•REPORT NO. IAEA-R-785-F

TITLE

Repair mechanisms and variations in radiosensitivity within thegeneration cycle of yeast cells

FINAL REPORT FOR THE PERIOD

1 Nov. 1969 - 3C Nov. 1571

AUTHOH(S)

E l i a Nunes de Langguth

INSTITUTE

Departamento de BiofisicaFacultad de MedicinaMontevideo, Uruguay

INTERNATIONAL ATOMIC ENSRCY AGENCY

DATE

Final Report.

Research Contract No.785 /EL /EB.

Title of project: "Repair mechanisms and variations in radwsensitivity

within the generation cycle of yeast cells".

Institute where research is being carried out: Departamento de

Biofísica , Facultad de Medicina , Montevideo, and Department of

Biology,Brooklyn College,New York.

Chief scientific investigator: Dr. Ella Nunes de Langguth

Time period covered: 3/1/71-11/30/71.

La sobrevida celular varía.dependiendo de la posición de la

célula en subido de generación,en el momento de la irradiación. (Sinclair,

1963). En levaduras haploides se comprobó que sólo eran capaces de recu-

peración post-irradiación las células que se encontraban en la fase ra-

diorresistente del ciclo de ge••.. ación ( Langguth, 1968) .3stos resultados

sugieren la presencia de un sistema de reparación que actuaría en

forma variable a través del ciclo de generacióa celular y que explicaría

las variaciones en radiosensibilidaci a través del mismo. A su vez las

diferencias en radiosensibilidad entre poblaciones de diferente ploidía

podría deberse, por lo menos en parte, a una distinta eficiencia de los

sistemas de reparación. Se investigaron estos dos problemas utilizando

poblaciones sincronizadas de levaduras diploides y hexaploides.

Material y métodos.

3L) Cepas de levaduras.Se usaron dos cepas de Saccharomyces cerevisiae,

descritas por LaskowskL (I960) .Una diploide (211) y otra hexaploide (600).

2) Sincronización. Se usaron los métodos de Williamson y Scopes (1962) y

el de Hartwell(1970). Se obtuvo una eficiencia de 80 a 95 % de sincronizá-

I

11

.2.

3) Medios de cultivo. Composición del medio sólido (YED-Agar): 2% Agar,

2% Dextrosa,Q.5 % extracto de levadura. Composición del medio líquido:

igual que el anterior,pero sin agar. (YED)

4)Condiciones de irradiación.Rayos X: máquina Picker con tubo Eachlett OEG-6O

con ventana de Be,50 K7,40 mfi.,distaneia foco objeto: 30cm,56 k rad/min.

Rayos OT : fuente:lámpara Philips TUV,15 W,distancia lámpara-objeto: 20 cm,2

30 erg/Wi .seg . Los cultivos sincronizados de distintas edades (distintos

tiempos de incubación en YED luego del tratamiento de sincronización) fueron5

lavados y suspendidos en agua a una concentración de 10 células /mi. Se

irradiaron luego en cajas de Petri de 5cm de diámetro,conteniendo 5 mi de

la suspensión celular,bajo agitación magnética continua.

5)Condxciones de cultivo e inducción de la recuperación (liquid holding recovery).

Parte de los cultivos se sembraron inmediatamente después de la irradiacióno

en YED-Agar y se incubaron a 30 C. Cuando interesaba investigar la recuperación

se suspendieron muestras de los cultivos irradiados en agua destilada ,duranteo

periodos de 1 a 4 días a 30 C, La sobrevida se determinó por el método

de conteo de las mar-o colonias.

6)Tratamiento con inhibidores, ¿n algunos casos se suspendieron las poblaciones-5

irradiadas en soluciones de inhibidores enzimaticos: cafeina 10 M,yodoacetato-4 -4 -5 -7

lo M,o de la síntesis de ADN:cristal violeta 10 -10 M y actinomicina 10 M.

El tratamiento se extendió durante 1-2 días previa siembra en YSD-agar.

Resultados.

En la fig.l se aprecian las curvas de sobrevida a los Rayos X de células

diploides de distintas edades sembradas en YED-agar inmediatamente después de

la irradiación (I.P.). En las levaduras existe una correspondencia entre el

estado morfológico y los eventos bioquímicos (Williamson,1962,Hartwell,197l).

En particular interesa el hecho de que la síntesis de DNA se realiza durante

la fase de brotamiento,como se indica en la figura 2 a. Allí se aprecian también

los estados de las células de distintas edades,en el momento de irradiación.

.3.

La sobrevida a la irradiación varía con la edad celular (<*),siéndoos 45' la

fase de mayor radiosensibilidad. Todas las curvas son sigmoidea, si bien difieren noto-

riamente en el tamaño del "hombro" ,números de extrapolación y en consecuencia

en LD . Los valores de esta dosis son:50

O1 20' 45' 75! 85'

LD50

73 66 33 56 73 krad

La variación en el tiempo de la fracción sobreviviente para una misma dosis

(D = 50 krad) se aprecia en la fig 2a.Las abscisas de los puntos de inflexión

limitan los períodos de mayor resistencia que corresponden al 52$ de la

duración total'del ciclo (t -i85')«La máxima resistencia corresponde alc

momento en que se sintetiza ADH. Pero esta correlación no siempre se

verificáronlo lo demostró Sinclair en otras líneas celulares.

Para aclarar las causas de la variación en radiosensibilidad durante el

ciclo de generación aplicamos a las células irradiadas cafeína, sustancia

que inhibe la reparación del daflo producido por rayos W en bacterias

y en la levadura Schizosaccharomyces pombe.(Fabre,197l)»Su mecanismo

de acción molecular se debe,probablemente,a la inhibición de enzimas

que actúan en la excisión de díme_roe o a su unión con las porciones

lesionadas de ADN (Domon,19ó9). EL tratamiento de las células en fase

resistente (<¿-0 ) con cafeína produce un efecto dramático sobre su radio-

resistencia/ Desaparece todo el hombro que las diferencia de las células

mas sensibles (<=< = 45 • ) . Estos resultados sugieren fuertemente que la diferencia

en radiosensibilidad durante el ciclo se debe a la acción de un sistema

de reparación de efectividad cíclica.

Para caracterizar con mayor exactitud la capacidad de recuperación celular

del daño potencialmente letal se prolongo experimentalmente la fase de lag

previa a la primera división después de la irradiación (inducción de LHR).

.4.

En la figura 3a se aprecia la sobrevida de células irradiadas durante la

fase sensible («(= 45') y sembradas inmediatamente después de la irradiación

(IP) o luego del tratamiento de "Liquid Holding" (DP).Se calculó el factor

modificante de la Dosis: 3,4 * DMFS6 que cuantifica el aumento

de la sobrevida celular inducido por el tratamiento.

Células de distintas edades fueron sometidas al mismo tratamiento, ver

por ej.figura 3J>, Para estas células de edad<rtr75f: 2,5«DMF-s3,O

Para d - O : 1,3 ¿DMF-^1,5. Ss decir qie durante todo el ciclo está

presente la capacidad de reparación del daño producido por la absorción

energética. 3sta reparación involucra excisión y nueva síntesis de ADN,

se da previamente a la duplicación del código genético y requiere un

sistema enzimático. (Korogodin,l°67,Ganesan,19ó8).

Las variaciones an DMF según la edad indican que la recuperación

depende de la inactivación previa . Parte del daño es irreversible

ya que aún prolongando 1.a fase lag hasta 4 días la fracción sobre-

viviente es menor que 1,0 para dosis mayores de 40 krad. (ver fig.

3,curvas DP) La sobrevida después del tratamiento de "liquid holding"

es la misma ,independientemente de la edad t y cuantiíica la

magnitud del daño irreversible en. las condiciones de nuestros experimentosg

Para estudiar las causas de la diferencia en radíosensibilidad entre

cepas de distintas ploidías,s.e analizó la respuesta a la irradiación X

de una cepa hexaploide derivada directamente de la cepa diploide utili-

zada en las experiencias descriptas en los párrafos anteriores.

En la figura 4 se aprecia la sobrevida de células hexaploides de

dos edades diferentes,en función de la dosis. Se aprecian aquí también

diferencias marcadas en la radioresistencia según la posición de las

células en el ciclo de generación. Comparando la figura 4 con la 1,

y las figuras 2a y 2b, comprobamos que las variaciones en radiosesrsten *-

.5.

era a través del ciclo son cualitativamente semejantes para diploides

y hexaploides con un máximo durante la fase de brotamiento y un míni-

mo en la interdivisión. Cuantitativamente existen diferencias que eran

de esperar de acuerdo a los datos proporcionados por otros autores en

poblaciones homogéneas (no. sincronizadas).

N /N es siempre mayor en las células diploides para las mismas dosis,m °Para las células hexaploides (fig 4) í

46,6LD (R)50

LD (S)5o

1.6*DEF « 2

27.0

Para las células diploides: (fig 1)

73LD (R)50

LD (S)50

_ 2.2

33

R y 3 indican aquí los estados de máxima y mínima resistencia,respectiva-

mente.

La duración de las fase sensible,limitada por las abscisas de los puntos

de inflexión es 48 % en la cepa diploide y 60^ en la hexaploide (ver fig2).

Aparentemente la eficiencia del sistema de'repair*es aquí,en las células

hexaploides ,menor y deja de actuar o es muy poco eficaz durante un

tiempo comparativamente mayor del ciclo, (nótese que el ciclo de"generación

en las células hexaploides dura 1051). La diferencia de respuesta entre

los componentes mas sensibles de arbas poblaciones reflejaría directamente

el efecto de la ploidía sobre la sensibilidad a la radiación; pero más

experimentos son necesarios para determinar si en esas células existe

aún un sistema de reparación diferente al cafeína -sensible.

.6.

ISs importante aclarar también el efecto de compuestos conocidos

por su acción inhibidora de la síntesis de ácidos nucleicos o

proteica sobre la radiosensibilidad celular,en particular sobre la

síntesis de ADN reparadora (unscheduled synthesis). Al respecto

disponemos de algunos resultados preliminares.

Como inhibidores de la síntesis de ADN se usaron cristal violeta

y actinomicina, compuestos que se unen al ADN en células de mamíferos

(Cleaver, 1969). EL cristal violeta,aplicado a concentraciones inocuas

para dichas células provocó muerte celular en interdivisión en las

levaduras diploides.Se están realizando experimentos con concentraciones-6 -7 ,

menores (10 M-10 M ) . La actinomicina no tiene efecto en la levadura ,

de acuerdo a nuestros resultados 7 datos de J.Marmur (comunicación per-

sonal). Se usará myxina, sustancia que^ actúa en estas células en forma

análoga a la actinomicina en otras líneas celulares.

31 yodoacetato3que inhibe la síntesis normal y reparadora de ADN

en células de mamífero,tanibién disminuye la recuperación de levaduras

diploides en fase sensible.Más experimentos son necesarios para determi-

nar su acción a otras edades celulares. Su efecto se debe muy probable-

mente a que inhibe la fermentación,una de las fuentes enrgeticas de la

recuperación ,de acuerdo a nuestros resultados en células con deficiencia

respiratoria.(Langguth y Gelos,1970).

Últimamente algunos autores (Lemontt,1970jEbpendel et al.1970) han

sugerido la existencia de algunas etapas comunes en la reparación

del daño producido en la molécula de ADN, sea por absorción de rayos X

o UV. El hecho que la cafeína,conocida por su efecto inhibidor sobre

la reparacio'n del daño producido por UV, actúe también sobre el daño

producido por rayos X,habla en favor de esa hipótesis.

En levaduras diploides comprobamos variaciones en la rradiosensibilidad

dependientes de la edad celular ,tratando la poblacio'n con rayos Ü.V.

Se estudiará ahora el efecto de inhibidores aobre esta respuesta celular

y se comparará con la obtenida aplicando rayos X.

Conclusiones.

l) La sensibilidad a los rayos X de levaduras diploide3 y hexaploides

varia durante su ciclos de generación* £1 máximo de radioresistencia

corresponde a la fase de brotamientojdurante la cual se sintetiza

ADN,y el míndmo,& la interdi-visión.

2)2n levaduras diploides tratadas con cafeína después de la irradiación,

se suprime el aumento de radiorresistencia,típico de la fase de brotaraiento.

Estos resultados indican que las variaciones en radiosensibilidad se

deben a la efectividad cíclica de un sistema de reparación enzimático,

sensible a la cafeína.

3)La capacidad de recuperación celular después de la irradiación X '

en condiciones de baja actividad biosintética (liquid holding recovery),

está presente durante todas las fases del ciclo de generación de las

levaduras diploides. Sn esas condiciones se repara todo el daño potencial-

mente letal. EL daño irreversible es igual para las células de distintas

edades en el momento de la irradiación.

J+)Las células hexaploides son,durante todo su ciclo de generacion^mas sensibles

que las diploides.La fase radiosensible dura k&%, del ciclo en las células

diploides y 6 Q % en las hexaploides.Los cálculos de DMF y LD sugieren 1

50 ]que la efectividad del sistema de reparación en las células hexaploides es . ¡menor y deja de actuar durante un tiempo más prolongado. §

Bibliografía.

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yeast Saccharomyces cerevisiae,Nature (London) 193,256-257 (1962).

H / Nm

Fig. 1

Fig .2 a

0 •

óIfft—\—

30 60

cf 8 8 S120

ot /'lain

R:

•

fase radiorresistente

.1

Fig.2 b

30 60 90 120 150 ot / Bin4 II

.a

M

* • - — .

Fig.3 •

I.F.

1.0 -

.tí

.6

.4 -

D.P.

= 45»)

Fig 3 b

I.P.

, 1

.2 -

Tí

I.P.

D.P.

0 20 40 60 SO, 100 120 Uü 160 lea

m

1.0

.08

.06

.04

.02

.01

.006

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20 40 60 SO 100 140 160 D / kr*d

Resumen

Title of project; Repair mechanisms and variations in radiosensitivity within

the generation cycle of yeast cells.

Dr. ELia Nunes de Langguth

Dime period covered: II/I/69-II/3O/7I.

Resultados de distintos autores coinciden en señalar la influencia de sistemas de

reparación enzimáticos de la molécula de ADN,en la respuesta celular a la irra-

diación. En el presente trabajo se analizó el rol de la fermentación como

fuente energética de los procesos de reparación en levaduras (Saccharomyces

cerevisiae ) con deficiencia respiratoria, comprobándose que el consumo de

cantidades relativamente bajas de glucosa ,durante la fase lag posterior a

la irradiación ,es fundamental para asegurar la recuperación en estas

células .

Por otra parte,se estudió la respuesta a la irradiación X y ÜV de levaduras diploides

de distintas edades» Se comprobaron variaciones en la radiosensibilidad a través

del ciclo de generación ;se determinó ia- duración de las fases de distinta sen-

sibilidad y el efecto de la cafeína sobre las mismas . 3e investigó también

la capacidad de recuperación (liquid holding recovery) en levaduras diploides

de distintas edades, irradiadas con rayos X. Los datos obtenidos son coherentes

con la hipótesis que las variaciones en radiosensibilidad durante el ciclo

celular se deben a la acción cíclica de uno o más sistemas de reparacidn,bajo

control genético.

La diferencia de radiosensibilidad entre poblaciones de levaduras diploides y

hexaplo^des se analizó teniendo en cuenta la duración de la fase radiorresistente

y la eficiencia de los sistemas de reparación.

Método experimental.Se usaron las cepas de levaduras descriptas por Laskowski,196O.

Dos de ellas,normale3,diploide (211) y hexaploide (600) y una tercera (211-p)

con deficiencia respiratoria,mutante "petit" espontánea ,aislada de la 211.

Fuentes de irradiación: Hayos Ü.V.,lámpara Philips TUV,15 W,distaricia

I

I

.2,

lámpara -objeto:20 cm,3^ erg/mm .seg. Rayos X: máquina Picker,con tubo

Machlett OBG-60,50 KV,4Q UTA,distancia foco -objeto 10 cm,56 krad/min.5

Las suspensiones celulares (10 celulas/tnl) se irradiaron en cajas de

Petri'de 5 era de diámetro,conteniendo 5 mi de la suspensión celular ,

bajo agitación magnética continua. Todos los experimentos se realizaron ao

una temperatura de 30 C.

Se usaron los métodos de sincronización celular de Xilliamson y Scones (1962)

y,posteriormente,el de Hartwell (1970). Cuando interesaba investigar la

recuperación inducida (liquid holding recovery) se suspendieron muestras de los

cultivos irradiados en agua destilada,durante períodos de 1 a 4 días des-

pués de la exposición.Luego se sembraron en medio nutriente (YED-agar).

Las células con deficiencia respiratoria se suspendieron su soluciones de

distintas^oncentraciones de glucosa (0,015-0,30 ^),después de la irradiación,

para inducir la recuperación.

Resultados. Sn las figuras I-IV y en la tabla I se resumen los resultados

sobre la recuperación en la cepa 211-p (con deficiencia rsspiratoria),

irradiada con luz UV, La figura I muestra ls curva de sobrevida e los

rayos iJV ele las células "r.etit", s librad a rj inmediateirante despuís de la

exposición. Los círculos sLiertos indican la sobrevida de spués del tratamiento

de incubación en agua destilada;se verifica falte cié recuperación. La fig.

II nuestra el aumento de ]a fracción sobreviviente cuando las células se incuban

en concentraciones relativamente bajas de glucosa (círculos abiertos),en fase lag,y luego se siembran en medio nutriente.

Los círculos negros indican la sobrevida de la población sembrada en medio

nutriente inwediatamente después de la irradiación.

¿n la figura III se representa la fracción sobreviviente en función del

tiempo de incubacio'n en 0,152 de glucosa previo al sembrado en medio nutriente

(tiempos de exposición al Uv" : 90 y 40 seg).La velocidad de recuperación

es menor para la dosis mas baja. En la figura IV se aprecia que la recuperación

es maxima para concentraciones intermedias de glucosa en el medio de incubación

•-?=

.3.

FR esta definido en la tabla I.Allí,0 y 24 (horas)son los tiempos de

incubación previa. ••• .

Variaciones en radiosensibilidad durante el ciclo de generación de

células diplmides (figl y 2): iSn la fig 1 se aprecian las curvaste sobre-

vida a la irradiación X de levaduras diploides de distintas edades (<).

La fase más resistente corresponde al brotamiento (ver fig 2 ) . EL período

de mayor resistencia corresponde al 52% de la duración del ciclo. La

sensibilidad es máxima para oír 45', LD varía entre 33 y 73 kradj50

DMF ,calculado considerando la edad mas sensible (<*-=45') y la más

o es constante.(1,6* Dl-íF—2,5jt Suspendiendo las células-5

en fase resistente en cafeína (10 M ) durante 24 horas previamente a

la siembra en medio nutriente,se suprime la radiorresistencia. La curva de

sobrevida de estas células («£=0'gratadas con cafeína,coincide con la

de edad 45'. (ver fig l ) .

La capacidad de liquid holing recovery fue estudiada en células diploides

de. distintas edades(fig 3 a y 3 b).Las células irradiadas fueron sembradas

inmediatamente de-pues de la irradiación (IP) o luego de incubación en

agua destilada (DP), DMF es máximo para las células em fase sensible.

Las variaciones en radiosensibilidad a través del ciclo en levaduras hexaploidep

son cualitativamente semejantes a las de células diploides (fig 4 y 2 b).

DMF, calculado a partir de las curvas de sobrevida para células de máxima

y mínima resistencia es 1,6*DMF«2 .La duración de la fase resistente es

el 40/S de la duración del ciclo.

En levaduras diploides irradiadas con rayos Uvjse verificó la variación de

radiosensibilidad durante el ciclo de generación,con un máximo para

la edad (cc=45!) y un mínimo para la edad (*80')«

4

.4.

Conclusiones.

1)Contrariamente a lo que sucede con células de levadura diploides normales,

las células con deficiencia respiratoria (petit) son incapaces de recuperarse

de las lesiones letales sufridas por absorcicn da radiación U.V.,durante

incubacion¡en agua destilada después de la irradiación.

2)¿'s necesario agregar un substrato energético en el medio de incubación,

que aseare,durante le fase lag,la síntesis de una cantidad mínima de

compuestos "ricos en energía" suficiente para permitir la reparación a

nivel molecular,en ce'lulas con deficiencia respiratoria.

3) La velocidad de recuperación de estas células en medios conteniendo

concentraciones relativamente bajas de glucosa ( 0,015-0,30 %) es diferente

para distintos niveles de inactivación ,1o cual sugiere: la presencia de

dos tipos distintos de daño producido por rayos UV,un© para dosis bajas ( 1200erg )mmíseg

y otro para dosis mayoresjo la acción de dos sistemas distintos de reparación.

k) SI máximo de recuperación se logra para una concentración de glucosa en

el medio de incubación (previa a la siembra) de 0,15í. Para concentraciones

mayores ,disminuye la duración de la fase lag durante la cual se produce la

recuperación. La fermentación es la fuente en«rgética de la recuperación en

células con deficiencia respiratoria.

5) La sensibilidad a los rayos X y UV varía durante el ciclo de generación de

levaduras diploides normales.

6) £1 máximo de resistencia a los rayos X corresponde a la fase de brotamiento,

durante la cual se sintetiza ADN, y el mínimo a la interdivision.

7)3n levaduras diploides tratadas con cafeína después de la irradiación,se

suprime el aumento de resistencia durante el ciclo.Se sabe que la cafeína

inhibe la reparación post-i'radiación en otras líneas celulares.Nuestros

resultados sugieren que ese aumento de radiorresistencia se debe a la

acción de un sistema de reparación enzimático sensible a la cafeína.

Más experimentos son necesarios para dilucidar el efecto á== esta sustancia a

nivel molecular»

.5.

8)La capacidad de recuperación en condiciones de baja actividad metabólica

(liquid holding recovery) está presente durante todas las fases del ciclo de

generación de células diploides irradiadas con rayos X, La magnitud de la

recuperación medida por el aumento en la tasa de sobrevida,depende de la edad

celular, SI daño irreversible es igual para las células irradiadas en

distintas fases»

9)La respuesta a la irradiación X de células hexaploides de distintas edades

es cualitativamente similar a la de células diploides.Durante todo el ciclo

se obtienen curvas de inactivación sigmoides (contrariamente a lo que sucede

en células haploides) y el máximo de resistencia corresponde con la fase de

brotamiento. Perc la duración de la fass sensible es más prolongada y el

aumento de radiorresistencia durante el ciclo es relativamente menor,

lo que indicaría una menor eficacia en el sistema de reparación sensible a la

cafeína.

Trabajo publicado durante la realización de este contrato»

Langguth,E.N. y U.Gelos:Reparación del daño producido por radiación U.V.

en imitantes "petit" de Saccharomyces cerevisiae.Abstracts II

Jornadas Uruguayas de Ciencias Fisiológicas,p,14,Solis (1970).

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unirr.

irrad (80 s)

irrad (60 s)

16 t / hours

Fig. Ill

Table I

Dark rfecovsry of the petit strain of yeast depending

on doses and glucose concentration of storage medium.

Values of FR. ™ ~Í\ /"D>24 • I". -'Vu '

Survival

fraction

0.50-0.60

0.20-0.30

0.02-0.04-

0.005-0.010

1.0

liO

1.0

1.0

Glucoss

0.0153

• 1.5

2,0

3.5

5.B

-

concentration

D.

1

2

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1

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.2

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N : Wuir.ber of viable calls in the irradiation

N ; ".'unber of surviving cells pottirradiatiün»

Fig. I