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WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE

ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD

OFICINA REGIONAL PARA EUROPA

CURSO DE FORMACIÓN SOBRE

ANÁLISIS DE LA PRESENCIA DE ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS

EN MUESTRAS DE ALIMENTOS

MANUAL DEL PARTICIPANTE

Editado por Maddalena Querci, Marco Jermini y Guy Van den Eede

La presente publicación también se encuentra on-line en la dirección siguiente: http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/documentation.htm

ISBN: 978-92-79-04831-9 Numero de catalogo: LB-X1-07-033-ES-C

Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos

II

Ni la Comisión Europea ni ninguna persona que actúe en su nombre se responsabilizará del

uso que pudiera hacerse de esta información.

Puede obtenerse información sobre la Unión Europea a través del servidor Europa

en la siguiente dirección de Internet http://europa.eu

Luxemburgo: Oficina de Publicaciones Oficiales de las Comunidades Europeas, 2007

ISBN-978-92-79-04831-9

© Comunidades Europeas, 2007

Reproducción autorizada, con indicación de la fuente bibliográfica

Printed in Italy


III

EDITORES Maddalena QUERCI Comisión Europea Centro Común de Investigación Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores Unidad de biotecnología y OGM Coordinadora del área científica de la biología molecular Dirección electrónica: [email protected] Marco JERMINI Repubblica e Cantone Ticino http://www.ti.ch Dipartimento della sanità e della socialità Divisione della salute pubblica Laboratorio Cantonale - Bellinzona Dirección electrónica: [email protected] Guy VAN DEN EEDE Comisión Europea Centro Común de Investigación Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores Unidad de biotecnología y OGM Jefe de Unidad Dirección electrónica: [email protected]


IV


V

Prólogo El Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores del Centro Común de

Investigación de la Comisión Europea y el Programa de Seguridad Alimentaria

dentro del Centro Europeo para el Medio Ambiente y la Salud (División de Roma) de

la Organización Mundial de la Salud han organizado conjuntamente una serie de

cursos de formación sobre «Análisis de la presencia de organismos genéticamente

modificados en muestras de alimentos».

El Centro Común de Investigación presta apoyo científico y técnico a las políticas

comunitarias colaborando con las direcciones generales de la Comisión Europea e

interactuando con las instituciones, organizaciones e industrias europeas mediante

la formación de redes con laboratorios de los Estados miembros. La tarea general

del Centro Europeo para el Medio Ambiente y la Salud de la OMS es prestar ayuda

de forma completa y coordinada tanto a las autoridades como a los ciudadanos

europeos en el ámbito de la salud ambiental. Estos cursos de formación se inscriben

en la colaboración entre ambas instituciones para fomentar aspectos relativos a la

inocuidad de los alimentos en la región europea de la OMS, tanto dentro como fuera

de las fronteras de la propia UE, teniendo en cuenta especialmente los países

candidatos a la adhesión a la UE, así como los países de Europa central y oriental

con economías de transición.

El objetivo de los cursos de formación es ayudar al personal de los laboratorios de

control a familiarizarse con las técnicas de detección molecular y a adaptar sus

instalaciones y programas de trabajo para permitir la realización de análisis que se

ajusten a los actos normativos a escala mundial en el campo de la biotecnología.

Los cursos se destinan a enseñar técnicas de detección molecular a personal de

laboratorio con buen nivel de conocimientos analíticos, pero con poca o ninguna

experiencia en este ámbito concreto.

El Centro Común de Investigación se ha comprometido a proporcionar formación

sobre la detección y cuantificación de los OGM y, además de los cursos de

formación, ofrece (y ha ofrecido en el pasado) formación individual para


VI

necesidades específicas. Se ha pedido con frecuencia formación sobre este tema

debido a su importancia ante el aumento de la necesidad de cumplir la normativa

europea, tanto vigente como en fase de elaboración.

A lo largo de los años, la Unidad de biotecnología y OGM ha conseguido un

profundo conocimiento de los diferentes aspectos relativos a la detección y

cuantificación de los OGM, y ha elaborado, adaptado o validado métodos

avanzados para su detección y cuantificación.

El conocimiento de estas técnicas se ha transferido a los laboratorios colaboradores

mediante publicaciones, proyectos conjuntos, formación individual o cursos

específicos. También se han explicado detalles técnicos a personal en formación

mediante presentaciones verbales o breves notas escritas. La Unidad de

biotecnología y OGM, consciente de la necesidad de disponer de una fuente

permanente de información, ha redactado el presente Manual, que describe algunas

de las técnicas utilizadas en nuestro laboratorio.

A lo largo de los cursos se atiende a los siguientes temas:

- extracción de ADN de materias primas y productos transformados

- cribado de productos alimentarios para detectar la presencia de OGM

mediante reacción en cadena de la polimerasa, tanto simple como anidada

- cuantificación de OGM en ingredientes mediante reacción en cadena de la

polimerasa en tiempo real

- cuantificación de OGM en ingredientes mediante prueba de inmunoabsorción

enzimática.

El Manual se ha preparado en el Instituto de la Salud y la Protección de los

Consumidores del Centro Común de Investigación, como información de base para

los participantes en los cursos y con la finalidad de proporcionar una información

teórica y práctica sobre las metodologías y protocolos utilizados en la actualidad. La

materia abarca una amplia variedad de técnicas de detección, identificación,

caracterización y cuantificación de OGM, y se incluye información teórica que se

considera importante y básica para quien desee introducirse y trabajar en el campo

de la detección de OGM.


VII

Esperamos que la estructura y el contenido del Manual ayuden a los participantes

en el curso (y también a otros usuarios) para la transmisión y difusión de las

capacidades adquiridas en el contexto de los diferentes entornos de trabajo según

las necesidades.

No se ha intentado en ningún momento competir con la información disponible en

libros de texto o publicaciones periódicas. Lo que pretende el Manual es

complementar la información que se encuentra en la literatura especializada.

Para facilitar su difusión y consulta, esta publicación se encuentra también en línea

en la dirección: http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/documentation.htm.

Los miembros del personal del CCI que han participado en la preparación del

Manual han sido supervisados por Maddalena Querci y se mencionan en el índice

junto a su aportación.

Vaya desde aquí nuestro agradecimiento especial también a todos los miembros del

personal de la Unidad de biotecnología y OGM que, aunque no se mencionen uno a

uno, han contribuido al éxito de la preparación del Manual.

Manifestamos también nuestro agradecimiento a Margarita Aguilera-Gomez por su

colaboración en la revisión del Manual.

Dra. Maddalena Querci

Coordinadora del curso

Junio de 2006


VIII

Observaciones iniciales de la Organización Mundial de la Salud La Organización Mundial de la Salud otorga gran prioridad a la seguridad en el uso y

aplicación de la biotecnología moderna para la producción y transformación de

alimentos. Por este motivo, desde los primeros años noventa la OMS trabaja mucho

en la organización de consultas con expertos sobre la inocuidad de los alimentos

derivados de la biotecnología. En mayo de 2000, la LIII Asamblea Mundial de la

Salud adoptó una resolución en el sentido de que la OMS debía ayudar a los

Estados miembros a aportar una base científica para las decisiones sobre la salud

en relación con los alimentos modificados genéticamente. Asimismo, el Consejo

Ejecutivo de la OMS contempló la posibilidad de que se exploraran otras

consideraciones pertinentes en colaboración con otros organismos.

La Comisión del Codex Alimentarius (CCA) es un organismo intergubernamental

creado para elaborar normas internacionales sobre los alimentos. Su objetivo

primario es proteger la salud de los consumidores y garantizar unas prácticas leales

en el comercio alimentario. La OMS es una de las organizaciones madre de la CCA

desde su creación en 1963. En el marco de las actividades del Codex Alimentarius,

la OMS y su organización hermana dentro de la ONU, la FAO, participan en el

Grupo de acción intergubernamental especial del Codex sobre alimentos obtenidos

por medios biotecnológicos, en el Comité del Codex sobre etiquetado de los

alimentos y en el Comité del Codex sobre métodos de análisis y muestreo.

El Programa de Seguridad Alimentaria en Europa de la OMS colabora con el Centro

Común de Investigación (CCI) de la Comisión Europea desde el año 2000 en la

organización de cursos de formación sobre técnicas de detección de organismos

genéticamente modificados (OGM) en alimentos. La finalidad de esta formación es

capacitar en biotecnología analítica al personal de los laboratorios de control de

alimentos y fomentar el uso de métodos validados y armonizados para detectar

OGM en Europa y en el resto del mundo.

Unos métodos adecuados de análisis y muestreo son fundamentales para que un

etiquetado apropiado de los alimentos aumente la transparencia de los procesos de

producción y facilite la trazabilidad, lo que redundará en la mejora de los sistemas


IX

de seguridad de los alimentos. Para permitir un acceso más amplio a estos

métodos, se ha decidido publicar en la red el Manual utilizado durante los cursos de

formación conjuntos CCI/OMS. Los métodos presentados en este Manual se ajustan

a los considerados por el Comité del Codex sobre métodos de análisis y muestreo.

El Programa de Seguridad Alimentaria de la OMS en Europa reconoce la

importancia de la colaboración con el Centro Común de Investigación de la

Comisión Europea, institución científica reconocida en todo el mundo en el ámbito

de los OGM, y seguirá fomentando las actividades de capacitación en el ámbito de

los métodos de detección de OGM en los alimentos, tanto en Europa como en otras

regiones.

Dra. Cristina Tirado, veterinaria Consejera Regional de Seguridad Alimentaria de la OMS en Europa


X

CURSO DE FORMACIÓN SOBRE


MANUAL DEL PARTICIPANTE

Editado por Maddalena Querci, Marco Jermini y Guy Van den Eede

Índice Sesión Titulo Autores

1

Panorama, introducción general sobre los organismos genéticamente modificados (OGM), legislación comunitaria

M. Querci, G. Van den Eede, M. Jermini

2 Presentación del Manual, métodos de trabajo e introducción del curso

M. Querci

3

Muestras utilizadas durante el curso

M. Querci, N. Foti

4

Extracción y purificación de ADN

M. Somma

5 Electroforesis en gel de agarosa M. Somma, M. Querci

6 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) M. Somma, M. Querci

7 Características de la soja Roundup Ready, del maíz MON810 y del maíz Bt-176

M. Querci, M. Mazzara

8

Características de los sistemas cualitativos de PCR descritos en el Manual

M. Querci, M. Mazzara

9

Detección cualitativa mediante PCR del maíz MON810, del maíz Bt-176 y de la soja Roundup Ready

M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara

10

PCR cuantitativa para la detección de OGM

F. Weighardt

11 Detección cuantitativa de la soja Roundup Ready mediante PCR en tiempo real

N. Foti

12 Detección cuantitativa de la soja Roundup Ready mediante ELISA

F. Eyquem

Apéndice

Ejemplo de programa de trabajo

M. Querci





Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de

Alimentos

Sesión nº 1

Panorama, Introducción General sobre los Organismos Genéticamente Modificados (OGM),

Legislación Comunitaria

M. Querci, G. Van den Eede, M. Jermini

Panorama, Introducción General sobre los Organismos Genéticamente Modificados (OGM), Legislación Comunitaria 2

Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 1

Índice

Sesión nº 1

Panorama, Introducción General sobre los Organismos Genéticamente Modificados (OGM), Legislación Comunitaria

Introducción 3

Modificación genética de los vegetales 4 Legislación comunitaria 5 Inocuidad y etiquetado de alimentos obtenidos mediante la biotecnología moderna; la

perspectiva de la OMS 13

Anexo 1. Legislación comunitaria sobre la comercialización de OGM, con inclusión de los

programas relacionados de etiquetado y control 17



Introducción

Aparte del abanico de líneas vegetales modificadas genéticamente desplegado por partes

de las regiones agrícolas del mundo, todos los cultivares actualmente cultivados son

producto de la domesticación intensiva a partir de un estado silvestre original mediante la

continuidad de la selección y la reproducción controlada para conseguir un producto más

productivo, más resistente a las plagas o de una calidad mejor o diferente respecto a las

líneas ancestrales anteriores. Tales cambios, que se llevan produciendo desde la primera

domesticación de plantas para su explotación por el hombre, implican el intercambio o

recombinación de caracteres deseados, o genes, mediante el cruce continuo a lo largo del

tiempo dentro de una especie o entre grupos de especies con estrecha relación y

compatibles sexualmente. En las últimas décadas se ha hecho posible producir cruces no

solo entre plantas que son compatibles en la naturaleza, sino también entre plantas cuyos

cruces se consideran estériles naturalmente. Como ejemplos de técnicas que se utilizan en

tales casos pueden citarse las de recuperación de embriones, el cultivo de embriones in

vitro o in vivo, los cultivos de óvulos y ovarios, la polinización in vitro y la fertilización in vitro.

Por otra parte, pueden obtenerse cambios mutacionales, por ejemplo mediante irradiación

de semillas.

Los procedimientos tradicionales de hibridación y selección presentan una serie de

inconvenientes. Uno de los principales es que los obtentores suelen desear introducir

determinados caracteres aislados, más que transferir y recombinar genomas enteros. Otro

consiste en que la selección y clasificación de variedades genéticamente estables es un

proceso lento.

Parece que estas desventajas se alivian mediante la aplicación de tecnologías de

transformación y recombinación de ADN. Se ha introducido el término «organismos

genéticamente modificados» (OGM) para describir a los organismos cuyo material genético

se ha modificado de una forma que no se da en la naturaleza en condiciones normales de

hibridación o recombinación natural. El OGM en sí debe ser una unidad biológica capaz de

multiplicarse o transmitir material genético. Aplicado a los vegetales, el término se refiere a

plantas en cuyo genoma (hospedador) se han introducido de forma estable uno o varios

genes procedentes de otras especies, mediante técnicas de transferencia genética y

cuando en la mayoría de los casos se ha comprobado que tales genes introducidos hacen

que se obtenga un producto génico (una proteína). El proceso de introducir genes en

especies no emparentadas y conseguir que funcionen se denomina «transformación

genética».

El análisis de notificaciones de liberaciones experimentales en la UE pone de manifiesto

como caracteres estudiados con mayor frecuencia los siguientes: tolerancia a los



herbicidas, restauración de la fertilidad o esterilidad masculina, resistencia a los insectos

derivada de Bacillus thurigiensis, resistencia a los virus, resistencia a los hongos y

alteración de la biosíntesis de almidón (para más información, véase en

http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu/).

Modificación genética de los vegetales

Aunque hay muchas variaciones sobre el tema de la transformación de los vegetales, son

pocos los métodos principales de modificación genética de estos seres vivos. La primera de

las tecnologías, desarrollada en la década de 1980, utiliza una especie bacteriana

(Agrobacterium tumefaciens) para conseguir el gen que interesa introducir en el vegetal

hospedador.

Agrobacterium, microorganismo patógeno para los vegetales, se conoce desde el inicio del

siglo XX. En la naturaleza, A. tumefaciens tiene la excepcional capacidad de transferir un

segmento particular de ADN (ADN-T) de su plásmido inductor de tumores (Ti) al núcleo de

las células infectadas, donde se integra después de forma estable en el genoma

hospedador y se transcribe, provocando la enfermedad de la agalla de la corona. El

fragmento ADN-T está flanqueado por repeticiones directas de 25 pares de bases, que

actúan como señal de elemento cis para la maquinaria de transferencia.

Los científicos aprovechan el fenómeno de que cualquier ADN extraño situado entre estos

extremos de ADN-T puede transferirse a células vegetales para desarrollar cepas de

Agrobacterium en que se ha sustituido algún gen patógeno por ADN seleccionado

específicamente.

Desde este descubrimiento se ha logrado avanzar notablemente en la comprensión del

proceso de transferencia génica a células vegetales mediante Agrobacterium. No obstante,

la especie Agrobacterium tumefaciens infecta de forma natural solo a plantas

dicotiledóneas, por lo que muchos vegetales de importancia económica, como los cereales

(que son monocotiledóneas), han quedado en gran medida al margen de la manipulación

genética. Para estos casos se han desarrollado métodos alternativos de transformación

directa, como la transferencia mediante polietilenglicol, la microinyección, los protoplastos y

la tecnología de electroporación de células intactas y lanzagenes (biolística).

Sin embargo, la transformación mediante Agrobacterium tiene diversas ventajas sobre los

métodos de transformación directa. Principalmente, reduce el número de ejemplares del

transgén, lo que puede hacer que se produzcan menos problemas de cosupresión e

inestabilidad de los transgenes.



En ambos casos, las células (tanto las infectadas con Agrobacterium como las obtenidas

con el lanzagenes «biolístico») se utilizan para regenerar plantas completas, que llevan el

nuevo gen o genes de interés. Estas plantas son objeto de pruebas, se reproducen de

forma intensiva y finalmente proporcionan semillas para una nueva generación de líneas

vegetales modificadas genéticamente.

Legislación comunitaria1, 2

El uso de organismos genéticamente modificados (su liberación al medio ambiente, cultivo,

importación y, en particular, su utilización como alimentos o ingredientes alimentarios) está

reglamentado en la Unión Europea mediante un conjunto de procedimientos estrictos. Los

primeros instrumentos jurídicos de la Comunidad (Directiva 90/220/CEE del Consejo y

Directiva 90/219/CEE del Consejo) se publicaron en 1990 con el propósito específico de

proteger la salud humana y animal y el medio ambiente.

Actualmente, el principal instrumento jurídico comunitario, considerado como el marco

jurídico horizontal que rige el sector de la biotecnología en la Unión Europea, es la Directiva 2001/18/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 12 de marzo de 2001, sobre la

liberación intencional en el medio ambiente de organismos genéticamente modificados. La

Directiva 2001/18/CE deroga a la Directiva 90/220/CEE del Consejo y refuerza las normas

anteriores sobre la liberación de OGM en el medio ambiente, estableciendo principios de

evaluación del riesgo ambiental, obligaciones de seguimiento (ambiental) tras la

comercialización, información al público, etiquetado y trazabilidad en todas las fases de

comercialización, y la creación de un registro molecular, entre otras medidas.

Según la Directiva 2001/18/CE, las autorizaciones vigentes concedidas en virtud de la

Directiva 90/220/CEE del Consejo deben renovarse para evitar disparidades y tener

plenamente en cuenta las condiciones de autorización establecidas en la Directiva

2001/18/CE. La autorización (renovable) se concede por un plazo máximo de diez años a

partir de la fecha de la autorización.

Tras la comercialización de un OGM como producto o componente de un producto, el

notificador debe velar por que el seguimiento tras la comercialización y la presentación de

informes se lleven a cabo con arreglo a las condiciones especificadas en la autorización.

1 En el anexo 1 se encuentra una lista casi completa, aunque no exhaustiva, de los Reglamentos y Directivas de la Unión Europea sobre OGM. 2 La situación reflejada es la del 9 de junio de 2004.



Cuadro 1. Vegetales modificados genéticamente y autorizados para su comercialización en

la UE según la Directiva 90/220/CEE del Consejo

Producto Línea Notificante Caracteres principales Número de la Decisión de la Comisión/fecha

Claveles Florigene Color de la flor modificado

20.10.1998 (autorización del Estado

miembro)

Claveles Florigene Duración modificada de la flor cortada


miembro)

Claveles Florigene Color de la flor modificado


miembro)

Maíz Zea mays L. línea MON 810

Monsanto Expresión del gen cryIA(b) de Bt

98/294/CE de 22 de abril de 1998

Maíz* Zea mays L. línea Bt-11

Novartis Tolerancia al glufosinato de amonio y expresión del gen cryIA(b) de Bt


Maíz Zea mays L. T25

AgrEvo Tolerancia al glufosinato de amonio


Colza de primavera*

Brassica napus L. ssp. oleifera

AgrEvo Tolerancia al glufosinato de amonio


Colza Brassica napus L. oleifera Metzg. MS1, RF2

Plant Genetic Systems

Tolerancia al glufosinato de amonio

97/393/CE de 6 de junio de 1997

Colza Brassica napus L. oleifera Metzg. MS1, RF1



97/392/CE de 6 de junio de 1997

Maíz Zea mays L. línea Bt-176 (maíz Maximizer)

Ciba-Geigy Tolerancia al glufosinato de amonio y expresión del gen de la endotoxina de Bt

97/98/CE de 23 de enero de 1997

Achicoria con esterilidad masculina**

Cichorium intybus L.

Bejo-Zaden BV


96/424/CE de 20 de mayo de 1996

Soja* Glycine max L. (Roundup Ready)

Monsanto Tolerancia al glifosato 96/281/CE de 3 de abril de 1996

Colza Brassica napus L. oleifera Metzg. MS1Bn x RF1Bn



96/158/CE de 6 de febrero de 1996

Tabaco Variedad ITB 1000 OX

SEITA Tolerancia al bromoxinilo 94/385/CE de 8 de junio de 1994

* Cultivo en la UE no autorizado. ** Solo para la producción de semillas.



La Directiva 2001/18/CE, aplicada en cada Estado miembro mediante normas nacionales,

se refiere tanto a los ensayos de campo a pequeña escala (liberaciones voluntarias con

fines experimentales, objeto de la parte B de la Directiva) como a las disposiciones de

comercialización de los OGM (objeto de la parte C). Como se indica en el cuadro 1, se ha

autorizado un total de 18 OGM según el antiguo procedimiento 90/220/CEE (de ellos,

quince se refieren a vegetales, tres de los cuales por autorización de los Estados

miembros). Hasta ahora, se han presentado más de 25 solicitudes de comercialización de

OGM para su autorización según la Directiva 2001/18/CE (para obtener mas información

sobre la situación de los expedientes en la dirección http://gmoinfo.jrc.ec.europa.eu/).

La utilización confinada de microorganismos genéticamente modificados se regula mediante

una Directiva «hermana» (Directiva 98/81/CE del Consejo, de 26 de octubre de 1998, por

la que se modifica la Directiva 90/219/CEE relativa a la utilización confinada de

microorganismos genéticamente modificados).

Además de las Directivas antes mencionadas, a lo largo de los años se ha ido elaborando y

aplicando una serie de instrumentos jurídicos verticales, en los que se trata más

específicamente la aprobación y la seguridad en el uso de los OGM destinados al consumo

humano. La comercialización dentro de la Comunidad de nuevos alimentos y nuevos

ingredientes alimentarios era objeto hasta hace poco de un acto legislativo vertical, el

Reglamento (CE) nº 258/97, que se refería específicamente a lo siguiente:

- alimentos e ingredientes alimentarios que contengan organismos genéticamente

modificados con arreglo a la Directiva 90/220/CEE, o que consistan en dichos organismos;

- alimentos e ingredientes alimentarios producidos a partir de organismos genéticamente

modificados, pero que no los contengan;

- alimentos e ingredientes alimentarios de estructura molecular primaria nueva o modificada

intencionadamente;

- alimentos e ingredientes alimentarios consistentes en microorganismos, hongos o algas u

obtenidos a partir de estos;

- alimentos e ingredientes alimentarios consistentes en vegetales, u obtenidos a partir de

ellos, e ingredientes alimentarios obtenidos a partir de animales, excepto los alimentos e

ingredientes alimentarios obtenidos mediante prácticas tradicionales de multiplicación o de

selección y cuyo historial de uso alimentario sea seguro;

- alimentos e ingredientes alimentarios que se hayan sometido a un proceso de producción

no utilizado habitualmente, que provoca en su composición o estructura cambios

significativos que afectan a su valor nutritivo, a su metabolismo o a su contenido en

sustancias indeseables.



La cuestión concreta del etiquetado de alimentos GM (modificados genéticamente) es

objeto de varios instrumentos jurídicos. Los requisitos de etiquetado se mencionaban por

primera vez en el Reglamento (CE) nº 258/97 (Reglamento sobre nuevos alimentos), pero

ciertas líneas GM de maíz y de soja fueron sometidas posteriormente a normas de

etiquetado al entrar en vigor el Reglamento (CE) nº 1139/98 del Consejo.

De hecho, como antes de que entrara en vigor el Reglamento (CE) nº 258/97 ya se habían

comercializado dos OGM (la soja Roundup Ready y el maíz Maximizer), en el Reglamento (CE) nº 1139/98 se establecieron a posteriori requisitos de etiquetado específicos para

ellos.

En el Reglamento (CE) nº 258/97 se establecían requisitos específicos de etiquetado para

que el consumidor final estuviera informado de cualquier cambio de las características o

propiedades alimentarias, tales como la composición, el valor nutritivo o los efectos

nutritivos, o el uso previsto del alimento, responsable de que un nuevo alimento o

ingrediente alimentario dejara de ser equivalente a un alimento o ingrediente alimentario

existente. Actualmente, se han autorizado y pueden comercializarse legalmente en la UE

productos de diecisiete modificaciones genéticas (véase el cuadro 2). Una soja GM y un

maíz GM fueron autorizados en virtud de la Directiva 90/220/CEE antes de la entrada en

vigor del Reglamento sobre nuevos alimentos. Los demás (alimentos transformados

derivados principalmente de siete colzas oleaginosas GM y cinco maíces GM, y aceite de

dos semillas de algodón GM) se han notificado como sustancialmente equivalentes de

acuerdo con el Reglamento sobre nuevos alimentos y se han autorizado según el

procedimiento simplificado.

El Reglamento (CE) nº 1139/98 del Consejo establecía un modelo de etiquetado basado en

el principio de que un alimento o ingrediente GM deja de considerarse equivalente a uno

existente no GM si puede detectarse la presencia de ADN o de proteína derivados de la

modificación genética. Los aditivos estaban excluidos de los requisitos de etiquetado hasta

la entrada en vigor del Reglamento (CE) nº 50/2000 de la Comisión.

El Reglamento (CE) nº 1139/98 fue modificado posteriormente por el denominado

«Reglamento de umbrales» (Reglamento (CE) nº 49/2000 de la Comisión, de 10 de enero

de 2000, por el que se modifica el Reglamento (CE) nº 1139/98 del Consejo), que intentaba

resolver el problema planteado por la contaminación inadvertida e introducía el concepto de

umbral.



Cuadro 2. Alimentos modificados genéticamente autorizados en la Unión Europea3

Modificación Vegetal Solicitante Rasgo Posibles usos alimentarios Fecha Base

jurídica

1 GTS 40/3/2 Soja Monsanto

Protección contra insectos y tolerancia a herbicidas

Alimentos de soja incluidos bebidas, tofu, aceite, harina o lecitina.

3.4. 96 Dir. 90/220/CEE, art. 13

2 Bt 176 Maíz Ciba-Geigy

Protección contra insectos y tolerancia a herbicidas

Alimentos de maíz incluidos granos, aceite, harina de maíz, azúcar y jarabe.

23.1. 97 Dir. 90/220/CEE, art. 13

3 TOPAS 19/2 Colza oleaginosa AgrEvo Tolerancia a

herbicidas 24.6. 97

Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

4 MS1 / RF2 Colza oleaginosa


Tolerancia a herbicidas 24.6. 97

Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

5 MS1 / RF1 Colza oleaginosa


Tolerancia a herbicidas

24.6. 97

Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

6 GT 73 Colza oleaginosa Monsanto Tolerancia a

herbicidas

Aceite de colza. Entre los productos obtenidos del aceite de colza pueden citarse alimentos fritos, productos de panadería y aperitivos.

21.11. 97

Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

7 MON 810 Maíz Monsanto Protección contra insectos

6.2. 98

Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

8 T 25 Maíz AgrEvo Tolerancia a herbicidas 6.2.98

Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

9 Bt 11 Maíz Novartis Protección contra insectos

6.2.98

Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

10 MON 809 Maíz Pioneer Protección contra insectos

Derivados de maíz incluidos aceite de maíz, harina, azúcar y jarabe. Entre los derivados del maíz pueden citarse aperitivos, productos de panadería, alimentos fritos, artículos de confitería y refrescos. 23.10.98

Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

11 Falcon GS 40/90

Colza oleaginosa

Hoechst / AgrEvo

Tolerancia a herbicidas 8.11.99

Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

12 Liberator L62 Colza oleaginosa

Hoechst / AgrEvo

Tolerancia a herbicidas 8.11.99

Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

13 MS8/RF3 Colza oleaginosa


Tolerancia a herbicidas

Aceite de colza incluidos alimentos fritos, productos de panadería y aperitivos.

26.4.00

Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

14 1445 Algodón Monsanto Tolerancia a herbicidas 19.12.02

Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

15 531 Algodón Monsanto Protección contra insectos

Aceite de semilla de algodón, los alimentos fritos, productos de panadería y aperitivos. 19.12. 02

Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

16 pRF69/pRF93 Bacillus subtilis

F. Hoffmann - La Roche

Riboflavina Vitamina B2 23.3. 00 Reg. (CE) nº 258/97, art. 5

17 Bt11 Maíz Syngenta Resistencia a insectos Maíz dulce 19.5. 04 Reg. (CE) nº

258/97, art. 7

3 Fuente: Comisión Europea: http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm. Último acceso enero de 2010.



El Reglamento establecía que no se aplicarían a los alimentos los requisitos específicos

adicionales de etiquetado en caso de que la presencia en los ingredientes alimentarios de

material obtenido de los organismos genéticamente modificados no superara la proporción

del 1 % en cada uno de los ingredientes alimentarios.

Por otra parte, a fin de establecer que la presencia de este material era accidental, los

operadores debían aportar pruebas de que habían tomado las medidas oportunas para no

utilizar organismos genéticamente modificados.

Por diversas razones, como la controvertida opinión de diferentes asociaciones de usuarios

en relación con los OGM, las dificultades de interpretación y aplicación de los instrumentos

jurídicos promulgados a lo largo del tiempo o la ausencia de legislación comunitaria

específica sobre piensos GM, se llegó al convencimiento de que era necesario unificar,

actualizar y completar los instrumentos jurídicos en este ámbito.

Finalmente, en octubre de 2003 se publicaron dos Reglamentos que, al modificar o derogar

instrumentos jurídicos anteriores, proporcionaron una guía más completa e informativa

sobre estas cuestiones.

En concreto, se trata de los siguientes: el Reglamento (CE) nº 1829/2003 del Parlamento

Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2003, sobre alimentos y piensos

modificados genéticamente, y el Reglamento (CE) nº 1830/2003 del Parlamento Europeo y

del Consejo, de 22 de septiembre de 2003, relativo a la trazabilidad y al etiquetado de

organismos genéticamente modificados y a la trazabilidad de los alimentos y piensos

producidos a partir de éstos, y por el que se modifica la Directiva 2001/18/CE.

En el Reglamento (CE) nº 1829/2003 se han reforzado y ampliado las normas sobre

evaluación de la seguridad. Mediante este Reglamento se introducen por primera vez

normas específicas sobre piensos GM y se consagran los requisitos de etiquetado de

alimentos y piensos GM, que hasta ahora eran tratados solo parcialmente en el Reglamento

(CE) nº 1139/98 del Consejo y en el Reglamento (CE) nº 49/2000 de la Comisión.

Como característica principal, este Reglamento aplica el principio de una sola llave y una

sola puerta: una sola autorización permite la utilización tanto en alimentos como en piensos,

llenando así el vacío legal sobre la aprobación de productos para piensos y abandonando a

la vez el procedimiento simplificado que se basaba en el concepto de la «equivalencia

sustancial».

De conformidad con el Reglamento (CE) nº 1829/2003 (vigente desde el 18 de abril de

2004), el solicitante debe presentar un expediente completo donde se indique un método de

detección de la modificación genética concreta de que se trate. El expediente y, en

particular, sus partes sobre evaluación del riesgo para el medio ambiente y para la

seguridad de los alimentos, han de ser evaluados por la Autoridad Europea de Seguridad



Alimentaria (creada en virtud del Reglamento (CE) nº 178/2002 del Parlamento Europeo y

del Consejo, de 28 de enero de 2002). Los métodos de detección indicados por el solicitante

deben ser evaluados y validados por el laboratorio comunitario de referencia (creado en

virtud del Reglamento (CE) nº 1829/2003).

En el Reglamento se definen nuevos umbrales mínimos para el etiquetado. Se ha reducido

al 0,9 % el umbral del 1 % especificado en el Reglamento (CE) nº 49/2000 de la Comisión

respecto a la presencia accidental de OGM autorizados. Por otra parte, se ha establecido un

umbral del 0,5 % respecto a la presencia accidental de OGM no autorizados, con carácter

transitorio, siempre que hayan sido objeto de un dictamen favorable del comité o comités

científicos pertinentes. La UE reconoce el derecho de los consumidores a la información y al

etiquetado como instrumento para elegir con conocimiento de causa. Desde 1997 es

obligatorio el etiquetado para indicar la presencia de OGM como tales o formando parte de

un producto. Sin embargo, el Reglamento (CE) nº 1830/2003 refuerza las normas vigentes

sobre etiquetado de alimentos GM: extiende el etiquetado obligatorio a todos los alimentos y

piensos, independientemente de la detectabilidad, y define la trazabilidad como la

capacidad de seguir la traza de los OGM y los productos producidos a partir de OGM en

todas las fases de su comercialización a lo largo de las cadenas de producción y

distribución.

Así pues, es necesario disponer de métodos no solo para detectar la eventual presencia de

un OGM en una matriz alimentaria, sino también para identificar el OGM en concreto y

medir su cantidad en diferentes ingredientes de alimentos y piensos.

Pueden utilizarse métodos cualitativos de detección en un cribado inicial de los productos

alimentarios, para investigar la presencia de compuestos específicos (ADN o proteínas) de

OGM. Es posible efectuar así análisis cualitativos de productos muestreados en las

estanterías de los supermercados, en los suministros almacenados en las existencias, o en

otros puntos remontando la cadena de distribución.

Si los análisis cualitativos proporcionan una indicación de la presencia de OGM, con un

ensayo cuantitativo posterior podría obtenerse una respuesta decisiva sobre el requisito de

etiquetado.

Como se ha señalado anteriormente, se introduce en el marco normativo un nuevo

componente fundamental del procedimiento legislativo: el laboratorio comunitario de

referencia (CRL). En el contexto del Reglamento (CE) nº 1829/2003, el CCI, asistido por la

Red Europea de Laboratorios OGM, ha sido nombrado laboratorio comunitario de referencia

(http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/).

El CRL tiene el mandato de evaluar y validar métodos analíticos para garantizar que «se

ajustan al objetivo de cumplir la normativa» y de asesorar sobre aspectos científicos y

técnicos en caso de litigio.



En la legislación citada se exige la disponibilidad de métodos de análisis que sean seguros,

precisos y robustos. Esto implica una actividad de investigación que contribuya a la

armonización y normalización del enfoque y del conjunto de procedimientos analíticos y sus

características en todos los laboratorios comunitarios de ejecución y control en relación con

los OGM.

La armonización y normalización de los procedimientos y sus características dentro de los

laboratorios europeos de control ya lleva varios años siendo señalada por el CCI como

elemento fundamental para el éxito de cualquier instrumento legislativo de control.

Efectivamente, la Unidad de biotecnología y OGM del Instituto de la Salud y la Protección

de los Consumidores del CCI propone y fomenta desde 1999 la formación de una red de

laboratorios de ejecución participantes en asuntos relacionados con los OGM.

La Red Europea de Laboratorios OGM se inauguró oficialmente en diciembre de 2002

(http://engl.jrc.ec.europa.eu/). La gestión y las actividades de secretaría son coordinadas por

la Comisión Europea (DG Centro Común de Investigación – CCI). Esta Red, que contaba

anteriormente con 47 laboratorios de control de los Estados miembros, ha crecido

recientemente hasta tener 71 componentes, de los que 24 proceden de los últimos países

adheridos a la Unión Europea. La presidencia y la secretaría de la Red son responsabilidad

de la Unidad de biotecnología y OGM del Instituto de la Salud y la Protección de los

Consumidores del CCI.

El objetivo de la Red Europea de Laboratorios OGM consiste en crear una plataforma única

de expertos activos en el muestreo, detección, identificación y cuantificación de OGM en

semillas, granos, alimentos, piensos y muestras ambientales, para plantear y tratar temas

técnicos, como:

desarrollo de métodos para el análisis cuali y cuantitativo;

transferencia de tecnología, formación y creación de capacidad;

validación y estudios de aptitud de métodos adecuados para el cribado de diversas

matrices en cuanto a la presencia de OGM o para la estimación de las cantidades de

OGM presentes;

materiales de referencia (este aspecto corresponde al Instituto de Materiales y

Medidas de Referencia del CCI);

estrategias y métodos de muestreo de los diferentes productos GM (semillas,

granos, materias primas, productos para el consumidor final o las colectividades);

bases de datos y bioinformática y requisitos para la identificación inequívoca de

OGM y creación de bases que contengan tales datos moleculares.

En el contexto de las actividades de la Red, los cursos de formación deben considerarse

uno de los principales instrumentos para conseguir los objetivos antes citados.



Inocuidad y etiquetado de alimentos obtenidos mediante la biotecnología moderna; perspectiva de la OMS4

La liberación de OGM en el medio ambiente y la comercialización de alimentos GM han

provocado un debate público en muchas partes del mundo. Es probable que este debate

continúe en el contexto más amplio de otros usos de la biotecnología (p. ej., en medicina) y

sus consecuencias para la sociedad. Aunque los temas debatidos suelen ser muy similares

(costes y beneficios, aspectos relacionados con la inocuidad), el resultado del debate

cambia de un país a otro. Actualmente no hay consenso sobre aspectos como la utilidad del

etiquetado y de la trazabilidad de los alimentos GM para disipar la inquietud de los

consumidores. Esto se ha puesto de manifiesto en los debates efectuados en la Comisión

del Codex Alimentarius a lo largo de los últimos años. La Comisión del Codex Alimentarius

(Codex; http://www.codexalimentarius.net/web/index_es.jsp) es el organismo conjunto

FAO/OMS encargado de compilar las normas, códigos de prácticas, orientaciones y

recomendaciones que constituyen el Codex Alimentarius, el código alimentario

internacional. A pesar de la falta de consenso sobre estos temas, se ha avanzado bastante

en la armonización de las opiniones sobre la evaluación del riesgo. Sin embargo, el Codex

está a punto de adoptar principios sobre la evaluación del riesgo antes de la

comercialización que muestran un aumento del entendimiento a nivel internacional (véase la

prepublicación de los «Principios para el análisis de riesgos de alimentos obtenidos por

medios biotecnológicos modernos», CAC/GL 44-2003, en la dirección

ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/princ_gmfoods_es.pdf).

Los diferentes organismos GM contienen diferentes genes insertados de formas diversas.

Esto significa que los distintos alimentos GM y su inocuidad deben evaluarse caso por caso

y que no es posible hacer declaraciones generales sobre la seguridad de todos los

alimentos GM. Según la OMS, los alimentos GM actualmente disponibles en el mercado

internacional han sido objeto de evaluaciones del riesgo y no es probable que presenten

riesgos para la salud humana. Además, no se han puesto de manifiesto efectos sobre la

salud humana que fueran resultado del consumo de tales alimentos por la población en

general de los países en que se han autorizado. La evaluación de la inocuidad de los

alimentos GM debe basarse en el uso continuo de evaluaciones del riesgo según los

principios del Codex y, en su caso, con seguimiento tras la comercialización.

4 Para obtener información completa sobre las actividades de la OMS y de otras agencias de la ONU en relación con los alimentos obtenidos mediante la biotecnología moderna, véase en la dirección http://www.who.int/foodsafety/en/.



El etiquetado de los alimentos producidos por biotecnología puede estar relacionado o no

con la inocuidad de los alimentos per se, pero la OMS lo toma como una herramienta para

aumentar la transparencia de los procesos de producción de alimentos. Es posible que

este etiquetado facilite también el desarrollo de estrategias de trazabilidad, que podrían

contribuir a mejorar los programas nacionales de inocuidad de los alimentos e

indirectamente, por tanto, la propia inocuidad de los alimentos en general. Así pues, es

evidente la importancia de disponer de unos métodos adecuados de análisis y muestreo.

La OMS trabaja en el desarrollo de principios y recomendaciones sobre la seguridad y la

evaluación del riesgo de alimentos obtenidos mediante biotecnología. Los resultados

obtenidos a lo largo de diversas consultas de expertos constituyen la base de unas

orientaciones nacionales y actualmente se está en fase de incorporarlos a orientaciones

reconocidas internacionalmente. El enfoque según el principio de la equivalencia sustancial

se elaboró para evaluar la seguridad de la primera generación de plantas modificadas

genéticamente y muchos lo consideran adecuado. No obstante, esta idea es criticada

actualmente. Las actividades que se están llevando a cabo deben tener en cuenta estos

argumentos y contribuir a la consecución de unos ajustes y mejoras con base científica.

La Consulta FAO/OMS de expertos sobre aspectos relacionados con la inocuidad de los

alimentos modificados genéticamente de origen vegetal, celebrada en el año 2000, admitió

que el concepto de equivalencia sustancial puede utilizarse como enfoque comparativo

centrado en las similitudes y diferencias entre los alimentos modificados genéticamente y su

contraparte convencional. Simultáneamente, manifestó su opinión de que el concepto de

equivalencia sustancial no es en sí una evaluación de la inocuidad ni un criterio, sino tan

solo un punto de partida para la evaluación de la inocuidad

(http://www.fao.org/ag/agn/food/risk_biotech_aspects_en.stm).

La próxima generación de alimentos GM será la de vegetales con un valor nutritivo

mejorado, cruzando así el límite con los alimentos funcionales y nutracéuticos. Las futuras

estrategias de evaluación de la inocuidad de los alimentos tendrán que referirse a los

cambios metabólicos más complejos causados por las modificaciones genéticas dadas. Las

evaluaciones tendrán que ir considerando cada vez más el impacto de un alimento GM

sobre la situación nutricional general, habida cuenta de las diferentes necesidades de los

países desarrollados y en desarrollo.

Actualmente no está implantado ningún sistema normativo internacional específico. Sin

embargo, hay varios organismos internacionales que participan en la elaboración de

protocolos sobre OGM. Como se ha dicho antes, el Codex está elaborando principios sobre

el análisis del riesgo de los alimentos GM para la salud humana. La premisa de estos



principios exige una evaluación previa a la comercialización, efectuada caso por caso y con

inclusión de un estudio tanto de los efectos directos (del gen insertado) como de los efectos

imprevistos (que pueden producirse como consecuencia de la inserción de un nuevo gen).

Los principios se encuentran en una fase avanzada de elaboración, pero aún no se han

adoptado (véase la prepublicación de los «Principios para el análisis de riesgos de

alimentos obtenidos por medios biotecnológicos modernos», CAC/GL 44-2003, en la

dirección ftp://ftp.fao.org/es/esn/food/princ_gmfoods_es.pdf). Estos y otros principios del

Codex en fase de elaboración (incluidos los Principios sobre métodos de análisis y

muestreo) carecen de efecto vinculante sobre la legislación nacional, pero se citan

específicamente en el Acuerdo sobre la aplicación de las medidas sanitarias y fitosanitarias

de la Organización Mundial del Comercio (Acuerdo SPS) y pueden utilizarse como

referencia en caso de litigios comerciales.

Teniendo en cuenta el trabajo efectuado entre 1999 y 2003 por el Grupo de acción

intergubernamental especial del Codex sobre alimentos obtenidos por medios

biotecnológicos (http://www.fao.org/ag/agn/agns/biotechnology_codex_en.asp), el Comité

del Codex sobre etiquetado de los alimentos y el Comité del Codex sobre métodos de

análisis y muestreo, seguirán siendo objeto de atención preferente de la OMS la elaboración

de orientaciones aceptadas generalmente para la evaluación de la inocuidad de los

alimentos obtenidos mediante biotecnología, los aspectos de la comunicación del riesgo (p.

ej., mediante el etiquetado) y, por tanto, la elaboración de métodos adecuados de análisis.

Por tanto, la OMS sigue organizando consultas de expertos

(http://www.who.int/foodsafety/biotech/consult/en/index.html) para elaborar principios y

metodologías de evaluación del riesgo, gestión del riesgo y comunicación del riesgo en

relación con alimentos producidos mediante biotecnología, y coordinando la colaboración

entre países desarrollados y en desarrollo en el ámbito de los métodos de detección.

El Departamento de Inocuidad de los Alimentos, dentro de la OMS, está terminando un

estudio basado en evidencias sobre las implicaciones de la biotecnología moderna de los

alimentos para la salud y el desarrollo humanos. El impulso para el estudio procede de una

resolución de la LIII Asamblea Mundial de la Salud, celebrada en mayo de 2000, según la

cual la OMS debe reforzar su capacidad de ayudar a los Estados miembros a sentar las

bases científicas de las decisiones sobre la moderna biotecnología alimentaria, y de velar

por la transparencia, excelencia e independencia de los dictámenes emitidos.

El estudio (http://www.who.int/foodsafety/biotech/who_study/en/index.html) pretende

complementar los esfuerzos de otros organismos internacionales reuniendo la información

ya existente y analizándola según corresponde al mandato de la OMS. A fin de aumentar la



transparencia del proceso, la OMS ha colaborado con la FAO y ha contado con la

participación de una serie de interlocutores y grupos de interés. El objetivo principal es el de

crear una base de conocimiento accesible para ayudar a los Estados miembros, organismos

de normas internacionales y otros interlocutores a alcanzar un consenso transparente y

global sobre la evaluación y la aplicación de la biotecnología. Finalmente, la OMS pretende

establecer unos cimientos basados en pruebas factibles para construir una evaluación más

holística de la biotecnología para el futuro.

Este estudio se dirigía a poner en su contexto la contribución general que puede aportar a la

salud y desarrollo humanos la biotecnología moderna de los alimentos. Incluye la aplicación

de la biotecnología moderna de los alimentos a los microorganismos, vegetales y animales.

Se adoptó un planteamiento integrado (holístico) para identificar los aspectos

fundamentales que afectan directa o indirectamente a la salud y desarrollo humanos, y

establecer cuáles son las pruebas disponibles. Los principales aspectos relacionados con

las pruebas son los siguientes:

investigación y desarrollo;

impacto sobre la salud humana (inocuidad de los alimentos y efectos ambientales);

seguridad del abastecimiento alimentario, coste y acceso a la tecnología;

aspectos éticos, legales y sociales;

iniciativas para crear capacidad.

Se recopilaron datos procedentes de una bibliografía muy amplia, de Internet y de una

investigación por encuesta, avalada por unas 120 respuestas a un cuestionario que se

había planteado a una amplia gama de interlocutores y expertos en mayo de 2002. También

se han incorporado las observaciones procedentes de un debate electrónico de

interlocutores, celebrado entre enero y abril de 2003. Asimismo se han incluido las

opiniones de los participantes (entre los que había representantes de los gobiernos, de los

consumidores, de la industria y de las organizaciones no gubernamentales (ONG), de

países tanto desarrollados como en desarrollo) en una reunión de interlocutores celebrada

los días 5 y 6 de junio de 2003 en Ginebra.

El informe redactado como resultado de este proceso de consulta será utilizado

directamente por la OMS para planificar sus actividades en el futuro respecto al uso y

aplicación de la biotecnología moderna en la salud y desarrollo humanos.



Anexo 1. Legislación comunitaria sobre la comercialización de OGM, con inclusión de los programas relacionados de etiquetado y control

Directiva 90/220/CEE del Consejo, de 23 de abril de 1990, sobre la liberación intencional en

el medio ambiente de organismos genéticamente modificados (DO L 117 de 8.5.1990,

p. 15).

Derogada por:

Directiva 2001/18/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 12 de marzo de 2001,

sobre la liberación intencional en el medio ambiente de organismos genéticamente

modificados y por la que se deroga la Directiva 90/220/CEE del Consejo. (DO L 106 de

17.4.2001, p. 1).

Directiva 90/219/CEE del Consejo, de 23 de abril de 1990, relativa a la utilización confinada

de microorganismos genéticamente modificados (DO L 117 de 8.5.1990, p. 1).

Modificada por:

Directiva 98/81/CE del Consejo, de 26 de octubre de 1998, por la que se modifica la

Directiva 90/219/CEE relativa a la utilización confinada de microorganismos genéticamente

modificados (DO L 330 de 5.12.1998, p. 13).

Reglamento (CE) n° 258/97 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 27 de enero de

1997, sobre nuevos alimentos y nuevos ingredientes alimentarios (DO L 43 de 14.2.1997,

p. 1).

Reglamento (CE) nº 178/2002 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 28 de enero de

2002, por el que se establecen los principios y los requisitos generales de la legislación

alimentaria, se crea la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria y se fijan

procedimientos relativos a la seguridad alimentaria (DO L 31 de 1.2.2002, p. 1).

Reglamento (CE) nº 1139/98 del Consejo, de 26 de mayo de 1998, relativo a la indicación

obligatoria, en el etiquetado de determinados productos alimenticios fabricados a partir de

organismos genéticamente modificados, de información distinta de la prevista en la Directiva

79/112/CEE (DO L 159 de 3.6.1998, p. 4).



Directiva 97/4/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 27 de enero de 1997, por la

que se modifica la Directiva 79/112/CEE del Consejo, relativa a la aproximación de las

legislaciones de los Estados miembros en materia de etiquetado, presentación y publicidad

de los productos alimenticios destinados al consumidor final (DO L 43 de 14.2.1997, p. 21).

Directiva 96/21/CE del Consejo, de 29 de marzo de 1996, por la que se modifica la Directiva

94/54/CE de la Comisión, relativa a la indicación en el etiquetado de determinados

productos alimenticios de otras menciones obligatorias distintas de las previstas en la

Directiva 79/112/CEE (DO L 88 de 5.4.1996, p. 5).

Directiva 94/54/CE de la Comisión, de 18 de noviembre de 1994, relativa a la indicación en

el etiquetado de determinados productos alimenticios de otras menciones obligatorias

distintas de las previstas en la Directiva 79/112/CEE del Consejo (DO L 300 de 23.11.1994,

p. 14).

Reglamento (CE) nº 49/2000 de la Comisión, de 10 de enero de 2000, por el que se

modifica el Reglamento (CE) nº 1139/98 del Consejo relativo a la indicación obligatoria, en

el etiquetado de determinados productos alimenticios fabricados a partir de organismos

genéticamente modificados, de información distinta de la prevista en la Directiva

79/112/CEE (DO L 6 de 11.1.2000, p. 13).

Reglamento (CE) nº 50/2000 de la Comisión, de 10 de enero de 2000, relativo al etiquetado

de los productos alimenticios e ingredientes alimentarios que contienen aditivos y aromas

modificados genéticamente o producidos a partir de organismos genéticamente modificados

(DO L 6 de 11.1.2000, p. 15).

Directiva 89/397/CEE del Consejo, de 14 de junio de 1989, relativa al control oficial de los

productos alimenticios (DO L 186 de 30.6.1989, p. 23).

Directiva 93/99/CEE del Consejo, de 29 de octubre de 1993, sobre medidas adicionales

relativas al control oficial de los productos alimenticios (DO L 290 de 24.11.1993, p. 14).

Recomendación de la Comisión, de 25 de enero de 2002, relativa a un programa

coordinado de control oficial de productos alimenticios para el año 2002 (2002/66/CE) (DO L

26 de 30.1.2002, p. 8).



Reglamento (CE) nº 1829/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre

de 2003, sobre alimentos y piensos modificados genéticamente (DO L 268 de 18.10.2003,

p. 1).

Reglamento (CE) n° 1830/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre

de 2003, relativo a la trazabilidad y al etiquetado de organismos genéticamente modificados

y a la trazabilidad de los alimentos y piensos producidos a partir de éstos, y por el que se

modifica la Directiva 2001/18/CE (DO L 268 de 18.10.2003, p. 24).

Reglamento (CE) n° 641/2004 de la Comisión, de 6 de abril de 2004, sobre las normas de

desarrollo del Reglamento (CE) n° 1829/2003 del Parlamento Europeo y del Consejo en lo

relativo a la solicitud de autorización de nuevos alimentos y piensos modificados

genéticamente, la notificación de productos existentes y la presencia accidental o

técnicamente inevitable de material modificado genéticamente cuya evaluación de riesgo

haya sido favorable (DO L 102 de 7.4.2004, p. 14).

Directiva 79/112/CEE del Consejo, de 18 de diciembre de 1978, relativa a la aproximación

de las legislaciones de los Estados Miembros en materia de etiquetado, presentación y

publicidad de los productos alimenticios destinados al consumidor final (DO L 33 de

8.2.1979, p. 1).

Reglamento (CE) n° 65/2004 de la Comisión, de 14 de enero de 2004, por el que se

establece un sistema de creación y asignación de identificadores únicos a los organismos

genéticamente modificados (DO L 10 de 16.1.2004, p. 6).

Reglamento (CE) n° 882/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 29 de abril de

2004, sobre los controles oficiales efectuados para garantizar la verificación del

cumplimiento de la legislación en materia de piensos y alimentos y la normativa sobre salud

animal y bienestar de los animales (DO L 165 de 30.4.2004, p. 1/141).






Alimentos

Sesión nº 2

Presentación del Manual, Métodos de Trabajo e Introducción del Curso

M. Querci

Presentación del Manual, Métodos de Trabajo e Introducción del Curso 2


Índice

Sesión nº 2

Presentación del Manual, Métodos de Trabajo e Introducción del Curso

Cómo detectar OGM 3 Ventajas y limitaciones intrínsecas de los enfoques del ADN y de las proteínas 4 Consideraciones generales y presentación del Manual 7

Bibliografía 11



Cómo detectar OGM

Como se ha visto anteriormente, las plantas transgénicas se caracterizan por la

inserción de un nuevo gen (o de un nuevo conjunto de genes) en sus genomas. El

nuevo gen o genes se traducen y la nueva proteína se expresa. Esto proporciona a

la planta una característica nueva, como la resistencia a determinados insectos o la

tolerancia a ciertos herbicidas. La base de todas las técnicas de detección de OGM

consiste en explotar la diferencia entre la variedad no modificada y la planta

transgénica. Esto puede hacerse detectando el nuevo ADN transgénico que se ha

insertado, o la nueva proteína expresada, o (si la proteína actúa de enzima)

utilizando el análisis químico para detectar el producto de la reacción enzimática.

Hay dos planteamientos científicos que se utilizan generalmente en la actualidad

para detectar modificaciones genéticas en plantas como la soja, el maíz, el algodón

y otras. Uno es el ELISA (ensayo de inmunoabsorción enzimática), con el que se

estudia la presencia de proteínas específicas explotando la especificidad de la unión

entre un antígeno expresado y un anticuerpo diana; el otro es la PCR (reacción en

cadena de la polimerasa), basada en la detección de secuencias nuevas de ADN

insertadas en el genoma de la planta. Estos métodos muestran la ausencia o

presencia del OGM en la muestra, pero a veces también pueden dar una indicación

cuantitativa (porcentaje) sobre la muestra estudiada.

El primer método validado a nivel comunitario es uno de cribado que aplica la PCR y

es capaz de detectar la mayoría de los OGM cuya comercialización está autorizada

actualmente (Lipp et al., 1999). Este método, elaborado por Pietsch et al. (1997), se

basa en la detección de las secuencias de control que flanquean al gen introducido,

y que son el promotor 35S y el terminador nos. La validación fue coordinada por la

antigua Unidad de productos alimentarios y bienes de consumo del Instituto de la

Salud y la Protección de los Consumidores, del Centro Común de Investigación, y se

hizo en colaboración con el Instituto de Medidas y Materiales de Referencia del CCI,

encargado de la producción de los apropiados materiales de referencia certificados.

Como se señala más arriba, también hay actividades de investigación para el

desarrollo de métodos relativos a las proteínas. Se ha validado un método muy

específico para la detección de soja Roundup Ready utilizando ELISA (Lipp et al.,

2000) y se han elaborado otros

(http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm).



Ventajas y limitaciones intrínsecas de los enfoques del ADN y de las proteínas

El enfoque del ADN

Cada vez se utilizan más los métodos analíticos basados en la técnica de la PCR

para la detección de secuencias de ADN asociadas con OGM.

La PCR permite la amplificación selectiva de segmentos específicos de ADN

presentes con baja frecuencia en una mezcla compleja con otras secuencias de

ADN. En la PCR, los pequeños fragmentos de ADN complementario se llaman

cebadores y se utilizan por pares. Estos cebadores se diseñan para hibridarse con

sitios de reconocimiento de la secuencia complementaria en hebras opuestas del

gen de interés. A través de una serie de ciclos térmicos diferenciales repetitivos, una

enzima ADN polimerasa ayuda a la replicación y a la amplificación exponencial de la

secuencia situada entre el par de cebadores. Finalmente, estos fragmentos

amplificados se someten a electroforesis en gel normal para poder detectar su

presencia en función de la determinación de su tamaño.

Se han desarrollado muchos métodos basados en esta PCR que pueden detectar y

cuantificar los OGM presentes en plantas agrícolas utilizadas como alimentos y

piensos. Por otra parte, la determinación de la identidad genética permite la

segregación y la trazabilidad (preservación de la identidad) a lo largo de la cadena

de distribución de las plantas GM.

Un requisito previo fundamental de la detección de OGM es el conocimiento del tipo

de modificación genética, incluida la conformación molecular del gen introducido y

los elementos reguladores (promotores y terminadores) que lo flanqueen. Para el

análisis es necesario disponer de una cantidad mínima de material de muestra con

ADN intacto, incluido el gen diana.

La PCR es una técnica de laboratorio cuya realización exige personal formado y

material especializado.

A continuación se indican algunas de las características clave del diagnóstico por

PCR:

- Puede ser extremadamente sensible, capaz de detectar la presencia de unos

pocos ejemplares (e incluso de un solo ejemplar) de un gen o secuencia diana de

interés dentro de todo el material genético de un organismo (genoma). Como

resultado de esta elevada sensibilidad, pueden obtenerse falsos positivos con

niveles muy bajos de contaminación accidental. Por tanto, ha de extremarse la

atención para evitar la contaminación cruzada.



- Exige poco tiempo de elaboración de los reactivos comparando con los ensayos

inmunológicos (síntesis de cebador frente a producción de anticuerpos).

- Casi todos los reactivos necesarios están disponibles en el comercio y pueden

obtenerse fácilmente de varias fuentes. Sin embargo, hace falta una autorización

para utilizar algunos de ellos en actividades de diagnóstico comerciales.

- El análisis de las muestras lleva un día aproximadamente.

- La PCR puede discriminar entre diferentes tipos de modificación genética (también

denominados productos transgénicos) si se efectúa adecuadamente. Los métodos

de diagnóstico para identificar productos transgénicos específicos necesitan más

tiempo de elaboración y actividades de validación.

El enfoque de las proteínas El método de ensayo de proteínas utiliza anticuerpos específicos de la proteína de

interés. La técnica ELISA detecta o mide la cantidad de proteína de interés en una

muestra que puede contener otras muchas proteínas diferentes. Utiliza un

anticuerpo para ligar la proteína específica, un segundo anticuerpo para amplificar la

detección (fase optativa) y un conjugado de anticuerpo con una enzima, cuyo

producto genera una reacción coloreada, que es fácil de observar y cuantificar

comparando con una curva patrón de la proteína de interés.

Para la ejecución adecuada del ensayo hace falta también personal formado y

material especializado.

Entre las características fundamentales de los ensayos con ELISA están las

siguientes:

- Menor sensibilidad que la PCR, por lo que es más difícil que aparezcan «falsos

positivos» debidos a pequeños niveles de contaminación.

- Elevados costes iniciales para el desarrollo del ensayo y la obtención de

anticuerpos y patrones de proteínas.

- Reducidos costes por muestra, una vez elaborados los reactivos.

- No puede discriminar entre diferentes modos y modelos de expresión de diferentes

productos transgénicos que expresan características proteínicas similares.

- Los métodos de proteínas exigen un notable tiempo de preparación de los

reactivos y del método.

- Los métodos de ensayo de proteínas son prácticos y eficaces cuando se produce

una proteína detectable. Sin embargo, es posible que los productos modificados

genéticamente se formen solo durante ciertas fases del desarrollo o en

determinadas partes de los vegetales, por lo que resultaría poco probable que tales

productos fueran detectados sin problemas por la técnica ELISA. Por otra parte, las



transformaciones industriales desnaturalizan fácilmente las proteínas, lo que plantea

dificultades para el uso de métodos ELISA con fracciones de alimentos

transformados.

Teniendo todo esto en cuenta, ha de quedar claro que el ELISA y la PCR deben

considerarse mutuamente complementarios y no se excluyen entre sí.

Cuadro 2. Comparación resumida de los métodos ELISA y PCR

Método Objeto Duración Facilidad de utilización

Resultados

ELISA Proteínas 2 - 8 horas Moderada; exige conocimiento de las prácticas de laboratorio; los ensayos son específicos de especie y de variedad.

Confirma una modificación genética específica y permite la cuantificación.

PCR ADN 1 – 3 días Escasa; requiere formación y material especializados.

Muy sensible; tiende a dar falsos positivos; confirma la presencia de ADN GM y permite la cuantificación.



Consideraciones generales y presentación del Manual

La validación del método es crítica tanto para los laboratorios como para las

autoridades de control. Lo ideal es que un número limitado de laboratorios

capacitados verifique las características de cada método en cuanto a su capacidad

de dar resultados reproducibles, sensibles y específicos. El Centro Común de

Investigación de la Comisión Europea fue el primero en validar los métodos ELISA y

PCR para materias primas constituidas por soja Roundup Ready y un método PCR

para maíz Maximizer (Bt-176), así como un método PCR tanto para soja Roundup

Ready como para maíz Maximizer (Bt-176) en fracciones de alimentos

transformados (Lipp et al., 1999, 2000 y 2001). Después se han desarrollado y

validado algunos otros métodos de análisis tanto cuali como cuantitativo. Para

obtener mas información sobre los métodos validados de detección y cuantificación

de OGM en la dirección: http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm

La preparación de las muestras, tanto si se aplican métodos de ADN como de

proteínas, es crítica para la detección y la cuantificación. Es importante saber las

limitaciones de cada procedimiento en función del aspecto que interese (p. ej.,

análisis cuali o cuantitativo). Tanto el tamaño de la muestra como los procedimientos

de muestreo influyen muchísimo en las conclusiones que puedan extraerse de estos

métodos de ensayo.

Los dos tipos de métodos dependen fundamentalmente de la disponibilidad de

materiales de referencia certificados que sean adecuados. Las muestras

utilizadas en el curso son materiales de referencia certificados producidos en el

IRMM del CCI (Trapmann et al., 2002 y 2001). Las características y los certificados

correspondientes se presentan en la sesión nº 3. Otra fase crítica, que debe

mencionarse aunque no se va a efectuar durante el curso, es la homogeneización de la muestra.

La figura 1 resume las distintas fases efectuadas durante el curso. Es fundamental

optimizar la extracción del ADN para garantizar la presencia y calidad del ADN

extraído y amplificable por PCR. Este aspecto es particularmente importante, ya que

la mayoría de los productos alimentarios comercializados a base de soja o maíz

están muy transformados. Es bien sabido que el ADN puede degradarse

considerablemente durante la transformación de los alimentos, sobre todo por

tratamiento térmico en presencia de agua. Por tanto, a medida que se transforman

más los alimentos, puede disminuir el número de fragmentos de ADN que siguen

siendo suficientemente largos y conteniendo intacta la secuencia de interés para

permitir la detección de la presencia de OGM en alimentos transformados. Además,



un método verdaderamente adecuado de extracción del ADN debe conseguir la

eliminación de las sustancias inhibidoras que pueda haber en la muestra. Este tema

se tratará en la sesión nº 4. Se han elaborado diversos métodos de extracción de

ADN y son muchas las empresas comerciales que producen kits especializados

listos para usarse. Durante el curso se hablará sobre las características y la validez

de los diferentes protocolos disponibles. Sin embargo, para evitar la implicación

directa de empresas comerciales, se ha decidido efectuar la extracción del ADN con

el denominado método CTAB, protocolo validado y versátil que ha demostrado su

idoneidad para varias matrices diferentes.

Tras la extracción del ADN, las muestras (así como los productos de la PCR) se

analizan mediante electroforesis en gel de agarosa (sesión nº 5).

En la sesión nº 6 se presentan los principios, ventajas y desventajas de la reacción en cadena de la polimerasa.

Como ya se ha indicado, la utilización eficaz de las técnicas modernas para la

detección de OGM depende de la disponibilidad de información exacta. La detección

de OGM exige el conocimiento al menos parcial de la secuencia del gen diana y del

tipo de modificación genética. En la sesión nº 7 se presentan las características

específicas de las líneas transgénicas de maíz MON810, maíz Bt-176 y soja

Roundup Ready.

Se han elaborado distintos planteamientos de PCR para la detección de los OGM

autorizados. La especificidad de la PCR depende de la selección exacta de los

cebadores. Los cebadores de la PCR pueden dirigirse a diferentes elementos

utilizados en el proceso de transformación. Pueden obtenerse sistemas de detección

de PCR de «banda ancha», denominados generalmente «métodos de cribado»,

diseñando cebadores específicos de las secuencias más comunes utilizadas en la

transformación. Se trata generalmente de las secuencias reguladoras (promotor y

terminador). Los vegetales modificados genéticamente pueden dividirse también en

«categorías» según el gen estructural introducido. Otra forma más de dirigir la

especificidad de la reacción es elegir unos cebadores específicos de las secuencias

de ADN localizadas en distintos elementos genéticos (p. ej., promotor-gen

estructural, gen estructural-terminador). Finalmente, siempre que se disponga de

información específica y completa sobre la secuencia, a fin de obtener métodos

realmente específicos de un determinado vegetal modificado genéticamente, pueden

elaborarse sistemas «con especificidad de línea» (específicos de una

transformación) seleccionando una combinación «única» de secuencias, presente

tan solo en esa línea transformada concreta. Esto se consigue generalmente

diseñando cebadores con hibridación en la región del ADN en la que se incluye el



empalme del sitio de integración. El empalme entre el ADN insertado (ADN-T) y el

ADN hospedador ofrece una secuencia nucleotídica única que constituye una diana

ideal para un ensayo muy específico por PCR. Los métodos realizados durante el

curso se resumen en la figura 1, y se describen con detalle en la sesión nº 8. La

parte experimental de los métodos y protocolos se encuentra en la sesión nº 9.

Como se indica anteriormente, la necesidad de cuantificar el OGM presente en una

muestra hizo que se elaboraran muchos protocolos basados en la PCR, los cuales

permiten no solo una respuesta cualitativa (presencia / ausencia), sino también una

indicación, más o menos precisa (según el método elegido) de la cantidad relativa

del OGM presente en una muestra determinada. Los dos planteamientos de ADN

más comunes son la PCR competitiva y la PCR en tiempo real (sesión nº 10). La

PCR en tiempo real se efectúa utilizando una instrumentación específica y compleja,

que por ahora solo puede adquirirse en unas pocas empresas comerciales. En la

sesión nº 11 se indican los protocolos que se van a seguir durante el curso.

Finalmente, la sesión nº 12 contiene una introducción general al planteamiento

serológico de la detección de organismos genéticamente modificados. En concreto

se explicará la técnica ELISA y se proporcionará el protocolo para efectuar un

ensayo ELISA específico de Roundup Ready.



No se efectuará durante

el curso Materias primas y

transformadas

PCR-lectina para soja y PCR-zeína para maíz

ADN vegetal presente Sin ADN vegetal detectable

Detección de elementos reguladores (promotor 35S y terminador nos)

Vegetal GM Vegetal no GM

Figura 1. Diagrama de flujo de los métodos utilizados durante el curso.

Extracción del ADN

Comprobación de la presencia de ADN vegetal por PCR

+

PCR de cribado

Homogeneización de la muestra

-

+ -

Detección de OGM específicos por PCR anidada

Cuantificación del OGM mediante PCR

en tiempo real

Cuantificación del ADN mediante

espectrofotometría

Detección de OGM mediante ELISA



Bibliografía

Lipp, M., Anklam, E. y Stave, J.W. (2000). Validation of an immunoassay for

detection and quantification of a genetically modified soybean in food and food

fractions using reference materials: Interlaboratory study. Journal of AOAC

International 83, 919–927.

Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. y

Anklam, E. (2001). Validation of a method based on polymerase chain reaction

for the detection of genetically modified organisms in various processed

foodstuffs. European Food Research Technology 212, 497-504.

Lipp, M., Brodmann, P., Pietsch, K., Pauwels, J. y Anklam, E. (1999). IUPAC

collaborative trial study of a method to detect genetically modified soy beans and

maize in dried powder. Journal of AOAC International 82, 923–928.

Pietsch, K., Waiblinger, H.-U., Brodmann, P. y Wurz, A. (1997). Screening-Verfahren

zur Identifizierung „gentechnisch veränderter” plfanzlicher Lebensmittel.

Deutsche Lebensmittel Rundschau 93, 35–38.

Trapmann. S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E.,

Le Guern, L., Kramer, G. N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny, R.,

Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M. y Anklam, E. (2002).

The certification of reference materials of dry-mixed soya powder with different

mass fractions of Roundup Ready™ soya. Certified Reference Materials IRMM-

410S.

(https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/atta

chements/ERM-BF410_report.pdf) (Último acceso enero de 2010)

Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G. N., Schimmel, H.,

Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede, G. y Anklam, E. (2001). The certification

of reference materials of dry mixed maize powder with different mass fractions of

MON810 maize. Certified Reference Materials IRMM-413.


chements/ERM-BF413_report.pdf). (Último acceso enero de 2010)



ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО


Alimentos

Sesión nº 3

Muestras Utilizadas durante el Curso

M. Querci, N. Foti

ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD OFICINA REGIONAL PARA EUROPA

Muestras Utilizadas durante el Curso 2

Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión 3

Índice

Sesión nº 3

Muestras Utilizadas durante el Curso

Muestras utilizadas durante el curso 3 Material de Referencia Certificado 3 Composición de las materias primas y procesadas distribuidas entre los participantes 4 Lista de muestras distribuidas durante el curso. 6 Resultados previstos por PCR 6 Bibliografía 7



Muestras utilizadas durante el curso

En el curso se ensayarán distintos métodos para detectar la presencia de maíz

MON810 y soja Roundup Ready en diversas materias. Con este fin se utilizarán

mezclas de maíces y sojas no GM y GM (MON810 en el caso del maíz y Roundup

Ready en el de la soja) respectivamente, en distintos grados de concentración. Se

utilizarán dos tipos de materiales:

• materiales de referencia certificados

• diversas materias primas y procesadas distribuidas entre los participantes.

Material de referencia certificado

Las materias primas vegetales utilizadas en el curso son los materiales de referencia

certificados IRMM-410S (soja Roundup Ready) e IRMM-413 (maíz MON810). El

IRMM-410S y el IRMM-413 consisten en dos series de CRM de polvo desecado de

soja y maíz, respectivamente, con distintas fracciones de masa (0; 0,1; 0,5; 1; 2; y

5 %) de polvo desecado preparado a partir de soja Roundup Ready y maíz MON810

modificados genéticamente. Los CRM se produjeron en el Instituto de Materiales y

Medidas de Referencia (http://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/homepage.htm) para Fluka

Chemie AG (Buchs, Suiza) en el marco de la colaboración con el Instituto de la

Salud y la Protección de los Consumidores (http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/) del Centro

Común de Investigación de la Comisión Europea (Ispra, Italia) (Trapmann et al.,

2002 y 2001) y están concebidos para la validación de métodos de detección de

alimentos modificados genéticamente. Dado que la cuantificación de ADN y/o

proteínas puede variar en función de las variedades, las conclusiones cuantitativas

de las mediciones de muestras desconocidas deben extraerse con las debidas

precauciones.

El polvo de soja desecado con soja GM Roundup Ready se ha elaborado a partir de

semillas completas de una línea de soja no modificada (Asgrow A1900) y la soja

modificada genéticamente 40-3-2 Roundup Ready (línea Asgrow AG5602 RR). El

polvo de maíz desecado con maíz GM MON810 se ha elaborado a partir de granos

completos del cultivar no modificado DK512 y el cultivar MON810 DK513.



Composición de las materias primas y procesadas distribuidas entre los participantes

Se comprobarán distintas materias: galletas, leche en polvo, migas de aperitivos

secos y harina.

Materias primas

Mezcla de harinas. A fin de obtener un 0,5 % de cada OGM (peso en seco total), se

puso soja RR (IRMM-410S) al 1 % junto a harina con un 1 % de MON810 (IRMM-

413). Se pesaron 50 GM de ambas harinas y se introdujeron directamente en tubos

de reacción preparados para la extracción de ADN. La harina con un 1 % de

MON810 es el material de referencia certificado IRMM-413 (con un 1 % de maíz

MON810).

Migas de aperitivos secos La muestra se extrajo de un programa de comprobación de la idoneidad de OGM

(Programa GeMMA, ronda 06, material de ensayo GMO-06B). El material se preparó

a partir de aperitivos secos a base de soja no modificada genéticamente disponibles

en el mercado y aperitivos con soja modificada genéticamente.

Migas de aperitivos

secos

1 372 g de aperitivos a base de soja no modificada genéticamente y

28 g de aperitivos con soja modificada genéticamente

Antes de proceder a la mezcla, cada material se molió y tamizó hasta obtener un

conjunto de migas homogéneo, tras lo cual se mezclaron en un tambor durante una

noche. Por último, los materiales se mezclaron durante aproximadamente una hora

utilizando un mezclador giratorio y se guardaron a –20 °C.

Galletas El material se produjo en el Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores

del CCI y se utilizó para validar un método de PCR para soja Roundup Ready y maíz

Maximizer (Bt-176) en fracciones de alimentos transformados (Lipp et al., 2001).

Las harinas desecadas de soja y maíz se pesaron y mezclaron con los otros

ingredientes en la proporción indicada a continuación.



Galletas # 1

250 g de maíz (0 % OGM), 250 g de soja (0 % OGM), 300 g de trigo, 200 g de

azúcar, 100 g de mantequilla, 10 g de sal, 16 g de levadura artificial con aroma

de vainilla y 2 huevos

Los ingredientes se mezclaron minuciosamente con 600 ml de agua y la masa se

homogeneizó, se extendió uniformemente en un bandeja de horno y se coció en un

horno precalentado a 180 ºC con recirculación de aire durante 10 min. A

continuación, el material se retiró del horno, se cubrió para evitar su contaminación y

se dejó enfriar a temperatura ambiente. Posteriormente se guardó a –20 °C.

Leche de soja en polvo La muestra se extrajo de la ronda 05 del Programa GeMMA de comprobación de la

idoneidad.

1 700 g de leche de soja en polvo de EE.UU. se mezclaron en un tambor durante

una noche con 300 g de aislado de proteínas de soja Roundup Ready, tras lo cual se

repartieron distintas submuestras (10 g) en frascos de plástico taponados a rosca y

se guardaron a temperatura ambiente antes de su distribución.

Galletas MON810 Este material se produjo en la Unidad de biotecnología y OGM del CCI.

La harina desecada de maíz se pesó y mezcló con los otros ingredientes en la

proporción indicada a continuación.

Galletas MON810

200 g de harina de trigo, 100 g de harina de maíz* (2* % OGM), 150 g de

azúcar, 100 g de mantequilla y 1 huevo.

*La harina de maíz con un 2 % de MON810 se obtuvo añadiendo harina de maíz

silvestre a harina MON810 al 100 % y mezclándolas durante 30 minutos.

Los ingredientes se mezclaron minuciosamente, se extendieron uniformemente en

un bandeja de horno y se cocieron en un horno precalentado a 180 ºC con

recirculación de aire durante10 min. A continuación, el material se retiró del horno,

se cubrió para evitar su contaminación y se dejó enfriar a temperatura ambiente.

Posteriormente se guardaron a 4 °C hasta su utilización.



Lista de muestras distribuidas durante el curso.

Características % de OGM (ingrediente específico)

Muestra

Soja RR Maíz MON810

Galletas # 1 0 % 0 % Mezcla de harinas 1 % 1 % Harina MON810 - 1 % Migas de aperitivos secos 2,2 % - Leche de soja en polvo 8,9 % - Galletas MON810

- 2 %

Resultados previstos por PCR

MUESTRA zeína lectina 35S nos E35S/hsp70(b) CTP/EPSPS

IRMM- 410S-0 (0 %) - + - - - - IRMM- 410S-1 (0,1 %) - + + + - + IRMM- 410S-2 (0,5 %) - + + + - + IRMM- 410S-3 (1 %) - + + + - + IRMM- 410S-4 (2 %) - + + + - + IRMM- 413-0 (0 %) + - - - - - IRMM- 413-1 (0,1 %) + - + - + - IRMM- 413-2 (0,5 %) + - + - + - IRMM- 413-3 (1 %) + - + - + - IRMM- 413-4 (2 %) + - + - + - Galletas # 1 + + - - - - Mezcla de harinas + + + + + + Harina MON810 + - + - + - Migas de aperitivos

secos - + + + - +

Leche de soja en polvo - + + + - + Galletas MON810

+ - + - + -



Bibliografía








Trapmann. S., Catalani, P., Conneely, P., Corbisier, P., Gancberg, D., Hannes, E.,

Le Guern, L., Kramer, G. N., Prokisch, J., Robouch, P., Schimmel, H., Zeleny, R.,

Pauwels, J., Van den Eede, G., Weighardt, F., Mazzara, M. y Anklam, E. (2002).

The certification of reference materials of dry-mixed soya powder with different

mass fractions of Roundup Ready™ soya. Certified Reference Materials IRMM-

410S.


chements/ERM-BF410_report.pdf). (Último acceso enero de 2010)

Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G. N., Schimmel, H.,

Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede, G. y Anklam, E. (2001). The certification

of reference materials of dry-mixed maize powder with different mass fractions of

MON810 maize. Certified Reference Materials IRMM-413.


chements/ERM-BF413_report.pdf) (Último acceso enero de 2010) GeMMA Scheme-GMO analysis Round 06. GMO Proficiency Testing (octubre de

2001). Report N. GMO 06.

GeMMA Scheme-GMO analysis Round 05. GMO Proficiency Testing, (octubre de

2001). Report N. GMO 05.






Alimentos

Sesión nº 4

Extracción y Purificación de ADN

M. Somma

Extracción y Purificación de ADN 2


Índice

Sesión nº 4

Extracción y Purificación de ADN

Introducción 3 Métodos de extracción 4 Métodos de purificación 4 Método de extracción y purificación con CTAB 6 Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría 9 Principios de la cuantificación de ADN por espectrofotometría 10 Determinación de la concentración de ácidos nucleicos 11 Práctica 13

Bibliografía 17



Introducción

La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primara etapa de la

mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de

recombinación de ADN. En este caso, los métodos de extracción permiten obtener

ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar

análisis específicos de modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de

la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los ácidos nucleicos son dos de los

elementos más importantes en ese tipo de análisis. Si se desea obtener ácidos

nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso

aplicar métodos de extracción adecuados. Los contaminantes capaces de inhibir el

análisis PCR se enumeran en el cuadro 1. Con objeto de evitar los falsos negativos

debidos a la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra, se recomienda

vivamente efectuar un experimento de control de la inhibición de la PCR, que suele

hacerse mediante PCR específica de vegetales (eucariotas o cloroplastos) o de la

especie.

Cuadro 1. Inhibidores de la PCR.

Inhibidor Concentración de inhibición Dodecilsulfato sódico > 0,005 % Fenol > 0,2 % Etanol > 1 % Isopropanol > 1 % Acetato de sodio > 5 mM Cloruro de sodio > 25 mM EDTA > 0,5 mM Hemoglobina > 1 GM/ml Heparina > 0,15 UI/ml Urea > 20 mM Mezcla de reacción > 15 %

Dada la gran variedad de métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos

existentes, la elección de la técnica más adecuada suele efectuarse conforme a los

criterios siguientes:

• ácido nucleico diana;

• organismo fuente;

• material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.);

• resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificación);

• uso posterior (PCR, clonación, etiquetado, transferencia, RT-PCR, síntesis de

ADNc, etc.).



A continuación se recogen los principios de algunos de los métodos de extracción y

purificación de ácidos nucleicos que más se emplean en la actualidad.

Métodos de extracción

Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis

celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos

de células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de

técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo

(un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico

diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes:

• rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.);

• tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles,

etc.);

• digestión enzimática (Proteinasa K, etc.).

Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al

mismo tiempo. Por ejemplo, una misma solución puede contener detergentes que

solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes que inactiven las

enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los

restos de células se eliminan fácilmente por filtración o precipitación.

Métodos de purificación

Los métodos empleados para purificar los ácidos nucleicos de extractos celulares

suelen ser combinaciones de dos o más técnicas de las siguientes:

• extracción/precipitación;

• cromatografía;

• centrifugación;

• separación por afinidad.

En los párrafos siguientes se describen brevemente estas técnicas (Zimmermann et

al., 1998).

Extracción/precipitación

A menudo se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los

contaminantes de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una

combinación de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las proteínas. Para

concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una precipitación con isopropanol o

etanol. Si la cantidad de ácido nucleico diana es escasa, puede añadirse a la mezcla



un portador inerte (como el glucógeno) para favorecer la precipitación. También

puede realizarse una precipitación selectiva con concentraciones salinas elevadas

(precipitación salina) o una precipitación de las proteínas mediante cambios del pH.

Cromatografía

Pueden emplearse diversas técnicas cromatográficas de separación: permeación

sobre gel, intercambio iónico, adsorción selectiva o unión por afinidad. La

permeación sobre gel aprovecha las propiedades de las partículas porosas del gel

para tamizar moléculas. Se emplea una matriz con poros de tamaño definido, que

dejan pasar las moléculas más pequeñas por difusión, pero no las más grandes, que

quedan eluidas en el volumen vacío. Así pues, las moléculas quedan eluidas por

orden de tamaño decreciente. La cromatográfica de intercambio iónico es otra

técnica, que se basa en la interacción electrostática de la molécula diana con un

grupo funcional de la matriz en columna. Los ácidos nucleicos (polianiones lineales

con fuerte carga negativa) pueden eluirse de las columnas de intercambio iónico con

simples Tampones salinos. En la cromatografía de adsorción, los ácidos nucleicos

se fijan selectivamente en sílice o vidrio, en presencia de determinadas sales (por

ejemplo, sales caotrópicas), mientras que otras moléculas biológicas no se fijan. A

continuación, los ácidos nucleicos pueden eluirse con agua o un tampón hiposalino y

se obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las aplicaciones

posteriores.

Centrifugación

La centrifugación selectiva constituye un método de purificación eficaz. Así, por

ejemplo, la ultracentrifugación en gradientes autogenerados de CsCl con fuerzas g

elevadas se lleva empleando mucho tiempo para purificar plásmidos. La

centrifugación suele asociarse a otros métodos, como la cromatografía de columna

centrifugada, en cuyo caso se combina la permeación sobre gel y la centrifugación

para separar el ADN o ARN de contaminantes más pequeños (sales, nucleótidos,

etc.), intercambiar tampones o seleccionar según el tamaño. Algunos procedimientos

combinan la adsorción selectiva en matriz cromatográfica (véase el apartado anterior

«Cromatografía») y la elución por centrifugación para purificar de forma selectiva un

tipo de ácido nucleico.

Separación por afinidad

En los últimos años, cada vez son más los métodos de purificación que combinan la

inmovilización por afinidad de ácidos nucleicos y la separación magnética. Por

ejemplo, los ARNm poli A + pueden unirse a partículas magnéticas revestidas de



estreptavidina mediante oligo dT marcados con biotina, y el complejo de partículas

puede eliminarse de la solución (y de los contaminantes libres) con un imán. Esta

técnica en fase sólida simplifica la purificación de los ácidos nucleicos, pues permite

sustituir las etapas de centrifugación, extracción orgánica y separación de fases por

una operación de separación magnética, única y rápida.

Método de extracción y purificación con CTAB

El protocolo del método del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado

por Murray y Thompson en 1980 (Murray y Thompson, 1980) y publicado

posteriormente, en 1987, por Wagner y sus colaboradores (Wagner et al., 1987). El

método es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos

derivados de vegetales y está especialmente indicado para eliminar los polisacáridos

y los compuestos polifenólicos, que, de otro modo, alterarían la pureza del ADN y,

por tanto, su calidad. Este procedimiento se ha aplicado con frecuencia en genética

molecular de los vegetales y ha sido probado en ensayos de validación para detectar

OGM (Lipp et al., 1999; 2001). Se han elaborado algunas variantes adicionales para

adaptar el método a una amplia gama de matrices de alimentos transformados o sin

transformar (Hupfer et al., 1998; Hotzel et al., 1999; Meyer et al., 1997; Poms et al.,

2001).

Principios del método del CTAB: lisis, extracción y precipitación

Las células vegetales pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de cetil-

trimetil amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos en

medio hiposalino. De ese modo, los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los

demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por

lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentración salina y se

precipita con etanol o isopropanol. En esta sección se describirán los principios de

las tres etapas principales: la lisis de la membrana celular, la extracción del ADN

genómico y su precipitación.

Lisis de la membrana celular: Tal como se ha mencionado anteriormente, la

primera etapa de la extracción del ADN es la rotura de la membrana celular y

nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con el tampón de

extracción, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas biológicas

presentan la misma estructura general, integrada por moléculas de lípidos y de

proteínas, unidas por interacciones no covalentes.



Figura 1. Representación simplificada de las membranas celulares1.

Tal como muestra la figura 1, las moléculas lipídicas están ordenadas en una doble

capa continua, en la que las moléculas proteínicas están «disueltas». Las moléculas

lipídicas están formadas por extremos hidrófilos, denominados «cabezas», y

extremos hidrófobos, denominados «colas». En este método, el detergente (CTAB)

contenido en el tampón de extracción provoca la lisis de la membrana. Dado que la

composición de los lípidos y del detergente es similar, el componente de CTAB del

tampón de extracción captura los lípidos que integran la membrana celular y nuclear.

La figura 2 ilustra el mecanismo de solubilización de los lípidos con un detergente.

Figura 2. Solubilización de los lípidos.

1 Las ilustraciones que figuran en esta página y en las siguientes proceden del Genetic Science Learning Center, Universidad de Utah, http://gslc.genetics.utah.edu.

ADN

Membrana nuclear



La figura 3 ilustra cómo se libera el ADN genómico cuando el detergente captura los

lípidos y las proteínas al entrar en contacto la membrana celular y el tampón de

extracción con CTAB. Con una concentración salina (NaCl) determinada, el

detergente forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos. El EDTA es un

componente quelante, que se une al magnesio, entre otros metales. El magnesio es

un cofactor de la desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad de la

desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl confiere a la solución la

capacidad de amortiguar el pH (un pH inferior o superior daña el ADN). Es

importante señalar que, como los ácidos nucleicos se degradan fácilmente en esta

fase de la purificación, debe reducirse al mínimo el tiempo transcurrido entre la

homogeneización de la muestra y la adición de la solución tampón con CTAB. Una

vez que se han roto las membranas de la célula y de los orgánulos (como los que se

encuentran alrededor de las mitocondrias y los cloroplastos), se purifica el ADN.

Figura 3. Rotura de la membrana celular y extracción del ADN genómico.

Extracción - En esta etapa, se separan los complejos formados por los ácidos

nucleicos y el CTAB de los polisacáridos, los compuestos fenólicos, las proteínas y

los demás lisados celulares disueltos en la solución acuosa. Es especialmente

importante eliminar los polisacáridos y los compuestos fenólicos, pues pueden inhibir

numerosas reacciones enzimáticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl < 0,5 M),

los contaminantes de los complejos de ácidos nucleicos no precipitan y pueden

eliminarse extrayendo la solución acuosa con cloroformo. El cloroformo

desnaturaliza las proteínas y facilita la separación de las fases acuosa y orgánica. La

fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si dicha fase es densa

debido a la concentración salina (> 0,5 M), formará la fase inferior. Además, si el pH

de la solución acuosa no se ha equilibrado debidamente (pH 7,8 – 8,0), los ácidos

nucleicos tenderán a repartirse en la fase orgánica. Si es preciso, la extracción con



cloroformo se realizará dos o tres veces, con objeto de eliminar por completo las

impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extracción de los ácidos

nucleicos, puede retroextraerse la fase orgánica con una solución acuosa, que se

añade a continuación al extracto anterior. Una vez purificados los complejos de

ácidos nucleicos, puede procederse a la precipitación, última etapa del

procedimiento.

Precipitación - En esta última etapa se separan los ácidos nucleicos del detergente,

para lo cual la solución acuosa se trata primero con una solución de precipitación

compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentración elevada (NaCl >

0,8 M). Una alta concentración salina es necesaria para que se forme un precipitado

de ácidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl

por su capacidad tampón. En estas condiciones, el detergente, que es más soluble

en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los ácidos

nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite una mayor

purificación o elución de los ácidos nucleicos de la sal residual.

Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría

El ADN, el ARN, los oligonucleótidos e incluso los mononucleótidos pueden

cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir,

midiendo la absorbancia A (o densidad óptica, DO) de luz ultravioleta (también

puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene

cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol o agarosa, la

medición espectrofotométrica de la irradiación ultravioleta absorbida por las bases es

sencilla y exacta. En este método, los tampones acuosos con escasa concentración

iónica (por ejemplo, tampón TE) resultan idóneos. La concentración de ácidos

nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un blanco. La

interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un «cociente». Dado

que las proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular

la pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros

son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorción a 230 nm significa que la muestra

está contaminada con hidratos de carbono, péptidos, fenoles, compuestos

aromáticos u otras sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de 2,2

aproximadamente.

Cuando la cantidad disponible de ácidos nucleicos es escasa, puede emplearse el

método de la placa de agarosa con bromuro de etidio. Permite calcular la cantidad

de ácidos nucleicos a partir de la intensidad de la fluorescencia emitida por el



bromuro de etidio irradiado con luz UV, comparándola con unos patrones de

concentración.

Principios de la cuantificación de ADN por espectrofotometría

El espectrofotómetro se funda en la transmisión de la luz a través de una solución

para determinar la concentración de un soluto presente en la misma. El aparato

funciona conforme a un principio sencillo: se irradia una muestra con una radiación

luminosa de longitud de onda conocida y se mide la energía luminosa transmitida

con una célula fotoeléctrica situada detrás de la muestra.

Tal como muestra la figura 4, el espectrofotómetro de haz único consta de una

fuente luminosa, un prisma, un recipiente con la muestra y una célula fotoeléctrica.

Los distintos elementos están conectados a los sistemas eléctricos o mecánicos

adecuados para controlar la intensidad luminosa y la longitud de onda y para

convertir en variaciones de tensión la energía recibida en la célula fotoeléctrica. Las

variaciones de tensión se miden en un contador o se registran en un ordenador para

su posterior análisis.

Fig Figura 4. Representación esquemática de la transmisión de la luz.

Cada molécula absorbe la energía radiante a una longitud de onda específica, a

partir de la cual es posible extrapolar la concentración de un soluto en una solución.

Con arreglo a la ley de Lambert-Beer, existe una relación lineal entre la absorbancia

A (también denominada densidad óptica, DO) y la concentración de la

macromolécula, conforme a la ecuación siguiente:

A = DO = εlc (1)

donde ε es el coeficiente de extinción molar, c es la concentración y l es el paso de

luz de la cubeta. Las proteínas y los ácidos nucleicos absorben la luz en el intervalo



ultravioleta, a longitudes de onda comprendidas entre los 210 y los 300 nm. Tal

como se ha señalado anteriormente, la absorbancia máxima de las soluciones de

ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones de proteínas, a 280 nm.

Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz a 280 nm y las

que contienen proteínas hacen lo propio a 260 nm, el cociente de los valores

obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A260/A280) proporciona una estimación del grado de

pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes A260/A280 respectivos del ADN y el

ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un paso de luz de 10 mm y una

longitud de onda de 260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde aproximadamente

a 50 µg/ml de ADN bicatenario, 37 µg/ml de ADN monocatenario, 40 µg/ml de ARN o

30 µg/ml de oligonucleótidos. Si la muestra también contiene proteínas, el cociente

A260/A280 será considerablemente inferior a dichos valores y no podrá determinarse

con exactitud la cantidad de ácidos nucleicos. Debe precisarse que la

espectrofotometría no permite identificar de forma fiable impurezas de ARN

presentes en las soluciones de ADN. Puede emplearse la absorbancia a 325 nm

para poner de manifiesto la presencia de restos en la solución o la suciedad de la

cubeta.

Determinación de la concentración de ácidos nucleicos

Elección de la cubeta. La cantidad de solución de ácidos nucleicos necesaria para

medir la absorbancia A depende de la capacidad de la cubeta. Debe elegirse una

cubeta apropiada atendiendo al intervalo de concentración de la muestra, el factor

de dilución y el volumen de la muestra. En la mayor parte de los procedimientos

empleados para detectar OGM, el volumen de ADN genómico disponible varía entre

50 y 100 µl. Para la cuantificación espectroscópica de pequeños volúmenes de

ácidos nucleicos se emplean diversos tipos de cubetas de microvolumen, cuya

capacidad oscila entre 5 y 70 µl.

Preparación. Para calibrar el espectrofotómetro es importante:

• establecer el paso de luz correcto;

• establecer el factor correcto (ADN bicatenario, ADN monocatenario o ARN);

• medir la solución en blanco (establecer la referencia), que será agua o solución

tampón (A260 = 0);

• cerciorarse de que la referencia establecida se renueva periódicamente;

• medir una cantidad conocida de ácidos nucleicos puros para comprobar la

fiabilidad de la referencia establecida.



Medición en una muestra desconocida. Para medir la concentración, se utilizan

cantidades determinadas de solución de ADN en función de la capacidad de la

cubeta empleada (por ejemplo, 5 µl de ADN diluidos en 195 µl de agua si la

capacidad de la cubeta es inferior a 0,2 ml). Después de calibrar el

espectrofotómetro y de añadir la solución de ácidos nucleicos, se tapa la cubeta, se

mezcla la solución y se mide la absorbancia. Con objeto de reducir los errores de

pipeteado, debe efectuarse la medición al menos dos veces y siempre con 5 µl de

solución de ADN, como mínimo. Se desaconsejan los valores de A260 inferiores a

0,02 o comprendidos entre 1 y 1,5 (según el instrumental empleado) por el elevado

margen de error que entrañan.

La concentración c de un ácido nucleico determinado presente en una solución se

calcula conforme a las ecuaciones siguientes:

• ADN monocatenario: c(pmol/µl) = A260/0,027

• ADN bicatenario: c(pmol/µl) = A260/0,020

• ARN monocatenario: c(pmol/µl) = A260/0,025

• Oligonucleótido: c(pmol/µl) = A260100/1,5NA+0,71NC+1,20NG + 0,84NT

donde A260 es la absorbancia medida a 260 nm.

El cuadro 2 recoge un ejemplo de los valores de la absorbancia de ADN de timo de

ternera muy purificado, en suspensión en un tampón TNE 1x, considerando que el

ADN de referencia es ADN bicatenario, con una A260 = 1 a 50 µg/ml, en una cubeta

cuyo paso de luz es de 10 mm. La concentración nominal de ADN era de 25 µg/ml.

Cuadro 2. Valores de la absorbancia de ADN de timo de ternera muy purificado, en

tampón TNE 1x.

Longitud de onda

Absorbancia A260/A280 Conc. (µg/ml)

325 0,01 - - 280 0,28 - - 260 0,56 2,0 28 230 0,30 - -



Práctica

Instrumental

OBSERVACIONES Antes de utilizar todo el instrumental hay que esterilizarlo y eliminar todos los

residuos de ADN. Para evitar la contaminación, deben usarse puntas de pipeta con

barrera protectora contra aerosoles.

• Instrumental reductor (hoja de bisturí estéril, mortero, etc.)

• Baño maría o calentador

• Microcentrifuga

• Micropipetas

• Mezclador de torbellino

• Tubos para microcentrifuga de 1,5 ml

• Bandejas de pesar o equivalente

• Espátulas

• Balanza capaz de efectuar mediciones de 0,01 g

• Asas

• Soporte para tubos de microcentrifuga

• Optativo: desecador en vacío para secar los sedimentos de ADN.

Reactivos

OBSERVACIONES Todos los productos químicos han de ser de calidad de biología molecular. El agua

desionizada y los Tampones han de esterilizarse en autoclave antes de su

utilización. Ningún producto químico debe contener ADN ni desoxirribonucleasa.

• Bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) Nº CAS 124-03-8

• Cloroformo

• Isopropanol

• Na2EDTA Nº CAS 6381-92-6

• Etanol

• NaCl

• Proteinasa K



• Ribonucleasa A

• Trometamol (Tris-HCl)

• Agua desionizada esterilizada

Tampón a base de CTAB

CTAB 20 g/l 4 g

NaCl 1,4 M 16,4 g

Tris-HCl 0,1 M 3,15 g

Na2EDTA 20 mM 1,5 g

• Añadir 100 ml de agua desionizada;

• ajustar el pH a 8,0 con NaOH 1 M;

• completar hasta 200 ml y esterilizar en autoclave;

• conservar el Tampon a 4°C (seis meses como máximo).

Solución de precipitación a base de CTAB

CTAB 5 g/l 1 g

NaCl 0,04 M 0,5 g

• Añadir 100 ml de agua desionizada;

• ajustar el pH a 8,0 con NaOH 1 M;

• completar hasta 200 ml y esterilizar en autoclave;

• conservar la solución a 4°C (seis meses como máximo).

NaCl 1,2 M

• Disolver 7,0 g de NaCl en 100 ml de agua desionizada;

• esterilizar en autoclave y conservar a temperatura ambiente.

Solución de etanol al 70 % (v/v)

Mezclar 70 ml de etanol puro y 30 ml de agua desionizada estéril.

Ribonucleasa A 10 GM/ml: conservar a –20°C.

Endopeptidasa K 20 GM/ml: conservar a –20°C.



Procedimiento

Debe efectuarse en condiciones estériles. La contaminación durante la preparación

de la muestra puede evitarse empleando material desechable y soluciones de

descontaminación y evitando la formación de polvo.

• Depositar 100 GM de muestra homogénea en un tubo estéril de 1,5 ml para

microcentrífuga;

• añadir 300 µl de agua desionizada estéril y mezclar con un asa;

• añadir 500 µl de tampón a base de CTAB y mezclar con un asa;

• añadir 20 µl de proteinasa K (20 GM/ml), agitar e incubar a 65°C durante 30-90

minutos*;

• añadir 20 µl de ribonucleasa A (10 GM/ml), agitar e incubar a 65°C durante 5-10 minutos*;

• centrifugar durante 10 minutos a 16 000 g aproximadamente;

• trasladar el sobrenadante a un tubo de microcentrifugación que contenga 500 µl

de cloroformo y agitar durante 30 segundos;

• centrifugar durante 10 minutos a 16,000 g hasta que se separen las fases;

• trasladar 500 µl de la capa superior a otro tubo de microcentrifugación que

contenga 500 µl de cloroformo y agitar;

• centrifugar durante 5 minutos a 16 000 g;

• trasladar la capa superior a otro tubo de microcentrifugación;

• añadir 2 volúmenes de solución de precipitación a base de CTAB y mezclar

pipeteando;

• incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente;


• desechar el sobrenadante;

• disolver el precipitado en 350 µl NaCl (1,2 M);

• añadir 350 µl de cloroformo y agitar durante 30 segundos;

• centrifugar durante 10 minutos a 16,000 g hasta que se separen las fases;

• trasladar la capa superior a otro tubo de microcentrifugación;

• añadir 0,6 volúmenes de isopropanol y agitar;


* Estas etapas optativas se suelen incluir ahora en el método de extracción con CTAB para aumentar el rendimiento de la extracción de ADN genómico de matrices muy complejas.




• añadir 500 µl de solución de etanol al 70 % y agitar con cuidado;



• secar los sedimentos y volver a disolver el ADN en 100 µl de agua desionizada

estéril.

La solución de ADN puede conservarse en la nevera dos semanas como máximo o

en el congelador a - 20°C durante más tiempo.



Bibliografía

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Alimentos

Sesión nº 5

Electroforesis en gel de agarosa

M. Somma, M. Querci

Electroforesis en Gel de Agarosa 2


Índice

Sesión nº 5

Electroforesis en Gel de Agarosa

Introducción 3

Principios físicos de la electroforesis en gel de agarosa 3 Componentes de la electroforesis en gel de agarosa 6

Práctica 8

Bibliografía 12



Introducción

La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas

en función del tamaño, la carga eléctrica y otras propiedades físicas. El término

electroforesis describe la migración de las partículas cargadas bajo la influencia de

un campo eléctrico. «Electro» se refiere a la electricidad y «foresis», del griego

phoros, significa «trasladar». Así pues, la electroforesis en gel es una técnica

consistente en aplicar corriente eléctrica a las moléculas para que atraviesen una

placa de gel. La fuerza motriz de la electroforesis es la tensión eléctrica aplicada a

los electrodos en ambos extremos del gel. Las propiedades de una molécula

determinan la velocidad con que un campo eléctrico puede desplazarla a través de

un medio gelatinoso.

Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo, los aminoácidos, los

péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen grupos

ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas

eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga

neta, las partículas cargadas migrarán hacia el cátodo o hacia el ánodo. Así, por

ejemplo, cuando se aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos

fosfato del ADN cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo

(Westermeier, 1997).

La electroforesis en gel de agarosa es un método normalizado que se utiliza para

separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. Se trata de una técnica sencilla y

rápida que permite diferenciar fragmentos de ADN que no pueden separarse

adecuadamente con otros procedimientos. Por otra parte, el ADN puede localizarse

en el gel tiñendo con una concentración baja de bromuro de etidio, que es un agente

intercalante fluorescente que se utiliza como colorante.

En las siguientes secciones se presentan los principios físicos, los componentes

(matriz de gel, tampón, tampón de carga y marcador) y los procedimientos para

preparar la electroforesis en gel de agarosa (Sambrook et al., 1989).

Principios físicos de la electroforesis en gel de agarosa

La electroforesis en gel es una técnica que se emplea para separar los ácidos

nucleicos y las proteínas. La separación de las macromoléculas depende de dos

variables: carga y masa. Cuando una muestra biológica, como por ejemplo el ADN,

se mezcla en una solución tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan

conjuntamente. La corriente eléctrica de un electrodo repele las moléculas, al



tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de fricción del material de gel actúa

como «tamiz molecular», separando las moléculas en función de su tamaño.

Durante la electroforesis, las macromoléculas son empujadas a través de los poros,

dependiendo su tasa de migración por el campo eléctrico de los siguientes factores:

• fuerza del campo

• tamaño y forma de las moléculas

• hidrofobicidad relativa de las muestras

• fuerza iónica y temperatura del tampón en que se desplazan las moléculas.

Para tener una idea cabal del proceso de separación de las partículas cargadas en

la electroforesis en gel, conviene tener presentes las simples ecuaciones referidas a

esta técnica. Cuando se aplica tensión a los electrodos se genera un gradiente de

potencial (E), que puede expresarse con la siguiente ecuación:

E = V/d (1)

donde V, medida en voltios, es la tensión aplicada y d, la distancia en cm entre los

electrodos.

Al aplicarse el gradiente de potencial (E) se genera una fuerza (F) en una molécula

cargada, que puede expresarse con la siguiente ecuación:

F = Eq (2)

donde q corresponde a la carga en culombios que lleva la molécula. Esta es la

fuerza, medida en newtons, que empuja la molécula cargada hacia el electrodo.

Existe asimismo una resistencia de fricción que ralentiza el desplazamiento de las

moléculas cargadas. Esta fuerza de fricción es función de los siguientes factores:

• tamaño hidrodinámico de la molécula

• forma de la molécula

• tamaño de poro del medio en que tiene lugar la electroforesis

• viscosidad del tampón.

La velocidad v de una molécula cargada en un campo eléctrico depende del

gradiente de potencial, la carga y la fuerza de fricción de la molécula, y puede

expresarse con la siguiente ecuación:

v = Eq / f (3)

donde f es el coeficiente de fricción.

La movilidad electroforética (M) de un ión puede entonces determinarse dividiendo la

velocidad del ión por el gradiente de potencial:

M = v / E (4)



Además, de la ecuación (3) se infiere que la movilidad electroforética M puede

expresarse de modo equivalente como la carga de la molécula (q) dividida por el

coeficiente de fricción (f):

M = q / f (5)

Cuando se aplica una diferencia de potencial, las moléculas que poseen distintas

cargas globales comenzarán a separarse debido a sus diferentes movilidades

electroforéticas. La movilidad electroforética es un parámetro significativo y

característico de las moléculas o partículas cargadas y depende del valor de pK del

grupo cargado y del tamaño de la molécula o partícula. Incluso las moléculas con

cargas semejantes empezarán a separarse si sus tamaños moleculares son distintos

por cuanto estarán sometidas a fuerzas de fricción diferentes. El ADN bicatenario

lineal migra por las matrices de gel a velocidades inversamente proporcionales al

log10 del número de pares de bases. Las moléculas más grandes migran más

despacio debido a la mayor resistencia de fricción y a la menor eficacia del

desplazamiento a través de los poros del gel.

La corriente que atraviesa la solución entre los electrodos es conducida

principalmente por los iones del tampón, si bien una pequeña proporción lo es por

los iones de la muestra. La relación entre intensidad I, tensión V y resistencia R se

expresa según la ley de Ohm:

R = V / I (6)

Esta ecuación muestra que, para una resistencia R dada, es posible acelerar la

separación electroforética aumentando la tensión V aplicada, lo cual dará lugar al

correspondiente incremento de la intensidad de la corriente I. La distancia migrada

será proporcional a la intensidad y al tiempo. Con todo, el aumento de tensión (V) y

el incremento correspondiente de intensidad e (I) ocasionaría uno de los principales

problemas que plantea la mayor parte de las formas de electroforesis, a saber, la

generación de calor. Este fenómeno queda ilustrado con la siguiente ecuación, en la

que la potencia (W, medida en vatios) generada durante la electroforesis equivale al

producto de la resistencia multiplicado por el cuadrado de la intensidad:

W = I2R (7)

Dado que la mayor parte de la potencia producida en el proceso electroforético se

disipa en forma de calor, pueden producirse los siguientes efectos perjudiciales:

• aumento de la tasa de difusión de los iones de la muestra y del tampón, con el

consiguiente ensanchamiento de las muestras separadas

• formación de corrientes de convección, con la consiguiente mezcla de las

muestras separadas



• inestabilidad térmica de las muestras, que son bastante sensibles al calor (por

ejemplo, desnaturalización del ADN)

• disminución de la viscosidad del tampón y, por ende, reducción de la resistencia

del medio.

Componentes de la electroforesis en gel de agarosa

Agarosa

La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con

un peso molecular medio de ~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad

básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6-

anhidrogalactosa. La agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla

con facilidad. Los geles de agarosa poseen grandes «poros» y se emplean

fundamentalmente para separar las moléculas grandes con un peso molecular de

más de 200 kDa.

Los geles de agarosa permiten una electroforesis rápida, pero con una resolución

limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser

difusas y a esparcirse. Ello obedece al tamaño de los poros y no puede controlarse.

Los geles de agarosa se obtienen por suspensión de agarosa seca en polvo en un

tampón acuoso, tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde

y se convierte en una solución transparente. A continuación, se vierte esta solución

en un molde para gel y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta que se forma

un gel rígido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene

determinada por su concentración.

Tampón de electroforesis

La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y la fuerza

iónica del tampón de electroforesis. En ausencia de iones, la conductancia eléctrica

es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de

elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una

importante cantidad de calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se

desnaturaliza.

Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo

bicatenario. Contienen EDTA (pH 8,0) y tris-acetato (TAE), tris-borato (TBE) o tris-

fosfato (TPE) a una concentración de aproximadamente 50 mM (pH 7,5 – 7,8). Los

tampones de electroforesis suelen prepararse en forma de soluciones concentradas



y se conservan a temperatura ambiente. El TBE se utilizaba inicialmente a una

concentración de trabajo de 1x en el caso de la electroforesis en gel de agarosa. No

obstante, una solución de trabajo de 0,5x proporciona un poder más que suficiente y

en la actualidad prácticamente todas las electroforesis en gel de agarosa se

practican utilizando esta concentración.

Concentración de agarosa

Un fragmento de ADN de un tamaño determinado migra a diferentes velocidades a

través de los geles según la concentración de agarosa. En función de la

concentración de agarosa o tampón, se pueden separar segmentos de ADN que

contengan de 20 a 50 000 pb. En los geles horizontales, la agarosa se emplea por

lo general en concentraciones comprendidas entre un 0,7 % y un 3 % (véase el

cuadro 1).

Cuadro 1. Concentración recomendada de gel de agarosa para separar moléculas de

ADN lineales.

% de agarosa Gamas de tamaños de ADN (pb)

0,75 10 000 – 15 000

1,0 500 – 10 000

1,25 300 – 5 000

1,5 200 – 4 000

2,0 100 – 2 500

2,5 50 – 1 000

ADN marcador

Para una tensión, un gel de agarosa y unas concentraciones de tampón

determinadas, la distancia de migración depende del peso molecular del material

inicial. Así pues, debe cargarse un ADN marcador de tamaño conocido en las

ranuras situadas en los extremos derecho e izquierdo del gel. Generalmente un

marcador contiene un número determinado de segmentos de ADN conocidos, lo cual

facilita la labor de determinar el tamaño de los ADN desconocidos en caso de que se

produjese alguna distorsión sistemática del gel durante la electroforesis.



Tampón de carga

Las muestras de ADN que deben cargarse en el gel de agarosa se mezclan en

primer lugar con un tampón de carga que por lo general contiene agua, sacarosa y

un colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de

bromocresol, etc.). La cantidad máxima de ADN que puede cargarse depende del

número de fragmentos. La cantidad mínima de ADN que puede detectarse mediante

fotografía de los geles teñidos con bromuro de etidio es de aproximadamente 2 ng

en una banda de 0,5 cm de ancho. Si una banda de este ancho contiene más de

500 ng de ADN, la ranura estará sobrecargada y se producirá emborronamiento. El

tampón de carga se emplea con tres fines:

• aumentar la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan

uniformemente en el pocillo

• añadir color a la muestra, simplificando de este modo el proceso de carga

• incorporar un colorante a la muestra que, en un campo eléctrico, se desplace

hacia el ánodo a una velocidad previsible.

Práctica

Advertencia: El bromuro de etidio es una sustancia mutágena/carcinógena potente y moderadamente tóxica. Se deberán llevar siempre guantes cuando se manipulen soluciones y geles que contengan bromuro de etidio.

Instrumental

• Unidad de electroforesis horizontal con alimentación eléctrica

• Horno microondas o incubador-agitador

• Micropipetas

• Tubos de reacción de 1,5 ml

• Balanza que pueda pesar 0,01 g

• Espátulas

• Soporte para tubos de reacción

• Material de vidrio

• Transiluminador (radiación UV, 312 nm)

• Instrumentos para documentación (por ejemplo, cámara Polaroid o magnetoscopio).



Reactivos

• Agarosa adecuada para electroforesis de ADN

• Tris[hidroximetil] aminometano (Tris) CAS 77-68-1

• Ácido bórico

• Na2EDTA CAS 6381-92-6

• Bromuro de etidio CAS 1239-45-8

• Sacarosa

• Cianol de xileno FF CAS 2650-17-1

• ADN marcadores:

Lambda ADN EcoRI/HindIII digerido (u otros marcadores adecuados

similares)

Escalera de ADN de 100 pb.

Tampón de TBE 10x (1 litro)

Tris [hidroximetil] aminometano (Tris) 54,0 g

Ácido bórico 27,5 g

Na2EDTA 7,44 g

• Mezclar el reactivo con agua desionizada para obtener una solución de un litro con

un pH de 8,3.

• Conservar a temperatura ambiente.

Tampón de carga 6x (10 ml)

Cianol de xileno FF 0,025 g

Sacarosa 4 g

• Añadir sacarosa y cianol de xileno FF al agua desionizada para obtener 10 ml de

solución.

• Mezclar la solución, pasar por autoclave y conservar a 4°C.



Procedimiento

• Sellar los bordes de un molde de plástico limpio y seco con cinta adhesiva o de

otro modo. Colocar el peine adecuado de modo que se formen pocillos

completos al añadir la solución de agarosa.

• Diluir tampón de TBE 10x y preparar la cantidad adecuada de tampón de TBE

0,5x para llenar la cubeta de electroforesis y preparar el gel.

• Pesar la agarosa en polvo según lo indicado en el cuadro 2 y añadirla a una

cantidad apropiada de tampón de TBE 0,5x en un matraz de Erlenmeyer con

tapa suelta (normalmente 150 ml de solución de gel para un molde de 15 x 15

cm y 100 ml de gel para un molde de 15 x 10 cm).

Cuadro 2. Concentraciones de gel de agarosa empleadas durante el curso.

GM

O3

GM

O4

ZEIN

3

ZEIN

4 p3

5S-c

f3

p35S

-cr4

H

A-n

os11

8-f

HA

-nos

118-

r C

RYI

A3

CR

YIA

4 G

M07

GM

08

GM

3

GM

4 A

DN

genó

mic

o

0,8 - 1% X

1,5% X X

2,0% X X X X X

• Calentar la mezcla en un horno microondas o al baño maría hasta que se

disuelva la agarosa (comprobar el volumen de la solución tras haberla

calentado).

• Enfriar la mezcla a 50 - 60°C y añadir bromuro de etidio (de una solución madre

de 10 mg/ml) hasta lograr una concentración final de 0,2 µg/ml y mezclar bien.

• Verter la solución en el molde y dejar que se forme el gel. La cantidad de gel

empleado debe corresponder a un grosor de aproximadamente 3 - 5 mm.

• Una vez completamente formado el gel, retirar cuidadosamente el peine y la

cinta adhesiva y colocar el gel en la cubeta de electroforesis.

• Añadir tampón de TBE 0,5x a la unidad de electroforesis de modo que el gel

quede cubierto por una capa de aproximadamente 2 - 5 mm.



Preparar muestras y marcador para ADN genómico del siguiente modo:

Muestra Marcador

Agua 3 µl Agua 6 µl Tampón de carga 2 µl Tampón de carga 2 µl Muestra 5 µl λ ADN EcoR I / Hind III 2 µl 10 µl 10 µl

Preparar muestras y marcador para productos de PCR del siguiente modo:

Muestra Marcador

Tampón de carga 2 µl Escalera de ADN de 100 pb15 µl Muestra 8 µl

10 µl

• Cargar 10 µl de cada muestra en pocillos consecutivos y el ADN marcador

adecuado en las calles primera y última.

• Cerrar la tapa de la cubeta del gel y conectar los cables eléctricos para que el

ADN migre hacia el ánodo y aplicar una tensión de 5 - 10 V/cm.

• Hacer la electroforesis hasta que el cianol de xileno haya recorrido la distancia

adecuada a través del gel (~ 40 - 60 minutos).

• Desconectar la corriente y retirar los cables y la tapa de la cubeta. Introducir el

gel en un transiluminador UV y fotografiarlo.

• Tirar el gel en el recipiente para residuos sólidos destinado al bromuro de etidio

previsto a tal fin.



Bibliografía

Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989). «Gel electroforesis of DNA» en:

Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a Laboratory

Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,

NY, USA, capítulo 6.

Westermeier, R. (1997). Electroforesis in Practice: a Guide to Methods and

Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.



ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО


Alimentos

Sesión nº 6

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

M. Somma, M. Querci

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 2


Índice

Sesión nº 6

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Introducción 3

Componentes, estructura y replicación del ADN 3 Principios de la PCR 9 Instrumentación y componentes para la PCR 12 Diseño de cebadores para la PCR 18 PCR especializada 22 La PCR en la práctica 24

Bibliografía 32



Introducción

La invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por K. Mullis y sus

colaboradores en 1985 ha revolucionado la biología molecular y la medicina

molecular (Saiki et al., 1985). La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica

in vitro utilizada para amplificar enzimáticamente una región determinada de ADN

situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Mientras que antes

solo podían obtenerse cantidades mínimas de un gen específico, ahora incluso un

único ejemplar de un gen puede amplificarse con la PCR hasta un millón de

ejemplares en tan solo unas pocas horas.

Las técnicas de PCR se han hecho indispensables para muchos procedimientos

comunes, como la clonación de fragmentos específicos de ADN, la detección e

identificación de genes para diagnóstico y medicina legal, y en la investigación de

modelos de expresión de los genes. Más recientemente, la PCR ha permitido la

investigación de nuevos campos, como el control de la autenticidad de los alimentos,

la presencia de ADN modificado genéticamente y la contaminación microbiológica.

Para comprender los principios de la PCR y sus aplicaciones, debe atenderse en

primer lugar a la naturaleza de la molécula del ADN, por lo que en la sección

siguiente se describen la estructura y la replicación del ADN.

Componentes, estructura y replicación del ADN

Componentes. Una molécula de ADN consta de dos cadenas en hélice,

complementarias y antiparalelas, formadas por unidades alternantes de ácido

fosfórico y desoxirribosa, con uniones transversales de bases púricas y pirimidínicas,

lo que constituye una estructura helicoidal dextrógira, y lleva la información genética

codificada en la secuencia de las bases. En las células eucarióticas, la mayor parte

del ADN se encuentra en el núcleo y se conoce como ADN cromosómico. Está

separado del resto de la célula (citoplasma) por una membrana de dos capas

(membrana nuclear). Por otra parte, puede haber ADN extracromosómico en las

mitocondrias y cloroplastos.

Los elementos estructurales del ADN, llamados nucleótidos, son los siguientes:

• dATP, desoxiadenosina-trifosfato;

• dGTP, desoxiguanosina-trifosfato;

• dTTP, desoxitimidina-trifosfato;

• dCTP, desoxicitidina-trifosfato.



Para mayor facilidad, estos cuatro nucleótidos se denominan dNTP (por las siglas en

inglés de desoxinucleósido-trifosfato). Un nucleótido está formado por tres grandes

partes: una base púrica (adenina, A, o guanina, G), o una base pirimidínica (citosina,

C, o timina, T), un azúcar pentosa (desoxirribosa) y un grupo trifosfato. Como se

muestra en la figura 1, una base púrica o pirimidínica está unida a un anillo de

pentosa por un enlace N-glucosídico, y un grupo fosfato está unido al átomo de

carbono 5' del azúcar por un enlace diéster. En el ácido ribonucleico, ARN, la timina

está sustituida por el uracilo (U) y la molécula de desoxirribosa por la ribosa.

Figura 1. Componentes de los nucleótidos (imagen: Andy Vierstraete, 1999).

Estructura. La figura 2 indica cómo forman los nucleótidos una cadena de ADN. El

ADN se forma uniendo los nucleótidos entre el grupo fosfato de un nucleótido (que

se sitúa en el átomo de C nº 5 de la molécula de azúcar) y el hidroxilo del átomo de

C nº 3 de la molécula de azúcar del nucleótido anterior. Para efectuar este enlace,

se separa un grupo difosfato, con liberación de energía. Los nuevos nucleótidos se

añaden siempre en el extremo 3’ de la cadena. Como se indica en la figura 3, el

ADN es bicatenario (excepto en algunos virus) y las dos cadenas o hebras se

aparean entre sí de forma muy precisa. Cada base de una cadena se aparea con un

solo tipo de base de la cadena contraria, formando un par de bases (pb): A siempre

Nucleótido azúcar + fosfatoDesoxiadenosina - trifosfato = dATP

Desoxiguanosina - trifosfato = dGTP

Desoxicitidina - trifosfato : dCTP

Desoxitimidina - trifosfato = dTTP



se une con T mediante dos puentes de hidrógeno, y C siempre se une con G

mediante tres puentes de hidrógeno. De esta manera, las dos cadenas son

mutuamente complementarias y una de las cadenas puede servir de ADN molde

para formar la otra.

Figura 2. Formación de una cadena de ADN a partir de los distintos nucleótidos

(imagen: Andy Vierstraete, 1999).

Las bases forman un núcleo hidrófobo dentro de la doble hélice. Los azúcares y los

grupos fosfato (en su forma aniónica) constituyen la capa hidrófila exterior de la

molécula. En condiciones fisiológicas, la hélice de ADN bicatenario es más estable

que una hélice de ADN monocatenario.

Extremo 5’

Extremo 3’



Figura 3. Estructura del ADN de una célula (imagen: Andy Vierstraete, 1999).

Genoma= total de todos los cromosomas

Fragmento de cromosoma

Gen

Pares de bases de los nucleótidos

Cromosoma

Esqueleto de azúcar y fosfato

Puente de hidrógeno Base

Mitocondria Membrana plasmática Retículo endoplásmico Aparato de Golgi Citoesqueleto filamentoso Núcleo Lisosoma



Replicación. El ADN contiene toda la información genética que define la estructura

y la función de un organismo. Hay tres procesos diferentes encargados de la

transmisión de la información genética:

• replicación;

• transcripción;

• traducción.

Durante la replicación, un ácido nucleico bicatenario se duplica para formar copias

idénticas. Con este proceso se perpetúa la información genética. Durante la

transcripción, un segmento de ADN que constituye un gen se lee y se transcribe en

una secuencia monocatenaria de ARN. El ARN pasa del núcleo al citoplasma.

Finalmente, durante la traducción, la secuencia de ARN se traduce a una secuencia

de aminoácidos que forman una proteína (Alberts et al., 1983).

La replicación del ADN es el proceso en que se basa la amplificación por PCR, y se

va a describir en detalle.

Durante la replicación, la molécula de ADN se desenrolla y cada cadena se convierte

en un ADN molde para la síntesis de una cadena complementaria nueva. Cada

molécula hija, consistente en una cadena nueva y una vieja de ADN, es una copia

exacta de la molécula madre.

Figura 4. La horquilla de replicación.

Hebra original Hebra nueva Cebador de ARN

Hebra adelantada

Las flechas indican la dirección de la replicación del ADN

Fragmento de Okazaki

Hebra retrasada



Para desenrollar la doble hélice y sintetizar una nueva hebra de ADN hacen falta

varias enzimas. La topoisomerasa y la helicasa se encargan de desenrollar el ADN

rompiendo la estructura superenrollada y cortando una sola hebra de ADN. A

continuación, una primasa (parte de un agregado de proteínas denominado

primosoma) une un pequeño cebador de ARN al ADN monocatenario, para actuar

como extremo 3'OH a partir del cual la ADN polimerasa inicia la síntesis. Este

cebador de ARN es eliminado finalmente por la ribonucleasa H y el hueco se rellena

mediante la ADN polimerasa I. En esta fase, la ADN polimerasa avanza a lo largo de

una molécula monocatenaria de ADN (una hebra sencilla), recogiendo dNTP libres

para unirlos mediante puentes de hidrógeno a los dNTP complementarios situados

en dicha hebra sencilla de ADN (A con T y G con C), y mediante un enlace

fosfodiéster covalente al nucleótido anterior de la propia hebra nueva. La energía

conservada en el trifosfato se utiliza para unir covalentemente cada nuevo nucleótido

a la segunda hebra en crecimiento. Hay diferentes formas de ADN polimerasa, pero

es la ADN polimerasa III la que se encarga de la síntesis progresiva de nuevas

hebras de ADN. La ADN polimerasa actúa solo desde el extremo 5’ hacia el 3’.

Como una de las hebras de la doble hélice tiene el sentido 5’-3’ y la otra el 3’-5’, la

ADN polimerasa sintetiza una segunda copia de la hebra 5’-3’ (hebra retrasada) a

tramos (fragmentos de Okazaki) (Ogawa y Okazaki, 1980). La síntesis de las nuevas

copias de la hebra 5’-3’ se muestra en la figura 4. La otra hebra, la hebra

adelantada, puede avanzar directamente con la síntesis, desde el extremo 5' al 3',

según se va desenrollando la hélice. La ADN polimerasa no puede empezar la

síntesis ex novo a partir de una hebra sencilla desnuda, sino que necesita la

presencia de un cebador con un grupo 3’OH libre al que pueda unir un dNTP.

Una ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre un extremo 3’OH y

un 5’fosfato, libres y adyacentes. Así puede rellenarse el hueco que queda cuando

se elimina el cebador de ARN. Ha de señalarse la importancia de la presencia de

proteínas de unión a ADN monocatenario para mantener la estabilidad de la

horquilla de replicación. El ADN monocatenario es muy lábil, o inestable, y estas

proteínas se unen a él mientras es monocatenario, protegiéndolo así de la

degradación.



Principios de la PCR

La PCR se basa en el mecanismo de la replicación in vivo del ADN: el ADN

bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a

enrollar. Esta técnica consiste en ciclos repetitivos de:

• desnaturalización del ADN por fusión a temperatura elevada, a fin de convertir el

ADN bicatenario en ADN monocatenario;

• unión (anillamiento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al ADN

diana;

• extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos a partir de los

cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones

Mg2+.

Los oligonucleótidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas,

que son diferentes entre sí y complementarias de los sitios de reconocimiento que

flanquean el segmento de ADN diana que debe amplificarse. Las fases de

desnaturalización del ADN molde, anillamiento del cebador y extensión del cebador

constituyen un «ciclo» del método de amplificación por PCR. La figura 5 ilustra las

tres fases principales del proceso de amplificación por PCR.

Figura 5. Fases de la amplificación por PCR (imagen: Andy Vierstraete, 1999).

30-40 ciclos de 3 fases

Fase 1: desnaturalización

Fase 2: unión

Cebadores directos e inversos

Fase 3: extensión

Sólo dNTPs



Tras cada ciclo, las hebras de ADN recién sintetizadas pueden servir de ADN molde

para el ciclo siguiente. Como se indica en la figura 6, el producto principal de esta

reacción exponencial es un segmento de ADN bicatenario cuyos extremos vienen

definidos por los extremos 5’ de los oligonucleótidos cebadores y cuya longitud viene

dada por la distancia entre los cebadores. Los productos de una primera ronda de

amplificación efectiva son moléculas de ADN de diferentes tamaños, cuyas

longitudes pueden superar la distancia entre los sitios de unión de los dos

cebadores. En la segunda ronda, estas moléculas generan hebras de ADN de

longitud definida que se acumulan de forma exponencial en rondas posteriores de

amplificación y constituyen los productos dominantes de la reacción. Así, la

amplificación, que es el número final de ejemplares de la secuencia diana, se

expresa con la siguiente ecuación:

(2n-2n)x (1)

donde n es el número de ciclos, 2n es el número de moléculas del primer producto

obtenidas tras el primer ciclo y de los segundos productos obtenidos tras el segundo

ciclo con longitud indefinida, x es el número de ejemplares del ADN molde original.

Teóricamente, al cabo de 20 ciclos de PCR habrá una amplificación de 220 veces,

suponiendo que cada ciclo tiene un rendimiento del 100 %. El rendimiento de una

PCR varía de un ADN molde a otra y depende del grado de optimización que se

haya conseguido.

En los párrafos siguientes se encuentra una descripción pormenorizada de las tres

fases de la amplificación por PCR (desnaturalización del ADN molde, anillamiento

del cebador y extensión) (Sambrook et al., 1989).

gen deseado

ADN plantilla

1er ciclo

2° ciclo

3er ciclo

4° ciclo

35° ciclo

68000 millones de ejemplares 4 8 16 32

ejemplares ejemplares ejemplares ejemplares

Figura 6. La amplificación exponencial del ADN mediante PCR.



Desnaturalización del ADN molde

Durante la desnaturalización, la hebra doble se funde, abriéndose para dar ADN

monocatenario, y se detienen todas las reacciones enzimáticas (es decir, la

extensión de un ciclo anterior). Las dos cadenas complementarias se separan por el

aumento de la temperatura, lo que se denomina desnaturalización. Para obtener la

desnaturalización del ADN, la temperatura suele aumentarse hasta unos 93 - 96°C.

De esta manera se rompen los fuertes puentes de H y aumenta el número de bases

desapareadas. La reacción se completa cuando todo el ADN bicatenario se

convierte en monocatenario. La temperatura a la que la mitad del ADN bicatenario

ha pasado a monocatenario se denomina temperatura de fusión, Tf. El proceso de

desnaturalización depende del tipo de disolvente, de la concentración salina y del pH

utilizado; por ejemplo, la temperatura de fusión desciende al bajar la concentración

salina, al subir el pH y en presencia de disolventes orgánicos como el formaldehído.

El valor de la Tf también se puede ver afectado por la concentración de G/C y T/A.

La Tf de una estructura de ADN que contiene una elevada proporción de G/C es más

alta que la de un ADN más rico en T/A. Por ejemplo, Serratia marcescens tiene

aproximadamente un 60 % de G/C y una Tf de unos 94 °C, mientras que

Pneumococcus tiene aproximadamente un 40 % de G/C y una Tf de unos 85 °C.

Anillamiento del cebador

La unión o rehibridación de las hebras de ADN se efectúa a una temperatura inferior

(generalmente, entre 55 y 65 ºC). Una vez se ha reducido la temperatura, las dos

hebras complementarias de ADN monocatenario tienden a formar de nuevo una

molécula de ADN bicatenario. En esta fase, los cebadores se mueven libremente y

es continua la formación y la ruptura de puentes de hidrógeno entre el cebador

monocatenario y el ADN molde también monocatenaria. Los enlaces más estables

duran un poco más (los cebadores que se corresponden exactamente con el ADN

molde) y es en ese pequeño fragmento de ADN bicatenario (ADN molde con

cebador) donde puede fijarse la polimerasa y empezar a copiar el ADN molde.

Cuando se han introducido unas cuantas bases, el enlace iónico entre el ADN molde

y el cebador es tan fuerte que ya no se rompe.

Extensión del cebador

En esta fase, los cebadores se extienden a lo largo de la secuencia diana utilizando

una ADN polimerasa termoestable (frecuentemente se trata de la ADN Taq

polimerasa) en presencia de dNTP, lo que produce la duplicación del material diana



inicial. La temperatura de trabajo ideal para la ADN polimerasa Taq es de 72 ºC.

Cuando los cebadores se han extendido unas cuantas bases, ejercen una atracción

iónica más fuerte sobre el ADN molde, lo que reduce la probabilidad de que se

invierta el proceso. Los cebadores que no se corresponden exactamente se vuelven

a soltar (debido a la temperatura elevada) y no dan lugar a la extensión del

fragmento. Las bases (complementarias del ADN molde) se unen al cebador en el

extremo 3’ (la polimerasa añade dNTP desde 5’ hacia 3’, leyendo el ADN molde

desde 3’ hacia 5’). La duración del tiempo necesario para las fases de extensión del

cebador puede aumentar si es larga la región de ADN que se va a amplificar; sin

embargo, en la mayoría de experimentos de PCR es suficiente un tiempo de 1 min

para conseguir una extensión completa.

Instrumentación y componentes para la PCR

Instrumentos

El proceso de la PCR ha podido automatizarse gracias a dos importantes avances:

a) el uso de ADN polimerasas termoestables, que resisten a la inactivación a

temperaturas elevadas; así pues, es posible que una alícuota inicial de

polimerasa se mantenga a lo largo de muchos ciclos del protocolo;

b) el desarrollo de baños termostatizados que pueden subir y bajar rápidamente su

temperatura de forma automatizada y programada; se denominan

termocicladores o máquinas de PCR.

Se utilizan diversos diseños de termocicladores como, por ejemplo, calentamiento y

refrigeración por fluidos, calentamiento por resistencia eléctrica y refrigeración por

fluidos, y calentamiento por resistencia eléctrica y refrigeración por semiconductores.

En la figura 7 se muestra un perfil típico de los ciclos de temperatura de un protocolo

de tres fases.



Figura 7. Perfil de ciclos de temperatura de la PCR.

Para que la PCR tenga éxito son fundamentales los parámetros ya mencionados de

los ciclos térmicos, en sus fases de desnaturalización, anillamiento del cebador y

extensión del cebador, así como los componentes utilizados y el número de ciclos

descritos en los párrafos siguientes.

ADN diana

En principio puede efectuarse la amplificación por PCR si está presente al menos un

ejemplar intacto del gen diana. Si el número de ejemplares del gen diana es mayor,

también lo será la probabilidad de que tenga éxito la amplificación del ADN.

Cualquier alteración, como una muesca en el ADN diana, puede bloquear la

amplificación por PCR. El tamaño de la secuencia diana puede variar entre < 0,1 y

unas cuantas kilobases. La cantidad total de ADN utilizada normalmente para la

PCR está entre 0,05 y 1,0 µg, lo que permite la detección de ejemplares solos de la

secuencia diana. Aunque las muestras no tienen que estar muy purificadas, sí es

necesario eliminar algunos contaminantes, como la heparina, el formol, los agentes

quelantes de Mg2+ o los detergentes, para evitar que inhiban el proceso de

amplificación.

Cebadores

Generalmente se utilizan cebadores de 16 a 30 nucleótidos de longitud, lo que

permite que la temperatura de anillamiento sea razonablemente elevada. Los

cebadores no deben tener tramos de secuencias con una polibase (p. ej., poli-dG) ni

Fase 1 : Desnaturalización de la ADN

Un « ciclo »

Minutos

Tem

pera

tura

(°C

)

Fase 3 : Extensión del cebador

Fase 2 : Hibridación del cebador



motivos repetidos, ya que podrían hibridarse de forma inadecuada con el ADN

molde. Deben evitarse las secuencias repetidas invertidas, a fin de prevenir la

formación de estructuras secundarias del cebador, que impedirían su hibridación con

el ADN molde. También deben evitarse las secuencias complementarias de otros

cebadores utilizados en la PCR, para prevenir la hibridación entre cebadores o la

formación de dímeros de cebadores (esto es especialmente importante en relación

con el extremo 3’ del cebador). Siempre que sea posible, conviene que el extremo 3’

del cebador tenga gran proporción de bases G y C para aumentar la hibridación del

extremo que se quiere extender. La distancia entre cebadores debe ser inferior a 10

kb en longitud. Normalmente se observa una importante reducción del rendimiento

cuando los cebadores se encuentran a más de unos 3 kb de distancia entre sí. La

concentración usual de oligonucleótidos para la PCR es de 1 µM. Esto resulta

suficiente para al menos 30 ciclos de amplificación. La presencia de oligonucleótidos

a una concentración superior puede provocar la amplificación no deseada de

secuencias distintas de la diana. Por el contrario, la PCR no es eficaz si la

concentración del cebador es limitante.

ADN polimerasa

El método original de PCR utilizaba el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de

E. coli (Saiki et al., 1985). Sin embargo, esta enzima se desnaturaliza a

temperaturas inferiores a las necesarias para desnaturalizar la mayoría de ADN

molde bicatenario. Así pues, en los primeros experimentos era necesario añadir más

enzima a la reacción tras cada ciclo. Por otra parte, había que trasladar las muestras

desde un baño a una temperatura hasta otro a otra temperatura para permitir el

desarrollo de las distintas fases de desnaturalización, anillamiento y polimerización.

Evidentemente, el uso de una ADN polimerasa termorresistente ha facilitado el

proceso porque ha dejado de ser necesario añadir enzimas tras cada fase de

desnaturalización. En principio, las ADN polimerasas solo pueden incorporar

nucleótidos al extremo 3’ de un polinucleótido. La primera ADN polimerasa

termoestable utilizada fue la ADN polimerasa Taq, aislada de la bacteria Thermus

aquaticus (Saiki et al., 1988). Aunque esta enzima es probablemente la más utilizada

a efectos de la PCR, en el comercio pueden encontrarse algunas otras ADN

polimerasas. En el cuadro 1 se recogen las propiedades de algunas ADN

polimerasas termoestables que se utilizan actualmente para la PCR (Newton y

Graham, 1994).



Cuadro 1. Características de algunas ADN polimerasas utilizadas para la PCR.

Taq/ AmpliTaq Vent Deep-

Vent Pfu Tth UITma

Fuente Thermus aquaticus

Thermo-coccus litoralis

Pyrococcus GB-D

Pyrococcus furiosus

Thermus thermophilus

Thermotoga maritima

Aplicación

Taq: natural AmpliTaq: para ingeniería genética

Para ingeniería genética


Natural Para ingeniería genética


T½ de actividad a 95 ºC (min) 40 1380 400 >120 20 > 50a Actividad exonucleásica de 5’ a 3’

Sí

No

No

No

Sí

No

Actividad exonucleásica de 3’ a 5’

No

Sí

Sí

Sí

No

Sí

Procesividad 50-60 ? 7 ? 30-40 ? Velocidad de extensión (nt/s)

75 ? >80 60 >33 ?

Extremos de ADN resultantes

3’A > 95 % romos

> 95 % romos ? 3’A Romos

PM en kDa 94 ? ? 92 94 70

ADN polimerasa Taq/AmpliTaq. Como ya se ha indicado, esta enzima se aisló de

la bacteria Thermus aquaticus que vive en una fuente caliente del parque nacional

de Yellowstone, de EE.UU., a temperaturas próximas a los 85 ºC. La temperatura

óptima de funcionamiento de esta enzima es de 70 a 80 ºC, a la que la bacteria

sintetiza ADN a la velocidad de 35 – 100 nucleótidos/segundo. Se conoce como

procesividad el número medio de nucleótidos que incorpora una enzima al ADN

antes de separarse del ADN molde. La ADN polimerasa AmpliTaq es un enzima

modificada genéticamente expresada por E. coli. Como AmpliTaq es recombinante,

su pureza y reproducibilidad son superiores a las del tipo silvestre. Sin embargo, es

posible que durante la amplificación del ADN se produzca contaminación con

algunas secuencias homólogas de E. coli. En tal caso, se recomienda el uso de una

ADN polimerasa que no se haya expresado con E. coli como organismo hospedador.

Tanto la ADN polimerasa Taq como la AmpliTaq poseen actividad exonucleásica de

5’ a 3’, con lo que eliminan nucleótidos por delante de la cadena en crecimiento.



ADN polimerasas Vent, DeepVent, Pfu y UITma. Estas enzimas tienen actividad

exonucleásica de 3’ a 5’, que les permite eliminar los residuos mal apareados hasta

que se forme un extremo con bases correctamente unidas. Sin embargo, la actividad

exonucleásica de 3’ a 5’ puede provocar la degradación de los cebadores. Por tanto,

la enzima solo debería añadirse una vez iniciada la reacción, o bien habría que

utilizar cebadores modificados químicamente.

ADN polimerasa AmpliTaqGold. Esta enzima consiste en una ADN polimerasa

AmpliTaq, inactiva a temperatura ambiente, y que solo puede activarse durante un

periodo de incubación a 94 ºC. En este caso, el programa del termociclador debe

incluir un tiempo de pre-incubación a la temperatura de 92 – 95 ºC. En caso de PCR

con liberación gradual es posible suprimir el tiempo de pre-incubación, pero deben

efectuarse al menos 10 ciclos más que con la PCR clásica.

Tampones de reacción y MgCl2 en las PCR

Además de los reactivos que participan directamente en la reacción, la PCR necesita

un tampón adecuado, cuya composición depende del tipo y de las características de

la enzima utilizada. La mayoría de los proveedores proporcionan normalmente un

tampón 10x para utilizarlo con la enzima respectiva. El tampón de reacción más

común utilizado con la ADN polimerasa Taq/AmpliTaq contiene:

• Tris 10 mM, pH 8,3

• KCl 50 mM

• MgCl2 1,5-2,5 mM.

En la PCR es fundamental la presencia de cationes divalentes. La concentración de

MgCl2 en la mezcla final de reacción suele estar entre 0,5 y 5,0 mM, y la

concentración óptima se determina empíricamente (Innis y Gelfand, 1990).

Los iones Mg2+:

• forman un complejo soluble con los dNTP, lo cual es fundamental para la

incorporación de estos;

• estimulan la actividad polimerásica;

• aumentan la Tf de la interacción cebador / ADN molde (con lo que estabilizan la

interacción entre las dos cadenas).



Generalmente, una concentración baja de Mg2+ provoca un rendimiento bajo (o

incluso nulo), mientras que una concentración elevada de Mg2+ hace que se

acumulen productos inespecíficos (errores de cebado). Es importante evitar que en

la solución de ADN molde haya una concentración elevada de agentes quelantes,

como el EDTA, o de grupos iónicos con carga negativa, como el fosfato. En la

bibliografía actual se encuentran discusiones sobre diversos tampones y

suplementos de la PCR, como el DMSO, el PEG 6000, la formamida, el glicerol, la

espermidina y los detergentes no iónicos, utilizados para aumentar la especificidad o

el rendimiento de la reacción (Roux, 1995). Efectivamente, algunas ADN

polimerasas alcanzan su nivel óptimo de actividad solo en presencia de tales

suplementos (Rolfs et al., 1992).

Desoxirribonucleósido-trifosfatos

Para la síntesis de ADN hacen falta desoxirribonucleósido-trifosfatos libres (dNTP).

La concentración de cada uno de los dNTP para la PCR debe estar entre 20 y

200 µM, y los cuatro dNTP deben utilizarse a concentraciones equivalentes para

minimizar los errores de incorporación (Innis et al., 1988). Hay varios fabricantes que

suministran dNTP de elevada pureza, bien como soluciones madre de cada uno de

los dNTP o bien como mezcla de los cuatro dNTP. Las soluciones madre de dNTP

(generalmente 100 mM) se deben ajustar a un pH de 7,0-7,5 con Na OH 1 M para

garantizar que el pH de la reacción final no baja de 7,1 (Sambrook et al., 1989); sin

embargo, ahora se suministran muchas soluciones madre de dNTP con el pH ya

ajustado.

Número de ciclos y efecto de meseta

El número de ciclos de amplificación necesarios para producir una banda visible en

un gel depende mucho de la concentración inicial del ADN diana. A fin de amplificar

50 moléculas diana se recomienda hacer entre 40 y 45 ciclos, mientras que para

amplificar 3x105 moléculas hasta la misma concentración es suficiente con entre 20 y

30 ciclos (Innis y Gelfand, 1990). Esta falta de proporcionalidad se debe al efecto

denominado de meseta, que es la atenuación de la velocidad exponencial de

acumulación del producto en las últimas etapas de una PCR, cuando el producto

alcanza la concentración de 0,3-1,0 nM. Puede deberse a una degradación de los



reactivos (dNTP, enzima), agotamiento de los reactivos (cebadores o dNTP: lo

primero con productos cortos y lo segundo con productos largos), inhibición por el

producto final (formación de pirofosfato), competencia por los reactivos por parte de

productos inespecíficos, competencia por la unión con el cebador mediante nueva

hibridación del producto concentrado (10 nM) (Innis y Gelfand, 1990). Si no se

obtiene el producto deseado tras 30 ciclos, debe tomarse una pequeña muestra (1

µl) del producto amplificado, la cual se mezclará y volverá a amplificar durante 20 o

30 ciclos en una nueva mezcla de reacción, en lugar de prolongar la tanda haciendo

más ciclos. En algunos casos en que es limitante la concentración del ADN molde,

esta nueva amplificación puede proporcionar un buen producto, mientras que la

extensión de los ciclos a más de 40 no lo hace.

Diseño de cebadores para la PCR

Es posible que el parámetro más crítico para tener éxito con la PCR sea el diseño de

los cebadores. A igualdad de todos los demás factores, un cebador mal diseñado

puede hacer que fracase una PCR. La secuencia del cebador determina varios

aspectos, como la posición y la longitud del producto, su temperatura de fusión y

finalmente el rendimiento (Innis y Gelfand, 1994). Un cebador mal diseñado puede

hacer que se consiga poco producto o incluso ninguno, debido a una amplificación

inespecífica o a la formación de dímeros de cebador, lo que puede llegar a competir

con la formación de producto hasta suprimirla. El objetivo de la presente nota de

aplicación es dar normas que deben seguirse en el diseño de cebadores para la

PCR. En otras publicaciones puede encontrarse un tratamiento más completo de

este tema (Dieffenbach et al., 1995).

Selección del cebador

Al diseñar cebadores para PCR hay que tener en cuenta diversas variables. Entre

ellas cabe destacar:

• la longitud del cebador;

• la temperatura de fusión (Tf);

• la especificidad;

• las secuencias complementarias del cebador;

• el contenido de G/C y los tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G);



• la secuencia del extremo 3’.

En las secciones siguientes se habla de cada uno de estos elementos críticos.

Longitud del cebador

Dado que la especificidad, la temperatura y el tiempo de hibridación dependen en

parte de la longitud del cebador, este parámetro es crítico para que tenga éxito la

PCR. En general, los oligonucleótidos que tienen entre 18 y 24 bases presentan una

especificidad extrema de secuencia, siempre que la temperatura de hibridación sea

óptima. La longitud del cebador también influye en la eficacia de la hibridación. En

general, cuanto más largo sea el cebador, menos eficaz será la hibridación. Al

cebarse menos ADNs moldes en cada fase, esto puede hacer que disminuya de

forma significativa la cantidad de producto amplificado. No obstante, los cebadores

tampoco deben ser demasiado cortos, salvo que la aplicación lo exija

específicamente. Como se comenta más abajo, el objetivo debe ser diseñar un

cebador con una temperatura de anillamiento de al menos 50 ºC.

La relación entre temperatura de hibridación y temperatura de fusión es una de las

«cajas negras» de la PCR. Una regla empírica general es utilizar una temperatura de

hibridación inferior en 5 ºC a la temperatura de fusión. Con frecuencia es posible que

la temperatura de hibridación determinada de esta forma no sea óptima y haya que

efectuar experimentos de tanteo para determinar la verdadera temperatura óptima.

La manera más fácil de hacerlo es con un termociclador de gradiente.

Temperatura de fusión (Tf)

Es importante no olvidar que son dos los cebadores que se añaden a una PCR en

relación con un sitio o diana. Los dos cebadores oligonucleotídicos deben diseñarse

de forma que tengan temperaturas de fusión similares. Si los cebadores no se

ajustan bien en cuanto a su Tf, la amplificación será menos eficaz o incluso podrá no

darse en absoluto, ya que el cebador con la Tf más elevada funcionará mal a

temperaturas más bajas y es posible que el cebador con la Tf más baja no trabaje a

temperaturas más elevadas. La forma más precisa de calcular las temperaturas de

fusión de los oligonucleótidos es utilizar cálculos termodinámicos del vecino más

próximo con la fórmula:

Tfcebador = ∆H [∆S+ R ln (c/4)] -273,15°C + 16,6 log 10 [K+] (2)



donde H es la entalpía y S es la entropía de la formación de la hélice, R es la

constante molar de los gases y c es la concentración de los cebadores.

La forma más fácil de hacerlo es con paquetes de programas informáticos de

diseños de cebadores que existen en el mercado (Sharrocks, 1994).

Afortunadamente, con la fórmula siguiente puede calcularse una buena

aproximación de trabajo de este valor (válido generalmente para oligonucleótidos de

entre 18 y 24 bases):

Tf = 2(A+T) + 4(G+C) (3)

donde A, T, G y C son las bases púricas y pirimidínicas.

El cuadro 2 muestra los valores correspondientes a cebadores de diversas

longitudes que se han calculado mediante esta ecuación (denominada fórmula de

Wallace) y suponiendo un contenido de GC del 50 % (Suggs et al., 1981).

Cuadro 2. Cálculo de la longitud de los cebadores con la ecuación de Wallace.


Tf = 2(A+T) + 4(G+C)


Tf = 2(A+T) + 4(G+C)

4 12°C 22 66°C

6 18°C 24 72°C

8 24°C 26 78°C

10 30°C 28 84°C

12 36°C 30 90°C

14 42°C 32 96°C

16 48°C 34 102°C

18 54°C 36 108°C

20 66°C 38 114°C

Las temperaturas calculadas según la fórmula de Wallace son imprecisas en los

extremos de este cuadro. Al calcular las temperaturas de fusión de los cebadores,

ha de velarse por que la temperatura de fusión del producto sea suficientemente

baja como para obtener el 100 % de fusión a 92 ºC. Este parámetro ayuda a



conseguir una PCR más eficaz, aunque no siempre es necesario para que la PCR

tenga éxito. En general, los productos que tienen entre 100 y 600 pares de bases se

amplifican de forma eficaz en muchas PCR. En caso de duda, la Tf del producto

puede calcularse con la fórmula siguiente:

Tf =81,5 + 16,6 (log10 [K+] + 0,41 (% G+C)-675/longitud (4)

Especificidad

Como ya se ha indicado, la especificidad del cebador depende al menos

parcialmente de su longitud. Es evidente que hay muchos más oligonucleótidos

distintos con 24 bases que con 15. Dicho esto, los cebadores han de elegirse de

forma que tengan una secuencia única dentro del ADN molde que debe amplificarse.

Un cebador diseñado con una secuencia muy repetitiva dará como resultado un

borrón al amplificar ADN genómico. Sin embargo, el mismo cebador puede dar una

sola banda si se amplifica un solo clon de una genoteca. Como la ADN polimerasa

Taq es activa en una amplia banda de temperaturas, la extensión del cebador se

producirá a las temperaturas inferiores de hibridación. Si la temperatura es

demasiado baja, podrá darse un cebado inespecífico, que podrá ser extendido por la

polimerasa si hay una corta homología en el extremo 3’. En general, los mejores

resultados se obtienen con una temperatura de fusión de 55 a 72 ºC (lo que

corresponde a una longitud del cebador de entre 18 y 24 bases, según la regla de

Wallace).

Secuencias complementarias del cebador

Es absolutamente necesario que el diseño de los cebadores no incluya ninguna

homología interna del cebador de más de 3 pares de bases. Si un cebador tiene

alguna de estas zonas de auto-homología, pueden formarse estructuras con

cambios bruscos u horquillas, parcialmente bicatenarias, capaces de interferir con la

hibridación al ADN molde. Otro peligro relacionado es la homología entre cebadores.

Una homología parcial en las regiones centrales de dos cebadores puede interferir

con la hibridación. Si la homología se produce en el extremo 3’ de cualquiera de los

cebadores, pueden formarse dímeros de cebadores, que en general impiden la

formación del producto deseado por un mecanismo de competencia.



Contenido de G/C y tramos de polipirimidina (T, C) o polipurina (A, G)

La composición de bases de los cebadores debe ser de entre un 45 y un 55 % de

GC. La secuencia del cebador debe elegirse de forma que no haya tramos de poli-G

ni poli-C que puedan favorecer la hibridación inespecífica. También deben evitarse

los tramos de poli-A y poli-T, ya que pueden «respirar» y abrir tramos del complejo

cebador-ADN molde, lo que puede reducir la eficacia de la amplificación. También

deben evitarse los tramos de polipirimidina (T, C) y polipurina (A, G). Lo ideal es que

el cebador tenga una mezcla casi aleatoria de nucleótidos, un contenido de GC del

50 % y una longitud aproximada de 20 bases. De esta manera, la Tf estará en la

banda de 56 – 62 ºC (Dieffenbach et al., 1995).

Secuencia del extremo 3’

Se ha visto claramente que la posición terminal 3' de los cebadores de la PCR es

fundamental para evitar errores de cebado. Ya se ha explorado el problema de las

homologías de cebadores en estas regiones. Otra variable importante es la inclusión

de un residuo de G o C en el extremo 3’ de los cebadores. Este «cepo de GC»

contribuye a que sea correcta la unión en el extremo 3’, debido a la mayor fortaleza

del puente de hidrógeno de los residuos de G/C. Esto también ayuda a mejorar la

eficacia de la reacción por minimizar las eventuales aberturas que pudiera haber.

PCR especializada

Además de la amplificación de una secuencia diana de ADN por los procedimientos

normales de PCR que se han descrito, se han desarrollado varios tipos

especializados de PCR para aplicaciones específicas.

PCR anidada

Pueden utilizarse conjuntos anidados de cebadores para mejorar el rendimiento de

la PCR de la secuencia diana de ADN (Newton y Graham, 1994). La PCR con



cebadores anidados se efectúa haciendo entre 15 y 30 ciclos con un primer conjunto

de cebadores y después otros 15 a 30 ciclos con un segundo conjunto de cebadores

respecto a una región interna del producto de ADN amplificado en primer lugar. Así

pues, el fragmento más largo producido en la primera ronda de PCR se utiliza como

ADN molde para la segunda PCR. El método de PCR anidada puede aumentar

espectacularmente la sensibilidad y la especificidad de la amplificación del ADN.

Mejora particularmente la especificidad porque esta técnica elimina casi siempre los

eventuales productos de amplificación inespecíficos que perturban el proceso. Esto

se debe a que tras la primera ronda de PCR es poco probable que los eventuales

productos inespecíficos sean suficientemente complementarios de los cebadores

anidados y puedan servir de ADN molde para la amplificación posterior, y así lo que

se amplifica preferentemente es la secuencia diana. No obstante, un inconveniente

de esta extrema sensibilidad es el mayor riesgo de contaminación, y deben

extremarse las precauciones cuando se realiza esta PCR, sobre todo en un

laboratorio de diagnóstico.

PCR Múltiplex

Mientras que la PCR normal utiliza en general un solo par de cebadores para

amplificar una secuencia específica, la PCR Múltiplex utiliza múltiples pares de

cebadores para amplificar muchas secuencias simultáneamente. La presencia de

muchos cebadores de PCR en un solo tubo puede causar muchos problemas, como

el aumento de la formación de productos de PCR con errores de cebado, dímeros de

cebadores y la discriminación de la amplificación de fragmentos más largos de ADN

(Atlas y Bey, 1994).

Para este tipo de amplificación por PCR, se eligen cebadores con temperaturas de

hibridación similares. Las longitudes de los productos amplificados deben ser

similares; si hay grandes diferencias entre las longitudes de los ADN diana se

favorece la amplificación de la diana más corta respecto a la más larga, lo que

implica diferencias en el rendimiento de los productos amplificados. Por otra parte,

los tampones de PCR Múltiplex contienen un aditivo de la polimerasa Taq, que

reduce la competencia entre amplicones y la discriminación de fragmentos más

largos de ADN durante la PCR Múltiplex.

Los productos de la PCR Múltiplex pueden seguir hibridándose con una sonda

específica del gen con fines de verificación.



La PCR en la práctica

Como ya se ha visto en secciones anteriores, la utilización de la PCR está muy

difundida porque se trata de una técnica potente de análisis y preparación. No

obstante, dada la naturaleza de este procedimiento, es posible que cantidades traza

de ADN contaminante sirvan de ADN molde, lo que provocaría la amplificación de un

ácido nucleico distinto del diana (falsos positivos). Así pues, resulta fundamental

realizar la amplificación por PCR en un entorno libre de ADN. El riesgo de

contaminación se reduce si se dispone de zonas de trabajo físicamente separadas y

dotadas de su propio material. El requisito previo más importante para reducir al

mínimo la tasa de falsos resultados positivos es el cumplimiento estricto de las

normas de descontaminación (descontaminación de ácidos nucleicos, prevención de

la formación de aerosoles, etc.). La contaminación de la PCR puede deberse a

fuentes diversas, como las siguientes:

• mesas de laboratorio, equipos y pipetas, que pueden estar contaminados con

preparados anteriores de ADN, o con fragmentos de restricción purificados;

• contaminación cruzada entre muestras;

• productos de amplificaciones anteriores por PCR.

Esta sección recoge algunas recomendaciones, con el fin de definir los requisitos

normales para el establecimiento y mantenimiento de un entorno limpio para

cualquier sistema de ensayo con PCR, independientemente del número de muestras

tratadas (Roth et al., 1997).

Métodos físicos de prevención

Instalaciones de los laboratorios. Para evitar la contaminación, debe disponerse

de zonas de trabajo separadas físicamente de la forma siguiente:

1. Zona de preparación de muestras

Esta sala consiste de una zona en que se efectúan todas las fases previas a la

amplificación del ADN molde (p. ej., aislamiento y purificación del ADN).

2. Sala de disposición de la PCR

Esta sala «limpia» se dedica a los procesos de preparación de la PCR en sí (p.

ej., mezcla maestra, diluciones de cebadores, etc.).

3. Zona post-PCR

Esta zona se reserva a la amplificación de la secuencia del ADN diana, y a la

detección y análisis de los productos de la PCR.



Por otra parte, han de seguirse las normas generales siguientes:

• Todas las salas deben contener su propio material (batas, guantes, reactivos y

suministros).

• Los reactivos y demás material deben etiquetarse con el nombre del contenido y

la fecha de preparación.

• Ha de utilizarse un sistema de flujo unidireccional, es decir, nunca se han de

trasladar materiales, muestras ni equipos de las zonas post-PCR a lugares pre-

PCR.

• Deben utilizarse tubos de reacción para PCR desechables, libres de

desoxirribonucleasa y de ribonucleasa.

• Han de utilizarse puntas de pipeta especiales, que impidan la formación de

aerosoles, y los juegos de pipetas serán exclusivos (se utilizarán solo para la

PCR) y, de preferencia, del tipo de desplazamiento positivo.

• Siempre que sea posible, prepárese la PCR en una campana extractora dotada

de luz UV. En la campana extractora hay de poner una microcentrifuga y guantes

desechables que se utilizarán exclusivamente para la PCR.

• Las mesas y estantes se lavarán periódicamente con lejía al 10 %, seguida de

etanol al 70 %.

Manipulación de las muestras

• Utilícense técnicas estériles y llévense puestos guantes recientes siempre que se

trabaje en las zonas antes descritas. Hay que cambiarse de guantes con

frecuencia, sobre todo si se sospecha que se han contaminado con soluciones

que contengan ADN molde.

• Para preparar los reactivos de la PCR y el ADN molde han de utilizarse siempre

materiales de vidrio, de plástico y pipetas nuevos o esterilizados.

• Pasar por autoclave todos los reactivos y soluciones que puedan sufrir este

tratamiento sin que se vean afectadas sus propiedades. Por supuesto, no deben

pasar por autoclave los cebadores, los dNTP ni la ADN Taq polimerasa.

• Debe disponerse de un conjunto propio de reactivos y soluciones de PCR que

solo se utilizarán con este fin, y dichos reactivos se almacenarán en pequeñas

cantidades.

• Cuando se pipetea el ADN, ha de evitarse la formación de aerosoles que puedan

transportar contaminantes.



• Siempre han de efectuarse reacciones de control, como por ejemplo un control

negativo («sin ADN»), que contenga todos los componentes de la reacción

excepto el ADN molde, y un control positivo que se haya utilizado con éxito en

PCR anteriores.



Métodos bioquímicos de prevención

Uracil-ADN glucosilasa. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) puede

amplificar una sola molécula más de mil millones de veces. Así, es posible amplificar

una cantidad incluso minúscula de un contaminante, lo que daría lugar a un falso

positivo. Tales contaminantes suelen ser productos de anteriores amplificaciones por

PCR (contaminación por arrastre). Por tanto, se han elaborado métodos para evitar

esta contaminación.

Una estrategia frecuente es sustituir el dTTP por dUTP durante la amplificación por

la PCR, para formar ADN que contenga uracilo (U-ADN) (Longo et al., 1990). El U-

ADN contaminante de la muestra se eliminará tratando las mezclas de PCR

posteriores con uracil-ADN glucosilasa (UNG) antes de la amplificación por PCR y

descomponiendo después los polinucleótidos pirimidínicos a temperatura elevada

(95 ºC) en condiciones alcalinas (durante la fase de desnaturalización inicial) (véase

la figura 8).

Figura 8. Reacción de la uracil-ADN glucosilasa.

Por supuesto, este método exige que todas las PCR del laboratorio se realicen con

dUTP en lugar de con dTTP.

Ha de tenerse en cuenta lo siguiente cuando se utilicen productos de PCR que

contengan dU en aplicaciones posteriores:

A=Adenina U=Uracilo G=Guanina

Calor ─► pH alcalino

Uracil-ADN ─► Glucosilasa



• los productos de PCR que contienen dU funcionan tan bien como los que

contienen dT cuando se utilizan como dianas de hibridación o como ADN moldes

para la técnica del didesoxi;

• los productos de PCR que contienen dU pueden clonarse directamente si se

transforman en hospedadores bacterianos UNG-;

• un sustrato que contenga dU es digerido fácilmente por ciertas enzimas de

restricción comunes (p. ej., EcoR I y BamH I), mientras que otras (p. ej., Hpa I,

Hind II, Hind III) presentan una actividad reducida sobre estos sustratos;

• no se recomienda utilizar ADN con dU en estudios sobre la unión a proteínas ni

sobre la interacción del ADN con proteínas.

Desoxirribonucleasa I, exonucleasa III. Otros métodos bioquímicos se basan en el

tratamiento del ADN contaminado con desoxirribonucleasa I, exonucleasa III o con

una enzima de restricción que contenga una secuencia de reconocimiento dentro del

ADN diana. Sin embargo, dadas las condiciones desfavorables en que debe

efectuarse la reacción, estas enzimas presentan el inconveniente de reducir la

eficacia de la amplificación por PCR.

Preparación de la mezcla para la PCR (mezcla maestra)

Los reactivos fundamentales para la PCR son agua, el tampón de reacción, una

ADN polimerasa termoestable, cebadores oligonucleotídicos, desoxinucleótidos

(dNTP) y ADN molde (diana), así como iones de magnesio (Mg2+). En general, todos

los reactivos (excepto el ADN molde) se mezclan en un solo tubo, con un volumen

suficiente según el número de reacciones que se vaya a realizar (mezcla maestra).

La mezcla maestra se reparte a continuación en alícuotas en varios tubos y se

añade el ADN molde. El uso de una solución maestra reduce el riesgo de

contaminación y mejora el rendimiento de la PCR por los motivos siguientes:

• se garantiza una calidad uniforme de la solución respecto a todos los reactivos

para una serie de análisis;

• disminuye el riesgo de contaminación de la solución original y de las resultantes;

• pueden pipetearse volúmenes mayores;

• hay menos etapas de pipeteado, con lo que se ahorra tiempo.

El éxito en la amplificación de la región de interés depende de la cantidad y de la

calidad del ADN molde. La cantidad de ADN molde necesaria es función de la

complejidad de la muestra de ADN. Teniendo en cuenta que el tamaño del genoma



nuclear varía según los organismos, la concentración de ADN debe mantenerse

constante (generalmente 10 ng/µl). El cuadro 3 muestra una comparación del

tamaño del genoma de varias especies vegetales utilizadas con frecuencia en la

transformación vegetal, así como el número correspondiente de ejemplares de

genoma en una cantidad definida de ADN.

Cuadro 3. Comparación del tamaño del genoma de varias especies vegetales y

número correspondiente de ejemplares de genoma en una cantidad definida de

ADN.

Muestra Tamaño del

genoma

Ejemplares de genoma en

1 µg ADN

Ejemplares de genoma

en

1 ng ADN

Maíz 5 x 109 pb 1,85 x 105 185

Soja 1,55 x 109 pb 5,98 x 105 598

Tabaco 3,8 x 109 pb 2,43 x 105 245

Arroz 4 x 108 pb 2,31 x 106 2310

Por ejemplo, en un plásmido de 4 kb con un inserto de 1 kb, la diana de interés es el

25 % del ADN aportado. A la inversa, un gen de 1 kb en el genoma del maíz (5 x 109

pb) representa alrededor del 0,00002 % del ADN aportado. Hace falta

aproximadamente un millón de veces más ADN del genoma del maíz para mantener

el mismo número de ejemplares de la diana por reacción. Para optimizar los

resultados, deben utilizarse > 104 ejemplares de la secuencia diana como ADN

molde inicial para obtener una señal al cabo de 25 o 30 ciclos. Aunque en la práctica

es posible amplificar menos de 10 ejemplares de una secuencia diana, en este caso

podría ser necesario un número mayor de ciclos de PCR para detectar una señal por

electroforesis en gel. Los protocolos generales aplicados habitualmente consideran

un número de ciclos entre 30 y 40. Debe vigilarse un aumento del número de ciclos,

ya que entonces podría incrementarse la amplificación inespecífica.

Controles

Como se señalaba en la sección anterior, se encuentran fuentes posibles de

contaminación por todo el laboratorio. Tanto las muestras como el personal de

laboratorio, el sistema de aire acondicionado, el equipo y los reactivos pueden ser



fuente de contaminación. Entre los agentes contaminantes pueden citarse los

siguientes:

1. contaminación por arrastre de ADN diana amplificado en PCR anteriores;

2. contaminación cruzada entre muestras, lo que supone la transferencia de ADN

diana de una muestra a otra;

3. ADN genómico de preparados de muestras anteriores;

4. degradación de productos por reacciones de descontaminación.

Mientras que las tres primeras formas de contaminación producen falsos positivos, el

último tipo produce falsos negativos. Esta forma de contaminación, observada en

primer lugar por Niederhauser y colaboradores en 1994, provoca la inhibición de las

PCR (Niederhauser et al., 1994). De hecho, la descontaminación con el método

UNG favorece la formación de complejos con los cebadores.

Para obtener resultados fiables, con las PCR siempre hay que utilizar controles tanto

positivos como negativos. El cuadro 4 indica algunos de los controles más utilizados

para garantizar el resultado de los procedimientos de amplificación de ácido

nucleico.

Cuadro 4. Controles que deben introducirse en los ensayos con PCR.

Control Método

Contaminación de los reactivos con el ADN diana

Control negativo de la PCR sin ADN molde (solo mezcla maestra)

Especificidad de la reacción Controles para detectar productos secundarios e inespecíficos

Desarrollo y sensibilidad de la reacción

Controles positivos y negativos para verificar que se cumplen las condiciones y rendimientos buscados

Integridad de la mezcla de PCR PCR con control positivo de ADN

Controles positivos

Hay que comprobar mediante controles positivos la eficacia de la extracción y

amplificación del ADN. Lo ideal es dar límites de detección en equivalentes

genómicos, lo que permitiría la producción de controles de sensibilidad definidos,

con pequeños números de ejemplares. Como norma, debe disponerse de un



preparado de referencia que contenga una concentración conocida del ADN diana

estudiado.

Controles negativos

Puede darse contaminación (arrastre de productos amplificados o ácidos nucleicos)

durante el aislamiento y la purificación del ADN diana, así como durante la

preparación de la mezcla de reacción para la amplificación. Por tanto, es necesario

introducir un control negativo con la mezcla de reacción para la amplificación.



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Alimentos

Sesión nº 7

Características de la Soja Roundup Ready, del Maíz MON810 y del Maíz Bt-176

M. Querci y M. Mazzara

Características de la Soja Roundup Ready, del Maíz MON810 y del Maíz Bt-176 2


Índice

Sesión nº 7

Características de la Soja Roundup Ready, del Maíz MON810 y del Maíz Bt-176

Características de la soja Roundup Ready 3 Características del maíz MON810 7 Características del maíz Bt-176 11 Bibliografía 17



Características de la soja Roundup Ready1

Identificación sucinta

Denominación GTS 40-3-2

Solicitante Monsanto Canada Inc.

Especie vegetal Glycine max L. (soja)

Caracteres nuevos Nueva tolerancia al glifosato, ingrediente

activo del herbicida Roundup

Método de introducción del

nuevo carácter genético

Aceleración de partículas (biolística)

Utilización propuesta Producción de soja para la alimentación

animal (principalmente harina y copos

tostados desgrasados) y el consumo

humano (principalmente aceite, fracciones

de proteínas y fibra dietética)

Información de base

Monsanto Canada Inc. ha desarrollado la línea de soja GTS 40-3-2 para permitir la

utilización de glifosato como forma alternativa de lucha contra las malas hierbas en

la producción de soja.

El desarrollo de GTS 40-3-2 se ha basado en la tecnología de recombinación de

ADN, mediante la introducción de una forma tolerante al glifosato del gen de la

enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), aislada de la cepa CP4 de

Agrobacterium tumefaciens, en la variedad comercial de soja "A5403" (Asgrow Seed

Company).

Descripción del nuevo carácter

Tolerancia al glifosato

El ingrediente activo de Roundup, el glifosato, es un herbicida sistémico post-

emergente utilizado en todo el mundo como agente de lucha contra las malas

hierbas no selectivo. El glifosato actúa como inhibidor competitivo de la 5-

enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, enzima esencial de la ruta bioquímica del

shikimato que participa en la producción de los aminoácidos aromáticos: fenilalanina,

1 Procedentes de la Agencia Canadiense de Inspección Alimentaria, Documento de decisión DD95-05.



tirosina y triptófano (figura 1). La inhibición de la EPSPS supone la interrupción del

crecimiento y la muerte de la planta.

Esta enzima esencial presenta una amplia distribución entre vegetales, hongos y

microorganismos, pero el gen introducido de tolerancia al glifosato codifica una

versión bacteriana (derivada de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens)

sumamente insensible al glifosato y que puede, por tanto, satisfacer las necesidades

metabólicas de aminoácidos aromáticos de la planta.

El gen EPSPS está regulado por un fuerte promotor constitutivo del virus del

mosaico de la coliflor (P- CaMV E35S) y termina con el terminador de la nopalina

sintasa (T-nos) de Agrobacterium tumefaciens (figura 2). Se ha clonado en el

extremo 5’ del gen de la tolerancia al glifosato, una secuencia de ADN derivada de

plantas que codifica un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP4 de Petunia hibrida).

El péptido señal fusionado al gen EPSPS facilita la importación de la enzima recién

traducida a los cloroplastos, donde se encuentran la ruta del shikimato y los sitios de

acción del glifosato. Una vez ha tenido lugar la importación, se retira el péptido de

tránsito y se degrada rápidamente mediante una proteasa específica.

La EPSP sintasa se encuentra abundantemente en la naturaleza y, en principio, no

es tóxica ni alergénica. Al someterla a análisis comparativos con bases de datos de

secuencias de polipéptidos tóxicos o alergénicos, la secuencia de aminoácidos de la

enzima no muestra ninguna homología significativa con ninguna toxina o alérgeno

conocido.

fenilalanina tirosina triptófano

Figura 1 La EPSPS cataliza la reacción de shikimato-3-fosfato y fosfoenolpiruvato (PEP) para formar 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP) y fosfato. El EPSP es un producto intermedio en la síntesis de los aminoácidos aromáticos. Como consecuencia de la inhibición de esta ruta bioquímica, se altera la síntesis de proteínas, provocando la muerte de la planta. La EPSPS es el único objetivo fisiológico del glifosato en las plantas, y ninguna otra enzima que utilice PEP es inhibida por el glifosato.

+

glifosato (Roundup) N-(fosfonometil)glicina

5-enolpiruvil-shikimato-3-fosfato

fosfoenolpiruvato eritrosa-4-fosfato

shikimato-3-fosfato

fosfoenolpiruvato



Figura 2. Representación esquemática del casete del gen de soja Roundup Ready

(modificado a partir de Padgette et al., 1995).

Método de desarrollo

La variedad comercial de soja A5403 (Asgrow Seed Co.) se ha transformado

mediante un bombardeo de partículas de oro, con el vector plasmídico PV-GGMT04

recolectado de Escherichia coli (véase la figura 3). El plásmido PV-GGMT04

contenía el gen CP4 EPSPS que codifica la tolerancia al glifosato, el gen gus de

producción de ß-glucuronidasa como marcador genético y el gen nptII de resistencia

a antibióticos (kanamicina). El transformante original seleccionado mostró dos sitios

de integración, uno con el marcador genético gus y otro con el gen de tolerancia al

glifosato. Esos dos sitios se segregaron posteriormente de forma independiente en la

generación sexual siguiente, y se observó mediante análisis que la línea GTS 40-3-2

contenía un único sitio de inserción en el que solo estaba integrado el gen de

tolerancia al glifosato.

Figura 3. Mapa plasmídico que incluye los elementos genéticos del vector PV-GGMT04

utilizado en la transformación 40-3-2 de la soja RR, (procedente de Monsanto, 2000)

CTP4 P-E35S CP4 EPSPS T-nos



Estabilidad de la inserción de los caracteres introducidos

Los datos originales (Padgette et al., 1995, 1996) indicaron que GTS 40-3-2 contenía

un único casete génico CP4 EPSPS funcional, consistente en el promotor E35S del

virus del mosaico de la coliflor (CaMV), un péptido de tránsito del cloroplasto, la

secuencia de codificación CP4 EPSPS y la secuencia de poliadenilación nos.

No se observaron incorporaciones de ninguna región de codificación desde fuera del

gen de fusión del vector plasmídico original. En las generaciones posteriores no se

observó más segregación del gen de fusión descrito más arriba, lo que revelaba que

la línea GTS 40-3-2 era homocigótica para el gen de fusión. Los análisis del ADN

realizados en seis generaciones mostraron que la inserción era estable.

En estudios de caracterización más recientes se ha comprobado que, durante la

integración del ADN insertado, se habían producido varias modificaciones y que,

además del inserto primario funcional, el producto 40-3-2 de la soja Roundup Ready

contiene dos pequeños segmentos no funcionales de ADN insertado de 250 pb y 72

pb, respectivamente (Monsanto, 2000; Windels et al., 2001)

Decisión de reglamentación

La soja Roundup Ready (RR) es actualmente la única línea de soja transgénica cuya

comercialización está aprobada en la UE. Tras su autorización en los EE. UU. en

1994, la Decisión 96/281/CE de la Comisión, de 3 de abril de 1996, permitió su

importación a la Unión Europea. La citada Decisión autoriza la importación de

semillas a la UE únicamente para su transformación industrial en productos

inviables, incluidos piensos, productos alimenticios y otros productos en los que se

utilicen fracciones de soja.



Características del maíz MON8102


Denominación Maíz producto de la transformación

MON810 (nombre comercial YieldGard)

Solicitante Monsanto Canada Inc.

Especie vegetal Zea mays L. (maíz)

Caracteres nuevos Resistencia al piral del maíz (Ostrinia

nubilalis)



Aceleración de partículas (biolística)

Utilización propuesta Producción de Z. mays para el consumo

humano (productos de molienda húmeda

o seca o aceite de semillas) y harina y

ensilado para alimentación del ganado.


El maíz producto de la transformación MON810 (YieldGard) ha sido desarrollado por

Monsanto Canada Inc. específicamente para ser resistente al piral del maíz (Ostrinia

nubilalis) y proporcionar un método de lucha contra las pérdidas de las cosechas

ocasionadas por la alimentación del piral de maíz en su fase de larva, sin utilizar los

plaguicidas convencionales.

La línea MON810 se ha desarrollado utilizando la tecnología de recombinación del

ADN y el bombardeo con microproyectiles de células vegetales para introducir un

gen que codifique la producción de una proteína insecticida presente en la

naturaleza (derivada de Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki). Esta proteína es activa

contra determinadas especies de Lepidoptera, el orden de insectos al que

pertenecen las mariposas y polillas, incluido el piral del maíz. Más concretamente, la

proteína expresada en la línea MON810 es una forma truncada de una proteína

insecticida, la δ-endotoxina CRYIA(b), y protege a las plantas de maíz de los daños

causados por las larvas del piral del maíz en las hojas y tallos.

2 Procedentes de la Agencia Canadiense de Inspección Alimentaria, Documento de decisión 97-19.



Descripción del nuevo carácter

Resistencia al piral del maíz

Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki es una bacteria que forma endosporas, gram-

positiva y presente en el suelo. En su fase esporogénica, además de la endospora,

produce varios cristales de proteína insecticida, incluida la δ-endotoxina CRYIA(b),

activa contra determinados insectos lepidópteros como el piral del maíz, la tórtrix de

las yemas de la picea, el gusano telarañoso, la palomilla gitana, la palomilla de dorso

de diamante, la lagarta del girasol, el gusano de la yema del tabaco y la oruga de la

col. Se ha demostrado en numerosas ocasiones que la proteína no es tóxica para los

seres humanos, para otros animales vertebrados ni para los insectos beneficiosos

(Lee et al., 1995). La línea MON810 fue transformada con una copia del gen cryIA(b)

bajo el control del potente promotor constitutivo reforzado CaMV 35S y la secuencia

principal del intrón de HSP70 del maíz (figura 4).

La secuencia de codificación cryIA(b) de Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki HD-1 fue

modificada para optimizar y maximizar la expresión de la δ-endotoxina CRYIA(b) en

las plantas. La proteína resulta tóxica para las larvas de lepidópteros tras romperse

para dar un núcleo bioactivo y resistente a la tripsina. Se cree que la actividad

insecticida depende de la unión de los fragmentos activos a receptores específicos

presentes en células epiteliales del mesogastrio de insectos sensibles y de la

posterior formación de poros, lo que altera el equilibrio osmótico y, finalmente, deriva

en lisis celular. Las plagas de lepidópteros específicas del maíz, sensibles a la

proteína, son el piral del maíz y el gusano Helicoverpa zea.

La secuencia de aminoácidos de la toxina expresada en el maíz modificado resultó

ser idéntica a la producida de forma natural y equivalente a la proteína producida

como plaguicida biológico, ampliamente utilizada por la industria alimentaria

ecológica.

Figura 4. Representación esquemática de la construcción genética cryIA(b) del

plásmido PV-ZMBK07 utilizado en la transformación de MON810, que incluye el

promotor reforzado CaMV 35S, el intrón de hsp70 del maíz y el gen sintético de la δ-

endotoxina cryIA(b) seguido del terminador nos (modificado de BATS, 2003).

P-E35S hsp70 cryIA(b) T-nos




La línea MON810 se obtuvo a partir del genotipo Hi-II de maíz mediante

transformación biolística con una mezcla de ADN plasmídicos, PV-ZMBK07 y PV-

ZGMT10. El plásmido PV-ZMBK07 contiene el gen cryIA(b) (figura 5) y el plásmido

PV-ZGMT10 contiene los genes CP4 EPSPS y gox. Ambos plásmidos contienen

también el gen nptII (para la selección bacteriana) bajo el control de un promotor

bacteriano, y un origen de replicación de un plásmido pUC (ori-pUC) necesario para

la replicación de los plásmidos en E. coli. Los dos vectores se introdujeron mediante

el bombardeo con microproyectiles en células vegetales cultivadas. Se

seleccionaron las células transformadas con tolerancia al glifosato y a continuación

se cultivaron en un medio de cultivo tisular para la regeneración de plantas

(Armstrong et al., 1991).

Los análisis moleculares proporcionados por los autores indicaron que sólo los

elementos de la construcción genética PV-ZMBK07 se integraron en el genoma de la

línea MON810 como un inserto único, consistente en el promotor reforzado CaMV

35S (E35S), la secuencia principal de hsp70 y el gen truncado cryIA(b). La señal de

terminación en 3' de nos, presente en el plásmido PV-ZMBK07, se perdió mediante

un truncamiento en 3’ del casete del gen y, por consiguiente, no se integró en el

genoma hospedador (BATS, 2003).

Figura 5. Representación esquemática del plásmido PV-ZMBK07 utilizado en la

formación de la línea MON810 (procedente de Agbios Database on Essential

Biosafety).

CryIA(b)



Estabilidad de inserción de los caracteres introducidos

Los datos facilitados por los autores muestran que la segregación y la estabilidad

corresponden a un único sitio de inserción del gen cryIA(b) en el genoma de

MON810. La estabilidad de la inserción se demostró mediante múltiples

generaciones de cruces. La línea de maíz se ha cruzado con varios genotipos de

maíz diferentes durante 4 generaciones, manteniendo la protección contra el piral del

maíz. La línea MON810 deriva de la tercera generación de retrocruzamiento. La

integración estable del inserto único se demostró a través de las tres generaciones

mediante análisis de transferencia de Southern.


La Agencia de Protección del Medio Ambiente de EE. UU. autorizó en julio de 1996

la plantación de la línea de maíz MON810 en dicho país. La comercialización de esta

línea de maíz en la UE se autorizó mediante la Decisión 98/294/CE de la Comisión,

de 22 de abril de 1998.

La Agencia Canadiense de Inspección Alimentaria elaboró el Documento de decisión

97-19 para su aprobación en la alimentación humana y animal. La línea MON810

está también autorizada en Argentina, Australia, Japón, Sudáfrica y Suiza.

Esta línea de maíz se destina al consumo humano (producto de molienda húmeda,

seca o aceite de semillas) y harina y ensilado para alimentación del ganado.



Características del maíz Bt-1763


Denominación Maíz producto de la transformación 176 Bt

Solicitante Ciba Seeds de Ciba-Geigy y Mycogen

Corporation

Especie vegetal Zea mays L. (maíz)

Caracteres nuevos Resistencia al piral del maíz (Ostrinia

nubilalis); tolerancia al herbicida

glufosinato de amonio



Aceleración de partículas (biolística) en

embriones inmaduros

Utilización propuesta Para cultivo como maíz en grano híbrido


Ciba Seeds y Mycogen Corporation han desarrollado una línea de maíz resistente al

piral del maíz. Esta línea de maíz, denominada producto Bt-176, ha sido

transformada mediante la tecnología de recombinación de ADN y el bombardeo con

microproyectiles de embriones para producir una proteína insecticida, derivada de

Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki, activa contra determinadas especies de

Lepidoptera, el orden de insectos al que pertenecen las mariposas y polillas, incluido

el piral del maíz. Concretamente, esta proteína es una forma truncada de la δ-

endotoxina CRYIA(b) y protege las plantas de maíz contra los daños causados por

las larvas del piral del maíz con su alimentación. Además, esta línea de maíz fue

cotransformada con un gen que confiere tolerancia al herbicida glufosinato de

amonio, utilizado para seleccionar las plantas transformadas en fases muy

tempranas de desarrollo.

Descripción de los caracteres nuevos

Resistencia al piral del maíz

Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki es una bacteria que forma endosporas, gram-

positiva y presente en el suelo. En su fase esporogénica, además de la endospora,

produce varios cristales de proteína insecticida, incluida la δ-endotoxina CRYIA(b),

3 Procedentes de la Agencia Canadiense de Inspección Alimentaria, Documento de decisión DD96-09.



activa contra determinados insectos lepidópteros como el piral del maíz, la tórtrix de

las yemas de la picea, el gusano telarañoso, la palomilla gitana, la palomilla de dorso

de diamante, la lagarta del girasol, el gusano de la yema del tabaco y la oruga de la

col. Se ha demostrado en numerosas ocasiones que la proteína no es tóxica para los

seres humanos, para otros animales vertebrados ni para los insectos beneficiosos

(Lee et al., 1995).

Se desarrolló un gen sintético cryIA(b), derivado de la cepa HD-1 de Bacillus

thuringiensis ssp. kurstaki, que codifica una forma truncada de la δ-endotoxina

CRYIA(b), y modificada para aumentar su expresión en el maíz. El gen sintético

tiene aproximadamente una homología del 65 % en lo que respecta a los nucleótidos

con el gen nativo (Koziel et al., 1993). La proteína CRYIA(b) truncada contiene la

región insecticida de la CRYIA(b) nativa. Se cree que la actividad insecticida

depende de la unión del fragmento activo a los receptores específicos presentes en

células epiteliales del mesogastrio de insectos sensibles y de la posterior formación

de poros, lo que altera el equilibrio osmótico y deriva en lisis celular, interrupción de

la alimentación y finalmente muerte del insecto.

La línea Bt-176 se obtuvo por transformación con dos construcción genéticas

sintéticos del gen cryIA(b). Un construcción genética está bajo control transcripcional

del promotor de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (P-PEPC) del maíz y se expresa en

tejidos verdes. El segundo construcción genética está bajo el control del promotor de

una proteína kinasa dependiente de calcio (P-CDPK) del maíz y se expresa

específicamente en el polen. Ambas construcciones genéticas se terminan con un

terminador extraído del virus del mosaico de la coliflor (T-CaMV 35S) y también

incluye el intrón 9 del gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (véanse las figuras 6 y

7).

La finalidad de la expresión de la proteína CRYIA(b) en los tejidos verdes es hacer la

planta resistente a la primera generación de larvas del piral del maíz, que se

alimenta de las hojas. La expresión en polen se dirige a la segunda generación de

larvas de piral del maíz, ya que éstas se alimentan de polen.

La proteína CRYIA(b) de las hojas del producto de transformación Bt-176 se sometió

a estudios de digestibilidad in vitro simulando condiciones gástricas de mamífero y

se demostró su degradación como proteína dietética convencional.



Figura 6. Representación esquemática del gen sintético cryIA(b) bajo el control del

promotor CDPK (de Matsuoka et al., 2000).

Figura 7. Representación esquemática del gen sintético cryIA(b) bajo el control del

promotor PEPC (de Matsuoka et al., 2000).

Tolerancia al herbicida glufosinato de amonio

El gen de la tolerancia al glufosinato de amonio (gen bar), extraído de la bacteria

común del suelo Streptomyces hygroscopicus, codifica una fosfinotricina

acetiltransferasa (PAT) bajo control transcripcional del promotor constitutivo CaMV

35S, activo en todos los tejidos vegetales, excepto en el polen. La fosfinotricina, un

inhibidor de la glutamina sintetasa, es la fracción activa del glufosinato de amonio. La

actividad herbicida de la fosfinotricina se caracteriza por la inhibición de la glutamina

sintetasa resultante de la acumulación de cantidades letales de amoniaco en la

planta. La PAT cataliza la acetilación de fosfinotricina, de tal modo que elimina su

actividad herbicida.

El L- isómero de la fosfinotricina (L-PPT) es ampliamente utilizado como un agente

de amplio espectro para luchar contra las malas hierbas. El L-PPT es el ingrediente

activo del herbicida glufosinato de amonio desarrollado por Hoechst y denominado

BASTA. Este isómero es un análogo estructural de glutamato, el sustrato de la

T-35S cryIA(b)

PEPC Intr # 9

P-PEPC

P-CDPK cryIA(b)

PEPC Intr # 9

T-35S



glutamina sintetasa (véase la comparación entre el L-PPT y el glutamato en la

figura 8).

O H H CH3 — P — CH2 — CH2 — C — COOH HOOC — CH2— CH2 — C— COOH

OH NH2 NH2

Figura 8. El L-isómero de fosfinotricina (izquierda) comparado con el glutamato

(derecha).

En un principio, el L-PPT fue aislado de Streptomyces viridochromogenes, que

sintetiza sólo el L-isómero de la fosfinotricina. El glufosinato de amonio sintético es

una mezcla equimolar y racémica de los isómeros D- y L- de la PPT (la D-PPT no

exhibe actividad herbicida). Se ha demostrado que la PAT actúa específicamente

sobre la fosfinotricina, ya que no se ha observado ninguna otra actividad con otros

sustratos comunes de la acetiltransferasa, como el piruvato, la colina o la serina.

Mediante estudios de digestibilidad in vitro, simulando condiciones gástricas de

mamífero simuladas, llevados a cabo sobre la PAT expresada en E. coli, se vio que

esta proteína se digiere como una proteína dietética convencional.

El gen de la tolerancia al glufosinato de amonio se introdujo como un marcador

genético que permitía la identificación de embriones transformados en un medio

selectivo para poder realizar un seguimiento de los genes introducidos durante el

cultivo de las plantas. Como ya se ha notificado (FSANZ, 2000), los datos

moleculares indican que la línea Bt-176 contiene una sola copia del gen bar, bajo la

regulación transcripcional del promotor 35S y el terminador 35S extraídos del virus

del mosaico de la coliflor (P-CaMV 35S y T-CaMV 35S, respectivamente) (véase la

figura 9).

Figura 9. Representación esquemática del gen bar (extraído de Matsuoka et al.,

2000).

P-35S

bar T-35S




La línea Bt-176 se obtuvo mediante la transformación biolística de la línea

endogámica de maíz CG00526 (Zea mays L.) con dos plásmidos. Los dos

construccion geneticas sintéticos del gen cryIA(b) se clonaron juntos en un único

vector plasmídico (pCIB4431). Un segundo vector plasmídico (pCIB3064) contenía el

gen de la tolerancia al herbicida (bar), aislado de la bacteria del suelo Streptomyces

hygroscopicus. Los dos vectores se introdujeron en la línea de maíz CG00526

mediante el bombardeo con microproyectiles de embriones inmaduros. Con análisis

moleculares de la planta transformada se vio que en el genoma de la línea de maíz

están integradas dos o más copias de cada construcción genética plasmídica. Los

resultados de ensayos y análisis de transferencia de Northern indican que el gen de

la resistencia a la ampicilina (gen bla), regulado por un promotor bacteriano (utilizado

para la selección de los vectores en entornos bacterianos) no se expresó en tejidos

de hojas ni en polen de la planta. Se seleccionaron dos productos transgénicos

independientes de la transformación del maíz para posteriores cruces y

caracterizaciones: el 171 y el 176 (Koziel et al., 1993).

La presencia en maíz Bt-176 de los genes cryIA(b) (Koziel et al.,1993), bar y bla

(Privalle, 1994) se confirmó mediante estudios de caracterización adicionales. Los

datos comunicados por Food Standards Australia New Zealand (FSANZ, 2000)

también indican que puede haber hasta seis copias de los genes cryIA(b) y bla

presentes en Bt-176, y al menos dos del gen bar (junto con el promotor 35S), tal

como determinó el análisis de Southern frente al ADN del maíz Bt-176 (Privalle,

1994).

Estabilidad de inserción de los caracteres

Según la información comunicada (FSANZ, 2000), se determinó que la producción

de las proteínas CRYIA(b) y PAT en hojas y polen de plantas cultivadas en

invernadero era estable tras cuatro generaciones sucesivas de retrocruzamientos.

Los análisis de segregación indicaron que los caracteres de resistencia al piral del

maíz y tolerancia al herbicida se segregan como caracteres mendelianos vinculados.

Un estudio realizado con 3 240 plantas indicó que solo cinco plantas (el 0,15 %) se

consideraron con tolerancia al glufosinato de amonio pero susceptibles de ser

dañadas por larvas de piral del maíz.




En agosto de 1995, la Agencia de Protección del Medio Ambiente de los Estados

Unidos aprobó con reservas la comercialización de maíz de campo derivado del

producto de transformación 176 hasta el año 2000.

La comercialización de esta línea de maíz se autorizó en la UE mediante la Decisión

97/98/CE de la Comisión, de 23 de enero de 1997. Esta línea de maíz se destina al

cultivo, producción de semillas y producción de ensilado y grano para la alimentación

animal y grano para la transformación industrial (Decisión 97/98/CE de la Comisión).



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Decisión 97/98/CE de la Comisión, de 23 de enero de 1997, relativa a la

comercialización de maíz (Zea mays L.) modificado genéticamente con una

alteración de las propiedades insecticidas conferidas por el gen de la endotoxina

Bt, combinada con una mayor resistencia al herbicida glufosinato de amonio, con

arreglo a la Directiva 90/220/CEE del Consejo. (DO L 31 de 1.2.1997, p. 69).



Decisión 96/281/CE de la Comisión, de 3 de abril de 1996, relativa a la

comercialización de semillas de soja (Glycine max L.) modificada genéticamente

con una mayor resistencia al herbicida glifosato, de conformidad con la Directiva

90/220/CEE del Consejo. (DO L 107 de 30.4.1996, p. 10).

Decisión 98/294/CE de la Comisión, de 22 de abril de 1998, relativa a la

comercialización de maíz (Zea mays L. línea MON 810) modificado

genéticamente con arreglo a la Directiva 90/220/CEE del Consejo. (DO L 131 de

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Alimentos

Sesión nº 8

Características de los Sistemas Cualitativos de PCR Descritos en el Manual

M. Querci y M. Mazzara

Características de los Sistemas Cualitativos de PCR Descritos en el Manual 2


Índice

Sesión nº 8

Características de los Sistemas Cualitativos de PCR Descritos en el Manual

Características de los sistemas cualitativos de PCR descritos en el Manual 3 PCR específica de plantas 3 Detección del gen de la lectina 3 Detección del gen de la zeína 3

Método de cribado: detección del promotor CaMV 35S y del terminador nos 4 Detección del promotor CaMV 35S 5 Detección del terminador nos 5

PCR específica de OGM 7 Detección específica del casete génico CTP/EPSPS en la soja Roundup Ready 7 Detección del gen cryIA(b) sintético del maíz Bt-176 7 Detección específica del casete del promotor E35S / exón-intrón de hsp70 del maíz

MON810 9

Bibliografía 11



Características de los sistemas cualitativos de PCR descritos en el Manual

En este curso se utilizarán diferentes sistemas de detección: 1) se emplearán

cebadores específicos de plantas para confirmar la presencia y la calidad (capacidad

de amplificación) del ADN extraído de las muestras; 2) el denominado «método de

cribado», basado en la detección específica de las secuencias reguladoras más

comunes, el promotor 35S y el terminador nos. Esos dos métodos se efectuarán con

arreglo a un protocolo de PCR simple. Por último, se utilizarán cebadores

específicos de OGM en «PCR anidada» para la detección selectiva y la identificación

de las diferentes líneas transgénicas. El presente capítulo incluye una introducción

sucinta de los diferentes sistemas utilizados para la detección y caracterización de la

soja Roundup Ready, del maíz MON810 y del gen cryIA(b) del maíz Bt-176. Para

más información sobre las secuencias y la composición de los cebadores, véase la

Sesión nº 9.

PCR específica de plantas

Detección del gen de la lectina

Para la identificación del ADN de la soja, se utilizarán los cebadores GMO3 y GMO4

(Meyer et al., 1996), que amplifican un fragmento del gen de la lectina (Le1),

específico de la soja.

Como se ha indicado anteriormente, el objetivo es confirmar la presencia y la calidad

del ADN extraído de las muestras que contienen soja, entendiéndose aquí por

calidad del ADN su capacidad de amplificación por la PCR. Los cebadores GMO3 y

GMO4 se utilizan como PCR anidada para la segunda PCR-soja notificada por

Meyer y Jaccaud (1997) sobre el ADN extraído de alimentos transformados. El

producto previsto es un amplicón de 118 pb.

Detección del gen de la zeína

Los cebadores ZEIN3 y ZEIN4 (Studer et al., 1997) específicos del gen de la zeína

en el caso del maíz (Ze1, codificación de una proteína de 10 kb) se utilizarán para

confirmar la presencia y la calidad del ADN extraído de muestras que contienen



maíz. Por lo que respecta al gen de la lectina, los cebadores ZEIN3 y ZEIN4 se

diseñaron en principio como cebadores internos (segunda ronda de PCR) en un

sistema de PCR anidada para la detección de ADN de maíz extraído de alimentos

transformados. Si el ADN diana extraído está presente, intacto y es amplificable, se

prevé la amplificación de una banda de 277 pb.

Método de cribado: detección del promotor CaMV 35S y del terminador nos

La detección del promotor 35S y del terminador nos por PCR constituye el

denominado «método de cribado» para la identificación de productos alimenticios

derivados de plantas modificadas genéticamente. El uso del promotor 35S y del

terminador nos como secuencias diana permite la detección de la mayoría de los

productos alimenticios modificados genéticamente, ya que hasta ahora están

presentes en casi todos los vegetales modificados genéticamente autorizados por la

UE (Hemmer, 1997). Las características de algunas líneas de maíz cuya

comercialización está autorizada en la UE figuran, a modo de ejemplo, en el

cuadro 1. Los cebadores específicos del promotor 35S y del terminador nos

empleados durante el curso se utilizaron para validar un método de PCR para la

detección de la soja Roundup Ready y del maíz Maximizer (Bt-176) en fracciones de

alimentos transformados (Lipp et al., 2001).

Cuadro 1. Características de algunas líneas de maíz transgénico cuya

comercialización está autorizada en la UE.

Denominación Empresa Carácter Promotor Gen o genes introducidos Terminador

Línea Bt 176 Ciba-Geigy Bt, bar

35S PEPC CDPK

bar cryIA(b)/int.9 PEPC cryIA(b)/int.9 PEPC

35S 35S 35S

Línea Bt-11 Novartis Bt, pat 35S cryIA(b)/int. IVS6 nos

Línea T25 AgrEvo pat 35S pat 35S

Línea MON810 Monsanto Bt E35S E35S

cryIA(b)/int.hsp70 cryIA(b)/int.hsp70

- -



Detección del promotor CaMV 35S

Este promotor regula la expresión de los genes de numerosas plantas transgénicas,

como la soja Roundup Ready y la línea de maíz Bt-176. Para su detección

específica, se utilizarán los cebadores p35S-cf3 y p35S-cr4 (Lipp et al., 2001). El

amplicón previsto es un fragmento de 123 pb, como se indica en la figura 1 que

viene a continuación, en el que los cebadores p35S-cf3 y p35S-cr4 se han colocado

en la región correspondiente de la secuencia del promotor CaMV 35S.

ID A18053_3; parent: A18053 AC A18053; FT promoter 396..1779 FT /note="35S3 promoter sequence derived from cauliflower FT mosaic virus isolate CabbB-JI” SQ Sequence 1384 bp; nnnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnn nnnnnnnnn 1140 ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 1200 acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga catctccact gacgtaaggg 1260 p35S-cf3 atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc 1320 p35S-cr4 atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctat aaatctatct ctctctctat 1380 aacc 1384 //

Figura 1. Secuencia parcial del promotor 35S derivado del virus del mosaico de la

coliflor (CaMV) y sitios de hibridación de los cebadores p35S-cf3 y p35S-cr4.

Detección del terminador nos

Los cebadores HA-nos118-f y HA-nos118-r (Lipp et al., 2001) se utilizan para la

detección del terminador nos, que está presente en la soja Roundup Ready y en

otras líneas de plantas transgénicas (p. ej., la línea de maíz Bt-11). La amplificación

del terminador nos dará lugar a la producción de un fragmento de ADN de 118 pb.



En la figura 2, los cebadores HA-nos118-f y HA-nos118-r se han colocado dentro de

la secuencia de la parte transgénica de la soja Roundup Ready. HA-nos118-r > 151 nnnnnnnnnn nnnnnnnnga tccccgatct agtaacatag atgacaccgc

201 gcgcgataat ttatcctagt ttgcgcgcta tattttgttt tctatcgcgt

< HA-nos118-f 251 attaaatgta taattgcggg actctaatca taaaaaccca tctcataaat

301 aacgtcatgc attacatgtt aattattaca tgcttaacgt aattcaacag

351 aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc aatcttaaga

/ / 1601 gatccaggtg tcgccttcct tacggatcct ggcgcccatg gcctgcatgg

1651 ccttgcccgt attgatgacg tcctcgcctt ccagaaggcc ggtgatgcgc

GM09 > 1701 gtttcaccgc tcgcgagacc gccgaacatg aaggaccggt gggagatcga

1751 cttgtcgccg ggaatgcgga cggttccgga aaggccagag gatttgcggg

1801 cggttgcggg ccggctgctt gcaccgtgaa gcatgcaggc tgtagccact

1851 gatgctgaaa tcctaaagga acaaaacttt tgcataaaaa ttgaatcttt

1901 tttcaaaacc aacatagaat ttgctgaatt tttcagtttt ttagatccaa

GM08 > 1951 aaacaagaaa acttgaagat ttaggaactt ggggtttatg gaaattggaa

2001 ttgggattaa gggtttgtat cccttgagcc atgttgttaa tttgtgccat

p35S-cr4 > 2051 tcttgaaaga tctgctagag tcagcttgtc agcgtgtcct ctccaaatga

< GM07 2101 aatgaacttc cttatataga ggaagggtct tgcgaaggat agtgggattg

< GM05 < p35S-cf3 2151 tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatcc acttgctttg

2201 aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg

2251 ggtccatctt tgggaccact gtcggcagag gcatcttcaa cgatggcctt

2301 tcctttatcg caatgatggc atttgtagga gccaccttcc ttttccacta

2351 tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc aatggaatcc gaggaggttt

2401 ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca catcg

Figura 2. Secuencia de la parte transgénica de la soja Roundup Ready de Monsanto

con arreglo a la patente WO 92/04449.



PCR específica de OGM

Los cebadores de amplificación utilizados para la identificación de la soja Roundup

Ready, el maíz Bt-176 y el maíz MON810 se eligieron por su capacidad para

detectar, de manera específica, la estructura genética insertada en los genomas de

la soja Roundup Ready y de los maíces Bt-176 y MON810, respectivamente.

Detección específica del casete génico CTP/EPSPS en la soja Roundup Ready

Las parejas de cebadores GMO9/GMO5 y GMO8/GMO7 se diseñaron para la

detección específica del transgén de la soja Roundup Ready por PCR anidada

(Meyer y Jaccaud, 1997). Los cebadores externos GMO9 and GMO5 son

complementarios de la secuencia de ADN correspondiente al gen CP4 EPSPS y al

promotor CaMV 35S. La amplificación del ADN con esos dos cebadores da lugar a

un amplicón de 447 pb. Los cebadores internos, GMO8 y GMO7, son

complementarios del gen epsps de la petunia y del promotor CaMV 35S. La

amplificación del ADN con esos cebadores internos da lugar a un fragmento de

169 pb, como se indica en la figura 2.

Detección del gen cryIA(b) sintético del maíz Bt-176

Las parejas de cebadores CRYIA1/CRYIA2 y CRYIA3/CRYIA4 se concibieron para

la detección específica del gen cryIA(b) sintético mediante PCR anidada (Studer et

al., 1997). Los cebadores externos, CRYIA1 y CRYIA2, y los internos, CRYIA3 y

CRYIA4, son complementarios de la secuencia de ADN del gen cryIA(b). Como se

indica en la figura 3, los dos cebadores externos (CRYIA1/CRYIA2) delimitan un

fragmento de 420 pb, mientras que el par CRYIA3/CRYIA4 produce un fragmento

de 189 pb.



ID I41419 standard; ADN; UNC; 1947 bp. AC I41419; ……… DE Sequence 3 from patent US 5625136. ……… RA Koziel M.G., Desai N.M., Lewis K.S., Kramer V.C., Warren G.W., Evola S.V., RA Crossland L.D., Wright M.S., Merlin E.J., Launis K.L., Rothstein S.J., RA Bowman C.G., Dawson J.L., Dunder E.M., Pace G.M., Suttie J.L.; RT "Synthetic DNA sequence having enhanced insecticidal activity in maize"; RL Patent number US5625136-A/3, 29-APR-1997. ……… FT source 1..1947 FT /db_xref="taxon:12908" FT /organism="unclassified" SQ Sequence 1947 bp; 412 A; 729 C; 528 G; 278 T; 0 other; atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60 gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120 agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180 gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240 gagcagctga tcaaccagcg catcgaggag ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300 gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 360 cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatg cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420 ctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtg cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480 tacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagc gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540 cgctggggct tcgacgccgc caccatcaac agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600 ggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctgg tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660 cccgacagcc gcgactggat caggtacaac cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720 ctggacatcg tgagcctgtt ccccaactac gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780 agccagctga cccgcgagat ttacaccaac cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840 cgcggcagcg cccagggcat cgagggcagc atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900 aacagcatca ccatctacac cgacgcccac cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960 atcatggcca gccccgtcgg cttcagcggc cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020 cebador directo CRYIA1 en la PCR externa atgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatc gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080 accctgagca gcaccctgta ccgtcgacct ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140 cebador directo CRYIA3 en la PCR interna (anidada) agcgtgctgg acggcaccga gttcgcctac ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200



taccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctg gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 1260 cebador inverso CRYIA4 en la PCR interna (anidada) ccacctcgac agggcttcag ccaccgtctg agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320 agcaacagca gcgtgagcat catccgtgca cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380 gagttcaaca acatcatccc cagcagccaa atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440 cebador inverso CRYIA2 en la PCR externa aacctgggca gcggcaccag cgtggtgaag ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500 cgccgcacca gccccggcca gatcagcacc ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560 cagcgctacc gcgtccgcat ccgctacgcc agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620 atcgacggcc gccccatcaa ccagggcaac ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680 ctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggc ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740 agcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtg ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800 cgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacc ttcgaggccg agtacgacct ggagagggct 1860 cagaaggccg tgaacgagct gttcaccagc agcaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg 1920 accgactacc acatcgatca ggtgtag

Figura 3. Gen cryIA(b) optimizado insertado en maíz Bt-176: secuencia del gen

cryIA(b) SEQ ID No. 3 con arreglo a la patente estadounidense nº 5625136 y a

Genebank Accession nº 141419.

Detección específica del casete del promotor E35S / exón-intrón de hsp70 del maíz MON810

Las parejas de cebadores GM1/GM2 y GM3/GM4 fueron diseñadas para la

detección específica del casete del promotor E35S / exón-intrón 1 de hsp70

mediante PCR anidada (Zimmermann et al., 1998). Esta construcción génica es

específica del maíz MON810. Los cebadores externos, GM1 y GM2, se hibridan con

la secuencia del promotor E35S y con la región del intrón 1 de hsp70,

respectivamente, mientras los cebadores internos son complementarios de la

secuencia de ADN del promotor E35S y de la región del exón 1 de hsp70,

respectivamente. Como se indica en la figura 4, los dos cebadores externos

(GM1/GM2) producen un fragmento de 401 pb, mientras que el par GM3/GM4

produce un fragmento de 149 pb.



Figura 4. Representación esquemática de parte del casete de maíz MON810, que incluye

el promotor reforzado CaMV 35S y el intrón de hsp70 del maíz, y la posición relativa de los

cebadores GM1, GM2, GM3 y GM4 (modificado de Zimmermann et al., 1998).

Plant DNA

401 pb

149 pb GM1 GM2

GM3 GM4

P-E35S

exón 1 de hsp70

exón 2 de hsp70

intrón 1 de hsp70

intrón de hsp70



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Alimentos

Sesión nº 9

Detección Cualitativa mediante PCR del Maíz MON810, del Maíz Bt-176 y de la Soja Roundup

Ready

M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara

Qualitative Detection of MON810 Maize, Bt-176 Maize and Roundup Ready Soybean by PCR 2


Índice

Sesión nº 9

Detección Cualitativa mediante PCR del Maíz MON810, del Maíz Bt-176 y de la Soja Roundup Ready

Práctica 3

Introducción 3

PCR específica de plantas: gen de la lectina de soja 6 PCR específica de plantas: gen de la zeína de maíz 9 Método de cribado para detectar vegetales genéticamente modificados 12 Detección del promotor 35S 12 Detección del terminador nos 14 Detección específica mediante PCR anidada del maíz MON810, del maíz Bt-176 y de la

soja Roundup Ready 17 Detección del maíz MON810 17 Detección del maíz Bt-176 22 Detección de la soja Roundup Ready 26



Práctica

Introducción

Los protocolos siguientes son métodos basados en la PCR que permiten el cribado de OGM

(mediante el promotor 35S y el terminador nos) y la detección de OGM específicos (soja

Roundup Ready, maíz MON810 y maíz Bt-176) en material bruto y transformado por

comparación con muestras correspondientes no modificadas genéticamente (soja y maíz).

Los métodos que siguen sólo permiten obtener resultados cualitativos con una indicación de

la presencia o ausencia de la secuencia diana en la muestra.

Instrumental

• Micropipetas

• Termociclador

• Microcentrífuga



• Tubos de reacción para PCR de 0,2 ml

• Tubos para microcentrífuga de 1,5 ml

• Sala estéril aparte con campana ultravioleta

OBSERVACIONES Todo el instrumental debe estar libre de ADN y, cuando sea posible, esterilizarse antes de

su uso.

Para evitar la contaminación, deben usarse puntas de pipeta con barrera, protegidas contra

la formación de aerosoles.

Reactivos

• dATP CAS1923-31-7

• dCTP CAS102783-51-7

• dGTP CAS93919-41-6

• dTTP CAS18423-43-3

• Tampones de PCR concentrados 10 veces (normalmente distribuidos por el

proveedor de ADN polimerasa Taq).



• MgCl2 25 mM

• ADN polimerasa Taq

• Oligonucleótidos de uso anterior y posterior

• Aceite mineral (necesario si se utiliza un termociclador sin tapa caliente)

• Agua libre de nucleasa

Solución madre de dNTP 4 mM

• Los dNTP puede suministrarse en soluciones madre recombinadas (con dATP,

dCTP, dGTP, dTTP en la misma concentración) o separados en distintas soluciones

madre. Si se utilizan soluciones separadas, los distintos dNTP deben disolverse en

agua desionizada esterilizada para obtener una solución madre final de dNTP 4 mM.

• Dividir en alícuotas y guardar a –20 °C. Los dNTP se mantienen estables durante

varios meses.

Solución de cebador 20 µM

Los oligonucleótidos del cebador suelen suministrarse liofilizados, por lo que debe diluirse

hasta alcanzar una concentración de 20 µM.

• Preparar una solución de cebador 20 µM siguiendo las instrucciones del proveedor.

- 1 µM = 1 pmol/µl, por tanto 20 µM = 20 pmol/µl.

- X nmol de cebador + 10 X µl de agua esterilizada = 100 pmol/µl = 100 µM.

- Incubar 5 min a 65 °C, agitar e incubar durante otros 3 min a 65°C.

- Dilución 1:5. Preparar 1 tubo de microcentrífuga con 400 µl de agua esterilizada y

añadir 100 µl de la solución de cebador (100 µM). Concentración final: 20 µM.

• Dividir en alícuotas pequeñas y guardar a –20 °C. Las alícuotas guardadas a –20 °C

se mantienen estables durante al 6 meses. los cebadores liofilizados se mantienen

estables a –20 ºC durante un máximo de tres años.

Tampón PCR 10x

• El tampón para PCR 10x, con KCl 500 mM, Tris-HCI 100 mM (pH 9,0 a 25 °C) y

Tritón X-100 al 1 % suele suministrarse junto con la ADN polimerasa Taq y está listo

para su uso. El tampón debe mezclarse y centrifugarse brevemente antes de cada

uso.

• Las alícuotas se guardan a –20 °C y se mantienen estables durante varios meses.



Solución de MgCl2 25 mM

La solución de MgCl2 «de grado PCR» suele suministrarse junto con la ADN Taq polimerasa

y lista para su uso. La solución debe mezclarse (mezclador de torbellino) antes de cada uso

y centrifugarse brevemente (para destruir el gradiente de concentración que puede formarse

en caso de conservación prolongada). Guardar a –20 °C.

Alícuotas de agua libre de nucleasa

Se preparan alícuotas de agua desionizada, esterilizada y libre de nucleasa para la mezcla

maestra y para la dilución del ADN. En cada serie de análisis debe utilizarse una alícuota

distinta.



PCR específica de plantas: gen de la lectina de soja

La identificación del ADN de la soja se realiza con el gen lectina como diana.

La presencia de ADN amplificable de soja en la muestra se determina mediante PCR con

los cebadores GMO3 y GMO4.

Características de los cebadores GMO3 y GMO4

GMO3 Secuencia GCCCTCTACTCCACCCCCATCC Longitud 22 Peso molecular (g/mol) 6471,6 Punto de fusión * (G/C) 65,1

GMO4 Secuencia GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG Longitud 23 Peso molecular (g/mol) 6981,1 Punto de fusión * (G/C) 59,6

*Suponiendo que la [Na+] sea de 50 mM.

Controles

Es importante realizar ensayos de control con cada análisis por PCR. Los controles

negativos están diseñados para comprobar si los reactivos de la PCR están contaminados

con ADN. Los controles positivos con muestras caracterizadas también son críticos para

determinar la eficacia y la especificidad de la PCR.

Al realizar análisis con PCR deben incluirse los siguientes controles:

• Control positivo: ADN puro, aislado de la soja convencional

• Control negativo: ADN puro, aislado de otras especies y libre del gen lectina

• Control sin plantilla: control negativo de la mezcla maestra, utilizando agua en

vez de ADN.

Preparación de la mezcla maestra

Los reactivos necesarios para una serie de 10 muestras (con controles positivos, negativos

y sin plantilla) se mezclan siguiendo las instrucciones indicadas en el cuadro 1.



El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de GMO3 y GMO4 y

2 µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las soluciones

se guardan en hielo.

Cuadro 1. Mezcla maestra GMO3-GMO4

Concentraciónfinal

Mezcla maestra para una muestra

Mezcla maestra para 10 muestras

Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido GMO3 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido GMO4 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl

TOTAL 48 µl 480 µl

• Preparar un tubo para microcentrífuga de 1,5 ml

• Añadir los reactivos siguiendo el orden indicado en el cuadro 1

• Agitar suavemente la mezcla maestra de GMO3 y GMO4 por pipeteado y centrifugar

brevemente

• Dividir la mezcla maestra en alícuotas de 48 µl en tubos de reacción de PCR de 0,2 ml

• Añadir 2 µl de la solución de ADN a dichas alícuotas

• Agitar suavemente y centrifugar brevemente

• Colocar los tubos de reacción de PCR en el termociclador

Programa PCR* (GMO3/GMO4)

Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial 95 ˚C 3 min

Desnaturalización 95 ˚C 30 s Anillamiento 63 ˚C 30 s Extensión 72 ˚C 30 s Número de ciclos 40 Extensión final 72 ˚C 3 min 4 ˚C ∞



Tras la amplificación, las muestras se centrifugan brevemente y se colocan en hielo.

* Nota: En el curso se utilizarán termocicladores Perkin Elmer Gene Amp PCR system

9600, ABI 9700. La utilización de modelos o marcas de termocicladores distintos

producirá los mismos resultados siempre que se los programas de PCR se adapten y

comprueben en consecuencia1.

Análisis de los productos de la PCR

Tras la amplificación de la secuencia diana, se analizan los productos de la PCR mediante

electroforesis en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Se mezclan 8 µl de una

reacción de PCR con 2 µl de tampón de carga, tras lo cual se cargan las muestras en el gel

de agarosa (1,5 %). Se realiza una migración a 100 V durante 1 hora. Se someten a

electroforesis marcadores de tamaño (15 µl de una escalera de 100 pb) en pocillos

adyacentes del gel, de forma que pueda determinarse con precisión el tamaño de los

amplicones. Completado el ciclo, el ADN del gel puede visualizarse mediante

transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel del resultado del ensayo, puede

fotografiarse el gel.

Interpretación de los resultados

El sistema se comprueba utilizando la pareja de cebadores GMO3-GMO4 para detectar el

gen de la lectina sin modificar; la calidad de amplificación del ADN extraído se ve

confirmada por una banda de 118 pb, específica del gen lectina.

El control positivo amplificará una banda de 118 pb. Los controles negativo y sin plantilla no

deben arrojar una banda visible.

Si los controles positivo o negativo no dan los resultados esperados, el análisis por PCR de

las muestras seleccionadas no es válido.

Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra no presenta una banda a

118 pb, significa que la muestra no contiene ADN de soja amplificable. Conviene observar

que éste (como otros protocolos de esta sesión) es un método cualitativo que sólo permite

obtener un resultado cualitativo (disyuntiva sí-no).

1 El CCI y la OMS no promocionan ningún instrumento utilizado en los cursos de formación o mencionado en el presente manual. Los análisis realizados en nuestros laboratorios deberían reproducirse fácilmente utilizando otros instrumentos, siempre que se tengan en cuenta las características divergentes del sistema usado.



PCR específica de plantas: gen de la zeína de maíz

La identificación del ADN del maíz se realiza con el gen zeína como diana.

La presencia en la muestra de ADN adecuadamente amplificable de maíz se determina

mediante PCR con los cebadores ZEIN3 y ZEIN4.

Características de los cebadores ZEIN3 y ZEIN4

ZEIN3 Secuencia AGTGCGACCCATATTCCAG Longitud 19 Peso molecular (g/mol) 5772,3 Punto de fusión * (G/C) 55,2

ZEIN4 Secuencia GACATTGTGGCATCATCATTT Longitud 21 Peso molecular (g/mol) 6410,9 Punto de fusión * (G/C) 51,7


Controles

• Control positivo: ADN puro, aislado del maíz convencional

• Control negativo: ADN puro, aislado de otras especies y libre del gen zeína


vez de ADN.




El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de ZEIN3 y ZEIN4 y





Cuadro 2. Mezcla maestra ZEIN3-ZEIN4

Concentraciónfinal

Mezcla maestrapara una muestra

Mezcla maestra para 10

muestras

Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón de PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido ZEIN3 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido ZEIN4 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Agitar suavemente la mezcla maestra de ZEIN3 y ZEIN4 por pipeteado y centrifugar

brevemente




• Colocar los tubos de reacción de PCR en el termociclador.

Programa PCR (ZEIN3/ZEIN4)

Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial 95 ˚C 3 min Desnaturalización 96 ˚C 1 min Anillamiento/Extensión 60 ˚C 1 min Número de ciclos 40 Extensión final 72 ˚C 3 min 4 ˚C ∞





Tras la amplificación del ADN, se analizan los productos de la PCR mediante electroforesis

en gel de agarosa en presencia de bromuro de etidio. Se mezclan 8 µl de la solución con

2 µl de tampón de carga, tras lo cual se carga la mezcla en el gel de agarosa (1,5 %). Se

realiza una migración a 100 V durante 1 hora. Se someten a electroforesis marcadores de

tamaño (15 µl de una escalera de 100 pb) en pocillos adyacentes del gel, de forma que

pueda determinarse con precisión el tamaño de los amplicones. Completado el ciclo, el ADN

del gel puede visualizarse mediante transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel

del resultado del ensayo, puede fotografiarse el gel.


La calidad de amplificación del ADN extraído se comprueba utilizando la pareja de

cebadores ZEIN3-ZEIN4 para detectar el gen de la zeína del maíz sin modificar. Si el ADN

extraído tiene suficiente calidad de amplificación, se observará en el gel una banda

específica del gen de la zeína de 277 pb.

El control positivo debería también amplificar una banda de 277 pb.

Los controles negativo y sin ADN molde no deben arrojar una banda visible.



Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra no presenta una banda a

277 pb, significa que la muestra no contiene ADN de maíz amplificable.



Método de cribado para detectar vegetales genéticamente modificados

Los genes están sometidos a la regulación de promotores y terminadores. Las secuencias

más utilizadas para la regulación de un transgén son el promotor 35S (derivado del virus del

mosaico de la coliflor) y el terminador nos (derivado de Agrobacterium tumefaciens). La

detección de una de estas secuencias reguladoras en una muestra con soja o maíz indica la

presencia de OGM. En la soja Roundup Ready, pueden detectarse tanto el promotor 35S

como el terminador nos, mientras que en las líneas de maíz Bt-176 y MON810 sólo se da la

presencia del promotor 35S.

Detección del promotor 35S

Características de los cebadores p35S-cf3 y p35S-cr4

p35S-cf3 Secuencia CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG Longitud 21 Peso molecular (g/mol) 6414.5 Punto de fusión * (G/C) 57,4

p35S-cr4 Secuencia TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC Longitud 25 Peso molecular (g/mol) 7544,2 Punto de fusión * (G/C) 56,3


Controles

• Control positivo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0,5 % es GM)

• Control negativo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0 % es GM)

• Control sin ADN molde: control negativo de la mezcla maestra, utilizando agua

en vez de ADN.






El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de p35S-cf3 y p35S-

cr4 y 2 µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las

soluciones se guardan en hielo.

Cuadro 3: Mezcla maestra de p35S-cf3 y p35S-cr4

Concentraciónfinal

Mezcla maestrapara una muestra


Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido p35S-cf3 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido p35S-cr4 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Agitar suavemente la mezcla maestra de p35S-cf3 y p35S-cr4 por pipeteado y

centrifugar brevemente





Programa PCR (p35S-cf3 y p35S-cr4)

Temperatura TiempoDesnaturalización inicial 95 ˚C 3 min Desnaturalización 95 ˚C 25 s Anillamiento 62 ˚C 30 s Extensión 72 ˚C 45 s Número de ciclos 50 Extensión final 72 ˚C 7 min 4 ˚C ∞





Tras la amplificación, se analizan los productos de la PCR mediante electroforesis en gel de

agarosa en presencia de bromuro de etidio. Se mezclan 8 µl de la solución con 2 µl de

tampón de carga, tras lo cual se carga la solución en el gel de agarosa (2,5 %). Se realiza

una migración a 100 V durante 1 hora. Se someten a electroforesis marcadores de tamaño

(15 µl de una escalera de 100 pb) en pocillos adyacentes del gel, de forma que pueda

determinarse con precisión el tamaño de los amplicones. Completado el ciclo, el ADN del

gel puede visualizarse mediante transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel del

resultado del ensayo, puede fotografiarse el gel.


Para la detección del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor se utiliza el par de

cebadores p35S-cf3/p35S-cr4, que rinde un fragmento de 123 pb. Este promotor regula la

expresión de los genes de numerosas plantas transgénicas, como la soja Roundup Ready y

la línea de maíz Bt-176. El control positivo amplificará una banda de 123 pb. Los controles

negativo y sin plantilla no deben arrojar una banda visible. Si los controles positivo o

negativo no dan los resultados esperados, el análisis por PCR de las muestras

seleccionadas no es válido.

Si los controles arrojan los resultados esperados y la muestra presenta una banda de

123 pb, significa que la muestra contiene ADN modificado.

Detección del terminador nos

Características de los cebadores HA-nos 118-f y HA-nos 118-r

HA-nos 118-f Secuencia GCATGACGTTATTTATGAGATGGG Longitud 24 Peso molecular (g/mol) 7462,8 Punto de fusión * (G/C) 56,2

HA-nos 118-r Secuencia GACACCGCGCGCGATAATTTATCC Longitud 24 Peso molecular (g/mol) 7296,9 Punto de fusión * (G/C) 61,2




Controles

• Control positivo: ADN del material de referencia (soja de la que un 0,5 % es GM

[soja Roundup Ready])

• Control negativo: ADN del material de referencia (soja de la que un 0 % es GM)


en vez de ADN.




El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de HA-nos118-f y

HA-nos118-r y 2 µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas

las soluciones se guardan en hielo.

Cuadro 4. Mezcla maestra de HA-nos118-f y HA-nos118-r

Concentraciónfinal


Mezcla maestrapara 10

muestras

Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido HA-nos118-f 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido HA-nos118-r 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Agitar suavemente la mezcla maestra de HA-nos118-f y HA-nos118-r por pipeteado y

centrifugar brevemente







Programa PCR (HA-nos118-f/HA-nos118-r)

Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial

95 ˚C 3 min













Para la detección del terminador nos se utiliza el par de cebadores HA-nos118-f/HA-

nos118-r, que rinde un fragmento de 118 pb. El terminador nos está presente en la soja

Roundup Ready y en otras líneas de plantas transgénicas (p. ej., la línea de maíz Bt-11).

El control positivo amplificará una banda de 118 pb. Los controles negativo y sin plantilla no

deben arrojar una banda visible. Si los controles positivo o negativo no dan los resultados

esperados, el análisis por PCR de las muestras seleccionadas no es válido.


118 pb, significa que la muestra contiene ADN modificado.



Detección específica mediante PCR anidada del maíz MON810, del maíz Bt-176 y de la soja Roundup Ready

Detección del maíz MON810

El sistema de detección es específico del maíz MON810. Los elementos diana son el

promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y la región de hsp70 exón1-intrón1, que

son respectivamente una secuencia reguladora constitutiva y un gen de una proteína de

choque térmico que produce un mayor nivel de transcripción.

Características de los cebadores GM1, GM2, GM3 y GM4

GM1 Secuencia TATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC Longitud 25 Peso molecular (g/mol) 7665,1 Punto de fusión * (G/C) 59,6

GM2 Secuencia TGCCCTATAACACCAACATGTGCTT Longitud 25 Peso molecular (g/mol) 7560.2 Punto de fusión * (G/C) 57.9

GM3 Secuencia ACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC Longitud 25 Peso molecular (g/mol) 7472,2 Punto de fusión * (G/C) 61,2

GM4 Secuencia GCATTCAGAGAAACGTGGCAGTAAC Longitud 25 Peso molecular (g/mol) 7722,9 Punto de fusión * (G/C) 59,6




Controles

• Control positivo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0,1 % es GM

[MON810])



en vez de ADN.

Preparación de la mezcla maestra 1



El procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de GM1 y GM2 y 2

µl de solución de ADN. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las soluciones


Cuadro 5. Mezcla maestra GM1-GM2

Concentraciónfinal


Mezcla maestrapara 10

muestras

Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido mg1 20 µM 0.5 µM 1.25 µl 12.5 µl Oligonucleótido mg2 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Agitar suavemente la mezcla maestra de GM1 y GM2 por pipeteado y centrifugar

brevemente







Programa PCR (mg1/mg2)


95 ˚C 3 min

Desnaturalización 95 ˚C 45 s Anillamiento Extensión

60 ˚C 72 ˚C

50 s 50 s

Número de ciclos 35 Extensión final 72 ˚C 3 min 4 ˚C ∞



Los reactivos necesarios para una serie de 10 muestras se mezclan siguiendo las

instrucciones indicadas en el cuadro 6. El procedimiento se aplica a una muestra con 49 µl

de mezcla maestra de GM3 y GM4 y 1 µl de solución de ADN preamplificado de la primera

PCR. Durante la preparación de la mezcla maestra todas las soluciones se guardan en

hielo.

Cuadro 6. Mezcla maestra GM3-GM4

Concentraciónfinal



muestras Agua desionizada esterilizada 33,75 µl 337,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido mg3 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido mg4 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 49 µl 490 µl





• Agitar suavemente la mezcla maestra de GM3 y GM4 por pipeteado y centrifugar

brevemente





Programa de la PCR anidada (mg3-mg4)

Temperatura Tiempo Desnaturalización

inicial

95 ˚C 3 min


60 ˚C 72 ˚C

50 s 50 s







una migración a 100 V durante 1 hora. Se emplean marcadores de tamaño (15 µl de una

escalera de 100 pb) en pocillos adyacentes del gel, de forma que pueda determinarse con

precisión el tamaño de los amplicones. Completado el ciclo, el ADN del gel puede

visualizarse mediante transiluminación ultravioleta. Para llevar un registro fiel del resultado

del ensayo, puede fotografiarse el gel.




Las parejas de cebadores mg1-mg2 y mg3-mg4 se diseñaron para la detección específica

de la transformación MON810 mediante PCR anidada, que rinde un fragmento final de PCR

anidada de 149 pb. La especificidad viene dada por el hecho de que los cebadores están

diseñados en la región que comprende el promotor E-35S y el gen exón/intrón de hsp70. El

control positivo amplificará una banda de 189 pb. Los controles negativo y sin plantilla no

deben arrojar una banda visible.




149 pb, significa que la muestra contiene ADN de maíz MON810.



Detección del maíz Bt-176

El gen diana es el gen cryIA(b), que protege la planta de insectos como el piral del maíz.

Características de los cebadores CRYIA1, CRYIA2, CRYIA3 y CRYIA4

CRYIA1 Secuencia CGGCCCCGAGTTCACCTT Longitud 18 Peso molecular (g/mol) 5394,6 Punto de fusión * (G/C) 59,5

CRYIA2 Secuencia CTGCTGGGGATGATGTTGTTG Longitud 21 Peso molecular (g/mol) 6519,2 Punto de fusión * (G/C) 57,6

CRYIA3 Secuencia CCGCACCCTGAGCAGCAC Longitud 18 Peso molecular (g/mol) 5397,6 Punto de fusión * (G/C) 61,7

CRYIA4 Secuencia GGTGGCACGTTGTTGTTCTGA Longitud 21 Peso molecular (g/mol) 6479,2 Punto de fusión * (G/C) 57,6


Controles

• Control positivo: ADN del material de referencia (maíz del que un 0,1% es GM

[Bt-176])



en vez de ADN.



y sin plantilla) se mezclan siguiendo las instrucciones indicadas en el cuadro 7. El



procedimiento se aplica a una muestra con 48 µl de mezcla maestra de CRYIA1 y CRYIA2 y



Cuadro 7. Mezcla maestra CRYIA1-CRYIA2

Concentraciónfinal



Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido CRYIA1 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido CRYIA2 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl



• Agitar suavemente la mezcla maestra de CRYIA1 y CRYIA2 por pipeteado y centrifugar

brevemente





Programa PCR (CRYIA1-CRYIA2)

Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial 95 ˚C 3 min Desnaturalización 95 ˚C 40 s Anillamiento Extensión

60 ˚C 72 ˚C

40 s 40 s







instrucciones indicadas en el cuadro 8.

El procedimiento se aplica a una muestra con 49 µl de mezcla maestra de CRYIA3 y

CRYIA4 y 1 µl de solución de ADN preamplificado de la primera PCR. Durante la

preparación de la mezcla maestra todas las soluciones se guardan en hielo.

Cuadro 8. Mezcla maestra CRYIA3-CRYIA4

Concentraciónfinal



muestras Agua desionizada esterilizada 33,75 µl 337,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido CRYIA3 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido CRYIA4 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 49 µl 490 µl



• Agitar suavemente la mezcla maestra de CRYIA3 y CRYIA4 por pipeteado y centrifugar

brevemente







Programa de la PCR anidada (CRYIA3/CRYIA4)

Temperatura Tiempo Desnaturalización inicial 95 ˚C 3 min


60 ˚C 72 ˚C

40 s 40 s













Las parejas de cebadores CRYIA1-CRYIA2 y CRYIA3-CRYIA4 se diseñaron para la

detección específica del gen sintético cryIA(b) mediante PCR anidada, que rinde un

fragmento final de PCR anidada de 149 pb. Este gen está presente en la línea del maíz Bt-

176 y en otras líneas (p. ej., la línea del maíz Bt-11).

El control positivo amplificará una banda de 189 pb.

Los controles negativo y sin plantilla no deben arrojar una banda visible.




189 pb, significa que la muestra contiene ADN de maíz Bt-176.



Detección de la soja Roundup Ready

La diana es el gen CP4 EPSPS, que confiere resistencia al herbicida Roundup.

Características de los cebadores GMO5, GMO9, GMO7 y GMO8

GM05 Secuencia CCACTGACGTAAGGGATGACG Longitud (pb) 21 Peso molecular (g/mol) 6479,4 Punto de fusión * (G/C) 59,5

GM09 Secuencia CATGAAGGACCGGTGGGAGAT Longitud (pb) 21 Peso molecular (g/mol) 6559,4 Punto de fusión * (G/C) 59,5

GMO7 Secuencia ATCCCACTATCCTTCGCAAGA Longitud (pb) 21 Peso molecular (g/mol) 6309,6 Punto de fusión * (G/C) 55,8

GM08 Secuencia TGGGGTTTATGGAAATTGGAA Longitud (pb) 21 Peso molecular (g/mol) 6579,8 Punto de fusión * (G/C) 51,7


Controles

• Control positivo: ADN del material de referencia (soja de la que un 0,1% es GM

[soja Roundup Ready])

• Control negativo: ADN del material de referencia (soja de la que un 0 % es GM)


vez de ADN.










Concentraciónfinal



Agua desionizada esterilizada 32,75 µl 327,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido GMO5 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido GMO9 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl

TOTAL 48 µl 480 µl




brevemente







Programa PCR (GMO5-GMO9)


95 ˚C 3 min





instrucciones indicadas en el cuadro 10.


1 µl de solución de ADN preamplificado de la primera PCR. Durante la preparación de la

mezcla maestra todas las soluciones se guardan en hielo.


Concentraciónfinal



muestras Agua desionizada esterilizada 33,75 µl 337,5 µl Tampón para PCR 10x 1x 5 µl 50 µl MgCl2 25 mM 2,5 mM 5 µl 50 µl dNTP 4 mM 0,2 mM 2,5 µl 25 µl Oligonucleótido GMO7 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl Oligonucleótido GMO8 20 µM 0,5 µM 1,25 µl 12,5 µl ADN polimerasa Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 49 µl 490 µl

• Preparar un tubo para microcentrifuga de 1,5 ml





brevemente





Programa de la PCR anidada (GMO7-GMO8)


95 ˚C 3 min













Las parejas de cebadores GMO5-GMO9 y GMO7-GMO8 se diseñaron para la detección

específica de la construcción genética de la soja Roundup Ready mediante PCR anidada,



que rinde un fragmento de PCR anidada de 169 pb. Los cebadores GMO5 y GMO7 son

complementarios del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor; el GM09 se hibrida

con el gen CP4 EPSPS de Agrobacterium sp., cepa CP4, y el GMO8 con el gen CTP

EPSPS.

El control positivo amplificará una banda de 169 pb.

Los controles negativo y sin plantilla no deben arrojar una banda visible. Si los controles

positivo o negativo no dan los resultados esperados, el análisis por PCR de las muestras

seleccionadas no es válido.


169 pb, significa que la muestra contiene ADN de la soja Roundup Ready.






Alimentos

Sesión nº 10

PCR Cuantitativa para la Detección de OGM

F. Weighardt

PCR Cuantitativa para la Detección de OGM 2


Índice

Sesión nº 10

PCR Cuantitativa para la Detección de OGM

Introducción 3

Métodos de cuantificación basados en la PCR 4

Historia de las técnicas de PCR en tiempo real 7

Principios de la PCR en tiempo real 7

Principios de cuantificación con la PCR en tiempo real 13

Bibliografía 20



Introducción

Una vez comprobado que un producto alimenticio ha dado positivo en relación con

una o más modificaciones genéticas (soja Roundup Ready, maíz Bt-176, maíz Bt-11,

maíz MON810 y maíz T25), los pasos analíticos posteriores consisten en determinar

si se cumple la legislación vigente (Reglamento (CE) nº 1829/2003 y Reglamento

(CE) nº 1830/2003) midiendo la cantidad de cada OGM presente en cada ingrediente

(figura 1).

Los Reglamentos mencionados disponen que todos los productos que contengan

OGM, consistan en OGM o estén producidos a partir de OGM deben ir etiquetados

como tales.

No es exigible el etiquetado de los productos que incluyan materiales que contengan

OGM, consistan en OGM o estén producidos a partir de OGM en proporción no

superior al 0,9% de los ingredientes alimenticios individualmente considerados,

siempre que esta presencia sea accidental o técnicamente inevitable.

Todos los ingredientes (harina, sémola, aceite, etc.) derivados de una misma

especie (p. ej., maíz, soja, colza, etc.) se consideran colectivamente un solo

ingrediente (p. ej., maíz).

Figura 1. No se exige etiquetado. La cantidad tanto de soja GM como de maíz GM

está por debajo del umbral legal.

Si, por ejemplo, un ingrediente derivado exclusivamente del maíz contiene menos de

un 0,9 % de maíz GM, no es necesario etiquetar el alimento obtenido a partir de él.

Por el contrario, si contiene más de un 0,9 % de maíz GM, es obligado etiquetar los

Maíz no GM99,4%

Maíz GM0,6%

Soja no GM 99,4%

Soja GM0,6%



productos alimenticios derivados. Esto es así incluso si en el producto final,

considerando la suma de todos los ingredientes derivados de especies distintas (p.

ej., soja y maíz), la cantidad relativa de maíz GM desciende por debajo del 0,9 %. Si

están presentes dos o más variedades distintas de maíz GM, habrá que sumar sus

concentraciones y utilizar el porcentaje total para determinar si es necesario o no

etiquetar (figura 2). Si la suma resultante está por debajo del umbral del 0,9 %, no

será obligado etiquetar.

Figura 2. Es necesario etiquetar en razón del ingrediente maíz. La suma de las

modificaciones Bt-11 (0,6 %) y Bt-176 (0,6 %) rebasa el umbral del 0,9 % exigido

para el etiquetado.

El contenido relativo de OGM (porcentaje) se determina normalizando la cantidad de

secuencias específicas del OGM con respecto a la cantidad de un gen específico de

la planta (p. ej., el de la lectina en el caso de la soja y los de la invertasa o la zeína

en el del maíz). El porcentaje de OGM resultante se expresa, por lo tanto, así: OGM

(%)= ADN-GM/ADN-referencia x 100.

Métodos de cuantificación basados en la PCR

Un grave inconveniente de la PCR convencional es la ausencia de información

cuantitativa exacta debido a la eficiencia de la amplificación. Si la eficiencia de la

Maíz no GM98,8%

Maíz Bt 176 0,6%

Soja no GM 100%

Maíz Bt 11 0,6%



reacción permaneciera constante para cada ciclo de amplificación, la concentración

de ADN posterior a la PCR sería directamente proporcional a la cantidad de ADN

diana inicial. Lamentablemente, la eficiencia de la amplificación varía de una

reacción a otra, así como en ciclos sucesivos de una misma reacción. En particular,

en los últimos ciclos de la PCR los productos de la amplificación se forman de

manera no exponencial y a una velocidad de reacción desconocida.

La cuantificación del ADN basada en la PCR convencional se apoya en la medición

en el punto final, a fin de conseguir la sensibilidad máxima, cuando la amplificación

alcanza el rendimiento máximo (la denominada «fase meseta»). En esta etapa la

reacción ha superado la fase exponencial, a causa fundamentalmente del

agotamiento de los reactivos y de la inactivación térmica gradual de la polimerasa

utilizada. Por ello, la correlación resultante entre la concentración del producto final y

el número de moléculas diana iniciales es limitada.

Para superar este problema se han desarrollado técnicas como la PCR competitiva

cuantitativa (PCR-CC) y la PCR en tiempo real, que se proponen establecer una

relación entre la concentración de ADN diana y la cantidad de producto de la PCR

generada por la amplificación.

PCR competitiva cuantitativa

Uno de los primeros métodos de PCR cuantitativa desarrollados es la PCR

competitiva cuantitativa (Giacca et al., 1994; Studer et al., 1998; Hardegger et al.,

1999). Este método se basa en la coamplificación de la plantilla de ADN diana y

cantidades definidas de un patrón de ADN interno (competidor) que portan los

mismos sitios de unión del cebador. Dado que se conoce la cantidad de competidor

inicial y que la eficiencia de la amplificación es la misma en los ADN competidor y

diana, la proporción de las cantidades de los dos productos de la PCR, determinada

por ejemplo mediante electroforesis en gel, es representativa de la proporción de los

ADN diana y competidor presentes en la mezcla de reacción antes de la

amplificación.

Normalmente un competidor es un plásmido linearizado que lleva la misma

secuencia de nucleótidos que el ADN diana, salvo una supresión o inserción que

permite, una vez coamplificado, obtener dos bandas de distinto tamaño tras una

electroforesis de geles estándar.



ADN amplificado de la diana

ADN amplificado del competidor

Figura 3. Coamplificación de una cantidad fija de ADN diana con distintas

cantidades de ADN competidor.

La PCR competitiva se ha utilizado con éxito para cuantificar tanto el ADN como en

ARN, pero su intervalo dinámico se limita a una proporción diana/competidor

comprendida entre aproximadamente 1:10 y 10:1. De hecho, la máxima exactitud se

obtiene encontrando el punto de equivalencia en el que la proporción

diana/competidor es 1:1 (figura 3). Para conseguir una proporción adecuada, habrá

que ensayar varias diluciones.

Otro inconveniente de este método es la necesidad de construir y caracterizar un

competidor diferente para cada diana que se vaya a cuantificar. En realidad, incluso

diferencias pequeñas en la eficiencia de la amplificación pueden comprometer

gravemente la exactitud de la cuantificación mediante la PCR competitiva

cuantitativa. Por último, al final de la reacción, la PCR competitiva exige una

cuantificación adecuada de los amplicones de la diana y del competidor, lo que suele

exigir un laborioso tratamiento ulterior.

La PCR competitiva es un método semicuantitativo que comporta la comparación de

un patrón (el competidor) con la muestra. Los resultados solo pueden indicar un

valor inferior, igual o superior a una concentración patrón definida.

No obstante, el sistema de la PCR competitiva tiene la ventaja de que los

laboratorios no necesitan adquirir equipos especializados, ya que puede aplicarse

con el instrumental habitual de un laboratorio de biología molecular y PCR.

PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real representa una metodología de la PCR más exacta y más

utilizada actualmente. Al contrario que en el caso de las determinaciones en el punto

final, los sistemas de PCR en tiempo real monitorizan la reacción a medida que tiene

lugar. En este tipo de sistema, la PCR se acopla a la emisión de una señal

fluorescente proporcional a la cantidad de producto de la PCR producido en ciclos

posteriores. Esta señal se intensifica proporcionalmente a la cantidad de producto de



la PCR generado en cada ciclo de reacción sucesivo. Registrando la cantidad de

emisión fluorescente en cada ciclo, es posible monitorizar la PCR durante su fase

exponencial. El primer incremento significativo de la fluorescencia se correlaciona

con la cantidad inicial de plantilla diana (Ahmed, 2002).

Historia de las técnicas de PCR en tiempo real

Higuchi et al. (1992,1993) fueron los pioneros del análisis de la cinética de la PCR al

diseñar un sistema capaz de detectar los productos de la PCR a medida que se

acumulan. Este sistema «de tiempo real» incluía la molécula intercalante de bromuro

de etidio en cada mezcla de reacción. Para llevar a cabo las rondas se utilizaba un

termociclador adaptado para irradiar las muestras con luz ultravioleta y capaz de

detectar la fluorescencia resultante con una cámara CCD (dispositivo de

acoplamiento de cargas) controlada por ordenador y refrigerada. A medida que

´tenía lugar la amplificación, se producían cantidades crecientes de ADN bicatenario,

con bromuro de etidio intercalado, que inducían un aumento de la fluorescencia. Al

representar gráficamente la emisión de luz fluorescente frente al número de ciclo, el

sistema producía gráficos de la amplificación que daban una imagen más completa

del proceso de la PCR que el estudio de la acumulación del producto tras un número

de ciclos fijo.

Principios de la PCR en tiempo real

La especificidad del método de la PCR en tiempo real depende de las sustancias

utilizadas para generar y monitorizar la reacción de amplificación y del instrumento

utilizado para monitorizar la señal. Se han desarrollado varias sustancias al efecto:

colorantes de intercalación (bromuro de etidio, SYBR Green I) y sondas de

hibridación (sondas TaqMan, sondas FRET, balizas moleculares, Scorpions y

sondas TaqMan Minor Groove Binder).

PCR en tiempo real con uso del colorante SYBR Green I

La primera aplicación de la PCR en tiempo real derivó directamente de los

experimentos de Higuchi et al. (1992, 1993), sin más que sustituir el bromuro de

etidio por un agente intercalante del ADN bicatenario, fluorescente, menos tóxico y

más específico y sensible (entre 10 y 25 veces), el SYBR Green I (Haugland, 2002).

El colorante SYBR Green I se une al surco menor del ADN bicatenario, pero no al

ADN monocatenario. A consecuencia de esta unión, se potencia enormemente



(entre 800 y 1 000 veces) la fluorescencia (excitación aprox. a 488 nm y 254 nm;

emisión aprox. a 560 nm). Al iniciarse la PCR, el aumento de la cantidad de ADN

recién sintetizado produce un incremento de la señal fluorescente (Figura 4). No

obstante, el sistema de detección de secuencias basado en el SYBR Green I

presenta una limitación, que es la falta de especificidad de su modo de

reconocimiento del ADN. Por este motivo, se cuantifican todas las moléculas de ADN

bicatenario presentes en una PCR, incluidos los productos de la PCR no específicos

y los dímeros de los cebadores. Para resolver este problema y sustraer el

componente de la cuantificación debido a los ADN no específicos y a los dímeros de

cebadores en algunos dispositivos, es posible realizar un análisis de la curva de

fusión. Tras la fase final de la PCR, los productos se funden lentamente y se recogen

los datos de fluorescencia. Toda vez que cada ADN bicatenario tiene una

temperatura de fusión específica, es posible cuantificar los componentes que tienen

temperaturas de fusión diferentes en una única mezcla de reacción, eliminando así

de la cuantificación los componentes no específicos.

Métodos de la PCR en tiempo real basados en sondas específicas para una secuencia

El problema de la especificidad de la detección por fluorescencia del amplicón se ha

resuelto utilizando sondas específicas para una secuencia con un marcado

fluorescente diseñado en el interior del par de cebadores de la PCR. El proceso de

hibridación (y degradación final) de la sonda no suele interferir con la acumulación

exponencial del producto de la PCR. Se utilizan ahora unos pocos principios

diferentes para conseguir reacciones de cuantificación basadas en la PCR en tiempo

real específicas.

Sondas FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente) La FRET se basa en la transferencia de energía de un fluoróforo donador a un

fluoróforo aceptor (figura 4) (Haugland, 2002). Las condiciones básicas de la FRET

son:

• Las moléculas del donador y del aceptor deben estar muy próximas (habitualmente

10–100 Å).

• El espectro de absorción del aceptor debe solaparse con el espectro de emisión de

fluorescencia del donador.



• Las orientaciones de los dipolos de transición del donador y el aceptor deben ser

aproximadamente paralelas.

Si los fluoróforos donador y aceptor están muy próximos, la excitación del donador

por la luz azul desencadena una transferencia de energía al aceptor, que entonces

puede emitir luz de una longitud de onda mayor. La formación de productos de la

PCR puede monitorizase utilizando dos sondas de oligonucleótidos con

específicidad de secuencia con una marca fluorescente, denominadas sondas de

hibridación, además de los cebadores de la PCR. Las sondas de hibridación se

diseñan como pares en los que una sonda se marca con el colorante donador (3’-

fluorescina) y la otra con el aceptor (5’- Red 640 o 5’-Red 705). Dado que la FRET

disminuye con la sexta potencia de la distancia, es necesario diseñar las sondas de

hibridación de manera que se hibriden a regiones adyacentes de la plantilla de ADN

(usualmente están separadas por una distancia de 1-5 nucleótidos). Si se hibridan

ambas sondas, los dos colorantes se aproximan mucho y la FRET al colorante

aceptor produce una señal mensurable mediante fluorometría.

Sondas de degradación (principio TaqMan) El ensayo TaqMan aprovecha la actividad exonucleásica 5' - 3' de la ADN

polimerasa Taq para dividir una sonda de degradación durante la PCR (Lie y

Petropoulos, 1998). La sonda de degradación, o TaqMan, suele ser un

oligonucleótido de 20-30 bases de longitud (usualmente con una Tf 10 °C superior a

la Tf de los cebadores) que contiene un colorante delator fluorescente en el extremo

5' y un colorante inhibidor en el 3' (figura 4). Al estar bloqueado el extremo 3', la

sonda no puede extenderse como un cebador. Durante la PCR, en presencia de una

diana, la sonda se hibrida específicamente entre los sitios de los cebadores directo e

inverso. Cuando la sonda está intacta, la proximidad del colorante delator al

colorante inhibidor produce la supresión de la fluorescencia delatora principalmente

por transferencia de energía de tipo Forster (Forster, 1948; Lakowicz, 1983). Durante

la reacción, la actividad exonucleásica 5’-3’ de la ADN polimerasa Taq degrada la

sonda entre los colorantes delator e inhibidor solamente si la sonda se hibrida con la

diana. De esta manera, la fluorescencia aumenta a medida que progresa la

amplificación. La acumulación de producto de la PCR se detecta monitorizando el

incremento de la fluorescencia del colorante delator. Este proceso tiene lugar en

cada ciclo y no interfiere con la acumulación exponencial del producto. Las sondas

de degradación, a diferencia de las FRET, liberan fluorocromos en cada ciclo,

añadiendo más colorante al previamente liberado. En consecuencia, la señal



fluorescente se potencia considerablemente en cada ciclo. El ensayo TaqMan utiliza

unos parámetros de los ciclos térmicos y unas condiciones de la PCR que son

universales. Las sondas fluorogénicas exigen, eso sí, que no haya G en el extremo

5'. Una G adyacente al colorante delator inhibe la fluorescencia incluso tras la

división.

Figura 4.Diferentes

principios de la

PCR en tiempo real.

I. SYBR green I.

II. Sondas FRET

(transferencia de energía de

resonancia

fluorescente).

III. Sondas de

degradación TaqMan 5`

III. Sondas TaqMan

II. Sondas de hibridación

I. SYBR Green



Balizas moleculares Las balizas moleculares son sondas de ADN diseñadas para contener una estructura

en forma de piruleta. La secuencia del abultamiento de la piruleta es complementaria

de la diana específica de la sonda y las secuencias del estrechamiento se diseñan

de manera que sean mutuamente complementarias (figura 5) (Tyagi y Kramer,

1996). Los extremos 5’ y 3’ de la sonda se unen covalentemente a un fluoróforo y a

un inhibidor. Cuando se cierra la estructura de piruleta, el fluoróforo y el inhibidor se

aproximan. En este caso, todos los fotones emitidos por el fluoróforo son absorbidos

por el inhibidor. En presencia de una secuencia complementaria, la sonda se

despliega y se hibrida con la diana. El fluoróforo se ve desplazado del inhibidor y la

sonda inicia su fluorescencia.

Figura 5. Principio de las balizas moleculares.

Scorpions Otra posibilidad es la que ofrece la familia de sondas denominadas Scorpions. Un

Scorpion consiste en una secuencia de sonda específica con estructura de piruleta

(figura 6) (Thelwell et al., 2000). Se une un fluoróforo al extremo 5' y la señal fluorescente que da es inhibida en la

estructura de piruleta por una fracción unida al extremo 3'. La piruleta se une al

extremo 5' de un cebador. Tras la extensión del cebador del Scorpion, durante la

amplificación, la secuencia de sonda específica puede unirse a su complemento

dentro de la misma hebra de ADN. Esta hibridación abre el abultamiento de la



piruleta de manera que deja de inhibirse la fluorescencia y puede observarse un

incremento de la señal. Un bloqueante de la PCR situado entre el cebador y la

secuencia del estrechamiento evita que pase a leerse el abultamiento de la piruleta,

lo que podría ocasionar su apertura en ausencia de la secuencia diana específica. El

carácter unimolecular de la hibridación presenta ciertas ventajas con respecto a los

sistemas de sonda homogénea. A diferencia de los ensayos con balizas

moleculares, TaqMan o FRET, los ensayos con Scorpion no requieren una sonda

independiente aparte de los cebadores.

Figura 6. Principio de las sondas Scorpion.

Sondas TaqMan MGB Un MGB (enlazante al surco menor) es una pequeña molécula en forma de media

luna que encaja muy bien en el surco menor del ADN bicatenario (Kutyavin et al.,

2000). En las sondas TaqMan, el grupo MGB está unido al extremo 3' junto con el

colorante inhibidor (figura 7). Cuando la sonda TaqMan se hibrida, el MGB estabiliza

el apareamiento incorporándose al surco menor del ADN bicatenario creado entre la

sonda y la secuencia diana. La estabilización es mucho más eficaz cuando las

Cebador

Extensión

Hibridación

Desnaturalización



secuencias coinciden perfectamente (es decir, no hay desparejamiento). Además del

superior potencial discriminador, la mayor estabilidad hace que las sondas TaqMan

MGB sean muy cortas (normalmente de 13 a 20 bases) en comparación con las

sondas TaqMan estándar (de 18 a 40 bases), sin detrimento del respeto de las

directrices de diseño. Las sondas TaqMan MGB presentan varias ventajas para la

PCR cuantitativa, especialmente para los ensayos Múltiples. El mejor rendimiento

espectral hace posible una precisión y una coherencia superiores entre los distintos

ensayos, y la mayor especificidad de la hibridación permite una discriminación más

precisa de las dianas. Además, al ser la sonda más pequeña se facilita el diseño de

ensayos, pues las sondas se pueden encajar en regiones diana más cortas, tales

como «ventanas» de consenso entre conservación o divergencia de la secuencia. El

tamaño del amplicón puede reducirse al mínimo utilizando sondas MGB más cortas

que pueden contribuir a mejorar la coherencia entre ensayos.

Figura 7. Principio de las sondas MGB.

Principios de cuantificación con la PCR en tiempo real

Cuantificación relativa El contenido en OGM de una muestra puede expresarse como la cantidad de

material modificado genéticamente en la cantidad total de material. Para determinar

este valor en un sistema basado en la PCR en tiempo real es necesario medir el

número de secuencias de ADN de un gen de referencia endógeno (para usarlo como



«normalizador»), así como el número de secuencias de ADN diana específicas del

OGM. El gen de referencia debe escogerse de manera que sea específico de la

especie, presente en una sola copia por genoma haploide, representado como tal de

manera estable en líneas diferentes de la misma especie y tan amplificable como los

caracteres GM en el análisis (aunque esto se deba más a un buen diseño de

cebadores-sonda). En la cuantificación relativa se plantea un problema debido a la

interpretación del porcentaje de contenido de OGM, que no se especifica en la

legislación; por consiguiente, puede entenderse como contenido en OGM (en

porcentaje) el peso del ingrediente modificado puro en relación con el peso total del

ingrediente puro (p. ej., peso de maíz GM con respecto al peso total del maíz

contenido en la muestra). Desde un punto de vista analítico, es conveniente calcular

el porcentaje de OGM como el número de secuencias de ADN diana por secuencia

específica de taxón diana, pero esta definición no incorpora algunas características

importantes de las líneas de OGM; por este motivo, es preciso sopesar

cuidadosamente los siguientes parámetros en la interpretación de los resultados:

a) La ploidía de la transformación. Es posible que la modificación genética tenga una

ploidía diferente de la de la transformación wt (p. ej., tetraploide en vez de diploide).

b) La cigosidad del evento. El carácter GM podría ser homocigótico o heterocigótico.

c) El número de inserciones por genoma haploide de una única construcción

genética artificial. Un construcción genética se puede insertar en una única copia por

genoma haploide o en varias copias.

El punto c) puede obviarse diseñando el sistema cebador-sonda en la frontera de la

inserción de la construcción genética en el genoma. Como las secuencias de

frontera son únicas, el sistema así construido presentará la doble ventaja de ser

específico de la transformación y excluir de la cuantificación las inserciones múltiples

de la misma construcción genética. Los puntos a) y b) se resuelven empíricamente

utilizando materiales de referencia que sean homogéneos con la muestra (p. ej.,

material de referencia de harina de maíz para cuantificar la harina de maíz).

Alternativamente, pueden calibrarse patrones de cuantificación diferentes de los

materiales de referencia certificados (p. ej., secuencias de ADN clonadas o mezclas

de ADN genómico) utilizando materiales de referencia certificados a fin de corregir

las discrepancias moleculares en la cuantificación. Una manera ampliamente

aceptada de solventar los problemas relacionados con los puntos a) y b) es expresar

el porcentaje de OGM en términos de genomas haploides.

En cualquier caso, es preciso tener en cuenta este aspecto de la cuantificación al

desarrollar el método, dado que el límite de detección (LOD) y el límite de



cuantificación (LOQ) se ven influidos por el número real de copias que se

cuantifican.

Diseño de un experimento de cuantificación de OGM en tiempo real El diseño de un análisis de la PCR en tiempo real debe incluir los siguientes

componentes:

- Un sistema de PCR diseñado para detectar una secuencia de ADN diana

específica de un OGM.

- Un segundo sistema de PCR diseñado para detectar una secuencia de referencia

endógena, posiblemente específica de la especie, pero que se pueda utilizar como

«normalizador» en los cálculos de la concentración o las concentraciones relativas

de OGM.

- Curvas patrón para la diana y la referencia endógena. Para cada muestra

experimental, se determina la cantidad de diana y de referencia endógena a partir de

la curva patrón adecuada. La cantidad de diana se normaliza con la cantidad de

referencia endógena para obtener la concentración relativa de la diana. Para

satisfacer los requisitos estadísticos, las curvas patrón deben incluir por lo menos 4

puntos de concentración distintos. Cada punto de la curva patrón, así como la

muestra, debe cargarse al menos por triplicado.

Además, habrá que añadir un control negativo (NTC o control sin ADN molde) tanto

respecto al gen de referencia como a las cuantificaciones de OGM. Pueden utilizarse

también otros controles (p. ej., control negativo de la diana de ADN y control positivo

de la diana de ADN).

Por último, la cuantificación del gen de referencia y de la secuencia específica del

OGM debe tener lugar en el mismo ciclo de PCR (coamplificación), no en ciclos

diferentes, para evitar una posible fluctuación estadística entre experimentos

distintos.

PCR en tiempo real Múltiplex Dependiendo de las sustancias y del instrumental utilizados en la cuantificación, es

posible diseñar PCR en tiempo real para llevar a cabo la cuantificación de las

secuencias de referencia y OGM por separado en tubos distintos o en los mismos

tubos en tanto que reacción «Múltiplex».

Ambas posibilidades tienen sus ventajas y sus inconvenientes. Con las reacciones

múltiples se ahorran tiempo y reactivos (es posible analizar el doble de muestras en

un único experimento) y se evitan los errores de configuración entre la medida del



gen de referencia y del gen diana del OGM, al producirse en el mismo tubo, pero

resultan menos sensibles (en términos de LOQ) a causa de la interferencia entre las

dos reacciones y del distinto consumo de reactivos en ambas. El uso de reacciones

separadas para medir el gen de referencia y el gen diana del OGM, por su parte,

permite obtener mayor sensibilidad en términos de LOQ, pero exige disponer del

doble de reactivos y de pocillos en el equipo de PCR en tiempo real, y es mayor el

riesgo que suponen, p. ej., los errores de pipeteado, al medir una muestra. La

disponibilidad de múltiples colorantes delatores para las sondas TaqMan permite

detectar la amplificación de más de una diana en el mismo tubo. El colorante delator

(FAM) puede distinguirse del otro (VIC) gracias a las diferentes longitudes de onda

de sus máximos de emisión. Así por ejemplo, la disponibilidad de múltiples

colorantes con distintas longitudes de onda de emisión (FAM, TET, VIC y JOE)

permite realizar ensayos TaqMan Múltiplex. El colorante TAMRA se usa como

inhibidor en la sonda y el ROX como referencia pasiva en la mezcla de reacción. Se

recomienda la combinación de FAM (diana) y VIC (control endógeno) para obtener

los mejores resultados, ya que la diferencia entre sus máximos de emisión es la más

amplia. Por el contrario, JOE y VIC nunca deben combinarse. La realización de

ensayos TaqMan Múltiplex en los sistemas de detección de secuencias ABI PRISM

7700, 7900, 7500, 7300 y 7000 es posible gracias a su capacidad para detectar

colorantes múltiples con longitudes de onda de emisión distintas.

Análisis gráfico de los datos de una PCR en tiempo real A medida que progresa la PCR, se recogen datos sobre fluorescencia (valores Rn)

para construir un gráfico de la cantidad de señal frente al número de ciclo (es decir,

el tiempo). Habitualmente el gráfico se construye a escala semilogarítmica. En la

PCR en tiempo real es posible distinguir tres fases distintas: una primera fase de

«latencia» con ligeras fluctuaciones en los valores correspondientes a la señal de

fondo; una segunda fase exponencial, con valores que se incrementan en paralelo, y

una tercera fase en la que los valores tienden a situarse en una «meseta» (figura 8).



Figura 8. Gráfico de la PCR en tiempo real. Se señalan las fases típicas de una PCR

en tiempo real.

Si la PCR en tiempo real constituye una herramienta potente, esto se debe a que la

cuantificación no se produce en la fase final de la reacción (la meseta), sino en la

fase en que el crecimiento exponencial de la cantidad de ADN amplificado (Rn)

alcanza un valor significativamente superior a la señal de fondo. Al medir de esta

manera, mejora considerablemente la exactitud de la cuantificación, ya que existe

una correlación directa entre la cantidad de plantilla inicial y la fase en la que la

amplificación empieza a ser exponencial. En la PCR en tiempo real, se define

experimentalmente como ciclo umbral (CT) aquel ciclo en que la señal de

fluorescencia alcanza el valor medio de las señales de fluorescencia medidas entre

el ciclo tercero y el decimoquinto incrementado en diez desviaciones estándar.

Cuanto mayor es la cantidad inicial de ADN genómico, antes se detecta el producto

acumulado en el proceso de la PCR, y más bajo es el valor CT. En la práctica, a

menudo es el operador el que elige la línea umbral que determina el valor CT, lo que

constituye uno de los elementos subjetivos de la PCR en tiempo real. La línea

umbral debe situarse por encima de cualquier actividad basal y dentro de la fase de

crecimiento exponencial, que adquiere forma lineal en la transformación logarítmica

(todas las líneas son paralelas). Debe situarse siempre en el nivel en que empiezan

a coincidir más los gráficos de las réplicas. A veces las réplicas presentan, al

Fase exponencial

Valor umbral

Fluorescencia de fondo

Intervalo «meseta»



comienzo de la fase exponencial, una ligera divergencia que se atenúa o desaparece

según progresa la reacción.

Cálculo del contenido en OGM El resultado de una PCR en tiempo real es un valor ∆Rn, diferencia entre Rn+ (señal

de fluorescencia que incluye todos los componentes) y Rn- (señal de fondo de la

reacción – línea de base de la lectura de una muestra de control sin plantilla). El contenido de OGM de una muestra se puede determinar de dos maneras:

1. Se trazan dos curvas patrón, basadas en cantidades distintas de ADN:

- la primera con un sistema de cuantificación específico para el gen de referencia;

- la segunda con un sistema de cuantificación específico para la diana GM.

Para cada muestra, se determinan mediante interpolación con la curva patrón las

cantidades correspondientes a la diana específica y al gen de referencia. Luego se

calcula el contenido (porcentaje) de ADN GM como el cociente entre la cantidad de

la secuencia diana GM y la cantidad de la secuencia del gen de referencia

(GM/referencia * 100). Conviene tener presente que, necesariamente, las muestras analizadas deben estar

situadas entre los límites inferior y superior de ambas curvas patrón. Es preciso

excluir los valores atípicos, ya que suelen relacionarse con errores de cuantificación. 2. Método de comparación de CT (∆∆CT): En este método no se usan cantidades

conocidas de patrones, sino que se compara la cantidad relativa de la secuencia

diana del OGM con la secuencia del gen de referencia. La curva patrón se obtiene

cargando una serie de muestras con concentraciones diferentes y conocidas del

OGM (p. ej., materiales de referencia certificados del IRMM). El resultado es una

curva patrón de valores ∆∆CT (∆CT = CT gen de referencia - CT OGM). El contenido de OGM

se obtiene calculando el valor ∆CT de la muestra y comparándolo con los valores

obtenidos con los patrones. Para que este método dé buenos resultados, es preciso que las eficiencias de

amplificación de los sistemas de PCR diana y de referencia sean similares. Una

manera sensible de controlarlo es fijarse en cómo varía ∆CT (la diferencia entre los

dos valores CT de dos PCR correspondientes a la misma cantidad inicial de plantilla)

con la dilución de la plantilla. Si las eficiencias de los dos amplicones son

aproximadamente iguales, la representación gráfica del logaritmo de la cantidad

frente a ∆CT será una línea casi horizontal (pendiente <0,10). Esto significa que

ambas PCR tienen la misma eficiencia en el intervalo de cantidades de plantilla

iniciales. Si el gráfico pone de manifiesto que la eficiencia es desigual, deberá

aplicarse el método de la curva patrón para cuantificar los OGM. Debe determinarse



el intervalo dinámico para: 1) las concentraciones mínima y máxima de las dianas

para las que los resultados son exactos y 2) las razones mínima y máxima de dos

cantidades de gen para las que los resultados son exactos. En la PCR en tiempo

real competitiva convencional, el intervalo dinámico se limita a una proporción

diana/competidor de aproximadamente 10:1 a 1:10 (la máxima exactitud se obtiene

para una proporción 1:1). La PCR en tiempo real puede conseguir un intervalo

dinámico mucho más amplio.



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Tyagi, S. y Kramer, F.R. (1996). Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon

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Vaïtilingom, M., Pijnenburg, H., Gendre, F. y Brignon, P. (1999). Real-time

quantitative PCR detection of genetically modified Maximizer maize and Roundup

Ready soybean in some representative foods. Journal of Agricultural Food Chemistry

47, 5261–5266.






Alimentos

Sesión nº 11

Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante PCR en Tiempo Real

N. Foti

Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante la PCR en Tiempo Real 2


Índice

Sesión nº 11

Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante PCR en Tiempo Real

Práctica 3

Introducción 3

PCR en tiempo real utilizando el ABI PRISM 7700 3

PCR en tiempo real utilizando el lightcycler (Roche) 9

Bibliografía 15



Práctica

Introducción

Los protocolos siguientes son métodos basados en la PCR en tiempo real para la

cuantificación de una línea de soja GM específica (soja Roundup Ready) en material

bruto y transformado. Las cuantificaciones de la PCR en tiempo real se llevan a

cabo con dos termocicladores de PCR distintos equipados para detectar la

amplificación en tiempo real midiendo la fluorescencia: el ABI PRISM 7700 SDS

(Applied Biosystems) y el LightCycler (Roche).

La PCR en tiempo real se utiliza para amplificar una secuencia de ADN diana de

referencia endógena (particular de la soja), más una secuencia de ADN diana que

indica la presencia de soja genéticamente modificada (soja Roundup Ready).

Ambos ensayos comprenden dos sistemas de PCR independientes, cada uno de

ellos con sus propios cebadores de ADN y sondas marcadas por colorantes. Un

sistema de PCR detecta una secuencia de ADN diana específica del OGM y el otro

es un sistema de referencia endógeno que actúa como referencia cuantitativa para

detectar soja GM y no GM.

Nota: Los protocolos que figuran en el presente Manual se han seleccionado por su

valor didáctico y deben considerarse ejemplos básicos de cuantificación de OGM

mediante el método de la PCR en tiempo real. Recomendamos la consulta periódica

de las fuentes y la bibliografía pertinentes para conocer los protocolos desarrollados

y validados más recientemente. Nótese además que estos protocolos se han

seleccionado en función del instrumental disponible en nuestro laboratorio. Ni el CCI

ni la OMS promueven en modo alguno el uso exclusivo de una marca comercial

concreta.

PCR en tiempo real utilizando el ABI PRISM 7700

Protocolo de la PCR en tiempo real específica de la soja RR: método de PCR Múltiplex

Este método consiste en una amplificación/cuantificación del gen de referencia de la

lectina y una parte del casete insertado de soja RR utilizando un ensayo de PCR

Múltiplex (dos PCR en el mismo tubo) (Foti et al., 2006). Las sondas TaqMan de

lectina y RR se marcan con los colorantes VIC y FAM respectivamente, lo que



permite detectar la amplificación de más de una diana en el mismo tubo. El colorante

«delator» (FAM) puede distinguirse del VIC gracias a las diferentes longitudes de

onda de sus máximos de emisión. El ABI PRISM 7700 SDS es capaz de detectar

múltiples colorantes con longitudes de onda de emisión distintas.

La cantidad de colorante de la soja RR (FAM) se normaliza con la cantidad de

colorante de la materia vegetal (VIC) detectada en cada muestra. Se obtiene así un

valor ∆CT para cada muestra replicada, que se promedia. Estos valores se comparan

con una curva de calibración obtenida del ∆CT de los patrones con concentración

conocida de soja RR (método CT comparativo o ∆∆CT).

Este procedimiento ha sido aplicado con éxito a varias materias primas, ingredientes

y alimentos que contienen soja (p. ej., piensos, bebidas de soja, yogures, harinas,

lecitina, etc.).

El rendimiento analítico del método ha sido comprobado satisfactoriamente durante

varios procedimientos de ensayo de la aptitud (p. ej., FAPAS, GIPSA).

Instrumental y reactivos

• Sistema detector de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems)

• Placas de reacción de 96 pocillos MicroAmp Optical (Nº Cat. N801-0560)

• Tapas MicroAmp Optical (Nº Cat. N801-0935)

• Mezcla maestra de PCR universal TaqMan (Nº Cat. 4304437) 2X con el siguiente

contenido: ADN polimerasa AmpliTaq Gold en Tampón TaqMan 2x (5U/µl),

AmpErase UNG (1U/ml), dNTP 200 µM con dUTP, Referencia pasiva 1


• Centrifugadora refrigerada para tubos cónicos de 15 ml

• Micropipetas




• Tubos de centrifugación cónicos de polipropileno de 15 ml

• Agua sin nucleasa

• Cebadores específicos (Le-F y Le-R) y sonda (Le-Probe) del gen de referencia

• Cebadores específicos (RR-F y RR-R) y sonda (RR-Probe) del transgén.



Características de los cebadores y la sonda del gen de referencia

Características de los cebadores y la sonda del transgén

RR-F

Secuencia GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT Longitud (pb) 23 Peso molecular 7014

RR-R Secuencia GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C Longitud (pb) 25 Peso molecular 7712

RR-Probe Secuencia 5’-(FAM)-CTT GAA AGA TCT GCT AGA

GTC AGC TTG TCA GCG-(TAMRA)-3' Longitud (pb) 33 Peso molecular 10137

Le-F Secuencia TCC ACC CCC ATC CAC ATT T Longitud (pb) 19 Peso molecular 5586,0

Le-R Secuencia GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA Longitud (pb) 24 Peso molecular 7532

Le-Probe Secuencia

5’-(VIC)-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-(TAMRA)-3'

Longitud (pb) 23 Peso molecular 7019,0




• Descongelar, agitar suavemente y centrifugar la cantidad de componentes que exige

la reacción. Los reactivos descongelados deben mantenerse en hielo.

• A uno de los tubos de centrifugación de 15 ml mantenido en hielo, añadir los

siguientes componentes en el orden en que se mencionan (salvo el ADN) para

preparar las mezclas maestras. Cada extracto de ADN se analizará por triplicado.

Nótese que se preparan cuatro mezclas de reacción más para ayudar a calcular los

errores de pipeteado debidos a la viscosidad de la solución.

Cuadro 1. Preparación de la mezcla maestra para una placa de ensayo de PCR Múltiplex.

Concentra-ción en la

PCR

Mezcla maestra para el

recipiente de reacción

(µl)


(3 repeticiones)

Mezcla maestrapara una placa(32+4 muestras)

Agua desionizada estéril 18,3 54,9 1976,4 Mezcla maestra universal TaqMan 2X

1x 25 75 2700

Cebador Le-F (20 µM) 40 nM 0,1 0,3 10,8 Cebador Le-R (20 µM) 40 nM 0,1 0,3 10,8 Cebador RR-F (20 µM) 100 nM 0,25 0,75 27 Cebador RR-R (20 µM) 100 nM 0,25 0,75 27 Sonda Le-Probe (10 µM) 100 nM 0,5 1,5 54 Sonda RR-Probe (10 µM) 100 nM 0,5 1,5 54 ADN 50-250 ng 5 15 TOTAL 50 150

• Agitar suavemente y centrifugar brevemente.

• Preparar un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml para cada muestra de ADN que

se vaya a someter a ensayo: muestras de curvas patrón (soja RR–CRM al 0,1, 0,5,

1, 2, y 5 %) muestras desconocidas y muestras de control (0 % de soja RR, ADN de

soja RR y control sin plantilla o NTC).

• Añadir a cada tubo de microcentrifugación la cantidad de mezcla maestra necesaria

para 3 repeticiones (135 µl de mezcla maestra). Añadir a cada tubo la cantidad de

ADN necesaria para 3 repeticiones (es decir, 15 µl de ADN). Agitar en el mezclador

de torbellino al menos tres veces durante aproximadamente 10 segundos. Este paso



es muy importante, ya que contribuye a reducir al mínimo la variabilidad entre las

cuatro réplicas de cada muestra.

• Pasar brevemente por una microcentrífuga. Colocar la placa de reacción de 96

pocillos sobre una base y verter una alícuota de 50 µl en cada pocillo

horizontalmente de izquierda a derecha. Tras añadir las mezclas maestras a una fila

vertical de pocillos, cubrirlos con tapas ópticas utilizando el instrumento

correspondiente.

Nota: no debe escribirse en la placa óptica ni tocar la tapa.

• Cerciorarse de que las alícuotas de mezcla maestra cargadas están en el fondo de

los pocillos, sin que haya salpicaduras ni burbujas en los lados o las tapas.

• Colocar la placa en el instrumento ABI PRISM 7700; abrir una nueva ventana de

configuración de placa para asignar el tipo de muestra a cada pocillo: el tipo de

muestra de control interno (IPC) está asociado al colorante VIC y la incógnita

(UNKN) a la capa de colorante FAM.

• Someter las muestras a los ciclos descritos en el cuadro 2.

Cuadro 2. Programa de ciclos del ensayo Múltiplex de la soja RR en el SDS ABI PRISM 7700. Seleccionar: Modo PCR en tiempo real

Volumen de reacción de 50 µl

Paso: Fase T °C Tiempo Adquisición Ciclos 1 UNG 50o C 120 s No 1x 2 Desnaturalización inicial 95o C 600 s No 1x 3 Amplificación Desnaturalización 95o C 15 s No 45x 4 Hibridación y

extensión 60o C 60 s Medida

Análisis de los datos e interpretación de los resultados

Una vez completada la ronda, se analizan los datos usando el software del SDS ABI

PRISM 7700, obteniéndose los valores CT de cada colorante delator para cada

muestra.

Es importante numerar correctamente las muestras en la ventana Plate Setup del

software del SDS. Cada pocillo debe recibir un número único en el campo Replicate;

las réplicas de la misma muestra deben recibir el mismo número.



Se analiza la ronda seleccionando analyse en el menú de análisis para acceder

automáticamente a la ventana de gráfico de amplificación; se ajusta el valor umbral

para las capas FAM y VIC.

Tras el análisis, se exportan los resultados de la ronda en un archivo excel. Al abrir

el archivo de resultados exportado en Microsoft Excel, aparecerá un cuadro que

contendrá dos conjuntos de datos correspondientes a las capas de colorante FAM y

VIC con los valores CT de cada pocillo.

Se calculan los promedios CT (FAM) y CT (VIC) de cada grupo de réplicas para

calcular los valores ∆CT (CT FAM – CT VIC).

Para cada muestra, se calcula el porcentaje de OGM analizando el ∆CT de la

muestra, comparándolo con el conjunto de valores log (% OGM) y ∆CT obtenidos del

conjunto de patrones de concentración.



PCR en tiempo real utilizando el LightCycler (Roche)

Protocolo de la PCR en tiempo real específica de la soja RR

Este método consiste en una amplificación/cuantificación del gen de referencia

lectina y una parte del casete insertado de soja RR, realizadas en dos reacciones

PCR independientes (BgVV, EU Tender Report, 2000). Los dos sistemas de PCR

utilizan sondas marcadas con FAM.

Para cada muestra, se determina la cantidad de secuencias específicas de soja GM

y la secuencia del gen de referencia (lectina) a partir de las adecuadas curvas patrón

preparadas, tanto para el transgén, como para el gen de referencia. El contenido de

soja GM se divide por la cantidad de gen de referencia, obteniéndose así un valor

normalizado de soja GM.

Instrumental y reactivos

• Sistema Roche LightCycler

• Capilares para muestras LightCycler, Roche, Nº Cat. 1909339

• Adaptador de capilares LightCycler, Roche, Nº Cat. 1909312

• Sondas de hibridación FastStart DNA Master para LightCycler, Roche, Nº Cat.

3003248 con ADN polimerasa Taq FastStart, mezcla de dNTP (con dUTP en lugar

de dTTP) y Tampon de reacción, conc. 10x; agua esterilizada de grado PCR

• Seroalbúmina bovina (SAB), sin nucleasa (libre de ribonucleasa y

dexosirribonucleasa) p. ej., Promega Nº Cat. R9461 (1 µg/µl)

• ADN polimerasa Taq Platinum 5U/µl (junto con el Tampon original 10x y MgCl2 50

mM), Invitrogen – Life Technologies Nº Cat. 10966026


• Micropipetas




• Agua sin nucleasa

• Cebadores específicos (GM1-F y GM1-R) y sonda (GM1-Probe) del gen de

referencia

• Cebadores específicos (GM2–F, GM2-R) y sonda (GM2-Probe) del transgén.



Características de los cebadores y la sonda del gen de referencia

GM1-F

Secuencia 5'-CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3'

GM1-R Secuencia 5'-GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3'

GM1-Probe Secuencia 5'-(FAM)-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC -(TAMRA)-3'

Características de los cebadores y la sonda del transgén

GM2-R Secuencia 5'-GAG CCA TGT TGT TAA TTT GTG CC-3'

GM2-Probe Secuencia 5'-(FAM)-CAA GCT GAC TCT AGC AGA TCT TTC (TAMRA)-3'

Curvas patrón

En cada ronda se generan las dos curvas patrón con 5 diluciones patrón de ADN

diferentes. Se efectúan reacciones simples con cada ADN patrón de calibración con

ambas mezclas maestras.

Se construyen curvas patrón para la cuantificación del ADN de soja total y de la

secuencia GM con soluciones de ADN patrón a valores de concentración

decrecientes comenzando con el 2 % de ADN de soja RR con Tampon TE (0,1 M,

pH 8,0). Se utilizarán aproximadamente 100 ng de ADN para el primer punto de las

curvas patrón. Las diluciones y concentraciones de las curvas patrón se resumen en

el cuadro 3.

GM2-F Secuencia 5'-CAT TTG GAG AGG ACA CGC TGA-3'



Cuadro 3. Cantidad de ADN y diluciones de las curvas patrón.

Cantidad de ADN (ng)/reacción

% de ADN de

soja

% de ADN GM

Factor de dilución

PTR 1 100 100 2 PTR 2 50 50 1 1:2 PTR 3 25 25 0,5 1:4 PTR 4 12,5 12,5 0,25 1:8 PTR 5

6,25 6,25 0,125 1:16


• Descongelar, agitar suavemente y centrifugar la cantidad de componentes requerida

para la ronda. Los reactivos descongelados deben mantenerse en hielo.

• Para cada sistema, añadir los siguientes componentes en el orden en que se

mencionan (salvo el ADN) a un tubo de centrifugación de 1,5 ml mantenido en hielo

para preparar las mezclas maestras. Nótese que las dos mezclas de reacción llevan

un exceso de volumen para tener en cuenta los errores de pipeteado debidos a la

viscosidad de la solución.

Cuadro 4. Preparación de la mezcla maestra para el sistema GM1.

Componente Concentración en la PCR µl/reacción

Total µl (para 18

reacciones) Tampón pol.asa Taq Platinum 10xMgCl2 (50 mM) dATP, dGTP, dCTP,dTTP (4 mM) Cebador GM1-F (20 µM) Cebador GM1-R (20 µM) GM1-Probe (10 µM) SAB sin nucleasa (1 µg/µl) Polimerasa Taq Platinum (5 U/µl) Agua sin nucleasa ADN

1x

4 mM 0,8 mM 500 mM 500 nM 200 nM

0,1 mg/ml 0,8 U

#

2

1,6 4

0,5 0,5 0,4 2

0,16 6,85

2

36

28,8 72 9 9

7,2 36 2,9

123,5

Volumen total: 18 µl+2 µl ADN

324,2 µl (sin ADN)



Cuadro 5. Preparación de la mezcla maestra para el sistema GM2.

Componente Concentración en la PCR µl/reacción

Total µl (para 18

reacciones) Tampón pol.asa Taq Platinum 10xMgCl2 (50 mM) dATP, dGTP, dCTP,dTTP (4 mM) Cebador GM2-F (20 µM) Cebador GM2-R (20 µM) GM2-Probe (10 µM) SAB sin nucleasa (1 µg/µl) Polimerasa Taq Platinum (5 U/µl) Agua sin nucleasa ADN

1x

4 mM 0,8 mM 500 mM 500 nM 200 nM

0,1 mg/ml 0,8 U

#

2

1,6 4

0,5 0,5 0,4 2

0,16 6,85

2

36

28,8 72 9 9

7,2 36 2,9

123,5

Volumen total: 18 µl+2 µl ADN

324,2 µl (sin ADN)

• Agitar suavemente y centrifugar brevemente.

• Preparar dos (uno para el sistema GM1 y otra para el GM2) tubos de reacción de 0,5

ml para cada muestra de ADN que se vaya a someter a ensayo (muestras de curva

patrón y muestras desconocidas).

• Añadir a cada tubo la cantidad de mezcla maestra necesaria para 2 repeticiones (36

µl de mezcla maestra). Añadir a cada tubo la cantidad de ADN adecuada para 2

repeticiones (es decir, 4 µl de ADN). Agitar en el mezclador de torbellino al menos

tres veces durante aproximadamente 10 segundos. Este paso es muy importante

para reducir al mínimo la variabilidad entre las réplicas de cada muestra.

• Colocar los capilares en el adaptador de centrifugación preenfriado.

• Pipetear 20 µl de mezcla maestra a cada capilar según el esquema facilitado. (véase

el cuadro 6 «Configuración de las placas – orden de carga» - carrusel LightCycler

estándar).

• Pasar brevemente por una microcentrífuga a baja velocidad (aprox. 1 150 rpm). Esta

etapa garantiza la concentración de todo el volumen de la mezcla de reacción en la

punta del capilar.

• Transferir los capilares al carrusel LightCycler (Roche).

• Someter las muestras a los ciclos descritos en el cuadro 7.



Cuadro 6. Configuración de las placas – orden de carga del carrusel LightCycler: posiciones

1 a 16 = sistema GM1, posiciones 17 a 32 = sistema GM2. Cada muestra de ADN por

duplicado para los sistemas del gen de referencia y del transgén (OGM)

Posición

Muestra (%) Posició

n Muestra

(%) Posició

n Muestra

(%) 1 PTR (100) 13 U2 25 PTR (0,125)

2 PTR (100) 14 U2 26 PTR (0,125)

3 PTR (50) 15 NTC 27 U1

4 PTR (50) 16 NTC 28 U1

5 PTR (25) 17 PTR (2) 29 U2

6 PTR (25) 18 PTR (2) 30 U2

7 PTR (12,5) 19 PTR (1) 31 NTC

8 PTR (12,5) 20 PTR (1) 32 NTC

9 PTR (6,25) 21 PTR (0,5)

10 PTR (6,25) 22 PTR (0,5)

11 U1 23 PTR (0,25)

12 U1 24 PTR (0,25)

Cuadro 7. Programa de ciclos para el sistema LightCycler Seleccionar: pendiente 20° C/s en todos los pasos.

Modo pantalla fluorescente: F1/1

Desnaturalización:

Ciclos: 1 Tipo: Ninguno Modo pantalla fluorescente F1/1

Nº de segmento

Temp. Tiempo Pendiente Temp. 2ª

diana

Incre-mento

Demora del incremento

(ciclos)

Modo de adquisición

1 96 °C 120 s 20 °C/s 0 °C 0 °C 0 Ninguno

Ciclos: Ciclos: 45 Tipo: Cuantificación Modo pantalla fluorescente F1/1

Nº de segmento


diana

Incre-mento


(ciclos)


1 95 °C 5 s 20 °C/s 0 °C 0 °C 0 Ninguno

2 60 °C 15 s 20 °C/s 0 °C 0 °C 0 Sencillo

3 72 °C 15 s 20 °C/s 0 °C 0 °C 0 Ninguno

Refrigeración: Ciclos: 1 Tipo: Ninguno Modo pantalla fluorescente F1/1

Nº de segmento


diana

Incre-mento


(ciclos)


1 40 °C 30 s 20 °C/s 0 °C 0 °C 0 Ninguno



Durante la ronda, hacer clic en el botón EDIT SAMPLE e introducir los nombres de las

muestras en la pantalla de carga. Definir todas las posiciones (incluido el ADN calibrador)

como «Unknowns».

Análisis de los datos e interpretación de los resultados

• Para analizar los datos, seleccionar Fluorescence F1/F2 en la ventana frontal de

análisis de datos.

• Para cuantificar, hacer clic en el botón de cuantificación.

• El software de LightCycler ofrece dos métodos de cuantificación distintos: el método

del «máximo de la segunda derivada» y el método de los «puntos de ajuste». Para la

cuantificación con el kit de detección de ADN de soja RR es preferible utilizar el

segundo método. Seleccionar lo siguiente: ajuste de la línea base = Proportional;

número de puntos = 2.

• Realzar la curva patrón junto con todas las reacciones desconocidas

correspondientes.

• Abrir la carpeta Step 2: Noise Band.

• Llevar la banda de ruido a una posición de 0,1. Dicha banda puede desplazarse

manualmente utilizando el ratón o presionando el botón que se encuentra debajo del

botón Chance Graph Settings. Al pulsar este botón, aparece la ventana Manual

Cursor Adjustment y es posible definir el valor del cursor como 0,1.

• Abrir la carpeta Step 3: Analysis.

• En Step 3: Analysis se calculan los puntos de corte y las correspondientes

concentraciones de los patrones de calibración y las plantillas de ADN

desconocidas.

• Controlar el valor de r de la curva patrón. Son aceptables los valores de r ≥ -0,98,

siendo óptimo el valor r = -1.



Bibliografía

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raw material and processed food. European Food Research and Technology

Journal 222, 209-216.






Alimentos

Sesión nº 12

Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA

F. Eyquem

Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA 2


Índice

Sesión nº 12

Detección Cuantitativa de la Soja Roundup Ready mediante ELISA

Introducción 3

La técnica ELISA 8

Práctica 12

Diagrama de flujo 21

Bibliografía 22

Bibliografía complementaria 22



Introducción

La detección inmunológica específica de una proteína nueva sintetizada por un gen

introducido durante la transformación constituye un método alternativo de

identificación de plantas modificadas genéticamente. Hay que tener presente, no

obstante, que la modificación genética no siempre tiene por finalidad específica la

producción de una proteína nueva y no siempre se traduce en unos niveles de

expresión de la proteína útiles para la detección. Además, algunas proteínas se

expresan solo en determinadas partes de la planta (están utilizándose ya promotores

con especificidad tisular para fines concretos) o se expresan a niveles diferentes en

partes distintas o durante fases distintas del desarrollo fisiológico.

Se ha comunicado que los niveles de expresión de los productos transgénicos en las

plantas se sitúan entre el 0 y el 2 % de la proteína soluble total, incluso con

utilización de potentes promotores constitutivos para activar la expresión (Longstaff,

1995). En la mayor parte de los casos, no obstante, los niveles de expresión

comunicados (p. ej., en cultivos GM aprobados) se sitúan por debajo del límite

superior del 2 % (Hemmer, 1997).

Los inmunoensayos son sistemas de medición analítica que utilizan anticuerpos

como reactivos de ensayo. Los anticuerpos son proteínas específicas aisladas a

partir del suero de animales que solo se unen físicamente a la sustancia que ha

provocado su producción. Los anticuerpos se fabrican inyectando la sustancia que

se quiere detectar (p. ej., CP4 EPSPS, la proteína que confiere resistencia al

herbicida Roundup) a animales como el conejo o el ratón, cuyas células somáticas

reconocen la sustancia como «extraña» y responden produciendo anticuerpos contra

ella. Después se purifican los anticuerpos, se acoplan a un marcador detectable y se

utilizan como reactivos para detectar la sustancia de interés.

Un requisito previo para el desarrollo de métodos inmunológicos de detección es

disponer de anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína nueva que se quiere

detectar. Además, es necesario que la muestra o las proteínas de interés no se

degraden significativamente.

Los anticuerpos son un instrumento precioso para el biólogo en la detección y

cuantificación de antígenos en mezclas complejas. Todos los inmunoensayos se

basan en la unión específica del anticuerpo al antígeno.

Interacciones anticuerpo-antígeno

Al describir las propiedades de los anticuerpos en tanto que proteínas, la mayoría de

los inmunólogos citará la capacidad de estas moléculas para precipitar los antígenos



de una solución, aun cuando la precipitación de anticuerpos apenas se utilice ya

para aislar o detectar antígenos experimentalmente y los anticuerpos raramente

precipitan antígenos in vivo, salvo en el caso de algunas enfermedades

autoinmunes. El valor pedagógico de la reacción de precipitación por anticuerpos,

ilustrada en la figura 1, es que refleja nítidamente muchas de las propiedades

fundamentales y universales de las moléculas de anticuerpo. Esta técnica

demuestra, entre otras cosas, que:

• los anticuerpos (lgG) séricos son bivalentes en sus reacciones con antígenos y

tienen la capacidad de entrecruzar antígenos;

• los antígenos son a menudo multivalentes en sus interacciones con los

anticuerpos;

• los anticuerpos séricos suelen ser policlonales en la naturaleza, y

• los anticuerpos son sumamente específicos en lo que se refiere a las estructuras

que reconocen en las moléculas antigénicas.

Cuadro 1. Curva de precipitación de un sistema de un antígeno y sus anticuerpos.

En la representación gráfica de la cantidad de anticuerpo precipitada frente a la

concentración de antígeno (siendo constante el total de anticuerpo) se distinguen

tres zonas:

ANTISUERO POLICLONAL

Zona de exceso de anticuerpos

Zona de equivalencia

Zona de exceso de antígeno

Mioglobina

ANTICUERPO MONOCLONAL

Sobrenadantes: Exceso de Ac Exceso de Ag

Anticuerpo precipitado

Antígeno añadido



- una «zona de exceso de anticuerpo» en la que queda inhibida la precipitación y

puede detectarse un exceso de anticuerpo en el sobrenadante;

- una «zona de equivalencia» de precipitación máxima, en la que anticuerpos y

antígenos forman grandes complejos insolubles (de tonos azules) y no se puede

detectar en el sobrenadante ni el antígeno ni el anticuerpo;

- una «zona de exceso de antígeno» en la que queda inhibida la precipitación y

puede detectarse un exceso de antígeno en el sobrenadante.

Aun cuando la reacción de precipitación se presta magníficamente a la

caracterización de las interacciones entre anticuerpos policlonales y antígenos

multivalentes, no suele resultar muy útil para caracterizar las interacciones entre

antígenos y anticuerpos monoclonales, salvo en caso de que los antígenos exhiban

múltiples epítopos idénticos (como las estructuras repetitivas de hidratos de carbono

que se encuentran en los polisacáridos, por ejemplo). Solo entonces podrá un

anticuerpo monoclonal monoespecífico entrecruzar y precipitar antígeno. Sin

embargo, habitualmente los anticuerpos monoclonales se pueden caracterizar

mediante tipos de medición más refinados que aportan detalles sobre la interacción

entre anticuerpo y antígeno, tales como la constante de equilibrio y las tasas

cinéticas de asociación y disociación.

Nunca se insistirá bastante en la utilidad de los anticuerpos para la detección y

aislamiento de antígenos, dado el amplio espectro de aplicaciones extremadamente

potentes de los anticuerpos que se ha ido desarrollando a lo largo de los años. La

utilidad de los anticuerpos se ve además reforzada por su estabilidad relativa en

varias reacciones de modificación química, que alteran la estructura del anticuerpo

sin destruir su capacidad para unirse a antígenos. Los anticuerpos han sido

marcados químicamente con compuestos fluorescentes, magnéticos, radiactivos y

de otros tipos a fin de facilitar la detección o aislamiento de antígenos en

condiciones experimentales diversas.

Preparación de anticuerpos monoclonales

El sistema inmunitario de un organismo es capaz de reconocer como invasoras las

sustancias extrañas al mismo, como las bacterias y los virus patógenos y otros

agentes infecciosos, denominadas antígenos. Nuestras defensas naturales contra

estos agentes infecciosos son los anticuerpos, proteínas que buscan los antígenos y

ayudan a destruirlos.

Los anticuerpos presentan dos características de gran utilidad. En primer lugar, son

extremadamente específicos, es decir, cada anticuerpo se une a un antígeno



particular para atacarlo. En segundo lugar, algunos anticuerpos, una vez activados

por la presencia de una enfermedad, siguen confiriendo resistencia a ella.

Esta segunda característica es la que permite desarrollar vacunas. Una vacuna es

un preparado de bacterias o virus muertos o debilitados que, al ser introducido en el

organismo, estimula la producción de los anticuerpos correspondientes a los

antígenos que contiene.

La primera característica de los anticuerpos, su especificidad, es la responsable de

que la tecnología de anticuerpos monoclonales sea tan valiosa. Los anticuerpos no

solo pueden utilizarse con fines terapéuticos, para proteger de la enfermedad, sino

también en el diagnóstico de una amplia variedad de enfermedades y en la

detección de la presencia en la sangre de medicamentos, de productos víricos y

bacterianos y de otras sustancias inusuales o anormales.

Dado que estas sustancias de lucha contra la enfermedad tienen usos muy diversos,

se ha investigado durante mucho tiempo su producción en cantidades puras. El

método convencional era inyectar el antígeno a un animal de laboratorio y luego, una

vez formados los anticuerpos, recogerlos del suero sanguíneo (el suero sanguíneo

que contiene anticuerpos se llama antisuero). Este método, sin embargo, presenta

dos problemas: produce antisuero que contiene sustancias no deseadas y produce

una cantidad muy pequeña de anticuerpos utilizables.

La tecnología de anticuerpos monoclonales permite producir grandes cantidades de

anticuerpos puros utilizando células que producen anticuerpos de forma natural y

una clase de células que puede crecer continuamente en cultivo. Si formamos un

híbrido que combine la característica de la «inmortalidad» con la capacidad de

producir la sustancia deseada disponemos, desde luego, de una fábrica de

anticuerpos en funcionamiento permanente.

En la tecnología de anticuerpos monoclonales se fusionan células tumorales

capaces de replicarse indefinidamente con células de mamífero que producen un

anticuerpo. El resultado de esta fusión celular es un «hibridoma» que produce

anticuerpos continuamente. Estos anticuerpos se llaman monoclonales porque

proceden de un único tipo de célula, el hibridoma, mientras que los producidos por

métodos convencionales derivan de preparados que contienen muchos tipos de

células, por lo que se denominan policlonales. Se da a continuación un ejemplo de la

obtención de anticuerpos monoclonales.

Producción de anticuerpos monoclonales

Un mieloma es un tumor de la médula ósea que puede adaptarse para que crezca

permanentemente en un cultivo. Al fusionar células de mieloma con células de bazo



de mamífero productoras de anticuerpos, se halló que las células híbridas

resultantes, o hibridomas, producían grandes cantidades de anticuerpos

monoclonales. Este producto de una fusión celular combinaba las cualidades

deseadas de los dos tipos de células diferentes, a saber, la capacidad de

crecimiento continuo y la de producir grandes cantidades de anticuerpo puro.

Como las células híbridas seleccionadas producen un solo anticuerpo específico,

son más puros que los anticuerpos policlonales producidos mediante técnicas

convencionales y pueden resultar más efectivos que los medicamentos

convencionales para combatir la enfermedad, ya que estos no solamente atacan a la

sustancia extraña, sino también a las células del propio organismo, produciendo a

veces efectos secundarios no deseados tales como reacciones alérgicas. Los

anticuerpos monoclonales atacan a la molécula diana y solo a ella, y sus efectos

secundarios son mínimos o inexistentes.

Producción de anticuerpos monoclonales

Inmunización de un ratón para estimular la producción de anticuerpos

Se aislan células formadoras de anticuerpos a partir del bazo

Se cultivan células tumorales en un cultivo tisular

Las células formadoras de anticuerpos se funden con células tumorales cultivadas para formar hibridomas

Selección de hibridomas para la producción de anticuerpos

Hibridomas productores de anticuerpos clonados

Anticuerpos monoclonales aislados para su cultivo



La técnica ELISA Definición

Un ensayo de inmunosorción enzimática («Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay»)

es cualquier inmunoensayo enzimático que utilice un inmunorreactivo (antígeno o

anticuerpo) marcado con una enzima y un inmunosorbente (antígeno o anticuerpo

unido a un soporte sólido). Para medir una concentración desconocida pueden

usarse diversos métodos (p. ej., unión competitiva entre el reactivo marcado y el

elemento desconocido sin marcar).

ELISA (Clark y Adams, 1977) se basa en interacciones específicas entre anticuerpos

y antígenos. Los reactivos clave en ELISA son los anticuerpos, que son proteínas

solubles producidas por el sistema inmunitario en respuesta a una infección por una

sustancia extraña (llamada «antígeno»). En caso de la detección de OGM, el

antígeno puede ser la nueva proteína sintetizada.

Esta técnica se aplica en la evaluación, en fase experimental, del nivel de expresión

de la(s) proteína(s) sintetizada(s) por el nuevo gen introducido. Por ello, es posible

encontrar información sobre la producción y el uso de anticuerpos específicos en

muchos artículos que describen la creación de plantas transgénicas (Mohapatra et

al., 1999).

Solo se dispone comercialmente de unos cuantos anticuerpos específicos dirigidos

contra proteínas que son producto de los transgenes utilizados en cultivos

modificados genéticamente aprobados: sirvan de ejemplo los anticuerpos contra el

producto del gen nptII, NPTII, o APH(3')II y contra el producto del gen gus.



Existen tres métodos distintos de realizar el ensayo ELISA:

Un método de detección específica de la soja Roundup Ready basado en ELISA fue

desarrollado, sometido a prueba y validado por Lipp et al. (2000).

El método se basa en el uso de anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína

CP4 EPSPS (5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, enzima procedente de

Agrobacterium sp., cepa CP4) (Padgette et al., 1995), que es la proteína que

confiere la tolerancia frente al herbicida Roundup en la soja Roundup Ready. Los

resultados preliminares indican que este método (que se aplica utilizando un kit

comercia de ELISA) es capaz de detectar la presencia de OGM en material de soja

bruto en concentraciones que se sitúan entre el 0,3 % y el 5 %.

Principio

Para la detección de la proteína CP4 EPSPS se utiliza un ensayo de

inmunoadsorción enzimática (ELISA) directo de tipo sándwich, según se muestra en

las siguientes figuras:

a) ELISA indirecto

b) ELISA sándwich

c) ELISA competitivo

Pocillo revestido

de antígeno

Añadir anticuerpo específico

Añadir anticuerpo secundario conjugado con enzima

Añadir sustrato (s)

y medir color

Añadir sustrato y

medir color

Añadir sustrato sin color



Añadir antígeno

Añadir (Ag-Ac) al pocillo

revestido de antígeno

Pocillo revestido de anticuerpo

Incubar anticuerpo

con antígeno

lavado lavado lavado

lavado lavado lavado

lavado lavado



Se reviste la superficie de una placa de microvaloración con un anticuerpo de

captura monoclonal específico.

Cuando se añade la muestra de interés, el anticuerpo de captura se une al antígeno.

Los componentes de la muestra que no se han unido se eliminan mediante lavado.

Tras el lavado, se añade un anticuerpo policlonal, unido covalentemente a la

peroxidasa de rábano (HRP), que es específica para un segundo sitio antigénico en

la proteína CP4 EPSPS unida.

Superficie revestida

Y Anticuerpo monoclonal

Superficie revestida

Antígeno

Superfic. revestida

HRP

Superfic. revestida

TM TM

Anticuerpo detector



Tras otro lavado, se añade el cromógeno tetrametilbencidina de la peroxidasa de

rábano. La peroxidasa de rábano genera una señal de color que es proporcional a la

concentración de antígeno en un intervalo lineal. Para detener el desarrollo del color

se añade una solución de parada. El nivel de color producido se mide a una longitud

de onda de 450 nm.



Práctica (GMO Food Ingredient Testing, Soya kit User’s Guide (1999). Strategic Diagnostics,

Inc., Rev. 052099, Vers. 1.8.)1

Introducción

El siguiente protocolo especifica un método ELISA para la determinación de la

proteína CP4 EPSPS expresada en la soja Roundup Ready en productos agrícolas

brutos y elaborados como las harinas de soja y las proteínas aisladas de soja.

El método es aplicable a muestras que han sido poco o en absoluto tratadas, por lo

que la proteína CP4 EPSPS no está desnaturalizada. Por ejemplo, la temperatura a

la que se transforman los ingredientes de los alimentos puede repercutir en las

posibilidades de detección de la proteína. Según los datos, las temperaturas de

transformación de no más de 65 °C durante no más de 60 minutos permiten una

detección fiable.

El método ha sido validado para la detección de la proteína CP4 EPSPS y puede

usarse para determinar la concentración de la proteína en la muestra en el intervalo

del 0,3 % al 5 % (p/p) usando material de referencia específico. El kit puede

emplearse igualmente a niveles de detección más bajos (0,05 % a 0,3 %) con

modificaciones en el protocolo.

Instrumental

• Tubos de centrifugación cónicos de polipropileno de 15 ml

• Tubos de ensayo de vidrio de 12 X 75 mm

• Hojas de plástico o aluminio para envolver

• Cinta de plástico o lavador de placas manual

• Frascos lavadores, p. ej. de 500 ml

• Pipetas de precisión capaces de transferir de 20 µl a 500 µl


• Bandejas de pesar o equivalentes

• Espátulas

• Balanza capaz de efectuar mediciones de 0,01 g

1 El kit que se describe en esta sesión era el único protocolo validado disponible en el comercio en el momento en que se organizaron los cursos y se preparó el presente Manual. El CCI y la OMS no promocionan ninguna marca concreta de kits disponibles en el comercio.



• Centrifugadora que pueda trabajar a 5 000 - 10 000 rpm

• Lector de placas de microvaloración capaz de leer una absorbancia a 450 nm

• Horno de incubación capaz de mantener 37 °C

• Tamiz de 450 µm de abertura o equivalente

• Tamiz de 150 µm de abertura (malla 100) o equivalente

• Pipeta multicanal, p. ej., de 50 µl a 300 µl (opcional)

• Depósitos de reactivo para distribución multicanal (opcional)

• Lavador de placas automático (opcional)

• Soporte para tubos de centrifugación de 15 ml (opcional).

Reactivos

Generalidades

Durante los análisis, y a menos que se indique otra cosa, se utilizarán solamente

reactivos de grado analítico y agua desionizada o destilada.

Cualquier desviación de los criterios de rendimiento definidos podría indicar una

merma de la estabilidad de un reactivo. En caso de que los componentes del

sustrato hayan ya virado de transparente a azul, deberá descartarse el reactivo. No

deberán usarse soluciones tampón turbias.

Todos los componentes del kit deberán almacenarse a una temperatura de entre

2 °C y 8 °C. El período de validez de los componentes del kit viene indicado por su

fecha de caducidad. Sobre la base de ensayos de estabilidad acelerados, la fecha

de caducidad del kit de ensayo se ha fijado en 9 meses a una temperatura de entre

2 °C y 8 °C.

La solución madre «conjugado de soja» de conjugado de anticuerpo y la solución de

trabajo de conjugado de anticuerpo deberán almacenarse a una temperatura de

entre 2 °C y 8 °C hasta la fecha de caducidad del kit. El tampón de lavado de trabajo

diluido deberá almacenarse a una temperatura de entre 2 °C y 8 °C sin sobrepasar

la fecha de caducidad del kit.

Reactivos que suelen facilitarse con el kit de ensayo

• Tampón de extracción de soja, tampón de borato de sodio, pH 7,5

• Tampón de extracción de soja, PBS, Tween 20, seroalbúmina bovina, pH 7,4

• Pocillos en tiras revestidas (12 tiras de 8 pocillos cada una revestidas con los

anticuerpos de captura monoclonales y un portatiras)

• Conjugado de soja, proteína anti-CP4 EPSPS de conejo, liofilizada



• Diluyente del conjugado de soja, suero de ratón inactivado por calor al 10 %

• Sustrato cromogénico, K-Blue, tetrametilbencidina (TMB), peróxido de

hidrógeno, dimetilformamida al 5 % como disolvente de base

• Solución de parada, ácido sulfúrico al 0,5 %

• Tampón de lavado concentrado diez veces, PBS, Tween 20, pH 7,1

• Patrones de referencia negativos y positivos.

Procedimiento

Limitación del procedimiento

Este sistema de ensayo de la modificación genética mediante ELISA solo es válido

para muestras en las que la expresión de la proteína CP4 EPSPS se pueda

correlacionar con el nivel de material modificado genéticamente presente en los

patrones de referencia utilizados.

El kit de ELISA ha sido diseñado para ofrecer un rendimiento óptimo a una

temperatura ambiente de 15 °C a 30 °C. La absorbancia del patrón de referencia

más elevado debe ser superior a 0,8 y no estar fuera del intervalo lineal del

espectrómetro (el límite superior varía según el aparato). Es importante tener

presente que los valores de la densidad óptica aumentan más deprisa a

temperaturas superiores a 30 °C. En consecuencia, si la temperatura es elevada,

será necesario acortar el tiempo de incubación del sustrato. A temperaturas bajas

(inferiores a 15 °C), por el contrario, habrá que alargar dicho tiempo.

Medidas encaminadas a evitar la contaminación durante la preparación de la muestra

Generalidades. El sistema ELISA de ensayo de OGM es una técnica

extremadamente sensible capaz de detectar cantidades muy pequeñas de

contaminantes GM. Por este motivo, es imperativo que todo el instrumental utilizado

para procesar las muestras de soja sea limpiado a fondo entre dos lotes de

muestras. Los procedimientos que se mencionan a continuación incluyen un primer

paso de eliminación física de cuantas partículas sea posible. El segundo paso, un

lavado con alcohol, tiene por finalidad desnaturalizar la muestra de manera que no

reaccione durante el ensayo con ninguna proteína GM que pueda haber quedado en

el instrumental.



Limpieza del triturador o batidora. Cepillar con un cepillo de cerdas suave. Lavar

el cepillo periódicamente y remojarlo en una solución de alcohol. Secar el cepillo

antes de volver a usarlo. Enjugar con una bayeta suave o un paño de laboratorio.

Lavar con alcohol, que puede tenerse almacenado para su uso en una botella con

pulverizador o pitorro. Se recomiendan dos lavados o pulverizaciones. Luego, se

enjuagará a fondo con agua. Secar al aire o, si es preciso reutilizar enseguida el

instrumento, con un secador de pelo comercial.

Limpieza del tamiz. El polvo de soja suele endurecerse, atascando el tamiz.

Sacudir bruscamente el tamiz contra una superficie dura para desprender el material

endurecido.

Cepillar con un cepillo de cerdas suave y limpio. Lavar el cepillo periódicamente y

remojarlo en una solución de alcohol durante al menos un minuto. Secar el cepillo

antes de volver a usarlo. Enjugar con una bayeta suave.

Remojar en alcohol durante al menos cinco minutos y luego enjuagar a fondo con

agua. Secar al aire o, si es preciso reutilizarlo enseguida, con un secador de pelo

comercial.

Una alternativa sería el uso de un baño de ultrasonidos seguido de un secado al

aire.

Limpieza de la zona de trabajo. También es importante la limpieza de la zona de

trabajo. Dado que el ensayo es muy sensible, una ligerísima contaminación por

polvo GM del tubo de ensayo podría conducir a un falso positivo. Hay que evitar la

contaminación por polvo de soja en la zona de trabajo. No debe permitirse que el

polvo de soja de un proceso contamine el instrumental que se usará en un proceso

posterior. Lo ideal es realizar el ensayo en un espacio separado de la instalación en

la que se efectúa el triturado y la preparación de la muestra, a fin de evitar la posible

contaminación por polvo.

Preparación de la muestra

Debe tomarse de la muestra de laboratorio una submuestra incremental homogénea.

Si la muestra es de semillas de soja en bruto, se colocarán al menos 500 g en una

batidora adecuada y se triturarán durante 3 minutos aproximadamente, o hasta que

sea suficientemente fina para atravesar los tamices. Para análisis cuantitativos,

deberá obtenerse un tamaño de partícula inferior a 150 µm, y para análisis

cualitativos, inferior a 450 µm. En la fase de tamizado debe ponerse cuidado en

evitar la contaminación, así como en evitar el calentamiento excesivo. La batidora



permitirá mezclar y triturar la muestra. Se tomará una submuestra de

aproximadamente 100 g de material triturado, que se pasará a través de un tamiz

con un tamaño de poro de 450 µm (malla 40). Al menos el 90 % de esta submuestra

deberá atravesar el tamiz de 450 µm. Puede usarse este material directamente si se

trata de un ensayo cualitativo, pero si es cuantitativo debe volverse a pasar por un

tamiz con tamaño de poro de 150 µm. Como se ha demostrado que el material que

atraviesa el tamiz de 450 µm es homogéneo, basta hacer pasar por el tamiz de

150 µm suficiente material para obtener la muestra final.

Otros tipos de muestras deben recibir un tratamiento semejante, aunque puedan

utilizarse tamaños de muestra más pequeños.

Procedimiento de ensayo

Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de usarlos.

Se sacan las tiras revestidas y el portatiras de la bolsa de papel de aluminio. Tras

extraer el número de tiras adecuado, hay que volver a cerrar siempre la bolsa.

Hacen falta diez pocillos para los patrones de referencia y los blancos de ensayo.

Cada placa debe tener sus propios patrones y controles. Si se utiliza un lavado

manual, pegar con cinta de plástico los bordes de todas las tiras necesarias para un

ciclo al portatiras, a fin de evitar que caigan accidentalmente de este durante el

lavado.

Preparación del conjugado de anticuerpo

Solución madre de conjugado de anticuerpo. Pipetear 1 ml de diluyente de

conjugado de soja procedente de la botella de diluyente de conjugado de soja en el

frasco de conjugado de soja. Agitar en el mezclador de torbellino durante 10 s

aproximadamente.

Solución de trabajo de conjugado de anticuerpo. Volver a poner 240 µl de

conjugado de soja reconstituido en la botella de diluyente de conjugado de soja.

Marcar la botella con la fecha del día y mezclar invirtiéndola 20 veces.

Preparación del tampón de lavado

Dejar que el tampón de lavado concentrado diez veces alcance la temperatura

ambiente.

Diluir dicho tampón concentrado en agua desionizada para preparar el tampón de

lavado de trabajo (p. ej., 50 ml de tampón de lavado concentrado diez veces en 450

ml de agua desionizada).



Añadir al lavador de placas automático o al frasco lavador.

Extracción de muestras y patrones de referencia

Se extraen las muestras y los patrones de referencia negativos y positivos en las

mismas condiciones y por duplicado, según se describe a continuación.

Cuando vayan a pesarse las muestras, pesar cada patrón de referencia por orden de

concentración creciente y luego las muestras.

Pesar 0,5 g ± 0,01 g de cada patrón de referencia y de la muestra en distintos tubos

de centrifugación de polipropileno de 15 ml. Para evitar la contaminación, limpiar la

espátula entre cada pesada.

Añadir 4,5 ml de tampón de extracción de soja en cada uno de los tubos que

contienen una muestra de 0,5 g y agitar en un mezclador de torbellino durante 10 s.

Centrifugar las mezclas a aproximadamente 5000 rpm durante 15 minutos.

Utilizando una pipeta de transferencia, retirar cuidadosamente el sobrenadante sin

aspirar material sólido y colocarlo en un tubo de centrifugación de 15 ml limpio y

etiquetado.

Antes de comenzar el ensayo, diluir los extractos de la muestra y los extractos del

patrón de referencia con tampón de ensayo de soja con arreglo a lo indicado en el

cuadro 1.

Los extractos de proteína deben almacenarse a entre 2 °C y 8 °C, pero no durante

más de un día de trabajo.

Cuadro 1. Intervalos de dilución en función de la matriz

Matriz Dilución

Semillas de soja Harina de soja

Harina de soja desgrasadaAislado de proteínas

1:300 1:300 1:300 1:10

Dilución de extractos de muestras Para el control negativo extraído, para cada referencia positiva extraída y para cada

muestra, se precisan dos tubos de ensayo de 12 X 75 mm para realizar la dilución.

Pipetear 280 µl del tampón de ensayo de soja en uno de los dos tubos de ensayo de

12 x 75 mm.

Pipetear 380 µl del tampón de ensayo de soja en el otro tubo de ensayo de 12 x 75

mm. Marcar el tubo de 280 µl con la inscripción «1:15» y el de 380 µl con «1:300».



Pipetear 20 µl de cada extracto de muestra en el tubo «1:15» y agitar en el

mezclador de torbellino.

Transferir 20 µl del tubo «1:15» agitado al tubo «1:300» y agitar en el mezclador de

torbellino.

Repetir los mismos pasos para el control negativo, para cada referencia positiva y

para los extractos de muestra.

Procedimiento de inmunoensayo ELISA

Generalidades

El kit de ensayo ELISA puede utilizarse en distintos formatos con cualquier número

de bandas de 8 pocillos. Se recomienda seguir un sistema de carga aleatorio.

Todos los pocillos de reacción deben emplearse por duplicado, calculándose el valor

medio de absorbancia de cada pocillo. Cada ciclo está integrado por el blanco del

tampón de ensayo, el control negativo y la referencia positiva.

Una vez iniciado un ensayo, deben completarse todas sus etapas sin interrupción.

Adición de la muestra

Añadir 100 µl de extractos diluidos y el blanco de ensayo a los pocillos oportunos.

Usar puntas desechables distintas en cada etapa de pipeteo para evitar la

contaminación cruzada. Cubrir la placa con hoja de aluminio o de plástico para evitar

la contaminación y la evaporación.

Incubación de la muestra

Incubar la placa de microvaloración a 37 °C durante 1 hora.

Lavado

Lavar 3 veces con 300 µl de tampón de lavado.

Lavado manual. Vaciar los pocillos invirtiéndolos sobre un fregadero o un

contenedor de residuos adecuado. Utilizando un frasco lavador de 500 ml que

contenga solución de lavado de trabajo, llenar cada pocillo hasta el borde, dejar

reposar 60 s, y luego vaciar la placa como se acaba de indicar. Repetir el lavado un

total de 3 veces. Eliminar el líquido y las burbujas residuales sacudiendo boca abajo

la placa sobre varias capas de toallas de papel.

Se impedirá que las tiras caigan del marco sujetándolas con cinta adhesiva.

Lavado automático. Al final del período de incubación, aspirar el contenido de

todos los pocillos utilizando un lavador de micropocillos, y luego llenarlos con

tampón de lavado de trabajo. Repetir la aspiración y el llenado un total de 3 veces.



Por último, aspirar todos los pocillos mediante el lavador de micropocillos y sacudir

la placa invertida sobre una pila de toallas de papel para eliminar las gotitas

residuales de tampón de lavado y las burbujas.

No hay que dejar que los pocillos se evaporen, ya que esto podría afectar al

rendimiento del ensayo.

Un lavado inadecuado puede ocasionar resultados erróneos. Tanto si se utiliza un

lavador manual como automático, es importante cerciorarse de que todos los

pocillos de ensayo se lavan con idénticos volúmenes.

Adición del conjugado de anticuerpo

Añadir 100 µl de solución de trabajo de conjugado de anticuerpo a cada pocillo.

Cubrir la placa para evitar la contaminación y la evaporación.

Incubación

Incubar la placa de microvaloración a 37 °C durante 1 hora.

Lavado

Concluido el período de incubación, repetir el lavado según lo anteriormente

descrito.

Adición del sustrato

Añadir 100 µl de la solución de color a cada pocillo.

Agitar suavemente la placa e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

La adición de sustancia cromogénica debe efectuarse sin interrupciones. Mantener

la misma secuencia e intervalo de tiempo durante el pipeteo. Proteger la placa de

microvaloración de la luz del día, para evitar que se altere la intensidad del color.

Adición de la solución de parada

Al final del período de incubación, añadir 100 µl de solución de parada a cada

pocillo, pipeteándola en la misma secuencia en que se haya añadido el reactivo de

color.

La adición de solución de parada debe efectuarse sin interrupciones. Proteger la

placa de microvaloración de la luz del día, para evitar que se altere la intensidad del

color.

Lectura de la absorbancia

Utilizando un lector de microplacas equipado del filtro adecuado para efectuar

lecturas a 450 nm, medir la absorbancia de cada pocillo de ensayo.



Todas las lecturas deben efectuarse dentro de los 30 minutos siguientes a la adición

de la solución de parada.

Tomar nota de los resultados obtenidos y calcular los valores medios de

absorbancia, o recurrir a un programa informático.

Evaluación

Deben usarse los valores de los patrones para desarrollar una curva patrón. El valor

del blanco de ensayo deberá sustraerse de todos los valores de las muestras y

patrones de referencia. Se utilizarán los valores medios corregidos correspondientes

a cada punto de referencia duplicado para crear una curva patrón. Luego se

utilizarán los datos promedio de cada muestra duplicada para interpolar una

concentración a partir de dicha curva.

Criterios de aceptación o rechazo de un ciclo

Para tener validez, cada ciclo deberá satisfacer los criterios de aceptación o rechazo

del procedimiento. Un ciclo consistirá en lo siguiente: el blanco de ensayo, la

extracción de cada patrón GM de referencia positiva, el control negativo y cada

muestra desconocida. Todos los extractos de proteína y el blanco de ensayo se

utilizarán en duplicados. Si un ciclo no satisface los criterios de aceptación del

ensayo, deberá repetirse íntegramente.

Ciclo Criterios

Blanco de tampón de ensayo A450nm < 0,30

Patrón 0 % GM A450nm < 0,30

Referencia 2,5 % A450nm > 0,8

Todos los patrones positivos CV de los duplicados < 15 %

Muestras desconocidas CV de los duplicados < 20 %



Diagrama de flujo Diagrama de la extracción de la muestra y del patrón de referencia

Procedimiento Volumen/peso Descripción

Pesada 0,5 g Pesar muestras, blanco de ensayo y patrones de referencia

Adición 4,5 ml Añadir el tampón de extracción

Mezclado Mezclar la muestra con el tampón de extracción hasta que quede homogénea

Centrifugado 5000 rpm Centrifugar la muestra a 5000 rpm durante 15 minutos Eliminar el sobrenadante y pasarlo a un tubo limpio

Dilución 1:300 o 1:10 según el material investigado

Diluir las muestras y patrones de referencia

Diagrama del procedimiento de inmunoensayo ELISA

Procedimiento Volumen Descripción

Adición 100 µl Pipetear los extractos diluidos de muestras, patrones de referencia y blanco tampón de ensayo en los correspondientes pocillos

Incubación Incubar 1 h a 37 °C

Lavado Lavar 3 veces con tampón de lavado

Adición 100 µl Distribuir el conjugado de anticuerpo en cada pocillo de ensayo

Incubación Incubar 1 h a 37 °C

Lavado Lavar 3 veces con tampón de lavado

Adición 100 µl Distribuir la solución de color en cada pocillo

Incubación Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Adición 100 µl Distribuir la solución de parada en cada pocillo de ensayo

Medida de la absorbancia

Medir el valor de la absorbancia de cada pocillo en un lector de placas a 450 nm



Bibliografía

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Bibliografía complementaria

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Alimentos

Apéndice

Ejemplo de programa de trabajo (Base metodológica para un curso de una semana)

M. Querci

Ejemplo de programa de trabajo 2

Análisis de la presencia de organismos genéticamente modificados en muestras de alimentos Apéndice

PRIMER DÍA: LUNES

9:00 Introducción del curso, presentación de los organizadores y participantes

9:30 Teoría: Introducción sobre los procedimientos generales para la detección de

OGM y contenido del curso

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS: EXTRACCIÓN DE ADN

10:00 Práctica: Extracción de ADN por el método del bromuro de cetil-trimetil

amonio (CTAB) (1ª parte)

10:30 Descanso

11.:00 Teoría: Electroforesis en gel para análisis de ácidos nucleicos

Práctica: Preparación de geles de agarosa

12:00 Práctica: Extracción de ADN por el método del CTAB (2ª parte)

13:00 Almuerzo

14:00 Práctica: Extracción de ADN por el método del CTAB (3ª parte)

15:15 Práctica: Aplicación de la muestra en geles de agarosa

16:00 Descanso

16:20 Teoría: Consideraciones generales sobre la organización de un laboratorio

de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Resolución de problemas, etc.

17:20 Práctica: Interpretación de geles de agarosa



SEGUNDO DÍA: MARTES

PCR CUALITATIVA 9:00 Teoría: Introducción y utilización de la PCR para la detección de soja y maíz

transgénicos

9:30 Práctica: PCR para los productos transgénicos maíz MON810 y soja

Roundup Ready

Con especificidad de los vegetales: detección de los genes de la zeína y

de la lectina

10:15 Descanso

10:40 Preparación de geles de agarosa

11:00 Seminario: Muestreo y validación: conceptos básicos

12:30 Almuerzo

14:00 Aplicación de la muestra en geles de agarosa

14:30 Teoría: Características de la soja Roundup Ready y del maíz MON810 e

introducción de la PCR anidada específica de OGM

15:15 Interpretación de los geles de agarosa (PCR específica de zeína y lectina)

16:00 Descanso

16:15 Práctica: PCR para los productos transgénicos maíz MON810 y soja

Roundup Ready

Con especificidad de los OGM: detección del promotor 35S y del

terminador nos

17:00 Seminario: Introducción a la legislación europea sobre OGM



TERCER DÍA: MIÉRCOLES

PCR CUALITATIVA 9:00 Práctica: PCR anidada para la detección específica de los productos

transgénicos maíz MON810 y soja Roundup Ready (primera PCR)

10:00 Preparación de geles de agarosa

10:30 Descanso

11:00 Seminario: Ensayo de OGM y garantía de calidad analítica

12:00 Aplicación de las muestras en geles de agarosa (PCR del promotor 35S y del

terminador nos)

12:30 Almuerzo

13:30 Práctica: PCR anidada para la detección específica de los productos

transgénicos maíz MON810 y soja Roundup Ready (segunda PCR)

14:00 Interpretación de los geles de agarosa (PCR del promotor 35S y del

terminador nos)

15:00 Práctica: Preparación de geles de agarosa

15:30 Descanso

15:45 Práctica: Aplicación de las muestras de geles de agarosa (PCR anidada)

16:00 Teoría: Introducción de la PCR en tiempo real (RT-PCR) para la detección y

cuantificación de OGM

17:30 Práctica: Interpretación de geles de agarosa (PCR específica de los

productos transgénicos maíz MON810 y soja Roundup Ready)



CUARTO DÍA: JUEVES

PCR EN TIEMPO REAL (RT-PCR) CUANTITATIVA 9:00 Práctica: Cuantificación del ADN y preparación de muestras para la PCR en

tiempo real (RT-PCR)

9:30 Práctica: PCR en tiempo real (RT-PCR) para la detección específica de la

soja transgénica Roundup Ready utilizando:

el analizador LightCycler (de Roche) (Grupo 1) el secuenciador ABI PRISM 7700 (de Applied Biosystems) (Grupo 2)

Descanso

13:00 Almuerzo

14:00 Práctica: PCR en tiempo real (RT-PCR) para la detección específica de la

soja Roundup Ready utilizando:

el analizador LightCycler (de Roche) (Grupo 2) el secuenciador ABI PRISM 7700 (de Applied Biosystems) (Grupo 1)

15:30 Teoría: Análisis de datos: introducción a varios medios estadísticos

16:30 Descanso

17:00 Práctica: Continuación de la PCR en tiempo real (RT-PCR) para la detección

específica de la soja transgénica Roundup Ready



QUINTO DÍA: VIERNES

DETECCIÓN CUANTITATIVA DE SOJA ROUNDUP READY MEDIANTE ELISA

9:00 Teoría: Enfoque serológico de la detección de OGM

9:20 Práctica: ELISA, primera parte

10:00 Descanso

10:30 Seminario: Enfoque serológico de la detección de OGM

11:30 Práctica: ELISA, segunda parte

12:00 Almuerzo

13:00 Práctica: ELISA tercera parte

14:00 Interpretación de los resultados

15:00 Seminario: Ámbitos de negociaciones internacionales sobre la seguridad del

uso de organismos genéticamente modificados

16:00 Debate general y conclusiones

Comisión Europea DG Centro Común de Investigación, Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores Titulo: Curso de Formación Sobre Análisis de La Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos - Manual del Participante Editado por M. Querci, M. Jermini y G. Van den Eede Luxemburgo: Oficina de Publicaciones Oficiales de las Comunidades Europeas 2007 – 238 pp. – 21 x 29,7cm ISBN 978-92-79-04831-9 Resumen

El Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores del Centro Común de Investigación de la Comisión Europea y el Programa de Seguridad Alimentaria dentro del Centro Europeo para el Medio Ambiente y la Salud (División de Roma) de la Organización Mundial de la Salud han organizado conjuntamente una serie de cursos de formación sobre «Análisis de la presencia de organismos genéticamente modificados en muestras de alimentos». El Centro Común de Investigación presta apoyo científico y técnico a las políticas comunitarias colaborando con las direcciones generales de la Comisión Europea e interactuando con las instituciones, organizaciones e industrias europeas mediante la formación de redes con laboratorios de los Estados miembros. La tarea general del Centro Europeo para el Medio Ambiente y la Salud de la OMS es prestar ayuda de forma completa y coordinada tanto a las autoridades como a los ciudadanos europeos en el ámbito de la salud ambiental. Estos cursos de formación se inscriben en la colaboración entre ambas instituciones para fomentar aspectos relativos a la inocuidad de los alimentos en la región europea de la OMS, tanto dentro como fuera de las fronteras de la propia UE, teniendo en cuenta especialmente los países candidatos a la adhesión a la UE, así como los países de Europa central y oriental con economías de transición. El objetivo de los cursos de formación es ayudar al personal de los laboratorios de control a familiarizarse con las técnicas de detección molecular y a adaptar sus instalaciones y programas de trabajo para permitir la realización de análisis que se ajusten a los actos normativos a escala mundial en el campo de la biotecnología. Los cursos se destinan a enseñar técnicas de detección molecular a personal de laboratorio con buen nivel de conocimientos analíticos, pero con poca o ninguna experiencia en este ámbito concreto. El Centro Común de Investigación se ha comprometido a proporcionar formación sobre la detección y cuantificación de los OGM y, además de los cursos de formación, ofrece (y ha ofrecido en el pasado) formación individual para necesidades específicas. Se ha pedido con frecuencia formación sobre este tema debido a su importancia ante el aumento de la necesidad de cumplir la normativa europea, tanto vigente como en fase de elaboración. A lo largo de los años, la Unidad de biotecnología y OGM ha conseguido un profundo conocimiento de los diferentes aspectos relativos a la detección y cuantificación de los OGM, y ha elaborado, adaptado o validado métodos avanzados para su detección y cuantificación. El conocimiento de estas técnicas se ha transferido a los laboratorios colaboradores mediante publicaciones, proyectos conjuntos, formación individual o cursos específicos. También se han explicado detalles técnicos a personal en formación mediante presentaciones verbales o breves notas escritas. La Unidad de biotecnología y OGM, consciente de la necesidad de disponer de una fuente permanente de información, ha redactado el presente Manual, que describe algunas de las técnicas utilizadas en nuestro laboratorio. A lo largo de los cursos se atiende a los siguientes temas: - extracción de ADN de materias primas y productos transformados - cribado de productos alimentarios para detectar la presencia de OGM mediante reacción en

cadena de la polimerasa, tanto simple como anidada - cuantificación de OGM en ingredientes mediante reacción en cadena de la polimerasa en

tiempo real - cuantificación de OGM en ingredientes mediante prueba de inmunoabsorción enzimática. El Manual se ha preparado en el Instituto de la Salud y la Protección de los Consumidores del Centro Común de Investigación, como información de base para los participantes en los cursos y con la finalidad de proporcionar una información teórica y práctica sobre las metodologías y protocolos utilizados en la actualidad. La materia abarca una amplia variedad de técnicas de detección, identificación, caracterización y cuantificación de OGM, y se incluye información teórica que se considera importante y básica para quien desee introducirse y trabajar en el campo de la detección de OGM.

Misión del CCI La misión del Centro Común de Investigación consiste en proporcionar apoyo científico y técnico para la elaboración, el desarrollo, la aplicación y la supervisión de las políticas de la Unión Europea, en función de su propia demanda. Siendo un servicio de la Comisión Europea, el CCI funciona como centro de referencia en materia científica y tecnológica para la Unión. Encontrándose próximo al proceso de elaboración de políticas, sirve al interés común de los Estados Miembros, al tiempo que se mantiene independiente de intereses particulares, ya sean privados o nacionales.

LB-X

1-07-033-ES-C

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