Biokatalyse in unkonventionellen Reaktionsmedien
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100 BIOTECHNOLOGIE FRANK HOLLMANN 1 , SELIN KARA 2 1 DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY, DELFT UNIVERSITY OF TECHNOLOGY, DELFT, NIEDERLANDE 2 INSTITUT FÜR MIKROBIOLOGIE, PROFESSUR FÜR MOLEKULARE BIOTECHNOLOGIE, TU DRESDEN Biocatalysis in organic media enables higher concentrations of mostly hydrophobic reagents compared to traditional aqueous reaction systems. The resulting economic and ecologic advantages call for more intensive research efforts to attain deeper understanding of the behaviour of bio- catalysts under non-conventional reaction conditions. DOI: 10.1007/s12268-014-0412-7 © Springer-Verlag 2014 ó Eine grundsätzliche Herausforderung für die Anwendung von Biokatalysatoren in der organischen Synthese liegt in der Hydropho- bizität vieler Reagenzien und der traditio- nellen Beschränkung der Biokatalyse auf wässrige Medien [1]. Die Auffassung, dass die meisten Enzyme (mit Ausnahme einiger Hydrolasen) nur in wässrigen Medien aktiv und stabil sind, ist immer noch weit verbrei- tet. Leider begegnen viele wissenschaftliche Arbeiten diesem Problem durch die Verwen- dung kleiner Substratkonzentrationen. Die resultierenden Systeme sind ökonomisch wenig sinnvoll und aufgrund des hohen Was- serballasts auch ökologisch fragwürdig. Es ist also an der Zeit, Biokatalyse in wässrigen Sys- temen kritisch zu hinterfragen. Zunächst müssen verschiedene „Wasser- arten“ in wässrigen Reaktionssystemen unter- schieden werden. Der Großteil des Wassers dient lediglich als Medium, wohingegen ein kleiner Teil strukturelle und katalytische Auf- gaben im Biokatalysator übernimmt. Letzteres gebundenes Wasser unterscheidet sich in sei- nen physikalischen Eigenschaften deutlich vom freien Wasser, da es sich direkt in der Umgebung des Enzyms befindet und hier als „molekularer Schmierstoff“ agiert. Manche Enzyme, wie z. B. α-Chymotrypsin, benöti- gen recht wenig strukturelles Wasser (ca. 50 Äquivalente Wasser pro Enzym), während andere, wie z. B. Polyphenoloxidase, mit 3,5 × 10 7 Wassermolekülen pro Enzymein- heit eher „nasse“ Bedingungen benötigen [2]. Das molekulare Verständnis dieses Wasser- bedarfs ist derzeit noch nicht weit gediehen und stellt ein interessantes und zukunfts- weisendes Forschungsgebiet der Biokatalyse dar. Unter nicht-wässrigen Reaktionsbedin- gungen wird die Menge des oben erwähnten gebundenen Wassers vor allem durch die thermodynamische Wasseraktivität (a W ) im Reaktionsmedium beeinflusst. Die Wasser- aktivität kann auf verschiedene Weisen (z. B. durch gesättigte Salzlösungen, Paare von Salz- hydraten) gesteuert werden [3]. Neben dem erwähnten Wassergehalt kön- nen auch Additive bei der Katalysatorpräpa- ration (Lyophilisierung und/oder Immobili- sierung) einen großen Einfluss auf die Eigen- schaften des Biokatalysators unter den Reak- tionsbedingungen haben. So werden häufig Zusätze wie Kohlenhydrate, Polyole, organi- sche Salze oder Amphiphile zugesetzt, um die katalytisch aktive Form des Enzyms im heterogenisierten Zustand zu bewahren. Andere Agenzien sollen den direkten Kon- takt mit der organischen Phase vermindern oder die Extraktion des strukturellen Was- sers in das umgebende Medium verhindern [4–6]. Auch hier beherrschen derzeit noch trial and error die Literatur. Bekannt ist die sogenannte logP-Regel, nach der insbesondere sehr hydrophobe Lösungs- mittel wenig mit den Biokatalysatoren inter- agieren und demzufolge keinen negativen Einfluss auf deren Aktivität und Stabilität haben [7]. Allerdings zeigten beispielsweise Wandrey und Mitarbeiter, dass diese Dau- menregel nicht allgemeingültig ist [8]. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass sich trotz früher Pionierarbeiten insbe- sondere durch Klibanov und Mitarbeiter das Thema „nicht-wässrige Reaktionssysteme in der Biokatalyse“ noch nicht flächendeckend Enzyme in organischen Lösungsmitteln Biokatalyse in unkonventionellen Reaktionsmedien BIOspektrum | 01.14 | 20. Jahrgang ¯ Abb. 1: Wasserbal- last (in Liter ver- brauchtes Wasser pro Mol Produkt bei Vollumsatz) in Abhän- gigkeit der eingesetz- ten Substratkonzen- tration. Die eingefüg- ten Quadrate symbo- lisieren reale Mengen aus zufällig ausge- wählten Publikatio- nen. In manchen Fäl- len ist der reale Was- serballast höher als der theoretische, was auf unvollständigen Umsatz zurückzufüh- ren ist.
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100 BIOTECHNOLOGIE
FRANK HOLLMANN1, SELIN KARA2
1DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY, DELFT UNIVERSITY OF TECHNOLOGY, DELFT,
NIEDERLANDE2INSTITUT FÜR MIKROBIOLOGIE, PROFESSUR FÜR MOLEKULARE BIOTECHNOLOGIE,
TU DRESDEN
Biocatalysis in organic media enables higher concentrations of mostlyhydrophobic reagents compared to traditional aqueous reaction systems.The resulting economic and ecologic advantages call for more intensiveresearch efforts to attain deeper understanding of the behaviour of bio-catalysts under non-conventional reaction conditions.
DOI: 10.1007/s12268-014-0412-7© Springer-Verlag 2014
ó Eine grundsätzliche Herausforderung fürdie Anwendung von Biokatalysatoren in derorganischen Synthese liegt in der Hydropho-bizität vieler Reagenzien und der traditio-nellen Beschränkung der Biokatalyse aufwässrige Medien [1]. Die Auffassung, dassdie meisten Enzyme (mit Ausnahme einigerHydrolasen) nur in wässrigen Medien aktivund stabil sind, ist immer noch weit verbrei-tet. Leider begegnen viele wissenschaftlicheArbeiten diesem Problem durch die Verwen-dung kleiner Substratkonzentrationen. Dieresultierenden Systeme sind ökonomisch
wenig sinnvoll und aufgrund des hohen Was-serballasts auch ökologisch fragwürdig. Es istalso an der Zeit, Biokatalyse in wässrigen Sys-temen kritisch zu hinterfragen.
Zunächst müssen verschiedene „Wasser-arten“ in wässrigen Reaktionssystemen unter-schieden werden. Der Großteil des Wassersdient lediglich als Medium, wohingegen einkleiner Teil strukturelle und katalytische Auf-gaben im Biokatalysator übernimmt. Letzteresgebundenes Wasser unterscheidet sich in sei-nen physikalischen Eigenschaften deutlichvom freien Wasser, da es sich direkt in der
Umgebung des Enzyms befindet und hier als„molekularer Schmierstoff“ agiert. MancheEnzyme, wie z. B. α-Chymotrypsin, benöti-gen recht wenig strukturelles Wasser (ca. 50Äquivalente Wasser pro Enzym), währendandere, wie z. B. Polyphenoloxidase, mit3,5 × 107 Wassermolekülen pro Enzymein-heit eher „nasse“ Bedingungen benötigen [2].Das molekulare Verständnis dieses Wasser-bedarfs ist derzeit noch nicht weit gediehenund stellt ein interessantes und zukunfts-weisendes Forschungsgebiet der Biokatalysedar. Unter nicht-wässrigen Reaktionsbedin-gungen wird die Menge des oben erwähntengebundenen Wassers vor allem durch diethermodynamische Wasseraktivität (aW) imReaktionsmedium beeinflusst. Die Wasser-aktivität kann auf verschiedene Weisen (z. B.durch gesättigte Salzlösungen, Paare von Salz-hydraten) gesteuert werden [3].
Neben dem erwähnten Wassergehalt kön-nen auch Additive bei der Katalysatorpräpa-ration (Lyophilisierung und/oder Immobili-sierung) einen großen Einfluss auf die Eigen-schaften des Biokatalysators unter den Reak-tionsbedingungen haben. So werden häufigZusätze wie Kohlenhydrate, Polyole, organi-sche Salze oder Amphiphile zugesetzt, umdie katalytisch aktive Form des Enzyms imheterogenisierten Zustand zu bewahren.Andere Agenzien sollen den direkten Kon-takt mit der organischen Phase vermindernoder die Extraktion des strukturellen Was-sers in das umgebende Medium verhindern[4–6]. Auch hier beherrschen derzeit noch trial and error die Literatur.
Bekannt ist die sogenannte logP-Regel, nachder insbesondere sehr hydrophobe Lösungs-mittel wenig mit den Biokatalysatoren inter -agieren und demzufolge keinen negativenEinfluss auf deren Aktivität und Stabilitäthaben [7]. Allerdings zeigten beispielsweiseWandrey und Mitarbeiter, dass diese Dau-menregel nicht allgemeingültig ist [8].
Zusammenfassend lässt sich feststellen,dass sich trotz früher Pionierarbeiten insbe-sondere durch Klibanov und Mitarbeiter dasThema „nicht-wässrige Reaktionssysteme inder Biokatalyse“ noch nicht flächendeckend
Enzyme in organischen Lösungsmitteln
Biokatalyse in unkonventionellenReaktionsmedien
BIOspektrum | 01.14 | 20. Jahrgang
¯ Abb. 1: Wasserbal-last (in Liter ver-brauchtes Wasserpro Mol Produkt beiVollumsatz) in Abhän-gigkeit der eingesetz-ten Substratkonzen-tration. Die eingefüg-ten Quadrate symbo-lisieren reale Mengenaus zufällig ausge-wählten Publikatio-nen. In manchen Fäl-len ist der reale Was-serballast höher alsder theoretische, wasauf unvollständigenUmsatz zurückzufüh-ren ist.
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durchgesetzt hat. Systematische Untersu-chungen sind dringend notwendig als Daten-grundlage für ein molekulares Verständnisder Interaktion zwischen Biokatalysator undLösungsmittel.
Im Folgenden soll daher hauptsächlich aufdie potenziellen Vorteile von alternativen,wasserfreien bzw. wasserarmen Reaktions-bedingungen eingegangen werden.
Ökonomische und ökologische Vor -teile durch hohe ReagenzbeladungenDer geringen Löslichkeit vieler Reagenzienin wässrigen Reaktionsmedien wird leiderallzu häufig mit entsprechend niedrigen Kon-zentrationen begegnet. Die geringen Pro-dukttiter sind allerdings nur im Falle sehrhochpreisiger Produkte ökonomisch sinnvoll.Ein weiterer, bisher wenig beachteter Aspektliegt in der geringen Ökoeffizienz von ver-dünnten Reaktionslösungen. Einerseits fälltbei solchen Reaktionen ein großer Wasser-ballast an, der energie- und ressourcenauf-wendig aufgearbeitet werden muss. Ande-rerseits ist auch die Produktisolierungerschwert, was sich weiter negativ auf dieUmweltverträglichkeit eines Verfahrens auswirkt. Abbildung 1 verdeutlicht denZusammenhang zwischen Reagenzkonzen-tration und erzeugtem Wasserabfall. Führtman sich vor Augen, dass oftmals ein Vielfa-ches des Produktes als (zu behandelndes)Abwasser entsteht, stellt sich die Frage nachder Umweltfreundlichkeit von Wasser alsLösungsmittel.
Hydrophobe Lösungsmittel ermöglicheninsgesamt höhere Reagenzienkonzentratio-nen, woraus eine deutliche Reduktion desWasserballastes resultiert – allerdings zu demPreis eines zusätzlichen Lösungsmittels, wel-ches unter Umständen selbst eine hoheUmweltbelastung darstellt. Es ist also ratsam,bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Ver-fahrensentwicklung geeignete Lösungsmittelauch hinsichtlich ihres Umweltbelastungs-potenzials zu wählen. Dies ist alles andereals ein trivialer Prozess, da nicht nur dieunmittelbaren Eigenschaften eines Lösungs-mittels (wie Lösungseigenschaften, Siede-punkt, Toxizität etc.) zu beachten sind. Viel-mehr müssen für eine ganzheitliche Betrach-tung auch die frühen und späten Phasen desProduktzyklus betrachtet werden. Dies bein-haltet unter anderem: Wieviel Energie undRessourcen wurden für die Herstellung einesLösungsmittels verbraucht? Wie umweltbe-lastend sind Emissionen des Lösungsmittels,die sich während der Synthese und Anwen-
dung kaum verhindern lassen? Wie wird dasLösungsmittel später entsorgt, lässt es sichenergetisch verwerten oder ist die Entsorgungsogar energieintensiv?
Idealerweise werden also auch biokatalyti-sche Reaktionen lösungsmittelfrei durchge-führt. Im Falle Lipase-katalysierter Reaktio-nen ist das bereits Stand der Technik, ande-re Enzymklassen wie z. B. Alkoholdehydro-genasen folgen [5, 9].
Über die erwähnten Vorteile erhöhter Rea-genzkonzentrationen hinaus ermöglichennicht-konventionelle Lösungsmittel auch dieDurchführung thermodynamisch benachtei-ligter Reaktionen: Wasser stellt in vielen Fäl-len ein konkurrierendes Ko-Substrat dar; dasParadebeispiel hierfür sind Hydrolase-Reak-tionen. Ist die Kondensationsreaktion, bei-spielsweise Veresterung oder Amidierung,erwünscht, so stellt die Hydrolysereaktioneine unerwünschte Konkurrenzreaktion dar.Hält man sich vor Augen, dass in wässrigenMedien die Wasserkonzentration (ca. 55 Molpro Liter) um ein Vielfaches über der Reagenzienkonzentration liegt, wird offen -sichtlich, dass das Gleichgewicht nur sel-ten auf Seiten der gewünschten Produkteliegt. Eine wasserfreie Verfahrensweise isthier also unabdingbar, um hohe Umsätze zuerzielen.
MehrphasensystemeOft kann nicht ganz auf Wasser als Reak-tionsmedium verzichtet werden, etwa wenndiffusible Kofaktoren an der Reaktion beteiligtsind. In diesem Fall stellen Mehrphasenre-aktionssysteme einen interessanten Kom-promiss dar. Verbreitet sind sogenannte two-liquid-phase-Systeme (2LPS). Hier werden dieReagenzien in hoher Konzentration in einer
hydrophoben organischen Phase vorgelegt,von wo aus sie sich in einem Verteilungs-gleichgewicht auch in geringen Konzentra-tionen in der wässrigen Phase lösen und enzy-matisch umgesetzt werden. Die meist auchhydrophoben Produkte reichern sich ent-sprechend ihres Verteilungskoeffizienten wie-der in der organischen Phase an. Somit lassensich insgesamt hohe Reagenzkonzentratio-nen erreichen. Weitere Vorteile liegen in derVerminderung von Substrat- und Produktin-hibition der Enzymreaktion und in der poten-ziell vereinfachten Produktisolation aus derorganischen Phase. Auch können wassersen-sitive Produkte (wie z. B. Epoxide und/oderLaktone) durch Extraktion vor einer Hydro-lyse geschützt werden [10, 11].
2LPS eröffnen darüber hinaus auch häufigdie Möglichkeit zur Reaktionskontrolle. Sokonnten Schmid und Mitarbeiter die selek -tive Anreicherung reaktiver Aldehydinter-mediate durch in situ-Extraktion erreichenund so die Überoxidation zur Säure verhin-dern [12]. In einem ähnlichen Ansatz konntenwir kürzlich die Überreduktion von Säurenzu Alkoholen umgehen (Abb. 2, [13]).
Zu nennen sind hier auch noch sogenann-te slurry-to-slurry-Systeme, in denen einschwer wasserlösliches Edukt in ein ebensoschwer lösliches Produkt überführt wird. ImVergleich zu den besprochenen 2LPS zeich-net sich diese Verfahrensweise durch die Vermeidung des zusätzlichen Lösungsmittelsaus [14].
Eine generelle Herausforderung bei hetero-genen Reaktionssystemen ist, dass oftmalsder Stofftransport über die Phasengrenzegeschwindigkeitslimitierend wird. DurchEmulsionsbildung kann die Fläche der Pha-sengrenze maximiert werden; die dabei auf-
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˚ Abb. 2: Selektive Extraktion reaktiver Aldehydintermediate in biokatalytischen Alkoholoxidatio-nen und Säurereduktionen zur Vermeidung der Über-Oxidation bzw. -Reduktion.
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tretenden Scherkräfte führen allerdings oftzu einer Denaturierung der Biokatalysatoren.
FazitZusammenfassend lässt sich feststellen, dassunkonventionelle Lösungsmittel die Biokata-lyse bereichern. Über die potenziellen öko-nomischen und ökologischen Vorteile hinausermöglichen sie ein weiteres Mittel der Reak-tionskontrolle. Dennoch bleiben viele Fragenderzeit noch offen und bieten so Raum fürweitere bahnbrechende Forschung. ó
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