Biosensores Cantilever

Nardo Ramírez Frómeta

Departamento de Desarrollo, Dirección de Diagnóstico Microbiológico,Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNIC)

Ave. 25 esq. 158, Cubanacán, Playa, Ciudad de La Habana, CubaE-mail: nardo.ramirez@cnic.edu.cu

RESUMENNumerosos artículos recientes confirman el potencial de los biosensores microcantilever para aplicaciones ambientalesy biomédicas, así como su funcionalidad multifacética, lo cual indica su singularidad comparada con los diseños delos sensores más tradicionales. A diferencia de muchos tipos de transductores para sensores químicos, losmicrocantilever son simples dispositivos mecánicos: diminutas vigas o resortes batientes, cuyas dimensiones son:grosor entre 0.2 y 1 µm, ancho: entre 20 y 100 µm, y largo: entre 100 y 500 µm. Ellos están conectados al extremode un soporte apropiado para su conveniente manipulación. El presente artículo es un comentario especializadosobre las más recientes aplicaciones de los biosensores cantilever en el campo de las ciencias biológicas, físicas yquímicas. También se presentan al lector algunas de las potencialidades de estos biosensores que proporcionaninformación detallada sobre interacciones moleculares específicas. Además, se hace referencia al principio defuncionamiento, los logros y las tendencias de esta eficaz herramienta.

Palabras claves: biosensor, cantilever, electromecánico, interacciones moleculares

Biotecnología Aplicada 2006;23:316-319

ABSTRACTCantilever Biosensors. An increasing number of recent reports confirms the potential of MC sensors for environmentaland biomedical applications, and the multiple functions of the MCs indicate their uniqueness as compared withmore traditional sensor designs. Unlike many other types of transducers for chemical sensors, MCs are simplemechanical devices. They are tiny plates or leaf springs, typically 0.2-1 ìm thick, 20-100 ìm wide, and 100-500 ìmlong, which are connected on one end to an appropriate support for convenient handling. This paper is a specializedcomment on the latest applications of cantilever biosensors in the field of Biological, Physical and Chemical Sciences.Likewise, the reader is provided with some of the potentials of these biosensors which offer detailed information onspecific molecular interactions. Furthermore, reference is made to its functioning principle, achievements and thetendencies of this efficient tool.

Key words: biosensor, cantilever, electromechanical, molecular interactions

IntroducciónUna gran parte de los sistemas micro electromecánicosy nanoelectromecánicos convencionales (MEMS yNEMS, respectivamente) se usan para detectar ysensar. El principio para sensar difiere según eldispositivo, en dependencia de lo que se desea detectary de la precisión que se necesita. Entre los principiosde sensado que dependen de las propiedades mecánicas,están el capacitivo, el piezo resistivo y el de frecuenciade resonancia.

Los investigadores comenzaron a utilizar loscantilever micromaquinados, como sondas de fuerzaen la microscopia de fuerza atómica (MFA). Deinmediato se percataron de su extrema sensibilidadfrente a varios factores ambientales, tales como el ruidoacústico, la temperatura, la humedad y la presiónambiental. Sin embargo, en 1994, dos equipos deinvestigadores: uno del Laboratorio Nacional OakRidge y el otro de IBM, convirtieron el mismomecanismo que causaba la indeseada interferencia, enuna plataforma para una nueva familia de biosensores.Ellos encontraron que un cantilever de MFA estándarpodía funcionar como un microcalorímetro al ofreceruna sensibilidad del orden de 10-15 Joule y una mejorasustancial con respecto a las técnicas tradicionales.Midiendo el cambio en la frecuencia de resonancia delos microcantilever, los investigadores pudierondemostrar que son dispositivos sensibles a los cambios

de masa, con un mejor rendimiento que los sensorespiezoeléctricos gravimétricos convencionales. Estosinvestigadores, quienes disponían de instrumentaciónpara MFA, mostraron un interés sustancial en loscantilever como una nueva plataforma para unavariedad de biosensores químicos y físicos.

Avances recientes en las tecnologías de microfa-bricación han impulsado nuevas aplicaciones paramicroherramientas y nanoherramientas. Losmicrocantilever y nanocantilever se han empleadocomo una nueva clase de biosensores: reconocenproteínas con extrema sensibilidad y detectancantidades pequeñas de materiales, especialmentebacterias patógenas, cualidad importante para eldiagnóstico médico y para supervisar el suministrode alimentos. Los sistemas microelectromecánicosy nanoelectromecánicos dirigidos, también puedenservir como detectores biológicos multifuncionales,altamente sensibles e inmunoespecíficos.

CantileverLos cantilever (del inglés, ‘voladizo, tabla de salto otrampolín’) son biosensores nanomecánicos, producidospor tecnología estándar de microfabricación de silicio,que tienen dimensiones en la gama del micrómetro alnanómetro (Figuras 1 y 2). La flexibilidad de loscantilever, conjuntamente con las técnicas para

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supervisar su flexión, han hecho de estos una herramientaversátil para la microscopia de exploración y para ladetección de moléculas.

La tecnología estos sensores está establecida ybien documentada como una técnica multifuncional,altamente sensible, y un método en tiempo real, útilpara una variedad de aplicaciones, que incluye losbiosensores de gas para detectar explosivosplásticos, y los biosensores líquidos para detectarmicroorganismos enteros en estudios del ADN y delas proteínas.

Configuración de la medición Al integrar un piezo resistor en cada cantilever en unaconfiguración del tipo del puente de Wheatstone, esposible interpretar directamente un cambio de resistenciacomo un cambio del voltaje. La configuración del puentede Wheatstone puede consistir en un par de cantileverpara utilizar uno como referencia. La salida de estaconfiguración es la señal diferencial entre el cantileverde medición y el cantilever de referencia. Estaconfiguración mejora eficazmente la relación señal-ruidoy elimina el ruido que provocan los enlaces noespecíficos, las fluctuaciones térmicas y las vibraciones.

Los enlaces no específicos a una superficie es unproblema general que se debe reducir al mínimo entodos los análisis. Al utilizar un cantilever como

referencia, no se eliminan por completo los enlaces noespecíficos, pero sí es posible controlar su influenciaen la detección.

Principio de funcionamiento:detección de interaccionesmolecularesLa inmovilización de moléculas sobre la superficie delcantilever es un requisito previo para su uso comosensor nanomecánico (Figuras 3 y 4). La selección dela molécula depende de la aplicación deseada, ya seaen la fase líquida o en la fase gaseosa. Las moléculasinmovilizadas hacen al cantilever específicamentesensible a otras moléculas con las cuales tenga afinidad.La interacción molecular sobre la superficie delcantilever hace que este se flexione, como resultado dela tensión superficial inducida por la interacción [1].

La tensión superficial inducida por interaccionesmoleculares, generalmente no se observa en lasuperficie de un material común. Sin embargo, cuandola reacción ocurre en la superficie de un cantileverflexible, la tensión superficial lo fuerza a flexionarse.El cantilever es un sensor de la tensión y se flexionacomo respuesta a los cambios de energía libre en susuperficie.

Lectura eléctricaTradicionalmente, la flexión del cantilever ha sidomonitoreada, usando la técnica de “palanca óptica”, quetiene su origen en las técnicas de microscopia deexploración. Desarrollos recientes han logrado sensorescantilever con piezo resistores integrados. Estosbiosensores se caracterizan por ofrecer una lecturaeléctrica completa de la flexión del cantilever. Esta cualidadpermite eliminar la compleja alineación del láser, realizarmediciones en líquidos opacos, y reducir el coste de lainstrumentación.

Una característica particular de este principio delectura eléctrica es la posibilidad de crear dispositivosportátiles para aplicaciones de análisis descentralizados,es decir, no hay que llevar las muestras hasta ellaboratorio central.

Figura 1. Nanorresonador para el proyecto Nanomass.

Figura 2. Arreglo de diez microcantilever integrados en unmicrocanal.

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10

Figura 3. Cantilever (con piezorresistor integrado) sin detección.

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Y

Y Y Y Y Y Y Y YY

Figura 4. Cantilever con detección. Presencia de moléculasinmovilizadas sobre su superficie.

1. Cantilever technology. 2006.[Sitio enInternet]. Disponible en: http://www.Cantion.com/cantilever_technology.htm.Último acceso:12 octubre 2006.

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El piezo resistor integrado cambia su valor cuandose le aplica una fuerza; es un elemento sensor queposibilita medir la flexión del cantilever, por debajo dela escala manométrica. Generalmente, es difícil manejarcantilever por medio de la lectura piezo-resistiva enlíquidos, debido al aislamiento poco efectivo entre elpiezo resistor y el líquido.

La información obtenidaLos análisis acerca de la interacción molecular conlos cantilever micromecánicos y nanomecánicospueden proporcionar la información detallada sobreinteracciones moleculares específicas. La interacciónocurre en la superficie de los cantilever donde una delas moléculas que interactúa ha sido inmovilizada. Laexposición del chip a uno o más enlaces afines a lamolécula inmovilizada proporciona la informaciónque se relaciona con:

La concentración de la moléculaLa señal de estado estacionario del cantilever y/o elíndice de enlace a la superficie, dependen de laconcentración de la molécula afín a la moléculainmovilizada presente en la solución. Las solucionesse pueden preparar con moléculas purificadas o lamolécula afín a la molécula inmovilizada puede serparte de una mezcla compleja.

La cinética de la interacciónLa supervisión en tiempo real de la interacción molecularpermite determinar la velocidad de una interacciónespecífica. Cuando la muestra sustituye a la solucióntampón corriente en la celda de flujo, las moléculas de lamuestra se enlazan al “socio inmovilizado” en lasuperficie de un cantilever. Una vez que la muestrasalga de la celda de flujo y sea remplazada por unasolución tampón, las moléculas enlazadas en lasuperficie comenzarán a disociarse de su “socioinmovilizado”.

Para todos los análisis, la selectividad, la gamadinámica y otras características de funcionamiento delensayo, se determinan en gran parte por la selecciónde la molécula de enlace unida a la superficie.

Medición de una señalEl voltaje diferencial de salida del puente deWheatstone se supervisa en tiempo real. Cuando secoloca una muestra sobre el sensor, ocurre unainteracción específica en la superficie del cantilever.La fuerza cambiará la tensión superficial y comoresultado se flexionará el cantilever. Al plotear larespuesta contra el tiempo durante la interacciónmolecular, se obtiene una medida cuantitativa delprogreso de la interacción. La amplitud y el tiempo dereacción antes de que se obtenga un nuevo estadoestable, se usan para extraer información de laconcentración y de las interacciones cinéticas.

AplicacionesPara detectar reacciones bioquímicas en la superficiedel cantilever, una cara de este tiene que estar cubiertacon una película detectora que reaccione con lasmoléculas bajo investigación. Esta nueva técnica dedetección, basada en los cantilever, es muy sensible.Los biosensores basados en cantilever tienen un enorme

potencial, especialmente en el campo del análisisbioquímico. La técnica de detección puede ser utilizadapara construir rápidos y sencillos detectoresbioquímicos, pero debe permitir también nuevosestudios de interacciones moleculares sencillas, debidoa la elevada sensibilidad mecánica de los microcantilever(Figura 5).

Como tecnología, los biosensores cantilever sonaplicables a una gran cantidad de tareas específicas [2]:

1. Investigación acerca de las ciencias de la vida:estudio de los fundamentos de la interacción entre lasmoléculas biológicas u otras. Desarrollo de un nuevoanálisis sobre la plataforma con aplicacionespotenciales en dispositivos manuales.

2. El diagnóstico in vitro: permite analizar lasmuestras químicas y biológicas mediante métodosmucho más rápidos, sensibles y libres de etiquetas, esdecir, no se necesitan trazadores o marcadores para laidentificación final.

3. Descubrimiento de fármacos: estudio de lainteracción entre pequeñas moléculas y receptoresespecíficos. Hacer análisis multiplexados o paraincrementar el paralelismo y el contenido de losresultados de los análisis.

4. Control de agua fresca: detectar iones metálicospesados en agua fresca. Desarrollo de ensayos parauso descentralizado para el control de resina u otroscompuestos relacionados, en el suministro de aguafresca [3].

LogrosLos avances de la nanotecnología permiten desarrollarsistemas portátiles para aplicaciones biológicas,físicas y químicas, y alcanzar niveles de detecciónultrasensibles con muy bajo consumo de reactivos yanalitos.

Por medio de los biosensores nanomecánicos se hanpodido detectar cambios de masa del orden de 1.10-12

gramos, lo cual se corresponde con una variación de 1Hz en la frecuencia de resonancia del sistema [4].

Un ejemplo de la aplicación de los osciladoresmicromecánicos en la detección de una sola célula, loconstituye un sensor de masa que se basa en lamedición de la frecuencia resonante, compuesto porun sensor cantilever de nitruro de silicio de baja tensiónpara la detección de Escherichia coli (E. coli). Estesensor presenta anticuerpos de enlace con la sensibilidadsuficiente para detectar una célula. La etapa de enlaceimplica la interacción entre los anticuerpos de E. coliO157:H7 inmovilizados sobre la superficie delcantilever y el antígeno O157 presente en la superficiede E. coli patógena O157:H7. La carga total adicionaldel enlace específico de las células de E. coli se detectómidiendo un cambio de la frecuencia resonante del

YYYYYYYYY A B

(a) (b) (c)

Figura 5. Empleo de cantilever para la detección de cambio de tensión superficial (a), cambios detemperatura (b) y de masa (c).

2. Nanomechanics for bio/chemicaldetection. 2006. [Sitio en Internet]. Disponibleen: http://www.mic.dtu.dk/Research/NSE/BioProbe/Introduction.aspx. Último acceso:4 septiembre 2006.

3. Nanomechanical cantilever. 2006.[Sitio en Internet]. Disponible en: http://www.Cantion.com/applications.htm .Último acceso:12 octubre 2006.

4. Nanomechanical sensor. 2006. [Sitioen Internet]. Disponible en: http://monet.physik.unibas.ch/nose/inficon/.Último acceso:4 noviembre 2006.

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oscilador micromecánico. De los espectros medidosde la frecuencia resonante del cantilever, en aire, antesy después de la unión célula-anticuerpo, se calculóque la masa de una sola célula de E. coli puede ser de665 fg, la cual se corresponde con otros informes [5].

Un grupo de trabajo multidisciplinario de laUniversidad de Aarhus, Dinamarca, reporta queutilizando un cantilever con un elemento piezo resistivointerno lograron detectar una secuencia de una cadenade ADN [6].

La aplicación de los cantilever micromecánicos ynanomecánicos ha posibilitado el estudio deinteracciones moleculares en tiempo real, ladetección de bacterias enteras de forma rápida al norequerir del tiempo de crecimiento de estas, así comode toxinas y residuos de antibióticos en productosalimenticios. Uno de los campos en que ha habidouna rápida y amplia aplicación de los sensoresnanomecánicos, es en la detección de agentesquímicos contaminantes, tanto en los alimentoscomo en el medio ambiente.

Además, se ha desarrollado un sistema para lainmovilización múltiple y simultánea de moléculas ensecciones separadas sobre un arreglo de cantilever deforma simple. Esta configuración incrementa de maneranotable la eficiencia de cualquier medición química.Resulta una ventaja que un cantilever sea tratado conla misma molécula, ya que permite coleccionar unamayor cantidad de datos por cada medición, lo cualincrementa la confiabilidad de esta [7].

Existe una configuración que consiste en un arreglode 33 microcantilever para la detección de ADN conel empleo del polímero SU-8 soporte. Las pro -piedades mecánicas de este sistema, tales como laconstante spring, frecuencia de resonancia y factorde calidad, se caracterizan como una función de lasdimensiones y el medio. Al comparar esta tecnologíacon la de los cantilever comerciales a base de silicio,quedó demostrada que la sensibilidad mejoró en unfactor de 6 [8].

En la literatura es posible encontrar múltiplesaplicaciones de los biosensores nanomecánicos:detección bioquímica [9], detección de ADN [10],de proteínas [11], de pesticidas [12] y de explosivosTNT [13].

Sistema sensor cantilever SU-8 conlectura integradaConvencionalmente, los cantilever se han fabricadode silicio, y un sistema óptico conocido de lamicroscopia de fuerza atómica. Estos se hanempleado para la detección. Esta nueva aplicaciónpresenta como soporte el polímetro SU-8, y la lecturase realiza mediante un sensor de fuerza integrado, deoro [14].

Diseño de una nariz artificialSistema portátil capaz de identificar varios vapores decompuestos orgánicos volátiles. Es un sistemaautomático de flujo de gas, que trasporta el analito a lacámara de análisis, la cual contiene un arreglo decantilever nanomecánicos. La adquisición de datos y elcontrol se realiza por medio de una computadorapersonal [15].

ConclusionesEl campo de la microtecnología y de los sistemasmicroelectromecánicos (MEMS) ha crecido exponen-cialmente durante las dos últimas décadas del sigloXX. Recientemente los investigadores han centradosu trabajo en la búsqueda de materiales alternativos ala ya tradicional tecnología basada en el silicio. Uno delos materiales más prometedores para los nuevosdiseños de micro-sistemas y nanosistemas es elpolímetro SU-8. Entre sus útiles propiedades sedestacan su fotosensibilidad, su transparencia a la luzvisible, su bajo módulo de Young (también conocidocomo módulo de elasticidad, es un parámetro mecánicoque proporciona una medida de la rigidez de unmaterial sólido), así como su elevada biocompatibilidad.Su propia estructura lo convierte en un material establedesde el punto de vista químico y térmico, que permitela realización de microestructuras muy finas con unaexcelente relación de elementos como: señal-ruidoóptima. El uso del SU-8 también permite que elproceso de fabricación de los cantilever, basado en elmicromaquinado de superficies sea mucho más simple,barato y versátil. Esto hace que la integración de nuevasfuncionalidades sea más fácil y permita el desarrollode una amplia variedad de cantilever, tanto en formascomo en aplicaciones.

Recibido en noviembre de 2006. Aprobadoen noviembre de 2006.

5. Single cell detection with micro -mechanical oscillators. 2006. [Sitio enInternet]. Disponible en: http://scitation.aip.org/getabs/servlet/GetabsServlet?prog=normal&id=JVTBD9000019000006002825000001&idtype= vips&gifs=yes. Último acceso:4 noviembre 2006.

6. Piezoresistive cantilevers. 2006. [Sitio enInternet]. Disponible en: http://cat.inist.fr/?Modele=afficheN&cpsidt=17066108.Último acceso: 4 noviembre 2006.

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15.Artificial nose. 2006. [Sitio en Internet].Disponible en: http://monet.physik.unibas.ch/nose/index.html. Último acceso:2noviembre 2006.