-2 + [A] k+3). Ini memiliki bentuk garis lurus dengan kemiringan k+3 dan mencegat

k-2 ketika 1/τo diplot terhadap [A]. Dengan demikian, kemiringan k+3 = (10.000-5.000

detik-1) / (800-300 M) = 107M

-1 detik

-1. Mencegat adalah k-2 = 2000 detik

-1. Tingkat

disosiasi blocker adalah k-3 = 1/40 κ detik = 25.000 detik-1

. Konstan untuk blok kanal

keseimbangan Oleh karena itu, K3 = k-3 / k+3 = 2,5 mM.

Untuk bagian (d), mengganti ke dalam Pers. (6.55) memungkinkan hunian

kesetimbangan AR* menjadi dihitung pada 300 dan 800 mM Ach. Hasilnya 0.503

dan 0.565, masing-masing. Oleh karena itu, pada 300 M, dihitung PAR* dekat dengan

yang teramati dalam eksperimen. Namun, pada 800 M, dihitung PAR* lebih tinggi dari

yang diamati. Alasan untuk hasil ini termasuk kemungkinan bahwa Desen sitization

mempengaruhi p terbuka pada tinggi [A]. Selain itu, mekanisme yang digunakan

untuk menurunkan persamaan. (6.55) mungkin tidak benar (seperti yang akan terjadi

jika keadaan peka harus ditambahkan ke mekanisme).

Masalah 6.3

Untuk bagian (a), derivasi dari sebuah ekspresi untuk PAR di hadapan antagonis,

B, dicapai dengan menggunakan prosedur standar. Hasilnya diberikan dalam Pers.

(6.59):

Untuk bagian (b), sebidang kebalikan dari τ pada dengan [B] akan menjadi

garis lurus dengan kemiringan Pbebas k+B dan sumbu y intercept k-B. Menggunakan

data dalam tabel, lereng ditemukan menjadi 2 × 105 M

-1 detik

-1 dan mencegat 1 detik

-

1. Pbebas adalah 1 - PAR tanpa adanya antagonis. Dengan demikian, Pbebas= KA / ([A] +

KA) = 0,1. Sebagai Pbebas k+B = kemiringan, k+B = kemiringan / Pbebas = 2×106 M

-1 sec

-

1 konstanta kesetimbangan KB = k-B / k+B = 0,5 × 10

-6M. Akhirnya, menghitung PAR

dalam ketiadaan antagonis dan kemudian di hadapan masing-masing [B] dan

kemudian menggunakan hasil ini untuk menghitung persentase blok diproduksi pada

kesetimbangan oleh masing-masing antagonis konsentrasi. Ketika [A] = 100 M, KA =

11 M, Par = 0,9 dengan tidak adanya antagonis, dengan KB = 0,5 M dan [B] = 7,5 M,

dan Par = 0,36. The persen blok sama dengan (0,9-0,36) / 0,9 × 100 = 60%. Ketika

[B] = 20 M, Par = 0,191 dan blok persen adalah 79%. Ketika [B] = 45 M, Par = 0.098

dan blok persen adalah 89%.

Nilai-nilai dihitung untuk persen blok yang dekat dengan yang diamati pada

konsentrasi rendah blocker, tetapi pada konsentrasi yang lebih tinggi blok teramati

lebih dari yang diperkirakan. Kemungkinan alasan untuk ini mungkin terletak pada

pengukuran konstanta waktu onset atau asumsi tentang agonis menyeimbangkan jauh

lebih cepat daripada antagonis, atau mekanisme mungkin salah, mungkin karena

reseptor memiliki lebih dari satu situs mengikat atau pengikatan antagonis

mempromosikan desenssitisasi reseptor.

Dengan asumsi menyederhanakan dari β kecil ', jumlah dan produk dari

konstanta laju yang diukur dalam percobaan dapat digunakan untuk menghitung k-B

dan k + B jika α diketahui dari percobaan tanpa adanya blocker. Hal ini hanya

dilakukan dengan memetakan jumlah atau produk dari konstanta kecepatan diukur

terhadap konsentrasi blocker. Dari Persamaan. (6.32) di atas, produk dari konstanta

laju harus independen dari konsentrasi blocker dengan nilai sama dengan αk-B,

sedangkan jumlah dari konstanta laju (Persamaan (6.31)) akan memberikan garis

lurus dengan kemiringan sama dengan k + B dan intercept dari α + k-B.

Jika data eksperimen konsisten dengan prediksi tersebut, maka titik data diplot

dengan cara ini harus berada pada garis lurus, dan ini adalah bukti kuat bahwa

mekanisme kerja obat ini adalah untuk memblokir saluran ion terbuka. Asumsi bahwa

β 'sangat kecil telah digunakan ketika mempelajari efek dari saluran blocker pada arus

sinaptik, sebagai konsentrasi pemancar (dan karenanya pA2R) mungkin kecil selama

fase pembusukan arus. Selama percobaan analisis kebisingan, konsentrasi agonis

rendah digunakan sehingga, sekali lagi, kondisi ini β 'harus kecil.

6.3.5 SIGNAL BLOK DI EKUILIBRIUM

Hubungan antara Popen (Pkontrol) dan konsentrasi agonis untuk mekanisme situs

pengikatan dua agonis diberikan dalam Pers. (6.4) dan direproduksi di bawah ini

dalam bentuk yang sedikit berbeda:

(6.33)

Ketika blocker saluran terbuka yang ditambahkan, Popen di hadapan blocker

(Pblockers). Berikut ini adalah fungsi dari kedua agonis (A) dan (B) Konsentrasi

blocker:

(6.34)

Mengambil rasio Pcontrol / Pblockers memberikan hasil sederhana ini:

(6.35)

Karena saat ini tercatat dalam percobaan voltage clamp, tegangan berbanding

lurus dengan saluran Popen, rasio lancar tanpa adanya blocker untuk saat ini

meningkatkan konsentrasi blocker dapat digunakan untuk menghitung KB. Desain

eksperimen ini dimaksudkan untuk mendapatkan respon yang cukup besar untuk

agonis sendirian dan kemudian menghitung rasio ini respon kontrol untuk tanggapan

terhadap konsentrasi yang sama agonis dengan adanya peningkatan konsentrasi

channel blocker. Rasio Pcontrol / Pblockers ketika diplot terhadap [B] akan menjadi garis

lurus yang memotong sumbu y pada 1 dan memiliki kemiringan Pcontrol / KB. Jika

Pcontrol = 1, maka lereng = 1/KB. Jika Pcontrol dikenal untuk konsentrasi agonis

tertentu, maka jelas KB masih bisa diperkirakan. Jika kita asumsikan Pcontrol = 1,

maka KB dihitung akan lebih besar daripada KB benar: misalnya, dengan faktor 2

jika Pcontrol = 0,5 dan dengan faktor 10 jika Pcontrol = 0,1.

6.3.6 TUNGGAL-CHANNEL ANALISIS CHANNEL BLOK

Berikut adalah garis besar dari beberapa informasi yang dapat diperoleh dari

data single-channel menggunakan pengukuran yang cukup sederhana seperti waktu

buka rata-rata dan rata-rata waktu menutup. Analisis ini diilustrasikan pada Gambar

6.6 untuk blok saluran reseptor NMDA oleh ion Mg2 +.

6.3.6.1 Waktu Buka

Saluran blocker akan menghasilkan pengurangan waktu buka rata-rata dari:

(6.36)

dalam kontrol ke :

(6.37)

di hadapan blocker, dihitung dari aturan bahwa mean setiap negara adalah sama

dengan kebalikan dari jumlah tarif untuk meninggalkan bahwa negara (Colquhoun

dan Hawkes, 1982). Sebuah plot 1 / τ terhadap [B] harus, karena itu, memberikan

garis lurus dengan kemiringan k + B. Ini diilustrasikan pada Gambar 6.6C, di mana

untuk berbagai potensi membran dan Mg2 + konsentrasi saluran NMDA terbalik

berarti waktu terbuka berikut hubungan linier, memberikan k + nilai B dalam kisaran

6,6 × 106 M-1sec-1 pada -40 mV menjadi 8,4 × 107 M-1sec-1 pada -80 mV.

6.3.6.2 Waktu Tertutup

Periode tertutup karena penyumbatan saluran miliki, dari aturan yang sama,

seumur hidup rata-rata:

(6.38)

Perhatikan bahwa durasi saluran penyumbatan diprediksi akan menjadi

independen dari konsentrasi blocker, seperti digambarkan pada Gambar 6.6D, dimana

durasi penyumbatan tidak menunjukkan ketergantungan jelas pada Mg2 +

konsentrasi.

6.3.6.3 Penyumbatan Frekuensi

Frekuensi penyumbatan, per detik waktu buka, adalah k + B [B], sehingga

jumlah rata-rata penyumbatan pada setiap pembukaan saluran hanya frekuensi

penyumbatan dikalikan dengan waktu buka rata-rata:

(6.39)

6.3.6.4 Semburan Pembukaan

Dimana blocker saluran mengkonversi bukaan tunggal ke semburan jelas

(misalnya, blok anestesi lokal saluran nikotin), rata-rata jumlah bukaan per meledak

adalah salah satu lebih dari jumlah rata-rata kesenjangan (penyumbatan):

GAMBAR 6.6 Single - analisis saluran ion-blok saluran. Rekaman Perwakilan

arus single-channel melalui saluran reseptor NMDA tercatat diilustrasikan pada

potensial membran -20 mV, -50 mV, dan -80 mV dalam rekaman kontrol (A) dan di

hadapan magnesium 40-M (B). Yang cepat dan blokir memblokir saluran terutama

terlihat pada tegangan lebih negatif. Invers berarti waktu terbuka dan durasi rata-rata

kebalikan dari penutupan saluran tambahan yang disebabkan oleh Mg2+

diplot

terhadap Mg2+

konsentrasi (C) dan (D). Hasil ini mengkonfirmasi hubungan linier

antara konsentrasi Mg2+

dan terbalik berarti waktu terbuka dan kurangnya Mg2+

ketergantungan konsentrasi saluran diprediksi oleh sederhana saluran terbuka

menghambat mekanisme. Garis solid dalam (C) menggambarkan regresi linier dari

data yang tercatat pada setiap potensial membran. Lereng garis ini memberikan

perkiraan nilai k + B dari 6,6, 15,7, 26,6, 40,4, dan 84,0 × 106 M-1 detik-1 di -40 -, -

50 -, -60 -, -70 -, dan-80-mV potensial membran.

(6.40)

Perhatikan bahwa total rata-rata terbuka waktu per meledak akan:

(6.41)

(6.42)

(6.43)

Ini adalah hasil yang penting. Mekanisme terbuka-saluran blok sederhana

memprediksi bahwa total waktu per meledak terbuka adalah sama dengan waktu buka

rata-rata dalam ketiadaan blocker (Neher, 1983), meskipun bukaan sekarang

dicincang oleh penyumbatan saluran. Bahkan, untuk saluran yang memberikan

semburan bukaan di rekaman kontrol, total terbuka waktu per burst konstan dalam

ada atau tidaknya blocker.

Hasil ini juga penting karena menunjukkan bahwa blocker saluran terbuka

sederhana tidak mengurangi muatan melewati saluran selama setiap aktivasi sehingga

mereka tidak akan mengurangi biaya disuntikkan pada sinaps oleh arus sinaptik.

Sebaliknya, mereka memperpanjang waktu di mana muatan disuntikkan, yang dapat

memiliki efek yang cukup dramatis pada transmisi sinaptik.

6.3.6.5 Burst Panjang

Panjang rata-rata burst ditemukan seperti berikut:

Jadi plot panjang burst rata vs [B] akan memberikan garis lurus dari intercept 1

/ α dan kemiringan 1 / (αKB).

6.3.7 WAKTU SKALA CHANNEL BLOK

Channel blocker sering diklasifikasikan sebagai lambat, menengah, atau cepat

blocker, berdasarkan rentang yang sangat luas nilai-nilai yang telah ditemukan untuk

tingkat mikroskopis disosiasi konstan yang berbeda channel blocker. Hampir semua

channel blockers telah ditemukan memiliki konstanta laju asosiasi mikroskopis (k +

B) dalam kisaran sekitar 107 M-1sec-1. Sebaliknya, konstanta laju disosiasi

mikroskopis (k-B) rentang selama beberapa kali lipat dari sekitar 105 detik-1

(misalnya, blok saluran reseptor nicotinic oleh Ach) untuk 0,01 detik-1 untuk MK-

801 (dizocilpine) blok NMDA saluran. Rata-rata panjang kesenjangan penyumbatan

sehingga dapat berkisar dari 10 κsec hingga 100 detik. Hanya ketika penyumbatan

berada di kisaran menengah, pada urutan 1 msec dalam durasi, bahwa kesenjangan

mudah terdeteksi dalam rekaman single-channel. Jika blocker adalah blocker lambat

dengan kesenjangan penyumbatan sangat panjang, catatan data yang tampak seolah-

olah frekuensi bukaan saluran mengalami penurunan. Jika blocker cepat, amplitudo

single-channel muncul menurun karena memblokir dan blokir terlalu cepat untuk

diselesaikan.

6.3.8 PENGGUNAAN KETERGANTUNGAN DARI BLOCKERS CHANNEL

Ini mengikuti dari kenyataan bahwa blocker diasumsikan mengikat hanya

kepada negara diaktifkan dari saluran yang tingkat blok akan tidak hanya tergantung

konsentrasi tetapi juga menggunakan bergantung, dalam kata lain, semakin banyak

saluran yang diaktifkan, maka akan semakin tersumbat.

Ini mengikuti dari pembahasan di atas pada skala waktu blok saluran bahwa

tingkat penggunaan ketergantungan akan sangat tergantung pada mikroskopis

disosiasi laju yang konstan. Lambat blocker menunjukkan penggunaan

ketergantungan ekstrim, yang ditambah dengan blocker menampilkan fenomena

perangkap. Trapping terjadi ketika saluran dapat menutup dan agonis memisahkan

dengan blocker masih terikat dalam saluran. Blocker tersebut kemudian terjebak

dalam saluran sampai waktu berikutnya reseptor diaktifkan. Contoh penting dari blok

menjebak termasuk aksi hexamethonium di ganglia otonom dan blok dari reseptor

NMDA oleh saluran mk801 atau ketamin obat bius.

6.3.9 KETERGANTUNGAN TEGANGAN DARI BLOK CHANNEL

Salah satu hasil yang menarik yang timbul dari percobaan tegangan klem dini

dengan obat saluran-blocking adalah bahwa potensi blocker itu tergantung pada

tegangan membran. Sebaliknya, ini ditemukan tidak menjadi kasus untuk

antagonisme kompetitif pada reseptor nicotinic endplate (Gambar 6.5). Hasil ini

diinterpretasikan sebagai indikasi bahwa situs asetilkolin mengikat reseptor (dan

karena itu blok kompetitif di situs tersebut oleh tubocurarine) tidak dipengaruhi oleh

potensi perbedaan melintasi membran, padahal jika mengikat dipengaruhi oleh

potensial membran, maka situs pengikatan harus berada pada daerah dari protein

yang merupakan bagian dari jalan melintasi medan listrik dari membran.

Pengikatan obat dikenakan pada situs dalam medan listrik akan dipengaruhi

oleh bahan kimia interaksi (seperti ikatan hidrogen, umum untuk semua interaksi

obat-reseptor) dan oleh medan listrik dan muatan pada obat.

Konstanta laju mikroskopis untuk asosiasi dan disosiasi pada situs dalam

medan listrik (untuk blok oleh obat dibebankan) adalah fungsi eksponensial dari

tegangan membran:

(6.48)

(6.49)

Di sini, δ mengacu pada sebagian kecil dari tegangan membran bahwa indera

obat memblokir di situs pengikatan, dan tanda di δ ditentukan oleh apakah obat

memblokir mendekati situs pengikatan dari dalam atau di luar membran. Seperti yang

diungkapkan di sini, persamaan ini menggambarkan konstanta laju untuk blok dari

luar. Valensi obat memblokir diberikan sebagai z, dan F, R, dan T adalah konstanta

Faraday (9,65 × 104 C mol-1), tetapan gas (8.32 JK-1 mol-1), dan suhu mutlak (293

K pada suhu kamar), masing-masing. Tegangan ketergantungan konstanta

kesetimbangan disosiasi diberikan oleh:

(6.50)

Dari hubungan ini dapat dilihat bahwa plot semilog dari LNK (V) vs potensial

membran akan memberikan garis lurus dengan kemiringan δzF / RT dan intercept

dari LNK (0). Kebalikan dari lereng memberikan perubahan tegangan membran yang

diperlukan untuk memberikan perubahan e-kali lipat dalam konstanta kesetimbangan.

Hal ini dapat dilihat bahwa kemiringan maksimum akan diperoleh ketika δ = 1.

Untuk blocker dengan satu biaya, ini akan memberikan kemiringan maksimum 25

mV untuk perubahan e-lipat sedangkan untuk ion divalen, kemiringan maksimum

akan 13 mV untuk perubahan e-lipat. Analisis ini diilustrasikan pada Gambar 6.7

untuk blok saluran reseptor NMDA oleh ion Mg2+

.

Gambar 6.7A menunjukkan bahwa sebidang log k + B terhadap potensial

membran memberikan hubungan linier dengan kemiringan yang sesuai dengan δ =

0,76, sementara plot log k-B melawan potensial membran (Gambar 6.7B) juga linear

tetapi bukan sebagai tajam tegangan tergantung dengan δ = 0,21. Bagaimana

seharusnya hasil ini ditafsirkan? Mereka mungkin juga berarti bahwa hambatan

energi untuk Mg2+

mendekati tempat ikatannya dan disosiasi dari situs mengikat

kembali ke solusi ekstraseluler tidak simetris, atau bahwa proporsi ion Mg2+

meninggalkan situs mengikat mereka dengan menyerap melalui saluran ke bagian

dalam membran sel. Tegangan ketergantungan konstanta kesetimbangan, K + B,

menunjukkan bahwa afinitas Mg2+

untuk saluran tersebut curam tegangan tergantung

dengan δ = 0,97, menyiratkan bahwa ion Mg2+

merasakan hampir 100% dari medan

listrik membran di situs mereka mengikat (Ascher dan Nowak, 1998).

Mengingat bahwa saluran blocking obat, menurut definisi, bertindak dalam

jalur perembesan saluran, tidaklah mengherankan untuk menemukan bahwa interaksi

antara obat saluran-blocking dan ion permeant normal dapat mempengaruhi perilaku

blocker saluran. Ini adalah kasus untuk reseptor NMDA, di mana pendudukan situs

mengikat ion permeant memiliki dampak yang signifikan terhadap ketergantungan

tegangan diamati blok Mg2+

. Antonov dan Johnson (1999) telah menunjukkan bahwa

mengambil efek ini mempertimbangkan menempatkan situs pengikatan ion Mg2+

pada posisi yang lebih dangkal (δ = 0,47) dalam medan listrik membran, yang

konsisten dengan posisi yang diprediksikan dua asparagin residu dekat puncak dari

loop M2 dari subunit reseptor NMDA, yang telah diidentifikasi dari modifikasi

struktural reseptor NMDA sebagai penting bagi blok saluran Mg2+

.

Ketergantungan tegangan curam blok saluran mendasari peran penting yang

Mg2+

blok saluran NMDA bermain dalam memberikan reseptor NMDA milik

menjadi "coincidence detectors" dalam sistem saraf. Properti ini mungkin mendasari

perilaku Hebbian sinapsis rangsang di otak dan dapat, pada prinsipnya,

memungkinkan jaringan neuron untuk menyesuaikan perilaku mereka sesuai dengan

pengalaman, maka, pada dasarnya, properti ini memungkinkan sistem saraf untuk

belajar dari pengalaman. Sebuah simulasi pengaruh Mg2+

blok pada kondisi mapan

saat ini melalui saluran reseptor NMDA diilustrasikan pada Gambar 6.7D. Hal ini

dapat dilihat bahwa hubungan linier antara potensial membran

dan arus reseptor NMDA menjadi curam tegangan tergantung dengan meningkatnya

konsentrasi Mg2+

. Pada tingkat fisiologis Mg2+

(1 mM), arus melalui saluran

meningkat antara -80 dan -20 mV mV sebagai Mg2+

yang blok lega dengan

depolarisasi. Hal ini penting untuk menghargai bahwa jenis efek juga akan terjadi

pada tingkat yang lebih besar atau lebih kecil dengan obat yang bertindak untuk

memblokir saluran ion dan membuat memprediksi aksi saluran-blocking obat,

terutama pada sistem saraf, sangat rumit.

Gambar 6.8 menunjukkan representasi diagram dari hambatan energi bahwa

obat saluran-block mungkin seharusnya untuk mengatasi untuk membuka situs yang

mengikat di dalam saluran. Diagram ini memungkinkan untuk kemungkinan bahwa

obat memblokir benar-benar bisa menembus channel setelah mengikat daripada

kembali setelah disosiasi ke sisi yang sama seperti yang mereka berasal. Mekanisme

umum dapat digunakan untuk menggambarkan saluran blok dari kedua sisi membran,

akses ke

GAMBAR 6.7 Analisis tegangan-ketergantungan dari blok saluran reseptor NMDA

oleh Mg2. (A) Saluran-blocking rate, k B, diperkirakan dari kemiringan garis

dipasang ke data pada Gambar 4A, diplot terhadap potensial membran. Garis padat

menunjukkan fit dari Pers. (6.48) ke data dengan δ = 0,76 (mencerminkan

peningkatan e-kali lipat dalam menghalangi laju untuk setiap 16,6 mV

hyperpolarization dari potensial membran) dan menghalangi laju 2,66 × 107 M-1

detik-1 pada -60 mV. (B) Saluran tingkat blokir, k-B, diperkirakan sebagai rata-rata

nilai-nilai pada setiap konsentrasi Mg2, menunjukkan ketergantungan tegangan

dangkal daripada saluran memblokir tingkat. Garis padat menunjukkan cocok dengan

data dari Pers. (6.49) dengan δ = 0,21 (mencerminkan peningkatan e-kali lipat dalam

tingkat memblokir untuk setiap hyperpolarization mV 61 dari potensial membran)

dan menghalangi laju 2,66 × 107 M-1 detik-1 pada -60 mV. (C) Tegangan

ketergantungan konstanta kesetimbangan, KB, untuk blok saluran, dihitung dari rasio

k-B / k B. Garis padat menunjukkan kecocokan data dengan Persamaan (6.50) dengan

δ=0,97 dan menggambarkan tegangan curam ketergantungan KB yang meningkatkan

e-lipat untuk setiap 13 depolarisasi mV. (D) Hubungan simulasi arus-tegangan

dengan adanya saluran blok curam tegangan yang tergantung. Saat ini kontrol adalah

fungsi linier dari tegangan membran, namun, dengan adanya konsentrasi rendah (60

M) atau konsentrasi fisiologis (1 mM) dari Mg2, arus melalui saluran rectifies tajam

pada potensial negatif, mencerminkan curam tegangan ketergantungan konstanta

kesetimbangan, KB. Sisi pengikatan tergantung pada ketinggian hambatan energi

yang molekul obat harus menyeberang. Lebih umum, Gambar 6.8 membantu untuk

menggambarkan gagasan bahwa perbedaan antara perembesan ion melalui saluran

dan blok saluran mungkin salah satu derajat dan belum tentu cerminan dari adanya

perbedaan mendasar dalam cara ion permeant atau blocker berinteraksi dengan

jaringan protein.

6.4 KESIMPULAN

Materi dalam bab ini telah berpusat di sekitar efek obat pada reseptor di ligan

ion kelas channel. Secara khusus, tujuannya adalah untuk menekankan bahwa

pengobatan kuantitatif

GAMBAR 6.8 Tampil merupakan representasi dari model dua-energi-penghalang

yang dapat digunakan untuk menggambarkan hambatan energi obat saluran-blocking

mungkin harus diatasi untuk mencapai tempat ikatannya dalam saluran. Hambatan

ditampilkan sebagai simetris dalam kasus ini, meskipun mereka tidak perlu selalu

begitu, dalam hal nilai δ untuk akses ke situs mengikat tidak akan sama besarnya

dengan nilai δ untuk mengikat dan kembali ke sisi yang sama dari membran. Diagram

ini memungkinkan untuk kemungkinan bahwa obat memblokir benar-benar bisa

menembus channel setelah mengikat daripada kembali ke sisi yang sama dari

membran itu awalnya datang dari. Mekanisme umum dapat digunakan untuk

menggambarkan saluran blok dari kedua sisi membran, akses ke situs mengikat

tergantung pada ketinggian hambatan energi bahwa obat harus menyeberang. Energi

bebas, G, ditampilkan relatif terhadap luar membran. Tingkat transisi k1, k-1, k2, dan

k-2 akan tergantung pada kedua ketinggian penghalang energi dan potensi membran

dan dapat dihitung seperti yang dijelaskan di Hille (1992). (Diadaptasi dari Hille, B.,

Saluran ionik dari Membran bersemangat, 2nd ed., Sinauer, Sunderland, MD, 1992,

ara. 5, bab. 14.)

dari beberapa mekanisme sederhana dapat memungkinkan prediksi eksperimental

diuji harus dibuat untuk efek obat dan perkiraan afinitas obat untuk situs / situs di

reseptor mengikat. Karena mengukur interaksi obat dengan reseptor mereka di

jantung kemajuan dalam pengembangan obat selektif dan klasifikasi reseptor,

pendekatan ini kemungkinan akan terus menjadi bagian penting dari farmakologi. Hal

ini khususnya terjadi untuk studi dari sistem saraf pusat, mana membingungkan

subtipe reseptor menunggu perkembangan subtipe-selektif obat sehingga makna

fungsional dan terapi reseptor ini keragaman dapat ditentukan.

6.5 SOAL

Soal 6.1

Sebuah percobaan di mana AchR ion-channel arus tunggal dicatat pada

potensial membran -60 mV menunjukkan bahwa durasi bukaan saluran individu

mengikuti distribusi eksponensial tunggal. Waktu rata-rata terbuka adalah 5,0 msec.

Ketika percobaan diulang di hadapan antagonis, obat B, dengan konsentrasi 10 M,

ditemukan bahwa waktu buka rata-rata berkurang menjadi 2,5 msec dan bahwa

bukaan saluran disela oleh periode menutup singkat dengan durasi rata-rata 1,0 msec

sehingga bukaan dikelompokkan ke semburan. Ketika percobaan diulang pada

potensial membran dari -120 mV, waktu buka rata-rata adalah 10 msec dalam

ketiadaan obat B tetapi hanya 2 msec dalam kehadirannya, interupsi dari bukaan

saluran telah menjadi lebih lama, berlangsung 2 msec rata-rata pada -120 mV. Hasil

ini konsisten dengan obat B menjadi blocker saluran terbuka.

a. Hitung asosiasi mikroskopis dan konstanta laju disosiasi dan konstanta

kesetimbangan untuk aksi obat B

b. Apa yang bisa Anda katakan tentang situs kemungkinan kerja obat B yang

diberikan bahwa obat memiliki muatan positif tunggal?

Petunjuk: Kebalikan dari mean negara individu adalah jumlah tingkat (dalam

detik-1) untuk meninggalkan negara itu.

Soal 6.2

Dengan reseptor nicotinic endplate telah menemukan bahwa pengaktifan

reseptor, asetilkolin (Ach) blok saluran ion. Sebuah mekanisme yang mungkin untuk

menggambarkan situasi ini (dengan asumsi untuk kesederhanaan hanya mengikat

agonis tunggal diperlukan untuk mengaktifkan reseptor) karena mungkin:

(6.51)

a. Menyatakan semua asumsi Anda butuhkan untuk membuat, menurunkan ekspresi

untuk kesetimbangan hunian AR * negara (PAR *) dalam Pers. (6.51).

b. Tuliskan ekspresi untuk waktu buka rata-rata (τo) dan rata-rata durasi keadaan

diblokir (τb). (Petunjuk: rata-rata seumur hidup negara manapun adalah sama

dengan kebalikan dari jumlah tarif untuk meninggalkan negara itu.) Dalam

percobaan yang dirancang untuk menguji mekanisme dalam skema (6.51), dua

konsentrasi tinggi Ach (300 dan 800 M) diuji dalam eksperimen single-channel

rekaman, dan τo, τb, dan saluran terbuka probabilitas (popen) diukur. Hasilnya

adalah sebagai berikut: NIST mengikat diperlukan untuk mengaktifkan reseptor)

karena mungkin:

c. Menggunakan plot 1/τo vs [Ach], menghitung k-2 dan k +3. Selain itu, hitung k-3

dari durasi penyumbatan (τb) dan kemudian menghitung konstanta kesetimbangan

(K3) untuk blok saluran oleh Ach. Dalam percobaan lain, nilai 107 M-1 detik-1,

104 detik-1, dan 104 detik-1 ditemukan untuk k +1, k-1, dan k +2.

d. Menggunakan ekspresi yang Anda diturunkan dalam (a), menghitung nominal*

Anda harapkan pada 300 dan 800 mM Ach. Bagaimana hal ini dibandingkan

dengan popen eksperimen diamati diberikan dalam tabel di atas? Sarankan alasan

mengapa popen dihitung dan diamati mungkin berbeda.

Soal 6.3

Sebuah mekanisme sederhana untuk antagonisme kompetitif dari ligand-gated

ion-channel reseptor akan menjadi sebagai berikut:

(6.52)

7 G-Protein

David A. Brown

ISI

7.1 Penemuan G-

Protein……………………………………………………………………213

7.2 Struktur G-

protein………………………………………………………………………214

7.3 Siklus G-

protein…………………………………………………...……………………215

7.4 Perturbing Siklus G-Protein ...........................................

................................................217

7.5 Bukti Experimental untuk pasangan G-Protein di Reseptor Aksi

.................................. 218

7.5.1 Ketergantungan

GTP……………………………………………………………..218

7.5.2 Penggunaan GTP Analog dan Racun

................................................................... 219

7.6 Pengukuran Aktivasi G-Protein

..................................................................................... 220

7.7 Tipe dari G-

protein……………………………………………………………………...220

7.8 Pasangan Reseptor-G-

Protein……………………………………………………….….221

7.9 Pasangan G-Protein-

Efektor……………………………………………………………224

7.10Pengaturan dari Sinyal G-Protein

................................................................................. 229

7.10.1 RGS

Protein…………………………………………………………………….229

7.10.2 Efektor sebagai Pengaktivan GTPase-

Protein....................................................230

7.11 Kinetika Sinyal GPCR-Mediated

.................................................................................230

7.12 Bacaan lebih

lanjut……………………………………………………………………236

G-protein trimerik, sinyal-pentransduksi, guanin protein nukleotida-mengikat.

Mereka merupakan langkah pertama dalam transducing aktivasi agonis-induced dari

reseptor pasangan G-protein (lihat Bab 2) ke dalam respon seluler.

7.1 PENEMUAN G-PROTEIN

G-protein yang ditemukan sebagai hasil dari beberapa percobaan oleh Martin

Rodbell tahun 1971 pada stimulasi adenilat siklase oleh glukagon, di mana ia

menemukan bahwa penambahan guanosin trifosfat (GTP) diperlukan untuk

mendorong reaksi. Menggunakan istilah yang berasal dari teori informasi cybernetic,

ia tergambar sebuah protein nukleotida guanin peraturan, kemudian disebut "N

(nukleotida-mengikat)-protein," bertindak sebagai transduser perantara antara

diskriminator (reseptor) dan penguat (efektor, yaitu, adenilat siklase ) (Gambar 7.1).

Dia kemudian menemukan bahwa adenilat siklase diaktifkan kuat dan ireversibel oleh

GTP analog, 5'-guanylylimidophosphate, atau [GPP (NH)-p] '. Karena GPP (NH)-p

tahan terhadap hidrolisis, Rodbell menyarankan bahwa GTP "dihidrolisis di lokasi

aktivasi," yaitu, transduser bertindak sebagai GTPase a. Ini kemudian ditampilkan

langsung oleh Cassell dan Selinger pada tahun 1976. Kehadiran protein GTP-binding

terpisah, berbeda dari enzim adenilat siklase, didirikan oleh Alfred Gilman dan

kolega yang mampu menyusun kembali GPP (NH)-p-menstimulasi aktivitas adenilat

siklase dalam membran dari garis sel limfoma mutan (Cyc -) yang berisi adenilat

siklase tetapi tidak memiliki G-protein dengan menambahkan terpisah dimurnikan

40-kDa faktor GTP-mengikat. Pada tahun 1980, Howlett dan Gilman melaporkan

bahwa aktivasi gigih ini adenilat-merangsang G-protein (Gs) menyebabkan

penurunan dalam molekul

GAMBAR 7.1 Konsepsi Martin Rodbell tentang peran dari transduser G-protein

dalam aktivasi adenylate cyclase oleh glukagon. (Dari Birnbaumer, L., FASEB J., 4,

3178, 1990. Dengan izin.)

massa protein, menyiratkan bahwa G-protein terdiri dari subunit tdk. The trimerik

sifat G-protein kemudian dibentuk oleh Stryer dan rekan. Menggunakan fotoreseptor

G-protein transducin (Gt), mereka menunjukkan bahwa aktivasi Gt oleh GPP (NH)-p

dan cahaya menyebabkan disosiasi kompleks αβγ trimerik ke GPP (NH)-p-terikat αt

dan βγ, dan αt yang bertanggung jawab untuk stimulasi phosphodiesterase. Pada

tahun 1985, α-transducin dikloning oleh empat kelompok yang dipimpin oleh Numa,

Bourne, Khorana, dan Simon, subunit α dari Gs dikloning oleh kelompok Gilman di

1986. Rodbell dan Gilman bersama-sama dianugerahi Hadiah Nobel pada tahun

1994.

7.2 STRUKTUR G-PROTEIN

G-protein yang terdiri dari tiga subunit: sebuah subunit α massa molekul ~ 39-

45 kDa, subunit β (~ 37 kDa), dan γ subunit kecil (~ 8 kDa). Sekitar 20 produk gen

yang berbeda menyandikan berbagai subunit α, 6 subunit β yang berbeda, dan 12

subunit γ yang berbeda (lihat di bawah). Dalam trimerik asli negara mereka, G-

protein yang melekat pada wajah bagian dalam membran sel melalui ekor lipofilik

pada α dan subunit γ (miristoil dan palmitoil pada α, farnesyl atau geranylgeranyl

pada γ tersebut) (Gambar 7.2). The β dan γ subunit diperintahkan agak tegas melalui

interaksi melingkar-coil untuk membentuk βγ-dimer, subunit β dimer ini kemudian

melekat pada subunit α melalui pelengkap situs peptida-mengikat dua protein dan

melalui interaksi ekor lipofilik. Ketika G-protein diaktifkan, interaksi ini subunit α-β

terganggu, dan terdisosiasi trimer ke subunit α monomer dan dimer βγ subunit (lihat

di bawah). Kedua α dan subunit βγ tetap melekat pada membran tetapi bebas untuk

bergerak.

The α subunit memiliki dua domain fungsional penting lainnya selain domain

β-mengikat. Pertama, subunit α berinteraksi dengan reseptor melalui domain yang

mencakup lima asam amino terakhir dari C-terminus (Gambar 7.3). Kedua,

menanggung guanin saku mengikat nukleotida dan

GAMBAR 7.2 Diagram untuk menunjukkan G-protein α, β, dan subunit γ melekat

pada membran luar sel. (Diadaptasi dari Clapham, DE, Nature, 379, 297, 1996.

Dengan izin.)

Gambar 7.3

bertanggung jawab untuk kegiatan GTPase dari G-protein. Di sisi lain, baik α dan

subunit βγ dapat berinteraksi dengan efektor.

7.3 G-PROTEIN SIKLUS

Siklus kejadian setelah aktivasi reseptor diringkas dalam Gambar 7.4. Urutan

ini sebagai berikut:

1. In keadaan dasar, G-protein ada dalam trimerik (αβγ) bentuk, dengan difosfat

guanosin (PDB) terikat pada situs nukleotida-mengikat subunit α. Hal ini

dekat dengan, tapi mungkin tidak untuk precoupled, reseptor. Rata-rata, ada

lebih G-protein daripada reseptor, jadi satu mungkin membayangkan reseptor

tunggal dikelilingi oleh cincin terdekat G-protein, menyediakan sekuensial

beberapa interaksi reseptor-G-protein.

2. Agonis menginduksi (<1 msec) perubahan konformasi cepat dalam reseptor,

sehingga penyelarasan dan membuka dari heliks transmembran, mungkin

melalui rotasi helix 6 dan pemisahan heliks 3, 6, dan 7.

3. Setelah Wajah bagian dari reseptor diaktifkan mengikat C-terminus dari G-

protein α subunit (lihat Gambar 7.3). Loop batin 3 (IC3) antara transmembran

heliks 5 dan 6 dari reseptor memainkan peran penting dalam interaksi ini.

Catatan, bagaimanapun, bahwa meskipun subunit α beruang tempat

pengikatan utama untuk reseptor, lampiran βγ-dimer ke subunit α sangat

penting untuk interaksi ini terjadi.

4. Pengikatan reseptor menginduksi perubahan konformasi yang cepat (switch)

dalam trimer G-protein. Ini ditularkan ke situs pengikatan nukleotida, sekitar

3 nm pergi, dan hasil dalam disosiasi dari PDB terikat.

5. PDB diganti di situs nukleotida-mengikat oleh guanosin trifosfat (GTP), yang

hadir dalam tiga sampai empat kali lipat lebih (50-300 M) dalam sitosol.

6. Binding GTP mempromosikan mengharubirukan karboksil-dan amino-termini

dari G-protein α subunit, dengan dua konsekuensi paralel: GTP-terikat

memisahkan subunit α

GAMBAR 7.4 Diagram siklus G-protein dengan (dalam kasus ini) aktivasi efektor

oleh GTP-bound α subunit. Lihat teks untuk huruf. (Diadaptasi dari Neer dan

Clapham, Nature, 333, 129, 1988. Dengan izin.)

baik dari reseptor dan dari βγ-dimer, melepaskan gratis Gα-GTP dan Gβγ gratis.

itu

konformasi Gβγ tidak berubah pada disosiasi dari subunit

7. Gα-GTP bebas atau bebas Gβγ lain (atau kadang-kadang keduanya) berinteraksi

dengan molekul efektor untuk mengaktifkan atau menghambat itu (lihat di bawah

untuk contoh). Aktivasi ini adalah persisten kecuali terbalik dengan langkah 8.

8. Terminal (γ) fosfat GTP dihidrolisis oleh aktivitas GTPase dari G-protein α

subunit, meninggalkan PDB terikat sebagai gantinya. Ini membalikkan perubahan

konformasi dalam langkah 5 dan memungkinkan subunit α untuk memisahkan dari

efektor dan reassociate dengan subunit βγ. Reassociation juga akan membalikkan

interaksi βγ-efektor karena Gα-PDB efektif bersaing dengan efektor untuk βγ-

mengikat. Meskipun afinitas cukup tinggi (misalnya, KD ~ 50 nM untuk GIRK

[G-protein-diaktifkan hati meluruskan K + channel] aktivasi) dan gigih dalam

ketiadaan bersaing Gα-PDB, mengikat βγ-efektor tidak ireversibel.

Pengaruh stimulasi reseptor demikian untuk mengkatalisis reaksi siklus. Hal ini

menyebabkan amplifikasi yang cukup dari sinyal awal. Misalnya, dalam proses

eksitasi visual, yang photoisomerization dari satu molekul rhodopsin menyebabkan

aktivasi sekitar 500 sampai 1000 transducin (Gt) Molekul, masing-masing yang pada

gilirannya mengkatalisis hidrolisis ratusan monofosfat siklik guanosin (cGMP)

molekul dengan phosphodiesterase. Amplifikasi dalam adenilat siklase kaskade

kurang tapi masih besar, masing-masing ligan yang terikat mengaktifkan β-

adrenoreseptor sekitar 10 sampai 20 molekul Gs, masing-masing yang pada

gilirannya mengkatalisis produksi ratusan siklik adenosin monofosfat (cAMP)

molekul dengan adenilat siklase.

Durasi respon reseptor-dimediasi tergantung, dalam contoh pertama, pada laju

Reaksi GTPase dari subunit α. Dalam larutan, angka ini agak lambat (waktu-

konstanta, 10-60 sec), terlalu lambat untuk memperhitungkan tingkat off banyak

pasangan G-protein reseptor (GPCR)-diinduksi efek. Sebagai contoh, jawaban cahaya

retina dan tanggapan jantung terhadap stimulasi vagal terakhir kurang dari satu detik.

Namun, dalam sel utuh, reaksi GTPase dipercepat 10 - sampai 100 kali lipat oleh

Protein GTPase-mengaktifkan (GAP). Dalam beberapa kasus, efektor sendiri

bertindak sebagai sebuah GAP, misalnya,

GAMBAR 7.5 Beberapa nukleotida guanosin dan turunannya. Singkatan: PDB,

difosfat guanosin, GTP, guanosin trifosfat, GTPγS, guanosin 5'-O-(3-

thiotriphosphate); GPP (NH)-p, 5'-guanylylimidophos-fosfat, AlF4, aluminium

fluoride.

fosfolipase C mempercepat kegiatan GTPase dari Gαq G-protein. Sebuah

keluarga RGS (regulator G-protein signaling) protein yang mempercepat aktivitas

GTPase subunit α dibahas lebih lanjut di bawah ini. Biasanya (tapi dengan

pengecualian cGMP fosfodiesterase), ketiga komponen Sistem - reseptor G-protein,

dan efektor - berada di membran plasma dan tetap di sana selama semua langkah

dalam siklus.

7.4 PERTURBING SIKLUS G-PROTEIN

Siklus G-protein dapat terganggu dalam beberapa cara:

1. Reversal siklus tergantung pada hidrolisis γ-fosfat GTP. Hal ini dicegah jika

nonhydrolyzable, atau perlahan terhidrolisis, analog GTP diganti, misalnya, 5'-

guanylylimidophosphate (GPP (NH)-p) atau guanosin 5'-O-(3-thiotriphosphate)

(GTPγS), atau dengan menambahkan AlF4, yang membentuk ketiga "semu" fosfat

terhadap PDB di Gα-PDB (Gambar 7.5 ). Dengan kondisi tersebut, aktivasi efektor

menjadi hampir ireversibel setelah aktivasi singkat reseptor (lihat Gambar 7.6

untuk contoh). Pengaruh aktivasi reseptor pada dasarnya adalah untuk

mengkatalisasi siklus G-protein, mempercepat itu 100- atau 1000-kali lipat.

Bahkan tanpa adanya aktivasi reseptor oleh ligan, bersepeda basal lambat terjadi.

Hal ini mungkin disebabkan oleh fakta bahwa sebagian kecil dari reseptor ada

dalam "aktif" konformasi, bahkan tanpa adanya ligan, seperti yang diharapkan dari

model dua-negara reseptor (lihat Bab 1). Akibatnya, substitusi GPP (NH)-p atau

GTPγS untuk GTP atau penambahan AlF4 sendiri dapat merangsang respon

efektor dalam ketiadaan ligan reseptor, dan, memang, teknik ini digunakan untuk

tujuan ini dalam percobaan awal pada adenilat siklase, namun onset jauh lebih

lambat daripada yang terlihat untuk co-penambahan ligan.

2. Siklus Aktifitas dapat diperlambat dengan menambahkan kelebihan dari PDB atau,

lebih umum, guanosin 5'-O-(2-thiodiphosphate) (GDPβS), analog lebih stabil.

Tidak seperti GTPγS, GDPβS tidak terikat ireversibel dan sehingga hanya bersaing

dengan GTP, oleh karena itu hanya efektif ketika hadir dalam besar (sepuluh kali

lipat) berlebih.

GAMBAR 7.6 efek ireversibel dari GTPγS-bound G-protein α subunit. Catatan

menunjukkan penghambatan arus kalium dalam M1 asetilkolin reseptor sel

neuroblastoma mengekspresikan hybrid muscarinic oleh asetilkolin. Kalium saat ini

tercatat sebagai luar arus berkelanjutan pada potensial memegang -30 mV (garis

putus-putus) dan dinonaktifkan selama 1 detik setiap 30 detik dengan hyperpolarizing

sel untuk -60 mV. Dalam sel kontrol (jejak atas), sebuah aplikasi singkat 100 M

asetilkolin (Ach) sementara menghambat arus kalium, tapi ini pulih sekitar 6 menit

setelah mengeluarkan asetilkolin dari cairan mandi. Namun, dalam sel lain ditambal

dengan elektroda berisi 500 GTPγS M (jejak yang lebih rendah), efek asetilkolin

bertahan setelah washout, memang, saat ini terus menurun selama satu jam

berikutnya, mungkin mencerminkan omset lambat dari siklus G-protein dalam tidak

adanya aktivasi GPCR. Perhatikan bahwa efek ini asetilkolin mungkin dimediasi oleh

Gαq, melalui jalur kedua utusan diketahui. (Dari Robbins et al., J. Physiol., 469, 153,

1993. Dengan izin.)

3. Kehadiran NAD +, G-protein α subunit dapat ADP-ribosylated oleh dua protein

bakteri. Pertusis (batuk rejan-) toksin (PTX) ADP-ribosylates residu sistein dalam

C-terminus G-protein dari Gi dan kelompok Go (Gambar 7.7, lihat di bawah).

Akibatnya mencegah kopling reseptor-G-protein dan tanggapan blok untuk

aktivasi GPCR. N-etil-maleimide (NEM) alkylates sistein dan memiliki efek yang

sama. Toksin kolera (CTx) ADP-ribosylates arginin di G-protein dari (adenilat

siklase-stimulating) kelas Gs, dekat situs katalitik dari domain GTPase, akibatnya,

itu blok aktivitas GTPase dan menghasilkan Gs / adenilat siklase aktivasi terus-

menerus. Transducin dan gustducin (visual dan rasa-transducing G-protein, lihat di

bawah) ADP-ribosylated oleh kedua racun. Reaksi ini telah sangat membantu

dalam mengisolasi dan memurnikan G-protein yang dapat ADP-ribosylated.

7.5 BUKTI EKSPERIMENTAL UNTUK PASANGAN G-PROTEIN DI

RESEPTOR AKSI

7.5.1 KETERGANTUNGAN GTP

Sebuah efek G-protein-dimediasi memiliki syarat mutlak untuk GTP. Referensi

telah dibuat untuk persyaratan untuk GTP dalam membangun kembali dirangsang

hormon-aktivitas adenilat siklase. Suatu persyaratan yang sama dapat ditunjukkan

ketika efektor adalah saluran ion, seperti atrium inward-rectifier K + channel jantung

yang diaktifkan setelah stimulasi M2 muscarinic reseptor asetilkolin. Dengan

demikian, dalam percobaan diilustrasikan pada Gambar 7.8, saluran direkam dengan

sel-

GAMBAR 7.7 C-terminal residu G-protein subunit α. Sistein ADP-ribosylated oleh

Pertusis toksin (PTX) ditumbuk.

terlampir Patch pipet dari sel atrium utuh tonically diaktifkan bila asetilkolin (atau

adenosine) hadir dalam pipet menempel. Kegiatan ini hilang ketika patch dipotong

(dalam konfigurasi inside-out) tetapi kemudian dikembalikan pada menambahkan

GTP dengan solusi memandikan wajah dalam patch.

Bahkan tanpa adanya suatu efektor, keterkaitan reseptor diaktifkan untuk G-

protein dapat dideteksi dalam uji reseptor-mengikat oleh yang disebut GTP-shift.

Afinitas jelas agonis (tapi tidak antagonis), diukur baik secara langsung atau dengan

perpindahan agonis dengan antagonis, berkurang pada menambahkan GTP (atau

analog stabil, seperti GTPγS, atau bahkan PDB) menjadi solusi (Gambar 7.9) . Hal ini

karena trimerik G-protein, dengan situs pengikatan nukleotida guanin kosong

membentuk kompleks stabil dengan reseptor diaktifkan seperti untuk memperlambat

disosiasi agonis. Agonis kemudian memiliki afinitas tinggi untuk G-protein.

Penambahan istirahat nukleotida kompleks ini membentuk dipisahkan PDB-terikat

trimer atau GTP-bound α subunit, agonis kemudian dapat memisahkan lebih cepat

dari reseptor, menganugerahkan afinitas rendah.

7.5.2 PENGGUNAAN GTP analog DAN RACUN

Analog Stabil GTP dan PDB dapat digunakan untuk mempelajari peran G-

protein, seperti ditunjukkan di atas. Dengan demikian, stabil GTP analog

meningkatkan efek agonis reseptor-mediated-diinduksi dan memperlambat

pembalikan mereka, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7.6. Pertusis dan kolera

racun juga dapat digunakan untuk menghambat atau mengaktifkan G-protein tertentu,

seperti yang ditunjukkan.

GAMBAR 7.8 Persyaratan GTP dalam aktivasi batin perbaikan saluran kalium di

membran sel guinea pigatrial oleh asetilkolin. Rekaman dimulai ketika pipet

mengandung asetilkolin melekat pada sel atrium utuh (ca). Ini menghasilkan

pembukaan berkelanjutan hingga tiga saluran kalium (dicatat sebagai defleksi saat

batin pada -60 mV karena pipet berisi 145 mM K +). Pada eksisi patch membran

dalam mode inside-out (io) ke dalam larutan mandi (mengandung 140 mM [K +]),

aktivitas berhenti, tapi dibangkitkan dengan menambahkan 100 M GTP untuk solusi,

memandikan wajah bagian membran Patch. (Dari Kurachi et al., Am. J. Physiol., 251,

H681, 1986. Dengan izin.)

GAMBAR 7.9 GTP pergeseran agonis mengikat GPCR a. Grafik menunjukkan

pengikatan carbachol (lingkaran) dan atropin (kotak) untuk tikus homogenat jantung

dalam ketiadaan (simbol terbuka) dan kehadiran (simbol tertutup) dari 1 mM GTP.

Axes: reseptor hunian (P) dan log-molar konsentrasi ligan. (Diadaptasi dari Hulme et

al., Di Reseptor Obat dan efektor mereka, Birdsall, NJM, Ed., Macmillan, New York,

1981, hal. 23. Dengan izin.)

7.6 PENGUKURAN G-PROTEIN AKTIVASI

Cara yang paling langsung mengukur aktivasi oleh reseptor adalah untuk

mengukur tingkat hidrolisis GTP dalam sel rusak atau pembuatan membran setelah

aktivasi reseptor. Sayangnya, hal ini tidak selalu sangat mudah dalam praktek karena

tingkat latar belakang tinggi (mencerminkan aktivitas basal semua G-protein dalam

membran ditambah reaksi enzimatik lainnya), yang justru respon tertentu G-protein

diaktifkan oleh reseptor, dan karena beberapa G-protein seperti Gs memiliki tingkat

GTPase lambat dalam persiapan tersebut. Metode yang terbaik bagi anggota Go /

keluarga Gi yang melimpah, tinggi omset G-protein. Sebuah metode alternatif dan

banyak digunakan adalah untuk mengukur tingkat GTPγS mengikat, yang tidak

tergantung pada aktivitas GTPase, hanya pada tingkat aktivasi G-protein dan PDB

disosiasi. Metode untuk mengukur perubahan fluoresensi selama aktivasi G-protein

juga telah dijelaskan.

7.7 JENIS G-PROTEIN

Secara tradisional, G-protein telah diklasifikasikan dalam hal kopling efektor

dari subunit α. Terlepas dari fakta bahwa (1) ini mendahului informasi mengenai

struktur primer dan sekunder dari kerja kloning, dan (2) subunit βγ juga terlibat dalam

kopling efektor, klasifikasi ini masih cukup berguna.

Pertama G-protein α subunit untuk diidentifikasi adalah Gs. The α subunit Gs

(αs) bertanggung jawab untuk merangsang adenilat siklase (maka, subscript "s") dan

ADP-ribosylated dan diaktifkan oleh CTx. Gs memiliki setidaknya empat varian

molekul. Beberapa bukti bahwa αs juga dapat meningkatkan aktivitas jantung L-type

Ca2+

channel, terlepas dari fosforilasi mereka dengan cAMP-dirangsang protein

kinase A. Golf adalah homolog adenilat-stimulating di epitel penciuman, diaktifkan

oleh keluarga besar reseptor penciuman .

Gi adalah G-protein yang bertanggung jawab untuk menghambat adenilat siklase.

Penghambatan ini dimediasi oleh subunit α. Berbeda Gs, Gi tidak terpengaruh oleh

CTx tapi malah ADP-ribosylated (dan menghambat) oleh PTX. Dari tiga isoform

Gi(Gil-3), αil adalah inhibitor yang paling ampuh dari adenilat. Gi juga mengaktifkan

inward-rectifier (Kir3.1/3.2 dan Kir 3.1/3.4) K+ channel (saluran GIRK), dan aktivasi

ini dimediasi oleh dirilis subunit βγ (lihat di bawah).

7.8 Reseptor G-Protein Coupling

Interaksi antara reseptor dan G-protein bersifat sementara dan cepat reversibel.

Hal ini ditunjukkan, misalnya, oleh kenyataan bahwa molekul rhodopsin tunggal

diaktifkan oleh cahaya dapat mengaktifkan molekul 500 sampai 1000 transducin

selama 1 sampai 3 sec yang seumur hidup. Oleh karena itu, interaksi harus, di titik

akhir, akan diatur oleh hukum normal interaksi kimia dan dinyatakan dalam bentuk

asosiasi dan tetapan laju disosiasi dan afinitas pengikatan. Pertanyaan yang kemudian

muncul, apakah afinitas reseptor yang berbeda untuk berbagai G-protein bervariasi.

Artinya, ada kekhususan dalam kopling reseptor-G-protein, dan, jika demikian, apa

yang menentukan ini?

Idealnya, mungkin akan berpikir bahwa pertanyaan ini terbaik bisa didekati

dengan mengukur aktivasi individu rekombinan trimer G-protein (menggunakan

reaksi GTPase, GTPγS mengikat, atau metode fluoresensi) oleh reseptor rekombinan

individu (baik dalam konsentrasi diketahui) dalam membran lipid buatan , namun, ini

adalah tugas yang menakutkan. Rubinstein dan rekan telah mencapai pendekatan

dengan mengukur aktivitas GTPase beberapa subunit α rekombinan dilarutkan

dengan dimurnikan adrenoreseptor β dan dimurnikan sapi G-protein βγ subunit dalam

vesikula fosfolipid. Menggunakan konsentrasi tunggal (10 M) dari isoprenalin,

dengan berbagai konsentrasi reseptor, mereka menemukan bahwa GDP / GTP

pertukaran dirangsang paling efektif menggunakan αs, sekitar sepertiga secara efektif

menggunakan αi1 atau αi3, sepersepuluh dengan αi2, dan diabaikan dengan αo .

Pendekatan yang lebih sering adalah untuk menilai interaksi reseptor rekombinan

dengan rekombinan atau endogen G-protein dalam baris sel, dengan menggunakan

pengukuran GTPase atau GTPγS mengikat dalam fraksi membran atau beberapa

fungsi efektor hilir sebagai titik akhir. Ini telah menghasilkan informasi yang cukup

tentang apa yang terbaik mungkin disebut "preferensi" dalam hal interaksi reseptor-

Gprotein individu, dan, melalui penggunaan titik-mutasi dan chimera, telah sangat

berguna dalam menggambarkan beberapa fitur struktural reseptor dan G-protein yang

menentukan seperti preferensi. Dari pekerjaan tersebut, jelas bahwa faktor penentu

utama adalah urutan C-terminal subunit α, di satu sisi (lihat Gambar 7.3), dan loop

batin ketiga dan kedua (i3, i2) reseptor, pada sisi lain, meskipun domain lainnya dari

subunit α dan β dari dan subunit γ juga terlibat dalam interaksi keseluruhan.

Seperti "reconstitutional" pendekatan menderita dua masalah, namun. Pertama,

selektivitas kopling reseptor-G-protein dalam lingkungan sel asli mereka tidak hanya

tergantung pada afinitas relatif dari reseptor untuk berbagai G-protein, tetapi juga

pada proporsi relatif dan ketersediaan reseptor dan G-protein. Dengan demikian,

beberapa contoh jelas "pergaulan bebas" dalam reseptor-G-protein kopling diragukan

lagi dapat dikaitkan dengan reseptor berlebih. Kedua, respon G-protein untuk reseptor

dapat dipengaruhi oleh faktor-faktor pendukung: misalnya, kehadiran tertentu RGS

protein (lihat di bawah) yang mungkin sel tertentu. Pertanyaan yang kemudian

muncul adalah bagaimana reseptor-G-protein kopling selektivitas terbaik dapat

disimpulkan dalam sel normal. Beberapa pendekatan telah digunakan. Satu sederhana

adalah untuk menguji apakah respon terhadap mengaktifkan reseptor itu dicegah oleh

PTX, sehingga mendefinisikan responsif G-protein sebagai anggota Gi / Go keluarga.

Jika demikian, maka hal ini dapat ditindaklanjuti dengan mencoba untuk

"menyelamatkan" respon dengan menerapkan atau mengungkapkan individu subunit

α eksogen di mana sistein ADP-ribosylated digantikan oleh beberapa asam amino

lainnya seperti isoleusin. Pendekatan lain adalah untuk mengganggu sambungan ke

individu G-protein α subunit menggunakan antibodi diarahkan terhadap urutan C-

terminal atau menggunakan bersaing urutan pendek-peptida. Ini akan memungkinkan

diskriminasi antara, katakanlah, Gi1 / 2 dan Gi3 atau Go, antara Aceh dan pelayar, atau

antara Gi/o dan Gq/11, tapi bukan antara Gi1 dan Gi2 atau antara Gq dan G11, karena

urutan Cterminal untuk pasangan ini adalah sama (lihat Gambar 7.7). Selektivitas

yang lebih besar dapat diperoleh dengan menghapus subunit individu G-protein

menggunakan gen knockout atau, lebih cepat dan lebih murah (tapi kurang lengkap),

dengan mengurangi ekspresi protein dengan antisense konstruksi.

Dua poin umum muncul dari pekerjaan tersebut. Pertama, pendekatan yang

berbeda tidak selalu memberikan hasil yang sesuai. Misalnya, antisense-deplesi

menunjukkan bahwa aktivasi saluran GIRK oleh aksi noradrenalin pada α2-

adrenoreseptor di neuron simpatik asli dimediasi selektif oleh Gi-protein, dari pada

Go-protein, tetapi aktivasi dapat sama baiknya diselamatkan di PTX-sel diperlakukan

oleh bentuk-bentuk PTX-tahan dari kedua αo dan αi (Gambar 7.10). Sebaliknya,

penghambatan N-type Ca2 saat dalam sel-sel yang sama dengan noradrenalin dapat

diselamatkan setelah PTX pengobatan oleh PTX-tahan αi meskipun antisense deplesi

menunjukkan penghambatan yang biasanya dimediasi oleh protein Go asli, bukan

protein Gi. Dengan demikian, menyelamatkan percobaan, seperti ekspresi lainnya

pendekatan, cenderung menunjukkan apa jalur kopling mungkin dan tidak selalu

menentukan apa yang biasanya jalur beroperasi. Kedua, dan mengikuti dari ini,

tingkat agak mengejutkan kekhususan dalam kopling reseptor-G-protein dalam sel

asli telah muncul dari beberapa studi antisense-deplesi, memperluas tidak hanya

untuk subunit α terkait erat tetapi juga untuk β terkait dan subunit γ . Misalnya,

penghambatan Ca2 arus dalam GH3 sel tumor hipofisis oleh somatostatin tampaknya

istimewa dimediasi oleh kombinasi αo1β1γ3, sedangkan efek yang sangat mirip

asetilkolin, melalui reseptor muscarinic M4, paling efektif obtunded oleh antisense

penipisan αo1β3γ4. Salah satu alasan untuk tinggi spesifisitas in situ tidak dapat

diprediksi dari percobaan pemulihan mungkin bahwa, dalam sel normal, reseptor dan

kognitif G-protein tidak terdistribusi secara acak dalam membran sel tetapi co-

terlokalisasi di "microdomains."

Di sisi lain, beberapa reseptor yang benar-benar "promiscuous" dalam bahwa

mereka dapat mengaktifkan dua atau lebih G-protein dari kelas berbeda, bahkan

dalam lingkungan yang normal mereka seluler. Sebagai contoh, konsentrasi yang

sama thyroid-stimulating hormone (TSH; 0,1-100 U / ml) dapat merangsang

penggabungan 32P-GTP ke αi, αo, α12, α13, αs, dan αq/11 melalui aktivasi reseptor

thyrotropin di membran dari kelenjar tiroid manusia. TRH aktivasi Ca2 + arus dalam

GH3 sel obtunded sama oleh antisense-penipisan αi2, αi3, dan αq/11, tapi bukan dari αo.

Beberapa genotip reseptor nukleotida P2Y individu juga dapat pasangan dengan

afinitas sama dengan PTX-sensitif dan PTxinsensitive G-protein dalam neuron

simpatik. Derajat, atau sebaliknya, seperti "pergaulan" diduga ditentukan oleh

struktur protein reseptor itu sendiri.

Lebih menarik lagi, beberapa bukti menunjukkan bahwa tingkat preferensi

bahwa salah satu reseptor menunjukkan untuk satu atau lain G-protein mungkin

tergantung pada agonis digunakan. Dengan demikian, aktivasi reseptor octopamine

Drosophila diungkapkan dalam bahasa Cina hamster ovarium (CHO) sel

menghambat adenilat siklase dan meningkatkan Ca2+

intraseluler melalui aktivasi dua

G-protein yang berbeda: PTX-sensitif dan tidak sensitif, masing-masing. Tyramine

dan octopamine telah terbukti meningkatkan Ca2+

dengan potensi yang sama, tapi

tyramine adalah jauh lebih kuat dalam menghambat adenilat daripada octopamine.

Hal ini sesuai dengan percobaan sebelumnya yang menunjukkan bahwa mutasi dari

aspartat sangat lestari terlibat dalam agonis amina mengikat hampir semua reseptor

mempengaruhi kopling G-protein dalam agonis tergantung cara. Salah satu

interpretasi dari ini adalah bahwa agonis yang berbeda menghasilkan states aktif yang

berbeda dari reseptor, atau distribusi yang berbeda dari states yang aktif, dengan

afinitas yang berbeda untuk berbagai Gproteins, namun, tidak ada informasi langsung

apakah ada atau tidak reseptor ligan-diduduki dapat membentuk beberapa states yang

aktif. Diaktifkan cahaya rhodopsin melewati beberapa states konformasi sebelum

membentuk aktif-states metarhodopsin-II, tetapi tidak ada states menengah memiliki

lebih dari ~ 1/10, 000 dari afinitas metarhodopsin-II untuk transducin. Dengan tidak

adanya bukti langsung yang bertentangan, tampaknya bijaksana untuk menafsirkan

fenomena seperti variasi agonis-tergantung dalam efisiensi kopling pada asumsi

bahwa reseptor yang diberikan biasanya dapat membentuk hanya satu states yang

aktif.

GAMBAR 7.10 Membandingkan informasi yang dihasilkan oleh antisense deplesi

dan subunit α pemulihan mengenai spesies G-protein yang bertanggung jawab untuk

penghambatan adrenergik inward penyearah arus GIRK pada tikus neuron simpatik.

Catatan menunjukkan hati meluruskan arus GIRK dihasilkan dalam sel sebelumnya

transfected dengan cDNA coding untuk Kir3.1 dan Kir.3.2 saluran kalium oleh jalan

tegangan dari -140 sampai -40 mV, direkam dalam ketiadaan (basal) dan kehadiran

(NE) dari 10 pM noradrenalin (norepinefrin). Perhatikan bahwa dalam (a) co-ekspresi

cDNA antisense ditujukan terhadap GαoA tidak berpengaruh pada aktivasi saat ini

dengan noradrenalin, sedangkan co-ekspresi dari antisense ditujukan terhadap urutan

pengkodean umum Gαi1-3 mengurangi respon terhadap noradrenalin sekitar setengah

(seperti yang ditunjukkan pada grafik batang bawah). Di (b), pendekatan yang

berbeda digunakan, di mana α subunit asli adalah tidak aktif dengan Pertusis toksin

(PTX), sehingga menghambat efek noradrenalin (panel atas), dan upaya yang

dilakukan untuk menyelamatkan respon oleh co-transfecting cDNA coding untuk

subunit α berbeda bermutasi untuk menghapus sistein PTX-responsif (lihat Gambar

7.7). Dalam kasus ini, respon diselamatkan untuk luasan yang sama oleh semua

subunit α diekspresikan. (Diadaptasi dari Fernandez-Fernandez et al., Eur. J.

Neurosci., 2001.

TABEL 7.1

Beberapa Prinsip Preferensi Reseptor G-Protein Coupling

G-Protein Reseptor

Gs β-Adrenoceptor; dopamine D1,5; histamine H2; 5-hydroxytryptamine

5HT4,6,7; glucagon; vasopressin V2; VIP/PACAP (VPAC1Ŕ3); prostanoid DP, IP;

CRF1,2; calcitonin/amylin/CGRP

Gi/Go α2-Adrenoceptor; M2/4 muscarinic acetylcholine; dopamine D2Ŕ4;

5HT1; opioid δ, κ, θ, OFQ; somatostatin sst1Ŕ5; GABAB; mGlu2Ŕ4; cannabinoid

CB1,2

Gq/G11 α1-Adrenoceptor; M1,3,5 muscarinic; histamine H1; 5HT2; mGlu1,5;

nucleotide P2Y; vasopressin V1; tachykinin NK1Ŕ3; bradykinin B1,2; neurotensin

NTS1,2; endothelin ET1,2; TRH; cholecystokinin CCK2; prostanoid FP, TP

Meskipun berbagai pertimbangan dan keberatan mengenai reseptor G-protein

coupling spesifisitas yang diuraikan di atas, dan mengabaikan variasi antara coupling

untuk anggota yang berbeda dari kelas yang sama dari G-protein, Tabel 7.1 dapat

membantu dalam memberikan ringkasan operasional yang luas dari pokok-reseptor

preferensi G-protein-coupling. Informasi yang lebih rinci diberikan di bawah ini di

bagian Bacaan lebih lanjut (lihat Guderman et al., 1996).

7.9 G-Protein-Coupling Efektor

"Efektor" dalam pengertian ini adalah protein target langsung diaktifkan G-

protein subunit (s). Meskipun awalnya ditandai dalam hal aktivasi efektor oleh α

subunit GTP-bound, misalnya, dari adenilat siklase oleh αs, sekarang jelas bahwa

subunit βγ dibebaskan juga bertindak sebagai transduser independen (lihat Tabel 7.2).

Sementara tunjangan harus dibuat dalam sistem utuh untuk efek tidak langsung

melalui Gβγ mengikat, dan inaktivasi, Gα-GTP, interaksi langsung Gβγ dengan

efektor protein telah ditetapkan untuk reseptor kinase β-adrenergik (βARK), adenilat

siklase, fosfolipase C-β1, 2,3, phosducin, GIRK K saluran, dan N-type (α1B) saluran

Ca2+

. Mengikat efektor ini tampaknya terutama melalui situs pada subunit β yang

tumpang tindih dengan situs di mana βγ mengikat subunit α, maka, subunit α bebas

bertindak sebagai pesaing dengan efektor untuk βγ mengikat (lihat di bawah). Situs

mengikat komplementer untuk βγ pada C-terminus protein βARK, pada linker I-II

dari saluran Ca2+

α1B (tumpang tindih tempat engikatan saluran β subunit) dan pada

kedua N-dan C-termini dari saluran GIRK memiliki telah diidentifikasi. Beberapa

efektor adalah target untuk kedua α dan subunit βγ (misalnya, PLCβ1-3, beberapa

isoform adenilat siklase). Dalam kasus ini, dua subunit memiliki efek independen dan

aditif. Aktivasi enzim ini dengan βγ dilepaskan dari α subunit PTX-sensitif dapat

menjelaskan banyak contoh adenilat PTX-sensitif atau tanggapan PLC untuk aktivasi

reseptor.

Pertanyaan yang kemudian muncul adalah bagaimana, dalam sebuah sistem

yang tidak diketahui, seseorang dapat mengidentifikasi subunit (α atau βγ) membawa

pesan. Dua pendekatan utama yang tersedia untuk mengidentifikasi respon βγ-

dimediasi: replikasi (dan oklusi) oleh dinyatakan atau diterapkan subunit βγ dan

antagonisme dengan mengungkapkan atau diterapkan peptida βγ mengikat seperti

peptida C-terminus dari βARK-1 atau α-transducin, yang, pada dasarnya, bersaing

dengan target untuk subunit βγ gratis. Identifikasi positif efek α-dimediasi lebih sulit,

karena antagonis Gα seperti PTX atau antibodi C-terminusjuga mencegah pelepasan

Gβγ gratis, dan efek yang dihasilkan dari antisense penipisan α subunit mungkin

TABLE 7.2

Tipe G-Protein

Subskrip Sentivitas Toxin Efektor

(Gsubskrip) PTx CTx α subnit βγ subunit

S Ŕ + Adenilat siklase ↑ βARK translasi ICa(N)↓

olf Ŕ + Adenilat siklase ↑ ŕ

t + + Fosfodiesterase ↑ Fosfolipase A2 ↑

gust + + Fosfodiesterase ↑ PLC ↑

i + Ŕ Adenilat siklase ↓ GIRK ↑

o + Ŕ ŕ Ca(N, P, Q) ↓

z Ŕ Ŕ ŕ Ca(N)↓, GIRK ↑

q Ŕ Ŕ PLC ↑ PLC ↑

11 Ŕ Ŕ PLC ↑ ŕ

12 Ŕ Ŕ ? ŕ

13 Ŕ Ŕ ? ŕ

14 Ŕ Ŕ PLC ↑ ŕ

15 Ŕ Ŕ PLC ↑ ŕ

16 Ŕ Ŕ PLC ↑ ŕ

Singkatan: βARK1, β-adrenergik reseptor kinase 1, PLC, fosfolipase C, GIRK, G-

protein-diaktifkan dalam hati perbaikan saluran kalium, Ca (N, P, Q), tipe N, P-jenis,

atau kanal kalsium Qtype.

disebabkan kelebihan Gβγ terikat. Replikasi oleh subunit α GTPase-kekurangan

dalam ketiadaan bukti positif bagi keterlibatan subunit βγ dapat berguna.

Sebagai contoh dual efek α-dan βγ-dimediasi, orang mungkin menganggap

penghambatan N-type Ca2 +

arus di neuron simpatik asetilkolin (Angka 7.11 dan 7.12,

lihat juga Hille, 1994). Asetilkolin menghambat arus ini melalui dua reseptor

muscarinic berbeda (M1 dan M4), menggunakan dua jalur G-protein yang berbeda.

GAMBAR 7.11 Pendekatan Eksperimental pada identifikasi subunit G-protein yang

bertanggung jawab untuk menghambat arus kalsium pada rat neuron simpatik

merangsang reseptor asetilkolin muskarinik M4 dengan agonis muskarinik,

oxotremorine-M (Oxo-M). Arus (ditimbulkan oleh 5-msec depolarisasi langkah untuk

0 mV dari -60 mV) tercatat dari sel ganglion dipisahkan ditambal dengan elektroda

terbuka-tip yang mengandung 20 mM Bapta, ini menghilangkan komponen

penghambatan diproduksi dengan merangsang reseptor M1 (lihat Bernheim et al,

1991;. Beech et al, 1992).. Seperti ditunjukkan dalam meninggalkan jejak atas, Oxo-

M diproduksi ~ 60% penghambatan saat ini, yang secara sementara dan sebagian

dibalik oleh 10-msec depolarisasi langkah +90 mV. Preinjection dari antibodi

diarahkan terhadap C-terminus Gαo, tetapi tidak Gαi1 / 2, mengurangi inhibisi (a),

menunjukkan bahwa Gαo adalah menerima α subunit untuk efek ini. Hal ini

dikonfirmasi dan dipersempit ke GαoA isoform dengan mengekspresikan antisense

cDNA konstruksi untuk menguras subunit α individu (b). Ekspresi

dari β1γ2 subunit (oleh transfeksi cDNA) juga menghambat arus dan tersumbat aksi

Oxo-M (c), sedangkan berlebih dari fragmen C-terminal βARK-1 (yang bertindak

sebagai agen βγ-mengikat) mencegah tegangan- penghambatan tergantung oleh Oxo-

M (d), menyiratkan penghambatan yang dimediasi oleh subunit βγ dibebaskan dari

diaktifkan GαoA -abg trimer. Subunit βγ dibebaskan berinteraksi langsung dengan

saluran kalsium dengan cara tegangan-tergantung: depolarisasi menyebabkan

disosiasi subunit, yang kemudian reassociate dengan rata-rata waktu konstan 37 msec

pada repolarisasi (e; lingkaran terbuka); berlebih dari βARK- 1C-ter mengurangi

konsentrasi efektif subunit βγ bebas dan memperpanjang waktu konstan untuk

reassociation menjadi 51 msec. Perhatikan bahwa noradrenalin, bukan Oxo-M,

digunakan untuk menghambat arus dalam (e). (Records (a) sampai (d) yang

diadaptasi dari Delmas et al, Eur J. Neurosci, 10, 1654-1666, 1998;... Record (e)

adalah dari Delmas et al, J. Physiol, 506,.. 319-329, 1998.)

Stimulasi reseptor M4 menghasilkan penghambatan cepat yang ditandai dengan

ketergantungan tegangan. Artinya, pembukaan saluran selama tegangan langkah

depolarizing tertunda (sehingga timbulnya arus diperlambat), dan sementara ini

dibalik oleh kuat depolarizing Prepulse (Gambar 7.11a). Efek seperti ini dicegah oleh

PTX dan dimediasi oleh anggota Gi / Go keluarga yang dapat dipersempit khusus

untuk ke GαA , karena (1) antagonis yang disuntikkan antibodi untuk domain C-

terminal Gαo tetapi tidak untuk C-terminal Gαi1 / 2 (Gambar 7.11a), dan (2) dikurangi

pada mengekspresikan antisense RNA untuk GαoA (Gambar 7.11b). Transduser akhir

adalah βγ-dimer dilepaskan dari αoAβγ-trimer karena (1) efek stimulasi reseptor M4

direplikasi dan tersumbat karena berlebih dari kombinasi βγ umum (β1γ2, Gambar

7.11c), dan (2), aksi agonis dicegah dengan meningkatkan ekspresi yang peptida

domain C-terminal βARK-1, yang mengikat dan disekap subunit βγ bebas (Gambar

7.11d). Kecil, residu penghambatan tegangan-independen mungkin hasil dari efek

tambahan dari monomer αoA-GTP. Pengaruh subunit βγ pada saluran ini dapat

ditafsirkan sebagai berikut. Sebuah molekul βγ bebas mengikat langsung ke protein

saluran pada satu atau lebih situs, termasuk situs di linker I-II yang berisi mengikat

motif (QXXER) yang sesuai dengan motif yang sama di βARK-1 peptida, maka

kompetisi. Ini mengikat mengarah ke keterbelakangan di Ca2 +

membuka saluran pada

langkah tegangan. Depolarisasi yang kuat menyebabkan disosiasi sementara ini

molekul βγ terikat sehingga membalikkan penghambatan. Pada repolarisasi, molekul

βγ dipisahkan rebind dan inhibisi dipulihkan. Rebinding (reinhibition) mengikuti

waktu-tentu eksponensial saja, tingkat-konstan yang tergantung pada konsentrasi

yang tersedia gratis Gβγ [βγ], sesuai dengan persamaan kobs = k1 [βγ] + k2, di mana

k1 dan k2 adalah konstanta laju maju dan mundur untuk pengikatan reversibel dari

satu molekul βγ dengan satu saluran molekul protein (C): C + βγ = Cβγ. Dengan

demikian, laju reinhibition dipercepat dengan meningkatkan konsentrasi agonis atau

dengan menerapkan meningkatnya konsentrasi βγ dan diperlambat dengan

mengurangi jumlah βγ tersedia dengan menggunakan βARK-1 peptida (Gambar

7.11e). Sedangkan hanya satu molekul Gβγ tampaknya mengikat satu sama lain

kanal Ca2 +

molekul, ke dalam rectifier kanal K +, yang diaktifkan oleh Gβγ, terdiri

dari empat subunit yang terpisah, masing-masing dapat mengikat satu molekul Gβγ.

Stimulasi reseptor M1 menghasilkan penghambatan lambat yang tidak sensitif

dan tegangan yang bertahan di hadapan PTX (Gambar 7.12a). Seperti yang

diharapkan dari perlawanan terhadap PTX, ini tidak terpengaruh oleh antisense-

penipisan αoA tetapi, sebaliknya, berkurang antisense-penipisan αq (Gambar 7.12b)

dan hilang dalam neuron dari Gαq ketukan luar mice (Gambar 7.12c). Berbeda

dengan penghambatan tegangan-sensitif diproduksi dengan merangsang reseptor M4,

tidak dimediasi oleh βγ-dimer dilepaskan dari dirangsang trimer αqβγ karena (1) tidak

terpengaruh oleh βARK-1 peptida (Gambar 7.12d), dan (2) penghambatan agonis

berlanjut setelah mengekspresikan gratis β1γ2 subunit (Gambar 7.12e). Sebaliknya,

efek agonis ini direplikasi dan tersumbat dengan meningkatkan ekspresi yang

GTPase-kekurangan bentuk (dan karena itu permanen aktif, GTP-bound) dari Gαq

(Gambar 7.12f). Tindakan ini Gαq-GTP tidak mungkin hasil dari interaksi langsung

dari subunit α dengan + saluran Ca2+

tetapi mungkin melibatkan produksi dan

tindakan utusan lain yang dapat menyebar melalui sitoplasma untuk mempengaruhi

kanal Ca2 +

beberapa cara pergi dari lokasi pembentukan Gαq-GTP, seperti Ca2 +

aktivitas saluran tercatat dalam pipet patch yang melekat pada membran sel dapat

dihambat dengan merangsang reseptor muskarinik pada bagian lain dari membran sel

luar patch (Gambar 7.12g, juga lihat di bawah dan Gambar 7.18).

Apa arti fungsional dari berbagai mode Ca2+

penghambatan saat ini? βγ-

dimediasi inhibisi oleh asetilkolin, atau pemancar lain seperti noradrenalin dan γ-

aminobutyric acid (GABA), dan pengurangan konsekuensi dari masuknya Ca2+

di

terminal saraf mungkin menyediakan komponen penting dari tindakan otoinhibitor

presinaptik pemancar pada rilis mereka sendiri dalam sistem saraf baik perifer dan

sentral, meskipun efek lain di luar langkah Ca2+

masuk juga dapat menyebabkan

pelepasan pemancar berkurang. Di sisi lain, semakin penghambatan α-dimediasi jarak

jauh tampaknya terbatas pada membran somatik. Di sini, efek utamanya adalah untuk

mengurangi jumlah Ca2+

tersedia untuk membuka saluran Ca2+

K-dependent, ini

meningkatkan rangsangan somatik, yang memungkinkan neuron untuk api lebih lama

dan lebih cepat potensi kereta selama eksitasi terus menerus atau frekuensi tinggi.

Satu masalah yang timbul sehubungan dengan tanggapan βγ-dimediasi adalah

bagaimana kekhususan reseptor-efektor kopling dipertahankan. Dengan demikian,

sebagian besar efek βγ-dimediasi, pada saluran ion setidaknya, yang dihambat oleh

PTX, menyiratkan bahwa mereka hasil dari aktivasi Gi atau Go. Ada pengecualian,

misalnya, penghambatan βγ-dimediasi Ca2 +

arus dan aktivasi GIRK arus di neuron

simpatik juga dapat disebabkan oleh peptida intestinal vasoaktif (VIP), bertindak

melalui Gs. Namun, ini adalah pengecualian dan, secara umum, tegangan yang

tergantung Ca2 +

penghambatan saat ini atau aktivasi GIRK dalam sel asli dibatasi

untuk reseptor bahwa pasangan untuk PTX-sensitif G-protein seperti α2-

GAMBAR 7.12 Pendekatan Eksperimental pada identifikasi subunit G-protein yang

bertanggung jawab untuk menghambat arus kalsium pada rat neuron simpatik

merangsang reseptor asetilkolin muskarinik M1 dengan agonis muskarinik,

oxotremorine-M (Oxo-M). Dalam eksperimen ini, penghambatan M4/Go/βγ-mediated

diilustrasikan pada Gambar 7.11 telah diblokir oleh pengobatan sebelumnya dengan

Pertusis toksin, dan arus kalsium dicatat menggunakan varian berlubang-patch

metode patch-clamp (yang memelihara konstituen sitoplasma normal). Dengan

kondisi tersebut, oxotremorine-M menghasilkan penghambatan perlahan berkembang

yang umpan balik dengan depolarisasi kuat (a). Bentuk inhibisi tidak terpengaruh

oleh mengekspresikan antisense untuk GαoA, melainkan secara selektif dikurangi

dengan antisense penipisan Gαq (b). Dalam konfirmasi ini, penghambatan sangat

berkurang dalam sel ganglion dari rat transgenik kekurangan Gαq (Gαq - / -), dan

inhibisi dipulihkan dalam sel-sel dengan bebas mengekspresikan Gαq (c). Tidak

seperti penghambatan M4-dimediasi (Gambar 7.11), bentuk penghambatan tidak

terpengaruh dengan meningkatkan ekspresi yang βARK-1 peptida (d) dan berlanjut

setelah overexpressing bebas β1γ2 subunit (e). Sebaliknya, penghambatan ini

direplikasi dan tersumbat oleh mengekspresikan sebuah α subunit GTPase-

kekurangan dari Gq (f), menunjukkan bahwa itu dimediasi oleh GTP-bound αq

subunit. Ini mungkin tidak berinteraksi secara langsung dengan saluran kalsium

melainkan memicu kaskade enzim yang menghasilkan beberapa pesan substansi yang

berdifusi melalui sitoplasma untuk mempengaruhi saluran, sebagai inhibisi penuh

terlihat ketika saluran clusterof dicatat dengan patch pipet sel-terlampir dan Oxo-M

ditambahkan ke dalam larutan mandi dalam kontak dengan membran sel luar patch

(g). (Records (a), (b), dan (d) sampai (g) yang diadaptasi dari Delmas et al, Eur J.

Neurosci, 10, 1654-1666, 1998;... Record (c) yang diadaptasi dari Haley et al., J.

Neurosci., 20, 3973-3979, 2000.)

Adrenoreseptor atau reseptor muskarinik M2 atau M4. Adrenoseptor bahwa

pasangan melalui Gs atau Gq/11 atau reseptor muskarinik bahwa pasangan melalui

Gq/11 biasanya tidak menimbulkan efek βγ-dimediasi. Sebaliknya, sementara ada

perbedaan dalam afinitas relatif antara kombinasi βγ berbeda, baik saluran GIRK dan

kanal Ca2 +

muncul untuk menanggapi berbagai βγ kombinasi subunit bila langsung

diterapkan atau dinyatakan, termasuk yang biasanya mengasosiasikan dengan PTX-

sensitif α subunit. Oleh karena itu, spesifisitas jelas diberikan oleh subunit α.

Bagaimana ini diterjemahkan spesifisitas respon efektor belum jelas.

GAMBAR 7.13 Peran protein RGS dalam mempercepat offset efek G-protein-

dimediasi. (a) Dalam hati meluruskan GIRK kalium arus diaktifkan dengan

merangsang reseptor muskarinik M2 asetilkolin dengan asetilkolin (Ach), dicatat (1)

dari miosit atrium rat, (2) dari sel CHO cotransfected dengan saluran GIRK jantung

(Kir3.1 + Kir3 .2) ditambah reseptor M2, dan (3) dari sel CHO transfected seperti

dalam (2) tetapi juga dengan RGS protein RGS4. Perhatikan bahwa respon dalam sel

CHO (2) lebih lambat untuk mencapai kondisi mapan dan jauh lebih lambat untuk

menonaktifkan dibandingkan dengan sel atrium, tetapi meniru respon dari sel atrium

setelah transfeksi RGS4 (3). (b) Rata-rata tanggapan foton tunggal dari fotoreseptor

batang retina yang diambil dari normal (+ / +) tikus dan dari heterozigot (+ / -) dan

homozigot (- / -) RGS9 tikus knockout. Lampu flash disampaikan pada waktu = 0

detik. (Record (a) diadaptasi dari Doupnik et al, Proc Acad Sci USA Natl, 94, 10.461-

10.466, 1997;..... Record (b) adalah dari Chen et al, Nature, 403, 557-560,. 2000.

Dengan izin.)

7.10 Pengaturan Sinyal G-Protein

7.10.1 Protein RGS

(Lihat Vries et al., 2000, di bagian Bacaan lebih lanjut.) Protein RGS adalah anggota

besar (20 atau lebih) keluarga protein longgar terkait yang memiliki kesamaan dengan

domain RGS 130-asam amino yang memungkinkan mereka untuk mengikat G-

protein subunit α. Mereka memiliki (untuk berbagai luasan) dua tindakan utama di

sinyal G-protein sebagai konsekuensi dari ini mengikat. Pertama, dan yang paling

penting, mereka bertindak sebagai GAP (protein GTPase-activating), yaitu, mereka

mempercepat hidrolisis GTP oleh G-protein aktif dan karenanya mempercepat

pemulihan efektor dari aktivasi oleh GαGTP atau Gβγ. Mereka tidak mempengaruhi

nilai tukar PDB-GTP dan tidak mengubah tingkat aktivasi G-protein dengan reseptor.

Kedua, mereka juga dapat mengurangi pengikatan GαGTP ke efektor, mungkin

secara fisik menghalangi interaksi. Ini mungkin independen dari kegiatan GAP

mereka, yang juga harus mengurangi respon efektor ke tingkat tertentu aktivasi G-

protein (lihat di bawah), karena dapat dilihat ketika subunit α diaktifkan oleh GTPγS

nonhydrolyzable. Misalnya, protein RGS, RGS4, menghambat respon PLC-β1 ke

GTPγS-diaktifkan Gq.

Gambar 7.13a menunjukkan contoh efek dari protein RGS pada aktivasi saluran

GIRK dengan merangsang reseptor asetilkolin muskarinik M2 dengan asetilkolin. Ini

adalah saluran K+ dalam sel-sel alat pacu jantung yang dibuka oleh asetilkolin

dilepaskan setelah stimulasi vagal dan bertanggung jawab atas hiperpolarisasi dan

memperlambat alat pacu jantung (lihat di bawah). Namun, ketika hanya saluran

GIRK dan reseptor M2 dilarutkan dalam oosit atau sel nonkardiak mamalia, saluran

dalam waktu beberapa detik untuk menutup kembali setelah menghapus asetilkolin,

padahal dalam hati, saat pulih dalam waktu kurang dari satu detik. Seperti

ditunjukkan dalam Gambar 7.13a, tingkat off untuk penonaktifan GIRK berikut

penghapusan asetilkolin dalam sistem dilarutkan adalah dipercepat lebih dari 10 kali

oleh co-mengekspresikan RGS4 dan sekarang sesuai dengan tingkat off untuk saat

atrium asli.

Jumlah besar protein RGS memiliki berbagai tingkat selektivitas untuk subunit

α berbeda dan efek pada sistem efektor yang berbeda (lihat Vries et al., 2000)

bervariasi. Properti ini biasanya dinilai dalam sistem ekspresi dilarutkan. Yang

kurang jelas saat ini adalah peran yang RGS protein individu bermain di sel asli.

Salah satu pendekatan yang menarik untuk pertanyaan ini memanfaatkan fakta bahwa

kopling protein RGS ke subunit α dapat terganggu oleh mutasi titik dalam subunit α

tanpa gangguan lain untuk fungsi Gα. Dengan menggabungkan mutasi tersebut

dengan mutasi lain untuk menghilangkan PTX sensitivitas (lihat Gambar 7.10), telah

ditetapkan bahwa RGS protein endogen yang terlibat dalam penghambatan Ca2 +

arus

di neuron simpatik noradrenalineactivated Go, sebagai penggantian Goα endogen

dengan Goα bermutasi telah terbukti mengurangi kepekaan terhadap noradrenalin

sekitar sepuluh kali lipat dan untuk memperlambat laju onset dan pemulihan inhibisi.

Namun, bahkan ini melibatkan tingkat pemulihan, dengan masalah konsekuen

ditangani sebelumnya. Pendekatan alternatif adalah penghapusan genetik. Dengan

demikian, ada dramatis (lebih besar dari sepuluh kali lipat) perlambatan pemulihan

dari photoresponse batang retina terisolasi pada ketukan luar rat kekurangan dalam

RGS retina-spesifik protein RGS-9 (Gambar 7.13b).

7.10.2 Efektor Protein GTPase-Aktif

Beberapa efektor enzim juga bertindak sebagai GAP, mempercepat hidrolisis

GTP dan karenanya mempromosikan belokan cepat dari enzim G-protein-diaktifkan

sendiri. Sebagai contoh, kegiatan GTPase murni Gαq-GTP sangat lambat (10 sampai

60 detik) bila diukur dalam larutan tetapi meningkat 50 kali lipat pada menambahkan

sasaran efektor yang PLC-β1, untuk yang lebih fisiologis waktu paruh 1 detik.

Demikian juga, penambahan fosfodiesterase mempersingkat paruh GTP-terikat α-

transducin dari 20 detik sampai 5 detik. Ini efek percepatan dari fosfodiesterase

efektor yang sinergis dengan efek visual yang RGS protein RGS9 disebutkan di atas.

Apakah efektor ion-channel juga bertindak sebagai GAP dengan tidak adanya protein

RGS jelas.

7.11 Kinetika Sinyal GPCR-Dimediasi

Efek dimediasi oleh G-protein coupled receptors (GPCRs) sangat jauh lebih

lambat dibandingkan mereka yang dimediasi, misalnya, saluran ion ligand-gated,

terutama karena langkah-langkah lebih banyak yang terlibat antara aktivasi reseptor

dan respon akhir. Misalnya, bahkan secara sederhana, tiga langkah, efek Gprotein-

dimediasi, seperti pembukaan saluran GIRK atrium setelah aktivasi reseptor

muscarinic M2 oleh asetilkolin, yang mengikuti skema:

Ach R → R-Ach Gαβγ → [αGTP] βγ GIRKtertutup → βγ-GIRKterbuka

latency minimum untuk perkembangan GIRK saat ini dan konsekuen membran

hiperpolarisasi, setelah pulsa-aplikasi asetilkolin, adalah sekitar 30 msec (Gambar

7.14). Hal ini kontras dengan <1-msec latency pembukaan nikotinik saluran

menyusul penerapan asetilkolin untuk endplate otot reseptor nikotinik. Dengan

analogi dengan respon rodopsin terhadap kilasan cahaya, ada kemungkinan bahwa

pengikatan awal asetilkolin pada reseptor muskarinik dan perubahan konformasi

selanjutnya mengambil tidak lebih dari satu milidetik atau lebih, waktu ekstra

diperlukan untuk difusi dan docking reseptor diaktifkan untuk G-protein, pertukaran

GTP untuk GDP, dan disosiasi dari G-protein, serta difusi dan docking dari subunit

βγ dibebaskan dengan saluran kalium. Setelah puncaknya, saat kemudian menurun

selama beberapa ratus milidetik, ini ditentukan oleh laju hidrolisis GTP dan disosiasi

akibat dari subunit α dari efektor atau merebut kembali dari subunit βγ dari efektor

oleh PDB yang baru dibentuk terikat α subunit (lihat di atas dan Gambar 7.13).

Pengaruh stimulasi adrenoreseptor jantung bahkan lebih santai karena beberapa

langkah lagi mengikuti aktivasi dari protein Gs oleh β-adrenoreseptor. Misalnya,

untuk meningkatkan kekuatan kontraksi jantung, kita memiliki (1) aktivasi adenilat

siklase oleh GαS-GTP, (2) pembentukan cAMP, (3) aktivasi protein kinase A oleh

cAMP, maka (4) fosforilasi saluran protein kalsium oleh kinase. Akibatnya,

dibutuhkan sekitar 5 sampai 6 detik dari waktu reseptor diaktifkan untuk kenaikan

pertama dalam arus kalsium amplitudo (Gambar 7.15a). Sebagian besar waktu ini

diambil dengan langkah menuju generasi jumlah yang cukup cAMP (adenilat siklase

GAMBAR 7.14 Waktu-kursus aktivasi G-protein-dimediasi GIRK saluran kalium

dalam sel kelinci simpul sinoatrial. (a). Saat Outward ditimbulkan oleh 33-msec, 50-

nA pulsa iontoporetik asetilkolin (antara anak panah). (b). Respon dari sel unclamped

ke pulsa iontoporetik asetilkolin (Ach). (Record (a) disesuaikan dengan izin dari

Trautwein et al., Di Reseptor Obat dan efektor mereka, Birdsall, . NJM, Ed,

Macmillan, New York, 1980, hlm 5-22; record (b) disesuaikan dengan izin dari

Noma, di Elektrofisiologi Sel Jantung Single, Noble, dan D. Powell, T., Eds,

Akademik. press, San Diego, CA, 1987, hlm 223-246.)

merupakan enzim relatif lambat-acting), sebagai latency berkurang menjadi sekitar

150 msec pada penerapan lompatan konsentrasi cAMP oleh lampu kilat fotolisis dari

intraseluler akumulasi photolabile cAMP prekursor (Gambar 7.15b).

Namun, latency saja tidak baik panduannya untuk jumlah langkah dalam

kaskade G-protein-dimediasi, geometri dan packing density juga penting. Dengan

demikian, (hampir) reaksi kaskade sama kompleks yang terlibat dalam respon

fotoreseptor ke lampu kilat (di mana rodopsin mengaktifkan transducin G-protein,

yang pada gilirannya mengaktifkan fosfodiesterase, yang mengurangi konsentrasi

cGMP sehingga menutup kation cGMP-gated saluran) sangat cepat, dengan latency

minimal sekitar 10 msec pada tertinggi intensitas berkedip (Gambar 7.16). Alasan

untuk ini adalah kepadatan sangat tinggi reseptor G-protein, dan fosfodiesterase

dalam cakram batang. Juga, fosfodiesterase memiliki (substrat-difusi-terbatas) tingkat

turnover jauh lebih tinggi dari pada adenilat siklase. Sebagai aturan praktis, rasio

biasa reseptor G-protein untuk efektor kanal ion mungkin sekitar 1:10:0.1, karena

saluran ion yang paling tampaknya memiliki kepadatan sekitar 1 per mikrometer

persegi, ini memberikan sekitar 10 reseptor dan sekitar 100 G-protein per mikrometer

persegi. Sebaliknya, ada sekitar 2500 molekul transducin dan sekitar 167 efektor

(fosfodiesterase) molekul per mikrometer persegi batang membran disk. Sebaliknya,

bahkan aktivasi langsung, atau inhibisi, dari saluran ion mungkin sangat lambat

dengan kepadatan rendah saluran dan G-protein (Gambar 7.17).

Untuk efektor kanal ion, Angka 7.8 dan 7.12 menggambarkan cara lain untuk

memutuskan apakah diaktifkan subunit G-protein berinteraksi langsung dengan

saluran atau tidak langsung melalui reaksi kaskade mengarah ke utusan sitoplasma,

menggunakan teknik patch-clamp ditampilkan, kalium GIRK saluran dicatat dalam

patch sel-terpasang pada Gambar 7.8 diaktifkan oleh asetilkolin di pipet patch yang

tetapi tidak pada menambahkan asetilkolin dengan solusi mandi luar patch,

menyiratkan efek lokal dari reseptor-activated protein-G pada saluran. Sebaliknya,

kalsium saluran dalam Gambar 7.12 ditutup dengan menambahkan agonis reseptor

muskarinik pada membran ekstra-patch melalui solusi mandi, menyiratkan bahwa

GAMBAR 7.15 Waktu-program dari peningkatan amplitudo arus kalsium direkam

dari kodok atrium trabekula berikut (A) aplikasi cepat dari agonis β-adrenoreseptor

isoprenalin (3 M), dan (B) rilis intraseluler cepat cAMP oleh flash-fotolisis cAMP o-

nitrobenzil. Aplikasi / berkedip dibuat pada waktu nol. (Dari Nargeot et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. Amerika Serikat, 80, 2395-2399, 1983. Dengan izin.)

beberapa utusan diffusible diproduksi untuk membawa pesan melalui sitoplasma dari

reseptor-diaktifkan G-protein untuk patch-tertutup saluran. Contoh lain seperti sinyal

jalur jarak jauh yang membawa pesan dari reseptor muskarinik-diaktifkan G-protein

untuk jenis lain dari saluran kalium diilustrasikan pada Gambar 7.18.

GAMBAR 7.16 (A) photocurrents sel batang salamander mengikuti berkedip

memberi antara 10 dan 2000 rhodopsin molekul isomerizations. (B) kenaikan

Dihitung dalam konstanta laju phosphodiesterase hidrolitik. (Dari Lamb, TD dan

Pugh, Jr, EN, Tren Neurosci., 15, 291-299, 1992. Dengan izin.)

GAMBAR 7.17 Dihitung latency (delay) antara aktivasi dari reseptor asetilkolin

muscarinic dan penutupan M-saluran kalium diplot terhadap kepadatan membran G-

protein (dalam satuan logaritmik) untuk berbagai kepadatan saluran kalium.

Diasumsikan (untuk kesederhanaan) bahwa diaktifkan GTP-bound α subunit

berinteraksi langsung dengan saluran kalium. Perhitungan didasarkan pada domba

dan Pugh (1992), dengan berikut koefisien difusi: reseptor, 0,7 m / detik; Gαβγ, 1,2 m

/ detik; Gα, 1,5 m / detik; channel, 0,4 m / detik.

Inset: latency diamati penghambatan saat ini pada 35 ° C dalam sel

neuroblastoma hibrida mengekspresikan muscarinic M1 reseptor asetilkolin setelah

aplikasi tekanan 100-msec ion barium (Ba, yang secara langsung colokan saluran)

dan asetilkolin (Ach). Perbedaan rata-rata latency (Ach - Ba) adalah ~ 272 msec. pada

diperkirakan channel dan G-protein kepadatan 1 dan 25/κm2, langsung-klik interaksi

G-protein-channel akan memprediksi latency ~ 180 msec. (Diadaptasi dari Robbins,

J. dkk, J. Physiol, 469, 153-178, 1993;.. Tambahan bahan yang tidak dipublikasikan

dari J. Robbins.)

GAMBAR 7.18 Contoh interaksi G-protein-efektor terpencil. Catatan

menunjukkan saluran kalium M-jenis Kegiatan direkam dari neuron tikus simpatik

pipet patch yang sel-terpasang diadakan di ~ 0 mV. kegiatan ini adalah ditekan ketika

muscarinic reseptor asetilkolin agonis, muscarine (10 M), diterapkan ke sel membran

luar elektroda menempel. (Solusi mandi berisi 25 mM [K +] untuk mengatur

membran potensial pada EK (~ -30 mV) dan mencegah depolarisasi oleh muscarine.)

Fakta bahwa muscarine tidak dapat menyebar melalui segel ketat antara kaca pipet

dan membran (difusi dan dari G-protein diaktifkan melalui membran ke saluran di

dalam patch elektroda akan sangat lambat) menunjukkan bahwa beberapa diffusible

substansi diproduksi untuk membawa pesan dari reseptor teraktivasi dan G-protein

luar patch ke saluran di patch. Catatan dan bar chart dalam (b) diperoleh dengan

menggunakan pipet patch yang sudah diisi dengan larutan muscarine. Terlepas dari

ini, saluran yang aktif dan masih bisa ditutup dengan menambahkan muscarine ke

membran ekstra-patch. Hal ini menunjukkan bahwa saluran tidak bisa ditutup oleh

interaksi lokal (langsung) dari diaktifkan G-protein dengan saluran (juga, bahwa tidak

cukup reseptor hadir di ditambal membran untuk menghasilkan jumlah yang cukup

utusan untuk menutup saluran). (Diadaptasi dari Selyanko et al., Proc. Roy. Soc.

London Ser. B, 250, 119-125, 1992.)

7.12 BACAAN

Beech et al., Neuron, 8, 97-106, 1992.

Bernheim et al., Neuron, 6, 859-867, 1991.

Birnbaumer, L., Transduksi sinyal reseptor dalam modulasi aktivitas efektor oleh G-

protein: pertama

20 tahun atau lebih, FASEB J., 4, 3068-3078, 1990.

Bourne, HR, Bagaimana reseptor berbicara dengan trimerik G-protein, Curr. Opin.

Cell. Biol., 9, 134-142, 1997.

Clapham, DE, The G-protein nano, Nature, 379, 297-300, 1996.

Clapham, DE dan Neer, E., G-protein βγ subunit, Annu. Rev Pharmacol. Toxicol., 37,

167-203, 1997.

Gudermann, T., Kalkbrenner, F., dan Schultz, G., Keanekaragaman dan selektivitas

interaksi reseptor-G-protein,

Annu. Rev Pharmacol. Toxicol., 36, 429-459, 1996.

Hille, B., Modulasi ion fungsi saluran oleh reseptor G-protein-coupled, Tren

Neurosci., 17, 531-536,

1994.

Ikeda, SR dan Dunlap, K., modulasi Tegangan tergantung dari saluran kalsium tipe

N: peran G-protein

subunit, Adv. Kedua Messenger phosphoprotein Res., 33, 131-151, 1999.

Lamb, TD dan Pugh, Jr, EN, cascades G-protein: keuntungan dan kinetika, Tren

Neurosci, 15, 291-299, 1992..

Rodbell, M., Peran reseptor hormon dan protein GTP-peraturan dalam transduksi

membran, Alam,

284, 17-22, 1974.

Vries, LD, Zheng, B., Fischer, T., Elenko, E., dan Farquhar, M., The pengatur G-

protein signaling keluarga,

Annu. Rev Pharmacol. Toxicol., 40, 235-271, 2000.

Wickman, KD dan Clapham, DE, regulasi G-protein saluran ion, Curr. Opin.

Neurobiol., 5, 278-285,

1995.

CHAPTER 8

TRANSDUKSI SINYAL MELALUI PROTEIN KINASE TIROSIN

8.1 PENDAHULUAN

8.1.1 Posforilasi debagai pengganti fungsi sel

Fosforilasi protein ditemukan pada era "regulasi alosterik." Peraturan

aktivitas enzim dapat dijelaskan oleh konsentrasi substrat, kehadiran kofaktor,

dan konsentrasi produk akhir (efektor alosterik). Salah satu jalur sehingga dianalisis

adalah jalur glikolisis. Langkah pertama dalam jalur ini adalah konversi glikogen

menjadi glukosa- 1-fosfat yang dimediasi oleh enzim yang disebut glikogen

fosforilase . Aktivitas enzim adalah ditemukan diatur melalui interaksi alosterik oleh

adenosin 5 ' -Monophosphate (stimulasi) dan glukosa-6-fosfat (penghambatan).

Glikogen fosforilase dapat diisolasi dalam dua bentuk: sebuah bentuk aktif (ditunjuk

dengan sebuah) Dan bentuk yang kurang aktif (ditunjuk dengan b). Pada tahun 1956,

Krebs dan Fischer menemukan bahwa fosforilasa b bisa menggabungkan satu

molekul fosfat organik di residu serin, sebuah proses yang menyertai peningkatan

aktivitasnya. Melalui penggabungan fosfat, fosforilase b memperoleh karakteristik

fosforilasa sebuah , menjadi kurang sensitif terhadap tindakan hambat glukosa-6-

fosfat dan lebih sensitif terhadap tindakan stimulasi adenosin 5 ' -Monophospate.

Dengan demikian, terlepas dari regulasi alosterik, modifikasi kovalen seperti

fosforilasi juga dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Fosforilasi dikatalisis oleh

protein kinase, kinase fosforilasa. Kemudian ditemukan bahwa katalis fosfatase

fosforilasa defosforilasi, yang membawa enzim fosforilase kembali ke dalam b

negara. Pada tahun 1970, itu jelas bahwa hampir semua enzim diatur oleh fosforilasi /

defosforilasi, dan peneliti mulai mempertanyakan mengapa hal itu perlu untuk

memiliki dua sistem yang luas untuk mengendalikan enzim Kegiatan: regulasi

alosterik dan fosforilasi. Selain itu, dalam kasus fosforilasa dan enzim lain, glikogen

sintase, itu jelas bahwa regulasi alosterik dan kovalen mungkin bekerja melalui

perubahan konformasi serupa. Perbedaan mendasar antara kedua mode tindakan

menjadi jelas ketika ditemukan bahwa reseptor hormon, melalui pelepasan

intraseluler second messenger, pada gilirannya mengontrol aktivitas kinase

fosforilase. Sementara alosterik kontrol umumnya mencerminkan kondisi intraseluler,

fosforilasi terjadi sebagai respons terhadap ekstraseluler sinyal. Fosforilasi

memungkinkan organisme untuk mengontrol metabolisme dalam sel-sel individual.

Reaksi phosphorylation dan defosforilasi, seperti yang akan terlihat dalam paragraf

berikut, selalu bagian dari kaskade reaksi. Sistem kaskade memungkinkan untuk

amplifikasi besar serta modulasi baik dari sinyal asli. Sementara bidang serin /

treonin protein kinase meledak, tipe baru protein kinase memasuki arena pada tahun

1978 dengan penemuan bahwa sarkoma Rous virus yang terkandung protein kinase,

bernama v-src, bahwa protein terfosforilasi pada residu tirosin. Itu kemudian

menemukan bahwa reseptor faktor pertumbuhan mengandung protein tirosin kinase,

dan baru bidang penelitian berkembang pesat.

8.1.2 Faktor Tumbuh, Interleukin, Interferon Dan Sitokinin

Yang dapat mendukung pertumbuhan sel dalam kultur diisolasi dan dinamai (1)

sel-sel mereka terisolasi dari, (2) sel-sel mereka dirangsang, atau (3) tindakan prinsip

mereka tampil. Sebagai contoh, Faktor platelet-derived growth (PDGF), faktor

pertumbuhan epidermal (EGF), atau transforming growth factor (TGF). Di bidang

imunologi, faktor dipelajari bahwa pematangan diarahkan dan proliferasi sel darah

putih. Faktor ditemukan diberi nama interleukin atau colony-stimulating faktor.

Dalam virologi, faktor diteliti yang mengganggu dengan infeksi virus: interferon.

Dan, di penelitian kanker, faktor yang diteliti yang dapat mempengaruhi pertumbuhan

tumor padat - misalnya, tumor necrosis factor (TNF). Setiap bidang penelitian

percaya bahwa faktor difungsikan oleh dan besar hanya dalam kategori di mana

mereka terungkap. Ia juga percaya bahwa setiap faktor memiliki set tindakan

tambahan yang berhubungan satu sama lain dalam beberapa cara yang jelas. Dengan

kemajuan, menjadi jelas bahwa faktor pertumbuhan juga bertindak pada sel-sel dari

sistem kekebalan tubuh dan telah benar-benar tindakan yang tidak terkait. Selain itu,

hal itu menunjukkan bahwa konteks di mana sel-sel dipelajari (misalnya, adanya

faktor-faktor lain, kehadiran sel-sel lainnya, terpasang atau dalam suspensi, jenis

substrat) juga menentukan hasil dari respon seluler. Sebuah contoh yang baik adalah

TGF- β , Faktor awalnya menunjukkan untuk meningkatkan transformasi sel, maka

namanya. Kemudian ditemukan bahwa faktor ini adalah yang kuat penghambat

pertumbuhan jalur sel epitel berubah dan bahwa itu adalah faktor chemotactic sangat

ampuh untuk neutrofil. Telah diusulkan bahwa nama umum untuk faktor-faktor ini

harus sitokin , didefinisikan sebagai berikut:

Sitokin adalah suatu larut (glyco) protein, nonimmunoglobulin di alam, dirilis

oleh sel-sel hidup dari tuan rumah, yang bertindak nonenzymatically di picomolar

untuk konsentrasi nanomolar untuk mengatur fungsi sel inang.

Informasi ini tidak secara langsung relevan untuk memahami aksi protein

tirosin kinase, tetapi ini menggambarkan bahwa berbagai bidang penelitian yang

datang bersama-sama dan memperkenalkan wawasan baru ke dalam fungsi sel. Hal

ini juga menggambarkan bahwa fosforilasi tirosin tidak terbatas pada growthinducing

sitokin. Fosforilasi tirosin telah terbukti untuk mengatur sel-sel dan sel-matriks

interaksi melalui reseptor integrin dan tempat adhesi focal. Hal ini juga terlibat dalam

stimulasi dari ledakan pernafasan pada neutrofil. Pekerjaan dari sel-B imunoglobulin

M (IgM) dan afinitas tinggi IgE reseptor serta pendudukan T-sel dan interleukin-2

(IL-2) reseptor hasil dalam fosforilasi tirosin. Akhirnya, fosforilasi tirosin juga

terlibat dalam pemilihan tanggapan pemancar disebabkan oleh kontak neuronal.

Hanya sebagian kecil dari apa yang diketahui tentang peran protein tirosin

kinase dalam fungsi selular akan dibahas dalam bab ini, tetapi tetap harus

mengungkapkan beberapa prinsip yang memungkinkan pembaca untuk lebih

memahami sastra saat ini pada subjek. Bab ini dibagi menjadi dua luas bagian: satu

berhubungan dengan reseptor yang mengandung protein tirosin kinase sebagai bagian

integral dari molekul (protein reseptor tirosin kinase, atau PTKS)dan satu berurusan

dengan reseptor yang mengasosiasikan dengan sitosol protein tirosin kinase

(nonreceptor PTKS). Karena studi dengan genetik organisme diakses seperti

Drosophila dan Caenorhabditis elegans telah membuat kontribusi penting pada

penemuan jalur sinyal-transduksi, kami akan menggambarkan beberapa analogi

antara berbagai spesies dalam lampiran untuk bab ini. Pengetahuan ini juga akan

memfasilitasi pemahaman Anda tentang nomenklatur sinyal transduksi.

8.2 Reseptor Yang Mengandung Tirosein Kinase

8.2.1 Hubungan Reseptor Penyebab Aktivasi

Bagian ini berfokus pada sinyal-transduction jalan diprakarsai oleh mengikat

dari faktor pertumbuhan reseptor untuk mereka. Kita akan membatasi tunduk kepada

beberapa prinsip yang umumnya berlaku untuk -kinase tirosin reseptor yang

mengandung, dengan EGF, faktor penumbuh turunan platelet, dan syaraf faktor

pertumbuhan (NGF) reseptor sebagai contoh. EGF dan faktor penumbuh turunan

platelet benar faktor pertumbuhan, proliferasi dari sel epitel dan fibroblasts,

sedangkan peran utama dari NGF adalah untuk memastikan kelangsungan hidup

neuron dan/atau neurite adalah hasil daripada, tidak proliferasi.

Reseptor tirosin kinase-yang mengandung datang dalam berbagai bentuk,

disatukan oleh kehadiran dari domain membran-mencakup tunggal dan protein tirosin

kinase domain katalitik intraseluler (reseptor PTK). Rantai ekstraseluler bervariasi,

seperti digambarkan pada Gambar 8.1. banyak pertumbuhan reseptor faktor

mengandung domain imunoglobulin, yang berperan dalam pengikatan ligan, karena

itu, mereka adalah bagian dari superfamili imunoglobulin. Sebuah fitur umum adalah

bahwa hasil yang mengikat ligan dalam dimerisasi reseptor. Cross-linking reseptor

oleh faktor pertumbuhan dapat dicapai dalam beberapa cara. PDGF dan NGF adalah

disulfida-linked ligan dimer yang cross-link mereka.

GAMBAR 8.1 Klasifikasi protein tirosin kinase (PTK) yang mengandung reseptor.

Semua reseptor ini memiliki satu-membran-mencakup segmen dan semua dari

mereka memasukkan domain katalitik kinase, di beberapa kasus terganggu oleh

insert. Domain ekstraseluler bervariasi seperti ditunjukkan, tapi banyak mengandung

imunoglobulin motif yang bertindak sebagai situs pengikatan ligan. Beberapa

reseptor ini ada di berbagai isoform. FLT1, Fmsrelated tirosin kinase (reseptor untuk

faktor pertumbuhan endotel vaskular [VEGF]); PDGFR, platelet-derived reseptor

faktor pertumbuhan, EGFR, reseptor faktor pertumbuhan epidermal, INSR, reseptor

insulin, NGFR, pertumbuhan saraf reseptor faktor (juga dikenal sebagai TrkA),

FGFR, reseptor faktor pertumbuhan fibroblast. (Diadaptasi dari Heldin, hal.4.)

GAMBAR 8.2 Aktivasi dan reseptor sinyal pembentukan kompleks. Pada

pendudukan oleh ligan, protein tirosin kinase (PTK) yang mengandung reseptor

membentuk dimer, yang menginduksi perubahan konformasi dari domain sitoplasmik

yang mengungkapkan aktivitas PTK latennya. Ini phosphorylates residu tirosin pada

linked reseptor molekul (interphosphorylation). The terdimerisasi, molekul

terfosforilasi merupakan katalis reseptor aktif. Activated EGF, PDGF, atau reseptor

NGF (EGF-R, PDGF-R, atau NGF-R, masing-masing) asosiasi dengan efektor,

termasuk enzim (misalnya, PLC γ , GAP) atau adaptor protein yang merekrut enzim

(misalnya, Gab-1, P85 PI 3 -kinase, Grb2), untuk membentuk kompleks sinyal

reseptor.

Ketika mereka mengikat reseptor mereka, silang secara otomatis. EGF, yang

ligan monomer, mengubah konformasi reseptor dalam domain ekstraselular, yang

memungkinkan monomer diduduki saling mengenali. Sinyal aktivasi, tentu saja, lebih

rumit dari ini. Untuk aktivasi semua fungsi reseptor, tidak hanya harus molekul

reseptor akan dibawa bersama sebagai dimer, tetapi mereka juga harus berorientasi

dengan benar dalam hubungannya dengan satu sama lain.

Dimerisasi memungkinkan aktivitas kinase dari kedua rantai intraseluler

menghadapi urutan target di sisi lain, molekul reseptor terkait. Hal ini memungkinkan

antarmolekul cross-fosforilasi beberapa residu tirosin (Gambar 8.2). The terfosforilasi

dimer kemudian merupakan reseptor aktif. Ia memiliki sebuah array dari

phosphotyrosines yang memungkinkannya untuk mengikat protein untuk membentuk

reseptor sinyal kompleks . Selain itu, reseptor terdimerisasi dan terfosforilasi

memiliki potensi phosphorylating target.

8.2.2 Src dan Ptb Homologi Domain dan Susunan dari Kompleks Reseptor

Signaling

Setelah pembentukan kompleks sinyal reseptor didirikan, itu penting untuk

membangun bagaimana protein berinteraksi dengan reseptor tirosin terfosforilasi.

Analisis urutan protein yang mengikat telah menunjukkan bahwa banyak, tapi tidak

semua dari mereka, mengandung domain juga hadir dalam sitoplasma protein tirosin

kinase Src, maka nama SH2 domain . Lain mengandung domain yang sebelumnya

diidentifikasi sebagai domain phosphotyrosine-binding (PTB). Bukti untuk peran

SH2 domain dalam transmisi sinyal karena PTKS reseptor berasal dari temuan bahwa

penghapusan SH2 domain dihapuskan interaksi dengan reseptor dan respon seluler.

bukti lebih lanjut berasal dari temuan bahwa hanya γ isoform dari fosfolipase C

(PLC) langsung diaktifkan oleh reseptor ini. Secara signifikan, PLC γ , Tapi tidak β

dan δ isoform, memiliki SH2 domain. Di Kesimpulannya, perakitan sinyal kompleks

tergantung pada perekrutan dengan tirosin-terfosforilasi reseptor protein memiliki

SH2 atau PTB domain. Banyak protein mengandung SH2 domain mengasosiasikan

dengan PTKS reseptor dalam pembentukan sinyal kompleks, dan pilihan ini adalah

diilustrasikan pada Gambar 8.3.

GAMBAR 8.3. Organisasi domain protein yang mengasosiasikan dengan tirosin

kinase terfosforilasi (PTK) - mengandung reseptor. Protein yang mengasosiasikan

dengan reseptor tirosin-terfosforilasi mengandung SH2 atau PTB domain, yang

mengakui membentang amino-asam tertentu di sekitar residu tirosin terfosforilasi.

Berbeda dengan enzim, adapter kurangnya aktivitas katalitik intrinsik tetapi

berfungsi untuk menghubungkan reseptor terfosforilasi dengan protein efektor

lainnya. Beberapa protein yang disajikan dalam gambar ini dibahas dalam bab ini.

asosiasi ini, meskipun tidak jelas apakah atau tidak proses ini selalu diperlukan

untuk mereka aktivasi. Dalam kasus PLC, Fosforilasi tentu diperlukan.

Dari berbagai adapter dan enzim yang berinteraksi dengan EGF, PDGF, atau reseptor

NGF, beberapa muncul untuk mengikat lebih erat daripada yang lain, menunjukkan

kepekaan terhadap residu asam amino dalam disekitar phosphotyrosines (Gambar

8.3). Dengan demikian, reseptor tertentu dapat menularkan sinyal melalui panel SH2-

atau PTB yang mengandung protein. Masih belum jelas, namun, jika dua atau lebih

protein intraseluler dapat mengikat molekul reseptor secara bersamaan.

8.2.3 B Peternakan DARI THE SIGNALING PATHWAY

Sejumlah jalur sinyal transduksi-cabang keluar dari reseptor sinyal kompleks.

Lima cabang seperti dijelaskan dalam teks berikut (lihat Gambar 8.4).

8.2.3.1 The Ras Signaling Pathway

8.2.3.1.1 Ras dan Transformasi your

Infeksi tikus dengan virus murine leukemia dapat memprovokasi pembentukan

sarkoma. Sebuah utama muka adalah penemuan bahwa murine virus sarkoma Harvey

mengkode menerus diaktifkan bentuk H-ras gen, sebuah guanosin trifosfat monomer

(GTP)-binding protein, atau GTPase, di mana valin menggantikan glisin pada posisi

12. Protein GTP-binding bertindak sebagai monostable switch. Mereka adalah "on" di

negara GTP-bound dan "off" di difosfat guanosin (PDB) - keadaan terikat.

Pengikatan GTP terjadi melalui disosiasi GDP (pertukaran reaksi), dan GTP yang

kemudian hilang melalui hidrolisis (reaksi GTPase). Keadaan aktivasi kinetis

GAMBAR 8.4 Percabangan jalur sinyal-transduksi. Setelah aktivasi reseptor PTK,

beberapa jalur sinyal-transduksi dapat diaktifkan, lima di antaranya ditunjukkan di

sini (lihat teks untuk rincian lebih lanjut).

diatur, positif oleh tingkat awal PDB disosiasi dan asosiasi selanjutnya GTP dan

maka negatif oleh tingkat di mana GTP dihidrolisis (Gambar 8.5). Valin-to-glisin

substitusi mencegah hidrolisis GTP, sehingga Ras aktif konstitutif (juga disebut

sebagai mutasi gain-of-fungsi). Ekspresi mutan ini pada fibroblast tikus diam

mengakibatkan diubah morfologi sel, stimulasi sintesis DNA, dan proliferasi sel. Bila

diekspresikan, biasa Hc-Ras juga menginduksi transformasi onkogenik seperti halnya

injeksi dari protein mutan. Sebaliknya, suntikan menetralisir antibodi untuk

menghambat fungsi Ras yang normal membalikkan transformasi sel. Akhirnya,

stimulasi sel diam dengan serum atau dengan faktor pertumbuhan dimurnikan

menyebabkan aktivasi Ras, melalui promosi pertukaran GDP untuk GTP. Ini menjadi

jelas bahwa Ras merupakan komponen penting dalam mengatur jalur sinyal

proliferasi sel, tapi bagaimana Ras akan masuk ke jalur yang dikenal berasal dari

reseptor faktor pertumbuhan masih belum jelas untuk waktu yang cukup.

8.2.3.1.2 Peraturan Ras di Vertebrata

The diaktifkan reseptor faktor pertumbuhan mengikat Grb2, sebuah protein

adaptor, melalui domain SH2 nya, dan tindakan ini merekrut hSos penukar nukleotida

guanin ke membran plasma, sehingga dalam sekitar Ras. Para hSos diaktifkan

sekarang pertukaran GDP untuk GTP dan membawa ke Ras diaktifkan nya negara,

siap untuk sinyal ke dalam sel melalui interaksi dengan molekul efektor nya.

Ras-GTPase mengaktifkan protein P120 GAP berisi dua SH2 domain (Gambar

8.3). Hal ini juga mengikat phosphotyrosines pada reseptor aktif, dan merupakan

komponen dari kompleks sinyal yang merakit pada reseptor PDGF aktif (Gambar

8.2). Tidak jelas apa peran asosiasi dari GAP bermain dalam transduksi sinyal.

Misalnya, sel-sel yang mengekspresikan mutan dari reseptor PDGF yang gagal untuk

mengikat GAP mewujudkan aktivasi normal Ras.

8.2.3.1.3 Dari Ras ke MAP Kinase dan Aktivasi Transkripsi

Peristiwa setelah aktivasi Ras akhirnya menyebabkan aktivasi MAP kinase,

diikuti *oleh aktivasi ekspresi gen respon langsung-awal. Aktivasi MAP kinase

membutuhkan dua langkah menengah, yang keduanya melibatkan fosforilasi

(Gambar 8.5). Yang segera penggerak MAP kinase MAP-kinase-kinase (juga disebut

MAP kinase-kinase ERK, atau MEK), enzim yang paling tidak biasa yang

phosphorylates MAP kinase pada kedua treonin (T) dan tirosin (Y) residu. Ini adalah

dalam target-urutan tujuh residu (LTEYVATRWYRAPE) (Tabel 8.1)

Gambar 8.5 Peraturan ras-MAP kinase oleh reseptor protein kinase tirosin. Adaptor

Grb2 protein, berkaitan dengan pertukaran guanin faktor Sos, menempel pada tirosin-

terfosforilasi reseptor melalui domain SH2 nya. Hal ini membawa kompleks

Grb2/hSos ke sekitar membran, di mana mengkatalisis pertukaran nukleotida guanin

di Ras. The diaktifkan asosiasi Ras dengan serin / treonin protein kinase Raf-1. Its

penempatan di hasil membran aktivasi dan fosforilasi berikutnya dari dual-

kekhususan kinase MEK. Hal ini menyebabkan fosforilasi ganda MAP kinase (tirosin

dan treonin residu) dan memperlihatkan peptida sinyal yang memungkinkan MAP

kinase untuk berinteraksi dengan protein yang membimbing ke dalam nukleus

(translokasi). Di dalam inti, MAP kinase phosphorylates p62 TCF, Yang kemudian

asosiasi dengan p67 SRF untuk membentuk sebuah kompleks transkripsi faktor aktif

yang mengikat DNA pada elemen serum-respon (SRE).

Di sisi N-terminal motif APE dilestarikan, hadir di tengah katalitik kinase.

Fosforilasi di situs tersebut membuat protein kinase katalis kompeten. Sampai saat

ini, MAP kinase tampaknya menjadi substrat unik untuk fosforilasi oleh MEK,

menunjukkan terutama tingkat tinggi spesifisitas.

Bergerak lebih hulu, hilir kinase pertama Ras adalah Raf-1 (juga dikenal

sebagai MAPkinase- kinase-kinase, atau MAPKKK) kinase ini awalnya diidentifikasi

sebagai produk onkogen menyebabkan fibrosarcoma pada tikus. Temuan berikutnya

yang diaktifkan Ras merekrut Raf-1 ke membran dan akibatnya membawa kinase

aktivasi link MAP kinase dengan jalur Ras. Dalam aktivasi Raf-1, adalah rekrutmen

ke membran plasma, tidak ada hubungan yang sebenarnya dengan diaktifkan Ras,

yang diperlukan. Tentu saja, hubungan dengan Ras sangat penting dalam kondisi

normal kondisi, namun bentuk mutan dari Raf-1 memiliki kotak C-terminal-Caax

yang bertindak sebagai situs untuk prenylation (dan karena itu yang berhubungan

secara permanen dengan membran plasma) instigates peristiwa hilir independen dari

Ras. Dengan demikian, peran Ras dalam fisiologis Situasi dapat dianggap sebagai

yang dari membran-terletak merekrut sersan.

8.2.3.1.4 Selain MAP Kinase: Aktivasi Ekspresi Gen

The diaktifkan MAP kinase memperlihatkan peptida sinyal yang

memungkinkan untuk berinteraksi dengan protein yang mempromosikan translokasi

ke dalam nukleus. Di dalam, itu mengkatalisis fosforilasi substrat pada motif Ser-Pro

dan Thr-Pro. Dalam kasus stimulasi oleh EGF dan PDGF, aktivasi

MAP kinase merupakan syarat mutlak untuk proliferasi sel. Dalam kasus NGF,

stimulasi berperan dalam perkembangan neurite dan kelangsungan hidup. Gen-gen

respon awal menjadi aktif dalam satu jam stimulasi reseptor. Aktivasi mereka bersifat

sementara dan dapat terjadi dalam kondisi di yang sintesis protein terhambat.

Aktivasi EGF, PDGF, atau hasil reseptor NGF dalam induksi cepat dari faktor

transkripsi c-Fos, salah satu yang pertama sitokin-diinduksi transkripsi faktor yang

harus ditemukan. * Ini menempati posisi sentral dalam regulasi ekspresi gen. Lain

gen respon awal meliputi c-myc, JunB, Dan c-Juni. Promotor daerah dari c-fos gen

mengandung elemen serum-respon (SRE), domain DNA yang mengikat faktor

transkripsi p67 SRF (Serumresponse Faktor) dan p62 TCF (Faktor terner-kompleks).

** Fosforilasi p62 TCF pada residu ser- 383 dan ser-389 oleh MAP kinase

meningkatkan pembentukan kompleks dari kedua faktor transkripsi dengan DNA

untuk mempromosikan transkripsi c-fos gen (Gambar 8.5). Aktivasi kinase MAP

jalur meningkatkan transkripsi gen respon awal, seperti c-fos, yang pada gilirannya

harus terlibat dalam ekspresi dari sejumlah besar gen mengingat adanya 12 O-

tetradecanoylphorbol- 13-asetat (TPA) elemen (TRE) di wilayah promotor dari

banyak gen responsif.

8.2.3.1.5 lainnya Aktivator Ras dan efektor

Faktor pertukaran nukleotida guanin selain hSos juga telah ditemukan untuk

mengaktifkan Ras, seperti yang telah efektor lainnya (lihat Tabel 8.2). Ini mungkin

berinteraksi dengan urutan yang unik dalam lingkaran efektor. Itu Pertanyaannya

tetap, namun, untuk berapa banyak efektor yang berbeda dapat melampirkan

diaktifkan Ras dan apa yang menentukan tingkat prioritas mereka.

8.2.3.1.6 Sebuah Keluarga Kinase MAP

Setelah itu kloning, tampak jelas bahwa MAP kinase adalah anggota dari

keluarga besar protein yang dapat diklasifikasikan ke dalam tiga kelompok fungsional

utama. Yang pertama menengahi mitogenik dan sinyal diferensiasi, dan dua lainnya

berhubungan dengan respon seluler terhadap stres dan sitokin inflamasi. Anggota

GTPases homolog ke Ras (rho keluarga GTPases), di khususnya Cdc42 dan Rac,

memainkan peran dalam inisiasi kaskade ini. MAP kinase keluarga anggota

beroperasi di tiga jalur (Gambar 8.6):

1. ERK jalur. ERK1 dan ERK2 adalah kinase MAP prototypic dijelaskan dalam

sebelumnya teks. The ERK (kinase ekstraseluler-sinyal-diatur) keluarga memiliki

tujuh anggota, namun, sebagian besar lebih tinggi isoform nomor tidak berfungsi

di mitogenik jalur.

2. SAPK / JNK jalur. Dalam kelas, Juni SAPK (stres-activated protein kinase) Kinase

N-terminal (JNKs) membentuk subfamili (SAPK/JNK1-3).

3. p38/HOG jalur. Tinggi osmolaritas gliserol (HOG) diinduksi oleh stres osmotik

dalam ragi (Saccharomyces cerevisiae), mengakibatkan aktivasi ini 38 kDa protein

kinase. P38 MAP kinase membentuk subfamili lain dari empat anggota.

Masing-masing jalur tersebut melibatkan kaskade kinase sehingga fosforilasi

dan aktivasi dari MAP anggota keluarga kinase. Masing-masing berisi situs ganda

fosforilasi (TEY, TPY, atau TGY) dan residu sentral dalam karakteristik motif kelas,

seperti yang ditunjukkan pada Tabel 8.1. Hal ini terbukti bahwa sel-sel diberkahi

dengan jalur sinyal transduksi-paralel dan bahwa mereka dapat beroperasi individual

atau dalam kombinasi untuk memulai pola tertentu ekspresi gen. Selain itu, crosstalk

antara jalur pasti terjadi. Tak satu pun dari jalur tersebut memiliki fungsi yang unik,

melainkan lebih mungkin bahwa kombinasi jalur yang diaktifkan (atau dibungkam)

bersama-sama dengan

GAMBAR 8.6 jalur Sejalan dengan transkripsi dan keluarga MAP kinase. Kinase

MAP dapat diklasifikasikan menjadi tiga

kelompok, berdasarkan pada identitas residu menengah dalam motif ganda

fosforilasi mereka (TEY, TGY, atau TPY). Klasifikasi ini juga mendefinisikan tiga

jalur sinyal transduksi yang berbeda-diindikasikan sebagai ERK, para JNK / SAPK,

dan jalur p38/HOG, masing-masing memiliki protein kinase unik bertindak hulu

GAMBAR 8.7 Klasifikasi phosphatidylinositol-3 kinase (PI-3 kinase). (Kiri) Enzim

diklasifikasikan menjadi tiga kelompok berdasarkan struktur molekul subunit yang

berisi domain kinase. Kelas I adalah dibagi ke dalam kelompok A dan B. Grup A

terdiri α, β, dan γ, yang berinteraksi dengan subunit regulasi, P85 atau P55. Grup B

memiliki satu anggota, p110γ, diatur oleh G-protein βγ subunit. Hal ini juga

ditemukan terkait dengan protein P101 yang belum diketahui identitasnya. (Kanan)

PI-3 kinase phosphorylate posisi 3OH di cincin inositol dari lipid

phosphatidylinositol. PH domain PKB berinteraksi istimewa dengan PI- ,4,5-P

produk. PTEN adalah fosfatase 3-fosfat inositol dan melawan fosforilasi oleh PI3-

kinase. (Diadaptasi dari Vanhaesebroeck et al., TIBS, 22, 267-272, 1997.)

konteks seluler memutuskan hasil dari respon, termasuk proliferasi, diferensiasi,

invasi jaringan, atau sel mati.

8.2.3.2 PKB Signaling Pathway

Tirosin terfosforilasi faktor pertumbuhan reseptor merekrut p85PI3-kinase,

molekul adaptor yang asosiasi dengan p110PI3-kinase, dan bersama-sama mereka

membentuk lipid kinase disebut phosphatidylinositol-3 kinase (PI3-kinase). Protein

kinase memainkan peran penting dalam sejumlah proses seluler: regulasi

glycogenesis (sebagai respon terhadap insulin), regulasi ukuran sel, migrasi,

kelangsungan hidup, dan proliferasi. Dalam bab ini, kita akan fokus pada perannya

dalam proliferasi seluler (EGF, PDGF) melalui regulasi sintesis protein dan perannya

dalam apoptosis (NGF) melalui inaktivasi BAD dan

caspase-9 dan penghambatan translokasi nuklir faktor transkripsi FKHRL-1.

8.2.3.2.1 PI-3 kinase

PI-3 kinase terdiri keluarga enzim dibagi dalam tiga kelas. Mereka memiliki

berbeda substrat dan berbagai bentuk regulasi. Mereka semua memiliki empat

homolog daerah, kinase domain yang paling kekal (Gambar 8.7). Uniknya, I enzim

kelas mengaktifkan protein kinase B dan karena itu akan dibahas dalam bab ini. Kelas

ini fosfolipid kinase memfosforilasi PI, PI-4-P, dan PI-4,5-P2 (substrat disukai) pada

3 posisi cincin inositol (Gambar 8.7). Enzim ini memiliki dua subunit: regulasi (P55

atau P85) dan catalytic (P110), masing-masing ada di berbagai bentuk. Struktur

multidomain dari subunit regulasi, khususnya P85, menunjukkan bahwa mereka

harus dapat berinteraksi dengan sejumlah sinyal protein. The SH2 domain

memungkinkan mereka untuk mengikat residu phosphotyrosine, dan SH3 domain

memungkinkan interaksi dengan urutan kaya prolin hadir, misalnya, dalam molekul

adaptor SHC, yang Cdc42GAP protein GTPase-mengaktifkan, atau pengatur T-

limfosit reseptor (TCR) sinyal, CBL. Selain itu, P85 subunit mengandung breakpoint

klaster daerah (BCR) homologi domain yang berinteraksi dengan anggota keluarga

Rho dari GTPases, Rac, dan Cdc42, menyediakan namun peluang lebih lanjut untuk

regulasi. Katalitik P110 Subunit memiliki empat isoform, yang semuanya

mengandung domain kinase dan Ras situs interaksi. Selain itu, α, β, dan γ isoform

memiliki situs interaksi untuk P85 subunit. I enzim kelas dapat lebih dibagi dua, IA

enzim kelas berinteraksi melalui SH2 domain mereka dengan phosphotyrosines hadir

di kedua tirosin kinase protein atau docking protein seperti insulin-reseptor substrat

(IRSs, GAB-1) atau linker untuk aktivasi sel T (lats, dalam kasus Sel T).

8.2.3.2.2 Phosphatidyl Inositol Fosfatase

Fosforilasi inositol dapat dinetralkan oleh dua fosfatase lipid: SH2-mengandung

inositol fosfatase (KAPAL) dan fosfatase dan tensin homolog dihapus dari kromosom

10 (PTEN). Dephosphorylates KAPAL pada 5 posisi inositol dan ditemukan sebagai

protein yang asosiasi dengan protein SHC adaptor dalam sel hemopoietic. KAPAL

memainkan peran utama dalam modulasi signaling reseptor permukaan sel-

hemopoietic. Ketiadaan, melalui gangguan ditargetkan pada tikus, dikaitkan dengan

peningkatan jumlah granulosit-makrofag nenek moyang dan dengan berlebihan

infiltrasi jaringan oleh sel-sel. PTEN ditemukan sebagai suppresser tumor karena

menonaktifkan mutasi terdeteksi di glioblastomas, melanoma, dan kanker payudara,

prostat, dan karsinoma endometrium. Urutannya mengungkapkan karakteristik

protein fosfatase dual-kekhususan namun substrat favorit adalah Phosphoinositide.

Ini dephosphorylates pada 3 posisi cincin inositol, menangkal fosforilasi oleh kinase

PI3-(Gambar 8.7). Ekspresi ektopik PTEN-kekurangan Hasil sel tumor dalam

penangkapan siklus sel di fase G1 akhirnya diikuti oleh apoptosis. Itu juga

mengurangi migrasi sel, temuan yang mungkin menjelaskan mengapa hilangnya

produk gen sering terkait dengan tumor metastatik stadium akhir.

8.2.3.2.3 Aktivasi PI-3 Kinase

The EGF dan PDGF reseptor langsung mengikat subunit P85-adaptor PI3-

kinase melalui interaksi residu tirosin terfosforilasi mereka dengan SH2 domain

adaptor. Ini perekrutan kemungkinan besar ditegakkan oleh mengikat simultan

diaktifkan Ras ke P110-katalitik domain kinase lipid. Dalam kasus NGF, situasinya

berbeda. Aktivasi NGF reseptor (TrkA) menyebabkan fosforilasi dari "docking

protein" di sejumlah residu tirosin. Docking ini protein, bernama Grb2 terkait

pengikat 1 (Gab-1) menyerupai salah satu substrat utama dari reseptor insulin, IRS-1,

protein dengan fungsi yang sama. The SH2 domain P85- protein adaptor sekarang

mengikat Gab-1. Pengikatan PI3-kinase pada reseptor diaktifkan atau docking protein

merekrut ke membran dan membawanya ke dalam kontak dengan fosfolipid

(substrat), yang merupakan aktivasi. Yang penting, generasi berikutnya dari PI-3 hasil

,4,5-P3 di aktivasi serin / treonin protein kinase B (PKB).

8.2.3.2.4 Kinase B Protein dan Aktivasi melalui PI-3 ,4,5-P3

Protein kinase B, atau Akt, ditemukan sebagai produk dari onkogen yang akut

mengubah retrovirus AKT8, menyebabkan limfoma sel-T pada tikus. Ini mengkode

hasil fusi dari seluler serin / treonin protein kinase dan virus struktural protein Gag.

Kinase ini mirip dengan kedua protein kinase Cε (PKCε, identitas% 73 ke domain

katalitik) dan protein kinase A (PKA 68%). Ini berbeda dari kinase protein lainnya

yang mengandung homologi pleckstrin (PH) domain, yang memungkinkan untuk

mengikat polyphosphoinositide kelompok kepala (dan juga ke G-protein βγ subunit).

Sampai saat ini, tiga subtipe telah diidentifikasi: α, β, dan γ, yang semuanya

menunjukkan jaringan distribusi yang luas. Itu

GAMBAR 8.8 Mekanisme aktivasi protein kinase B (PKB). PI3-kinase yang

direkrut untuk membran melalui hubungan langsung dengan reseptor PTK atau

melalui asosiasi dengan protein docking Gab-1. Ini mengkatalisis generasi fosfatidil

3,4,5-inositolphosphate, yang berfungsi sebagai sinyal membran-perekrutan untuk

PKB. Terkait dengan membran, pertama-tama terfosforilasi dalam domain katalitik

oleh PDK1 dan kemudian oleh PDK2 dalam motif hidrofobik. The diaktifkan PKB

kemudian melepaskan dari membran.

ditemukan bahwa PI-3 kinase, melalui produksi PI-3 ,4,5-P3 adalah penggerak

PKB. Itu mekanisme aktivasi ini ternyata proses tahapan, dengan fosfolipid yang

bermain dua peran yang berbeda. Salah satunya adalah langsung, merekrut PKB ke

membran melalui pengikatan lipid kepala kelompok ke domain PH di segmen N-

terminal. Interaksi lain adalah tidak langsung, melibatkan perekrutan dua kinase

protein terlarut, PDK1 dan PDK2 (3 phosphoinositide-dependent protein kinase 1 dan

2), juga dikaruniai dengan domain PH. Pengikatan PI-3 ,4,5-P3 sangat penting,

karena memungkinkan PDK1, PDK2, dan PKB untuk datang bersama-sama (Gambar

8.8). PDK1 phosphorylates PKB di perusahaan katalitik lingkaran, tetapi sinyal

aktivasi penuh memerlukan fosforilasi kedua di C-terminal domain. Reaksi ini

tergantung pada PDK2, yang belum diidentifikasi secara benar. Dua kali lipat

fosforilasi PKB menyebabkan detasemen nya dari membran, dan ini memungkinkan

untuk berinteraksi dengan substrat yang lain dalam sel. Produk onkogen virus, v-Akt,

memiliki jangkar lipi (Kelompok miristoil), yang berarti bahwa protein kinase sudah

terletak di membran, yang dapat memfasilitasi aktivasi.

8.2.3.2.5 PKB dan Peraturan Sintesis Protein

The PI3-kinase/PKB jalur mengatur sintesis protein melalui aktivasi eukariotik

terjemahan inisiator faktor-4E (EIF-4E) dan ribosom protein kinase p70 S6-kinase.

EIF-4E adalah faktor inisiasi membatasi sintesis protein di sebagian besar sel, dan

aktivitas yang memainkan seorang pelaku berperan dalam menentukan tarif

terjemahan global. Hal ini diatur oleh fosforilasi (misalnya, melalui MAP kinase)

tetapi juga dengan mengikat protein represor translasi, 4E-BPs. Ini represor tidak

aktif oleh fosforilasi. S6 protein merupakan komponen dari ribosom 40S subunit, dan

fosforilasi yang meningkatkan laju penerjemahan, sehingga meningkatkan protein

sintesis. Komponen S6 difosforilasi oleh kinase S6, yang beberapa isoform memiliki

telah diidentifikasi, salah satunya adalah p70-S6 kinase. Kegiatan mereka diatur oleh

insulin, pertumbuhan faktor, atau glukagon. Kedua 4E-BP1 dan p70-S6 kinase berada

di bawah kendali PKB, tapi ini tidak langsung, melibatkan lagi protein kinase, protein

FKBP-rapamycin terkait (FRAP) / mTOR, homolog manusia dari ragi TOR gen

(Gambar 8.9). Protein kinase adalah awalnya diakui sebagai target rapamycin,

immunosuppressant dan inhibitor protein sintesis. FRAP / mTOR phosphorylates 4E-

BP1, yang menyebabkan pelepasan EIF-4E, yang dapat sekarang berpartisipasi dalam

inisiasi sintesis protein. Hal ini juga phosphorylates p70-S6 kinase, yang memiliki

efek stimulasi pada translasi protein.

8.2.3.2.6 Aktivasi PKB dan Peraturan cyclinD Ekspresi

Substrat lain dari PKB adalah glikogen sintase kinase 3β (GSK3β), yang

menyebabkan fosforilasi inaktivasi nya. Seperti namanya menunjukkan, protein

kinase ini pada awalnya ditemukan sebagai regulatorc

GAMBAR 8.9 Peraturan sintesis protein, siklus sel, dan kelangsungan hidup. (A)

Melalui aktivasi PKB, PI-3 kinase mengontrol inisiasi dan terjemahan dalam sintesis

protein. Activated PKB phosphorylates dan mengaktifkan protein kinase FRAP, yang

phosphorylates 4E-BP1, penghambat faktor inisiasi EIF-4E. The dibebaskan EIF-4E

melekat pada struktur tutup mRNA dan, dengan cara menyetrika keluar jepit rambut,

memfasilitasi asosiasi EIF 2GTP dan 40S subunit ribosom. FRAP juga

phosphorylates dan mengaktifkan p70S6 kinase yang pada gilirannya phosphorylates

S6 protein dari subunit ribosom 40S. Terfosforilasi S6 meningkatkan efisiensi

translasi protein. (B) PKB mengontrol stabilitas cyclinD1 pada dua tingkat. Ini

phosphorylates dan menginaktivasi GSK3β, sehingga mencegah fosforilasi cyclinD1

dan karenanya kehancuran ubiquitin-dimediasi nya. PKB juga phosphorylates dan

mengaktifkan FRAP melalui yang mengatur stabilitas cyclinD1 mRNA dan protein

sendiri oleh jalur belum jelas (tidak ditampilkan). (C) PKB mengontrol kelangsungan

hidup sel melalui penyerapan dari FKHRL dalam sitosol dan inaktivasi buruk dan

caspase-9.

glikogen sintase. GSK3β juga memainkan peran penting dalam penghancuran

dimediasi protein melalui jalur ubiquitination. Ketika cyclinD1 difosforilasi oleh

GSK3β, menjadi ubiquitinated, sebuah proses yang melibatkan penambahan sejumlah

peptida ubiquitin kecil dalam urutan, yang berfungsi sebagai sinyal pengakuan untuk

mesin seluler-protein-kehancuran 26S proteosome. Fosforilasi dan penghambatan

GSK3β oleh PKB, karena itu, mencegah penghancuran cyclinD1 (Gambar 8.9).

Selain itu, aktivasi PKB juga meningkatkan transkripsi gen cyclinD1,

meskipun Sinyal-jalur transduksi menyebabkan efek ini belum terungkap. Kombinasi

daripeningkatan ekspresi dan kehancuran berkurang menyebabkan akumulasi dalam

sel dari cyclinD1 protein. CyclinD1, terkait dengan subunit katalitik, kinase cyclin-

dependent 4 atau 6 (CDK4 atau 6) adalah kekuatan pendorong dari siklus sel selama

fase G1, karena itu adalah salah satu yang paling penting

siklin dalam mengatur proliferasi sel.

8.2.3.2.7 PKB dan kelangsungan hidup Seluler

Seperti disebutkan sebelumnya, NGF tidak dianggap sebagai faktor

pertumbuhan yang benar, sebaliknya, kehadirannya menyebabkan neurite

perkembangan dalam sel PC12, tanda diferensiasi selular. Ia juga memiliki penting

peran dalam kelangsungan hidup neuron. Neuron kekurangan NGF memulai proses

kematian sel terprogram, apoptosis. Kehadiran NGF entah bagaimana harus menjaga

sinyal kelangsungan hidup intraseluler, dan PKB memainkan peran penting dalam

acara ini karena menginduksi sejumlah phosphorylations yang menyelamatkan sel

dari apoptosis. PKB mempromosikan penyelamatan melalui setidaknya dua jalur

(Gambar 8.9). salah satunya adalah melalui fosforilasi langsung dan inaktivasi

komponen mesin apoptosis, termasuk BAD dan caspase-9. BAD, anggota keluarga

Bcl-2 dari regulator apoptosis, mempromosikan dimerisasi dan aktivasi caspases

inisiator (orang-orang yang memulai proses apoptosis). Caspases adalah protease

yang mengandung sistein dalam situs katalitik dan protein membelah pada asparate

residu, maka nama mereka (protease sistein-asparate). Caspase-9 adalah salah satu

inisiator caspase tersebut, dan perannya adalah untuk membelah dan mengaktifkan

disebut caspases efektor lain, mereka yang merusak penting komponen sel (inhibitor

nucleases DNA, enzim perbaikan DNA, dan komponen sitoskeleton). PKB bisa juga

langsung memfosforilasi caspase-9, rendering enzim kurang sensitif terhadap

aktivasi. Jenis lain dari perlindungan yang ditawarkan oleh fosforilasi FKHR-L1,

sebuah faktor transkripsi (anggota Drosophila forkhead / bersayap-helix keluarga

AFX, FKHR, dan FKHR-L1, yang orthologs DAF-16, faktor forkhead yang mengatur

umur panjang dalam Caenorhabditis elegans). Ketika terfosforilasi, FKHRL1 masih

dipertahankan dalam sitosol dan dicegah dari mengaktifkan gen penting untuk

induksi faktor yang mendorong kematian sel seperti ligan Fas. Sekali menyatakan,

ligan Fas akan berikatan dengan reseptor permukaan sel dan menginduksi reseptor

trimerisasi, mengakibatkan aktivasi caspases inisiator. Acara ini pasti akan

mengakibatkan kematian sel.

8.2.3.3 The PLCγ dan Protein Kinase C Sinyal-Transduksi Pathway

8.2.3.3.1 PKC, Keluarga dari Kinase Protein

Di antara kegiatan yang digerakkan oleh aktivasi dari reseptor EGF dan PDGF

adalah generasi dari diasilgliserol (DAG) dan inositol-1 ,4,5-fosfat (IP3) oleh PLCγ.

The DAG tetap dalam membran dan bertindak sebagai stimulus untuk PKC.

Konsekuensinya adalah transformasi phosphotyrosine sinyal melalui aktivasi PLCγ

menjadi sinyal phosphoserine / phosphothreonine. Salah satu substrat pertama PKC

adalah reseptor EGF sendiri. Hal ini menjadi terfosforilasi pada serin a residu sangat

dekat dengan domain transmembran dan memiliki efek menonaktifkan reseptor.

PKCS mamalia terdiri dari 12 anggota keluarga yang berbeda yang dapat dibagi lagi

menjadi tiga subfamilies diklasifikasikan atas dasar kesamaan urutan dan modenya

aktivasi. Itu subfamilies adalah PKCS konvensional (cPKCs), termasuk α, β1, β2, dan

γ, PKCS baru (nPKCs), termasuk δ, ε, ε, dan ζ, dan atipikal PKCS (aPKCs),

termasuk ι, η, δ, dan κ (PKD). Beberapa mereka karakteristik disajikan dalam Tabel

8.3.

Mayoritas anggota ini reseptor untuk ester phorbol, produk tumor-

mempromosikan diperoleh dari minyak puring. Salah satunya, 12-O-

tetradecanoylphorbol-13-asetat (TPA),

adalah ampuhpenggerak PKC. Dengan tujuan untuk memahami mekanisme aksi PKC

yang mendasari promosi tumor dengan ester phorbol, dua strategi eksperimental

independen telah diterapkan. Satu melibatkan mencari elemen kontrol transkripsi

yang menengahi phorbol-ester-induced perubahan dalam ekspresi gen dan kemudian

bekerja mundur untuk mengidentifikasi faktor-faktor transkripsi yang mengikat

unsur-unsur dan akhirnya jalur sinyal-transduksi yang mengatur aktivasi mereka. Itu

Pendekatan kedua adalah untuk overexpress berbagai isoform PKC dan untuk

mempelajari perubahan dalam sel fenotipe. Meskipun upaya besar, peran PKC dalam

promosi tumor masih belum jelas, dan PKC telah gagal untuk memenuhi syarat

sebagai onkogen benar.

8.2.3.3.2 PKC dan Aktivasi TRE dan SRE oleh phorbol Ester

Analisis daerah promotor gen TPA-diinduksi (misalnya, kolagenase,

metallothionein IIA, dan stromelysin) mengungkapkan dilestarikan tujuh pasangan

basa palindromic motif (TGACTCA). Ini Elemen TPA-responsif (TRE) diakui oleh

aktivator protein 1 (AP-1). Pada saat itu, itu dipahami bahwa AP-1 adalah pada akhir

penerimaan jalur kompleks yang mentransmisikan efek phorbol ester promotor tumor

dari membran plasma ke mesin transkripsi, mungkin melibatkan protein kinase C.

AP-1 meliputi sekelompok faktor transkripsi dimer kompleks terdiri dari Juni-Juni,

Jun-Fos, atau Jun-ATF, * dikenal onkogen dihubungkan oleh interaksi protein-

protein Motif dikenal sebagai ritsleting leusin. Varian onkogenik dari faktor-faktor

transkripsi memiliki meningkat paruh dan menunjukkan aktivitas transkripsi

ditingkatkan sebagai konsekuensi dari penghapusan parsial.

Ditemukan bahwa aktivasi PKC menyebabkan defosforilasi c-Juni hanya di

dasar daerah di mana ia mengikat DNA. Fosforilasi segmen ini juga dapat dicapai

(dalam tabung tes) oleh glikogen sintase kinase 3β (GSK-3β), jadi itu mendalilkan

bahwa PKC merangsang mengikat c-Juni DNA melalui penghambatan GSK-3β

(Gambar 8.10). Hal ini akan mengakibatkan defosforilasi yang wilayah dasar.

Konsisten dengan ide ini adalah bahwa aktivasi PKC (α, β1, β2, dan ) menyebabkan

fosforilasi dan dengan demikian penonaktifan GSK-3β. Namun, interaksi molekul

antara GSK-3β dan c-Jun belum terbukti juga tidak jelas yang fosfatase strip residu

fosfat dari c-Juni Bahwa ini tidak bisa seluruh cerita menjadi jelas dari temuan bahwa

fosforilasi pada N-terminus juga penting untuk kedua aktivitas transkripsi dan sel

transformasi dengan c Jun.

Penemuan Juni N-terminal protein kinase (JNK-1) yang phosphorylates c-Juni

melalui interaksi dengan situs docking kinase spesifik menarik lapangan jauh dari

PKC dan TRE dan terfokus perhatian pada unsur serum-respon (SRE) dan keluarga

baru muncul kinase MAP. Selain perannya dalam mengatur ekspresi serum-dimediasi

faktor transkripsi c-fos, yang SRE juga terlibat dalam respon seluler terhadap ester

phorbol. Seperti telah disebutkan, SRE mengikat dua faktor transkripsi: faktor serum-

respon (SRF) dan faktor p62TCF terner-kompleks (Elk-1). Faktor pertumbuhan

mengatur aktivitas transkripsi melalui fosforilasi p62TCF, sebuah modus aktivasi

yang juga berlaku untuk ester phorbol.

8.2.3.3.3 PKC dan Modulasi dari MAP Kinase Signal-Transduksi Persiapan

Sebagai jalur sinyal transduksi-yang berasal dari reseptor faktor pertumbuhan

yang mengaktifkan SRE secara bertahap diselesaikan dan ditemukan untuk

melibatkan Ras dan anggota keluarga kinase MAP, peran PKC tetap jelas. PKCε

ditemukan untuk mengaktifkan Ras-diaktifkan kinase c-Raf, dan dua enzim bekerja

sama dalam transformasi NIH3T3 fibroblas. Dalam fibroblas embrio tikus, aktivasi

Raf-1 juga penting untuk efek transformasi dari PKC. Karena semua faktor

pertumbuhan menginduksi generasi DAG dan karenanya mengaktifkan PKC, maka

bahwa PKC memberlakukan Ras-diprakarsai Pertumbuhan sinyal faktor pada tingkat

Raf-1. Namun, ini tidak selalu menghasilkan peningkatan

GAMBAR 8.10 Protein kinase C (PKC) dan aktivasi elemen TPA-responsif

(TRE) dan serumresponse elemen (SRE). PKC dan faktor pertumbuhan yang pada

awalnya untuk mengaktifkan sinyal yang berbeda-transduksi jalur, mengakibatkan

aktivasi TRE dan SRE, masing-masing. Gagasan ini berakhir ketika disadari bahwa

TPA juga mengaktifkan SRE dan bahwa faktor pertumbuhan dapat mengaktifkan

TRE melalui aktivasi Juni Nterminal kinase (JNK). PKC mungkin memiliki peran

penting dalam modulasi kedua MAP kinase yang berbeda jalur. Efek tertentu pada

GSK3β, mengakibatkan dephosphorylation wilayah dasar c-Juni, mungkin juga

melayani untuk meningkatkan aksi JNK, protein kinase yang phosphorylates daerah

N-terminal dan mempromosikan dimerisasi faktor transkripsi.

proliferasi sel. Temuan lebih baru menggunakan kinase-mati dan konstitutif

diaktifkan mutan memastikan bahwa beberapa isoform PKC dapat mengaktifkan jalur

MAP kinase, dalam beberapa kasus terkemuka untuk aktivasi baik MAP kinase

(ERK) dan JNK. Ganda ini sinyal reintegrates pada tingkat fosforilasi p62TCF

(Gambar 8.10). Aktivasi JNK sama bisa mengakibatkan fosforilasi c-Juni, sehingga

aktivasi AP-1 di situs TRE. Secara kolektif, studi ini menunjukkan PKC yang

bertindak terutama sebagai modulator dari Ras jalur sinyal transduksi-yang berasal

dari reseptor faktor pertumbuhan. Komitmen, baik untuk mempromosikan atau untuk

menekan aktivitas, ditentukan pada tingkat kinase MAP.

8.2.3.4 The Ca2 + / Calmodulin Pathway

Pembelahan fosfatidil inositol-4,5-fosfat (PIP2) oleh hasil PLCγ dalam

pembebasan IP3, yang mengikat reseptor pada retikulum endoplasma, sehingga

membuka saluran Ca2 +. Hasil ketinggian sitosol bebas Ca2 + menyebabkan aktivasi

dari sejumlah serin / treonin protein kinase, semua yang mengandung Ca2 subunit

regulasi + mengikat, kalmodulin (juga hadir dalam sejumlah lainnya enzim, lihat

Gambar 8.11). Ini termasuk spektrum luas Ca2 + / protein kalmodulin-dependen

kinase II (CaMKII), myosin rantai ringan kinase-(MlCK), fosforilasa kinase, dan

perpanjangan Faktor 2 kinase (EF-2 kinase), di samping protein fosfatase kalsineurin,

pemain penting dalam aktivasi limfosit T. Jelas, Ca2 + adalah utusan kedua sangat

serbaguna modulasi sinyal intraseluler banyak, subjek terlalu luas untuk menangani

dalam sebuah bab buku.

GAMBAR 8.11 jalur sinyal transduksi-Beberapa diprakarsai oleh kalmodulin.

Kalmodulin terikat Ca2 + berinteraksi dan mengaktifkan banyak enzim, membuka

berbagai respon seluler mungkin. singkatan: MAP-2, mikrotubulus terkait protein 2,

NO, oksida nitrat, Tau, unit perakitan tubulin.

8.2.3.5 Fosforilasi Langsung Faktor Transkripsi dan Aktivasi STAT

Cara paling sederhana di mana reseptor membran plasma bisa mengubah

ekspresi gen akan oleh fosforilasi langsung faktor transkripsi. Aktivasi transkripsi

oleh interferon adalah contoh. Faktor transkripsi yang dikenal sebagai STAT

(transduser sinyal dan aktivator transkripsi) diakui sebagai target untuk reseptor

interferon, tetapi sekarang jelas bahwa mereka juga memediasi sinyal EGF dan PDGF

reseptor. The STAT p84Stat1a dan p91Stat1b direkrut untuk tirosin terfosforilasi-

reseptor faktor pertumbuhan melalui SH2 domain mereka. Setelah fosforilasi, mereka

menggabungkan, melalui interaksi timbal balik dari SH2 domain mereka, dengan

fosfat tirosin untuk membentuk sebuah kompleks dimer, dan sebagai akibatnya,

mereka translokasi ke nukleus, di mana mereka mempromosikan transkripsi gen

respon awal seperti c-fos (Gambar 8.12). The STAT dimer, terbentuk setelah tirosin

fosforilasi oleh reseptor PDGF, pada awalnya digambarkan sebagai simian-sarkoma-

virusinducible factor (SIF), sebuah kompleks faktor transkripsi diaktifkan oleh

onkogen virus, v-Sis. Ini Kode onkogen virus untuk prekursor PDGF dan

mengaktifkan jalur sinyal transduksi-sama.

8.3 RESEPTOR YANG ASOSIASI DENGAN Protein Tyrosine Kinase

8.3.1 KELUARGA nonreceptor PROTEIN tirosin kinase

Bagian ini berkaitan dengan keluarga penting reseptor yang tidak memiliki

aktivitas katalitik intrinsik tetapi namun menginduksi respon serupa dengan tirosin

kinase reseptor. Pertanyaan bagaimana mereka sinyal itu diselesaikan dengan temuan

bahwa banyak reseptor subunit katalitik merekrut dari dalam sel dalam bentuk satu

atau lebih nonreceptor protein tirosin kinase (nonreceptor PTKS). Ini dapat dibagi

menjadi sembilan keluarga: ABL, Fes / Fer, Syk/Zap70, Jak, Tec, Fak, Ack, Src, dan

CSK. Empat PTKS nonreceptor tambahan (RLK / TXK, SRM, Rak / Frk, dan BRK /

Sik) tidak muncul milik salah satu keluarga didefinisikan (Gambar 8.13). Protein ini

ada dalam sitosol sebagai komponen larut, atau mereka mungkin membran terkait

melalui farnesylation (C15 isoprenoid) atau palmitoylation (C16) dari daerah C-

terminal (Src, Fyn, Lyn, atau Yes) atau melalui kehadiran dari domain PH (anggota

keluarga Btk / Tec). Sejumlah besar gen vertebrata encode untuk nonreceptor PTKS

(minimal 33). Perekrutan nonreceptor PTKS dan akibatnya phosphorylations tirosin

biasanya langkah pertama dalam perakitan sebuah sinyal besar kompleks yang terdiri

dari selusin atau lebih protein yang mengikat dan berinteraksi satu sama lain.

GAMBAR 8.12 fosforilasi Langsung Bahasa Dari Kelas B STAT faktor transkripsi.

Melalui domain SH2 mereka, Yang p84Stat1a Dan p91Stat1b mengasosiasikan

Artikel Baru reseptor Dan menjadi terfosforilasi FUNDS residu tirosin. Mereka

membentuk dimer (disebut faktor Sis-diinduksi, atau SIF) Yang translocates Ke inti,

di mana besarbesaran mengikat Sisinducible sebuah elemen (SIE) Dan mengaktifkan

transkripsi, misalnya, gen c-fos.

GAMBAR 8.13 nonreceptor PTKS. Ini protein kinase membentuk keluarga

besar, dan sebagian besar dari mereka mengandung SH2 dan SH3 domain. Beberapa

awalnya ditemukan sebagai transformasi gen dari genom virus, maka nama

seperti src atau ABL, berasal dari virus sarkoma Rous atau Abelson murine

leukemia virus, masing-masing. (Diadaptasi dari Hunter, T., Biochem. Soc. Trans.,

24 (2), 307-327, 1996.)

Contoh dari kelas reseptor yang merekrut nonreceptor PTKS termasuk yang

memediasi imun dan inflamasi tanggapan:

• Reseptor T-limfosit (TCR) yang terlibat dalam deteksi antigen asing, disajikan

bersama-sama dengan major

histocompatibility complex (MHC). Selanjutnya, mengatur ekspansi klonal sel T.

• Reseptor limfosit B untuk antigen penting di baris pertama pertahanan terhadap

infeksi oleh mikroorganisme.

• The interleukin-2 reseptor (IL-2R) adalah penting dalam bahwa sitokin IL-2,

disekresikan oleh subset sel T-helper, meningkatkan proliferasi aktif sel T dan B

dan meningkatkan aktivitas cytolytic pembunuh (NK) sel alami dan sekresi IgG.

• reseptor imunoglobulin, seperti reseptor afinitas tinggi untuk IgE, yang hadir pada

tiang sel dan basofil ditularkan melalui darah. Reseptor ini memainkan peran

penting dalam hipersensitivitasdan inisiasi respon inflamasi akut.

Untuk sel-sel lain, seperti sel-sel endotel atau epitel:

• Integrin hadir dalam kompleks adhesi focal menyebabkan perekrutan dua jenis

protein kinase tirosin ke membran plasma focal adhesion kinase (FAK) dan Src.

Mereka memainkan peran dalam kelangsungan hidup sel dan proliferasi.

8.3.2 MODE PENGAKTIFAN nonreceptor PROTEIN tirosin kinase

PTKS nonreceptor adalah kelompok besar sinyal protein yang memiliki peran

beragam dalam kontrol proliferasi sel, diferensiasi, dan kematian. Beberapa banyak

diekspresikan, yang lainnya dibatasi untuk jaringan tertentu. Klasifikasi awal mereka

didominasi oleh penemuan pp60src, sejauh bahwa kelompok utama dari kinase yang

hanya dikenal sebagai keluarga Src. Setidaknya ada sepuluh dikenal subfamilies dari

nonreceptor PTKS.

The Src kinase keluarga berbagi struktur yang sama. Sebuah domain yang unik

di N-terminus diikuti oleh domain SH2 dan SH3 domain (prototipe dari domain yang

diekspresikan secara luas). Itu SH3 domain ini kemudian melekat dengan wilayah

menghubungkan ke domain kinase dan akhirnya ekor C-terminal (Lihat Gambar

8.13). Banyak kinase ini berfungsi dengan menjadi terkait dengan makromolekul

sinyal kompleks dirakit di situs membran. Membran asosiasi dapat dipromosikan oleh

domain N-terminal yang unik. Dalam keluarga Src, SRC sendiri (pp60c-src), Fyn,

Lyn, dan Ya adalah N-terminal myristoylated. Ini rantai alifatik 14-karbon

memberikan kesempatan untuk membran lampiran yang dapat diperkuat dengan

palmitoylation di sistein dekatnya. Demikian pula, anggota dari keluarga Btk / Tec

dapat menjadi membran terkait melalui domain PH mereka, yang dapat mengikat

polyphosphoinositide lipid. PTKS nonreceptor lain direkrut ke situs mereka tindakan

melalui asosiasi SH2 domain mereka dengan residu phosphotyrosine pada target

mereka.

Terlepas dari lokasi mereka, kebanyakan kinase Src keluarga umumnya tidak

aktif. Mereka umumnya diselenggarakan di negara ini oleh tirosin terfosforilasi

penting (di pp60c-Src, Y527 di C-terminus) yang terlibat N-terminal SH2 domain.

Selanjutnya, urutan di linker mengambil struktur yang menyerupai wilayah kaya

prolin, sehingga mengikat SH3 domain. Interaksi ini menyebabkan molekul untuk

mengadopsi struktur kompak. Pembengkokan ekor karboksil menyebabkan rotasi

lobus kecil dari domain kinase, yang mendistorsi situs aktif. Aktivasi karena itu

memerlukan penghapusan fosfat C-terminal, dimungkinkan karena urutan asam

amino segera berdekatan dengan phosphotyrosine tidak optimal untuk ketat mengikat

ke domain SH2. SH2 domain mengikat phosphotyrosines yang paling efektif ketika

mereka berada di motif pYEEI. Sebuah setara urutan di Src C-terminus tidak

memiliki isoleusin di Py +3 dan tidak begitu terikat erat. Ini memberikan kesempatan

untuk diakses oleh fosfatase (seperti CD45 dalam limfosit) (Gambar 8.14). Memiliki

kehilangan fosfat karboksil-ekor, loop aktivasi di tepi dari situs katalitik kemudian

dapat menjadi

GAMBAR 8.14 Aktivasi PTKS nonreceptor. Lck diadakan dalam keadaan

kompak diakses melalui fosforilasi residu Y505, yang berinteraksi dengan

intramolekul SH2 domain. Setelah aktivasi CD45 (ligan diketahui), pY505 akan

dihapus dan molekul membuka. Autofosforilasi di Y-394 residu dalam domain

katalitik merupakan aktivasi PTK tersebut. terfosforilasi, sangat meningkatkan

aktivitas katalitik. Aktivasi Src kinase keluarga karena membutuhkan pertama

defosforilasi dan kemudian fosforilasi a.

8.3.3 T CELL RESEPTOR SINYAL

8.3.3.1 Aktivasi Limfosit T dan Interaksi antara TCR dan MHC

Limfosit T memiliki peran sentral dalam imunitas diperantarai sel. Ketika

diaktifkan, mereka berkembang biak dan membedakan menjadi baik sitotoksik (NK)

atau helper (Th) sel T. Sel T sitotoksik membunuh spesifik target, paling sering sel

yang terinfeksi virus, sedangkan sel T helper membantu sel-sel lain dari kekebalan

sistem, seperti limfosit B (untuk menginduksi produksi antibodi) dan makrofag

(untuk meningkatkan pelepasan sitokin inflamasi yang memungkinkan pertahanan

tuan rumah yang efektif). Limfosit T diaktifkan melalui interaksi dengan sel-sel yang

menyajikan antigen dalam konteks utama istocompatibility complex (MHC).

Interaksi sel-sel terjadi dengan cara berikut. Itu Acara selektif adalah pengakuan

antigen ditempatkan di alur MHC oleh sel-T reseptor (TCR). Dalam kasus antigen

intraseluler atau virus, fragmen protein (antigen) yang disajikan oleh MHC kelas I,

dalam kasus antigen infeksi mikroba, mereka disajikan oleh MHC kelas II. Sebelum

limfosit menjadi sepenuhnya diaktifkan, interaksi antara antigenpresenting sel dan

limfosit T harus ditegakkan oleh sejumlah interaksi lainnya, seperti sebagai CD4

(atau CD8) berinteraksi dengan MHC dan B7 dengan CD28 (antara lain). Tanggapan

penuh terdiri induksi ekspresi IL-2 dan reseptor diikuti oleh stimulasi autokrin,

mengakibatkan proliferasi sel, acara juga disebut sebagai ekspansi klonal.

8.3.3.2 Sinyal Transduksi Hilir TCRs

Meskipun tidak memiliki domain katalitik intrinsik, aktivasi limfosit T dimulai

dengan phosphorylations tirosin, aktivasi PLC-γ dengan produksi IP3 dan DAG, dan

elevasi sitosol bebas Ca2 +. Dengan demikian, konsekuensi dari reseptor ligasi tidak

berbeda dari orang-diinduksi oleh reseptor untuk EGF atau PDGF. Sebuah studi awal

mencoba untuk menjelaskan induksi tirosin kinase kegiatan menghasilkan penemuan

protein tirosin kinase nonreceptor Lck (p56lck), T-cellspecific anggota keluarga Src.

Lck dikaitkan dengan ekor sitosol CD4 (di T helper sel) atau CD8 (dalam sel T

sitotoksik) (Gambar 8.14). Seperti disebutkan, domain ekstraseluler inimolekul

mengikat protein MHC, yang tidak hanya memperkuat interaksi agak lemah didirikan

antara TCR dan antigen tetapi juga membawa CD4 (atau CD8) ke disekitar TCR

kompleks, yang mengarah ke Lck target pada?-Rantai. Namun, seperti kinase Src

keluarga lainnya, Lck tidak aktif sampai residu tertentu telah dephosphorylated. Hal

ini dilakukan dengan belum protein lain transmembran, CD45, yang memiliki protein

aktivitas tirosin fosfatase (lihat Gambar 8.14)

Aktivasi Lck hasil dalam fosforilasi δ-rantai TCR. Target tyrosines terbatas

pada immunoreceptor berbasis tirosin aktivasi motif (ITAMs). ITAMs juga hadir

dalam α, δ, dan ε rantai CD3 dan target lain Src kinase keluarga, Fyn (p59fyn) terkait

dengan rantai ε. Fyn juga diaktifkan oleh defosforilasi. Kedua Fyn dan Lck

diperlukan untuk efisien TCR sinyal. Fosforilasi ITAMs menyediakan situs docking

untuk SH2 domain-bantalan molekul, dan hasil langsung adalah perekrutan lagi

nonreceptor protein tirosin kinase, ZAP-70 (δ-rantai protein tirosin kinase terkait dari

70 kDa). Setelah terikat, ini pada gilirannya menjadi terfosforilasi dan dengan

demikian diaktifkan, menyebabkan fosforilasi beberapa substrat. Sebagai dengan

reseptor faktor pertumbuhan, urutan kejadian mengikuti pola di mana

phosphotyrosines mengikat SH2-domain yang mengandung (atau PTB-) protein yang

mungkin mereka sendiri PTKS dan dapat phosphorylate protein lain dalam suksesi.

Pada setiap tahap, ada kesempatan untuk percabangan, melalui berbagai efektor.

Dengan perekrutan berturut-turut, sebuah kompleks sinyal yang luas dirakit bahwa

mencakup beberapa enzim efektor (Gambar 8.15). Yang penting cabang-point yang

ditawarkan oleh

GAMBAR 8.15 ekspansi klonal limfosit T naif melalui sinyal dari TCR. (A) TCR

memiliki heterodimer disulfida-linked rantai α dan β. Ini memiliki daerah

hypervariable yang mendeteksi antigen, disajikan sebagai peptida pendek dalam alur

dari molekul MHC. Heterodimer ini bersama dengan dua? - rantai, membentuk

kompleks dengan empat polipeptida (γε dan γδ) dari molekul CD3. CD4 dan CD8

molekul juga terkait dengan TCR di helper dan sel T sitotoksik, masing-masing.

Molekul-molekul ini berikatan dengan MHC dan membawa Lck, sebuah nonreceptor

PTK, ke daerah sekitar δ-rantai. (B) TCR mengaktifkan Lck, yang phosphorylates dua

δ-rantai di motif Itam. Residu phosphotyrosine membentuk sebuah situs docking

untuk SH2 domain ZAP70, lain PTK sitosol, yang, pada gilirannya, phosphorylates

beberapa (maksimal sembilan) residu tirosin pada protein transmembran adaptor

LAT. Berbagai protein melampirkan LAT, termasuk guanin pertukaran faktor Vav,

para Grb2 adaptor, subunit adaptor PI-3 kinase, dan PLC-γ. Semua ini memainkan

peran penting dalam aktivasi gen IL-2. Ketinggian Ca2 + intraseluler mengaktifkan

kalsineurin, yang dephosphorylates NF-AT (faktor nuklir sel T aktif). Bersama

dengan AP-1 kompleks, NFAT mendorong transkripsi gen IL-2. terpisahkan

membran protein LAT (linker untuk aktivasi sel T), yang menyajikan tidak kurang

dari sembilan residu tirosin substrat. Ketika terfosforilasi, ini merekrut berbagai

molekul sinyal, semua interaksi melalui dengan SH2 domain. Ini termasuk adaptor

protein Grb2, SLP76 (SH2-domain yang mengandung protein leukosit 76 kDa,

sebuah protein adaptor), enzim PLC-γ PI3-kinase (Melalui subunit regulasi P85), dan

guanin nukleotida pertukaran faktor Dbl dan Vav. Kompleks sinyal terbentuk di

sekitar TCR dan jalur bercabang yang berasal dari menyerupai mekanisme yang

digunakan oleh faktor pertumbuhan. Namun, tujuan dari jalur ini tidak semua jelas.

PLC-γ jalur (DAG, IP3, dan ketinggian intraseluler bebas Ca2 +) mengarah ke

aktivasi fosfatase kalsineurin, yang mengaktifkan faktor transkripsi NF-AT (nuklir

faktor sel T aktif). Hal ini penting untuk ekspansi klonal sel T karena penting nya

peran dalam induksi IL-2. NF-AT membutuhkan bantuan dari protein aktivator 1

(AP-1) kompleks dalam rangka mendorong ekspresi IL-2.

8.3.3.3 The IgE Reseptor dan Signal untuk eksositosis

Sel mast jaringan dan sirkulasi basofil adalah dari keturunan hematopoietik.

Terkenal karena peran mereka dalam alergi, mereka memediasi kedua reaksi

hipersensitivitas langsung dan tertunda. Mereka juga membantu untuk

mempertahankan tubuh terhadap infeksi bakteri dan parasit dan mengambil bagian

dalam respon inflamasi. Stimulus imunologi mereka disediakan oleh antigen

polivalen yang mengikat dan lintas-link IgE, yang dengan sendirinya terikat dengan

reseptor imunoglobulin afinitas tinggi, IgE-R (khusus, FcεRI). Awalnya, mekanisme

signaling memiliki kesamaan dengan limfosit dalam hal itu melibatkan rekrutmen

berturut-turut tirosin kinase dan protein SH2-domain yang mengandung (adapter dan

efektor).

The IgE-reseptor agregasi digerakkan serangkaian acara. Konsekuensi langsung

adalah sekresi produk preformed disimpan dalam sekresi butiran yang berlangsung

dalam beberapa menit. Zat dirilis termasuk agen vasoaktif dan mediator inflamasi

(histamin, proteoglikan, protease netral, hidrolisis asam). Kemudian, selama menit ke

jam, sel-sel mensintesis dan mensekresi sitokin (antara lain, IL-2 dan IL-6) dan

arakidonat yang diturunkan inflamasi mediator, seperti leukotrien LTB4.

Pembentukan butiran baru dan pemulihan morfologi sel kemudian berlanjut selama

periode membentang dari jam untuk minggu.

Peristiwa awal yang mengikuti agregasi reseptor melibatkan perekrutan tirosin

Src keluarga kinase, termasuk Lyn dan Syk. Seperti reseptor sel T, IgE-R berlokasi

sama dengan perancah protein LAT dalam rakit lipid (microdomain). Fosforilasi LAT

oleh Syk menyediakan docking situs untuk sejumlah protein SH2 domain yang

mengandung (Gambar 8.16). Dari jumlah tersebut, Vav adalah penting karena

mengatur aktivasi anggota keluarga dari GTPases Rho. Vav adalah diberkahi dengan

berbagai domain yang memungkinkannya untuk mengintegrasikan sinyal masuk dan

keluar yang beragam. Ini termasuk salah satu SH2 domain, dua SH3 domain, sebuah

homologi Dbl (DH) domain, pleckstrin sebuah homologi (PH) domain, wilayah

leusin kaya, dan daerah kaya sistein. DH domain, di khususnya, adalah karakteristik

dari faktor pertukaran nukleotida guanin yang mengkatalisis GTP / PDB pertukaran

GTPases Rho-family. Ini memediasi respon seluler yang beragam, termasuk

reorganisasi dari sitoskeleton dan peraturan Juni N-terminal kinase. Dalam sel mast,

Cdc42 dan Rac memainkan dua peran penting. Aktivasi mereka adalah langkah yang

menentukan kunci sel untuk melakukan menjalani eksositosis. Langkah-langkah

menghubungkan GTPases ini untuk protein yang mengatur fusi membran tetap tidak

diketahui. Kedua, mereka yang terlibat dalam regulasi pelepasan interleukin, respon

yang melibatkan aktivasi JNK.

Jalur kedua aktivasi sel mast dipicu oleh agen-agen seperti racun tawon peptida

mastoparan. Daripada berinteraksi dengan reseptor sel-permukaan, seperti "reseptor-

mimesis" agen dapat memasukkan ke dalam membran menyebabkan aktivasi

langsung heterotrimeric G-protein dari kelas Gi. Di sini, itu adalah subunit β dari G-

protein yang memberikan sinyal untuk eksositosis. Sebagai di jalur dari IgE-R, adalah

mungkin bahwa Vav berpartisipasi dalam integrasi sinyal ini, karena memiliki

domain PH (mengikat subunit β) dan memiliki aktivitas pertukaran nukleotida

guanin.

GAMBAR 8.16 Peran nonreceptor PTK di IgE-mediated eksositosis dalam sel

mast. Mengikat IgE kepada para reseptor FcεRI menghasilkan aktivasi nonreceptor

PTK SYK, yang phosphorylates tiga sasaran: yang reseptor itu sendiri, docking

protein LAT, dan faktor pertukaran Dbl. Faktor tukar mengaktifkan GTPases Cdc42

dan Rac, yang keduanya berperan dalam eksositosis langsung dari vesikel yang

mengandung mediator inflamasi dan dalam rilis jangka panjang sitokin, suatu acara

yang mengharuskan aktivasi JNK.

8.3.3.4 integrin Signaling

8.3.3.4.1 Peran FAK dalam Penyelamatan dari Apoptosis

Kelangsungan hidup sel endotel dan epitel sangat bergantung pada kontak

dengan satu sama lain dan dengan matriks ekstraseluler. Tanpa kontak, mereka mati

melalui proses terkendali sel kematian, apoptosis. Dalam kasus detasemen sel, situasi

memicu kematian sel terprogram telah disebut anoikis, berarti tunawisma.

Mekanisme ini melindungi organisme terhadap Pertumbuhan displastik (berarti salah

terbentuk), mencegah sel-sel menyimpang dari menjajah pantas lokasi. Sel memiliki

dorongan intrinsik untuk merusak diri sendiri, tetapi biasanya dicegah dari melakukan

hal ini oleh sinyal yang berasal dari jalur penyelamatan tertentu. Salah satu sinyal

tersebut (luar-dalam) berikut dari lampiran integrin α5β1 ke matriks ekstraseluler.

Ketika fibroblas tersebar di fibronektin, komponen melimpah dari matriks

ekstraseluler, anggota keluarga integrin molekul adhesi, terutama α5β1 dan αVβ3,

bentuk multimerik cluster yang menempel pada sitoskeleton di tempat adhesi focal.

Ini terdiri dari sejumlah protein, beberapa peran struktural memiliki, lain sinyal.

Bersama-sama mereka membentuk adhesi focal kompleks seperti yang digambarkan

dalam Gambar 8.17. Yang penting struktural komponen vinculin dan bentuk talin

situs pengikatan untuk sitoskeleton aktin dan dengan demikian mengarahkan

pembentukan serat stres dan aktin struktur dalam wilayah kortikal sel. Talin juga

membentuk situs lampiran untuk tirosin kinase FAK (focal adhesion kinase).

Lampiran mengakibatkan aktivasi dan autofosforilasi (Di Tyr-397) memungkinkan

FAK untuk bertindak sebagai situs docking untuk SH2 domain P85-peraturan subunit

PI-3 kinase, yang mengarah ke generasi fosfatidil inositide lipid 3-fosfat.

Hilir dalam jalur penyelamatan, PKB efek sejumlah phosphorylations yang

mencegah apoptosis (Gambar 8.17) (lihat Bagian 8.2.3.2). Adalah menarik untuk

dicatat bahwa kedua faktor pertumbuhan reseptor, seperti TrkA, dan molekul adhesi

menghasilkan sinyal penyelamatan melalui aktivasi protein kinase tirosin, dan

tampaknya sel mengharuskan kedua keterikatan matriks ekstraseluler dan adanya

faktor pertumbuhan tertentu agar tidak mati.

Pentingnya FAK digarisbawahi oleh temuan bahwa sel-sel mengekspresikan

konstitutif aktif membentuk bertahan di suspensi meskipun mereka "tunawisma." Di

sini, protein kinase aktif terlepas dari kegagalan untuk melakukan kontak dengan

matriks ekstraseluler. Menyelamatkan dari apoptosis juga terjadi ketika sel-sel

mengekspresikan bentuk onkogenik konstitutif diaktifkan Ras atau Src dan dengan

demikian mengaktifkan PI3-kinase dan jalur MAP kinase. Tidak seperti FAK, ini

tidak hanya mencegah apoptosis tetapi juga mempromosikan sinyal proliferasi yang

menghasilkan pembentukan tumor.

GAMBAR 8.17 kelangsungan hidup dan proliferasi. Tempat adhesi focal

mempromosikan sinyal kelangsungan hidup sel melalui aktivasi protein kinase B

(PKB). Seperti sel-sel jaringan tersebar pada matriks ekstraseluler, adhesi focal situs

terbentuk. Ini terdiri dari berkerumun β1 integrin terkait dengan talin, vinculin, dan

aktin sitoskeleton. The fokus adhesi kinase (FAK) menempel ke talin,

autophosphorylates pada residu tirosin (Y397), dan menyediakan sinyal aktivasi

untuk PI-3 kinase. Produksi PI-3,4,5-P3, yang bertindak sebagai pengikat situs untuk

domain PH PDK1 dan PKB, berikut. PKB difosforilasi pada dua serin / treonin residu

dan melepaskan dari membran untuk memfosforilasi dan menonaktifkan substrat

yang seharusnya peka sel untuk apoptosis. Ini termasuk BURUK, caspase-9, dan

faktor transkripsi FKHRL-1. The fokus adhesi situs mempromosikan sinyal

proliferasi sel melalui aktivasi Ras. Autofosforilasi FAK (Y397) juga menghasilkan

sebuah situs docking untuk Src, yang phosphorylates FAK pada residu tirosin kedua,

Y925, yang bertindak sebagai situs docking untuk SHC adapter, yang dengan

sendirinya menjadi terfosforilasi dan mengikat Grb2. ini memulai pengaktifan Ras-

MAP kinase, yang diperlukan untuk memulai siklus sel.

8.3.3.4.2 Peran FAK dan Src di Proliferasi Seluler

Pembentukan tempat adhesi focal tidak hanya menyelamatkan sel dari

apoptosis tetapi juga penting persyaratan untuk proliferasi sel-sel jaringan, didorong

oleh faktor pertumbuhan. Jika, misalnya, EGF atau PDGF ditambahkan ke fibroblas

ditangguhkan, aktivasi jalur MAP kinase hanyalah sementara, dan sel-sel gagal untuk

berkembang biak (dan dalam jangka panjang mati melalui apoptosis). Proliferasi

hanya hasil di bawah pengaruh dua rangsangan independen, satu karena faktor

pertumbuhan dan lainnya dari molekul adhesi. Cluster integrin memungkinkan

pengikatan FAK, yang mengalami autofosforilasi (di Tyr-397) dan kemudian

merekrut Src (atau Fyn) kinase menyebabkan fosforilasi lanjut (di Tyr-925) dan

pembentukan PTK kompleks diaktifkan (Gambar 8.17). The terfosforilasi FAK,

residu Tyr-925, sekarang mengikat protein SHC adaptor, yang mengikat GRB-2 dan

mengaktifkan jalur Ras (lihat Bagian 8.2.3.1). Hal ini dapat berfungsi untuk

meningkatkan sinyal dari faktor pertumbuhan reseptor dan hasil aktivasi

berkepanjangan MAP kinase (ERK). Sinyal berkelanjutan memastikan perkembangan

dari Pergi ke G1 dan masuk ke dalam siklus sel.

8.4 LAMPIRAN

8.4.1 Homolog Jalur pada Drosophila, Elegans Caenorhabditis, dan MAMALIA

Bagian ini menjelaskan bagaimana studi genetik dengan Drosophila dan

Caenorhabditis elegans memiliki memberikan kontribusi terhadap penemuan Ras

sinyal jalur transduksi operasi dalam sel mamalia.

8.4.1.1 Pengembangan fotoreseptor di Lalat Buah Drosophila

Melanogaster Para mata majemuk serangga terbentuk dari susunan heksagonal

unit-unit kecil, atau ommatidia (dalam Kasus lalat buah, sekitar 800 "mata kecil").

Masing-masing terdiri dari delapan sel fotoreseptor

Gambar 8.18 Mutasi pada mata ± ada tujuh. Peristiwa yang menyebabkan

perkembangan sel R7 pada mata dari drosofila telah memberikan kunci untuk

memahami perjalanan jalur reseptor PTKs. Gen bertindak sebagai aliran dari tujuh

reseptor yang diungkapkan oleh skrining untuk mutasi yang mempengaruhi

perkembangan sel R7. Mata dibangun dari ommatidia, delapan kelompok sel

fotoresptor masing-masing ditutupi oleh lensa tunggal. Gambar tersebut menjelaskan

anatomi dasar dari unit ommatidial tunggal dalam bagain membujur. Bagian a, b, dan

c ditunjukkan pada bagian melintang di sebelah kanan. Karena dua dari sel, R7 dan

R8 tidak memperpanjang unit ommatidial, bagain melintang b dan c hanya

mengungkapkan tujuh sel, tidak semua delapan sel. (Adapted from Dickson and

Hafen, Curr. Opin. Genet. Dev., 4, 64Ŕ70, 1994.)

(R1 Ŕ R8) dan 12 sel lainnya. Atas dasar morfologi, pola akson, dan sensitivitas

spektral, sel-sel reseptor dapat dibagi menjadi tiga fungsiona : R8 yang pertama kali

muncul diikuti oleh R1 hingga R6 dan kemudian R7. Pigmen fotosensitif berada

dalam microvillus tumpukan membran rhabdomer. Rhabdomer lebih besar dari R1 ke

R6 disusun trapesium sekitar rhabdomer R7 dan R8, rhabdomer R8 terletak dibawah

rhabdomer R7 (gambar 8.18). Perkembangan R7 memberikan produk dari dua gen.

Kerugian mutasi dari fenotip yang dihasilkan adalah salah satu dari gen ini

mengalami identik, R7 gagal memulai pembangunan saraf (fly menjadi Ŗsevenlessŗ).

Mutasi ini mudah dideteksi dalam tes perilaku. Mengingat pilihan antara hijau dan

ultraviolet (UV), normal (WT) fly akan bergerak cepat menuju sumber UV.

Kegagalan untuk membangun sel R7, sel fotoreseptor terakhir yang akan

ditambahkan ke cluster ommatidial, berkolerasi dengan kurangnya respon cepat

photothactic, dan tidak bergerak ke arah lampu hijau.

Sementara produk sev hanya diperlukan dalam prekursor R7, fungsi bos harus

dinyatakan dalam pengembangan R8. Kloning mengubah produk bos menjadi

glikoprotein 100-kDa dan memiliki tujuh bentang transmembran dan domain N-

terminal ekstraseluler diperpanjang. Meskipun akhirnya diekspresikan pada semua sel

fotoresptor, pada saat R7 sedang ditentukan hanya hadir pada R8 tertua. Produk dari

gen sev adalah reseptor tirosin kinase protein. Bukti untuk interaksi langsung antara

produk-produk dari kedua gen berasal dari demonstrasi bahwa sel-sel kultur

mengekspresikan produk bos cenderung membentuk agregat dengan sel

mengekspresikan sev.

Diketahui bahwa pengikatan Boss (ligan) ke Sev (kinase reseptor) mengarah

pada aktivasi protein kinase dan pada akhirnya menentukan nasib R7 sebagai saraf

sel. Karena pengurangan dosis gen dari lalat Ras1 mengganggu sinyal oleh Sev, dan

aktivasi Ras1 menyingkirkan kebutuhan untuk bos dan produk gen sev, maka aktivasi

Ras merupakan konsekuensi awal kegiatan Sev. Layar genetik lalat mengungkapkan

konstitutif Sev diaktifkan menyebabkan identifikasi dari dua komponen menengah

jalur ini: Drk (hilir kinase reseptor) dan Sos (anak sevenless) (untuk urutan peristiwa,

lihat Tabel 8.3). Protein Sos menunjukkan homologi substansial dengan ragi CDC25

produk gen, katalis pertukaran nukleotida guanin untuk RAS. Sementara penurunan

dosis gen Drk dan Sos mengganggu sinyal dari pengaktifan Sev konstitutif, tidak ada

efek pada sinyal dari Ras konstitutif diaktifkan. Di jalur aktivasi, menempatkan

fungsi produk Drk dan Sos ke posisi penengah antara Sev dan Ras. Kode gen Drk

untuk protein kecil yang terdiri dari Src homologi domain, dua SH3 domain mengapit

SH2 domain tunggal. Setelah tidak ada aktivitas katalitik sendiri, Drk bertindak

sebagai daptor. Berikatan dengan reseptor tirosin terfosforilasi dan link ke domain

kaya prolin dari Sos.

Gambar 8. 19. Pengembangan vulva di Caenorhabditis elegans. Karena merupakan

struktur yang relatif sederhana, terbentuk dari hanya beberapa sel, vulva yang cocok

untuk analisis genetik dari diferensiasi sel selama perkembangan embrio ini adalah

produk dari hanya tiga garis keturunan sel, keturunan sel p5.p, p6.p, dan p7.p.

Pembangunan diprakarsai oleh sinyal dari jangkar sel yang terletak bersebelahan

dengan p6.p. Ligan, lin-3 (homolog yang EGF), yang diproduksi oleh sel jangkar,

mengikat reseptor Mari-23 (homolog dengan EGF-R) pada permukaan sel p6. P6.p

sel, pada gilirannya, melepaskan sinyal ke tetangganya, p5.p dan p7.p. hal ini

memulai serangkaian kejadian yang melibatkan jalur MAP kinase yang menentukan

nasib sel-sel sebagai komponen dari jaringan vulva.

8.4.1.2 Pengembangan Sel Vulva di Caenorhabditis elegans

Dalam nematoda C.elegans, jalur aktivasi melibatkan autofosforilasi kinase

reseptor tirosin menyebabkan aktivasi GTPase Mari-60, homolog yang Ras. Hal ini

menentukan perkembangan sel-sel vulva. Protein tersebut pertama kali diidentifikasi

dari analisis genetik mutasi mematikan (membiarkan, atau mematikan mutan),

perubahan morfologi dalam pengembangan vulva (sem, atau seks otot mutan), atau

perubahan dalam sel keturunan (lin, atau keturunan mutan). Hal tersebut merupakan

komponen jalur sinyal transduksi-berdasarkan produk disekresikan dari sel jangkar

(Lin-3, kemungkinan besar setara dengan EGF), kinase reseptor tirosin dari sel p5.p (

Let-23), adaptor memiliki SH2 dan SH3 domain (Sem-5) yang mengaitkan dengan

(Sos-seperti) guanin protein pertukaran nukleotida. Hal tersebut membawa pertukaran

sekitar nukleotida Let-3 (Gambar 8.19).

Dalam cacing dan lalat, protein Ras bertindak sebagai saklar yang menentukan

nasib sel. Dalam C. elegans, aktivasi Ras menentukan pembentukan vulva sebagai

lawan hypodermal (kulit) sel (untuk urutan kejadian, lihat Tabel 8.4). Pada

Drosophila fotoreseptor, aktivasi Ras menentukan perkembangan R7 sebagai saraf

sebagai lawan sel kerucut. Dalam kedua kasus, protein Ras mengoperasikan hilir

reseptor tirosin kinase yang diaktifkan oleh interaksi sel-sel.

8.4.1.3 Drosophila, Caenorhabditis elegans, dan Penemuan Pathway Ras di

Vertebrata

Penjelasan dari jalur Ras dalam vertebrata didasarkan pada identifikasi protein

yang memiliki homologi urutan dengan mereka yang hadir di Drosophila dan C.

elegans. Ekspresi atau injeksi protein ini (dan reagen yang sesuai seperti peptida,

antibodi, dll) digunakan untuk mengembalikan atau memodulasi aktivitas jalur ini

dalam sel yang berasal dari mamalia, lalat, atau cacing dan kerugian fungsi dari

bantalan mutasi. Sebuah Grb2 protein vertebrata (faktor pertumbuhan mengikat

reseptor protein 2), kurang aktivitas katalitik tetapi memiliki SH2 dan SH3 domain,

ditemukan mampu memulihkan fungsi dalam kekurangan mutan Sem-5. Selain itu,

Grb2 ditemukan berasosiasi dengan protein yang diakui oleh antibodi yang diajukan

terhadap protein Drosophila, Sos. Dengan cara ini, urutan kejadian menjadi jelas.

Grb2 merupakan protein adapter, menghubungkan tirosin kinase terfosforilasi

reseptor ke penukar nukleotida guanin dalam vertebrata. Mamalia Sos homolog,

hSos, adalah juga merupakan faktor pertukaran nukleotida guanin yang berinteraksi

dengan Ras. Grb2 terdiri eksklusif dari Src homologi domain, satu SH2 diapit oleh

dua SH3 domain. Karena sifat dari interaksi SH3 dengan urutan prolin kaya, ada

kemungkinan bahwa Grb2 dan Sos tetap berhubungan bahkan di bawah kondisi

nonstimulating. Efek utama aktivasi reseptor adalah untuk memastikan rekrutmen

Grb2/Sos kompleks ke membran plasma (untuk urutan peristiwa, lihat tabel 8.4).

TABEL 8.4

Perbandingan Sinyal-Transduksi Persiapan Hilir dari Protein Tyrosine Kinase

Reseptor Spesies dari Tiga Phyla terpisah

Jalur

Spesies

Drosophila

melanogaster

Caenorhabditis

elegans Mamalia

Pembentukan mata Induksi vulva Perkembangbiakan

Ligan Boss Anchorless Cytokines

RTK Sev Let-23 Receptor

Adaptor SH2 Drk Sem-5 Grb2/ Shc

Pengaturan Ras Sos Gap 1 Gap-1 hSos GAP

Ras Dras Let-60 Ras

Raf-1 Draf Lin-45 Raf-1

MEK D-MEK MEK-2 MEK-1

MAP Kinase ERK-A MPK-1 ERK

Faktor transkripsi Sina Lin-31, Lin-1/ Ets P62TCF

, c-jun

8.4.1.4 Kinase MAP di Organisme Lainnya

Persiapan diatur oleh MAP kinase didistribusikan secara luas dan dapat

ditemukan di semua organisme eukariotik. Dalam Saccharomyces cerevisiae, proses

fisiologis diatur oleh MAP kinase termasuk perkawinan, sporulasi, pemeliharaan

integritas dinding sel, pertumbuhan invasif, pertumbuhan pseudohyphal, dan

osmoregulasi. MAP kinase adalah pengatur respon imun dan perkembangan embrio

pada Drosophila. Hal ini juga telah terlibat sebagai regulator dalam jamur lendir,

tumbuhan, dan jamur.

8.4.2 Onkogen, Keganasan, dan Protein Tirosin Kinase

8.4.2.1. Onkogen Viral

Infeksi oleh virus yang membawa onkogen dapat menyebabkan pertumbuhan

sel ganas. Meskipun pertama kali diakui sebagai agen penyebab pada kanker burung

90 tahun yang lalu, untuk sebagian besar abad kedua puluh ada keraguan bahwa

setiap kanker pada manusia telah dimulai dengan cara ini. Bahkan sekarang, hampir

semua informasi di daerah ini mengacu pada hewan bukan manusia, yang menyajikan

sejumlah masalah. Pertama, sebagaimana sudah jelas dalam dekade pertama abad

terakhir, demonstrasi modus penularan virus tergantung pada induksi penyakit

dengan transfer filtrat jaringan dari hewan ke hewan. Beberapa virus hanya menjadi

onkogenik sebagai konsekuensi dari beberapa bagian dan melalui spesies binatang

yang berbeda. Kedua, sementara banyak kanker pada manusia pasti berhubungan

dengan infeksi virus, jauh dari tertentu dalam kebanyakan kasus apakah virus telah

memulai kondisi atau apakah itu hanya kondusif untuk induksi oleh agen lain, seperti

karsinogen kimia. Secara umum, produk transformasi dari onkogen virus berperilaku

seperti mutan terus-menerus diaktifkan protein seluler endogen memiliki peran kunci

dalam regulasi mitogenesis.

TABEL 8.5

Komponen Tyrosine Kinase Signal Transduksi Cascades Apakah Ditemukan

seperti Selular (atau Viral) Onkogen

Reseptor

Protein

Kinase Tirosin

Non Reseptor

Protein

Tirosin

Kinase

Serin /

Theroin

Protein

Kinase

Adaptor

SH2/SH3

Pertukaran

Nukleotida

Faktor GTP

ase

BeK Abl Akt/PKB Crk Bcr H-Ras

Eck Blk Cot Nck Dbl K-Ras

Elk Fgr Mos - Ost N-Ras

Eph Fsp Pim - Tiam -

ErbB Fyn Raf - Vav -

Flg Hck - - - -

Fms Lck/Lyn - - - -

Kit Src - - - -

Met Yes - - - -

Neu - - - - -

Ret - - - - -

TrkA - - - - -

TrkB - - - - -

TrkC - - - - -

8.4.2.2 Onkogen Nonvirus

Tumor tidak disebabkan oleh infeksi virus (misalnya dengan bahan kimia

karsinogen) juga mengekspresikan terus-menerus diaktifkan produk, seperti

onkogenik Ras. Sebagai contoh peran onkogen dalam transformasi sel, bentuk mutasi

dari Ras ditemukan di 40% dari semua kanker pada manusia dan lebih dari pada 90%

karsinoma pankreas. Secara umum, onkogen ini merupakan mutasi gain dari fungsi

gen seluler normal yang terlibat dalam transduksi sinyal dan transkripsi gen.

Sejumlah protein bermutasi beroperasi di tahap awal kinase jalur sinyal transduksi-

tirosin. Sel dapat berubah sebagai konsekuensi dari hipersekresi faktor pertumbuhan,

ekspresi bentuk varian dari reseptor tirosin kinase atau non reseptor tirosin kinase,

berlebih dari SH2/SH3-containing protein adaptor, berlebih dari serin / treonin

protein kinase, atau ekspresi varian GTPases kecil atau protein aksesori mereka. Pada

ujung hilir dari jalur transduksi sinyal, varian faktor transkripsi juga bertindak sebagai

transformator sel ampuh. Meskipun fosforilasi tirosin kinase menyumbang hanya

sekitar 5% dari total aktivitas fosforilasi selular, memiliki posisi kunci dalam banyak

jalur sinyal-transduksi, dan mungkin untuk alasan ini bahwa kejadian gen tersebut

dalam keganasan begitu tinggi. Beberapa contoh diberikan di Tabel 8.5.

8.5 Singkatan

4E-BP eukaryotic initiation factor 4E-binding protein

AKT acutely transforming retrovirus (AKT8)

AP-1 activator protein 1

ATF adenovirus transcription factor (= CREB)

BCR breakpoint cluster region, a GTPase

CD4 cluster of differentiation 4 (antigen typing on leukocytes)

Cdc cycle-deficient cell

CDK cyclin-dependent kinase

Boss bride-of-sevenless

CaMK calmodulin-dependent kinase

Cbl Cas NS-1 B-cell lymphoma

CREB cAMP-responsive, element-binding protein

Crk CT10 regulator of kinase

DAF-16 dauer phenotype

DAG diacylglycerol

Dbl diffuse B-cell lymphoma

Drk downstream of receptor tyrosine kinase

EF-2 elongation factor 2

EGF epidermal growth factor

EIF-4E eukaryotic initiation factor 4E

ERK extracellular signal regulated kinase

EST expressed sequence tag

FAK focal adhesion complex kinase

FKHRL forkhead related-L (forkhead gene promotes terminal as opposed to

segmental development in the Drosophila)

Fos feline osteosarcoma

FRAP FKBP-rapamycin-associated protein

Gab-1 Grb2-associated binder 1

GAP GTPase-activating protein

GRB growth-factor-receptor bound

GSK-3β glycogen synthase kinase 3β

HOG high-osmolarity glycerol

IL-2 interleukin-2

IRS-1 insulin receptor substrate 1

ITAM immunoreceptor tyrosine-based activation motif

JAK janus kinase

JNK Jun N-terminal kinase

Jun avian sarcoma virus 17 (junana, 17 in Japanese)

LAT linker of activated T cells

Lck lymphocyte kinase from murine lymphoma LSTRA cells

Let lethal mutant

Lin lineage mutant

MAP kinase mitogen-activated protein kinase

MAPKAP MAPK-activated protein kinase

MEK MAP kinaseŔERK kinase

MEKK MEK kinase

MHCII major histocompatibility complex II

MKP MAP kinase phosphatase

MLCK Myosin light-chain kinase

Myc myelocytomatosis virus MC29

NGF nerve growth factor

NK natural killer cell

nrPTK nonreceptor protein tyrosine kinase

PAK P21-activated protein kinase

PDGF Platelet-derived growth factor

PDK1 phosphatidyl inositol-dependent kinase 1

PI-3 kinase phosphatidylinositol-3 kinase

PIP2 phosphatidylinositol-4,5-phosphate

PH pleckstrin homology domain

PLC phospholipase C

PKB protein kinase B

PKC protein kinase C

PTB phosphotyrosine-binding domain

PTEN tensin homolog deleted from chromosome 10

PTK protein tyrosine kinase

PYK2 proline-rich protein tyrosine kinase 2

Rac Ras-like C3 substrate (however, it turns out Rac is not a C3 substrate; some

Rho contamination was present in the Rac protein preparations being studied)

Raf rat fibrosarcoma

Ras rat sarcoma

RBD Ras-binding domain

RGD arginineŔglycineŔaspartic acid

Rho Ras homologs

SAPK Stress-activated protein kinase

Sem sex muscle mutant

Sev sevenless

Shc Src homology collagen-like

SH2 Src homology 2

SHIP SH2-domain-containing inositol phosphatase

SIF v-Sis-inducible factor

Sina seven in absentia

v-Sis simian sarcoma virus gene

SLP76 SH2-domain containing leukocyte protein with a molecular weight of

76 kDa

Sos son of sevenless

Src sarcoma

SRE serum-response element

SRF serum-response factor

STAT Signal transducer and activator of transcription

TAK1 TGF-β1-activated kinase 1

TAM tyrosine-based activation motif

TCF ternary complex factor

TCR T-cell receptor

TRE TPA-responsive element

TrkA tyrosine receptor kinase A

TPA 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate

Vav sixth letter in the Hebrew alphabet

ZAP70 zeta-associated protein 70

8.6 Bacaan

Bos, J. L., ras oncogenes in human cancer: a review, Cancer Res., 49, 4682Ŕ4689,

1989.

Cantrell, D. A., T cell receptor signal transduction pathways, Annu. Rev. Immunol.,

14, 259Ŕ274, 1996.

Collins, T. L., Deckert, M., and Altman, A., Views on Vav, Immunol. Today, 18,

221Ŕ225, 1997.

Cooper, J. A. and Howell, B., The when and how of Src regulation, Cell, 73, 1051Ŕ

1054, 1993.

Corvera, S. and Czech, M. P., Direct targets of phosphoinositide 3-kinase products in

membrane traffic and signal transduction [review], Trends Cell. Biol., 8, 442Ŕ6, 1998.

Downward, J., How BAD phosphorylation is good for survival, Nat. Cell. Biol., 1,

E33ŔE35, 1999.

Deller, M. C. and Jones, E. Y., Cell surface receptors, Curr. Opin. Struc. Biol., 10,

213Ŕ219, 2000.

Giancotti, F. G., Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell

cycle progression, Curr Opin. Cell. Biol., 9, 691Ŕ700, 1997.

Gomperts, B., Kramer, I., and Tathan, P., Signal Transduction, Academic

Press/Elsevier, 2002.

Hunter, T., Tyrosine phosphorylation: past, present and future, Biochem. Soc. Trans.,

24(2), 307Ŕ327, 1996.

Kane, L. P., Lin, J., and Weiss, A., Signal transduction by the TCR for antigen, Curr.

Opin. Immunol., 12, 242Ŕ249, 2000.

Kaplan, D. R. and Miller, F. D., Signal transduction by the neurotrophin receptors,

Curr. Opin. Cell. Biol., 9, 213Ŕ212, 1997.

Karin, M., Liu, Z. G., and Zandi, E., AP-1 function and regulation, Curr. Opin. Cell.

Biol., 9, 240Ŕ246, 1997.

Kornfeld, K., Vulval development in Caenorhabditis elegans, Trends Genet., 13, 55Ŕ

61, 1997.

Metzger, H., The receptor with high affinity for IgE, Immunol. Rev., 125, 37Ŕ48,

1992.

Nishizuka, Y., Protein kinase C and lipid signaling for sustained cellular responses.

FASEB J., 7, 484Ŕ496, 1995.

Raff, M., Cell suicide for beginners, Nature, 96, 119Ŕ122, 1998.

Roovers, K. and Assoian, R. K., Integrating the MAP kinase signal into the G1 phase

cell cycle machinery, Bioessays, 22, 818Ŕ826, 2000.

Treisman, R., Regulation of transcription by MAP kinase cascades, Curr. Opin. Cell.

Biol., 8, 205Ŕ215, 1996.

Wymann, M. P. and Pirola, L., Structure and function of phosphoinositide 3-kinases,

Biochim. Biophys. Acta, 1436, 127Ŕ150, 1998.

Bagian V

Reseptor Sebagai Target Farmasi

9. Reseptor sebagai Target Farmasi

James W. Black

ISI

9.1 Reseptor Hormon

9.2 Agonis parsial: Masalah dalam Mendeteksi Perubahan Khasiat

9.3 Nilai Bioassays

9.4 Apakah Bioassays Berharga dalam Penelitian Farmasi ?

9.5 Perancangan Proses Pengembangan Obat

9.6 Me-tooism

9.7 Short-termism

9.8 Kimia Kombinatorial

9.9 Memilih Target untuk Pengembangan Obat

9.1 RESEPTOR HORMON

Tujuan dari penelitian farmasi adalah untuk menemukan dan mengembangkan

bahan baru yang dapat ditandai dengan selektivitas dan spesifisitasnya. Selektivitas

menggambarkan efek khusus pada negara fisiologis atau patologis yang substansi

dapat menghasilkan. Deskripsi ini, seperti hipnotis, hipoglikemik, hipotensi, dan anti-

inflamasi, mungkin seluruhnya empiris, namun, ini tidak menghambat utilitas

terapinya. Dengan demikian, utilitas klinis obat-obatan seperti morfin dan digitalis

didirikan jauh sebelum kami memiliki penjelasan biokimia untuk tindakan mereka.

Spesifisitas, di sisi lain, mengacu pada hipotesis biokimia yang mengklaim untuk

menjelaskan selektivitas suatu zat. Dengan demikian, aktivasi reseptor enkefalin

diusulkan sebagai mekanisme dimana tindakan morfin, dan penghambatan Na+- /K

+-

tergantung ATPase telah diklaim untuk menentukan aktivitas digitalis. Semua jenis

peristiwa biokimia telah digunakan untuk menentukan tindakan obat. Interaksi

dengan enzim, saluran ion, dan transporter membran telah banyak digunakan untuk

menjelaskan tindakan obat. Namun, reseptor farmakologi mungkin merupakan situs

favorit kerja obat yang digunakan dalam model penjelasan kegiatan selektif mereka.

Reseptor adalah istilah yang banyak digunakan dalam biologi: reseptor

sensorik, telereceptors, mechanoreceptors, baroreseptor, kemoreseptor, reseptor T-sel,

dan seterusnya. Sederhananya, reseptor membutuhkan kata sifat atau awalan untuk

menjadi informatif. Seperti digunakan di sini, reseptor merupakan tempat aksi

hormon, neurotransmiter, modulator dari berbagai jenis, dan autocoids. Hingga kini,

tidak ada nama class yang telah disepakati untuk reseptor terkait dengan agen ini,

namun semua agen ini memenuhi perannya sebagai pembawa pesan antar sel. Karena

ini adalah konsep di balik penemuan Bayliss dan Starling dengan sebutan hormon.

Akan lebih mudah untuk berpikir bahwa sekelompok molekul (misalnya, hormon

reseptor) memiliki ciri-ciri yang sama dengan ciri-ciri umum sebagai kelas enzim.

Dengan demikian, enzim menginduksi perubahan kimia dalam substrat sedangkan

dirinya sendiri tidak berubah secara permanen dalam proses, dengan kata lain, mereka

adalah katalis. Dengan cara yang sama, hormon mengubah sifat kimia dari reseptor

yang berhubungan sedangkan dirinya secara kimiawi tidak berubah dalam proses itu,

dengan kata lain, hormon dan bukan reseptor mereka bekerja layaknya katalis.

Dengan demikian, hormon reseptor dengan baik mengenali dan merespon pembawa

pesan konjugasinya. Untuk memudahkan penulisan, ini adalah pengertian kolektif

dimana reseptor akan disebut dalam bab ini.

Hormon, didefinisikan secara luas sebagai pembawa pesan kimiawi, semua

dapat ditandai dengan selektivitas dan spesifisitas mereka. Selektivitas hormon

menggambarkan peran mereka dalam proses regulasi fisiologis dan patofisiologis.

Kekhasan hormon mengacu pada bukti bahwa mereka menghasilkan efek dengan

berinteraksi dengan reseptor protein yang dapat diidentifikasi. Hormon, kemudian,

memiliki obat-kualitas seperti, seperti alam, farmakope fisiologis. Ini adalah ide yang

membuat sistem hormon-reseptor begitu menarik bagi para peneliti farmasi. Ketika

peneliti baru-obat menggunakan kualitas obat-seperti hormon sebagai titik awal,

mereka sudah jauh untuk tujuan menemukan sebuah protodrug dengan selektivitas

dan spesifisitas yang diinginkan.

Selektivitas hormon selalu melibatkan konsep afinitas, Kemungkinan hormon

dan reseptor berinteraksi satu sama lain, dan khasiat, Kekuatan respon yang

menghasilkan hormon yang berasal dari aktivasi reseptor. Konsep-konsep ini

ditetapkan berdasarkan parameter dalam model termodinamika klasik interaksi

hormon-reseptor. Sebagai parameter ini hormon terdefinisi tidak mudah diakses,

bahkan dalam studi radioligand-binding, industry farmakolog biasanya menetapkan

untuk parameter empiris kurva dosis-respons - yaitu, respon maksimum dan dosis

yang dibutuhkan untuk respon setengah-maksimal. Penelitian farmasi modern

didasarkan pada interaksi hormon-reseptor didasarkan pada pengukuran dan

menafsirkan kurva dosis-respons. Targetnya adalah kemampuan untuk memanipulasi

khasiat hormonal seperti yang tersirat dalam kurva dosis-respons. Sebuah fraksi yang

signifikan dari farmakope kontemporer tentang obat yang menyerupai, meningkatkan,

memperpanjang, atau menghapuskan efektivitas hormon.

9.2 Agonis Parsial : MASALAH DALAM MENDETEKSI PERUBAHAN

EFIKASI

Penulis diperkenalkan dengan masalah efikasi dan ekspresi dalam bioassay

dalam beberapa bulan memulai proyek pertamanya dalam penelitian farmasi saat

menggunakan isoprenalin, sepenuhnya berkhasiat analog dari hormon noradrenalin

dan adrenalin, untuk mendorong laju detak jantung hamster yang terisolasi (persiapan

Langendorff) melalui aktivasi β-adrenoreseptor. Segera setelah mulai proyek, analog

dikloro dari isoprenalin, DCI, digambarkan sebagai antagonis dari isoprenalin pada

otot bronkus. Namun, dalam persiapan jantung, kami menemukan bahwa DCI

berkhasiat sebagai isoprenalin sendiri. Selanjutnya, persiapan Langendorff diganti

dengan laju-kontrol persiapan otot papiler hamster. Pada persiapan baru, DCI tidak

memiliki aktivitas agonis tetapi sekarang antagonis kompetitif dari katekolamin.

Pesatnya perkembangan selanjutnya β-Antagonis adrenoreseptor didasarkan pada

pengamatan ini. Jaringan-ketergantungan kemanjuran DCI itu membingungkan, jadi

kami tidak siap untuk pertemuan kedua dengan fenomena tersebut.

Pertemuan kedua terjadi beberapa tahun kemudian ketika laboratorium kami

beralih kepentingan untuk antagonis histamin. Tidak secara in vitro tes untuk

mempelajari sekresi asam lambung perangsang-histamin yang dikenal pada waktu itu,

jadi kami menggunakan perut lumen-perfusi tikus yang sudah dibius (persiapan

Ghosh dan Schild). Analog Histamin Guanidino (IEG) adalah salah satu senyawa

yang pertama diuji. Untuk tujuan praktis, IEG berperilaku seperti agonis yang

berkhasiat sepenuhnya. Beberapa tahun kemudian mengecewakan, ditemukan bahwa

IEG tidak cukup berkhasiat sebagai histamin. ketika IEG didosiskan selama taraf

kesadaran maka respon sekretori maksimal untuk histamin, tingkat kecil

penghambatan terungkap. Pesatnya perkembangan selanjutnya histamin H 2

antagonis reseptor didasarkan pada pengamatan ini. Hal ini akhirnya menemukan

bahwa, persiapan pada uterus tikus yang terisolasi telah digunakan untuk bioassay

skrining, akan segera menunjukkan bahwa IEG kurang ampuh dibandingkan

histamin.

Baik DCI dan IEG sekarang diklasifikasikan sebagai agonis parsial. Agonis

parsial, menurut definisi, merupakan sebuah gambaran komparatif. Ketika zat B tidak

dapat memproduksi sama besar sebagai respon maksimum zat A dalam jaringan

tertentu, dan ketika mereka bisa memperlihatkan hasil efeknya dengan bekerja dalam

reseptor pada populasi yang sama, maka zat B didefinisikan sebagai agonis parsial.

Meskipun begitu, Ini adalah definisi yang sangat terbatas. Pengamatan pertama

dengan DCI dan IEG sekarang umumnya diakui. Ekspresi agonis parsial merupakan

jaringan yang tergantung dalam cara yang sangat sensitif. DCI yang telah

diklasifikasikan sebagai agonis penuh sebagaimana dinilai oleh perubahan denyut

jantung dan sebagai antagonis kompetitif sederhana sebagaimana dinilai oleh

kontraksi otot papiler. Variasi dalam ungkapan efikasi antara analog berkaitan erat

dengan hormon yang bekerja pada jaringan tertentu dan variasi dalam ekspresi

khasiat oleh analog tertentu yang bekerja pada jaringan yang berbeda keduanya

memiliki implikasi praktis dan teoritis.

Kenakin dan Beek menerbitkan sebuah data yang indah yang mengatur

perbandingan kegiatan isoprenalin (diklasifikasikan sebagai agonis penuh) dengan

prenalterol (diklasifikasikan sebagai agonis parsial) pada enam jaringan yang

berbeda. Di seberang jaringan, potensi isoprenalin bervariasi oleh dua perintah besar:

dalam jaringan di mana potensi isoprenalin sangat tinggi, kemanjuran prenalterol juga

sangat tinggi, hampir sama seperti isoprenalin. Dimana potensi isoprenalin rendah,

prenalterol tidak terdeteksi aktivitas agonis dan, memang, sekarang berperilaku

seperti antagonis kompetitif. Dari sudut pandang penelitian farmasi dampaknya jelas.

Cobalah untuk menemukan beberapa jaringan yang akan mengekspresikan Kegiatan

hormon yang menarik. Potensi relatif dari hormon dapat menunjukkan kemungkinan

bahwa jaringan tertentu akan mengekspos efektivitas agonis parsial. Dalam penelitian

farmasi, itu diperlukan pada tahap awal dari proyek berbasis hormon-reseptor untuk

dapat mendeteksi perubahan kecil dalam kemanjuran analog hormon. Sebuah uji

tanpa terlalu banyak amplifikasi diperlukan. Namun, pada tahap selanjutnya dari

proyek (misalnya, bila senyawa telah ditemukan yang berperilaku seperti antagonis

kompetitif sederhana), sistem amplifikasi-efficacy tinggi diperlukan untuk

mendeteksi tanda-tanda aktivitas agonis residual.

Dari sudut pandang teoritis, efektivitas agonis dalam jaringan tergantung pada

rasio antara konsep kepadatan reseptor yang dipahami dan konsep yang jauh lebih

buram dari "semacam faktor penghubung," kemampuan intrinsik reseptor terikat

untuk menghasilkan intraseluler stimulus. Kemungkinan reseptor yang berasal dari

kelas yang sama mungkin memiliki efisiensi penghubung yang berbeda dalam

jaringan yang tidak dapat diabaikan, namun, perbedaan kepadatan ekspresi reseptor

antara jaringan sekarang dikenal dengan baik dan merupakan cara yang paling

menarik untuk menafsirkan keberhasilan dari kebergantungan jaringan. Daya tarik

konsep tersebut tidak hanya karena kesederhanaan namun juga karena menunjuk ke

sebuah cara di mana teknologi baru mengendalikan ekspresi cloning gen reseptor

dapat dimanfaatkan untuk menghasilkan sistem baru untuk mendeteksi dan mengukur

keberhasilan. Meskipun ini sistem ekspresi reseptor baru merupakan perpanjangan

menarik untuk berbagai bioassay, mereka tidak dalam arti pengganti bioassay

tradisional yang didasarkan pada utuh, jaringan terisolasi in vitro.

9.3 NILAI Bioassay

Inti dari penggunaan bioassay jaringan-yang utuh dalam proyek farmasi yang

terkait dengan hormon adalah bahwa Hormon dapat digunakan untuk menyalakan

sejumlah populasi dari reseptor konjugasi dalam konseptual sederhana interaksi

biomolekuler. Jika peristiwa yang terjadi didominasi oleh pengikatan awal interaksi

ini, seperti yang dijelaskan oleh persamaan Hill, kurva dosis-respon persegi panjang

hiperbolik. Sederhana kurva dosis-respons hiperbolik sudah tentu ditemukan dalam

bioassay in vitro, namun berangkat dari kesederhanaannya lebih sering dijumpai.

Kami terus memahami berbagai aktivitas yang dapat menyebabkan kerumitan dari

kurva dosis-respons. Reseptor sendiri bisa menjadi sumber distorsi. Dinamika

ekspresi reseptor dapat memperkenalkan variasi karena internalisasi atau

desensitisasi. Namun, yang paling umum faktor rumit reseptor-dimediasi terjadi

ketika hormon mengaktifkan lebih dari satu populasi reseptor. Pengungkapan reseptor

heterogenitas selalu menarik dan menantang. Masalah yang dihadapi peneliti farmasi

adalah apa yang harus dilakukan tentang penemuan tersebut. Keadaan sekarang ini

adalah bahwa kita harus selalu berusaha untuk menemukan lebih banyak dan lebih

spesifik ligan Namun, ketika hormon mengaktifkan lebih dari satu set reseptor untuk

menghasilkan hasil akhir yang sama, meskipun dengan berbagai proses transduksi, itu

mungkin bisa dibilang lebih bijaksana untuk mencari ligan yang sangat nonselektif.

Ini mungkin cara terbaik untuk mencapai tujuan dari selektivitas yang diinginkan.

Hormon itu sendiri bisa mengenalkan kompleksitas ke bioassay. Banyak

hormon kini harus dilihat dan dipahami bukan sebagai entitas kimia tetapi sebagai

jalur kimia di mana aktivitas hormonal didistribusikan ke sejumlah spesies kimia.

Semakin banyak kita belajar tentang sifat farmakologis dari jalur anggota tubuh,

semakin kita menyadari bahwa masing-masing memiliki gabungan yang sama dan

sifat yang unik. intinya adalah bahwa kita harus berhati-hati tentang apa yang disebut

"hormon" kita memilih untuk menggerakkan bioassay kami. Sebuah jalur reaksi

kimia hormonal dapat berisi serta sumber tenggelam. Metabolisme dan penyerapan

hormon dapat memperkenalkan distorsi signifikan ke bioassay. Semua faktor-faktor

ini meninggalkan sidik jari mereka pada kurva dosis-respon, dan peneliti farmasi

yang mengembangkan bioassay baru harus belajar untuk membaca tanda-tanda.

Sebuah tantangan yang sangat menarik untuk industri farmasi terjadi ketika sel-

sel yang mensintesis hormon, dengan atau tanpa penyimpanan, yang ditemukan pada

jaringan yang sama dengan konjugat reseptor mereka. Sebagai contoh, sel-sel ini

dapat menjadi neuron, sel mast, atau sel enterochromaffin. Kendali pelepasan zat

yang disintesis atau disimpan salah satunya dapat dicapai dengan kimia atau

rangsangan listrik. Bioassay jaringan-yang utuh dalam mode agonis langsung

menawarkan dua kesempatan yang menarik. Pertama, kendala jaringan arsitektur dan

mengarahkan pelepasan zat pada target sel tertentu dengan cara yang tidak mungkin

dapat dicapai oleh hormon menyebar dalam jaringan secara beraturan dari wadah

organ. Kedua, pelepasan tidak langsung dapat menghasilkan gabungan dari

coreleased zat yang berpotensi dapat berinteraksi satu sama lain. Kedua fenomena ini

jelas diakui sekarang dan menawarkan kesempatan kepada peneliti farmasi. Potensi

interaksi pada tingkat pasca-reseptor yang terjadi antara zat pelepasan-terkendali

khususnya menawarkan peluang penting bagi masa depan penelitian obat.

9.4 Apakah Bioassay Penting dalam Riset Farmasi?

Sejauh ini, kami telah meninjau berbagai cara di mana kompleks kurva dosis-

respons jaringan-secara utuh bioassay dapat menjadi hasil, farmakologi yang

dihasilkan, dari dua atau lebih aktivitas yang berinteraksi. Sekarang, jika semua

bioassay tersebut dapat dicapai untuk mengaburkan dan menyamarkan kegiatan yang

mendasari, mereka harus memberikan cara yang lebih baru, tes analitis sederhana

berdasarkan kimia dan biokimia. Namun, keindahan dari bioassay jaringan-yang utuh

adalah bahwa mereka secara analitis mudah dikerjakan; dengan menggunakan

keluarga dari kurva dosis-respon dan model matematika yang sesuai, kompleksitas

yang utuh dari sistem hormon-reseptor dapat, memang, ditafsirkan. Bioassay

memungkinkan mereka untuk dipelajari sebagai sistem dengan cara yang diabaikan

untuk tes biokimia sederhana.

Apakah bioassay jaringan-secara utuh mampu berdiri sendiri, teknologi awal

untuk menemukan obat baru dalam hormon-reseptor-terarah proyek farmasi?

Jawabannya, berdasarkan pengalaman kita sendiri dan banyak bukti diterbitkan, harus

positif, tetapi tanpa diragukan lagi, bioassay secara in vitro yang lambat, sumber daya

intensif, dan mahal dan memerlukan peneliti terampil. Pertanyaan hari ini adalah

tentang apakah kita dapat menghemat tentang bioassay ini atau bahkan

menghilangkannya sama sekali dengan menggunakan layar bahan kimia yang lebih

produktif. Tes Pengikat-radioligand adalah contoh nyata. mereka telah banyak

digunakan di industri selama bertahun-tahun tetapi kita tidak tahu bagaimana

penggunaannya ini dioptimalkan dalam kaitannya dengan bioassay, bahkan setelah

pengalaman pribadi beberapa tahun pengamatan tes pengikat-radioligand berjalan

bersama bioassay untuk kedua gastrin dan reseptor cholecystokinin. setiap senyawa

yang kami telah buat telah dievaluasi dalam kedua jenis uji. Tidak diragukan lagi,

tidak mengherankan, kita memiliki memperoleh lebih banyak informasi tentang

senyawa baru menggunakan bioassay, namun, dalam retrospeksi, bisa kita dihemat

pada bioassay dengan menggunakan tes mengikat untuk memilih senyawa aktif?

Putusan saat ini adalah bahwa kita akan melewatkan beberapa senyawa yang

menarik. Untuk batas tertentu, ini adalah masalah gaya lebih dari taktik. Pada

umumnya, semua senyawa yang dibuat dalam program kami telah dirancang berusaha

untuk menjawab pertanyaan tentang hubungan struktur-aktivitas. Beberapa ribu dolar

telah dihabiskan dalam membuat masing-masing. Akibatnya, evaluasi biologis sepele

jenis biner, 0 atau 1, adalah tidak pantas. Yang dipermasalahkan adalah pertentangan

antara ahli biologi dan ahli kimia untuk belajar memahami dan saling percaya. Hal ini

tidak terlalu banyak karikatur untuk melihat bahwa ahli kimia percaya bahwa setiap

molekul berjuang begitu keras untuk Sifat memiliki yang menarik kalau hanya ahli

biologi akan mengevaluasi dengan cukup baik, ahli biologi, di sisi lain, adalah yakin

bahwa tes nya akan mengungkapkan sifat molekul yang diinginkan jika kimiawan

hanya akan membuat senyawa yang tepat. Berdasarkan pengalaman kami

menunjukan bahwa dibutuhkan setidaknya dua tahun kolaborasi berkelanjutan

sebelum kimia dan biologi benar-benar belajar saling percaya!

9.5 Perancangan Proses Pengembangan Obat

Seorang ahli kimia obat yang terlibat dalam proyek obat hormon-reseptor-

ditargetkan baru tepat di awal. Untuk terlibat, cukup struktur hormon perlu diketahui

untuk memungkinkan semua kemungkinan bentuk molekul yang akan

divisualisasikan oleh model valensi-kawat fisik, oleh ruang-menduduki model nuklir,

atau, saat ini, dengan berbagai simulasi komputerisasi pada komputer. apapun cara

yang dipilih, ahli kimia ini, pada prinsipnya, dalam pikiran mereka selalu berkisar

tentang molekul saat mereka melaksanakan interogasi imajinatif: apa itu tentang

molekul ini yang menarik bagi saya sebagai seorang ahli kimia? Dimana sumber

kemungkinan interaksi noncovalent serta beban reseptor-ion, kepadatan electron pada

karbonil dan gugus amino, sistem pi-elektron, dan sebagainya? Hari ini, ahli kimia

mungkin memiliki tambahan informasi dari modeler molekuler tentang kemungkinan

konformasi. Apapun input ke imajinasi mereka, ahli kimia obat menyaring keluar

pertanyaan pertama tunggal, pertanyaan yang mereka percaya bahwa mereka dapat

mencoba untuk menjawab dengan membuat analog sederhana atau turunan dari

hormon alami. Tentu saja, pertanyaan itu tidak dapat dijawab dengan presisi bedah.

Setiap perubahan yang tepat dalam molekul menghasilkan banyak perubahan lebih

konsekuensial konformasi, dalam distribusi muatan, di bidang listrik, dan sebagainya,

yang memastikan bahwa pertanyaan kimia kemungkinan akan memiliki buram

jawaban biologi pertama kali sekitar.

Jawaban atas pertanyaan para ahli kimia 'disediakan oleh bioassay. Karena ada

pertanyaan harus dijawab, setiap hasil biologis, termasuk (bahkan terutama) bahwa

molekul baru benar-benar tidak aktif, penuh perhatian. Apapun hasilnya, pertanyaan

baru dinaikkan, sebuah inkuisisi baru Senyawa harus dibuat, tes biologis baru harus

dilakukan. Proses berulang-ulang ini, pada prinsipnya, inti dari semua program

hormon-reseptor dari penelitian farmasi tradisional; Namun, dalam prakteknya,

proses tersebut tidak dapat didorong seperti ini sebagai siklus logis tunggal. Berbicara

secara umum, senyawa memakan waktu lebih lama untuk mensintesis daripada

mengevaluasi pada bioassay. Rata-rata, ahli kimia obat akan menghasilkan 15

senyawa target per tahun, sehingga tim ahli kimia biasanya terlibat, bekerja secara

paralel pada bagian dibagi--keluar dari masalah yang dirasakan. Molekul pemodel,

yang juga merupakan bagian dari lingkaran berulang, juga harus bekerja pada ritme

yang berbeda dari baik ahli kimia sintetik atau analis biologis, namun, prinsip

interogatif yang loop selalu bermain.

Selama hidup kita, kita telah menyaksikan kemajuan terus menerus dan luar

biasa dalam teknologi kimia obat, metode analisis kimia, dan kromatografi, tapi yang

paling spektakuler Perubahan terlihat pada sekitar 40 tahun penelitian farmasi berada

dalam pemodelan molekul. industri farmasi telah membuat investasi besar dalam

teknologi pelarian ini. Saya merasakan, meskipun, sejumlah kekecewaan industri

hasil dari investasi ini dan akan setuju bahwa pemodelan molekul belum dramatis

singkat jumlah iterasi loop untuk pergi dari hormon untuk senyawa berbasis hormon

dengan utilitas klinis yang potensial. Namun, ini sama saja dengan kehilangan

intinya. Tiga fitur pemodelan molekul tidak lagi diragukan. Teknologi ini

memungkinkan kita untuk mengatasi masalah, seperti hormon polipeptida yang ada

dimana-mana, yang pasti logis dan imajinatif mungkin 20 tahun yang lalu. Teknologi

terus maju dengan kecepatan yang menakjubkan, kecepatan yang tidak mungkin

tanpa investasi besar sebelumnya. teknologi ini membuat kontribusi yang lebih besar

dan lebih hebat untuk imajinasi kimia sintetis. Sepanjang sebagai model molekuler

yang masih berkaitan, penulis ini adalah pecandu.

9.6 ME-TOOSIM

Logis, imajinatif, dan berulang pendekatan obat baru berdasarkan sistem

hormon-reseptor Pada sketsa di atas berdiri di kontras dengan pendekatan industry

yang kita alami 40 tahun lalu dan ke arah mana industri ini sekarang bergerak secara

kompulsif dengan kecepatan sibuk. Pada masa lalu, penelitian industri dikritik karena

praktek skrining acak dan untuk generasi dari "me-too" obat. Tentu saja, skrining

biologis tidak acak, jauh dari itu, sebagai penyaringan tes dipilih dengan hati-hati

untuk mencerminkan kebutuhan medis yang diidentifikasi. Farmakologi mencoba

untuk mencerminkan pentingnya memenuhi kebutuhan medis dengan menggunakan

paradigma patologi eksperimental untuk skrining tes. Dengan demikian, tes sering

didasarkan pada eksperimen diinduksi hewan patologi seperti steril respon inflamasi

terhadap benda asing seperti kapas, atau terpentin, atau arthritis diinduksi dengan

presentasi antigen-ajudan, atau borok lambung yang diinduksi oleh histamin atau

aspirin, atau kejang-kejang disebabkan oleh leptazol atau listrik, dan sebagainya.

Senyawa yang disaring tidak dipilih secara acak, baik. Mereka dipilih dengan cara,

sistematis, melalui perusahaan terakumulasi koleksi majemuk, database-nya, atau

dengan membunyikan perubahan sistematis dari substituen dalam memimpin molekul

dilambangkan dengan "metil, etil, propil, butil, sia-sia!" Sterilitas intelektual proses

itu bukan karena keacakan tetapi karena kurangnya koneksi yang diperlukan antara

kimia dan bioassay.

Dalam kurung, muatan kritis mee-tooisms juga, saya yakin, salah tempat.

Untuk batas tertentu, Saya bisa menerima muatan komersial mee-tooism. Harga

premium tidak diragukan lagi telah diminta untuk senyawa dengan perbedaan akut

klinis tidak signifikan, tetapi efek samping mulai dikenal lambat, tergantung waktu.

Oleh karena itu, mau tidak mau, obat yang lebih tua memiliki akumulasi lebih banyak

laporan efek samping pada lembar data dan yang lebih baru obat ikut-ikutan dapat

mengayuh oleh manipulator pemasaran sebagai "sama baiknya tapi lebih aman."

Secara pribadi, saya tidak memiliki pandangan yang sinis tentang mee-tooism, dan

ada dua alasan untuk ini. Obat Ikut-ikutan membangun gambaran pikiran yang

menantang bahwa senyawa memiliki struktur kimia yang sangat berbeda tetapi dapat

memiliki sifat farmakologis kongruen. Konsep kelas seperti obat adalah dasar

farmakologi. Kedua, sedangkan struktur kimia yang berbeda memiliki satu fitur yang

sama, mereka sering digunakan dan penting perbedaan profil farmakokinetik dan

toksikologi mereka.

9.7 SHORT-TERMISM

Sebagaimana ditunjukkan, pengembangan program penelitian-reseptor hormon

berbasis telah mengubah semua itu. Logis, imajinatif, berulang pendekatan yang telah

dicat telah terbukti untuk bekerja secara teratur dan andal. Rekor jelas. Jika Anda

mengikuti saran John Locke "mantapkan pikiran anda dalam satu arah, "Anda akan

berhasil, namun, fakta bahwa jumlah iterasi dan tahun itu sepenuhnya akan waktu tak

terduga. Hal ini menjadi masalah yang signifikan, sebagai industri farmasi telah

membiarkan dirinya ditekan menjadi short-termism sebagai penangkal eksponensial

meningkatnya biaya penelitian dan pengembangan, terutama berkat ekstensi untuk

pengawas obat persyaratan dan biaya pengembangan. Akibatnya, tekanan saat ini

semakin cepat, pada apa yang bernama penyaringan throughput tinggi. Potensi untuk

penyaringan throughput tinggi didasarkan pada kemajuan spektakuler dalam

teknologi biologi dan imunologi molekuler dibuat dalam 10 terakhir tahun atau lebih.

Berbagai seluruh prosedur sekarang tersedia yang meliputi kloning gen reseptor

cotransfected dengan gen reporter dalam baris sel atau, dengan kemurnian kimia yang

lebih besar, seperti tes alat tes kedekatan skintilasi, di mana reseptor kimia murni

terikat untuk manik-manik bahwa rumah yang scintillant, sehingga pemecahan

masalahnya sangat jauh. Semua tes ini baru dapat dijalankan seperti robot, dan semua

tes baru ini memiliki persamaan fitur sebagai berikut. Mereka cerdik. mereka adalah

dasar dari kimia dan bukan tes biologis. Mereka sangat produktif tetapi menunjukkan

informasi minimum yang absolut (ada atau tidaknya, 0 atau 1). Pada dasarnya, ini tes

otomatis. Pertanyaan yang penting tidak diminta, sehingga analisis cerdas

dikompromikan. Namun demikian, melakukan hal-produktif, otomatis, menyediakan

tes yang lebih besar, hasil lebih cepat mengarah ke kimiawi?

Pada saat ini, pertanyaan tersebut belum dijawab, tetapi pertanyaan pelengkap

penting juga masih harus dijawab. Dimana senyawa yang berasal dari uji pakan, yang

dapat mengkonsumsi sekitar 2000 atau lebih bahan kimia per minggu? Sumber yang

terlihat adalah inhouse dengan kumpulan senyawa. Perusahaan obat penelitian

berbasis utama sekarang punya tempat antara 0,5 dan 1 juta senyawa di perpustakaan

majemuk mereka. Jadi program penelitian yang dapat assay sekitar 2000 senyawa per

minggu akan tetap diduduki selama setidaknya beberapa tahun hanya bekerja melalui

perpustakaan sendiri. Masalah dengan perpustakaan di rumah adalah bahwa mereka

tidak ensemble secara acak molekul organik terstruktur. Distribusi sangat kental.

Maksud saya bahwa banyak molekul disintesis akan berada di kelompok yang terkait

erat, yang telah disintesis untuk program sebelumnya, sukses serta berhasil. Kecuali

satu irredeemably optimis, ini mungkin tidak menjadi sebuah kolam molekul yang

ideal untuk menjaring pelanggan baru.

9.8 Kimia Kombinatorial

Kelaparan di jantung ini merupakan semangat baru untuk penyaringan

throughput tinggi harus puas dari beberapa sumber dermawan lainnya senyawa baru

untuk skrining. Menukar dengan kontrak atau membeli dengan mengambil alih

perusahaan atau penggabungan pendekatan yang jelas, tetapi harganya sangat mahal,

menawarkan strategi yang terbatas, dan tidak menghindari masalah lumpiness.

Untungnya, kemajuan dalam kimia luar biasa sebagai kemajuan dalam biologi

molekuler dan genetik. kombinatorial kimia adalah nama dari permainan baru.

Saya tidak punya pengalaman pribadi dengan kimia kombinatorial, namun

teknologi untuk membuat sejumlah besar molekul digabungkan ke prosedur seleksi

kimia yang tepat dimulai dengan percobaan laboratorium untuk mempelajari evolusi

molekuler dalam sistem kimia murni. Spiegelman dan rekan kerjanya memulai

dengan fag bakteri, yang salah satu dari empat gen adalah enzim replikase, untuk

membuat salinan dari dirinya sendiri. Mereka menunjukkan bahwa paparan berulang

in vitro RNA virus, replikase tersebut, dan pasokan dari empat nukleotida

menyebabkan urutan RNA yang sama sekali baru dengan peningkatan 15 kali lipat

dalam Tingkat replikasi, mutasi muncul dari kesalahan dalam replikasi. Selanjutnya,

kombinasi metode untuk menginduksi mutasi pada DNA atau RNA, ditambah

langkah berulang amplifikasi dengan PCR (polymerase chain reaction), telah

menyebabkan kemampuan untuk menghasilkan 10 sampai 13 urutan untai tunggal

DNA. Ini kemudian dapat diputar pada kolom yang terikat protein yang tepat. Sebuah

afinitas tinggi ligan DNA untuk trombin ditemukan dengan cara ini. Ketika ahli kimia

organik mengambil alih dari ahli biologi molekular, mereka mengembangkan teknik

untuk menghasilkan perpustakaan dari 106 sampai 107 urutan peptida. Reaksi dan tes

dilakukan pada manik-manik. Teknologi ini memiliki kemajuan dengan

memperkenalkan pengendalian pembangunan urutan ditambah kemampuan untuk

menandai setiap urutan untuk kemudahan identifikasi.

Sintesis urutan peptida terkendala kini telah diikuti oleh kombinasi nonpeptide

molekul. Ketika kendala besar diperkenalkan, produktivitas numerik jatuh, tapi

mungkin proporsi lead meningkat.

Kombinatorial kimia sekarang menjadi kegiatan yang berkembang pesat,

sebagai suatu teknologi, menarik perhatian ahli kimia yang sangat cerdik. Pada saat

ini, mustahil untuk memprediksi di mana teknologi ini akan membawa kita. Kami

tidak tahu apakah beberapa keterbatasan dasar akan diatasi. Pada saat ini, semua

metode dibatasi untuk reaksi biner yang berlangsung mudah. Hal ini berbeda dengan

masalah yang dihadapi seorang ahli kimia sintetik yang ingin membuat molekul

tertentu. Tidak hanya sejumlah langkah berurutan yang diperlukan, tetapi juga banyak

tahapan tuntutan yang membutuhkan kondisi terjadinya suatu reaksi. Dengan

demikian, sulit untuk melihat bagaimana kombinasi kimia dapat, dalam waktu dekat,

menjadi dasar untuk berulang, pendekatan interogatif terhadap hormon-reseptor-ligan

terkait.

Penyaringan throughput tinggi dari database ditambah masukan dari kimia

kombinatorial dirancang untuk menghasilkan lead. Saat aku memahami prosesnya,

lead kemudian akan dikembangkan menggunakan lebih banyak metode konvensional.

Asumsi tampaknya menemukan petunjuk yaitu tingkat-pembatas langkah dalam

proses penemuan obat. Sekarang, saya tidak yakin bahwa itu adalah benar.

Mengembangkan dan mengoptimalkan mengarah ke klinis diuji entitas kimia baru

(NCES, seperti yang disebut dalam industri) biasanya fasenya jauh lebih lambat.

Namun, produktivitas industri, sebagaimana dilihat pada penemuan obat-obatan yang

benar-benar baru, lebih dibatasi oleh pilihan target daripada mengarah pada

penemuan. Perawatan dalam memilih Target adalah titik keputusan yang paling

penting dalam penelitian farmasi.

9.9 SASARAN PEMILIHAN UNTUK PENGEMBANGAN OBAT

Pendekatan pribadi saya kepada target pemilih adalah untuk mencari jawaban atas

enam pertanyaan:

1. Apakah proyek tersebut dapat menyingkirkan angan-angan atau harapan?

2. Apakah titik awal kimia dapat diidentifikasi?

3. Apakah bioassay relevan sudah tersedia?

4. Apakah mungkin untuk mengkonfirmasi defenisi spesifisitas laboratorium pada

manusia?

5. Adalah kondisi klinis relevan dengan spesifisitas ini?

6. Apakah proyek ini juara?

Kriteria pemikiran adalah yang paling penting dari semua. Semua proyek

penemuan obat dimulai dengan keinginan untuk mencegah penyakit atau mengobati

penyakit. Angan-angan mengacu pada kerenggangan dari hubungan yang dirasakan

antara keinginan dan cara yang diusulkan untuk memenuhi itu.Yang paling umum

misalnya hari ini klaim dibuat lagi dan lagi: setelah kita tahu produk gen, maka kita

akan dapat menemukan obat baru. Sejauh ini, belum ada yang menunjukkan bahwa

ini akan disukai atau bahkan mungkin menjadi hal positif. Untungnya, sebagian besar

proyek pengarahan reseptor hormon relatif bebas dari angan-angan sejauh

menemukan ligan yang bersangkutan, meskipun potensi utilitas ligan mungkin akan

fantastis. Untungnya, sekali lagi, sebuah proyek hormon-reseptor memiliki titik awal

kimia, hormon sendiri. Disini, kami cenderung untuk berasumsi bahwa kita tidak

dapat membuktikan bahwa dalam mencari ligan baru berdasarkan pada hormon kimia

kita memberi kesempatan yang adil untuk mempertahankan evolusioner yang berasal

dari selektivitas hormon. Target reseptor hormon juga skor yang baik pada kriteria

bioassay. Sangat sering bioassay mengungkapkan fitur penting dari selektivitas

hormon. Idealnya, deteksi khasiat menawarkan keuntungan: misalnya, dalam

memiliki beberapa bioassay termasuk tes pemilihan ikatan radioligan. Tes didasarkan

pada spesies yang berbeda dapat sangat berharga. Kriteria penting, untuk saya

percaya adalah mengembangkan ligan yang kegiatannya tidak tergantung spesies,

tetapi tergantung prediktor yang paling dapat diandalkan untuk ekstrapolasi manusia.

Dalam memilih target, penting untuk membayangkan bagaimana untuk

menyelidiki ligan baru yang diusulkan pada manusia. Akankah kita bisa, dalam

prakteknya serta pada prinsipnya, untuk mengkonfirmasi selektivitas ligan

sebagaimana didefinisikan dalam eksperimen laboratorium? Ini akan sangat

menantang dalam kaitannya dengan pusat sistem saraf (SSP) dalam pengarahan

senyawa. Namun, sebagian besar hormon, pemancar, dan modulator ditemukan di

otak juga ditemukan dalam usus, jadi mungkin kekhususan ligan CNS dapat

dievaluasi diakhir. Hal ini juga penting sebelum memilih target untuk membayangkan

gangguan klinis apa yang mungkin dieksplorasi oleh ligan tertentu yang baru. Tidak

ada penghakiman komersial harus terlibat pada saat ini. Satu-satunya uji kelayakan.

Untuk obat baru, yang sebelumnya tidak tersedia spesifisitas, banyak bukti

menunjukkan bahwa penilaian komersial jarang berlaku. Ketika obat dikembangkan

dengan modus tertentu dari tindakan, dokter akan memiliki kesempatan untuk

mengeksplorasi gangguan yang tak terduga.

Pertanyaan terakhir ini biasanya memiliki jawaban yang jelas: kebutuhan untuk

juara. Kebutuhan berasal dari pengalaman umum bahwa program penelitian obat

sering melalui periode kebuntuan panjang. Selama periode ini, semangat dan

keyakinan yang diperlukan untuk mencegah keredupan hati dari berhenti.

Buku Pelajaran dari Reseptor Farmakologi

Education

Transcript of Buku Pelajaran dari Reseptor Farmakologi