Bruno Samori, Giuliano Siligardi, Carla Quagliariello, Albrecht L. Weisenhorn, James Vesenka and...

8/3/2019 Bruno Samori, Giuliano Siligardi, Carla Quagliariello, Albrecht L. Weisenhorn, James Vesenka and Carlos J. Bustaman

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 9 0 , p p . 3 5 9 8 - 3 6 0 1 , A p r i l 1 9 9 3B i o c h e m i s t r y

C h i r a l i t y o f DNA s u p e r c o i l i n g a s s i g n e d b y s c a n n i n gf o r c e m i c r o s c o p y( p l a s m i d s )

BRUNO S A M O R f * , G I U L I A N O S I L I G A R D I * , CARLA Q U A G L I A R I E L L O t , ALBRECHT L . W E I S E N H O R N ,J A M E S V E S E N K A , AND C A R L O S J . BUSTAMANTE* D i p a r t i m e n t o d i C h i m i c a a n d t D i p a r t i m e n t o d i B i o l o g i a C e l l u l a r e , U n i v e r s i t d d e l l a C a l a b r i a , 8 7 0 3 0 A r c a v a c a t a d i R e n d e ( C S ) , I t a l y ; I n s t i t u t d ' H i s t o l o g i e ,U n i v e r s i t e P e r o l l e s , C H 1 7 0 0 F r i b o u r g , S w i t z e r l a n d ; a n d l I n s t i t u t e o f M o l e c u l a r B i o l o g y , U n i v e r s i t y o f O r e g o n , E u g e ne , O R 9 7 4 0 3C o m m u n i c a t e d b y I . T i n o c o , J r . , D e c e m b e r 1 7 , 1 9 9 2ABSTRACT R e p r o d u c i b l e i m a g e s o f p B R 3 2 2 p l a s m i dm o l e c u l e s h a v e b e e n r e c o r d e d b y s c a n n i n g f o r c e m i c r o s c o p yu n d e r 1 - p r o p a n o l . M o s t o f t h e p l a s m i d s w e r e f o u n d i n a c o i l e ds t a t e . T h e s u p e r c o i l e d m o l e c u l e s o f o u r s a m p l e s l o o k l i k eb r a n c h e d o r u n b r a n c h e d i n t e r w o u n d s u p e r h e l i x e s . T h i s i sc o n s i s t e n t w i t h a v a i l a b l e e l e c t r o n m i c r o s c o p y d a t a o n c i r c u l a rDN A m o l e c u l e s . B y a p p l y i n g a s t r a t i g r a p h i c a n a l y s i s w h i c ht a k e s a d v a n t a g e o f t h e h e i g h t i n f o r m a t i o n c o n t a i n e d i n t h es c a n n i n g f o r c e m i c r o s c o p y i m a g e s , i t i s p o s s i b l e t o a s s i g n t h ec h i r a l i t y o f t h e l o c a l s u p e r c o i l i n g o f t h e i n d i v i d u a l m o l e c u l e s .U s u a l l y c i r c u l a r DNA m o l e c u l e s o f b a c t e r i a l c e l l s h a v e ad e f i c i e n c y o f d u p l e x t u r n s c o m p a r e d w i t h l i n e a r DNA m o l -e c u l e s o f t h e s a m e l e n g t h . T h i s d e f i c i e n c y c a u s e s a s t r a i n i nt h e d o u b l e h e l i x b e c a u s e o f t h e u n b r o k e n l o o p i n g o f t h e t w op o l y n u c l e o t i d e s t r a n d s . A s a r e s u l t , t h e DNA d o u b l e s t r a n ds u p e r c o i l s i n a r i g h t - h a n d e d f a s h i o n t h a t i s c a l l e d n e g a t i v es u p e r c o i l i n g ( 1 , 2 ) . T h e n e g a t i v e s u p e r h e l i c a l s t r a i n c a n b er e l i e v e d b y t o p o i s o m e r a s e I - m e d i a t e d b r e a k i n g a n d r e j o i n i n go f t h e DNA s t r a n d s ( 3 ) . I n s i d e t h e c e l l , t h e s u p e r c o i l i n g o fDNA i s c o n t r o l l e d b y a d y n a m i c b a l a n c e o f t h e a c t i o n s o ft o p o i s o m e r a s e s ( 4 ) . P o s i t i v e l y s u p e r c o i l e d DNA, f o r e x a m -p l e , h a s b e e n i s o l a t e d f r o m E s c h e r i c h i a c o l i w h e n g y r a s e i si n a c t i v a t e d ( 5 ) . S u p e r h e l i c a l s t r a i n c a n a r i s e a l s o i n l i n e a rDNAs w h e n t h e y a r e p a c k e d a n d f o l d e d i n t o c l o s e d l o o p s o rd o m a i n s ( 6 ) .M o s t o f t h e p r e s e n t k n o w l e d g e a b o u t t e r t i a r y s t r u c t u r e s o fs u p e r c o i l e d DNA h a s come f r o m e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( E M )a n d c o m p u t e r s i m u l a t i o n s . EM l e d t o t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o ft h e s h a p e o f DNA s u p e r c o i l s ( 1 , 7 , 8 ) a n d s h o w e d t h a t c i r c u l a rDNA m o l e c u l e s l o o k l i k e p l e c t o n e m i c ( b r a n c h e d i n t e r -w o u n d ) s u p e r h e l i x e s . C o m p u t e r s i m u l a t i o n s s u p p o r t e d t h e s ed a t a a n d p r o v i d e d a l s o c o m p u t a t i o n s o f m o l e c u l a r d y n a m i c st r a j e c t o r i e s o f t h e f o l d i n g a n d c o i l i n g o f s m a l l p l a s m i d s ( 9 , 1 0 ) .R e p r o d u c i b l e i m a g e s o f u n c o a t e d s u p e r c o i l e d a n d r e l a x e dc i r c u l a r DNA h a v e b e e n r e c e n t l y o b t a i n e d b y s c a n n i n g f o r c em i c r o s c o p y ( S F M ) u n d e r a i r ( 1 1 , 1 2 ) a n d u n d e r 1 - p r o p a n o l( 1 3 ) . T h e s e i m a g e s c o n t a i n t o p o g r a p h i c d a t a o n t h e s u r f a c e o ft h e DNA m o l e c u l e s i m a g e d . H e r e i t w i l l b e s h o w n t h a t , b ya p p l y i n g a s t r a t i g r a p h i c a n a l y s i s w h i c h t a k e s f u l l a d v a n t a g e o ft h e t h i r d - d i m e n s i o n d a t a c o n t a i n e d i n t h e SFM i m a g e s , i t i sp o s s i b l e t o a s s i g n t h e c h i r a l i t y o f t h e l o c a l s u p e r c o i l i n g . T h i sc h i r a l i t y i s d e t e r m i n e d b y i d e n t i f y i n g t h e o v e r l a y a n d u n d e r -l a y o f t h e c r o s s o v e r s o f DNA c h a i n s . T h u s , SFM c a n p r o v i d et h e s h a p e o f s u p e r c o i l e d DNA m o l e c u l e s a n d m o n i t o r t h e i rt o p o l o g y e a s i l y a n d r a p i d l y .

MAT E RIALS AN D M E T H O D SM e t h o d o f P r e p a r a t i o n o f pBR322 P l a s m i d DNA S a m p l e s . Af e w m i c r o l i t e r s o f a 3 0 - , t g / m l s o l u t i o n o f p B R 3 2 2 p l a s m i d

DNA ( S i g m a ) w a s d e p o s i t e d o n t h e s u r f a c e o f f r e s h l y c l e a v e dr u b y m i c a c i r c l e s ( A s h e v i l l e - S c h o o n m a k e r M i c a , N e w p o r tN e w s , VA) ( 1 1 , 1 3 ) . T h e e x c e s s s o l u t i o n was b l o t t e d o f f w i t hf i l t e r p a p e r . A f t e r 1 m i n t h e p l a s m i d o n m i c a w a s r i n s e d w i t ho n l y 1 - 2 d r o p s o f w a t e r , t h e e x c e s s w a s b l o t t e d o f f , a n d t h es u r f a c e w a s t h o r o u g h l y d r i e d w i t h n i t r o g e n g a s .SFM I m a g i n g a n d S t r a t i g r a p h i c A n a l y s i s o f t h e I m a g e s . T h es a m p l e s w e r e i m a g e d w i t h t h e N a n o S c o p e I I I a t o m i c - f o r c em i c r o s c o p e ( D i g i t a l I n s t r u m e n t s , S a n t a B a r b a r a , CA) a tf o r c e s l e s s t h a n 1 n N , u n d e r 1 - p r o p a n o l ( C a r l o E r b a , M i l a n )( 1 1 , 1 3 ) . S i l i c o n n i t r i d e c a n t i l e v e r s w e r e u s e d . T h e t i p s i nt h e s e c a n t i l e v e r s w e r e m o d i f i e d b y a n e l e c t r o n - be a m d e p o -s i t i o n p r o c e s s ( 1 1 , 1 3 , 1 4 ) . T h e s t r a t i g r a p h i c i m a g e a n a l y s i si n v o l v e s a l o o k - u p t a b l e w i t h e i g h t d i s c r e t e c o l o r s d i s p l a y i n ge i g h t d i f f e r e n t h e i g h t l e v e l s . T h e c h i r a l i t y o f t h e s u p e r c o i l i n gw a s t h e n i d e n t i f i e d f o r e v e r y w e l l - d e t e c t a b l e l o o p o f c o i l e dDNA b y c h a n g i n g t h e o f f s e t o f t h e h e i g h t u n t i l t h e i m a g es h o w e d u n a m b i g u o u s l y w h i c h a r m o f t h e l o o p was a b o v e t h eo t h e r a t t h e c r o s s i n g p o i n t .

R E S U L T SM o s t o f t h e p l a s m i d s w e r e f o u n d i n a c o i l e d s t a t e . E x a m p l e so f r e l a x e d m o l e c u l e s c a n b e s e e n i n F i g . 1 A a n d B . M o s t o ft h e s u p e r c o i l e d m o l e c u l e s e x h i b i t e d b r a n c h e d i n t e r w o u n ds h a p e s ( F i g . 1 B a n d C ) . U n b r a n c h e d s u p e r c o i l s w i t h e x -t e n d e d l o n g s h a p e s , e i t h e r f u l l y i n t e r w o u n d o r l o c a l l y u n -w o u n d i n t o l o o p s o f v a r i a b l e s i z e s , w e r e a l s o o b s e r v e d ( F i g .1 A a n d D ) . S e v e r a l u n c o i l e d m o l e c u l e s s h o w e d k i n k s a n db e n d s i n t w i s t e d - c i r c l e c o n f i g u r a t i o n s , l i k e t h o s e s u g g e s t e db y t h e c o m p u t a t i o n s i n r e f . 1 0 t o b e t r a n s i t i o n s t a t e s f r o mr e l a x e d t o s u p e r c o i l e d f o r m s .T h e m e t h o d i n v o l v e s o b t a i n i n g f i r s t a l o w - r e s o l u t i o n o v e r -v i e w i m a g e ( F i g . 1 A ) w h e r e t h e i n d i v i d u a l m o l e c u l e s o f t h es a m p l e c a n b e i d e n t i f i e d . A m o l e c u l e i s t h e n s e l e c t e d f o rf u r t h e r a n a l y s i s ( F i g . 1 B - D ) . F i g s . 2A a n d 3 A s h o w t w oc o i l e d m o l e c u l e s e x h i b i t i n g w e l l - d e t e c t a b l e l o o p s . N o n e t h e -l e s s , t h e s e i m a g e s h a r d l y a l l w u n a m b i g u o u s a s s i g n m e n t o ft h e c h i r a l i t y o f t h e s u p e r c o i l i n g b y s i m p l e i n s p e c t i o n . T h i sa s s i g n m e n t c a n b e m a d e w i t h t h e s t r a t i g r a p h i c a n a l y s i s . F i g s .2 a n d 3 s h o w ho w t h i s a p p r o a c h w a s a p p l i e d t o t w o w e l l -d e t e c t a b l e l o o p s o f t h e m l e c u l e s i m a g e d . A s d e s c r i b e da b o v e , t h e m e t h o d i n v o l v e s . o d i n g t h e h e i g h t i n f o r m a t i o n i nt h e i m a g e s , s o t h a t d i f f e r e n t r e g i o n s o f t h e i m a g e s a t t h e s a m eh e i g h t c a n b e i d e n t i f i e d . F i r s t t h e f u l l l o o p u n d e r i n v e s t i g a t i o ni s d i s p l a y e d i n a s i n g l e c o l o r . T h i s i s s h o w n i n F i g . 2 B , w h e r eb o t h a r m s o f t h e l o o p s a r e p i n k . T h i s c o l o r i s t h e n s h i f t e d u pa n d d o w n , a l o n g t h e v e r t i c a l a x i s , u n t i l t h e i m a g e s h o w su n a m b i g u o u s l y w h i c h a r m o f t h e l o o p i s a b o v e t h e o t h e r a t t h ec r o s s i n g p o i n t . I n F i g . 2 C , o n s h i f t i n g u p t h e p i n k c o l o r w i t hr e s p e c t t o F i g . 2 B , o n l y o n e a r m o f t h e l o o p b e c o m e sA b b r e v i a t i o n : SFM, s c a n n i n g f o r c e m i c r o s c o p y .t T o w h o m r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .

3 5 9 8

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 0 ( 1 9 9 3 ) 3 5 9 9A

1 Am

B 2 0 0 nm C--R c 2 0 0 nm D 2 0 0 nm0 _ _ _ q

F I G . 1 . O v e r v i e w SFM i m a g e o f p B R 3 2 2 p l a s m i d DNA m o l e c u l e s i m a g e d u n d e r 1 - p r o p a n o l ( A ) s h o w s t h a t o n e c a n c l e a r l y i d e n t i f y r e l a x e do r i n t e r w o u n d m o l e c u l e s a n d c h o o s e t h e m o l e c u l e o n w h i c h t o zoom i n ( B - D ) .i n t e r r u p t e d a n d c l e a r l y r e v e a l s t h a t t h i s a r m i s b e l o w t h eo t h e r a t t h e c r o s s i n g p o i n t . T h e l o o p i s t h e r e f o r e r i g h t - h a n d e da n d c o r r e s p o n d s t o a n e g a t i v e s u p e r c o i l ( 1 ) a s i l l u s t r a t e d b yt h e s k e t c h i n F i g . 2 . By f o l l o w i n g t h e s a m e a p p r o a c h , an e g a t i v e s u p e r c o i l i n g w a s a l s o i d e n t i f i e d f o r t h e m o l e c u l e i nF i g . 3 .O n l y n e g a t i v e s u p e r c o i l s w e r e f o u n d i n t h i s i n v e s t i g a t i o n .

DISCUSSIONI t h a s b e e n s h o w n r e c e n t l y t h a t i m a g i n g u n d e r 1 - p r o p a n o lp r o v i d e s t h e h i g h e s t s p a t i a l r e s o l u t i o n i n S F M , w h i c h m i g h tb e l i m i t e d o n l y b y t h e d i m e n s i o n o f t h e s t y l i u s e d ( 1 3 ) . Weh a v e i m a g e d m o l e c u l e s o f p B R 3 2 2 p l a s m i d DNA u n d e r t h es a m e s o l v e n t .T h e i m a g e s i n F i g . 1 c l e a r l y s h o w t h a t t h e SFM c a n , j u s tb y i n s p e c t i o n , p r o v i d e , a s d o e s EM, t h e o v e r a l l s h a p e o f t h ei n d i v i d u a l m o l e c u l e s o f t h e s a m p l e . T h e s u p e r c o i l e d m o l e -c u l e s o f o u r s a m p l e s l o o k l i k e b r a n c h e d o r u n b r a n c h e di n t e r w o u n d s u p e r h e l i x e s . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h EM d a t a o nc i r c u l a r DNA m o l e c u l e s w h o s e s i z e i s c o m p a r a b l e t o t h a t o ft h e m o l e c u l e s i n v e s t i g a t e d b y u s ( 1 , 7 , 8 ) . We f o u n d a l s ou n b r a n c h e d s t r u c t u r e s t h a t w e r e n o t o b s e r v e d i n t h e EMs t u d y o f r e f . 8 . On t h e o t h e r h a n d , i n s p i t e o f t h e l o wr e s o l u t i o n o f t h e i m a g e , u n b r a n c h e d s t r u c t u r e s s e e m t o b ep r e s e n t a l s o i n t h e EM i m a g e o f f i g u r e 1 i n r e f . 1 . EM a n dSFM t h e r e f o r e p r o v i d e a c o i n c i d e n t p i c t u r e o f t h e m o l e c u l a rs h a p e o f s u p e r c o i l e d DNA. I n a d d i t i o n , SFM e n a b l e s t h e u s e rt o a s s i g n t h e l o c a l c h i r a l i t y o f t h e t e r t i a r y s t r u c t u r e s . T o r o i d a ls t r u c t u r e s t h a t w e r e s u g g e s t e d o n t h e b a s i s o f x - r a y s c a t t e r i n gm e a s u r e m e n t s ( 1 5 ) w e r e n o t s e e n i n t h e s e s t u d i e s .T h e l i n k i n g d e f i c i t o f c l o s e d c i r c u l a r DNA i s p a r t i t i o n e db e t w e e n t h e c h a n g e s i n t h e s u p e r c o i l i n g s t a t e ( w r i t h i n g ) a n dt h e c h a n g e i n t h e h e l i c a l p i t c h ( t w i s t i n g ) ( 1 , 2 ) . A r i g o r o u sd e t e r m i n a t i o n o f w r i t h i n g , a n d i n p a r t i c u l a r o f i t s s i g n ( i . e . , o f

t h e s u p e r c o i l i n g c h i r a l i t y ) , r e q u i r e s k n o w l e d g e o f t h e s t r u c -t u r e o f t h e m o l e c u l e s i n t h r e e d i m e n s i o n s . B o l e s e t a l . ( 7 )d e v e l o p e d a n a p p r o a c h t o d e t e r m i n e t h e w r i t h i n g a n d t w i s t i n go f t h e m o l e c u l e s b y u s i n g b o t h g e o m e t r i c a l p a r a m e t e r s p r o -v i d e d b y EM i m a g e s a n d p a r a l l e l e l e c t r o p h o r e t i c d e t e r m i n a -t i o n s o f t h e l i n k i n g d e f i c i t o f t h e s u p e r c o i l s . I n t h e RecAp r o t e i n - c o a t i n g t e c h n i q u e f o r d e t e r m i n i n g DNA t o p o l o g y ,k n o t t e d o r c a t e n a t e d d o u b l e - s t r a n d e d DNA i s f i r s t c o n v e r t e dt o a t o p o l o g i c a l l y e q u i v a l e n t s i n g l e - s t r a n d e d f o r m , b e c a u s ec o m p l e t e r e a c t i o n b e t w e e n d u p l e x DNA a n d t h e p r o t e i n i sd i f f i c u l t t o a c h i e v e . T h e b i n d i n g o f RecA p r o t e i n t o s i n g l e -s t r a n d e d DNA y i e l d s a t h i c k c o a t i n g t h a t , w h e n s h a d o w e d ,i m p r o v e s t h e EM v i s u a l i n f o r m a t i o n s o much a s t o p e r m i t t h ei d e n t i f i c a t i o n o f t h e o v e r l a y a n d u n d e r l a y o f t h e c h a i n c r o s s -o v e r ( 1 6 , 1 7 ) . DNA d e n a t u r a t i o n p r e v e n t s a p p l i c a t i o n s o f t h i sm e t h o d t o s t u d i e s o f p l a s m i d s u p e r c o i l i n g .F i g s . 1 A - D , 2 A , a n d 3 A s h o w t h a t t h e p r e s e n t r e s o l u t i o no f SFM p r o v i d e s c l e a r i d e n t i f i c a t i o n o f t h e m o l e c u l a r s h a p eo f s u p e r c o i l e d DNA b u t d o e s n o t a l l o w d i r e c t d e t e r m i n a t i o no f t h e w r i t h i n g . T h e s t r a t i g r a p h i c a n a l y s i s d e s c r i b e d h e r ep e r m i t s e a s y , f a s t a s s i g n m e n t o f t h e l o c a l c h i r a l i t y o f t h es u p e r c o i l i n g .G e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 1 8 , 1 9 ) c a n r e s o l v e DNA t o p o i s o m e r st h a t d i f f e r i n l i n k i n g n u m b e r b y + 1 . P o s i t i v e a n d n e g a t i v et o p o i s o m e r s c a n b e r e s o l v e d i n t o d i s t i n c t s p o t s o n l y b y at w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e t i c m e t h o d . T h i s r e s o l u t i o n i sa c h i e v e d i n t h e s e c o n d d i m e n s i o n b y u s i n g i n t e r c a l a t i n ga g e n t s t o m o d i f y t h e o r i g i n a l s u p e r c o i l i n g o f t h e t o p o i s o m e r s .H o w e v e r , t h e s e e l e c t r o p h o r e t i c a s s i g n m e n t s a r e f o r a v e r a g et o p o l o g i c a l s t a t e s o f t h e DNA r i n g / l o o p p o p u l a t i o n , w h e r e a st h e h e i g h t i n f o r m a t i o n c o n t a i n e d i n t h e SFM i m a g e c a n b eu s e d t o a s s i g n t h e l o c a l c h i r a l i t y o f t h e s u p e r c o i l i n g i ni n d i v i d u a l m o l e c u l e s .T w o m a i n c o n c e r n s m u s t b e a d d r e s s e d i n c o n n e c t i o n w i t ht h e r e s u l t s p r e s e n t e d h e r e . T h e f i r s t i s a b o u t t h e i n t e r w o u n d

B i o c h e m i s t r y : S a m o r f e t a l .


3/4

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 0 ( 1 9 9 3 )A

100 nm

B C

( a )F I G . 2 . S t r a t i g r a p h i c a n a l y s i s o f t h e i m a g e . T h e r e s o l u t i o n o f t h i s i m a g e ( A ) d o e s n o t a l l o w d i r e c t d e t e r m i n a t i o n o f t h e c h i r a l i t y o f t h em o l e c u l a r w r i t h i n g . T h e h e i g h t i n f o r m a t i o n c o n t a i n e d i n t h i s i m a g e i s c o d e d b y t h e s e t o f e i g h t d i s c r e t e c o l o r s s h o w n i n t h e s c a l e i n t h e c e n t e ro f t h e f i g u r e . F i r s t t h e f u l l l o o p i s d i s p l a y e d b y t h e p i n k c o l o r ( B ) . T h i s c o l o r i s t h e n s h i f t e d u p ( C ) a n d t h e l o w e r arm b e c o m e s i n t e r r u p t e d . O n e

c a n t h e r e f o r e d i r e c t l y d r a w t h e s k e t c h s h o w n a t t h e b o t t o m , w h i c h c o r r e s p o n d s t o a r i g h t - h a n d e d c h i r a l i t y - i . e . , t o a n e g a t i v e s u p e r c o i l i n g .s h a p e o f t h e p l a s m i d s i n SFM i m a g e s . M o l e c u l e s l o s i n g t h e i rd i f f u s i o n a l f r e e d o m c a n b e f o r c e d , a s t h e y b i n d t o t h e m i c as u r f a c e , t o a s s u m e s h a p e s o t h e r t h a n t h o s e t h e y a s s u m e i na q u e o u s s o l u t i o n . T h e o n l y a r g u m e n t t o d i s r e g a r d t h i s c o n -c e r n i s t h e g o o d m a t c h i n g o f t h e m o l e c u l a r s h a p e s o b s e r v e di n SFM a n d EM . T h e m e t h o d s o f d e p o s i t i o n a n d t h e s u b -s t r a t e s a r e v e r y d i f f e r e n t i n SFM a n d EM, a n d i t s e e m st h e r e f o r e v e r y u n l i k e l y t h a t t h e s a m e a r t i f a c t s a r e c a u s e d b yt h e t w o t e c h n i q u e s .T h e s e c o n d c o n c e r n i n v o l v e s t h e u s e o f p r o p a n o l a s t h ei m a g i n g e n v i r o n m e n t i n t h e s e s t u d i e s . P r o p a n o l i s a d e h y -d r a t i n g a g e n t . W h i l e d e h y d r a t i o n o f DNAm a y h e l p e x p o s e i t sm o l e c u l a r s u r f a c e t o t h e p r o b i n g t i p , i t c a n a l s o c a u s ea g g r e g a t i o n ( 1 8 ) o r l o c a l c h a n g e s i n t w i s t . Y e t t h e m o l e c u l e ss h o w n i n F i g s . 1 - 3 a r e n o t a g g r e g a t e d , a n d c o n d e n s e d f o r m s( t o r o i d s , f i b e r s , e t c . ) h a v e n o t b e e n f o u n d i n t h i s s t u d y . T h eu n t w i s t i n g w h i c h p r o p a n o l c o u l d c a u s e , a s d o e s e t h a n o l a n dg l y c e r o l ( 2 0 ) , w o u l d m a n i f e s t i t s e l f a s c h a n g e s i n w r i t h e .I n c r e a s i n g a m o u n t s o f u n t w i s t i n g c o u l d c a u s e t h e n a t i v en e g a t i v e s u p e r c o i l i n g o f p B R 3 2 2 ( 1 9 ) t o b e u n w o u n d u n t i l i t sc h i r a l i t y i s r e v e r s e d ( 2 1 ) . Y e t o n l y n e g a t i v e s u p e r c o i l s w e r ef o u n d i n t h i s i n v e s t i g a t i o n . On t h e o t h e r h a n d t h e p o s s i b l ee f f e c t s o f p r o p a n o l c a n n o t b e k e p t u n d e r c o n t r o l o r r u l e d o u ti n t h e s e s t u d i e s . We u s e d p r o p a n o l b e c a u s e i t e n a b l e s o n e t oo b t a i n t h e h i g h e s t SFM r e s o l u t i o n . T h e u s e o f p r o p a n o li m p r o v e d t h e v i s u a l i n f o r m a t i o n s o much a s t o p e r m i t a c l e a rd e m o n s t r a t i o n t h a t SFM c a n m o n i t o r e a s i l y a n d r a p i d l y t h el o c a l c h i r a l i t y o f i n d i v i d u a l s u p e r c o i l e d m o l e c u l e s . F o r no wi t i s i m p o s s i b l e t o g e t s t a b l e i m a g e s o f p l a s m i d s o n m i c a u n d e r

w a t e r . P r o p a n o l , h a v i n g a l o w d i e l e c t r i c c o n s t a n t ( 1 3 ) , d o e sn o t s c r e e n , a s d o e s w a t e r , t h e e l e c t r o s t a t i c f o r c e s h o l d i n g t h em o l e c u l e s o n t h i s s u b s t r a t e . H o w e v e r , a s t e c h n i q u e s o f DNAd e p o s i t i o n a n d a t t a c h m e n t t o s u b s t r a t e s u r f a c e s a r e d e v e l -o p e d t h e s a m e s t r a t i g r a p h i c m e t h o d d e s c r i b e d h e r e c o u l d b er e a d i l y a p p l i e d t o SFM i m a g i n g u n d e r a q u e o u s e n v i r o n m e n ta s w e l l .I n c o n c l u s i o n , t h i s i n v e s t i g a t i o n d e m o n s t r a t e s t h a t S F M ,b e s i d e s p r o v i d i n g c l e a r i d e n t i f i c a t i o n o f t h e s h a p e s o f i n d i -v i d u a l c o i l e d p l a s m i d m o l e c u l e s , p e r m i t s t h e d i r e c t a s s i g n -m e n t o f t h e l o c a l c h i r a l i t y o f t h e s u p e r c o i l i n g . T h e t e c h n i q u ei s v e r y e a s y a n d f a s t . T h i s f i n d i n g o p e n s t h e p o s s i b i l i t y o ft a i l o r i n g e x p e r i m e n t s i n w h i c h o n e c a n d i r e c t l y m o n i t o r l o c a lm o d u l a t i o n s o f t h e s u p e r c o i l i n g d e p e n d i n g u p o n l o c a l s e -q u e n c e s , p o s i t i o n o f p r o m o t e r s , o r v e c t o r i a l t r a c k i n g o fm a c r o m o l e c u l a r c o m p l e x e s a l o n g DNA ( 2 , 2 2 - 2 7 ) . T h i s t e c h -n i q u e c o u l d a l s o b e p a r t i c u l a r l y u s e f u l i n f o l l o w i n g c o n v e r -s i o n f r o m n e g a t i v e t o p o s i t i v e s u p e r c o i l e d s t a t e s w h i c h w e r er e p o r t e d t o c h a r a c t e r i z e h i g h l y t r a n s c r i b e d g e n e s ( 2 6 ) .

T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y C o n s i g l i o N a z i o n a l e d e l l e R i c e r c h eP r o g e t t o F i n a l i z z a t o B i o t e c n o l o g i a e B i o s t r u m e n t a z i o n i a n d C o m i -t a t o B i o t e c n o l o g i e e B i o l o g i a M o l e c o l a r e , b y t h e H e l m u t - H o r t e n -S t i f t u n g ( A . L . W . ) , a n d t h e S c h w e i z e i r i s c h e N at i o n a l f o n d s 3 1 -3 3 7 5 3 . 9 2 ( A . L . W . ) .1 . B a u e r , W. R . , C r i c k , F . H . C . & W h i t e , J . L . ( 1 9 8 0 ) S c i . Am . 2 4 3 ,1 0 0 - 1 1 3 .2 . D r l i c a , K . ( 1 9 9 0 ) T r e n d s G e n e t . 6 , 4 3 3 - 4 3 7 .3 . G e l l e r t , M . ( 1 9 8 1 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 3 0 , 8 7 9 - 9 1 0 .

3 6 0 0 B i o c h e m i s t r y : S a m o r l ' e t a l .


4/4

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 0 ( 1 9 9 3 ) 3 6 0 1A

B

1 0 0 nm

C

F I G . 3 . S t r a t i g r a p h i c a n a l y s i s o f t h e i m a g e o f a n e g a t i v e l y c o i l e d p l a s m i d l i k e t h a t i n F i g . 2 ( s e e l e g e n d t o t h a t f i g u r e ) .4 . F r a n k - K a m e n e t s k i i , M . ( 1 9 8 9 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 3 3 7 , 2 0 6 .5 . L o c h s h o n , D . & M o r r i s , D . R. ( 1 9 8 3 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 1 , 2 9 9 9 - 3 0 1 7 .6 . W o r c e l , A . & B u r g i , E . ( 1 9 7 2 ) J . M o l . B i o l . 7 1 , 1 2 7 - 1 4 7 .7 . B o l e s , T . C . , W h i t e , J . H . & C o z z a r e l l i , N . R . ( 1 9 9 0 ) J . M o l . B i o l . 5 4 ,9 3 1 - 9 5 1 .8 . A d r i a n , M . , t e r H e g g e l e r - B o r d i e r , B . , W a h a l i , W . , S t a s i a k , A . Z . &D u b o c h e t , J . ( 1 9 9 0 ) EMBO J . 9 , 4 5 5 1 - 4 5 5 4 .9 . K l e n i n , K . V . , V o l o g o d s k i i , V . , A n s h e l e v i c h , V . V . , D y k h n e , A . M . &F r a n k - K a m e n e t s k i i , M . D . ( 1 9 9 1 ) J . M o l . B i o l . 2 1 7 , 4 1 3 - 4 1 9 .1 0 . S c h l i k , T . & O l s o n , W. K . ( 1 9 9 2 ) J . M o l . B i o l . 2 2 3 , 1 0 8 9 - 1 1 1 9 .1 1 . B u s t a m a n t e , C . , V e s e n k a , J . , T a n g , C . L . , R e e s , W . , G u t h o l d , M . &K e l l e r , R . ( 1 9 9 2 ) B i o c h e m i s t r y 3 1 , 2 2 - 2 6 .1 2 . H e n d e r s o n , E . ( 1 9 9 2 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 2 0 , 4 4 5 - 4 4 7 .1 3 . H a n s m a , H . G . , V e s e n k a , J . , S i e g e r i s t , C . , K e l l e r m a n , G . , M o r r e t t , H . ,S i n s h e i m e r , R . L . , E l i n g s , V . , B u s t a m a n t e , C . J . & H a n s m a , P . K . ( 1 9 9 2 )

S c i e n c e 2 5 6 , 1 1 8 0 - 1 1 8 4 .1 4 . K e l l e r , D . & C h i h - C h u n g , C . ( 1 9 9 1 ) S u r f . S c i . 2 5 3 , 3 5 3 - 3 6 4 .1 5 . B r a d y , G . W . , F e i n , D . B . , L a m b e r t s o n , H . , G r a s s i a n , V . , F o o s , D . &B e n h a m , C . J . ( 1 9 8 3 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 0 , 7 4 1 - 7 4 4 .

1 6 . W a s s e r m a n , S . A . , D u n g a n , J . M. & C o z z a r e l l i , N . R. ( 1 9 8 5 ) S c i e n c e2 2 9 , 1 7 1 - 1 7 4 .1 7 . W a s s e r m a n , S . A . & C o z z a r e l l i , N . R . ( 1 9 8 6 ) S c i e n c e 2 3 2 , 9 5 1 - 9 6 0 .1 8 . L e e , C . H . , M i z u s a w a , H . & K a k e f u d a , T . ( 1 9 8 1 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i .US A 7 8 , 2 8 3 8 - 2 8 4 2 .1 9 . W u , H . - Y . , S h y y , S . , W a n g , J . C . & L i u , L . F . ( 1 9 8 8 ) C e l l 5 3 , 4 3 3 - 4 4 0 .2 0 . H u e y , R . & M o h r , S . C . ( 1 9 8 1 ) B i o p o l y m e r s 2 0 , 2 5 3 3 - 2 5 5 2 .2 1 . W a r i n g , M . ( 1 9 7 0 ) J . M o l . B i o l . 5 4 , 2 4 7 - 2 7 9 .2 2 . R a h o u m i , A . R. & W e l l , R . D . ( 1 9 8 9 ) S c i e n c e 2 4 6 , 3 5 8 - 3 6 3 .2 3 . P e c k , L . J . & W a n g , J . C . ( 1 9 8 3 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 0 ,6 2 0 6 - 6 2 1 0 .2 4 . L i u , L . F . & W a n g , J . C . ( 1 9 8 7 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 4 ,7 0 2 4 - 7 0 2 7 .2 5 . Z h a n g , H . , J e s s e e , C . B . & L i u , L . F . ( 1 9 9 0 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A8 7 , 9 0 7 8 - 9 0 8 2 .2 6 . L e e , M . - S . & G a r r a r d , W. T . ( 1 9 9 1 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 8 ,9 6 7 5 - 9 6 7 9 .2 7 . M c C l e l l a n , J . A . , B o u b l i k o v a , P . , P a l e c e k , E . & L i l l e y , D . M . J . ( 1 9 9 0 )P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 7 , 8 3 7 3 - 8 3 7 7 .

B i o c h e m i s t r y : S a m o n ' e t a l .

Bruno Samori, Giuliano Siligardi, Carla Quagliariello, Albrecht L. Weisenhorn, James Vesenka and...

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