Atopy patch test in patients with atopic eczema/dermatitis syndrome: comparison of petrolatum and aqueous solution as a vehicle

J.M. Oldhoff, MD, I.C. Bihari, E.F. Knol , PhD, C.A.F.M. Bruijnzeel-Koomen, MD, PhD and M.S. de Bruin-Weller, MD, PhD Department of Dermatology/Allergology, University Medical Centre, Utrecht, The Netherlands

Allergy 2004: 59: 451-456 

Abstract  Background The atopy patch test (APT) is an  in vivo model to study the induction of eczema by  inhalant allergens. This study was designed to compare two commonly used APT methods.  Methods In the first method, the allergen is dissolved in aqueous solution, which is applied on  tape‐stripped  skin.  In  the  second  method,  the  allergen  is  dissolved  in petrolatum  and  applied without  tape  stripping.  Thirteen  patients  with  atopic dermatitis sensitized to inhalant allergens were patch tested using both methods. Reactions were evaluated macroscopically and microscopically after 48 h.  Results  Nine  out  of  13  patients  displayed  a  positive  reaction  for  both methods.  One patient  had  a  positive  APT  for  the  aqueous method  alone  and  three  for  the petrolatum method alone. Reactions were significantly stronger when using  the petrolatum method. Histological  evaluation  of  nine  patients  positive  for  both methods showed no significant differences in number of eosinophils, T‐cells and neutrophils. Conclusion The  APT  using  the  petrolatum  vehicle  induces  a  higher  number  of  positive reactions  and  is  significantly  stronger  relative  to  the  APT  using  allergen  in aqueous  vehicle.  The  cellular  influx  in  both  test methods  is  comparable.  Both methods  can  be  used  to  study  the mechanisms  in  the  induction  of  eczema  by inhalant allergens. 

APT:  comparison of two methods

Introduction  The  atopy  patch  test  (APT)  is  a  frequently  used  in  vivo  model  to  study  the mechanisms  involved  in the  induction of eczema by  inhalant allergens. Mitchell et al. first demonstrated that epicutaneous application of inhalant allergens could induce  eczematous  skin  lesions  in  patients  with  a  positive  immediate  skin reaction  to  the  same  allergen1.  Thereafter, many  groups  studied  the APT  as  a model  to  investigate  the  role  of  aeroallergens  and  food  allergens  in  the  atopic eczema/dermatitis  syndrome  (AEDS)2‐10.  Allergic  diseases  such  as  AEDS  are mediated by allergen‐specific IgE and a crucial role has been ascribed to the Th2‐cells responsible for a high production of IL‐4, IL‐5, IL‐13 and a low presence of IFNγ. In AEDS patients, the majority of T‐cells in acute lesional skin also appear to be of the Th0/Th2‐type, producing IL‐4 and IL‐511. The early APT reaction, up to 24 h after application, is likewise characterized by an increased IL‐4 production by  infiltrating T‐cells,  thereby  resembling  the T‐cell phenotype of acute  lesional skin12. However, in chronic lesional skin the majority of the lymphocytes show a Th1‐cytokine  profile,  producing  IFNγ13.  Looking  subsequently  at  the  late APT reaction at 48‐72 h, a switch from the original Th2/Th0 cytokine profile towards a Th1  skewed  cytokine  pattern was  found,  showing  an  increased  level  of  IFNγ, resembling  chronically  inflamed  skin  in  AEDS14;15.  Furthermore,  histological evaluation of the cellular infiltrate of the APT reaction shows close resemblance to lesional  skin with  a dermal  infiltrate predominantly  consisting  of CD4+ T‐cells and activated eosinophils14;16.  

The mechanism  involved in the  induction of the eczematous reaction by the APT  has  been  extensively  studied7;12;14;17‐22.  The  hypothesis  of  the  reaction mechanism  of  the APT  is  that  allergens  penetrate  the  skin  and  bind  to  FcεRI‐bound IgE on Langerhans cells. The Langerhans cell recognizes the allergen and presents  the  antigen  subsequently  to  T‐cells22;23.  T‐cells  of  the  Th2  phenotype proliferate  and  move  to  the  place  of  allergen  exposure  initiating  local inflammation by release of IL‐4 and IL‐5.   Many  different  methods  have  been  developed  for  APT.  The  differences  in methodology  include  differences  in  the  source  of  the  allergens,  vehicles, pretreatment  procedures  of  the  skin,  application  site  and  reading  time  of  the patch test2;4;8;9;24‐26. Owing to these factors, large variations exist in the macroscopic outcome of the APT27. For this reason, Langeveld‐Wildschut et al. and Darsow et al. extensively studied the methodology of APT25;26.      Darsow  et  al.  advised performing  the APT without pretreatment  of  the  skin using petrolatum as the vehicle and a high allergen concentration. Reading time was recommended at 48 and 72 h26. 

55 

Chapter 4

    Langeveld‐Wildschut  et al.  recommended  tape  stripping  the  skin 10  times as pretreatment, using a high allergen concentration of 10 000 AU/ml dissolved in an aqueous solution. The optimal reading time was at 24 and 48 h25. Both methods  recommend non‐lesional  skin of  the back as  the best application site. The aim of  the present  study  is  to  compare  the above‐mentioned methods macroscopically and histologically.   Methods  Patients Thirteen patients  (seven women and six men; age range 19‐49 years; mean age, 28.5 years) with AEDS were studied28. Of the 13 patients studied, three also had allergic  rhinitis,  three  had  allergic  asthma,  three  had  both  allergic  rhinitis  and asthma and four no other allergic disorders apart from AEDS. Patients  had  not  taken  oral  immunosuppressive  drugs,  including  oral corticosteroids,  for  at  least  1  month  before  the  APT  was  performed.  Oral antihistamine  drugs  and  topical  treatment  of  the  back with  corticosteroid was discontinued  for  at  least  14 days  before  the APT was  performed. None  of  the patients were treated with ultraviolet light radiation for at least four weeks before testing. 

Clinical  activity  of  skin  lesions  was  established  using  the  objective SCORAD29. All patients had a score between 15 and 40. All patients had positive skin prick tests to at least one aeroallergen. The characteristics of all patients are shown in Table 1. All participants in this study gave their informed consent. This study was approved by the local medical ethical committee.  Atopy patch test APTs were  performed  on  clinically  uninvolved  skin  of  the  back with  the  two methods to be compared. 

The  aqueous method was previously described  by Langeveld‐Wildschut  et al25.  The  test  sites  are  stripped  10  times  with  adhesive  tape  (Transpor hypoallergenic  tape;  3M  Health  Care,  St.  Paul,  MN.)  before  application  of aqueous allergen preparation. Commercially available allergen preparations were used  (0.08 ml/test)  from Haarlem’s Allergenen  Laboratorium  (HAL)  (Haarlem, The  Netherlands)  containing  Dermatophagoides  pteronyssinus  (HdM)  and  grass pollen (GP) in concentrations of 10 000 allergy unit (AU)/ml. The allergens were dissolved in HAL buffer solution consisting of a buffered salt solution. The buffer solution was applied as a negative control in all subjects. The test was performed with Leukotest patches (Beiersdorf AG, Hamburg, Germany). 

56 

APT:  comparison of two methods

Table 1   Patient charcteristics 

Patient  Age  AR  AA  SCORAD  SPT   1  26  +  ‐  nd  HdM  2+   2  33  ‐  +  34.2  HdM  3+   3  21  ‐  +  34  HdM  3+   4  26  +  +  29.9  GP      3+   5  39  ‐  +  33.5  HdM  3+   6  35  ‐  ‐  31.1  HdM  3+   7  19  +  +  39.1  HdM  2+   8  28  +  +  23.5  HdM  3+   9  19  +  ‐  37.3  HdM  2+   10  25  ‐  ‐  28.7  GP      2+   11  23  +  ‐  29.2  HdM  3+   12  28  ‐  ‐  20.8  HdM  3+   13  49  ‐  ‐  27  HdM  3+    AR, allergic rhinitis; AA, allergic asthma; SPT, skin prick test; HdM, house dust mite; GP, grass pollen.  The petrolatum method was previously described by Darsow et al26. In brief, the allergens  (HdM and GP) were dissolved  in  the petrolatum vehicle  (Stallergènes S.A.  , France) and applied with  large Finn  chambers  (Epitest Ltd., Oy, Finland; diameter  =  12  mm).  The  allergenic  potency  was  translated  as  an  index  of reactivity  (IR) and was 200  IR/ml  for all allergens. Petrolatum was applied as a negative  control  in  all  subjects.  No  tape  stripping  was  done  before  allergen application.  The  patch  test  reactions  in  patients  positive  for  both methods were  compared macroscopically after 48 h. Patch test reactions were recorded as positive when at least  erythema  and  induration  occurred  and  no  reaction was  observed  in  the control  patch:  1+,  erythema with  slight  induration,  2+, marked  erythema  and induration, papules, 3+, marked erythema and induration, papules and vesicles.  Biopsy specimens   Punch biopsy specimens (3 mm) were taken from  the APT positive sites at 48 h after application of  local anaesthesia  (2% xylocaine). Biopsies were  taken when the APT was positive  for both methods. Biopsies were  immediately  fixed  in 4% formalin  and  stored  in  small  vials.  Subsequently,  biopsies were  embedded  in paraffin  using  an  automatic  tissue  processor  (Histokinette).  Paraffin‐embedded tissue was  stored  at  room  temperature  until  further  handling.  Sections  (5μm) 

57 

Chapter 4

were  cut  from  the  paraffin‐embedded  skin  tissue  and  mounted  on  3‐aminopropyltriethoxysilane‐coated  (Sigma‐Aldrich,  Steinheim,  Germany)  glass slides.  Histochemical staining  Histochemical  staining  was  done  with  haematoxylin,  Congo  red  and Chromotrope  2R.  For  haematoxylin,  the  slides  were  incubated  for  15  min  in haematoxylin (Merck, Darmstadt, Germany). Subsequently, they were incubated for 10 min in tap water under flow, and then incubated for 2 min in eosin [0.5% in ethanol (96%)] (Chroma‐Gesellschaft Schimd & Co, Stuttgart, Germany).  

For Congo red, the slides were stained in haematoxylin (Merck) for 10 s and then incubated for 5 min in tap water under flow. Subsequently, the slides were stained  in  the  solution  containing  0.5%  Congo  red  (Fluka  A.G.  Buchs, Switzerland) in ethanol/0.1 M glycin (1 : 1) for 20 min. The slides were then rinsed in 70% ethanol until the background became clear30. 

For Chromotrope 2R the slides were stained in haematoxylin (Merck) for 30 s, incubated  in  tap  water  under  flow  for  5  min,  and  then  stained  in  0.5% Chromotrope 2R (Sigma‐Aldrich) containing 1% phenol crystals for 60 min31.  Immunohisto/cytochemical staining Monoclonal antibodies (mAb) against eosinophilic cationic protein in eosinophils (EG2, Pharmacia, Uppsala, Sweden), neutrophils (elastase, Dako, High Wycombe, UK)  and  T‐cells  (CD3,  Becton  Dickinson,  San  Jose,  CA)  were  employed  for immunohisto/cytochemical staining.  For  EG2,  slides  were  incubated  with  1:  50  diluted  EG2  in  1%  bovine  serum albumin  (BSA)  in  phosphate‐buffered  saline  (PBS),  subsequently  Powervision Poly AP‐Anti mouse  (Immunologic, Duiven,  the Netherlands) was  added  and incubated for 30 min.  

Alkaline  phosphatase  activity  was  demonstrated  using  naphtol‐ASMX phosphate  (Sigma‐Aldrich)  as  substrate  and  new  fuchsine  solution  (Merck)  as chromogen resulting in blue staining. Subsequently, the slides were stained with haematoxylin (Merck) for 10 s and rinsed in tap water for 5 min32;33. 

For  elastase, neutrophils were  stained, using  the  same method  as  for EG2, using  anti‐elastase  1:  25  in  the  incubation  step.  The  incubation  step  for  this procedure lasts 60 min. For CD3, de‐paraffined sections of 10 μm were heated at 95‐100 °C in EDTA‐buffer solution for 10 min. T‐cells were subsequently stained using  the  same method  as  for EG2, using monoclonal mouse  antibody  against CD3  1  :  50 dilutions  in  the  incubation  step. As  the  second  antibody,  goat–anti 

58 

APT:  comparison of two methods

rabbit biotin 1: 300 in 1% BSA in PBS was used. No Powervision was used in this procedure.   Quantification of staining Skin  sections  stained  with  EG2  and  Congo  red  were  examined  by  light microscopy  at  x400  magnification  by  a  blinded  observer.  Before  evaluation, sections were compared with either  the  isotype‐control‐stained counter‐sections or with the nonstained counter‐sections. Positive cells in the dermis were counted in  three  different  sections  of  1‐1.5 mm2  per  section  and  calculated  as  cells  per square  millimetre.  In  fields  containing  sweat  ducts  and  hair  shafts,  only intervening  dermal  regions  were  counted.  The  number  of  CD3  positive  and elastase positive cells was assessed using a three point scale; ‐, few positive cells/ as in normal skin; +, moderate presence of positive cells; ++, pronounced presence of  positive  cells.  The  dermal  and  epidermal  compartments  were  examined separately. 

One  out  of  every  five  analyses  was  controlled  by  a  second  independent observer. The mean interobserver coefficient of variation was approximately 10%.   Statistical analysis Statistical analysis was performed using the program SPSS for Windows (version 10.0.5,  1999).  The  two  groups were  analyzed  by  the  nonparametric Wilcoxon signed  rank  test  for  paired  samples  in  case  of  ordinal  values  and  in  case  of categorical data the ‘marginal homogeneity test’ was performed.    Results  Of the 13 patients, nine were positive for both methods (eight HdM, one GP). The macroscopic outcome (n = 13) of both methods is shown in table 2.  The largest number of positive tests was demonstrated after applying the allergen by  the  petrolatum method  (12  vs  10). One  patient  had  a  positive APT  for  the aqueous method alone  (HdM), whereas 3 showed positive reactions  for  just  the petrolatum method (two HdM, one GP). Furthermore, more pronounced positive reactions were  recorded  after  testing  by  the petrolatum method  (P  <  0.05). All reactions  showed  erythema  and  induration  and  12 out  of  22 positive  reactions also showed papules, resembling lesional skin.      

59 

Chapter 4

Table 2    Macroscopic outcome  Patient  Allergen  Aqueous  Petrolatum 1  HdM  1+  2+ 2  HdM  2+  2+ 3  HdM  1+  2+ 4  GP  1+  1+ 5  HdM  2+  3+ 6  HdM  2+  2+ 7  HdM  1+  2+ 8  HdM  1+  1+ 9  HdM  2+  2+ 10  GP  0  2+ 11  HdM  0  1+ 12  HdM  0  1+ 13  HdM  1+  0  Reading  time of  the APT at 48 h after allergen application: 0, no reaction present; 1+, erythema and induration; 2+, erythema, induration and papules; 3+, erythema, induration and papules and vesicles. HdM, house dust mite; GP, grass pollen.  Microscopic evaluation was performed on biopsies of the positive APTs (n = 18) of patients who showed a positive reaction upon testing with either method (n = 9). All sections resembled lesional AEDS, showing hyperkeratosis and spongiosis of  the  epidermis  and  a  cellular  influx  consisting  of  predominantly  T‐cells  and eosinophils (see Fig. 1). Histological evaluation showed eosinophils in all sections. Although  large  individual  differences were  recorded,  no  significant  difference was  found  in  the  number  of  eosinophils  (P  =  0.77)  between  the  two  tested methods.  The mean  number  of  eosinophils  in  the  aqueous  vs  the  petrolatum method was 124 ± 44 vs 153 ± 41 mm‐2 (mean ± S.E.M.) (Table 3). CD3+ cells were scored semiquantitatively. Large  infiltrates were seen  in all sections showing no significant differences between the two methods (P = 0.317). Neutrophils were not detected in 16 out of the 18 positive APT reactions. In patient 1, some neutrophils were detected in both APT reactions. No differences in neutrophil presence were found between the two methods.    

60 

APT:  comparison of two methods

Table 3   Microscopic evaluation  Patient  Eosinophils  Neutrophils  CD3 + cells   Aqueous  Petrolatum Aqueous  Petrolatum Aqueous  Petrolatum 1  178  157  +  +  ++  ++ 2  149  48  ‐  ‐  ++  ++ 3  398  111  ‐  ‐  ++  ++ 4  29  2  ‐  ‐  ++  ++ 5  48  310  ‐  ‐  ++  ++ 6  242  66  ‐  ‐  ++  ++ 7  25  221  ‐  ‐  +  ++ 8  8  98  ‐  ‐  +  ++ 9  41  364  ‐  ‐  ++  ++ Mean ± SEM 

124 ± 44 

153 ± 41         

 

Microscopic evaluation of biopsies from positive APTs of the patients who showed a positive reaction to both methods. Eosinophils in count/mm2. Neutrophils: ‐, no neutrophils present/as in normal skin; +,  >10  neutrophils/field. CD3+  T‐cells:  +, moderate  infiltrate  of  positive  cells;  ++,  large  infiltrate  of positive  cells. APT,  atopy patch  test; Aqueous,  aqueous APT method; Petrolatum, petrolatum APT method. 

 

Discussion   The  aim  of  the  present  study was  to  evaluate  two  commonly  employed APT methods  as  in  vivo models  to  study  allergic  inflammation  in AEDS.  The  first method uses an aqueous solution as a vehicle (‘aqueous method’) and the second petrolatum as a vehicle (‘petrolatum method’)25;26.  

Macroscopic results showed erythema and induration in all cases and in 50% papules, which  resemble  lesional  skin,  in both  types of  application. All  control patches with vehicle  alone were negative,  indicating  that vehicle  alone did not induce  an  irritant  reaction.  This moreover  demonstrated  the mild  effect  of  the tapestripping done in the aqueous method.  

The reactions recorded showed that the petrolatum method induced a higher number  of positive  reactions  and  that  the  reactions were  significantly  stronger than  when  the  aqueous  method  was  used.  A  possible  explanation  for  this difference may be the reading time point.  

61 

Chapter 4

Figure 1 

 Patient  2:  Congo  red  staining,  400x  magnification.  (A)  Petrolatum  method:  histology  showing  a dermal infiltrate consisting of eosinophils, T‐cells and no neutrophils. (B) Aqueous method: histology showing a dermal infiltrate consisting of eosinophils, T‐cells and no neutrophils.  Reading  time  in  this  study  was  chosen  at  48  h  after  application,  since  both methods showed positive reactions at 48 h in previous studies25;34. However, the aqueous method has been previously shown to display a positive reaction at only 24 h which  in most  cases persists until  48 or  even  72 h, but  in  some  cases has disappeared by 48 h7;25. This is in contrast to the petrolatum method, which shows a  peak  severity  of  the  APT  reaction  at  48  h26.  Therefore,  the  reaction  of  the aqueous method recorded  in  this study could have been past  its maximum and subsequently  less pronounced or even absent at 48 h. Another explanation may be  the  allergen  concentration  used.  The  two  types  of  application  use  different methods  to  identify  the  allergen  concentration  (index  of  reactivity  vs  allergy units). Therefore,  a difference  in  allergenic  capacity may be  responsible  for  the stronger reaction recorded in the petrolatum method.  

62 

APT:  comparison of two methods

Histological  evaluation  of  both  methods  showed  typical  morphological characteristics  of  eczema  with  acanthosis,  hyperkeratosis,  spongiosis  of  the epidermis and a cellular influx consisting of eosinophils and T‐cells. The average number  of  eosinophils  counted  in  both  methods  did  not  differ  significantly, although large individual variations were observed. The presence of eosinophils in  all  cases  indicates  that  an  allergic  reaction  occurs  during  the APT  reaction. Moderate  to mostly  large  T‐cell  infiltrates  were  seen  in  all  positive  reactions resembling lesional skin. In eight patients no influx of neutrophils was detected in the two methods studied. In patient 1, a minor influx of neutrophils was seen. An influx of neutrophils can be the result of irritation or bacterial infection. However, no clinical signs of infection were seen at the tested site in the patient. In addition, control patch  test  reactions were negative,  indicating  that no  irritation  reaction due  to  occlusion  of  the  vehicle  had  occurred.  The  overall  low  number  of neutrophils  is  in  concordance with  the  histology  of  lesional AEDS‐skin, where neutrophils are also sparsely present. This is in contrast to the late phase reaction after  intracutaneous  challenge  where  neutrophils  are  present  in  the  infiltrate, possibly due to traumatic disruption or the direct degranulation of mast cells16.  

Following our data, both aqueous and petrolatum methods can be used as an in vivo model to study allergic inflammation in AEDS. The choice of the method mostly depends on the experience of the investigator. The petrolatum method is easier  to  perform;  no  pretreatment  of  the  skin  is  needed  and  reactions  are macroscopically  more  pronounced  than  the  aqueous  method.  However,  it  is important  to realize  that  large differences exist between reactions with different allergen extracts dissolved  in petrolatum of different suppliers35. The advantage of the aqueous method is that this method has been investigated more extensively as  a  pathophysiologic  model  of  AEDS,  showing  good  reproducibility  and specificity  rates25.  It  is  stressed  that  allergen  sources  other  than  the  currently described have to be compared in the future before the same conclusions can be drawn. 

Summarizing,  the  reactions  to  both  APT  methods  studied  show  great similarity  to  lesional AEDS skin, macroscopically showing erythema,  induration and  papules.  Furthermore,  microscopically  the  dermal  infiltrate  consisted predominantly  of  T‐cells  and  eosinophils  with  hardly  any  neutrophils, resembling  lesional skin.  In conclusion, both methods can be used as an  in vivo model to study allergic inflammation in AEDS. 

 

We thank R.C.M. Kiekens for control counting, M.B.G. Koek, MD for her assistance with statistical analyses and A. Gasten for correcting the manuscript. 

63 

Chapter 4

References     1.   Mitchell EB, Crow  J, Chapman MD  et  al. Basophils  in allergen‐induced patch  test  sites  in 

atopic dermatitis. Lancet 1982; 1(8264): 127‐30.   2.   Gondo A, Saeki N, Tokuda Y. Challenge  reactions  in atopic dermatitis after percutaneous 

entry of mite antigen. Br.J.Dermatol. 1986; 115: 485‐93.   3.   Niggemann B, Reibel S, Wahn U. The atopy patch test (APT)‐‐ a useful tool for the diagnosis 

of food allergy in children with atopic dermatitis. Allergy 2000; 55: 281‐5.   4.   Norris  PG,  Schofield  O,  Camp  RD.  A  study  of  the  role  of  house  dust  mite  in  atopic 

dermatitis. Br.J.Dermatol. 1988; 118: 435‐40.   5.   Langeland T, Braathen LB, Borch M. Studies of atopic patch tests. Acta Derm.Venereol.Suppl 

(Stockh) 1989; 144: 105‐9.   6.   Clark RA, Adinoff AD. Aeroallergen contact can exacerbate atopic dermatitis: patch tests as 

a diagnostic tool. J.Am.Acad.Dermatol. 1989; 21: 863‐9.   7.   Bruynzeel‐Koomen CA, Van Wichen DF, Spry CJ et al. Active participation of eosinophils in 

patch  test  reactions  to  inhalant  allergens  in patients with  atopic dermatitis. Br.J.Dermatol. 1988; 118: 229‐38. 

  8.   Voorst Vader PC, Lier JG, Woest TE et al. Patch tests with house dust mite antigens in atopic dermatitis patients: methodological problems. Acta Derm.Venereol. 1991; 71: 301‐5. 

  9.   Seidenari  S, Manzini  BM, Danese  P  et  al.  Positive  patch  tests  to whole mite  culture  and purified mite extracts  in patients with atopic dermatitis, asthma, and  rhinitis. Ann.Allergy 1992; 69: 201‐6. 

  10.   Imayama S, Hashizume T, Miyahara H et al. Combination of patch test and IgE for dust mite antigens  differentiates  130  patients  with  atopic  dermatitis  into  four  groups. J.Am.Acad.Dermatol. 1992; 27: 531‐8. 

  11.   Hamid Q, Boguniewicz M, Leung DY. Differential in situ cytokine gene expression in acute versus chronic atopic dermatitis. J.Clin.Invest 1994; 94: 870‐6. 

  12.   Van Reijsen FC, Bruijnzeel‐Koomen CA, Kalthoff FS et al. Skin‐derived aeroallergen‐specific T‐cell  clones  of  Th2  phenotype  in  patients with  atopic  dermatitis.  J.Allergy Clin.Immunol. 1992; 90: 184‐93. 

  13.   Grewe M, Gyufko K,  Schopf  E  et  al.  Lesional  expression  of  interferon‐gamma  in  atopic eczema. Lancet 1994; 343: 25‐6. 

  14.   Thepen T, Langeveld‐Wildschut EG, Bihari IC et al. Biphasic response against aeroallergen in atopic dermatitis  showing a  switch  from an  initial TH2  response  to a TH1  response  in situ: an immunocytochemical study. J.Allergy Clin.Immunol. 1996; 97: 828‐37. 

  15.   Grewe M, Walther S, Gyufko K et al. Analysis of  the cytokine pattern expressed  in situ  in inhalant allergen patch  test  reactions of atopic dermatitis patients.  J.Invest Dermatol. 1995; 105: 407‐10. 

  16.   Langeveld‐Wildschut EG, Thepen T, Bihari IC et al. Evaluation of the atopy patch test and the cutaneous late‐phase reaction as relevant models for the study of allergic inflammation in patients with atopic eczema. J.Allergy Clin.Immunol. 1996; 98: 1019‐27. 

  17.   Bruynzeel‐Koomen C, van der Donk EM, Bruynzeel PL et al. Associated expression of CD1 antigen and Fc  receptor  for  IgE on  epidermal Langerhans  cells  from patients with atopic dermatitis. Clin.Exp.Immunol. 1988; 74: 137‐42. 

  18.   Tanaka Y, Tanaka M, Anan S  et al.  Immunohistochemical studies on dust mite antigen  in positive reaction site of patch test. Acta Derm.Venereol.Suppl (Stockh) 1989; 144: 93‐6. 

  19.   Tanaka Y, Anan S, Yoshida H. Immunohistochemical studies in mite antigen‐induced patch test sites in atopic dermatitis. J.Dermatol.Sci. 1990; 1: 361‐8. 

  20.   Bruynzeel‐Koomen CA,  Bruynzeel  PL. A  role  for  IgE  in  patch  test  reactions  to  inhalant allergens in patients with atopic dermatitis. Allergy 1988; 43 Suppl 5: 15‐21. 

64 

APT:  comparison of two methods   21.   Bruynzeel‐Koomen C. IgE on Langerhans cells: new insights into the pathogenesis of atopic 

dermatitis. Dermatologica 1986; 172: 181‐3.   22.   Bruynzeel‐Koomen C, Van Wichen DF, Toonstra  J et al. The presence of  IgE molecules on 

epidermal Langerhans cells in patients with atopic dermatitis. Arch.Dermatol.Res. 1986; 278: 199‐205. 

  23.   Bruynzeel‐Koomen  CA, Mudde  GC,  Bruijnzeel  PL. New  aspects  in  the  pathogenesis  of atopic dermatitis. Acta Derm.Venereol.Suppl (Stockh) 1989; 144: 58‐63. 

  24.   de Groot AC, Young  E. The  role  of  contact  allergy  to  aeroallergens  in  atopic dermatitis. Contact Dermatitis 1989; 21: 209‐14. 

  25.   Langeveld‐Wildschut  EG,  van  Marion  AM,  Thepen  T  et  al.  Evaluation  of  variables influencing the outcome of the atopy patch test. J.Allergy Clin.Immunol. 1995; 96: 66‐73. 

  26.   Darsow  U,  Vieluf  D,  Ring  J.  Atopy  patch  test  with  different  vehicles  and  allergen concentrations: an approach to standardization. J.Allergy Clin.Immunol. 1995; 95: 677‐84. 

  27.   Bruin‐Weller MS, Knol EF, Bruijnzeel‐Koomen CA. Atopy patch testing‐‐a diagnostic tool? Allergy 1999; 54: 784‐91. 

  28.   Johansson  SG, Hourihane  JO,  Bousquet  J  et  al.  A  revised  nomenclature  for  allergy.  An EAACI position statement  from  the EAACI nomenclature  task  force. Allergy 2001; 56: 813‐24. 

  29.   Kunz  B, Oranje AP,  Labreze  L  et  al. Clinical  validation  and  guidelines  for  the  SCORAD index: consensus report of the European Task Force on Atopic Dermatitis. Dermatology 1997; 195: 10‐9. 

  30.   Grouls  V, Helpap  B.  Selective  staining  of  eosinophils  and  their  immature  precursors  in tissue sections and autoradiographs with Congo red. Stain Technol. 1981; 56: 323‐5. 

  31.   Dourov N. [Microscopy of the thymus in the perinatal period]. Ann.Pathol. 1982; 2: 255‐61.   32.   Tai PC, Spry CJ, Peterson C  et al. Monoclonal antibodies distinguish between storage and 

secreted forms of eosinophil cationic protein. Nature 1984; 309: 182‐4.   33.   Ying S, Meng Q, Smith SJ  et al. Methods  for  Identifying human eosinophils  in blood and 

tissue. ACI International 2002; 14: 64‐71.   34.   Darsow U, Vieluf D, Ring J. Evaluating the relevance of aeroallergen sensitization in atopic 

eczema with  the  atopy  patch  test:  a  randomized,  double‐blind multicenter  study. Atopy Patch Test Study Group. J.Am.Acad.Dermatol. 1999; 40: 187‐93. 

  35.   Heinemann C, Schliemann‐Willers S, Kelterer D  et al. The atopy patch  test‐reproducibility and comparison of different evaluation methods. Allergy 2002; 57: 641‐5. 

    

  

65