Biotecnologia Vegetal

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LABORATORIO AVANZADO DE FISIOLOGÍA VEGETAL Curso 2006-2007 M M Ó Ó D D U U L L O O D D E E C C U U L L T T I I V V O O I I N N V V I I T T R R O O Comisión Docente de Fisiología Vegetal Departamento de Biología Universidad Autónoma de Madrid Francisca F. del Campo Soledad Sanz Alférez Luis E. Hernández

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LABORATORIO AVANZADO DE FISIOLOGÍA VEGETAL

Curso 2006-2007

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Comisión Docente de Fisiología Vegetal Departamento de Biología

Universidad Autónoma de Madrid

Francisca F. del Campo Soledad Sanz Alférez Luis E. Hernández

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Módulo de Cultivo in vitro

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CCUULLTTIIVVOO IINN VVIITTRROO DDEE EEXXPPLLAANNTTOOSS DDEE TTAABBAACCOO.. AANNÁÁLLIISSIISS DDEE TTRRAANNSSGGEENNIICCIIDDAADD

Introducción

Diversas plantas de interés agroalimentario, ornamental o manipuladas genéticamente, han de propagarse o regenerarse vegetativamente. Asimismo, en algunos casos es preciso emplear técnicas de propagación vegetativa para erradicar infecciones por virus y para introducir variaciones genotípicas que aumenten la calidad de los productos. Estas técnicas se conocen genéricamente como cultivo in vitro. Para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos hay una serie de factores que hay que tener en cuenta. El medio de cultivo debe tener los nutrientes necesarios para que las células vegetales puedan desarrollarse con normalidad: sales inorgánicas, una fuente de carbono en el caso de no poder realizar fotosíntesis, vitaminas en algunos casos y fitohormonas. El medio inorgánico más empleado es la mezcla de sales diseñada por Murashige y Skoog (MS). Este medio se puede completar con glucosa, vitaminas, auxinas y/o citoquininas para el cultivo de distintos tipos de tejidos y células. En la práctica vamos a preparar un medio de cultivo para la obtención de callos de explantos de plantas de tabaco. Prepararemos medios de cultivo con distintas relaciones de auxina/citoquinina que determinan, según los casos, mayor desarrollo de la parte aérea o mayor desarrollo de la raíz.

Fig. 1. Diferenciación de explantos en función de distintas concentraciones de auxina y citoquinina

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Una de las aplicaciones del cultivo in vitro, como se ha indicado, es la regeneración de plantas trasngénicas. Dado que los eventos de transformación genética solo afectan a unas pocas células del material vegetal manipulado, es preciso incluir un GEN DE SELECCIÓN. Esto es: un gen que codifica una enzima capaz de detoxificar una sustancia letal para las células vegetales. Así, muchas plantas transgénicas portan como gen de selección el gen de resistencia a los antibióticos kanamicina y neomicina (neomicina fosfotransferasa, nptII). La presencia de este gen de selección o resistencia se puede detectar en las plantas de tabaco cultivadas mediante dos experimentos: i) propagación del material vegetal en un medio de cultivo in vitro suplementado con kanamicina, y ii) detección del transgen mediante PCR a partir de DNA genómico.

Fig. 2. Estructuras moleculares de diversas auxinas y citoquininas empleadas para la preparación

de medios de cultivo in vitro.

BAP: bencilaminopurina Kinetina Zeatina

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NOTA IMPORTANTE: Hay que evitar en lo posible la contaminación de los medios de cultivo por bacterias u hongos. Es preciso trabajar en las mayores condiciones de esterilidad posibles. Se trabajará muy cerca de la llama del mechero Bunsen, con la mesa de trabajo MUY LIMPIA, evitando remover el aire alrededor de las placas en exceso. Hay que limpiarse bien las manos con jabón y posteriormente se deben enjuagar con etanol 70 %. SI NO CUIDAIS ESTE ASPECTO OS PODEIS ENCONTRAR CON VUESTRO EXPERIMENTO TOTALMENTE INFECTADO POR ORGANISMOS INDESEABLES!!!! Asimismo, es necesario ser muy pulcros al esterilizar el material vegetal que se va a cultivar in vitro. Por favor, seguid muy atentamente las indicaciones del guión de prácticas y las recomendaciones que hagan los profesores.

1ª PARTE: Propagación de plantas de tabaco tipo silvestre y transgénicas en medio con kanamicina

1.1. Material para el cultivo in vitro

Material vegetal Plantas cultivadas en un substrato orgánico. Se emplearán plantas que han sido previamente cultivadas en nuestro laboratorio de tabaco (Nicotiana tabacum), de las que disponemos una línea silvestre (no manipulada genéticamente) y otra transgénica (que sobreexpresa un gen que codifica MnSOD). Estas plantas se crecieron en un substrato de turba más perlita durante mes y medio.

Disoluciones para esterilizar los tejidos De lavado: etanol 70% Esterilizadora: hipoclorito sódico 20%, Tween-20 0.2 ml·L-1 Medio de cultivo básico Medio MS: Es un preparado comercial que contiene las distintas sales mezcladas y listas para ser disueltas en medio líquido. Cuando se disuelven en la cantidad adecuada, la concentración final de los distintos nutrientes minerales es la mostrada en la Tabla 1. Tabla 1. Concentración de sales minerales de la disolución nutritiva diseñda por Murashige-Skoog

Sales de macronutrientes (mg·L-1) Sales de micronutrientes (mg·L-1) NH4NO3 1650 KI 0.83 KNO3 1900 H3BO3 6.2 CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3 MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 8.6 KH2PO4 170 Na2MoO4·2H2O 0.25 CuSO4·5H2O 0.025 CoCl2·6H2O 0.025 Na2·EDTA 37.3

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FeSO4·7H2O 27.8 Dicho medio básico hay que suplementarlo con diversos componentes. Las vitaminas están preparadas en disoluciones concentradas stock, que, al ser termolábiles, se esterilizan por filtración: • Vitaminas (termolábiles, STOCK 1000 v.c.):

1. Ácido nicotínico 5 mg·L-1 2. Tiamina hidrocloruro 5 mg·L-1 3. Piridoxina hidrocloruro 1 mg·L-1

• Mio-inositol 1 g·L-1 • Sacarosa 3 % • Para medio sólido: agar (Phytogel, Sigma) 0.8 % Medio de cultivo con fitohormonas y kanamicina

Para comprobar el efecto de una aplicación exógena de hormonas sobre el desarrollo del explanto vamos a preparar distintos medios de cultivo, donde la concentración de fitohormonas será distinta, siguiendo el esquema de la Tabla 2. Se parte de disoluciones stock concentradas, que se añadirán para preparar 500 mL de medio por grupo. Este volumen de medio es suficiente para preparar al menos 20 placas Petri por grupo. • Auxina (termolábil, STOCK 1000 v.c.): ácido naftalénacético (NAA) 3 g·L-1 • Citoquinina (termolábil, STOCK 1000 v.c.): bencilaminopurina (BAP) 1 g·L-1 • Kanamicina (termolábil, STOCK 1000 v.c.): 50 g L-1 Tabla 2. Medios de cultivo a preparar por los distintos grupos de trabajo, en los que se variará la proporción de fitohormonas y la presencia o ausencia de kanamicina. Los volúmenes de los stock de fitohormonas se han calculado para preparar 500 mL de medio de cultivo.

Medio Kan Conc. final (mg·L-

1) auxina:citoquinina

NAA

BAP Kan Grupo

(mg L-1) (µL)

Alta auxina (AA) NO 3.0 : 0.0 500 0 0 1

Media aux. (MA) NO 1.5 : 0.5 250 250 0 2

Baja aux. (BA) NO 0.5 : 3.0 85 1500 0 3

AA + kanamicina 50 3.0 : 0.0 500 0 500 4

MA + kanamicina 50 1.5 : 0.5 250 250 500 5

BA + kanamicina 50 0.5 : 3.0 85 1500 500 6

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Aparatos, instrumental y material vario Autoclave Pinzas y bisturíes Balanza Placas Petri estériles Fitotrón (22ºC-17ºC, 16h luz-8h oscuridad) Tijeras

Pipetas automáticas Puntas pipetas estériles pHmetro Mechero Bunsen

Pulgas magnéticas Agitador magnético Tubos Falcon Frascos ISO de 1 L

1.2. Metodología cultivo in vitro DIA 1

Se prepararán las placas con medio de cultivo sólido. En primer lugar se procederá a la preparación de 500 mL de medio de cultivo líquido MS por grupo (Cada mesa tendrá los cuatro tratamientos indicados). Las sales inorgánicas (macronutrientes y micronutrientes) vienen mezclados en un preparado comercial (Sigma, M-5524). En un vaso de precipitado que contenga aproximadamente 400 mL de H2O desionizada, se disuelven 2.15 g del preparado comercial. Seguidamente se añaden 15 g de sacarosa y 0.5 g de mio-inositol. Una vez disueltos los solutos, la disolución se ajusta a pH 6.0 y se enrasa el volumen a 500 mL. En una botella de 1 L (Duran, tapón azul) se echan 4 g de Phytogel y se vierte con cuidado los 500 mL del medio que se ha preparado. Se autoclavan en ciclo corto 121ºC a 105 kPa durante 20 min. Una vez autoclavados los medios, se tienen que enfriar hasta alcanzar unos 60ºC. Esta temperatura permite coger los matraces con la mano, NO TIENEN QUE QUEMAR AL TACTO. Cuando ha alcanzado la temperatura adecuada, se procede a la adición de los componentes termolábiles que han sido esterilizados previamente por filtración. Se añaden los correspondientes volúmenes de las disoluciones stock: vitaminas 0.5 mL, fitohormonas o kanamicina según se indica en la Tabla 2. SIEMPRE CUIDANDO DE TRABAJAR MUY CERCA DEL MECHERO ENCENDIDO, MANTENIENDO LA BOCA DE LA BOTELLA CERCA DE LA LLAMA, Y SIEMPRE TRABAJAR CON LA MAYOR PRESTEZA POSIBLE. Una vez añadidos los componentes necesarios, la botella se agita por rotación para homogeneizar la mezcla, y con la mayor presteza hay que plaquear antes de que se solidifique el agar. Se prepararán 15-20 placas Petri con los 500 mL de medio de cultivo estrilizado. HAY QUE EVITAR DEJAR LAS PLACAS ABIERTAS. CUANTO MÁS CUIDADO SE PONGA EN ESTE PASO, MENOS PROBLEMAS DE CONTAMINACIÓN HABRÁ. Las placas se dejan solidificar, se cierran con una tira de Prafilm y ya estarán listas para el día siguiente.

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DIA 2

Se procederá a recolectar los tejidos a cultivar in vitro de plantas de tabaco silvestre y transgénico. Se cortarán secciones de tallo y hojas con bisturí, que seguidamente se transferirán a tubos Falcon de 50 mL para su esterilización. Esterilización Se añade 15-20 mL de etanol 70%, agitando suavemente durante 3 min. Se enjuaga el tejido con agua estéril y se lava el tejido con otros 15-20 mL de la disolución esterilizadora durante 5 min. Para eliminar la lejía, se lava el tejido con tres volúmenes de H2O desionizada estéril, TRABAJANDO SIEMPRE CERCA DEL MECHERO. MUCHO, MUCHO CUIDADO CON EL ETANOL Y EL MECHERO. ES ALTAMENTE INFLAMABLE Y NO QUEREMOS TENER BAJAS EN LA TROPA!! Una vez esterilizado el tejido, y TRABAJANDO CON PRESTEZA Y MUCHO CUIDADO, se cortarán más finamente los tallos en secciones de aproximadamente 0,5 cm de espesor. Seguidamente, se transfieren a las placas Petri con unas pinzas que hayan sido flameadas, apoyando los sectores sobre el agar. Finalmente, las placas hay que sellarlas con Parafilm. POR FAVOR, INSISTIMOS EN EL CUIDADO QUE DEBEIS TENER PARA QUE SE TRABAJE CON LA MAYOR LIMPIEZA Y ESTERILIDAD POSIBLES Dejaremos el material en el Fitotrón. Cada 5-7 días se observará el progreso del experimento, y cuando pasen 3-4 semanas podremos observar el desarrollo final de los explantos, a los que se tomarán fotografías.

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2ª PARTE: Detección de transgenes de resistencia a kanamicina mediante PCR en plantas transgénicas de tabaco

2.1. Fundamento del experimento

De las diversas técnicas disponibles para detectar la presencia de un transgen hemos optado por emplear la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ser una de las más sencillas. No obstante, se ha de disponer de información previa sobre la secuencia del gen o genes que se han incluido en el genoma de la planta para poder diseñar los cebadores específicos correspondientes (ver anexo con las secuencias).

Fig. 3. Esquema de amplificación de un fragmento de DNA genómico utilizando la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR).

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El procedimiento consiste en la extracción de DNA de hojas de plantas de tabaco, tipo silvestre o NO transgénicas (WT), y de plantas transgénicas (MnSOD) que portan un gen de selección de kanamicina (nptII). Para ello se utilizará el kit comercial Nucleon Phytopure (Amersham Biosciences/GE Healthcare, Reino Unido). El DNA obtenido se utilizará como molde de reacciones de PCR que se prepararán con cebadores específicos mostrados en la Tabla 3. Tras realizar la reacción de PCR en un termociclador, los productos de amplificación se visualizarán mediante una electroforesis en gel de agarosa y con tinción de bromuro de etidio (SUBSTANCIA CARCINOGÉNICA QUE HAY QUE MANIPULAR CORRECTAMENTE).

2.2. Metodología PCR de DNA genómico DIA 1

Extracción de DNA

Cada grupo coge hojas de un solo tipo de plantas: grupos impares (1, 3 y 5) de las plantas silvestres (WT); y grupos pares (2, 4 y 6) de las plantas transgénicas (MnSOD). Las hojas se congelan y homogeneizan con ayuda de un mortero en nitrógeno líquido (N2(l)). Será suficiente con coger 4 o 5 trozos grandes de hoja. Una vez obtenido un polvo congelado homogéneo, se transfieren 0,1 g a un tubo Eppendorf de 1.5 mL estéril, que previamente contiene 600 µL del tampón de homogeneización o REAGENT 1 (Nucleon Phytopure, Amersham Biosciences). Se mezcla bien con varias inversiones del tubo y se añaden 200 µL del tampón de dilución o REAGENT 2. Se invierte el tubo nuevamente varias veces hasta obtener una mezcla homogénea. Seguidamente se incuba a 65ºC durante 10 min con varias agitaciones manuales. Ubicar el tubo en un baño de hielo durante 20 min.

Para eliminar el DNA de impurezas se añaden 500 µL de cloroformo y 100 µL de la Resina de Extracción Nucleon. ESTA ÚLTIMA, SERÁ DISPENSADA POR LOS PROFESORES. Se mantienen los tubos a temperatura ambiente durante 10 min, y con agitación suave periódica. Seguidamente se centrifugan los tubos a 12000 g, 4ºC durante 5 min. Se toman 600 µL del sobrenadante SIN REMOVER LA INTERFASE CON LA RESINA. Es MUY importante que los tubos una vez centrifugados se manipulen con SUAVIDAD, para no volver a mezclar las fases y la resina.

Por último, se procede a precipitar el DNA purificado añadiendo 1 volumen (600 µL) de isopropanol frío (estará almacenado a -20ºC), invirtiendo suavemente el tubo hasta que el DNA precipita. A continuación se centrifugan el tubo a 12000 g durante 5 min para sedimentar el DNA. Se elimina con cuidado el sobrenadante y el precipitado de DNA se lava dos veces con 300 µL de etanol 70% frío (mantenido en baño de hielo). Para evitar que flote el precipitado de DNA hay que centrifugar a 12000 g durante 2 min entre lavados. Para no perder el DNA, lavar el precipitado y eliminar los sobrenadantes con las pipetas de 200 µL (puntas amarillas). Dejar secar el DNA al aire, y cuando esté seco (esperar 10-15 min) se redisuelve el DNA en 25 µL de agua MiliRO estéril. Previamente a la realización de la reacción de PCR, se diluye el DNA 1/5 (10 µL de la muestra más 40 µL de H2O) para tener la muestra molde preparada.

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Tabla 3. Cebadores específicos diseñados para amplificar distintos fragmentos de DNA, junto con el tamaño esperado del fragmento y la temperatura de anillamiento.

Reacción de PCR

Los profesores elaborarán una mezcla maestra (tubo MM) que contendrá todos los componentes de la mezcla de reacción de la PCR excepto el molde de DNA (obtenido por cada grupo) y los cebadores específicos de cada fragmento a amplificar. Para cada tubo de PCR (utilizar los tubos especiales de 200 µL de pared fina estériles), se deben poner los siguientes componentes en la MM para un volumen de reacción final de 50 µL: tampón de polimerasa 10X (ya contiene Mg2+), 5 µL; 1 unidad de Taq polimerasa (5 U/µL), 0,2 µL; dNTPs 10 mM (conc. final 200 µM), 2 µL; H2O, 27,8 µL. A los 35 µL de MM hay que añadir 5 µL de cada cebador (total 10 µL para la pareja) y 5 µL del molde de DNA. En la Tabla 4 se describen los componentes que hay que añadir en cada uno de los 8 tubos de PCR que cada grupo ha de preparar.

Dado que cada grupo ha extraído DNA de una sola planta, se compartirá por mesa ambos moldes para que TODOS LOS GRUPOS ENSAYEN TODAS LAS COMBINACIONES (Tabla 4).

Una vez mezclados los componentes de la reacción de PCR se introducen los tubos en el termociclador y se someten al siguiente programa:

Cebadores específicos utilizados

Fragmento Cebador positivo Cebador negativo Tª ani.

Rubisco

(349 pb) tccctgtttcaaggaagc Rbcs01F

gtcgcataaaattgaaggag Rbcs02R

59

nptII

(317 pb) gaagagcatcaggggctc nptII01F

gaagaactcgtcaagaaggc nptII02R

59

35S

(234 pb)

tgccatcattgcgataaagg 35S01F

cctctccaaatgaaatgaac 35S02R

59

Nos term

(127 pb)

gaatcctgttgccggtcttgcg nos01F

gcgggactctaatcataaaaac nos02R

62

Temperatura (ºC) Tiempo

• Desnaturalización 94 5 min

• 40 ciclos

Desnaturalización 94 1 min

Anillamiento 59 45 s

Extensión 74 45 s

• Extensión final 74 5 min

• Final reacción 10 Hasta el siguiente día

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Tabla 4. Componentes de la mezcla de reacción para la amplificación de fragmentos de DNA genómico mediante PCR.

Combinación de componentes del medio de reacción de PCR genómico

CEBADOR 10 µM (µL) Molde de DNA (µL)

Componente Rubisc

o nptII 35S Nos termin WT MnSOD

Rbcs01F 5

Rbcs02R 5

Molde de DNA 5 5

Rubisco

Tubos Nº 1 2

nptII01F 5

nptII02R 5

Molde de DNA 5 5 nptII

Tubos Nº 3 4

35S01F 5

35S02R 5

Molde de DNA 5 5 35S

Tubos Nº 5 6

nos01F 5

nos02R 5

Molde de DNA 5 5

Nos term

in

Tubos Nº 7 8

Mezcla Maestra (µL) 35 35 35 35 35 35

TOTAL (µL) 50 50 50 50 50 50

DIA 2

Análisis de la PCR: separación de los fragmentos en gel de agarosa

Los nucleótidos se separarán mediante electroforesis no desnaturalizante en gel de agarosa 2% en tampón TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0). Las bandas correspondientes al cDNA amplificado se visualizarán en un transiluminador con luz ultravioleta teñidos con bromuro de etidio (BrEt).

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Reactivos para la electroforesis de DNA

Tampón TAE. Madre 50x Volumen de 1 L

Tris base 242 g

Ácido acético glacial 57.1 mL

Disolución 0.5 M EDTA pH 8.0 100 mL

Tampón TAE de trabajo Dilución 1/50 del anterior

Disolución de carga de muestras, preparada en H2O miliRO

Bromofenol azul 0.25%

Xilencianol 0.25%

Glicerol 30%

Disolución madre de BrEt 10 mg/mL

Escalera de DNA de 100 pb, preparada directamente para cargar

En un matraz cónico de 250 mL limpio se pesan 2 g de agarosa y se añaden 100 mL del tampón TAE. Se pone a calentar en un horno microondas hasta conseguir la disolución de todo el agarosa, agitando suavemente hasta que desaparezcan los grumos. PRECAUCIÓN: el agarosa fundido puede estar a muy alta temperatura. Se ruega trabar con extremo cuidado para evitar quemaduras.

Cuando la agarosa no queme al tacto (el calor soportable normal es aproximadamente de 60ºC), se añaden 4 µL de la disolución madre de BrEt. Temperaturas superiores pueden hacer que se degrade, y posteriormente no veríamos nada. PRECAUCIÓN: el bromuro de etidio es altamente carcinogénico. HAY QUE MANIPULARLO CON MUCHO CUIDADO, siempre usando guantes, y desprendiéndose de los residuos (puntas de pipeta, cintas, guantes, etc.) en el contenedor destinado a ello. NO TIRAR NADA CONTAMINADO A LA BASURA NORMAL.

Una vez que el gel se ha solidificado se pone en la cubeta de electroforesis, se cubre suficientemente con TAE y se cargan las muestras. Para ello, se usan 15 µL del medio de reacción de PCR a los que se ha añadido 2 µL de disolución de carga. CON CUIDADO DE NO PERFORAR EL POCILLO DE AGAROSA, se transfieren 15 µL a cada pocillo.

Finalizado el proceso de carga, se conectan los cables a la fuente de electroforesis. Se enciende el equipo, se ponen a correr a 70 V y se espera aproximadamente 30 min para que se separen los colorantes añadidos a la muestra.

Por último, se visualiza el gel en el transiluminador de luz ultravioleta y, si ha habido reacción de PCR se toma una foto con la cámara digital. El resultado será, esperemos, similar a lo mostrado en la Fig. 4.

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Fig. 4. Amplificación por PCR de diversos fragmentos de DNA, utilizando como molde DNA

genómico obtenido de plantas no transgénicas (WT) y plantas transgénicas (MS) de tabaco. Se

muestran los resultados empleando cebadores contra la subunidad pequeña de Rubisco (control

positivo) y el de dos componentes de un transgen: gen de resistencia a kanamicina (nptII) y contra el

promotor CaMV35S (utilizado para conseguir un nivel constante de expresión de un gen). En el

carril L se muestra la escalera de DNA de100 pb, que permite determinar el tamaño de los

fragmentos amplificados (L).