Splicing Alternativo y La Progresión Tumoral

Resumen: El splicing alternativo es un mecanismo molecular clave para el aumento de la diversidad funcional de los proteomas eucariotas. Un gran chico de los datos experimentales implica corte y empalme aberrante en varias enfermedades humanas, incluyendo el cáncer. Ambas mutaciones en los elementos de corte y empalme que actúan en cis y alteraciones en la expresión y / o actividad dad de factores reguladores de empalme afectan drásticamente el perfil de empalme de muchos genes asociados con el cáncer. Además, el perfil de empalme de varios genes cancerassociated se altera en determinados tipos de cáncer argumentan a favor de un papel directo de las isoformas de corte y empalme específicos en la progresión tumoral.

Descifrando los mecanismos que subyacen a corte y empalme aberrante en el cáncer puede ser crucial para entender cómo se controla la maquinaria de empalme e integrado con otros procesos celulares, en particular, la transcripción y vías de señalización.  Por otra parte, la caracterización de la desregulación de empalme en el cáncer conducirá a una mejor comprensión de la transformación maligna. Variantes de splicing alternativo asociado al cáncer pueden ser nuevas herramientas para el diagnóstico y clasificación de los tipos de cáncer y podrían ser los objetivos de las intervenciones terapéuticas innovadoras basadas en enfoques de corrección de empalme altamente selectivos.

INTRODUCCIÓNDurante la evolución del número de genes dejó de crecer en paralelo con la complejidad del proteoma. Por lo tanto, el genoma humano contiene sólo 20,000-25,000 genes (Genoma Humano Consorcio Internacional de Secuenciación 2004), un número no significativamente diferente de la contadas en organismos menos complejos tales como erizos de mar (23.000) (Erizo de mar de Secuenciación del Genoma Consorcio 2006) y el nematodo gusano (19 000). Por otra parte, el número de genes humanos no es suficiente para dar cuenta de todas las proteínas reveladas por el análisis proteómico.¿Cómo se pueden explicar estas paradojas? Recientes cDNA secuencia y los datos de microarrays han implicado splicing alternativo (AS) como la principal fuente de diversidad funcional y proteómica en organismos metazoos. Junto con otros promotores y sitios de poliadenilación, edición de ARN y el procesamiento después de la traducción, COMO da lugar a un número estimado de al menos 100.000 proteínas humanas diferentes.

El término "splicing alternativo" describe cualquier situación en la que un único transcrito primario (pre-ARNm) se puede empalmar en más de un patrón para generar múltiples mRNAs maduros, distintas que conducen a la expresión de isoformas de proteínas con diferentes propiedades estructurales y funcionales. El "recordholder" para corte y empalme alternativo es un gen de Drosophila llamado Dscam, con 38.000 variantes de empalme, más que el número de genes de Drosophila. En los seres humanos, al menos, el 70% (y esta proporción podría ser aún más alto!) De los genes que codifican para las transcripciones que se someten a splicing alternativo, que pone de relieve la importancia de este mecanismo de regulación de la biología de la especie.

Debido a su capacidad para generar la diversidad de proteínas, se espera que corte y empalme alternativo para jugar un papel importante en la regulación de la expresión génica, una predicción que se fundamenta en la observación de que la generación de espacio-temporal apropiado de las variantes de corte y empalme está implicado en muchos procesos celulares y de desarrollo (incluyendo la determinación del sexo, la apoptosis, la guía de axones, la excitación y contracción celular y muchos otros).  No es de extrañar, por tanto, que la desregulación de los programas de splicing alternativo está estrechamente vinculada a trastornos genéticos humanos heredados y adquiridos. De hecho, trabajos en los últimos años han empezado a reconocer no apropiado splicing alternativo como un modificador genético durante la tumorigénesis. Muchos de los genes relacionados con el cáncer están regulados por splicing alternativo. Ellos codifican para proteínas implicadas en todos los aspectos importantes de la biología celular de cáncer, incluyendo el control del ciclo celular, la proliferación, la diferenciación, las vías de transducción de señales, la muerte celular, la

angiogénesis, la invasión, la motilidad y la metástasis. Una firma común de las células cancerosas es una pérdida general de la fidelidad de empalme, con la consiguiente reorganización de los perfiles de corte y empalme, e incluso cambiar a isoformas de empalme específicos por lo general expresadas en otros tipos de células.  Todos estos acontecimientos pueden contribuir a la carcinogénesis. En particular, hay varios casos de corte y empalme alternativo que se limita a los tipos específicos de cáncer, lo que implica claramente que la isoforma de empalme en particular en la progresión tumoral. Eventos de empalme del cáncer-específicos pueden ser también beneficioso para la terapia, ya que generan nuevos epítopos contra los que es posible producir anticuerpos para inmunoterapia.  Por lo tanto, existe un gran interés en el descubrimiento del efecto de corte y empalme alternativo de la complejidad del transcriptoma de células cancerosas y en la comprensión de cómo este mecanismo de regulación contribuye a la tumorigénesis. Esta revisión discute (1) los mecanismos básicos de splicing alternativo, (2) los conocimientos actuales sobre los mecanismos de regulación que rigen splicing alternativo y la desregulación en el cáncer, (3) las consecuencias biológicas derivadas de la alteración de empalme de alguna relacionada con el cáncer relevante genes y (4) las variantes de corte y empalme alternativos de cáncer asociados con un valor de diagnóstico / pronóstico claro que puede proporcionar dianas terapéuticas potenciales.

Splicing alternativoGenomas eucariotas se caracterizan por la presencia de genes "interrumpidas" que consiste en una sucesión ordenada de codificación (exones) y no codificante (intrón) secuencias.  En metazoos, particularmente en los mamíferos, interrumpido cuenta los genes para la gran mayoría de los genes. Por lo tanto, el empalme de ARN se produce en forma obligatoria, altamente regulado, proceso. A través de corte y empalme de pre-ARNm, intrones se eliminan con precisión y los exones se unen entre sí para reconstituir el marco de lectura y para generar ARNm traducibles que luego se exportan al citoplasma.La maquinaria de empalme (llamado spliceosome), es la máquina molecular más grande hasta ahora se describe en las células se compone de cinco ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNPs U1, U2, U4, U5 y U6) y más de 100 polipéptidos diferentes.  El spliceosome reconoce, mal conservadas, la secuencia de elementos que actúan en cis cortos en los límites exón-intrón (5 'y 3' sitios de empalme también conocidos como sitios de "aceptores" "donante" y) y utilizarlos para la reacción de cortar y pegar ( dos trans-esterificación secuencial) que elimina el intrón.

Mediante el uso de varias combinaciones de donante y aceptor de los sitios de diferentes exones, a través del proceso de corte y empalme alternativo que es posible producir distintos mRNAs de un pre-ARNm única. Se han observado cinco patrones de empalme alternativos distintos: 1) un exón regulado (casete), que a veces se incluye y, a veces excluido del ARNm; 2) múltiples cassette exones que son mutuamente excluyentes, es decir, el ARNm maduro siempre contiene sólo una de varias posibles opciones exón; 3) en casos raros, todo un intrón se conservan; sitios aceptores 4) donantes alternativa y 5) pueden resultar en exones de diferente tamaño (fig. 1). Por último, los promotores alternativos y sitios de poli-adenilación contribuyen a la heterogeneidad de las transcripciones codificadas por un solo gen.  Además de modificar las proteínas características, corte y empalme alternativo puede afectar a la estabilidad de las transcripciones a través de la decadencia (NMD) vía ARNm nonsensemediated, un mecanismo de CONTROL DE CALIDAD ARNm que depende de la maquinaria de traducción. Análisis recientes sugieren que aproximadamente el 35% de todos los eventos de corte y empalme alternativos en las células de mamíferos generar especies de ARNm que contienen codones de terminación prematuros (PTC), que pueden ser degradados de manera eficiente a través de NMD. Curiosamente, Ni han demostrado recientemente que los exones que contienen un codón de parada son particularmente frecuentes y conservadas en los genes para factores de empalme que intervienen en la elección de empalme. Estos exones con frecuencia se superponen elementos ultraconserved en los genomas de mamíferos.

Desde un punto de vista mecanicista de los diferentes tipos de splicing alternativo puede ser simplemente visto como un problema de reconocimiento de empalme de sitio por el spliceosome donde la decisión entre la inclusión y la omisión de un exón particular depende

principalmente en el reconocimiento y la utilización de los sitios de empalme que flanquean el exón. Exones empalmados alternativamente se caracterizan a menudo por los sitios de empalme corto y degenerar. La debilidad intrínseca de estos sitios, lo que refleja la afinidad reducida para las proteínas spliceosomal, es la causa principal de corte y empalme alternativo. El reconocimiento de los exones alternativos es modulada por una capa adicional de información proporcionada por un extensas y complejas redes de elementos que actúan en cis auxiliares (sitio de ARN elementos de secuencia no-empalme), se hace referencia como potenciadores y silenciadores de empalme, respectivamente, que promueven e inhiben el exón reconocimiento (Fig. 2A). Estos son los elementos de regulación cortos (~ 10 nucleótidos) que se pueden encontrar aislados o agrupados en el pre-mRNA y están presentes tanto en los exones (ESEs, Exonic empalme potenciadores y ESSS, silenciadores exonic empalme) e intrones (ISE, Intronic potenciador de empalme y ISS, Intronic empalme silenciadores). Los potenciadores de empalme bestcharacterized son típicamente ricos en purina y la función al proporcionar sitios de unión para serina-arginina (SR) factores, una familia (alrededor de una docena) de las proteínas de unión a ARN esenciales y abundante altamente conservadas en las células de plantas y animales. Factores SR muestran múltiples papeles en constitutiva de empalme y alternativa, así como en otros aspectos de la expresión génica. Todos los miembros de esta familia comparten una estructura modular que consta de una o dos copias de un motivo de ARN de reconocimiento N-terminal (RRM), seguido por un dominio C-terminal de longitud variable rico en serina alterna - dipéptidos arginina (el dominio RS). Los RRM determinar la especificidad de unión al ARN, mientras que el dominio RS media interacciones específicas entre proteínas que son esenciales para la contratación del aparato de empalme. Sin embargo, dentro de la spliceosome funcional también los dominios de RS pueden contactar directamente con el pre-mRNA. El carácter secuencial de estos contactos sugiere que el dominio de las interacciones de RS con ARN promover spliceosome asamblea.

Además, los residuos de serina del dominio RS son objetivos de extensas eventos de fosforilación que influyen en las interacciones de proteínas, y regulan la actividad y la distribución subcelular de las proteínas SR. Aunque se han mostrado varias quinasas, incluyendo SR proteínas quinasas (SRPKs) 1 y 2, CLK / STY, de especificidad dual de la tirosina quinasa-regulado, CRKRS, ADN topoisomerasa I, glucógeno sintasa quinasa-3 y AKT, para fosforilar las proteínas SR, la las vías de transducción de señales que regulan splicing alternativo son aún poco conocidos.

Se han propuesto varios modelos para la función de ESEs y factores de SR (Fig. 2B). De acuerdo con uno de estos modelos, las proteínas SR ESE enlazados a promover el exón definición directamente mediante el reclutamiento de la maquinaria de empalme a través de interacciones específicas proteína-proteína mediadas por el dominio RS. Otro modelo predice que la principal función de los factores de SR ESE-consolidados es para antagonizar el efecto negativo en el empalme de una proteína inhibidora que está enlazado a un elemento silenciador yuxtapuesta (ESS) (modelo de inhibidor). Exón inclusión o saltarse se determina por el equilibrio de estas actividades de la competencia, que a su vez reflejan por las concentraciones relativas de la unión al ARN activador cognado y proteínas represoras.  Estos modelos de mejora de empalme no son necesariamente excluyentes, ya que pueden reflejar las diferentes necesidades en el contexto de diferentes exones.

Silenciadores de empalme identificados hasta la fecha parecen muy diverso. Ellos pueden actuar como sitios de unión para factores que bloquean el acceso de la maquinaria de empalme a un sitio de empalme. Entre las proteínas que interactúan con ESS y elementos ISS hay ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas (hnRNP), un grupo de proteínas de unión a ARN inicialmente reconocida como factores que interactúan con transcripciones de ARN polimerasa II para formar partículas de hnRNP. En geles bidimensionales se han descrito aproximadamente 30 manchas, denominado con las letras del alfabeto de hnRNP A1 a través de U. De manera similar a los factores de SR, proteínas hnRNP tienen una estructura modular en la que uno o más dominios de unión a ARN, generalmente en el extremo N-terminal, se asocian a diferentes dominios "auxiliares". Tres tipos de dominios de unión a ARN (RRM, hnRNP K y RGG dominio de homología de dominio, una región de la proteína rica en repeticiones Arg-Gly-Gly) se han identificado en las proteínas hnRNP y se muestra para

proporcionar un cierto nivel de especificidad de unión de ARN.  Los dominios auxiliares son muy diferentes en secuencia y controlar la localización subcelular y la interacción con otras proteínas. Especificidad de ARN y proteína-proteína interacciones de unión contribuyen a la asamblea de los complejos de ribonucleoproteína que son los sustratos para la reacción de empalme subsiguiente. El mecanismo de acción hnRNPs depende de la posición de sus sitios de unión a lo largo de la pre-ARNm. Además del modelo de inhibidor descrito anteriormente, unido a hnRNPs ISS que flanquean un exón alternativo puede hacer que el exón a la salida de bucle, lo que resulta en la omisión del exón (Fig. 2C). Por otra parte, factores inhibidores unidos a ESS pueden polimerizarse por el exón y desplazar a las proteínas SR ESE determinada (Fig. 2C).

Sólo en pocos casos los exones empalmados alternativamente son controlados por empalme reguladores específicos de tejido. En la gran mayoría de los casos de eventos de empalme parecen ser controlado por la abundancia relativa y / o la actividad de factores SR antagónicas ampliamente expresadas y proteínas hnRNP a través de un mecanismo de combinatoria, con múltiples factores positivos y negativos y los elementos de secuencia que influyen en el resultado final del empalme reacción. Esto se ejemplifica por los efectos antagonistas sobre pre-mRNA de empalme de SF2/ASF, un factor de SR, y las proteínas hnRNP A1: altos niveles de SF2/ASF inducen la inclusión exón mientras que los altos niveles de hnRNP A1 promover la omisión de exón. Curiosamente, el nivel relativo de expresión de hnRNP A1 y SF2/ASF se ha demostrado que cambiar durante el crecimiento de pulmón neoplásico. Otro ejemplo es SRp55 y su factor de antagonista hnRNP E / PTB que el control del perfil de corte y empalme del factor de crecimiento de fibroblastos recepto r (FGFR1). Saltarse de resultados α-exón en la producción de la isoforma FGFR1-β que tiene una mayor afinidad por los factores de crecimiento de fibroblastos. El aumento de expresión de esta isoforma se correlaciona con el cáncer en el páncreas y el cerebro y con mal pronóstico en los tumores de mama y su sobreexpresión promueve la formación de tumores en ratones desnudos.  SRp55 se une a una ESE 69-nucleótidos y es necesario para α-exón inclusión mientras PTB reconoce una secuencia aguas arriba de la α-exón y promueve la omisión de exón y la producción de FGFR1-β.

Estudios recientes indican que las vías de señalización puede controlar decisiones de empalme al afectar a la distribución subcelular y / o la actividad de los reguladores de empalme. Muchos factores SR y proteínas hnRNP servicio de transporte continua y rápidamente entre el núcleo y el citoplasma, el cual da a conocer una función citoplasmática de estas proteínas, por ejemplo, en la traducción del ARN.  En este sentido, Michlewski mostró que el factor de empalme SF2/ASF estimula la iniciación de la traducción mediante la contratación directamente el objetivo mamífero de la rapamicina (mTOR) a un subconjunto de mRNAs. Notablemente, varios tratamientos de estrés perturbar la distribución núcleo-citoplasma de algunos reguladores de empalme. Por ejemplo, la exposición de las células a estímulos de estrés, tales como choque osmótico o la irradiación con UVC, da como resultado una marcada acumulación citoplásmica de hnRNP A1, concomitante con un aumento en la fosforilación de proteínas. Estos efectos están mediados por la MKK (3/6) - ruta de p38 y se correlacionan con los cambios en el patrón de corte y empalme alternativo de un E1A reportero de corte y empalme de pre-ARNm de adenovirus. Por otra parte, varios reguladores de empalme, incluyendo SF2/ASF, son secuestradas en los órganos de resistencia nuclear después de los tratamientos que activan la respuesta de choque térmico.  Esta capacidad para modular la actividad de los reguladores de empalme se abre la excitante posibilidad de que condiciones estresantes, como aquellos en el microambiente del tumor, puede influir en el perfil de empalme de un número de genes y por lo tanto afectar identidad de la célula.

Nuestro conocimiento de los mecanismos moleculares que subyacen a corte y empalme alternativo todavía es limitado. De hecho, hay muchos elementos exonic y intrónica para que los mediadores que actúan en trans están aún por identificar y, en la mayoría de los casos, circuitos de regulación que las decisiones de control de corte y empalme y la conexión con las vías de transducción de señales, no se conocen bien. Descifrando el complejo entramado que subyace alternativa de empalme elección sitio regulador sigue siendo un reto importante en esta área de investigación.

ABERRANTE SPLICING ALTERNATIVO EN CÁNCER, GENES RELACIONADOSDe ancho análisis del genoma indican que ~ 75% de los genes humanos codifican al menos dos isoformas empalmados alternativamente. Por lo tanto, corte y empalme alternativo parece ser la norma para los genes humanos y no es sorprendente que los defectos de empalme en los genes específicos están causalmente ligados a trastornos genéticos. Wellcharacterized ejemplos son la atrofia muscular espinal, distrofia miotónica, la retinitis pigmentosa, síndrome de Frasier, la hemofilia A, * La talasemia, fibrosis quística atípica y algunas enfermedades neurodegenerativas. Se ha calculado que aproximadamente el 15% de mutaciones puntuales que causan enfermedades hereditarias hacen alterar el procesamiento de pre-ARNm al afectar canónica 5 'y 3' sitios de empalme, sitios de ramificación o señales de poliadenilación. Esta cifra es probablemente una subestimación ya que no tiene en cuenta las mutaciones en elementos reguladores de empalme (potenciadores y silenciadores) que pueden prevenir la interacción con los reguladores de empalme (hnRNPs y factores SR). De hecho, al menos el 50% de 50 sustituciones de una sola base que causan la omisión de exón en genes humanos interrumpir potenciadores de empalme.  Con frecuencia, los defectos de empalme debido a mutaciones genéticas introducen codones de parada prematura y dirigen el ARNm de la degradación por la vía de descomposición mediada por el antisentido (NMD). El efecto final es que, en lugar de un polipéptido truncado, no se produce ninguna proteína.

En los últimos años ha surgido un vínculo entre el desarrollo del cáncer y la desregulación del splicing alternativo. Una característica común de las células cancerosas, de hecho, es la desregulación general de empalme, que puede conducir a la expresión de las variantes específicas de tumores y que es más probable es promovida por alteraciones en las vías de señalización y por las variaciones en la concentración, localización y actividad de trans -actuando empalme reguladores. Todavía se discute si estos cambios en los perfiles de corte y empalme son simplemente un "ruido" que ocurren en las células cancerosas o tener un papel directo en la tumorigénesis. Como cuestión de hecho, recientes avances en biología molecular y celular indican que los perfiles de corte y empalme alterados de genes críticos pueden tener un impacto sobre todos los principales aspectos de la biología de las células del cáncer.  Esto puede ser debido a la inactivación de onco-supresor o para obtener de la función de las proteínas implicadas en la susceptibilidad al cáncer y en la progresión tumoral.

Las mutaciones que actúan en cisEstos se heredan o mutaciones somáticas que afectan el proceso de empalme.  De acuerdo con su posición y el efecto sobre empalme, estas mutaciones se pueden dividir en dos subclases. Subclase I (60% de los casos) de empalme comprende mutaciones en los sitios de ayuste invariantes y abolir completamente reconocimiento de exón. Estas mutaciones se asocian con enfermedades graves.Subclase II se asocia a menudo con un fenotipo relativamente suave e incluye mutaciones en los motivos variantes (tales como el corte y empalme del tracto poli-pirimidina alternativa) y mutaciones intrónicas que generan donante o aceptor de los sitios crípticos. Un ejemplo proviene del gen p53 supresor de tumores, es decir, el gen más comúnmente mutado en los cánceres humanos.  Las isoformas de p53 se originan a través de splicing alternativo y se diferencian por su función de supresor de tumor. Curiosamente, las mutaciones "silenciosas" en el gen p53 se prevé que afectará a corte y empalme, ya que crean sitios de empalme en el centro de un exón.  Vale la pena considerar, sin embargo, que muchos de detección de mutaciones se centraron en los exones e ignoradas regiones no codificantes. A continuación, se discuten otros ejemplos de mutaciones que afectan empalme de oncogenes y genes supresores de tumores.

Las mutaciones en el gen APC resultado en la poliposis adenomatosa familiar, así (FAP). Recientemente, se ha informado de que una forma atenuada de FAP es causada por una inserción de una única T entre la segunda y la tercera posición del intrón 4 del gen APC que conduce a la omisión del exón 4 y para la expresión predicho de una proteína truncada . Dos mutaciones adicionales en los intrones 3 y 4 tienen el efecto idéntico.

También mutaciones en elementos reguladores de empalme, como ESE y las secuencias del SEE, pueden perturbar perfiles de empalme. Un buen ejemplo es el gen BRCA1 supresor de tumores que codifica una proteína implicada en una variedad de procesos celulares incluyendo la regulación transcripcional, la recombinación, la reparación del ADN y la apoptosis de las células. Las mutaciones en el gen BRCA1 son marcadores bien conocidos de susceptibilidad a cáncer de ovario y de mama, siendo la última la neoplasia maligna más frecuente entre las mujeres. Mazoyer demostrado que una mutación sin sentido heredado en el exón 18 interrumpe un elemento ESE (el sitio de unión para el factor de SF2/ASF SR) y provoca la omisión de exón. El análisis por ordenador con el programa ESEfinder ha identificado 23 ESEs altamente conservadas en los 22 exones del gen BRCA1. Alrededor del 60% de estos motivos contienen sustituciones de nucleótidos reportadas en el Breast Cancer Information Core sugiere la posibilidad de que la orientación de los perfiles de empalme pueden ser los mecanismos a través de los que las mutaciones afectan la función BRAC1. El gen BRCA1 codifica al menos treinta distintas variantes de empalme que son expresados diferencialmente en los tejidos. La mayoría de las transcripciones empalmados alternativamente mantener el marco de lectura abierto del ADNc original y tienen el potencial para codificar proteínas funcionales. En particular, las células de mama y de ovario expresan un conjunto común de variantes que sugiere la intrigante posibilidad de que comparten algunas vías de regulación que en su lugar está ausente en líneas celulares de leucemia que muestran un conjunto diferente de isoformas. Muchas mutaciones sin sentido en la región de codificación están asociados con la omisión de exón. Por lo tanto, un punto de mutación doble en el exón 7 de la neurofibromatosis 1 (NF1) gen altera los sitios de unión de consenso para los factores de SR, SC35 y SF2/ASF, y promueve la omisión de exón.  El gen NF1 muestra uno de la tasa de mutación más alta entre los genes asociados con trastornos humanos; simplemente sobre la base de la secuencia de ADN, se predijo que el 37% de estas mutaciones genómicas podría determinar defectos de empalme. Sin embargo, cuando esta predicción se verificó mediante el análisis de los mRNAs maduros, se hizo evidente que hasta el 50% de las mutaciones del gen NF1 están asociados con defectos de empalme.  El mensaje negativo que surge de este análisis es que todavía no somos capaces de inferir el perfil empalme simple de la secuencia primaria del ADN y que no tenemos que depender de ARN e incluso secuencias de la proteína para entender los efectos de cualquier mutación genética.

Similares observaciones se han hecho con una serie de otros genes asociados a tumores como el BRCA2, FHIT, KIT, MLH1, MDM2, MSH2 y LKB1. En particular, todos estos casos, y muchos otros que se describen de forma continua, representan una extensión del concepto según el cual la progresión del cáncer se debe a una serie de mutaciones genéticas estables que perturban la estructura, la función o la abundancia de proteínas críticas.  En este sentido, defectos de empalme pueden ser vistos como una de las rutas a través de mutaciones genéticas que causan la tumorigénesis. Sin embargo, corte y empalme alternativo de los oncogenes o supresores tumorales también podría verse afectada por mutaciones en reguladores de empalme que implica una actividad de estos factores como oncoproteínas o supresores tumorales, dependiendo de sus funciones antagónicas sobre la selección del sitio de empalme. Por ejemplo, el gen SRp55 (SFR6) se encuentra mutado en cánceres de mama y colorrectal. Curiosamente, SRp55 controles el perfil de empalme de varios genes asociados a tumores, entre los que CD44 y KIT. Además algunas proteínas hnRNP se han clasificado como oncogenes. En el 90% de los liposarcomas mixoides humanos, el (12; 16) t translocación genera una fusión entre el gen hnRNP P2, que codifica una proteína multifuncional implicada en la transcripción, corte y empalme y exportación de ARNm, y el gen CHOP, que codifica para una CCAAT / proteína de unión al potenciador implicado en la eritropoyesis, la diferenciación de adipocitos, la detención del crecimiento y G1-S progresión del ciclo celular. El producto de la fusión de hnRNP P2-CHOP contiene el dominio amino terminal de la transcripción de activación de hnRNP P2 y el dominio de unión a ADN de CHOP y su sobre-expresión en ratones desnudos resultados en la formación de tumores.

Los cambios en los factores que actúan en transMás interesante, desde nuestro punto de vista, es la observación, reportado por muchos estudios en los últimos 20 años, que la mayoría de las alteraciones de empalme asociados con el cáncer no se asocian con cambios de nucleótidos en los genes afectados, lo que

implica modificaciones en la expresión y / o actividad de factores de regulación de empalme. De hecho, los cambios en el repertorio de los factores de SR y proteínas hnRNP se producen con frecuencia en los tumores y se acompañan de alteraciones en la abundancia relativa de los productos de corte y empalme alternativos, una firma típica de las células cancerosas con efectos predecibles sobre el comportamiento celular. Como cuestión de hecho, las líneas de células cancerosas muestran un alto nivel de eventos de empalme alternativos que no se han conservado entre el ser humano y el ratón y no se expresan en tejidos normales el fortalecimiento de la idea de que un cambio en el nivel de empalme de los reguladores en células de cáncer puede afectar gravemente en programas de expresión génica.

Un ejemplo destacado para ilustrar la forma en corte y empalme aberrante en el cáncer puede ser modulada por la actividad alterada o expresión de factores de empalme es proporcionado porCD44, una glicoproteína transmembrana involucrados-las interacciones célula-célula y célula-matriz. Varias isoformas de CD44 se generan a través de la incorporación de la variable de 10 exones alternativos (v1-v10) en su dominio extracelular proximal. Estándar CD44, que carecen todos los exones alternativos, se expresa predominantemente en los tejidos normales, mientras que las isoformas de CD44, en particular, los que contienen variante exones V5, V6 y V7, están sobre-expresan en diversos tumores y han sido implicados en la invasión de células tumorales y la metástasis.La producción de las diferentes isoformas de CD44 se relaciona con los cambios en la abundancia de las proteínas SR y varios factores de empalme (incluyendo hnRNPA1, SRp55, SF2/ASF, Tra-2 beta, YB-1 y Sam68) que han demostrado para regular los exones variantes específicas. Varias líneas de evidencia indican que CD44 empalme está regulada en respuesta a estímulos extracelulares.Por lo tanto, la Materia y col. [68] encontró que la proteína de unión de ARN Sam68 (Src asociada en la mitosis 68-kDa) promueve v5 inclusión en respuesta a la activación de la vía de Ras-Raf-Mek-Erk. Aunque los detalles mecanicistas son incompletos, se ha sugerido que la interacción de fosforilados Sam68 con el exón v5 bloquea la actividad represiva de hnRNP A1, ya sea mediante la prevención de la interacción de hnRNP A1 con el elemento de ESS (por impedimento estérico), o contrarrestando el inhibitorio efecto de hnRNP A1 une a la ESS. Recientemente, Cheng y Sharp identificados SRm160 como otro factor de empalme Ras regulado responsable de inclusión de exón v5 en CD44 transcripciones. Es importante destacar, que también mostraron que el silenciamiento de SRm160 disminuye la invasividad celular, que une este regulador de empalme a la tumorigénesis.

Otro buen ejemplo de modulación de corte y empalme por vías de señalización viene del gen de la fibronectina (FN), un componente de la matriz extra-celular y un factor determinante en el control de la proliferación, la migración, invasión y metástasis comportamiento de las células tumorales. EDA es una isoforma de empalme FN generado por la inclusión de un solo exón (exón EDA, también conocido como EDI o EIIIA). Esta isoforma de empalme está pobremente expresado en tejidos normales de adultos, mientras que está presente en los embriones, así como durante la curación de heridas y en algunos tumores.  La inclusión del exón EDA es desencadenada por la activación de la quinasa / AKT Ras/PI3- por factores de crecimiento. AKT fosforila directamente la SR proteínas 9G8 y SF2/ASF, que a su vez se unen a la exón EDA y promover su reconocimiento por parte del aparato de empalme.  La activación de la misma vía por la insulina regula la actividad de otra proteína SR, SRp40, y estimula la inclusión de un exón alternativo en la proteína quinasa C (PKC) II pre-ARNm.  En total, estos resultados apoyan la posibilidad de que la desregulación de la vía de Ras/PI3-kinase/AKT, por ejemplo como resultado de mutaciones en sus componentes, podría tener consecuencias dramáticas en el perfil de empalme de cualquier pre-mRNAs regulados por 9G8, SF2/ASF, SRp40 y tal vez otras proteínas SR. Una hipótesis atractiva es que los exones que responden a esta vía de señalización pertenecen a un conjunto de genes que funcionan cooperativamente para modular la fisiología de la célula de acuerdo con la función biológica de la molécula de señalización. La identificación de estos exones, por lo tanto, será de vital interés.  Una indicación a favor de esta hipótesis proviene de la observación de que AKT también promueve traducción de EDA mRNAs obligado por 9G8 fosforilados y SF2/ASF.  Por lo tanto, la activación de una sola vía de transducción de señales controla de manera integrada tanto empalme y la traducción de los ARNm específicos y estimula la producción de proteínas específicas.  El

efecto final es un aumento drástico tanto en la velocidad y la fuerza de la respuesta de señalización tal como se mide por la producción de la proteína inducida.

Aunque estos ejemplos proporcionan ideas interesantes en los efectos de las vías de transducción de señales en la regulación de empalme, la caracterización molecular sigue siendo escasa y todavía no se ha proporcionado la aclaración de la vía completa.  Por lo tanto, además de para ilustrar una función de transducción de señales en el control de empalme, estos casos también sugieren la necesidad de estudios adicionales para dilucidar este importante mecanismo de regulación de genes.

Un cuerpo creciente de datos implica corte y empalme alternativo como un mecanismo para el control de la apoptosis o muerte celular programada, un proceso esencial en el desarrollo y en el mantenimiento de la homeostasis celular en los organismos multicelulares. Bcl-X es un miembro de la familia Bcl II que dirige desglose mitocondrial durante la apoptosis. El uso de 5 'sitios de empalme alternativos dentro de exón 2 determina la producción de dos isoformas de proteínas: una forma larga antiapoptótica (Bcl-XL) y una proteína corta la promoción de la apoptosis (Bcl-XS).Por lo tanto, un cambio en el patrón de empalme de estas transcripciones puede tener efectos profundos sobre la actividad proliferativa de las células cancerosas y de su respuesta a los tratamientos pro-apoptóticos. Varios factores de empalme, incluyendo Sam68, SF2/ASF, hnRNP F / H y SAP155, contribuyen en el control de la elección entre los dos sitios 5'-empalme alternativo.En particular, Sam68 sobre-expresión promueve la producción de pro-apoptótica Bcl-XS y este efecto se revierte a Sam68 fosforilación. Por el contrario, las proteínas hnRNP F / H, mediante la unión a un elemento tramo rico en G, promover el uso de la Bcl-XS - 5 'del sitio de empalme. La relación de Bcl-X variantes de empalme contribuir a determinar la sensibilidad de las células a una amplia variedad de agentes apoptóticos y puede tener importancia en la resistencia a las drogas y la capacidad de respuesta quimioterapéutico. Por ejemplo, la ceramida lipídica, un mediador / regulador de la apoptosis promueve la expresión de las variantes de empalme pro-apoptóticas Bcl-XS, la elección entre los dos sitios 5'-alternativas de empalme está controlada por un elemento sensible a la ceramida (CRCE 1) situado en el exón 2 y obligados por SAP155. Por otra parte, la ceramida es capaz de modular el estado de fosforilación de las proteínas SR en una fosfatasa 1 (PP1) forma-dependiente. Curiosamente, uno de los objetivos es el PP1 SR factor de SF2/ASF, otro importante regulador de la Bcl-X procesamiento pre-mRNAs.

Hay varios ejemplos de eventos de empalme alternativos que controlan la actividad de las proteínas implicadas en la motilidad celular y la invasión, un pre-requisito para la formación de metástasis de cáncer. Este es el caso de las isoformas de empalme de la andrógenos y receptores de estrógenos que están involucrados en carcinomas mamarios. Curiosamente, una isoforma de receptor de estrógeno alfa, debido a la omisión del exón 3 (delta3ER), es un activador más potente del factor de crecimiento endotelial vascular que el receptor de tipo salvaje. El Rac1b variante de empalme, que se genera por la inclusión de un exón casete 57-nucleótidos, se ha demostrado que conducen a un crecimiento celular independiente de anclaje. En particular, Rac1b es hasta reguladas en tumores colorrectales en las diversas etapas de la progresión neoplásica, en comparación con los tejidos normales adyacentes. Otros ejemplos, que muestran claramente el potencial efecto funcional de corte y empalme aberrante en la tumorigénesis, son el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 ( FGFR2 ), la fibronectina y la survivina .

Recientemente, se ha utilizado el Ron (recepteur d'origine nantais) proto-oncogén como modelo para investigar la relación entre el splicing alternativo y la progresión tumoral [40]. Ron, la tirosina quinasa del receptor humano para la proteína macrophagestimulating (MSP), es una proteína heterodimérica (p185-Ron) compuesta de subunidades α y β tanto derivadas de la transformación de un precursor común. La unión a MSP estimula la actividad tirosina quinasa intrínseca de Ron y resultados en la fosforilación de su sitio de acoplamiento para el transductor múltiple y adaptador de proteínas que conducen a la activación de cascadas de señalización (Fig. 3A ). Junto con Met, el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), Ron pertenece a una subfamilia de receptores de tirosina quinasas (RTK) con los patrones de expresión únicos y actividades biológicas. Además de promover el crecimiento celular y la protección de la apoptosis, estos receptores de célula de control de la

disociación, la motilidad y la invasión de matrices extracelulares, un proceso conocido como el crecimiento invasivo'''' o'''' dispersión de células [84]. Crecimiento invasivo es fisiológicamente relevante durante el desarrollo, la organogénesis y la regeneración de tejidos, pero también es importante para mediar en la invasividad y para promover la progresión maligna.Actualmente, se han identificado seis variantes incluyendo RonΔ170, Δ165, Δ160, Δ155, Δ110, y Δ55 con diversas deleciones o truncamientos en las regiones extracelular o intracelular. Todas estas variantes son constitutivamente activo, pero difieren en sus propiedades bioquímicas y biológicas. Por otra parte, el perfil de corte y empalme del gen Ron se altera con frecuencia en los cánceres epiteliales, tales como cánceres de colon y de mama, lo que sugiere que la producción de múltiples isoformas Ron podría contribuir a la patogénesis de estos tumores. El exceso de expresión de cualquiera de estas isoformas aumenta la motilidad celular (dispersión actividad similar). Sin embargo, sólo RonΔ160 o RonΔ155 son capaces de inducir la formación de foco, sostenido crecimiento independiente de anclaje y la capacidad para formar tumores metastásicos en ratones. Este potencial oncogénico se canaliza a través de la vía de la PI3-quinasa / AKT. Transcripciones se reunió también sufren splicing alternativo y una isoforma, llamado Met-SM, se origina en la omisión del exón 14, que codifica un segmento de 47 aminoácidos en el dominio yuxtamembrana. Esta isoforma se ha demostrado recientemente que desempeñar un papel importante en el desarrollo y la progresión de los cánceres humanos. Entre los mecanismos que controlan la expresión de las diferentes isoformas de Ron en las células cancerosas, el interruptor de constitutiva de corte y empalme alternativo desempeña el papel principal. Por lo tanto, la aclaración de las vías de regulación que controlan el perfil de empalme de las transcripciones Ron arrojará nueva luz sobre la iniciación y progresión del cáncer. Hemos estudiado en detalle el caso de corte y empalme alternativo que conduce a la producción de Δ Ron ARNm. Esta transcripción carece de un exón de 147-pb (exón 11). La proteína codificada tiene una 49-amino-ácido en la deleción en marco del dominio extracelular que afecta a la maduración proteolítica y resulta en la acumulación de una sola cadena de pro-RonΔ165 en el citoplasma. Por otra parte, la proteína eliminado se caracteriza por puentes disulfuro intracelulares aberrantes que facilitan RonΔ165 oligomerización que conduce a la fosforilación y activación constitutiva. Hemos demostrado que la elección entre la inclusión y la omisión del exón 11 es controlada por dos elementos reguladores adyacentes, un silenciador y un potenciador, ambos ubicados en el exón constitutiva 12 (Fig. 3B ). La unión de la proteína SR SF2/ASF al ESE estimula la omisión del exón 11 y la producción de ΔRon. Por lo tanto, la sobreexpresión de SF2/ASF en las células que normalmente expresan Ron desencadena la producción de la RonΔ165 con dramáticas consecuencias sobre las propiedades de la célula. En efecto, de manera similar a lo observado después ΔRon sobre-expresión, una expresión aumentada de SF2/ASF afecta profundamente la morfología celular y provoca la acumulación nuclear de β-catenina, la reorganización del citoesqueleto de actina, y la baja regulación de la E-cadherina, un tumor y supresor de la invasión en los carcinomas humanos. Todos estos cambios morfológicos y moleculares representan características de la transición epitelial a mesenquimal (EMT), que está implicada en la diseminación metastásica de los carcinomas humanos (Fig. 3B ). En particular, desmontables de SF2/ASF por interferencia de ARN (ARNi) reduce los niveles de ΔRon y de forma concomitante disminuye la motilidad celular. Del mismo modo, el ARNi dirigido específicamente contra Δ Ron reduce la motilidad celular y revierte parcialmente los cambios morfológicos inducidos por SF2 / ASF sobre-expresión.

Dada la informó sobre regulación de varias proteínas SR, incluyendo SF2/ASF, durante la progresión del tumor, es tentador especular que el factor de empalme SF2/ASF podría promover la transformación maligna induciendo una ΔRon mediada EMT. Esta hipótesis es consistente con un informe reciente que muestra que SF2/ASF se comporta como un auténtico protooncogén.SF2/ASF es hasta reguladas en un conjunto de tumores humanos y, el gen que codifica para SF2/ASF se amplifica específicamente en algunos tumores de mama, pero no en el tejido de mama normal del mismo paciente. Limitado sobre-expresión de SF2/ASF, comparable a la de las muestras de cáncer, dio lugar a la formación de tumores en ratones desnudos. En particular, varios objetivos de corte y empalme endógenas de SF2/ASF, entre ellos una nueva isoforma oncogénico del sustrato mTOR, S6K1, son esenciales para la transformación SF2/ASFmediated. Además, ARN de interferencia (ARNi) de SF2/ASF o la oncogénico S6K1 isoforma, dio lugar a la reversión del fenotipo transformado.

La identificación de los reguladores de empalme como una nueva clase de proto-oncogenes puede revelar nuevos aspectos de la biología del cáncer y ofrecer nuevas oportunidades para el diagnóstico y la terapia.Aunque todos los ejemplos presentados anteriormente, sin duda, demostrar que los cambios en la actividad de corte y empalme de las células tumorales está vinculada la progresión del tumor, sin embargo, los mecanismos moleculares responsables de estos cambios permanecen indefinidos. Varias preguntas siguen merecen investigación. ¿Cuáles son los eventos que conducen a la desregulación de la expresión y / o actividad de los miembros de SR y familias hnRNP? ¿Hay una reorganización generalizada de la maquinaria de empalme en las células de cáncer o hace el resultado interruptor de corte y empalme de una desregulación de un subconjunto de los reguladores de corte y empalme? ¿De qué manera las vías de transducción de señales que cooperen para afectar a los perfiles de empalme para determinar la conversión maligna?

Firmas splicing alternativo como indicadores de diagnóstico / pronóstico potenciales y perspectivas de terapiasEn las secciones anteriores hemos discutido varios ejemplos que ilustran un vínculo causal entre el empalme y el desarrollo de neoplasia alternativa. Vale la pena notar que en muchos casos isoformas de empalme parecen ser específica del cáncer. Por otra parte, existen evidencias de que en diferentes tejidos de un conjunto diferente de genes se somete a cambios de los perfiles de corte y empalme durante la tumorigénesis. Por lo tanto, en los tumores renales, Tropomyosin 1 , Actinin α 1 , la integrina β 4 , catenina δ 1 y de crecimiento de fibroblastos receptor del factor 2 cambiar sus patrones de splicing alternativo, mientras que N-glycanase1 no es así, a pesar de sus aparentes alteraciones en los tumores de pulmón y útero. Estos descubrimientos argumentan en contra de la idea de que los cambios en los perfiles de corte y empalme pueden ser resultado de una alteración generalizada de la maquinaria de empalme en las células de cáncer y sugieren que sólo un conjunto específico de empalme reguladores se ven afectados por la tumorigénesis de una manera tissuespecific. La identificación de tissuespecific isoformas específicas de cáncer, empalmados alternativamente inmediatamente incitó a su uso potencial como diagnóstico, pronóstico, o biomarcadores predictivos. Aunque los estudios a gran escala aún no se han llevado a cabo, los resultados iniciales son prometedores. Una correlación importante entre aberrante splicing alternativo y la progresión del tumor se ha demostrado para CD44. En particular, las isoformas que contienen el exón v6 de la variante son upregulated frecuentemente en carcinomas de cabeza y cuello o en cánceres avanzados gástrico en la etapa y CD44v6 tumores positivos se asocian a mal pronóstico.También, aberrante corte y empalme alternativo de MDM2 se encontraron transcripciones de asociarse con un factor de pronóstico pobre para la supervivencia en pacientes con cáncer de mama, mientras que HDMX se ha relacionado con sarcoma de tejidos blandos. Por otra parte, la expresión alterada de una variante empalmada del P73 , una proteína relacionada con p53, parece ser un marcador de pronóstico negativo en pacientes con neuroblastoma.

Durante la última década clásico perfil de la expresión genética realizado por microarray ha sido una poderosa herramienta para el descubrimiento de nuevos biomarcadores de cáncer. Sin embargo, la mayoría de las plataformas de gama desarrollado hasta la fecha no han sido diseñados para distinguir isoformas de ARNm. Una dirección importante para el futuro será la aplicación de todo el genoma pantallas diseñado para el análisis de firmas de corte y empalme alternativos asociados con cáncer, pero prácticamente ausente en las células normales. Estas micromatrices de splicingsensitive tienen el potencial de identificar mejor sub-clases de tumores. Por otra parte, no requieren que las relaciones causa-efecto entre los perfiles de empalme y los cánceres se identifican (o incluso que existían!), Sino sólo que esta asociación son suficientemente consistentes para ser predictivo. Curiosamente, Li ha utilizado un enfoque para cuantificar simultáneamente los cambios en el empalme ("splicing interruptor") y la abundancia de transcripción (de arriba a abajo-regulación). La ventaja de esta estrategia de perfiles "bidimensional'' es que funciona con muestras biológicas parcialmente degradadas, tales como ARN derivados de los bloques de tejido que han sido formalinfixed y embebido en parafina. Estos autores identificaron un conjunto específico de biomarcadores de isoformas de mRNA del cáncer de próstata mediante paneles independientes de muestras de tejido. En particular, informaron de dos variantes

de AMACR gen (que codifica una-metilacil-CoA racemasa) resultantes de la utilización alternativa del último exón junto con ción poliadenilación alternativa: una isoforma mostró un máximo de regulación cuantitativa en el cáncer de próstata en comparación con la próstata normal, tejidos, el otro parecían ser expresado sólo en el cáncer de próstata. Más recientemente, la novela de la tecnología de microarrays se ha utilizado para medir todo el genoma exón expresión en 102 muestras normales y de cáncer de tejidos de diferentes etapas de colon, vejiga urinaria, y la próstata. Se identificaron siete genes con variantes específicas de tumores de empalme ( alfa-actinina 1 , Caldesmon , Collagen, type VI alpha 3 , ricos en leucina repetir interacción proteína 2 , fosfatidilinositol-4-quinasa beta polipéptido catalítico , Tropomyosin 1 y Vinculina ). En particular, los patrones de empalme tumorspecific de alfa-actinina 1 , caldesmón y Vinculina se encontraron, los componentes clave del citoesqueleto, en los tres órganos que sugieren que pueden representar eventos de splicing relacionadas con el cáncer en general. Por otra parte, en el análisis de proteínas in silico predice que estas variantes de empalme del cáncer-específicos identificados codifican proteínas con funciones potencialmente alteradas, lo que indica que pueden estar implicados en la patogénesis y por lo tanto representan nuevos biomarcadores y dianas potenciales.

Variantes del cáncer-específicas de corte y empalme no sólo pueden servir como marcadores de diagnóstico y pronóstico de tumores, sino que también proporcionan objetivos potenciales para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas (Fig. 4 ). Una vía prometedora para el desarrollo de medicamentos contra el cáncer más selectivos consiste en la administración dirigida de compuestos bioactivos para el tumor por medio de moléculas (por ejemplo, anticuerpos) que son específicos para los marcadores asociados a tumores. La accesibilidad, así como el patrón de restricción de la expresión de la antígeno es un criterio importante en la selección de un objetivo para la intervención bio-molecular. En particular, muchos receptores que median las interacciones célula-célula y célula-matriz son regulados por corte y empalme alternativo y empalmados alternativamente variantes específicas de estas moléculas se asocian con muchos tumores malignos humanos. Curiosamente, casi el 90% de eventos de empalme alternativos afecta a las regiones situadas en la superficie expuesta de la proteína y para muchas moléculas de la membrana celular, los exones alternativos codifican nuevos epítopos que se encuentran generalmente en el dominio extracelular de la proteína. Estos epítopos parecen ser ideal para las estrategias de tumor de orientación. Una vez más, la proteína CD44, discutido en detalle en la sección anterior, es un ejemplo notable ya que los anticuerpos marcados radiactivamente dirigidos contra el CD44-v6 isoforma parecen ofrecer una herramienta terapéutica prometedora y están actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento del cáncer de cabeza y cuello. Sin embargo, a pesar de estos avances prometedores, los tumores sólidos son con frecuencia relativamente resistentes a las terapias basadas en anticuerpos. Esto es debido, en parte, a la relativa inaccesibilidad de las células tumorales y a la escasa penetración de los anticuerpos en el tejido tumoral. Dado que las células tumorales se separan de la sangre por las células endoteliales y los componentes de la matriz extracelular que rodea la vasculatura, la captación del tumor es muy limitado por la capacidad del anticuerpo para cruzar esta capa. Es importante destacar que, los enfoques terapéuticos dirigidos contra la vasculatura del tumor neo-han ganado significativa para un número de razones: (i) las células endoteliales vasculares tumorales son fácilmente accesibles para los medicamentos a través de la circulación de la sangre; (ii) existe una creciente evidencia de que la inhibición o regresión de los vasos del tumor conduce a la muerte celular del cáncer ya que se basan en los vasos sanguíneos de nutrientes y oxígeno para satisfacer sus necesidades metabólicas. Un ejemplo interesante es el EDB isoforma de corte y empalme alternativo de fibronectina (FN). El EDB isoforma se genera a través de la inclusión de un solo exón que codifica una región de 91 aminoácidos y está presente en los vasos sanguíneos de tejidos neoplásicos, mientras que está virtualmente ausente en tejidos maduros / adulto. EDB está implicada en la regulación de la proliferación celular endotelial y la morfogénesis vascular; un anticuerpo radiomarcado EDB-específica se encuentra actualmente en ensayos clínicos de fase II para el tratamiento del cáncer anti-angiogénica. Recientemente, se ha demostrado que el corte y empalme alternativo del dominio extra-A (EDA) de la fibronectina puede representar a otro, igualmente atractivos, objetivo para la entrega basada en anticuerpos de agentes bioactivos a la neovasculatura no sólo de tumores sólidos, pero también de lesiones metastásicas . Del mismo modo, las variantes de corte y empalme podrían representar nuevos antígenos específicos de leucemia con uso potencial en enfoques inmunoterapéuticos. En leucemias Phpositive, la (9; 22) t

translocación genera la Bcr / Abl proteínas de fusión, cuya activación de la tirosina quinasa constitutiva es responsable de la aparición del fenotipo de la leucemia. Además de la principal BCR / ABL transcritos de fusión, se ha informado de que BCR / ABL transcripciones, que surge de corte y empalme alternativo, también se producen en un alto porcentaje de la leucemia mielógena crónica (LMC) y leucemia linfoblástica aguda (LLA) de los pacientes. En particular, BCR / ABL transcripciones alternativas que implican ABL exón 4 son muy atractivos porque las proteínas de fusión resultantes contienen una novela epítopo inmunogénico que es capaz de provocar una respuesta específica de antígeno de células T.

Enfoques terapéuticos innovadores también podrían ser diseñados para apuntar a la maquinaria de empalme. Por ejemplo, modificaciones post-traduccionales de empalme de los reguladores pueden ser relevantes para la progresión tumoral. SRPK1 es hasta reguladas en tumores de mama y de colon en comparación con el epitelio normal adyacente, y los niveles de la quinasa aumentar junto con el grado del tumor. Fuerte expresión de la proteína SRPK1 también fue evidente en la mayoría de los de mama y las líneas celulares tumorales de colon. Curiosamente, la baja regulación de SRPK1 el uso de pequeños ARN de interferencia (siRNA) afecta a la expresión de factores apoptóticos clave BAX y BCL2, aumenta la proporción de las células tumorales (pero no de las células nontrasformed) sometidas a la apoptosis y amplifica su sensibilidad a los dos quimioterapéuticos utilizados frecuentemente agentes tales como gemcitabina y cisplatino. Estos resultados sugieren que la inhibición farmacológica de SRPK1 actividad puede ser eficaz como agente independiente o en combinación con regímenes quimioterapéuticos convencionales. Por otra parte, las pequeñas moléculas con SRPK-bloqueo de la actividad, tales como inhibidores de Clk1/Sty o inhibidores potentes de la reacción de corte y empalme, tales como derivados de indol, se pueden utilizar para alterar los patrones de empalme. Curiosamente, los datos recientes muestran que las proteínas E (SME) Funciones spliceosomal como supresor del crecimiento de células tumorales de manera independiente de p53. Por lo tanto, teniendo en cuenta que una gran parte de los cánceres humanos son defectuosos en la actividad de p53, la orientación de las PYME en la terapia génica contra el cáncer será de especial interés.

Diferentes enfoques terapéuticos están estudiando actualmente para corregir aberrante de corte y empalme alternativo a nivel del ARN. Estas estrategias pueden o bien alterar los patrones de splicing alternativo de genes específicos o reconocer especies de ARNm particulares para provocar su degradación (por ejemplo, ARNi, microARN y ribozimas). La corrección de defectos de empalme a través de la manipulación de ARNm requiere el uso de estrategias de genetherapy, que a menudo están relacionadas con problemas tales como la entrega, la toxicidad y la inmunogenicidad . terapia SiARN basada ha demostrado una gran promesa para muchas enfermedades tales como el cáncer. Los principales objetivos para la terapia siRNA incluyen oncogenes y genes que están involucrados en la angiogénesis, la metástasis, la supervivencia celular, Antiapoptosis y la resistencia a la quimioterapia. Por otra parte, las últimas generaciones de antisentido OLIGON ucleotides que contienen modificaciones químicas aparecen más estable en comparación con cadenas principales de nucleótidos convencionales. Algunos de estos oligos de evitar montajes ribosómico, y por lo tanto mRNA traducción, y parece ser bien tolerada en los pacientes. Además, los oligonucleótidos modificados sintéticamente dirigidos a través de la hibridación específica de secuencia de los sitios de empalme o secuencias adyacentes pueden bloquear la selección inadecuada de exón mediante la inhibición de la unión de trans factores de acción prolongada. Se han aplicado con éxito para corregir corte y empalme aberrante de la β -globina , CFTR , distrofina , tau genes y para reprimir la generación de variantes de corte y empalme relacionadas con el cáncer de FGFR1 , Bcl-X , y MDM2. Sola o en combinación con agentes quimioterapéuticos, tales como cisplatino, irinotecan, paclitaxel, fluorouracilo se puede utilizar con soltura en la terapia. Por último, hemos diseñado un oligómero de morfolino fosforodiamidato dirigidas a la región de la Ron potenciador que contiene el sitio de unión SF2/ASF (Mo-SF2) para bloquear estéricamente la unión de este factor de empalme y, por lo tanto, la omisión del exón 11. La eficacia de Mo-SF2 se ensayó usando células de carcinoma gástrico KATOIII humanas caracterizadas por altos niveles de SF2/ASF, ΔRon y fenotipo invasivo. Hemos encontrado que Mo-SF2 inhibe Δ Ron empalme y corrige la morfología celular y las propiedades de migración de las células [datos no publicados].

OBSERVACIONES FINALESDespués de la secuenciación de la totalidad de los genomas eucariotas, corte y empalme alternativo se ha convertido en la estrategia dedicada a la interpretación de la información genética. Como ampliamente discutido en esta revisión, de hecho, este mecanismo de procesamiento de cuentas pre-mRNA de una gran parte de la diversidad proteómica en eucariotas superiores. Mientras regulación de la transcripción determina la presencia y abundancia de transcripciones de genes primarios, corte y empalme alternativo está diseñado para manipular el mensaje en respuesta a una serie de estímulos. De esta manera se puede sintonizar las proteínas características, tales como la capacidad de participar a hetero-complejos o la localización subcelular, con el fin de satisfacer las necesidades de las células. Raramente son los programas de corte y empalme alternativos asociados a "sí o no" decisiones; en la mayoría de los casos, los productos de corte y empalme co-existir en una sola célula y contribuir a la capacidad celular para hacer frente a un número de diferentes estímulos internos y externos. Desde este punto de vista, por lo tanto, este mecanismo parece estar íntimamente conectada a la complejidad de los organismos metazoos que, una vez más, pone de relieve la necesidad de entender las reglas combinatorias que subyacen opciones del sitio de empalme como un paso obligatorio para llegar a una visión global de la lógica de la vida cuestión.

Descifrar las implicaciones biológicas de este proceso de regulación es una tarea difícil que requiere la integración de una gran cantidad de datos en relación con los cis secuencias de acción ytrans -actuando factores involucrados, los circuitos de regulación y vías de señalización que modulan las decisiones de empalme sitio y finalmente la consecuencias fisiológicas y / o patológicas resultantes de la expresión de las distintas isoformas de empalme. El logro de este resultado será sin duda acelerada por el desarrollo reciente de nuevos y muy sofisticados bioinformática y enfoques de biología de sistemas.

Se espera que un avance importante para comprender completamente cómo splicing alternativo impregna los programas de expresión para derivar a partir de la aplicación de metodologías de alto rendimiento. Durante la última década, las ciencias biomédicas han sido fuertemente influenciados por las "ómicas": la genómica, la proteómica, transcriptómica y metabolómica. La aplicación de los enfoques de alto rendimiento para estudiar los perfiles de empalme es sólo en su comienzo. Este retraso es sin duda debido a una serie de problemas técnicos que se derivan de la necesidad de evaluar contemporánea para cada gen, el nivel absoluto de los transcritos totales y la abundancia relativa de las isoformas de empalme. Por otra parte, la interpretación es complicada significativamente por la necesidad de comprender las implicaciones fisiológicas que resultan de un cambio en los perfiles de corte y empalme.Sin embargo, es fácil predecir que este tipo de análisis proporcionará información crucial para dar a conocer las vías de regulación que subyacen a la co-regulación de los perfiles de empalme y para comprender la relevancia de splicing alternativo en el contexto del desarrollo del organismo. La esperanza es que las matrices splicingsensitive guiarán la identificación de los circuitos que, al igual que la transducción de señales y las vías de transcripción, puede ser causalmente vinculados a los programas de desarrollo, organogénesis, definición de esquema corporal y la identidad celular.Otra cuestión pendiente se refiere a la identificación de la sub-genoma que no experimentan eventos de splicing alternativo. ¿Estos genes identificar cualquier función celular crítico particular?Por lo tanto, el cambio de perspectiva, desde la caracterización detallada de los mecanismos moleculares a enfoques globales, que se espera que mejore nuestra comprensión de la importancia fisiológica de corte y empalme alternativo y para aumentar drásticamente la comprensión de las condiciones fisiológicas y patológicas importantes, tales como la plasticidad neuronal y la complejidad del cáncer. Estamos seguros de que los enfoques de la biología de sistemas pueden ayudar a la identificación de los eventos de splicing alternativo que pueden desempeñar un papel fundamental en la progresión tumoral. Esto ofrecerá la oportunidad de desarrollar estrategias innovadoras de intervención terapéutica que se dirigen a variantes específicas de splicing alternativo.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue apoyado por becas de la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), de la Red de la Unión Europea (EURASNET) de Excelencia sobre splicing alternativo (EURASNET) y de la Fondazione Cariplo a GB

Figura (1). cis secuencias de acción necesarios para la reacción de empalme y los diferentes tipos de eventos de splicing alternativo. (A) de empalme secuencias consenso de un gen eucariota típica (señales exón / intrón empalme sitio, sitio de sucursal y el tracto polypyrimidine). (B) mRNAs empalmados alternativamente el resultado de la omisión de exón, intrón retención, el uso de la alternativa 3 '(aceptante) o 5'-(donante) y los sitios de la selección de los exones que se excluyen mutuamente. En el nivel de proteína, corte y empalme alternativo afecta drásticamente a la secuencia de aminoácidos por deleción o inserción de dominios, marco-turnos o codones de parada. Splicing alternativo en las regiones no codificantes del ARNm maduro podría repercutir en la estabilidad y la traducción del ARNm.

Figura (2). Cis-y elementos reguladores que actúan en trans que el control de corte y empalme alternativo y modelos para la función de empalme potenciadores y silenciadores. (A) los exones empalmados alternativamente por lo general se caracterizan por los sitios de empalme débiles. El reconocimiento de estos sitios depende de elementos reguladores de empalme: potenciadores exonic empalme (ESE) y silenciadores (ESS) y intronic potenciadores de empalme (ISE) y silenciadores (ISS). (B) los elementos ESE están obligados por los factores de empalme de la familia SR. través de interacciones con las proteínas del aparato de empalme, el dominio RS de factores SR estimula el ensamblaje de la splicesome en el intrón adyacente (a la izquierda).Además, los factores SR pueden contrarrestar la actividad inhibidora de proteínas hnRNP unidos a elementos ESS (derecha). (C) El mecanismo de acción de los elementos de silenciador depende de la su posición a lo largo de la premRNA. En algunos casos, factores inhibidores (por ejemplo proteínas hnRNP) se unen a secuencias que flanquean ISS un exón alternativo y causan un bucle y saltar fuera de este exón (a la izquierda). Alternativamente, los factores inhibidores unidos a ESS pueden polimerizar a lo largo del exón y desplazar las proteínas SR ESEbound (derecha).

Figura (3). Representación esquemática del receptor Ron y de las vías de señalización corriente abajo. ( A ) Ron es un solo paso, α disulfuro-ligado / heterodímero β. La cadena α es una glicoproteína extracelular mientras que la cadena β es una subunidad transmembrana que comprende una secuencia extracelular, un segmento trans-membrana corto, una gran porción citoplásmica con intrínseca dominio de tirosina quinasa (TK) y una cola C-terminal. Se indican residuos y dominios importantes para la actividad de Ron. En particular, el dominio intracelular incluye el sitio catalítico tirosina quinasa (óvalo blanco) flanqueado por secuencias de yuxtamembrana distintivo y carboxi-terminales. La fosforilación de tirosinas dos dentro del dominio quinasa regula positivamente la actividad de la enzima, mientras que un residuo de serina en el dominio yuxtamembrana tiene un papel regulador negativo. Dos residuos de tirosina en la región carboxi-terminal, cuando está fosforilada, forman un sitio de acoplamiento específico para múltiples transductores de señal y los adaptadores. La activación de Ron por MSP puede iniciar la señalización a través de muchas de las vías implicadas en la progresión tumoral y la metástasis, tales adhesión, invasión, la movilidad, la proliferación y la inhibición de la apoptosis. ( B ) El constitutivamente activa ΔRon isoforma se genera a través de la omisión del exón 11. Este evento es controlado por dos elementos de corte y empalme adyacentes, un silenciador y un potenciador, que se encuentra en la parte central y en el extremo 3 'del exón 12, respectivamente. Estos dos elementos reguladores pueden formar un casete de control'''' que ajusta la fuerza del sitio aceptor del intrón 11 y por lo tanto la relación entre Ron y transcripciones ΔRon. Factor de empalme SF2/ASF se une directamente al potenciador y rige su actividad. Los altos niveles de SF2/ASF aumentan la fuerza del sitio aceptor del intrón 11, promover la producción de ΔRon isoforma y desencadenar cambios morfológicos y moleculares típicos de la transición epitelial a mesenquimal (EMT). La función primaria del silenciador podría ser para antagonizar el potenciador y evitar la omisión de exón.

Figura (4). Uso potencial de los enfoques terapéuticos que se dirigen a splicing alternativo. Varias estrategias se están utilizando actualmente para explotar splicing alternativo para el tratamiento de cáncer. (A) En muchos casos, las variantes de corte y empalme del cáncer-restringidas contienen epítopos únicos que podrían ser utilizados como dianas para los anticuerpos específicos conjugados a toxinas de células del tumor. (B) Se han encontrado muchos compuestos químicos que afectan empalme de numerosos genes. Aunque los mecanismos por los cuales los patrones de empalme se alteran son aún poco conocidos, varios compuestos son capaces de bloquear la actividad de las quinasas de proteínas SR-(SRpKs) y, en consecuencia, reducir el estado de fosforilación de factores de empalme SR. (C oligonucleótidos) modificados sintéticamente, tales como fosforotioato, morfolino phosphorodiamide y 2'-O-metil, son capaces de bloquear la interacción de la maquinaria spliceosome con un sitio específico. Por otra parte, son más estables y activas de cadenas principales de nucleótidos regulares y presentan baja toxicidad in vivo. (D) transcritos de ARNm específico de cáncer que contienen secuencias únicas pueden ser dirigidos utilizando la degradación mediada por ARNi.