BIOFILMS ON MEDICAL DEVICES

Colonizzazione cuteMigrazione tratto sottocutaneo

Colonizzazione punta CVC

COMMENSALI della pelle: Staphylococcus epidermidis, S.aureus

Corynebacterium spp

COMMENSALI del tratto intestinale: Escherichia coli Klebsiella, Enterococcus

Batteri ambientali: Pseudomonas aeruginosa Sphyngobacterium spp Stenotrophomonas spp

COOMENSALE delle mucose: Candida albicans

5 milioni di CVC 5 milioni di CVC impiantati ogni annoimpiantati ogni anno

250.000 infezioni associate a 250.000 infezioni associate a catetericateteri

12%- 25% mortalità12%- 25% mortalità

Aumento della spesa ospedaliera da Aumento della spesa ospedaliera da 3000$ a 56167 $ per paziente3000$ a 56167 $ per paziente

American College of Critical Care Medicine e della Society for Healthcare

Epidemiology of America

Superficie di catetere sterileSuperficie di catetere sterile

Film proteico Film proteico depositato sulla depositato sulla

superficie del CVCsuperficie del CVC

Superficie di Superficie di catetere catetere colonizzato da colonizzato da

Staphylococcus epidermidisStaphylococcus epidermidis

ESEMPIO:Central Venous Catheters

greatest risk of device-related infection

infection rates of 3 to 5%.

Biofilms are universally present on CVCsbiofilm development: outside of the catheter or inner lumen

Colonization and biofilm formation may occur within 3 days of catheterization

Metodi utilizzati per la determinazione quantitativa della popolazione microbica adesa a

superfici rigide

Metodi diretti: microscopia ottica elettronica (trasmissione, scansione) confocale

Metodi indiretti: conta UFC di batteri eluiti

con mezzi fisici colorazione batteri adesi e successivo saggio del

colorante eluito radiomarcatura biologici

Svantaggi presentati dai vari metodi: impossibilità di distinguere tra cellule vive e morte possibile alterazione integrità cellulare possibile morte di parte della popolazione batterica distacco non garantito di tutte le cellule impiego di sostanze tossiche decadimento e diluizione dell’isotopo radioattivo necessità di curve di correlazione per ogni microrganismo

METODI DIRETTI

•MICROSCOPIA OTTICA

•MICROSCOPIA ELETTRONICA

•MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE

•MICROSCOPIA A FLUORESCENZA

•MICROSCOPIA CONFOCALE

VANTAGGI

• Facilità di esecuzione

MICROSCOPIA OTTICA

SVANTAGGI E LIMITI

• Non distingue Vivi/Morti

• Porzioni di materiali

Mai diagnostica, mai predittiva, sempre complementare

MICROSCOPIA ELETTRONICA

VANTAGGI

• Caratterizzazione strutture di adesione

• Localizzazione antigeni• Visualizzazione di un

fenomeno

SVANTAGGI E LIMITI

• Non distingue Vivi/Morti• Natura del materiale• Porzioni di materiali• Artefatti• Non facile • ANALISI QUALITATIVA• NON SU BIOMATERIALI

MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE

VANTAGGI

• Dettegli sull’attaccamento microbico

• Osservazione anche del materiale opaco

• SOLO QUALITATIVA

SVANTAGGI E LIMITI

• Non distingue Vivi/Morti • Solo porzioni di materiale• Non facile

VANTAGGI

• Distingue Vivi/Morti con colorazioni differenziali (BacLight Live/Dead)

MICROSCOPIA A FLUORESCENZA (CTC, ARANCIO DI ACRIDINA, DAPI, RODAMINA

123)SVANTAGGI E LIMITI

• Incubazione/Preparazione del campione

SYTO9: COLORANTE CATIONICO LIPOFILICO CHE PENETRA ATTRAVERSO LE MEMBRANE E MARCA I BATTERI VIVENTI CON UNA FLUORESCENZA VERDE

IODURO DI PROPIDIO: COLORANTE ANIONICO CHE NON PENETRA LE MEMBRANE. SE LE MEMBRANE SONO DANNEGGIATE O COMPROMESSE (BATTERI UCCISI) PENETRA E MARCA CON UNA FLUORESCENZA ROSSA

MICROSCOPIA CONFOCALE

VANTAGGI

• Illuminazione laser• Materiale opaco e

trasparente

SVANTAGGI

• Non evidenzia interazioni Interno/Esterno materiale

• Solo porzioni di materiale

METODI INDIRETTI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI ADESI

Metodi di conta con distacco dei batteri

METODO DI MAKI O ROLL TECHNIQUEMETODO DI CLERIMETODO DI SHERETZ

Metodi di conta in situ

MARCATURA CON ISOTOPISAGGI IMMUNOENZIMATICISAGGI BIOLOGICI

Qualitativo

Vantaggi Svantaggi

Coltivazione in brodo di punta del catetere

Grande semplicità

Grande sensibilità

Non discriminante tracontaminazionecolonizzazione

infezione

Impossibilità di determinarese presente più di una specie

Non garantito lo sviluppodi tutte le specie presenti

Necessaria la rimozionedel catetere

Semiquantitativo

Vantaggi Svantaggi

Rotolamento di punta del catetere su piastra per 4 volte

<15 colonie

Contaminazione

Sviluppo di:

>15 colonie

Colonizzazione

Grande semplicità

Facilità di esecuzione

Coltivazione della solaporzione esterna del

catetere

Bassa specificitàBassa predittività

Non garantito il distaccodei batteri

Necessaria la rimozionedel catetere

METODO DI MAKI O ROLL TECHNIQUE

Ampiamente utilizzato per cateteri venosi

Semina mediante striscio su opportuni terreni solidi

Microrganismi vivi

Semi-quantitativo (CRI)

Vantaggi Svantaggi

Coltivazione della punta edel segmento distale del catetere

Sonicazione, vortex

<102 colonie

ContaminazioneSviluppo di:

>102 colonie

Colonizzazione

Microrganismi viviSensibilità alta

Facilità di esecuzioneNon distingue tra

colonizzatori parte esterna e lume

Non garantita la vitalitàed il distacco dei batteri

Necessaria la rimozionedel catetere

METODO DELLA SONICAZIONE

Distacco dei microrganismi adesi o mediante sonicazione o vortex

SAGGI IMMUNOLOGICI ELISA

VANTAGGI

•No radioattivo

SVANTAGGI E LIMITI

• Conoscenza del microrganismo• Espressione dell’antigene

• Semi-quantitativa • Microrganismi in superficie• Antigene nella forma

plantonica è espresso?• Curve di riferimento

Metodi biologici

VANTAGGI•No radioattivo•Indipendente dallo

stato del microrganismo (plantonico/sessile/biofilm)

•Distingue vivi da morti

•Nessuna manipolazione del supporto abiotico

SVANTAGGI E LIMITI

• Curve di riferimento con metodo della conta delle UFC

Correlazione tra un fattore batterico (ATP, consumo di O2, produzione di CO2, ecc.) e numero di batteri

Contenuto di ATP e numero di batteri

VANTAGGI•Indipendente dallo stato del

microrganismo (plantonico/sessile/biofilm)

•Distingue vivi da morti

SVANTAGGI E LIMITI

• Curve di riferimento con metodo della conta delle UFC

• Rottura dei batteri non sempre efficace

Correspondence curves between log CFU-per-milliliter and log relative light unit (RLU) mean values

IL METODO BIOTIMERIL METODO BIOTIMERIL METODO BIOTIMERIL METODO BIOTIMER Consente di determinare il numero di batteri adesi, aggregati o in

biofilm, mediante un test biochimico e non mediante la classica determinazione del numero delle unità formanti colonia (UFC)

Il BioTimer utilizza un terreno di coltura contenente un indicatore di pH (rosso fenolo), che vira dal rosso al giallo in seguito all’acidificazione del terreno

Il tempo richiesto per il viraggio dell’indicatore viene correlato con il numero di cellule batteriche presenti inizialmente nel campione attraverso una curva di correlazione specifica

Il nuovo metodo consente di determinare il numero di batteri in situ, senza manipolazione del campione

Ceppi utilizzati

Streptococcus sobrinus ATCC33478T

Streptococcus oralis ATCC35037T

Escherichia coli MG1655 ATCC47076Staphylococcus aureus ATCC6538Pseudomonas aeruginosa PAO1

Esempi di curve di correlazione tra tempo di viraggio dell’indicatore e

numero dei batteri presenti nel campione

Log UFC

Tempo (ore)

Log UFC

4

5

6

7

8

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

y = -0,3056x + 8,2608

Streptococcus sobrinus

4

5

6

7

8

6 7 8 9 10 11 12 13 14

y = -0,301x + 9,0615Streptococcus oralis

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 6 7 8

y = -0,5443x + 8,5446

Staphylococcus aureus

Log UFC

Tempo (ore)

Concentrazione Minima Inibente

Metodi di valutazione dell’attività degli antibiotici

in vitro

Metodi di valutazione dell’attività degli antibiotici

in vitroMETODI PER DILUIZIONE in TERRRENO LIQUIDO o SOLIDOMETODI PER DIFFUSIONE in TERRENO SOLIDO

11

22

MICMICMICMIC

Concentrazione Minima Battericida

MBCMBCMBCMBC

SOLO PER BATTERI IN FORMA PLANCTONICA!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

NON IDONEO PER BIOFILM

National Committee for ClinicalLaboratory Standards (NCCLS)

Calgary device

Sistema per la determinazione della minima concentrazione per l’eradicazione del biofilm (MBEC)

APPLICAZIONE DEL BIOTIMER NELLA DETERMINAZIONE DIRETTA DELLA

SUSCETTIBILITA’ AGLI ANTIBIOTICI DA PARTE DI BATTERI ADESI IN BIOFILM A

CATETERI

NESSUNA MANIPOLAZIONE DEL CAMPIONE !!!!!!!!!!!!!