UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA DE CIENCIAS PROFESOR PATROCINANTE: DR. CARLOS D. FIGUEROA V. INSTITUTO DE HISTOLOGIA Y PATOLOGIA FACULTAD DE MEDICINA BRADICININA Y LIS-Des-[Arg9]-BRADICININA INDUCEN LA EXPRESION DE MOLECULAS DE ADHESION CELULAR ICAM-1 Y ELAM-1 EN CELULAS ENDOTELIALES HUMANAS EN CULTIVO Tesisdegradopresentadacomo partedelosrequisitosparaoptaral gradodeLicenciadoenCiencias Biolgicas MARCELO NICOLAS AGUILAR CARTES VALDIVIA CHILE 2007 A mi hijo Matas AGRADECIMIENTOS Enprimerlugarquisieraagradeceramiprofesorpatrocinante,Dr.Carlos Figueroa Valverde, quien con su constante apoyo, conocimientos y confianza me ayudo yguienlarealizacindeestatesis.AgradezcotambinaPamela,quientuvola paciencia y la disposicin de guiarme en el laboratorio. TambinagradeceralosDrs.MiguelConchayAlejandraVidal,ademsdetodosmiscompaerosdelaboratorioyalpersonaldelInstitutodeHistologay Patologa. FinalmentequierodarlelasgraciasamisPadresyamipololaClaudiapor haberme apoyado constantemente. Esta tesis fue financiada por el proyecto FONDECYT 1030258 I INDICE DE CONTENIDOS Pgina INDICE I INDICE DE FIGURAS IV 1. RESUMEN1 SUMMARY 3 2. INTRODUCCION4 2.1 Sistema Calicrena-Cinina4 2.2 Receptores de Cininas 5 2.3 Receptores de cininas en clulas endoteliales6 y su rol en inflamacin 2.4 Molculas de adhesin celular 7 2.4.1Molcula de adhesin intercelular-1 (ICAM-1) 7 2.4.2Selectina E o molcula de adhesin del endotelio 8 al leucocito-1 (ELAM-1)2.5 Objetivos9 3. MATERIALES Y METODOS 13 3.1 Cultivo de clulas endoteliales humanas EA.hy92613 3.1.2 Efecto de la concentracin de agonistas B1 y B2 sobre la 14 expresin de ICAM-1 3.1.3Efecto de la concentracin de agonistas B1 y B2 y del tiempo 15 de estimulacin sobre la expresin de ELAM-1 II 3.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida, electrotransferencia15 e inmunotincin de electrotransferidos 3.2.1Separacin de protenas por (SDS-PAGE) 15 3.2.2Preparacin de geles de poliacrilamida al 10%16 3.2.3Preparacin de geles de poliacrilamidaal 6% 16 3.2.4Electrotransferencia de protenas a membranas de Inmobilon P 16 3.2.5Inmunoreveladode electrotransferidos17 3.3 Inmunocitoqumica18 3.4 Anlisis de imagen y grficos19 4. RESULTADOS 20

4.1Expresin de receptores B1 y B2 de cininas en clulas 20 endoteliales EA.hy926 4.2 La expresin de ICAM-1 depende de la concentracin22 de LDBK y BK4.3 La expresin de ELAM-1 depende de la concentracin y del 24 tiempo de estimulacin con LDBK y BK 4.4 Evaluacin de laexpresin de ICAM-1 yELAM-1 mediante28 inmunocitoqumica 4.4.1ICAM-128 4.4.2ELAM-1 30 III 5. DISCUSION 32 5.1 Expresin de receptores B1 y B2 de cininas en clulas 32 endoteliales EA.hy9265.2 Las cininas BK y LDBK inducen la expresin de ICAM-1 33 5.3 Inmunolocalizacin de ICAM-134 5.4 BK y LDBK inducen la expresin de ELAM-135 5.5 Inmunolocalizacin de ELAM-1 36 6. BIBLIOGRAFIA38 IV INDICE DE FIGURAS Pgina Figura 1: Secuencia de acontecimientos leucocitarios en la inflamacin. 10 Figura 2: Estructura de la molcula de adhesin intercelular-1 (ICAM-1)11 Figura 3: Estructura de la molcula de adhesin del endotelio12 al leucocito-1 (ELAM-1) Figura 4: Inmunolocalizacin de receptores B1 y B2 de cininas en clulas21 endoteliales EA.hy926 en cultivo. Figura 5: Expresin de ICAM-1 en clulas endoteliales en cultivo EA.hy926, 23 estimuladas con dosis variables de TNF, BK y LDBK. Figura 6: Expresin de ELAM-1 en clulas endoteliales EA.hy926, estimuladas25 con dosis variables de TNF, BK y LDBK. Figura 7: Cintica de expresin de ELAM-1 en clulas endoteliales EA.hy926, 27 estimuladas con TNF yBK porperiodos variables de tiempo. Figura 8: Inmunolocalizacin de ICAM-1.29 Figura 9: Inmunolocalizacin de ELAM-1. 31 11. RESUMEN Enlosprocesosinflamatorioslasmolculasdeadhesincelular,ICAM-1y ELAM-1 cumplen un rol fundamental en el rodamiento, adhesin y transmigracin del leucocito al endotelio activado por mediadores inflamatorios como TNF, IL-1 e IFN, entremuchosotros.Lascininassonpptidosbiolgicamenteactivosconunaalta actividad pro-inflamatoria y por lo tanto podran regular la expresin de estas molculas en el endotelio. Para determinar el efecto de las cininas sobre la expresin de ICAM-1 y ELAM-1, se estimularon cultivos confluentes de clulas endoteliales EA.hy926 con agonistas del receptorB2(bradicinina,BK)yB1 (Lis-des-[Arg9]-bradicinina,LDBK).BKprodujoun aumentoenlaexpresindeICAM-1,dependientedelaconcentracindelpptido, siendo mxima con BK 100 nM. El agonista B1 tambin provoc un aumento de ICAM-1,perolarespuestafuediferenteyaqueelmximodeexpresinseprodujoal estimular las clulas con LDBK 1 nM disminuyendo cuando se us LDBK 100 nM. Por suparte,elincrementoenlaexpresindeELAM-1fueproporcionalalaumentode concentracin de BK o LDBK, alcanzndose el mximo a una concentracin 100 nM de cadapptido.ELAM-1presentunaexpresinmximaentrelas3y6hpost-estimulacin con BK, mantenindose al menos por 24 h. ICAM-1 y ELAM-1 presentaron unadistribucinvariableenlaclula,inmunolocalizndosetantoenlamembrana celularcomoenelcitoplasma.Nuestrosresultadosdemuestranquelascininas,va receptoresB1 yB2,regulanlaexpresindemolculasadhesincelularICAM-1y 2ELAM-1enclulasendotelialesencultivounhechoquepuedetenerimportantes implicancias para el desarrollo de una inflamacin aguda. 3SUMMARY Duringinflammation,thecellularadhesionmolecules,ICAM-1andELAM-1 executeafundamentalroleintherolling,adhesionandtransmigrationofleukocytes throughtheendotheliumactivatedbyinflammatorymediatorslikeTNF,IL-1and IFN. Kinins are biologically active peptides with a high pro-inflammatory activity that as such could regulate the expression of these molecules by the endothelium. In order to determine the effect of kinins on the expression of ICAM-1 and ELAM-1, confluent cultures of endothelial cells EA.hy926 were stimulated with specific agonist of the B2 (bradykinin, BK) or B1 (Lys-des-[Arg9]-bradykinin) receptors. BK produced an increase in the expression of ICAM-1 that was dependent on the peptide concentration, being maximal at 100 nM. The B1 agonist also produced an increase of ICAM-1, but the response was different since the maximal expression took place when stimulation was performed with 1 nM LDBK. The increase in ELAM-1 expression was proportional to the concentration of BK or LDBK used. The maximal response was reached at a 100 nM of eachpeptide.ELAM-1presentedamaximalexpressionbetween3and6hpost-stimulation with BK, staying at high levels of expression for 24 h. ICAM-1 and ELAM-1 presentedavariabledistributioninthecell,immunolocalizingbothonthecell membrane and in the cytoplasm. Ours results demonstrate that kinins, by activating B1 or B2 receptors, regulate the expression of the cellular adhesion molecules ICAM-1 and ELAM-1 in endothelial cells kept in culture. 42. INTRODUCCION 2.1 Sistema Calicrena-Cinina Las calicrenas son un grupo de serinas proteasas que se encuentran en clulas especficasyfluidosbiolgicos.Estasenzimassedividenendosgrandesgrupos: tisulares y plasmtica. Las calicrenas tisulares forman una familia de 15 protenas entre lascualesseencuentranlacalicrenaverdadera(hk1)yelantgenoprosttico especfico(PSAohk3).Lacalicrenaplasmticaparticipaenelensambledelos distintoscomponentesqueinicianlacoagulacinyenespecialdurantelafasede activacin por contacto a superficies cargadas negativamente. La principal accin de las calicrenasplasmticaytisularhk1esliberarpptidosvasoactivosconocidoscomo cininas,queparticipanenunaseriedeprocesosbiolgicostalescomorelajacindel msculolisovascular(hipotensin),incrementodelapermeabilidadvascular, contraccindelamusculaturalisadelrbolbroncopulmonarydolor.Estafamiliade pptidoscomprendelaliberacindebradicinina,poraccindecalicrenaplasmtica sobre el ciningeno de alto peso molecular y adems la liberacin de Lis-Bradicinina, por accin de calicrena tisular hk1 sobre ciningeno de bajo peso molecular (Bhoola y col.1992;Blaisycol.2000;Leeb-Lundbergycol.2005).Unavezproducidas,las cininassoninactivadasrpidamenteporcarboxi-yendo-peptidasasdenominadas cininasaspresentesenlasangreytejidos.Lascininasasmsimportantessonla enzimaconvertidoradeangiotensinaI(ECA)yendopeptidasaneutra(NEPo encefalinasa).LascarboxipeptidasasremuevenlaArg9delamolculadecinina, 5mientrasqueECAyNEPliberaneldipptidoPhe8-Arg9.LaECApuedehidrolizar adicionalmente el enlace Phe5-Ser6 (Erdos, 1979; Gafford y col. 1983). 2.2 Receptores de Cininas Losefectosbiolgicosproducidosporlascininasimplicanlaactivacinde receptoresespecficoslocalizadosenlasuperficiedecadaclulablanco.Los receptores de cininas han sido denominados B1 y B2 de acuerdo a la potencia relativa delosdistintosagonistas(RegoliyBarab,1980;BurchyKyle,1992;Hall,1992; Wohlfart y col. 1997; Figueroa y col. 2001). Ambos receptores de cininas pertenecen a la superfamilia de receptores que poseen 7 dominios transmembrana y estn acoplados aprotenaG.Estosdifierenensuestructuraprimaria,regulacindesuexpresiny distribucinenlostejidos(McEachernycol.1991;Menkeycol.1994).Estudios farmacolgicos y mtodos de clonamiento han permitido establecer y reconocer que el receptorB2esdetipoconstitutivoyactivadoporbradicinina(BK)yLis-bradicinina (LBK), mientras que el receptor B1 es generalmente sobre-expresado en diferentes tipos celularesporlipopolisacridosocitoquinascomointerleuquina-1beta(IL-1)yes activadopordes-[Arg9]-bradicinina(DBK)ydes-[Arg9]-Lis-bradicinina(LDBK), originadosporlaaccindecarboxipeptidasassobrebradicininayLis-bradicinina, respectivamente(Bhoolaycol.1992).Sehandesarrolladoantagonistasparaambos tiposdereceptorescomodes-[Arg9]-Leu8-bradicininaparaelreceptorB1yHOE140 para el receptor B2 (Wirth y col. 1991). Se ha consensuado que la mayor parte de los efectosbiolgicosproducidosporlascininassonmediadosporelreceptorB2yque 6bajo condiciones de inflamacin o dao tisular hay induccin del receptor B1 (Marceau y col. 1998). 2.3 Receptores de cininas en clulas endoteliales y su rol en inflamacin Ambosreceptoresdecininashansidodemostradosenclulasendoteliales;la activacin del receptor B2 conduce a un incremento del Ca2+ intracelular, produccin de xido ntrico y prostaciclina (Schini y col. 1990). En la linea celular CPAE, se demostr la presencia de receptores midiendo los niveles de Ca2+ intracelular y la liberacin de xidontrico(Smithycol.1995).Wohlfartycol.(1997)demostraronqueambos receptores de cininas, B1 y B2 median el incremento del cGMP intracelular en cultivos primarios de clulas endoteliales de bovino. Tambin existe evidencia de receptores de cininasenelsistemacardiovascular,ascomo,enclulasendotelialesdeaorta (Colden-Stanfield y col. 1987; Mendelowitz y col. 1992). Lascininasparticipanenetapasespecficasdelainflamacin(Bhoolaycol. 1992; Bockmann y Paegelow, 2000; Couture y col. 2001). Todos los signos cardinales y sntomas de la inflamacin son observados cuando las cininas son inyectadas en la piel. Primero,haydolordebidoalaestimulacindeterminalessensorialesdelafibras-C, seguidoporlaliberacindelasustanciaP,lacualsesumaalainflamacin neurognica.Luego,hayunaxnquemediaelreflejoinflamatoriocausadoporuna vasodilatacinlocalyunincrementodelapermeabilidadvascular,ademsdeuna extravasacindeprotenasyfluidos,queresultaenlaformacindeunedemalocal. Posteriormente, la estimulacin de cininas libera citoquinas desde monocitos, atrayendo leucocitos al sitio de inyeccin (Bhoola y col. 1992). Una particularidad importante de las 7cininas es liberar citoquinas como IL-1 y TNF (Tiffany y Burch, 1989) y la generacin de algunos segundos mensajeros como prostaglandina y leucotrienos, formados por la activacindefosfolipasaA2.ElreceptorB2estligadoalossignoscardinalesdela inflamacinqueincluyenaumentodelapermeabilidadvascular,venoconstriccin, dilatacinarteriolarydolorconunaparticipacinlimitadaenrelacinconel reclutamientocelularenelsitioinflamado.ElreceptorB1promueveeltrficode leucocitos sanguneos, edema y dolor durante la inflamacin (Couture y col. 2001).En los procesos inflamatorios la adhesin y transmigracinde leucocitos estn determinadas por la fijacin de molculas complementarias de adhesin a la superficie delosleucocitosyclulasendoteliales(comounallaveyunacerradura),ytanto mediadores qumicos, factores quimiotcticos como ciertas citoquinas influyen en estos procesos, modulando la expresin de las molculas de adhesin en la superficie celular (Robbins, 1994) (Fig. 1). 2.4 Molculas de adhesin celular 2.4.1 Molcula de adhesin intercelular-1 (ICAM-1) La molcula de adhesin ICAM-1 es una glicoprotena de transmembrana, que se expresa en leucocitos, endotelio y epitelios (Stanley y col. 2000). Est compuesta de cincodominiossemejantealasinmunoglobulinas,poseeunasolareginde transmembranayuncortodominiocitoplasmtico(Wertheimerycol.1992)(Fig.2); est constitutivamente presente en bajos niveles en la superficie de la clula endotelial, sin embargo, ciertos mediadores inflamatorios como IL-1, TNF, IFN y LPS, adems del neuropptido sustancia P pueden estimular la expresin de esta molcula (Quinlan y 8col. 1998; Wertheimer y col. 1992). Estudios previos indican que pptidos vasoactivos comoangiotensinaIItambinpuedenregularlaexpresindeICAM-1enclulas endoteliales derivadas de la vena umbilical humana (HUVECS) (Pastore y col. 1999). ICAM-1 presenta una cintica de expresin mxima entre las 24 y 48 h, y un mnimo de expresin entre las 4 y 6 h post-estimulacin con TNF o LPS (Silverman y col. 2001). ICAM-1promuevelafirmeadhesindelleucocitoalendotelioysumigracin transendotelialdurantelainflamacin.Larutademigracindelleucocitopuedeser transcelular y paracelular (Stanley y col. 2000; Yang y col. 2005). ICAM-1 interacciona conlasintegrinasdelosleucocitos,principalmentelasintegrinas 2 LFA-1yMac-1 (CD11a/CD18 y CD11b/CD18) (Blease y col. 1999). LFA-1 se une a los dominios 1 y 2 de ICAM-1, mientras que el ligando Mac-1 se une al dominio 3. Stanley y col. (2000), demostraron que el dominio 2 de ICAM-1 no une directamente al ligando LFA-1, pero contribuye a mantener la unin entre el dominio 1 de ICAM-1 y el ligando LFA-1. 2.4.2 Selectina E o molcula de adhesin del endotelio al leucocito-1(ELAM-1) La molcula de adhesin ELAM-1 esuna glicoprotena de transmembrana que seexpresasloenelendotelio(BevilacquayNelson,1993).Estcompuestaporun extremoamino-terminalquereconocecarbohidratos,dominiocaractersticodelas lectinasdependientesdeCa2+(tipo-C),undominiorelacionadoconelfactorde crecimiento epidrmico, secuencias cortas repetidas, un dominio de transmembrana y una cola citoplasmtica (McEver y col. 1996) (Fig. 3). ELAM-1 media el rodamiento y la adhesindeleucocitosalendotelioactivadoporcitoquinas(Bochnerycol.1991; Abbassiycol.1993;Ulfmanycol.1999;ForlowyLey,2001).Invitro,elcultivo 9endotelial expresa ELAM-1, despus de haber sido estimulado con citoquinas como IL-1,TNFoendotoxinasbacterianas(Bevilacquaycol.1987).ELAM-1presentauna cintica de expresin mxima entre las 4 y 6 h post-estimulacin con citoquinas o LPS, declinando rpidamente a niveles basales donde el mnimo de expresin es detectado a las24h(Ambergerycol.1997).Estudiospreviosindicanquepptidosvasoactivos como endotelina-1 tambin regulan la expresin de ELAM-1 en clulas endoteliales de arteriacoronariahumana(Fernandez-Patrnycol.2001).ELAM-1seasociacon oligosacridos,estructuradimricaLewisXsialiladaylactosaminafucosilada,las cuales son expresadas en monocitos y neutrfilos circulantes, adems de un pequeo porcentaje de linfocitos sanguneos. Otro ligando deE-selectina es la protena Lewis A sialilada,quesehadetectadoenclulascancerosas,sugiriendounposiblerolde ELAM-1 en la metstasis (Bevilacqua yNelson, 1993).Por lo tanto, el objetivo general de esta tesis es investigar si las cininas inducen o nolaexpresindemolculasdeadhesincelularICAM-1yELAM-1enclulas endoteliales en cultivo. 2.5 Objetivos LosobjetivosdelpresenteTrabajodeTesissonutilizarclulasendoteliales humanas en cultivo de la lnea EA.hy926 para determinar: a) el efecto de agonistas de receptores B1 y B2 sobre la expresin de ICAM-1; b) el efecto de los mismos agonistas sobre la expresin de ELAM-1. 10 Fig 1. Secuencia de acontecimientos leucocitarios en la inflamacin. En primer lugar, losleucocitosruedanymstardesedetienenyseadhierenalendotelio,para despusefectuarlatransmigracinatravsdelauninintercelular,atravesarla membrana basal y migrar hacia los factores quimiotcticos localizados en la zona de lesin.SehacetambinunaindicacindelospapelesquedesempeanICAM-1y ELAM-1, adems de los agentes activadores. Modificado de Miller, (2002) 11 Fig.2.Estructuradelamolculadeadhesinintercelular(ICAM-1).Cinco dominios semejantes a inmunoglobulinas, un dominio de transmembrana y una cola citoplasmtica. Modificado de Bevilacqua y Nelson, (1993). 12 Fig.3.Estructuradelamolculadeadhesindelendotelioalleucocito (ELAM-1).Undominiolectina,undominiorelacionadoconelfactorde crecimientoepidrmico,seissecuenciascortasrepetidas,undominiode transmembra y una cola citoplasmtica. Modificado de Bevilacqua y Nelson, (1993). 133. MATERIAL Y METODOS 3.1 Cultivo de clulas endoteliales humanas EA.hy926 Clulas endoteliales humanas de la lnea EA.hy926 (1x106), gentilmente donadas por la Dra. C.J .S. Edgell (Edgell y col. 1983), fueron cultivadas en botellas de 25 cm2 con medio Eagle Dulbecco modificado 1,8 mM Ca2+ (DMEM, Gibco) suplementado con hipoxantina,aminopterinaytimidina(HAT)(Gibco),10%suerofetaldebovino(SFB; Gibco),1%penicilinaG-estreptomicina(Gibco),1%Fungizonayglutamina200mM (Sigma) a 37C en atmsfera hmeda y 5% CO2. Este medio de cultivo fue denominado DMEM-HAT.Lasclulasconfluentes(aproximadamentealos3das)fuerontratadas con tripsina 0,25%-EDTA 1mM por 3 min y recuperadas con lavados en medio Hanks-10% SFB. Las clulas fueron contadas y la viabilidad determinada por exclusin de azul de tripano. Posteriormente fueron sembradas en placas de 30 mm en una proporcin de 3x105clulasporplacayenportaobjetosdecultivo(Lab-TekChamberSlideTM System)enunaproporcinde3x104 clulasporpocillo,ysedejaronenelmismo medio de cultivo DMEM-HAT por 3 das. 143.1.2 Efecto de la concentracin de agonistas B1 y B2 sobre la expresinde ICAM-1 CuandolasclulasalcanzaronlaconfluenciaselesremovielmedioDMEM-HAT-10% SFB y se mantuvieron 12 h en medio DMEM-HAT sin SFB. Posteriormente, el mediofueretiradoylasclulasfueronestimuladaspor6hcondiferentes concentraciones de BK (Bachem)y LDBK (Sigma), diluidas enmedio base sin SFB. Adems se utiliz TNF (10 ng/ml) (Roche) como estmulo conocido (control positivo). Finalizada la estimulacin se retir el medio y la reaccin se detuvo a 4C y agregando 100 ul de tampn modificado de radioinmunoprecipitacin (RIPA) [Tris-HCl 50 mM, pH 7.4; NaCl 150 mM; Nonidet P-40 1%; EDTA 1 mM; EGTA 1 mM], suplementado con una mezcla de inhibidores p-nitrofenilfosfato 250 g/ml; PMSF 200 mM; aprotinina 5 mg/ml, leupeptina 5mg/ml y pepstatina 1 mg/ml; NaF 200 mM; Na3VO4 200 mM. Las clulas fueron luego raspadas con una esptula de tefln policeman de 15 cm (Chemeware, USA) y transferidas a tubos de poliestireno de 1,5 ml (Axygen, USA). Una vez en los tubos,lasclulasfueronsonicadasdurante5-10segenhieloysemidila concentracindeprotenastotalesen10ldecadaextracto,segnelmtodode Bradford (1976), a una longitud de onda de 595 nm. Como blanco se utiliz 10 l de tampnRIPAms1mldelreactivodeBradford.Lasprotenasfueronseparadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 10% con dodecil sulfato de sodio y -mercaptoetanol (SDS-PAGE), el cual ser descrito posteriormente. 153.1.3 Efecto de la concentracin de agonistas B1 y B2 y del tiempo de estimulacin sobre la expresin de ELAM-1 Las clulas endoteliales crecidas bajo idnticas condiciones fueron estimuladas condiferentesconcentracionesdeambospptidospor6h,deacuerdoconlos protocolos ya descritos. Cuando se analiz el efecto de la concentracin, se estimul las clulasdurante3,6,12y24haunaconcentracinde100nMdelpptido correspondiente.TambinseutilizTNFcomocontrolpositivo.Posteriormentelas clulas fueron homogenizadas con tampn RIPA como se describi anteriormente en el punto 3.1.2 y las protenas fueron fraccionadas por SDS-PAGE al 6%. 3.2 Electroforesis en geles de poliacrilamida, electrotransferencia e inmunotincin de electrotransferidos 3.2.1 Separacin de protenas por SDS-PAGE TodaslaselectroforesisserealizaronsegnelmtododeLaemli(1970)con algunasmodificaciones.Cadaunadelasmuestrassemantuvoa-20Cenigual volumen de tampn de muestra 2x [Tris 0,06 M; glicerol 10% p/v; 2-mercaptoetanol 0,5 %v/vySDS4.6%p/v]utilizndoseencadacaso,unvolumendemuestra correspondiente a la cantidad de protenas necesaria para cada ensayo. Las muestras y elestndarpreteidodeprotenasdemasamolecular:118,84,47,33,26y18kDa fueron hervidas por 3 min, enfriadas y colocadas en los respectivos surcos del gel. Los minigeles(ancho100mm,alto65mmyespesor1,5mm)fueronpreparadosy montados en placas de vidrio con espaciadores de tefln. La corrida electrofortica se realizentampnTris0,02M,glicina0,05MySDS0,1%.Unavezcargadaslas 16muestras,lasprotenasfueronseparadasaunvoltajeconstantede100Vpor aproximadamente 2 h y 30 min. 3.2.2 Preparacin de geles de poliacrilamida al 10% Gelseparador(10%): Tampn inferior (Tris-HCl 1,5 M pH 8,3; SDS 0,4%) 1,8 ml; solucin de acrilamida al 30% (acrilamida 29,2% y bisacrilamida 0,8%) 2,4 ml; agua destilada, 3,0 ml; persulfato de amonio al 10% 19 l y Temed 15 l. Gelespaciador: Tampn superior (Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; SDS 0,4%) 0,94 ml; solucin de acrilamida al 30%, 0,6 ml; agua destilada, 2,2 ml; persulfato de amonio al 10%, 20 l y Temed 10 l. 3.2.3 Preparacin de geles de poliacrilamida al 6% Gel separador (6%): Tampn inferior (Tris-HCl 1,5 M pH 8,3; SDS 0,4%) 1,8 ml; solucindeacrilamidaal30%(acrilamida29,2%ybisacrilamida0,8%)1,5ml;agua destilada, 3,9ml; persulfato de amonio al 10% 18,8 l y Temed 15 l. Gel espaciador: Tampn superior (Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; SDS 0,4 %) 0,94 ml; solucin de acrilamida al 30%, 0,6 ml; agua destilada, 2,2 ml; persulfato de amonio al 10%, 20 l y Temed 10 l. 3.2.4 Electrotransferencia de protenas a membranas de Inmobilon P La transferencia se llev a cabo utilizando el mtodo de Towbin y col. (1979) con algunasmodificaciones.Unavezhechalaelectroforesissecolocsobreelgeluna membrana de Inmobilon Pque fue previamente sumergida en metanol absoluto por 1715 seg y luego equilibrada en tampn de transferencia [Tris 0,02 M, glicina 0,15 M, y metanol al 20%] por al menos 5 min. Estando la membrana sobre el gel, se cubrieron conpapelfiltroyesponjaporamboslados,losquehabansidopreviamente humedecidosentampndetransferencia.Luegosecolocaronenunacmarade electrotransferencia,orientandolamembranahaciaelpolopositivodelcircuito.La transferencia se realiz a 50 mA por 15 h usando el tampn antes mencionado. Una vez terminadoesteproceso,lamembranafueseparadadelgelysecadadurante30min para su posterior incubacin con los anticuerpos respectivos. Cada gel fue lavado con aguadestiladaparaluegoteirlasprotenasconazuldecoomasiepor20min.El colorante no unido a las protenas se elimin lavando el gel con agua destilada. Este procedimiento tuvo por objeto verificar una migracin homognea de las protenas y la eficiencia de su transferencia a la membrana de Inmobilon P. 3.2.5 Inmunorevelado de electrotransferidos CadamembranadeInmobilonPsedejsecarpor30mina37C,paraluego incubarlas con los respectivos anticuerpos en PBS 1x conteniendo Tween-20 al 0,05% y BSA 1%. Se utilizaron anticuerpos monoclonales anti-ICAM-1 humana (R&D Systems) a una dilucin de 0,5 ug/ml y anti-ELAM-1 humana (R&D Systems) a una dilucin de 1 g/ml.Laincubacinconcadaanticuerpofueporuntiempoaproximadode1ha temperatura ambiente y agitacin constante. Luego las membranas fueron lavadas con PBS 1x durante 20 min con cambios cada 5 min. Como segundo anticuerpo se utiliz un anti-IgGderatnconjugadoaperoxidasaaunadilucinde1:50.000por30mina 18temperaturaambienteenagitacinconstante.Posteriormentelasmembranasfueron lavadasconPBS1xdurante20minconcambioscada5min.Lasbandas inmunoreactivassevisualizaronutilizandoelmtododequimioluminiscenciaSuper Signal West Pico (Pierce) y pelcula Kodak BioMax ML. 3.3 Inmunocitoqumica Lasclulasendotelialesmantenidasenportasdecultivo(Lab-TekChamber SlideTM System)fuerontratadasyestimuladasconLDBK,BKyTNFcomocontrol positivo de la reaccin. Posterior a la estimulacin, las clulas fueron lavadas con PBS 1XpH7,4(3x5min).ParalainmunodeteccindeELAM-1lasclulasendoteliales fueron fijadas con p-formaldehdo al 4% (Fluka A.G), no as las clulas que se utilizaron para la inmunolocalizacin de ICAM-1. Antes de la incubacin con cada anticuerpo, las clulas fueron permeabilizadas con una mezcla de metanol absoluto (Merck) y perxido dehidrgeno0,3%por10minatemperaturaambiente,lacualademstenacomo objetivo eliminar la peroxidasa endgena de la clula. Alternativamente se permeabiliz las clulas agregando saponina 0,3% al buffer de dilucin del anticuerpo. Para bloquear los receptores Fc de la superficie celular, se utiliz suero bovino fetal al 10%, diluido en PBS 1X y 0,5 % albmina suero bovino (Winckler). Posteriormente, se incub toda la nocheconlosanticuerposdescritosanteriormenteenelpunto3.2.5enunbao termorreguladoaunatemperaturade22C,anti-ICAM-1seutilizaunadilucinde 1:1.600,mientrasqueanti-ELAM-1seutilizaunadilucinde2g/ml.Unavez incubado con los anticuerpos, se lav con PBS 1X (5 X 5 min). Las inmunoglobulinas unidas a las clulas fueron detectadas usando el Kit LSAB+streptavidina-biotina (Dako) 19y la peroxidasa fue revelada utilizando dos sustratos diferentes, para ICAM-1 se us el kit3-amino-9-ethylcarbazol(Dako)(rojo),mientrasqueparaELAM-1seutilizelkit 3,3`-diaminobenzidina (DAB) (caf). Los ncleos fueron teidos con hematoxilina por 30 segylosportaobjetosfueroncubiertosconcubreobjetosyMowiol(Polysciences). Adicionalmente se realiz inmunocitoqumica para ambos receptores de cininas B1 y B2, utilizandoanticuerposespecficosanti-RB1(Hessycol.1996)yanti-RB2(Figueroay col.1995)aunadilucinde1:400y1:10.000,respectivamente.Parala inmunodeteccindelosreceptoresseutilizelmtodostreptavidina-biotinayla peroxidasa fue revelada utilizando el sustrato aminoethylcarbazol. 3.4 Anlisis de imagen y grficos Conelobjetivodecuantificarlainmunoreactividaddelasbandasms representativasydelascualesnosinteresabaconocersuvariacinseutilizaronlos programas que a continuacin se mencionan. Se utiliz un experimento representativo para la aplicacin de estos programas. Paraelanlisisdensitomtricodelasbandasreveladasmediante quimioluminiscenciaseutilizelprogramaUN-SCAN-ITgelAutomatedDigitizing SystemVersin4.1paraWindows.Paraconstruirlosdiferentesgrficosseutilizaron los datos obtenidos del anlisis de imagen y se llevaron al programa SIGMAPLOT 2000. Deestamanerasegraficaronlasintensidadesenpixelesversuslacondicin experimental correspondiente. 204. RESULTADOS 4.1 Expresin de receptores B1 y B2 de cininas en clulas endoteliales EA.hy926 Utilizandoinmunocitoqumicayanticuerposespecficosparaambosreceptores decininas,selogrdemostrarsuexpresinenclulasendotelialesdelalnea EA.hy926.Losreceptoresdecininaspresentanunadistribucinsimilarenlaclula, inmunolocalizndose tanto en el citoplasma como en la membrana celular. La reaccin observadaenelcitoplasmaeradeaspectogranularconunadistribucin predominantemente en la regin perinuclear (Fig. 4). 21 Fig.4.InmunolocalizacindereceptoresB.,yB2decininasenclulas endotelialesEA.hy926encultivo.A)controlenquesereemplazel anticuerpo x suero no-inmune de la misma especie a una dilucin 1:10.000. B)InmunolocalizacindelreceptorB1decinina.C)Inmunolocalizacindel receptorB2decinina.Seutilizaronanticuerposanti-RB1yanti-RB2auna dilucin1:400y1:10.000,respectivamenteylaperoxidasaserevelcon aminoetilcarbazol. Todas las figuras x 650. 224.2 La expresin de ICAM-1 depende de la concentracin de LDBK y BK LacitoquinaTNF,usadacomoestmulocontrolaunaconcentracinde10 ng/ml, fue un estmulo potente para activar la expresin de ICAM-1 en la lnea celular EA.hy926(Fig. 5). Para determinar si la expresin de ICAM-1 era dependiente de la concentracin de los pptidos LDBK y BK, se estimularon cultivos confluentes de clulas endoteliales con diferentes concentraciones durante 6 h. Las protenas (100 g) de los extractos de clulas endoteliales fueron sujetas a electroforesis en geles de poliacrilamida al 10%, electrotransferidaseICAM-1fuedetectadoconunanticuerpomonoclonaldirigido contralaprotenahumana.ElagonistadelreceptorB2BKprodujounaumentoenla expresindeICAM-1,dependientedelaconcentracindelpptido.Laexpresinfue mxima cuando se us BK 100 nM (Fig. 5). El agonista del receptor B1 LDBK tambin produjo un aumento en la expresin de ICAM-1, pero la respuesta fue diferente dado queelmximodeexpresinseprodujoalestimularlasclulasendotelialesconuna concentracin de 1 nM LDBK (Fig. 5). De hecho, la expresin de la protena disminuy al estimular con 100 nM LDBK. 23 Fig. 5. Expresin de ICAM-1 en clulas endoteliales de la lnea EA.hy926. Las clulas fueron estimuladas por 6 h con dosis variables de TNFa, LDBK y BK, respectivamente.LasprotenasfueronseparadasporSDS-PAGE10%, transferidas a inmobiln P y luego incubadas con un anticuerpo anti-ICAM-1, el cual fue detectado utilizando quimioluminiscencia. 244.3LaexpresindeELAM-1dependedelaconcentracinydeltiempode estimulacin con LDBK y BK Los experimentos utilizando TNF como estmulo conocido para incrementar la expresin de ELAM-1 demostraron una banda inmunorreactiva principal de 95 kDa que comenzabaahacersedetectablecuandolaconcentracindelacitoquinaeraigualo mayor a 10 ng/ml (Fig. 6). Para determinar si la expresin de ELAM-1 era dependiente de la concentracin de los pptidos LDBK y BK, se estimularon cultivos confluentes de clulasendotelialescondiferentesconcentracionesdeLDBKyBKpor24h.Una cantidadaproximadade80gdeprotenasdelosextractosdeclulasendoteliales fueronsujetosaelectroforesisengelesdepoliacrilamidaal6%,electrotransferidosy sometidosainmunodeteccindelaprotenadeadhesinELAM-1,utilizandoun anticuerpomonoclonalanti-ELAM-1humana.Selogrdeterminarquealaumentarla concentracin del agonista del receptor B2 BK aument tambin la expresin de ELAM-1, donde el mximo de expresin se alcanz a una concentracin 100 nM del pptido (Fig. 6). Por su parte, LDBK produce un efecto idntico al de BK sobre la expresin de ELAM-1, donde el mximo es alcanzado a la concentracin de 100 nM LDBK, pero con una intensidad menor a la producida por BK (Fig. 6). 25 Fig.6. Expresin de ELAM-1 en clulas endoteliales de la lnea EA.hy926. Las clulasfueronestimuladaspor24hconconcentracionesvariablesdeTNF, LDBK y BK respectivamente. Las protenas fueron separadas por SDS-PAGE 6%, transferidas a inmobilon P y luego incubadas con un anticuerpo anti-ELAM-1, el cual fue detectado utilizando quimioluminiscencia. 26 Dado que la expresin de ELAM-1 fue ms acentuada con el agonista B2 que con LDBK, se realizaron experimentos adicionales utilizando este pptido para determinar si la expresin de ELAM-1 era dependiente del tiempo de estimulacin con BK. Para esto seestimularoncultivosconfluentesdeclulasendotelialesadiferentestiempos,con unaconcentracinfijade100nMBKyutilizandoTNFcomocontrolpositivo.La molcula de adhesin ELAM-1 present una cintica de expresin mxima entre las 3 y 6hdeestimulacinconTNF (Fig.7).Unresultadosimilarseobservcuandolas clulasseestimularonconBKenquelamximaexpresindelaprotenaocurri tambinentrelas3y6hdeestimulacin.AdiferenciadeloocurridoconTNF,el efecto producido por BK parece ser ms duradero en el tiempo ya que permanece hasta 24 h despus de realizada la estimulacin con el pptido (Fig. 7). 27 Fig.7.CinticadeexpresindeELAM-1enclulasendotelialesdelalnea EA.hy926. Las clulas fueron estimuladas con TNF y BK por periodos variables detiempo.LasprotenasfueronseparadasporSDS-PAGE6%,transferidasa inmobilnPyluego,incubadasconunanticuerpoanti-ELAM-1,elcualfue detectado por quimioluminiscencia. 284.4 Evaluacin de la expresin de ICAM-1 y ELAM-1 mediante inmunocitoqumica 4.4.1 ICAM-1 UtilizandoanticuerposespecficoscontraICAM-1selogrdemostrarsu expresinenlasclulasendotelialesEA.hy926encultivo.Lainmunocitoqumica muestraquelasclulastratadasconTNF,BKyLDBK(Fig.8B,CyD, respectivamente)muestranreaccinpositivaparaICAM-1,noaslasclulasno estimuladas (Fig.8A). ICAM-1 se observ tanto en la membrana celular como en el citoplasma de las clulas endoteliales. La reaccin observada en el citoplasma era de aspectogranularconunadistribucinpredominantementeenlareginperinuclear, probablemente asociada al retculo endoplsmico. 29 Fig.8.InmunolocalizacindeICAM-1enclulasendotelialesdelalnea EA.hy926.A)clulasnoestimuladas;B)clulasestimuladasconTNF;C) clulasestimuladasconBK;D)clulasestimuladasconLDBK.Seutilizun anticuerpoanti-ICAM-1humanaaunadilucinde1:1600ylaperoxidasase revel con aminoetilcarbazol. 304.4.2 ELAM-1 Mediante inmunocitoqumica se comprob el efecto estimulador de los agonistas deambosreceptoresdecininasydeTNFsobrelaexpresindeELAM-1.Esta tcnicapermitiobservarqueelefectoocurresloenlasclulastratadasconBK, LDBK o TNF (Fig.9C,DyB, respectivamente) y no en las no tratadas (Fig.9A). ELAM-1 mostr una distribucin variable en la clula, y se observ mayoritariamente en elcitoplasmayenmenorgradoenlamembranacelular.Lareaccinfue fundamentalmentegranularyaumentalincrementarlaconcentracindeBKyde LDBK. Aparentemente, el efecto de BK es mayor que el producido por LDBK. 31 Fig.9.InmunolocalizacindeELAM-1enclulasendotelialesdelalnea EA.hy926.A)clulasnotratadas;B)clulasestimuladasconTNF;C) clulas estimuladas con BK 10 y 100 nM; D) clulas estimuladas con LDBK 10 y 100 nM. Se utiliz un anticuerpo anti-ELAM-1 humana a una dilucin de 2 ug/ml y la actividad de la peroxidasa se revel utilizando diaminobenzidina. 325. DISCUSION Lascininasparticipanenetapasespecficasdelainflamacin(Bhoolaycol. 1992; Bockmann y Paegelow, 2000; Couture y col. 2001). El receptor B2 est ligado a lossignoscardinalesdelainflamacinqueincluyenaumentodelapermeabilidad vascular, venoconstriccin, dilatacin arteriolar y dolor con una participacin limitada en elreclutamientocelularenelsitioinflamado.AsuvezelreceptorB1promueveel edema y dolor durante la inflamacin (Couture y col. 2001) adems de la quimiotaxis de leucocitosneutrfilosenformaindirecta,estimulandolaliberacindeneuropptidos (AhluwaliayPerreti,1996)odirectamenteatravsdeungradientedeconcentracin formadoporelpptido(Ehrenfeldycol.2006).Duranteeltranscursodeunproceso inflamatoriolasmolculasdeadhesincelular,ELAM-1eICAM-1cumplenunrol fundamentalenelrodamiento,adhesinytransmigracindelleucocitoalendotelio activadopormediadoresinflamatorioscomoTNF,IL-1eIFN(Wertheimerycol. 1992; Amberger y col. 1997)) entre mucho otros. Por lo tanto, se puede deducir, que debera existir una estrecha relacin entre las cininas y la expresin de molculas de adhesincelularporpartedelendotelio.Esascomoelobjetivoprincipaldeeste trabajo fue el investigar si las cininas regulan o no la expresin de ELAM-1 e ICAM-1 en clulas endoteliales en cultivo. 5.1 Expresin de receptores B1 y B2 de cininas en clulas endoteliales EA.hy926 Utilizandoinmunocitoqumicayanticuerposespecficosparaambosreceptores decininas,selogrdemostrarsuexpresinenclulasendotelialesdelalnea 33EA.hy926.Losreceptoresdecininaspresentanunadistribucinsimilarenlaclula, inmunolocalizndose tanto en el citoplasma como en la membrana celular. La reaccin observadaenelcitoplasmaeradeaspectogranularconunadistribucin predominantementeenlareginperinuclear.Wohlfartycol.(1997)demostraronla expresindelosRNAmensajerosdeambosreceptoresdecininasellalneacelular HUVEC, utilizando RT-PCR acoplado a Southern Blotting. 5.2 Las cininas BK y LDBK inducen la expresin de ICAM-1 ICAM-1 es una glicoprotena de transmembrana que promueve la firme adhesin y migracin transendotelial del leucocito al endotelio durante la inflamacin, cuya ruta puedesertranscelularyparacelular(Stanleyycol.2000;Yangycol.2005).Est constitutivamentepresenteenbajosnivelesenlasuperficiedelaclulaendotelial (Quinlanycol.1998),sinembargo,citoquinasycomponentesdelaparedcelularde bacteriasGram(+)puedenestimularsuexpresin.Laestimulacindecultivos confluentes de clulas endoteliales de la lnea EA.hy926 con BK, agonista del receptor B2decininas,produjounaumentoenlaexpresindeICAM-1.Esteincrementofue proporcional al aumento de la concentracin de BK, donde el mximo se alcanz a una concentracin100nMdelpptido.OtrassustanciascomoIFNtambinprovocanun efecto dosis-dependiente en clulas endoteliales derivadas de vena umbilical humana (HUVEC) similar al observado con BK (Melrose y col. 1998). Las clulas utilizadas en este trabajo provienen de las clulas HUVEC que fueron fusionadas con una clula de hibridoma para generar esta lnea celular (Edgell y col. 1983). Por su parte, LDBK, un agonista del receptor B1, tambin produjo un aumento en la expresin de ICAM-1, pero 34la respuesta fue diferente. Fue as como el mximo de expresin se produjo al estimular con LDBK 1nM, mientras que una concentracin 100 nM del pptido provoc un mnimo aumento en la expresin de esta molcula de adhesin. En la lnea celular HLMVEC al estimularconcidolipoteichoicodeStaphylococcusaureus,tambinseobservun efecto de dosis-dependiente similar con respecto a ICAM-1 (Blease y col. 1999). Lasbandasinmunorreactivasdetectadastenandiferentesmasasmoleculares. Fue as como al estimular con TNF se obtuvo una banda de 95 kDa mientras que la estimulacin de las clulas con LDBK y BK gener dos bandas, una de 95 kDa y otra menor de 90 kDa. En la literatura se describen diferentes formas moleculares que van entre 90 a 110 kDa y que corresponden a distintos grados de glicosilacin de la protena (Diamondycol.1990).Porlotanto,losdistintosanticuerposcomercialesdisponibles pueden reconocer distintas formas glicosiladas de ICAM-1. 5.3 Inmunolocalizacin de ICAM-1 Mediante inmunocitoqumica y utilizando anticuerpos especficos contra ICAM-1 se logr demostrar su expresin en clulas endoteliales en cultivo. Los resultados de la inmunocitoqumicamuestranquelasclulasendotelialestratadasconTNF,BKy LDBK tienen reaccin positiva para ICAM-1, no as las clulas no tratadas. ICAM-1 se observ tanto en la membrana celular como en el citoplasma, adems de una reaccin granularqueesposiblequeestasociadaalretculoendoplsmicorugoso.Esto concuerdaconestudiospreviosrealizadosporBhuniaycol.(1998),quienes demostraronmedianteinmunofluorescencialalocalizacindeICAM-1enclulas endotelialesencultivoutilizandolamismalneacelularEA.hy926.Detectndoseuna 35intensainmunorreactividadparaICAM-1enlamembranacelularytambinenel citoplasma. 5.4 BK y LDBK inducen la expresin de ELAM-1 ELAM-1esunaglicoprotenadetransmembranaqueseexpresasloenel endotelio(BevilacquayNelson,1993)ymediaelrodamientoylaadhesinde leucocitosalendotelioactivadoporcitoquinas(Bochnerycol.1991;Abbassiycol. 1993; Ulfman y col. 1999; Forlow y Ley, 2001). La estimulacin realizada a los cultivos confluentes de clulas endoteliales de la lnea EA.hy926 con BK produjo un aumento en laexpresindeELAM-1,alaumentarlaconcentracindeBKaumenttambinla expresin de ELAM-1, alcanzndose el mximo de expresin a una concentracin 100 nM. Por su parte, el agonista B1 LDBK provoc un efecto idntico al de BK. Estudios previos utilizando ELISA han mostrado un efecto dosis-dependiente similar al estimular clulas HUVEC con diferentes concentraciones de TNF e IL-1 (Melrose y col. 1998). LamasamolecularrelativadeELAM-1varidistinguindosebandas inmunoreactivas de distinto tamao. Por ej. Al estimular las clulas con TNF se obtuvo una masa correspondiente a 95 kDa, mientras que con BK y LDBK se obtuvo masa de 115y/o95kDa.EstudiospreviosrealizadosporBevilacquaycol.(1987)enclulas HUVECactivadasconIL-1recombinantehumana,demostraronusando inmunoprecipitacin y electroforesis en gradiente, la expresin de dos polipptidos (115 kDa,especiemayory97kDa,especiemenor)correspondientesaELAM-1.Estos resultados fueron confirmados mediante experimentos depulso-caza que sugiere que las especies menores de 97 kDa se originan de un precursor del polipptido de mayor 36tamao. Los tamaos moleculares de ELAM-1 obtenidos en esta tesis son plenamente concordantes con los de Bevilacqua y col. (1987). ELAM-1 present una expresin mxima luego de 3 a 6 h de estimulacin con BK,mantenindosealomenosporlas24h.Unaexpresinsimilarfuedetectada medianteInmunofluorescenciaenclulasendotelialesmicrovascularesdedermis humana (HDMEC) por Vora y col. (1996) en respuesta a IL-10. Cabe resaltar que esta citoquina tambin produce una persistencia en la expresin de ELAM-1 hasta las 24 h post-estmulo,adiferenciadelosresultadosobtenidosporAmbergerycol.(1997) quienes mediante el anlisis de citometra de flujo en clulas endoteliales originadas de venasyarteriashumanasmuestranqueELAM-1nopresentaunapersistenciaenla expresin hasta 24 h post-estmulo con TNF, IL-1 y LPS, por el contrario, se produce una disminucin de su expresin. 5.5 Inmunolocalizacin de ELAM-1 Utilizando inmunocitoqumica y anticuerpos especficos contra ELAM-1 se logr demostrarsudistribucinenclulasendotelialesencultivo.Lasclulastratadascon TNF,BKyLDBKmostraronreaccinpositivaparaELAM-1,noaslasclulasno tratadas.ELAM-1mostrunadistribucinvariableenlaclula,inmunolocalizndosetanto en la membrana celular como en el citoplasma, adems de una reaccin granular. AlaumentarlaconcentracindeBK,tambinaumentlaexpresindeELAM-1,un efecto similar se produjo al estimular con LDBK. Esto concuerda con estudios previos realizados por Vora y col. (1996), quienes demostraron mediante Inmunofluorescencia 37la localizacin de ELAM-1 en clulas endoteliales microvasculares de dermis humana tratadas con citoquinas. En resumen, nuestros resultados demuestran que las cininas, vareceptores B1 yB2,regulanlaexpresindemolculasdeadhesincelularICAM-1yELAM-1en clulas endoteliales en cultivo. Avanzar en la caracterizacin de los complejos procesos inflamatorios, nos llevar a futuro a proveer nuevas estrategias para modular el curso de diversas enfermedades asociadas a la inflamacin. 386. BIBLIOGRAFIA Abbassi, O., Kishimoto, T.K., Mcintire, L.V., Anderson, D.C. and Smith, C.W. (1993) E-selectin supports neutrophil rolling in vitro under conditions of flow.J.Clin.Invest., 92: 2719-2730. Ahluwalia,A.,andPerreti,M.(1996)InvolvementofbradykininB1receptorsinthe polymorphonuclearleukocyteaccumulationinducedbyIL-1invivointhemouse.J. Immunol., 156: 269-274. 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