BIOCOMBUSTIBLES DE 2G: Situación actual y perspectiva en Cuba · Glucosa y Xilosa Proceso a partir...
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BIOCOMBUSTIBLES DE 2G: Situación actual y perspectiva en Cuba
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BIOCOMBUSTIBLES
DE 2G: Situación
actual y perspectiva
en Cuba
Alcohol industry in Cuba
• 12 distilleries, distributed in 9 provinces,
with a production capacity of 1.7 million
hectolitres/year
• Work Research for the production of
biofuels in two directions:
a. Bio-ethanol from Sugarcane Bagasse
b. Biodiesel from oleaginous yeast.
3
Incremento de la producción de bioetanol como combustible por sus características de ser renovable.
Etanol de azúcar (remolacha), mieles (la caña de azúcar), o amiláceas (el maíz, trigo, sorgo).
Utilización de cultivos para la producción de combustible, que no compita con la producción de alimentos.
Biomasa lignocelulósica, (bagazo, residuos de cosecha, residuos forestales), como materia prima para la producción de etanol.
SITUACION ACTUAL
4
El mercado del etanol combustible
El empleo del etanol como combustible automotor, tendrá sentido
en mezclas con la gasolina sustituyendo al MTBE, de acuerdo a las
demandas crecientes de combustibles.
5
La biomasa: alternativa para lograr los
incrementos en la producción de etanol
Granos
Celulosa
0
5
10
15
20
25
30
35
2000 2005 2010 2015 2020 2025
Año
Eta
no
l (B
illo
ne
s d
e g
al/
a)
Mieles y azúcar
6
Lignina: 15-25% estructura aromática compleja
alto contenido de energía
resistencia a conversión bioquímica
Hemicelulosa: 23-32% Xilosa es la 2da azúcar mas
abundante en la biosfera
polímero de 5- y 6- átomos de C
Celulosa: 38-50% la forma mas abundante de
carbono en la biosfera
Polímero de glucosa, buena materia prima bioquímica
Constituyentes
Lignocelulósicos
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
OH
O
HO
H3CO
OH
OCH3
OCH3
O
O
O
OH
OCH3
OCH3
H3CO
OO
HO
H3CO
HO
OCH3
OCH3
OH
O
HO
H3CO
OH
OCH3
OCH3
O
O
OH
OCH3
OCH3
OCH3
O
O
O
OH
HO
O
O
O
O
OH
HO
OH
OH
O
O
O
OH
HO
OH
OH
O
O
O
OH
HO
OH
OH
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO
OHO
7
BIOMASA
Hidrólisis enzimática
Separación de
la lignina
Fermentación
Destilación-
deshidratación
Etanol
Pretratamiento
Celulosa y
hemicelulosas
Glucosa y Xilosa
Proceso a partir de biomasa lignocelulósica:
ETANOL CELULOSICO
8
AVANCES DE LOS PROCESOS DE ETANOL DE
LIGNOCELULOSA
1950 Hidrólisis ácida Glucosa a etanol
No uso de hemicelulosa
Producción de enzima
Hidrólisis enzimática
Glucosa a etanol
No uso de hemicelulosa
1970
Hidrólisis enzimática Glucosa a etanol Azúcares hemicelulósicos a etanol
Producción de enzima Hoy
Producción de enzima
Hidrólisis enzimática Glucosa a etanol
No uso de hemicelulosa
1980
Producción de enzima Hidrólisis enzimática Glucosa a etanol Azúcares hemicelulósicos a etanol
Mañana
9
ABENGOA BIOENERGIA
Desarrolla un proyecto por 35 Millones de euros dentro del
Programa CENIT (España) para el desarrollo y optimización de la
síntesis catalítica.
Presente en los tres grandes mercados mundiales del bioetanol :
Estados Unidos, Europa y Brasil (asociación con Dedini Agro).
Es el primer productor Europeo y quinto en Estados Unidos.
En agosto del 2006, el Departamento de Energía de los Estados
Unidos (DOE) impulsó el desarrollo de un proyecto híbrido, con una
capacidad de producción de etanol de 100 millones de galones al
año: 12 de biomasa lignocelulósica y 88 de almidón. La energía para
el proceso se generó por gasificación de biomasa.
10
TECNOLOGIA ABENGOA
Etanol
Pretratamiento
Tecnología
SunOpta Destilación
Biomasa
lignocelulósica
Hidrólisis y
Fermentación
Microorganismo levadura
modificada genéticamente
Sacarificación y Co-
fermentación Simultanea
(SCFS)
Enzima
Comercial
Novozyme
11
12
BIOMASA
CONVERSIÓN
DE BIOMASA
BIOREFINERÍA
Laboratorio Nacional de Energías Renovables (NREL) de EEUU
Instalación que integra procesos de conversión
de biomasa para producir combustible, energía
y productos químicos
Productos Químicos
Y Materiales Polímeros,
Plásticos,
Textiles
Combustible
Etanol
Diesel
Gasolina
Keroseno
Energía
CONCEPTO DE BIOREFINERIA
Plataforma Bioquímica Fermentación de azúcares
Plataforma Termoquímica Gasificación
13 13
Fábrica
Levadura
Biogás
Vinaza
Producción
alimentos
Central
azucarero Bagazo
Fábrica
Tableros
Caña, Residuos
Biomasa
cañera
Fábrica
Pulpa
Papel
Papel
Destilería
Etanol
Energía
DIVERSIFICACIÓN DE LA CAÑA DE AZÚCAR
14
TRABAJOS
REALIZADOS
Antecedentes Centros Participantes
Talleres Realizados
Colaboración Internacional Estrategia para las condiciones
cubanas
15
ANTECEDENTES NACIONALES 70´s: ICIDCA y CENIC Prehidrólisis ácida del bagazo.
90´s: Universidad de Matanzas, el ISPJAE, la Universidad Central de Las Villas,
Cuba 9 y el ICIDCA trabajos en la prehidrólisis, estudio del complejo
enzimático, hidrólisis enzimática y purificación de licores hidrolíticos.
Inicios del 00´s: Universidad de Matanzas (en colaboración con la Universidad
de Lund) levadura modificada genéticamente para la conversión de las
pentosas en etanol.
2003: ICIDCA (con colaboradores dominicanos y brasileños): esquema de
pretratamiento e hidrólisis con recirculación de la enzima.
2012: ICIDCA dirige un proyecto ramal MINAZ y Cuba 9 desarrolla otro en el
PNCT de la Agroindustria Azucarera. Análisis de posibles alternativas de
Microorganismos Genéticamente Modificados. Intereses de I+D en la temática
con grupos españoles y empresarios canadienses.
16
Process by Alkalyne
Pretreatment
17
PRETRATAMIENTO ALCALINO
Validación del tratamiento alcalino.
Optimización del tratamiento:
Efecto del hidromódulo (1:20,
1:10)
Tamaño de partícula (molido e
integral)
Temperatura y % de NaOH
HIDRÓLISIS ENZIMATICA
Validación y optimización de
la hidrólisis enzimática:
Determinación de la
concentración óptima de la
enzima.
Efecto de la temperatura (30
y 50oC).
Selección del número de
ciclos en la recirculación del
licor y el reuso de bagazo
residual.
Trabajos de I+D a partir de bagazo (ICIDCA)
Purificación de licores hidrolíticos: tratamiento con carbón
activado y con columnas de intercambio iónico.
18
PRETREATMENT WITH STEAM
EXPLOSION
Reactor of 2 liters with 42 kg/cm2
of maximun pressure
Material : 200 g
Saturated steam is injected until
achieve the temperature and then
discharge the material in a ciclon.
CIEMAT
19
1230ºC2 min
2190ºC2 min
3230ºC10 min
4190ºC10 min
5210ºC6 min
6210ºC6 min
7210ºC0,34min
8238ºC6 min
9182ºC6 min
10210ºC12 min
94 94 84 93 95 93 96 86 95 96
97 96 93
99 96 93 93 84
98 96
26
86
15
54 31 39
91
15
90
30
52
65
48
60
57 54
71
49
69
52 Hemicel
Lignina
Celulosa
MASS BALANCE
(% g/g )
(% del
Componte
disponible )
< Cellulose recovery
others options are
(94 – 96%)
DIFFERENTS
< Lignin recovery
others option
(96%- 99%)
< Hemicellulose
recovery
< Yield .
Hemicelluloses are
solubles
20
Acetic Acid
Formic Acid
Furfural
Benzaldehyde
Vainillin + syrin Aldehyde
Cumaric acid
Ferulic acid
MASS BALANCE LIQUID FRACTION
DEGRADATION COMPOUND
Acetic acid
concentration
Degradation of
xilose and furfural
HMF and formic
acid concentration
lignin
degradation
DIFFERENTS
21 21
BIOETHANOL
production Simultaneous Sacarification and Fermentation
Process
0
10
20
30
40
50
60
0 50 100 150
10%
15%
20%
Bio
eth
an
ol
(g/ L
)
Time ( h)h)
Pretreatment
(230ºC 10 min)
Hidrólisis
Enzimática SFS
pretreated (%) 10 10
Potential glucose (g/L) 60.34 60.34
Glucosa Liberada (g/L) 50.9
Rendimiento de
Hidrólisis 84.4
Etanol (g/L) 23.36 25.83
Rendimiento Etanol
g/ g glucosa disponible) 0.387 0.428
Enzymatic
Hydrolysis
Hydrolyzed Yield 84.4
Able Glucose (g/L) 50.9
23.36 25.83 Bioethanol (g/L)
SFS
Bioethanol Yield (g/g) 0.387 0.428
Effect of the Substrate Concentration
Biomass
pretrated (%)
Bioethanol
(g/L) Yield , Bioethanol/ able glucose
10 25.83 0.428
0.431
0.401
15 39.02
20 48.38
22
BALANCE DE LA
CONVERSION DE
BIOMASA (BAGAZO) A
ETANOL
300 t de bagazo integral
150 t de bagazo seco
66 t de celulosa
63 t de AR
300 HL de alcohol/ d
Proceso de obtención de etanol a partir
de bagazo (ICIDCA)
CONDICIONES DE HIDRÓLISIS
TIEMPO 16 h , T= 50ºC
CONVERSIÓN DE CELULOSA
(85-90%)
23
ESQUEMA TECNOLOGICO PRELIMINAR (ICIDCA)
El costo beneficio no compite para el
establecimiento del proceso por excesivo
gasto de enzima y elevado costo de la
misma.
24
1. 5 % (p/p) pretreated bagasse of Solid Concentration
2. Enzymes: 15 UPF/g of the substrate of Novozymes
50013 (65 UPF/ml ) Cellulose and 15 UI /g of the
substrate Novozymes 50010 (600 UI) ß- glucosidase
in buffer acetate 0,05 M; pH 4,8
3. Temperature of 50ºC during 72 h with 150 rpm
ENZIMATIC HYDROLYSIS
25
Condición Temp °C Tiempo
(min)
% Glucosa Glucosa
potencial
g/L
Glucosa
liberada
g/L
Rend.
Bagazo
pretratado
1 200°C
5 min 63.94
33.65 19.36 57.53
2 215°C 5 min 70.36 37.03 29.24 78.96
3 230°C 5 min 60.96 32.09 28.89 90.02
0
20
40
60
80
100
200°C 5 min
215°C 5 min
230°C 5 min
H.E Rend %
Rendimiento de Hidrólisis enzimática
26
OBTENCIÓN DE ETANOL POR
SACARIFICACIÓN Y FERMENTACIÓN
SIMULTÁNEA (SSF)
27
Sacarificación Carga de enzima de 20 UPF/g de sustrato de Novozymes 50013 (65
UPF/ml ) de Novozymes 50010 (600 UI/ml) ß- glucosidasa disueltas en
tampón acetato 0.05 M pH 4.8
Carga de enzima de 75UI/g de sustrato de Novozymes 50030 550UI/ml
disuelta en tampón acetato 0.05 M pH 4.8
Temperatura de 50ºC durante 8 horas a 150 rpm
Fermentación Composición del Medio de cultivo (g/L)
Extracto de levadura 2.5
Pectona 2
NH4Cl 2
KH2PO4 1
MgSO4 0.3
Microorganismo: Sacharomyces cerevisiae. Relación de
inoculación 4% (v/v)
Temperatura 35ºC a 150 rpm
28
Bioethanol
g/L
Ys/p (HE) Yield
SSF 16% 44.93 0.420 89.36
SSF 18% 51.18 0.419 89.14
SSF 20% 56.3 0.415 88.29
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Yie
ld, %
Time (h)
SSF16%xil
SSFx 18%
SSFx 20%
29 29
Selección de cepas S. cerevisiae autóctonas
promisorias para la fermentación de hidrolizados
lignocelulósicos. A3
Contro
l 200 MPa/30 min.
1.5 M NaCl
3.2 mM
H2O2
CM 381
105 104 103 102 105 104 103 102 105 104 103 102
373
Contro
l 200 MPa/30 min.
1.5 M NaCl
3.2 mM
H2O2
XA3-1
105 104 103 102 105 104 103 102
Actividad alcohol deshidrogenasa (ADH) en cepas S.
cerevisiae
0
0,5
1
1,5
2
2,5
A3 373 381 CM XA3-1
cepas
un
idad
es/m
g p
rote
ina
glucosa
etanol
La cepa A3 resultó
promisoria debido a la
alta sobrevivencia que
tuvo frente a la presión
hidróstatica, inhibidores y
alta actividad AHD.
30
Selección de microorganismos con actividad
enzimática celulolítica.
CEPAS 3 6 7 8 12 13 17 20
PROCEDENCIA P B B B P B M Tr 101-20-1
Se realizó un muestreo de materiales celulósicos con indicios de
degradación. Papel
Bagazo enmohecido
Corteza de árbol
Procedimiento:
a) Suspensión en agua / tween 80
a) Siembra a profundidad en Celulosa-Agar (CA)
b) Aislamiento colonias celulolíticas en Malta-Agar
c) Screening de colonias a partir de siembra en placas en medio CA por punción
triplicada
d) Análisis del coeficiente de Degradación Celulosa (DC) por medición
del halo degradativo:
DC = (dh/dc) – 1 dh: diámetro halo degradativo
dc: diámetro colonia
DEGRADACIÓN CELULOLÍTICA
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
3 6 7 8 12 13 17 20Tr
CEPAS
DC
50ºC
30ºC
31 31
Fermentación sumergida en Erlenmeyers 250 mL:
• 50 mL solución trazas Mandels & Reese
• sales de amonio
• Urea
• extracto levadura
• Papel de filtro Whatman No.1…. 1%(w/v) (fuente C)
• Tween - 80 0.1 % (v/w)
hongos pre-seleccionadas
6, 7, 8, 13, 21
condiciones fermentación: 30 ºC X 72 horas 200 r.p.m
32 32
Estudio de la estabilidad de los crudos enzimáticos 27, J-1, M5-2, 6, 13 y 21
Estabilidad del crudo enzimático de la cepa J-1
33 33
Análisis de la electroforesis en SDS-page aplicada a los
crudos J-1, 27, M5-2, 6 y 21 y a los productos comerciales de
la NOVOZYMES NS50030, NS22002. NS50013 y NS50010
Kim D. et al., 1994 Endo (52, 60, 42 y 38 kDa) Exo (62 kDa)
34 34
Volumen: 5 m3
Carga: 250 kg de bagazo /ciclo de pretratamiento
Condiciones: 18 kgf/cm2 durante 8 min
Hidrolizador Industrial Jesús Rabí, Matanzas, Cuba
35
Síntesis (t. ebull)
tiempo: 2 hr
Mezcla de extracción
Mezclado y calentamiento
Ésteres etílicos de ácidos grasos
(BIODIESEL) Glicerina
Alcohol
Mezcla de extracción
Aceite
reciclado
Alcohol
Catalizador
BIODIESEL
36
BIODIESEL. Reactor de Planta Piloto ICIDCA
37
Crecimiento de Chlorella vulgaris en vinazas
Resultados
Comparación de crecimientos
0
5
10
15
20
25
30
35
0 2 4 7Días
millo
nes d
e c
el/m
L
12,50% 100% Control
30.30
24.45
23.93
11.50 10.28
BIODIESEL DE MICROALGAS
38
Área experimental de Jatropha (especie de Cabo
Verde) en la Granja agropecuaria de Paraguay
0.8 ha con 5 meses de vida:
-Sembrada:24-5-08
- Fecha de fotos: 12-11-08
Marco de siembra- 4 por 3
Problemas presentados.
- Extrema sequía durante los 6
meses siguientes a noviembre
de 2008.
39
Evaluación de cepa
R.toruloides en vinazas para
la producción de aceites
microbianos
40
Ventajas de la producción de aceites microbianos 1- Biomasa rica en grasas : Suplemento nutricional en la alimentación animal 2- Composición similar a los aceites vegetales : Alternativa para la sustitución parcial o total de combustibles fósiles 3- Producción de biosurfactantes de alto valor agregado en la cosmética y la bioremediación Microorganismos: Levaduras oleaginosas : sp. Rhodosporidium, Rhodotorula, Lypomices, Yarrovia, Cryptococcus, Trichosporon
41
Materiales de desecho Microorganismo Escala Tipo de cultivo Lipidos (%)
Efluente de la producción Y. lipolytica Fermentador Fed batch 50,8
de aceite de palma y
glicerol industrial
Glicerol industrial R. toruloides Fermentador Batch 74,1
Glicerol industrial C. curvatus Fermentador Fed batch 52,9
Grasas amarillas y glicerol C. curvatus Fermentador Fed batch 52
industrial
Glicerol industrial C. freyschussii Fermentador Fed batch 34
Glicerol industrial R. glutinis Fermentador Fed batch 61
Empleo de materiales de desecho para la
producción de lípidos microbianos.
42
Empleo de vinazas de destilerías para la
producción de lípidos microbianos
43
Evaluación del crecimiento celular a
diferentes factores de dilución
El crecimiento celular logró
alcanzar valores de concentración
celular similares al medio control
(YPG) pero fue más lento.
La cepa no mostró inhibición en la
vinaza
Vinaza
Medio t
(h) X max
(g/L) µ
(1/h)
YPG 24 14,1 0,25
Factor 1 72 14,5 0,116
44
Efecto de la concentración de glicerol sobre el
crecimiento y producción lípidos
1
2
0
2
0
4
0
6
0 8
0
1
0
0
0
0
5
10
15
20
25
30
20 40 60 80 100 120
Conc. Cel (g/L) Ys/x
Concentración
glicerol (g/L)
45
conc
NH4SO4
(g/L)
C/N
Biomass
conc (g/L)
Conc
lipidos
(g/L)
Lipid
content
(%) 2,17 50 13,0 2,6 19,9 1,09 100 11,9 3,8 31,5 0,72 150 11,2 3,7 33,0 0,54 200 12,6 4,3 34,0 0,43 250 11,0 4,3 39,3 0,36 300 11,6 4,5 39,2 0,27 400 10,8 4,1 38,2
46
Evaluación de la cepa en mieles y en vinaza suplementadas
con glicerol con limitacion de nitrogeno: C/N = 250
Miel Vin dil +glic
puro Vin dil + glic
ind
Conc cel
(g/L) 28,9 36,6 42,5
Y X/S (g/g) 0,66 0,76 0,84
Conc lipidos
(g/L) 6,1 7,53 9,35
Lípidos (%) 21,1 20,6 21,9
t (h)
KH2PO4 0,4 g/L MgSO4.7H2O 1,0 g/L
NH4 SO4 0,1 g/L
47
Composición de los
metilesteres
La composición de los metilesteres
es muy similar cuando se emplea
mieles y vinaza suplementada con
glicerol purificado
El uso de glicerol crudo reduce la
presencia de los acidos palmítico y
esteárico e incrementa la
producción de acido oleico
Los aceites extraídos de la cepa
contienen un porciento
considerable de ácido linolenico
48
Max Cell conc: 70,4 g/L
Lipid content: 34 %
Lipid conc: 21,1 g/L
Cultivos incrementados, Fermentador 2L
Max Cell conc: 72 g/L
Lipid content: 60 %
Lipid conc: 43,2 g/L
PROYECTOS
1. POLILACTATOS:
Programa Ramal de la Agroindustria Azucarera “PRODUCCION DE ACIDO LACTICO Y SUS DERIVADOS A PARTIR DE SUSTRATOS DE LA INDUSTRIA AZUCARERA” (250).
2. POLI-HIDROXIALCANOATOS:
Programa Ramal de la Agroindustria Azucarera “PRODUCCIÓN DE POLIi--HIDROXIBUTIRATO POR FERMENTACIÓN SUMERGIDA” (261). Colaboración: Facultad de Biología de la Universidad de La Habana Instituto de Ciencias Medioambientales de la Universidad de Zurich, Suiza.
Objetivos
1. Seleccionar cepas productoras de Poli-β-hidroxibutirato y de D- ácido láctico y caracterizar su producción en las mismas.
2. Establecer una metodología para el seguimiento, determinación y cuantificación de la producción de Poli-β-hidroxibutirato y de ácido láctico.
3. Evaluar el efecto en la producción de Poli-β-hidroxibutirato y de ácido láctico de diferentes fuentes de carbono y nitrógeno en el medio de cultivo.
4. Aislar, purificar y caracterizar el Poli-β-hidroxibutirato y el D- ácido láctico.
5. Iniciar estudios de polimerización con ácido láctico para obtener los polilactatos.
Estrategia General de Trabajo
Microorganismos 1. Selección de bacterias productoras de Polihidroxialcanoatos y de ácido láctico
2. Establecer una metodología para el seguimiento, determinación y cuantificación de la producción de Poli-β-hidroxibutirato y de ácido láctico.
3. Optimización de medio y condiciones de cultivo
Bacterias productoras
↑↑ acumulados PHAs y de ácido láctico
4. Aislamiento y purificación
5. Caracterización
1. Selección de Bacterias Productoras de PHB
1. Detección cualitativa de la producción de PHAs mediante reacciones de tinción.
Spiekerman y cols. (1999), Arch. Microbiol. 171: p. 73–80.
1
2
3
A
1
2
3
B C
4
5
6
1. Bacillus megaterium 2. B. subtilis B/ 23-44-4 3. Rhizobium sp. 4. P. putida N-14 5. P. citronellolis E-23 6. P. citronellolis N-312A
Bacillus megaterium
1. Selección de Bacterias Productoras de PHB
Cepas Peso seco celular (PSC) (mg) mg PHB % PHB/PSC
B. subtilis B/ 23-44-4 6.6 3.34 50.6
B. licheniformis B/ 23-26-3 8.2 2.43 29.6
B. licheniformis B/ 23-26-4 5.6 1.95 34.8
B. megaterium 6.5 1.74 26.8
P. putida N-14 7.0 nd -
P. citronolellolis E-23 7.6 nd -
P. citronolellolis N-312A 7.1 nd -
P. citronolellolis V-12 6.4 nd - Rhizobium sp. 5.1 0.20 3.9
nd: no detectable Brandl, H. (1993), Proceedings of the International Symposium on Bacterial Polyhydroxyalkanoates.Gottingen, p. 441-442
1. Selección de Bacterias Productoras de ácido láctico
1. Selección de bacterias productoras de ácido láctico a partir de sustratos azucareros
• Hojas, tallos y raíz de caña de azúcar
• Suelo húmedo cultivado con caña
• Hierba alrededor del ingenio azucarero
• Bagazo
• Compost
• Miel de caña de diferentes tipos
• Alimento animal a partir de sustratos azucareros
• Excretas de animales que se alimentes de caña de azúcar y derivados.
• Cultivo de lombrices o insectos sobre caña de azúcar.
Se muestrearon 6 complejos agroindustriales azucareros: 1. España Republicana 2. Habana Libre 3. Héctor Molina 4. Ciro Redondo 5. Melanio Hernández 6. Boris Luis
86 muestras
1. Selección de Bacterias Productoras de ácido láctico
1. Selección de bacterias productoras de ácido láctico a partir de sustratos azucareros
Muestra No. Colonia Apariencia Ácido Láctico total (g.l-1) % D- A.L MUD-001 1.4 Redonda 38.50 97.13 blanca 5 mm COM-010 10.7 Redonda, Azul clara 2mm 48.72 100.00 10.9 Redonda, amarilla intensa 49.74 100.00 COM-021 21.1 Redonda de bordes irregulares> 2 mm opaca 17.50 100.00
A.L: ácido láctico
Decoloración de la placa de
bromocresol verde en diferentes
etapas.
2. Optimización de medio y condiciones de cultivo
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
10 15 20
C source (g.l-1)
PH
B p
roduction (
g.l-1
)
Glucose Sucrose
Mannitol Glycerol
Acetate Molasses *
Figure 1. Poly-β-hydroxybutyrate production by Bacillus megaterium cultured in 24-Well Microplates with different carbon sources during 12 h at 30ºC. * molasses were used as carbon source at 1.0, 3.0 and 5.0 % (w/v) in the media (unpublished data)
2. Optimización de medio y condiciones de cultivo
2. Optimización de medio y condiciones de cultivo
Figure 2. Growth kinetic and PHB production of Bacillus megaterium cultured in 500 ml Erlenmeyer’s with a working volume of 100 ml (150 r.min-1, 30ºC, 24 h). It was used the base media for microculture supplemented with molasses 1% (w/v).The growth was fallowed measuring the optical density of the culture at 660 nm and the PHB production at 210 nm by HPLC (unpublished data)
0 0 0.34
4.53
22.8
26 26.4
14.18
0
5
10
15
20
25
30
0 2 4 6 8 10 12 24
Time (h)
% P
HB
/ D
CW
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Gro
wth
, O
.D 6
60 n
m
% PHB/DCW O.D 660 nm
2. Optimización de medio y condiciones de cultivo
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Time (h)
PH
B p
rod
uctio
n (
g.l-1
)
Sugarcane molasses
Sugarbeet molasses
Figure 3. Kinetic of PHB production of Bacillus megaterium on Beet and Sugarcane molasses at 1% (w/v). The media was supplemented with yeast extract 1.0 g.l-1 and sodium chloride 2.5 g.l-1. The cultures were carried out in 500 ml Erlenmeyers at 30º C, 150 r.min-1 and starting pH of 7.0
Comparación de cepas en cuanto a las características productivas
con medio MSC, a 40 oC y pH 6,0.
0.37 77.10 45.00 Lactobacillus
inulinus
0.33 99.20 40.00 Sponolactobacillus
inulinus
0.25 99.30 3.00 Bacillus
laevolacticus
1.08 98.10 60.00 10.7 (autóctona)
Productividad (g/Lh) %D(-) AL (g/L)
2. Optimización de medio y condiciones de cultivo
Tabla II Influencia del medio de cultivo sobre las características
fermentativas en la producción de AL D(-).
Fte de
C
Conc.final AL,
g/L
Productividad
máx, g/Lh
Esteroespecificidad,
%
1 68,9 1,373 100
2 42,3 0,846 100
3 59,9 1,09 100
4 85,0 1,277 100
5 93,4 1,542 100
1. MSC con sacarosa 2. Guarapo + sales de MSC 3. Guarapo 4. MSC con Guarapo 5. Guarapo + Hidrolizado de levadura + sales de MSC
2. Optimización de medio y condiciones de cultivo
Fig. 7 Estimación del costo por gramo de ácido láctico
considerando la etapa fermentativa.
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
1,35 1,4 1,45 1,5 1,55 1,6
Pmax, g/Lh
Co
sto
un
itari
o, $
/g var.2 GLS
var.1
MSC
3. Aislamiento y purificación
3. Aislamiento y purificación
3.1 Ácido láctico
lactato de calcio + H2SO4 = CaSO4 (precipitado) + ácido láctico
• Rendimiento Global (atendiendo a producción de A.L): 75.5 % • Remoción de color: 80.77 % • Eliminación proteínas: 69.75 % • Eliminación ART residuales: 19.7 %
3.2 Poli-β-hidroxibutirato
• Tratamiento con Hipoclorito de sodio 5% (v/v) • Tratamiento con Surfactantes 1 % (p/v) • Extracción con solventes orgánicos
3. Aislamiento y purificación
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5
Methods of purification
PH
B o
n F
inal P
roduct
(%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Recovery
(%
)
PHB on Final Product (%)
Recovery (%)
Figure 8. Partial purification of PHB from Dry cells of Bacillus megaterium. It was determined the % of PHB in the final products by HPLC and the recovery. 1: incubation with SDS 1% (w/v) and final wash with sodium hypochlorite 5% (v/v). 2: incubation with Triton X-100 1% (w/v) and final wash with sodium hypochlorite 5% (v/v). 3: treatment with sodium hypochlorite 5% (v/v). 4: treatment with sodium hypochlorite 5% (v/v) and sodium bisulfite 2% (w/v). 5: extraction with methylene chloride and methanol. (unpublished data)
2 cm
1
5 6
23
4
2 cm2 cm2 cm
1
5 6
23
4
1
5 6
23
4
7 1-Hipoclorito de sodio 5% (v/v) 2-Hipoclorito de sodio 5% (v/v)+ EDTA 10 mmol/L 3-Bisulfito de sodio 2%(p/v)+ Hip. de sodio 1%(v/v) 4-Triton X-100 1% (p/v) 5- SDS 1% (p/v) 6- Metanol-Cloroformo 7-Cloruro de metileno-metanol
3. Aislamiento y purificación
Extracción – Purificación del ácido láctico
a partir del caldo fermentado.
Objetivos:
a. Conservar la concentración de AL lograda en fermentación.
b. Remover color
c. Eliminar la mayor cantidad de proteína del caldo.
d. Eliminar la mayor cantidad de azúcares residuales.
Purificación
Los caldos de fermentación son de naturaleza
compleja: carbohidratos, proteínas, lípidos, sales y
otros metabolitos. Esto hace difícil y costoso el
proceso de recobrado del ácido láctico.
Células
Azúcares
Proteínas
Sales
Ácidos orgánicos
(ácido láctico)
Caldo fermentado de Lactobacillus COM 10.7
Ozono
S5
Concentrado de
ácido láctico
Ozonificación para disminuir color 60-70 % de ácido láctico
Ozonificación para disminuir color 60-70 % de ácido láctico
Centrifugación
Lactato de calcio 75 ºC, lentamente
Biomasa
Sobrenadante
Agitación y calentamiento (75ºC)
pH = 11, filtración al vacío. Contaminantes
Ca(OH)2
Agitación y calentamiento (75ºC) pH = 2.
Sobrenadante (AL+ impurezas)
75 ºC, lentamente
Ca SO4 (S)
Yeso
75 ºC, lentamente
Lavado con agua
Filtración
Carbón activado
Ácido Láctico 75 ºC, lentamente
Impurezas y carbón 75 ºC, lentamente
Ácido Láctico 75 ºC, lentamente
Concentrar por evaporación
Ozonificación
H2SO4
S3
S5
S6
S1
Filtración al vacío
Filtración al vacío
Ácido Láctico 75 ºC, lentamente
2 (CH3CHOHCOO)Ca2++ H2SO4(C) = 2 CH3CHOHCOOH + CaSO4 (s) S2
S4
Diagrama del proceso de recuperación- purificación del ácido láctico a partir del caldo fermentado.
Variables Nivel ( -1) Nivel (1)
Concentración de
carbón
activado
(X1)
1 g/L. 4 g/L.
Temperatura (X2) 25 C 75 C
Flujo de ozono
(X3) 0 L/ min 30 L/ min
Valores de cada nivel para las variables analizadas.
Resultados de la remoción de color y la concentración de AL según las corridas
experimentales correspondientes al diseño experimental 2³
Corri
das
C. de
carbón
activado
(g/L)
Tempera
tura (C)
Flujo de
ozono
(L/ min)
RAL
%
Rcolor
%
1 -1 -1 -1 84,3 39,7
2 1 -1 -1 71,3 73,4
3 -1 1 -1 83,1 34,7
4 1 1 -1 71,9 70,3
5 -1 -1 1 82,3 66,7
6 1 -1 1 73,7 78,1
7 -1 1 1 82,2 76,5
8 1 1 1 72,4 86,5
9 -1 -1 -1 87,6 40,2
10 1 -1 -1 74,2 74,5
11 -1 1 -1 84,0 35,6
12 1 1 -1 70,7 71,0
13 -1 -1 1 83,1 67,2
14 1 -1 1 73,6 78,7
15 -1 1 1 83,1 76,9
16 1 1 1 71,2 87,4
PC1 0 0 0 82,1 78,2
PC2 0 0 0 80,1 77,2
PC3 0 0 0 79,5 78,6
PC4 0 0 0 79,7 76,9
La ecuación del modelo ajustado respondió al siguiente polinomio: Y1 (Conc AL) = 78,505 – 5,6687 *X1 r2 = 0,9377 Y2 (Remoción de color) = 68,985 +10,6875 * X1+ 10,45 * X3 – 5,2625 *X1*X3 r2 = 0,9154
Gráfico de pareto estandarizado para Y1
Efectos estandarizados
+
-
0 3 6 9 12 15
AB
BC
C:X3
AC
B:X2
A:X1
Gráfico de Pareto estandarizado para Y2
Efectos estandarizados
+-
0 2 4 6 8
AB
B:X2
BC
AC
C:X3
A:X1
Superficie de Respuesta estimada Conc AL
Conc. carbonTemperatura
Con
c A
L
-1 -0,6 -0,2 0,2 0,6 1-1
-0,40,2
0,81,4
72
75
78
81
84
87
Superficie de Respuesta estimada
Conc. carbonOzono
Rem
ocio
n c
olo
r
-1 -0,6 -0,2 0,2 0,6 1-1
-0,20,6
1,4
42
52
62
72
82
92
Fig. 5.4 Cinética de la decoloración según variables
establecidas por el diseño experimental.
0
20
40
60
80
100
0 5 20 35 60 90 120
Tiempo, h
g/L
0
3
6
9
12
15
AR
T,
g/L
Concentración de carbón = 1 g/L
Temperatura = 25 °C
Flujo de ozono = 30 L/min
AL
Remoción color
ART
Calidad del proceso de recobrado de AL y remoción de contaminantes 3334.11
2142.78
1638.12
1237.35
1131.48
1047.21
926.98
715.94
645.36
624.65
608.25
1000150020002500300035004000
Wavenumber cm-1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
Absorbance U
nits
3410.11
2988.88
2942.38
2349.17
1994.02
1719.18
1455.11
1375.58
1210.11
1121.04
1042.37
920.97
867.91
821.44
744.25
637.38
1000150020002500300035004000
Wavenumber cm-1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
3329.91
2131.75
1638.40
1236.70
1130.51
1047.86
927.17
876.01
716.83
635.19
615.45
1000150020002500300035004000
Wavenumber cm-1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
Absorbance U
nits
Espectro infrarrojo del caldo purificado etapa 3 (S3) b, etapa 6 (S6) comparado con ácido láctico puro (a) (reactivo, procedente de Scharlau Chemie S. A. Barcelona, España, Ref. AC13811000).
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
uR
IU
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
uR
IU
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
K-23/401
08-06-04 Acido lactico2
Minutes
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
uR
IU
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
uR
IU
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
K-23/401
08-06-04 Mezcla2
3505.5
6
3397.5
3
1682.5
01619.1
3
1104.6
6
1003.9
8
667.0
9
1000150020002500300035004000
Wavenumber cm-1
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Absorbance U
nits
3505.5
6
3397.5
3
1682.5
01619.1
3
1104.6
6
1003.9
8
667.0
9
1000150020002500300035004000
Wavenumber cm-1
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Absorbance U
nits
Cromatograma del caldo semipurificado etapa 3 (S3) b comparado con ácido láctico puro (a) (reactivo, procedente de Scharlau Chemie S. A.
Barcelona, España, Ref. AC13811000).
Espectro infrarrojo del sulfato de calcio etapa 3 (S3) comparado con sulfato de calcio (reactivo, procedente de Scharlau Chemie S. A. Barcelona, España, Ref. H10320, 63436).
SINTESIS DEL PLA
Copolímero producto de la reacción directa del
LA con TDI. En un balón se añaden LA. Se agita y se calienta en un baño de aceite.
Posteriormente se gotea el TDI (disocianato de tolueno), continuando la
agitación hasta la formación de un material de aspecto cristalino.
Policondensación de LA por Irradiación
Ultrasónica. Un balón con condensador de reflujo se sitúa sobre un baño ultrasónico
Elma Transsonic T 460/H, frecuencia 35 kHz. Se añaden LA en benceno
y la trietilamina. La mezcla se calienta hasta alcanzar 40ºC, posteriormente
se añade la diisopropilcarbodiimida (DIC) y se refluja durante 8 horas a
80oC.
PLA DL PLA L(+)
CARACTERIZACION DEL PLA
Asignaciones de las señales características de los grupos uretano y señales correspondientes a la unidad de ácido láctico.[g1]
Técnica
-NH
-OCONH
Ar-
-CH3
-CH FTIR (cm-1)
3273
1200-1265
2990
1375
-
RMN-1 H
4.59
-
7.09-9.05
1.25-1.44
4.09
RMN-13 C
-
176.83*
125.36-152.59
16.74 20.29
68.52 66.09
Asignaciones características por RMN de la unidad lactato.
Técnica
CH3a
CH3b
- CH a
-CH b
-COO
RMN-1 H
1.02
1.15
3.85
4.75
-
RMN-13 C
22.52
23.40
40.73
43.73
169.85
