Aula 02 - Ferramentas e Técnicas Básicas de Análise de Dna
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Aula 02 - Ferramentas e Técnicas Básicas de Análise de DNA
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21/06/2013
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FERRAMENTAS E TCNICAS BSICAS DE ANLISE DE DNA
E CLONAGEM
Disciplina: Biotecnologia FarmacuticaDisciplina: Biotecnologia Farmacutica
No filme Parque dos Dinossauros ...
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Dolly
CLONAGEM GNICA OU MOLECULAR
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FERRAMENTAS E
TCNICAS DE ANLISE
PCR (PolimeraseChainReaction)
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Sequenciamento do DNA
Sequenciamento do DNA
A T C G C C A G C T T T A C T T T A C G
T A G C G G T C G A A A
FITA DNAFITA DNA
A
T
CG
AT
C G
BIG DYEBIG DYE
T
A
CG
T G A A
STOPSTOP
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Sequenciamento do DNA
eletroferograma
A gama de enzimas para a manipulao do DNA
(1) Nucleases
(2) Ligases
(3) Polimerases
(4) Enzimas modificadoras
(5) Topoisomerases
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Enzimas de Restrio
tb conhecidas como Endonucleases de Restrio
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NomenclaturaEcoRI E = gnero Escherichia
co = espcie coli
R = cepa RY13
I = primeira endonuclease identificada
- Reconhecem sequncias de 4 a 8 nucleotdeos
- Sequncias palindrmicas
- Escritas em 5 3
Ex. GAATTC
CTTAAG
Mapas de restrio
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Eletroforese
Mtodos de colorao de gis
Brometo de Etdio
Nitrato de Prata
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CLONAGEM GNICA OU MOLECULAR
O vetor plasmidial
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A clula hospedeira E.coli: organismo mais
utilizado em Biologia
Molecular;
Aceita DNA exgeno de
qualquer organismo;
Presente na flora bacteriana
normal humana;
Cresce 37graus e meio de
cultura similar ao TGI (LB).
Transformao
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Transformao
No laboratrio:
Cloreto de Clcio e choque trmico.
Ca++
42 graus
Eletroporao
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No Laboratrio...
Normas de biossegurana
O Conselho Tcnico Nacional deBiossegurana (CTNBio) o rgoresponsvel pela normatizao efiscalizao dos trabalhos que envolvemtransgnicos e engenharia gentica deforma geral, inclusive os aspectos ticos.
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Trabalhando com E.coli
Uso de cepas no-patognicas.
Descarte com responsabilidade:
- Flambe a ala ao manipular;
- Mantenha seu rosto longe do tubo;
- No incube as placas por muito tempo;
- Autoclave todo o material usado antes de descart-lo.
Prticas microbiolgicas-padro
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Prticas microbiolgicas-padro
Prticas microbiolgicas-padro
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Uso do brometo de etdioAgente intercalante marcador de cidos nucleicos.
Se intercala no DNA: poderoso efeito mutagnicoe, possivelmente pode ser cancergeno outeratognico.
USAR !!! :
Medies e micropipetagem
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Anlise do DNA com enzimasde restrio
Anlise do DNA com enzimasde restrio
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Anlise do DNA com enzimasde restrio
SISTEMAS-MODELO
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E. coli
E.coli e outras bactrias:
estudo do metabolismo catabolismo e anabolismo
Levedura
Estudo de processos moleculares: diferenas entre procariotos e eucariotos
So eucariotos unicelulares;
Haplides;
Crescem muito rpido (duplicam em 2h);
Poucos equipamentos, simples. Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pomble.
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O verme nematide
Eucarioto multicelular;
pequeno e fcil de manter;
3 dias de ovo a adulto;
Caenorhabditis elegans
Mosca-da-fruta
Estudo de mutantes;
Produzem centenas de descendentes em poucos dias;
Ovo a adulto em 12 dias;
Drosophila melanosgaster
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Outros
Peixe-zebra (paulistinha)
Anfbios
Galinha
Camundongo
Clulas humanas
Plantas
