Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System · viii Guía de reactivos de Applied Biosystems...

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Guía de reactivos

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The StepOne™ Real-Time PCR System is covered by US patents and corresponding claims in their non-US counterparts, owned by Applied Biosystems. No right is conveyed expressly, by implication, or by estoppel under any other patent claim, such as claims to apparatus, reagents, kits, or methods such as 5′ nuclease methods. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.

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Applera, Applied Biosystems, AB (Design), MicroAmp, Primer Express, and VIC are registered trademarks, and FAM, JOE, MultiScribe, NED, ROX, StepOne, TAMRA, and TET are trademarks of Applied Biosystems or its subsidiaries in the U.S. and/or certain other countries.

AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc.

SYBR is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.

All other trademarks are the sole property of their respective owners.

Número de referencia 4377718 Rev. B06/2010

Contenido Front Cover

iiiGuía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

PrólogoCómo utilizar esta guía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii

Cómo obtener más información . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix

Cómo obtener asistencia técnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xi

Capítulo 1 IntroducciónAcerca del sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2

Preparación de experimentos en el sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4

Selección del tipo de experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5

Selección del tipo de reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6

Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7

Capítulo 2 Introducción a los reactivosIntroducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

Reactivos TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

Reactivos SYBR® Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4

Selección del tipo de reactivo apropiado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-5

Reducción al mínimo de los contaminantes del DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7

Capítulo 3 Experimentos de cuantificación

Sección 3.1: Acerca de los experimentos de cuantificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4

Selección de un método de cuantificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5

Selección de una RT-PCR de 1 o 2 pasos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8

Selección de PCR en singleplex o en multiplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10

Selección del tipo de reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13

Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13

Sección 3.2: Directrices de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17

Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18

TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18

Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20

iv Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Selección de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21

Diseño del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22

Ensayos personalizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22

Diseño de cebadores y sondas con el software Primer Express® . . . . . . . . . . . . 3-23

Selección de reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-26

Uso de las condiciones de termociclado recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-28

Optimización de concentraciones de cebador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-31

Optimización de la concentración de sonda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-35

Para obtener más información . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-37

Capítulo 4 Experimentos de genotipado

Sección 4.1: Acerca de los experimentos de genotipado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-3

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4

Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6

Sección 4.2: Directrices de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9

Ensayos prediseñados/validados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-11

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination . . . . . . . . . . 4-12




Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15



Capítulo 5 Experimentos de presencia/ausencia

Sección 5.1: Acerca de los experimentos de presencia/ausencia . . . . . . . . . . . . . . 5-3

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4

Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-6

Sección 5.2: Directrices de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9

Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-13




vGuía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Apéndice A FórmulaFórmula para experimentos de CT comparativos (∆∆CT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-1

Apéndice B Limitación del cebador en la PCR en multiplex

Apéndice C Directrices de diseño de ensayos

Bibliografía

Glosario

Índice

vi Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

viiGuía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Prólogo

Cómo utilizar esta guía

Finalidad de estaguía

En esta guía, se proporciona información acerca de los reactivos que se pueden utilizar en Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System (sistema StepOne™). Información de esta guía:

• Introducción a los reactivos TaqMan® y SYBR® Green• Descripciones y directrices de diseño para los siguientes tipos de experimentos:

– Experimentos de cuantificación– Experimentos de genotipado– Experimentos de presencia/ausencia

Público Esta guía está destinada al personal de laboratorio y a los principales investigadores que realizan experimentos de curva estándar con el sistema StepOne.

Suposiciones En esta guía, se asume lo siguiente:

• Tiene un conocimiento práctico del proceso de reacción en cadena de polimerasa (PCR).

• Sabe manejar muestras de DNA y/o RNA y prepararlas para la PCR.

Convenciones deltexto

En esta guía, se utilizan las siguientes convenciones:

• El texto en negrita indica una acción del usuario. Por ejemplo:Escriba 0 y, a continuación, pulse Intro en cada uno de los campos restantes.

• El texto en cursiva señala palabras nuevas o importantes y también se utiliza para enfatizar algo. Por ejemplo:Antes de realizar el análisis, prepare siempre una matriz fresca.

• El símbolo de la flecha que apunta a la derecha ( ) separa los comandos sucesivos que se seleccionan en un menú desplegable o un menú de acceso directo. Por ejemplo:Seleccione File (Archivo) Open (Abrir).

Palabras de avisopara el usuario

En la documentación de Applied Biosystems, aparecen dos palabras de aviso para el usuario. Cada palabra implica un nivel concreto de observación o acción, tal y como se describe a continuación:

Nota: Proporciona información que puede ser interesante o útil, pero no es esencial para el uso del producto.

¡IMPORTANTE! Proporciona información que es necesaria para poder utilizar el instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisión o para poder utilizar un producto químico de manera segura.

viii Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Prólogo

A continuación, se muestran algunos ejemplos de palabras de aviso para el usuario:

Nota: La función de calibración también está disponible en la consola de control.

¡IMPORTANTE! Para comprobar la conexión del cliente, necesita un identificador de usuario válido.

Palabras de avisode seguridad

En la documentación del usuario de Applied Biosystems, aparecen cuatro palabras de aviso de seguridad en los puntos del documento en los que debe conocer la existencia de peligros importantes. Cada palabra de aviso (IMPORTANTE, PRECAUCIÓN, ADVERTENCIA, PELIGRO) implica un nivel de observación o acción particular, tal y como se explica a continuación.

Definiciones

¡IMPORTANTE! Proporciona información que es necesaria para poder utilizar el instrumento correctamente, para poder utilizar un kit de reactivos con precisión o para poder utilizar un producto químico de manera segura.

Indica una situación potencialmente peligrosa que, de no evitarse, podría causar lesiones leves o moderadas. También puede utilizarse para alertar de prácticas no seguras.

Indica una situación potencialmente peligrosa que, de no evitarse, podría causar lesiones graves o mortales.

Indica una situación inminentemente peligrosa que, de no evitarse, tendrá como resultado lesiones graves o mortales. Esta palabra de aviso se limita a las situaciones más extremas.

A excepción de los avisos IMPORTANTE, todas las palabras de aviso de seguridad de un documento de Applied Biosystems aparecen con la figura de un triángulo abierto que contiene un símbolo de peligro. Estos símbolos de peligro son idénticos a los que se incorporan en los instrumentos de Applied Biosystems.

Ejemplos

¡IMPORTANTE! Debe crear una hoja de cálculo de entradas de muestras diferente para cada placa de reacción de 96-pocillos.

PELIGRO QUÍMICO. TaqMan® Universal PCR Master Mix puede causar irritaciones en la piel y los ojos. Puede provocar molestias si se ingiere o se inhala. Consulte la ficha técnica de seguridad (MSDS) y siga las instrucciones de manipulación indicadas. Use protectores oculares, vestimenta protectora y guantes apropiados.

PELIGRO DE LESIONES FÍSICAS. Durante el uso de los instrumentos, la cubierta caliente y el bloque de muestras pueden alcanzar temperaturas superiores a 100 °C.

PELIGRO ELÉCTRICO. La continuidad del circuito de toma a tierra es vital para la seguridad. Jamás utilice el sistema con el conductor de toma de tierra desconectado.

ixGuía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Prólogo

Cómo obtener más información

Documentaciónrelacionada

El sistema StepOne incluye la siguiente documentación:

Documento Núm. ref. inglés

Núm. ref.

español

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Genotyping Experiments

4376786 4377729

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments 4376787

—

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Relative Standard Curve and Comparative CT Experiments

43767854377742

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Standard Curve Experiments

4376784 4377736

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation, Maintenance, and Networking Guide

4376782 4377798

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation Quick Reference Card

4376783 4377792

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Site Preparation Guide

4376768 4378359

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software Help

— —

x Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Prólogo

Applied Biosystems puede proporcionarle la siguiente documentación auxiliar:

Nota: Para obtener más documentación, consulte “Cómo obtener asistencia técnica” en la página xi.

Obtención deinformación de la

ayuda delsoftware

En Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software (software StepOne™ ) Help, se describe cómo se utiliza cada función de la interfaz de usuario. Para acceder a la ayuda desde el software StepOne, realice una de las siguientes acciones:

• Pulse F1.• Haga clic en en la barra de herramientas.

Documento Número de referencia

Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Protocol

4375575

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation Performance Verification Protocol

4376791

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Installation Qualification-Operation Qualification Protocol

4376790

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Planned Maintenance Protocol

4376788

Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4334429

Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines 4367671

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4334431

Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol 4367218

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol 4312214

Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide 4362460

SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol 4304965

SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol 4310251

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol 4362038

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol 4308335

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol 4351891

TaqMan® Gene Expression Assays Protocol 4333458

TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol 4332856

TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol 4304449

User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression 4303859

Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note

127AP08

xiGuía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Prólogo

• Seleccione Help (Ayuda) StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Para buscar temas de interés en la ayuda:

• Consulte el índice de contenido.• Busque un tema específico.• Busque en un índice alfabético.

Envíenos suscomentarios

Applied Biosystems agradece sus comentarios y sugerencias para mejorar sus documentos de usuario. Puede enviar sus comentarios a la dirección de correo electrónico:

[email protected]

¡IMPORTANTE! Esta dirección sólo sirve para enviar comentarios y sugerencias en relación con la documentación. Para solicitar documentos, descargar archivos PDF u obtener ayuda sobre una cuestión técnica, vaya a www.appliedbiosystems.com y, a continuación, haga clic en el vínculo Support (Asistencia técnica). (Consulte “Cómo obtener asistencia técnica” más adelante.)

Cómo obtener asistencia técnicaPara acceder a los servicios más recientes y obtener información acerca de la asistencia técnica, vaya a www.appliedbiosystems.com y, a continuación, haga clic en el vínculo Support (Asistencia técnica).

En la página Support (Asistencia técnica), puede:

• Buscar las preguntas más frecuentes (FAQ)• Enviar una pregunta directamente al Servicio de asistencia técnica• Solicitar a Applied Biosystems documentos de usuario, fichas técnicas de

solicitud de materiales (MSDS), certificados de análisis y otros documentos relacionados

• Descargar documentos PDF• Obtener información acerca de la formación del cliente• Descargar actualizaciones y parches de software

Asimismo, en la página Support (Asistencia técnica) podrá acceder a los números de teléfono y fax para ponerse en contacto con el Servicio de asistencia técnica y las instalaciones de venta de Applied Biosystems en todo el mundo.

¡IMPORTANTE! Cuando se le solicite que lo haga en esta guía o cuando tenga que programar el mantenimiento del instrumento StepOne™ (por ejemplo, el mantenimiento anual planificado o la verificación/calibración de la temperatura), póngase en contacto con el Centro de atención al cliente de Applied Biosystems. Para obtener un número de teléfono o enviar un mensaje de correo electrónico al centro, visite http://www.appliedbiosystems.com/support/contact.

mailto:[email protected]

http://www.appliedbiosystems.com

http://www.appliedbiosystems.com

http://www.appliedbiosystems.com/support/contact

xii Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Prólogo

1-1Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

1Introducción 1

Este capítulo cubre los siguientes temas:

Acerca del sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2

Preparación de experimentos en el sistema StepOne™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4

Selección del tipo de experimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-5

Selección del tipo de reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6

Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7

1-2 Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Capítulo 1 Introducción

Acerca del sistema StepOne™

Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System (sistema StepOne™) utiliza reactivos de reacción en cadena de polimerasa (PCR) basados en fluorescencia para proporcionar:

• Detección cuantitativa de las secuencias de ácido nucléico de diana (dianas) mediante análisis en tiempo real.

• Detección cualitativa de secuencias de ácido nucléico de diana (dianas) mediante análisis de punto final y curva de disociación.

Acerca de larecogida de

datos

El sistema StepOne recoge datos de fluorescencia brutos en diferentes puntos de una PCR, dependiendo del tipo de proceso que realice:

Con independencia del tipo de proceso que se realice, un punto de recogida de datos o una lectura constan de tres fases:

1. Excitación: el instrumento StepOne™ ilumina todos los pocillos de la placa de reacción en el instrumento StepOne para excitar los fluoróforos de cada reacción.

2. Emisión: la óptica del instrumento StepOne capta la fluorescencia residual que se emite desde los pocillos de la placa de reacción. La imagen resultante que capta el dispositivo sólo consta de luz que se corresponde con el rango de las longitudes de onda de emisión.

3. Recogida: el instrumento StepOne crea una representación digital de la fluorescencia residual recogida en un intervalo de tiempo fijado. El software StepOne™ almacena la imagen fluorescente bruta para analizarla.

Después de un proceso, el software StepOne utiliza datos de calibración (espacial, espectral y de fondo) para determinar la ubicación y la intensidad de las señales fluorescentes en cada lectura, el fluorocromo asociado a cada señal fluorescente y el significado de la señal.

Tipo de proceso Punto de recogida de datos

Procesos en tiempo real

Curva estándar El instrumento recoge datos después de cada paso de extensión de la PCR.

Curva estándar relativa

CT comparativos (∆∆CT)

Procesos de punto final

Genotipado El instrumento recoge datos antes y después de la PCR. El instrumento también puede recoger datos durante el proceso (en tiempo real), lo que puede resultar útil para solucionar los problemas.

Presencia/ausencia El instrumento recoge datos antes y después de la PCR.



Consumiblesadmitidos

El sistema StepOne admite los consumibles que se enumeran a continuación. Estos consumibles se utilizan en protocolos o reactivos estándar y rápidos.

Para obtener másinformación

Para obtener más información acerca de alguno de los temas que se explican en esta guía, acceda a la ayuda desde Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Software pulsando F1, haciendo clic en en la barra de herramientas o seleccionado Help (Ayuda) StepOne Help (Ayuda de StepOne).

Consumible Número de referencia

• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plates• MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film

• 4375816• 4375323

• MicroAmp™ Fast 8-Tube Strips• MicroAmp™ Optical 8-Cap Strips

• 4358293• 4323032

• MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps • 4358297

• MicroAmp™ Fast 48-Well Trays• MicroAmp™ 48-Well Base Adaptor• MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base

• 4375282• 4375284• 4312063

G

A

C

D

A

C

F

B

C

# Consumible

A MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate

B MicroAmp™ Fast 48-Well Tray

C MicroAmp™ Splash Free 96-Well Base

D MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip

E MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip

F MicroAmp® Fast Reaction Tubes with Caps

G MicroAmp™ Optical 48-Well Adhesive Film

E

B



Preparación de experimentos en el sistema StepOne™

Flujo de trabajogeneral

Antes de realizar experimentos en el sistema StepOne, prepare el experimento de la siguiente forma:

1. Seleccione un tipo de experimento (página 1-5).

2. Seleccione el tipo de reactivo (página 1-6).

3. Seleccione el tipo de ensayo (página 1-7).

Información deesta guía

En este capítulo, se ofrece información general acerca de los tipos de experimentos, los tipos de reactivos y los tipos de ensayos que se pueden utilizar en el sistema StepOne.

En capítulos posteriores se ofrece información específica:

Capítulo Descripción

Capítulo 2, Introducción a los reactivos

• Describe y compara los reactivos TaqMan® y SYBR® Green.

• Proporciona información acerca de cómo reducir al mínimo la contaminación del DNA.

Capítulo 3, Experimentos de cuantificación

• Explica cómo funciona el tipo de experimento.• Ofrece el flujo de trabajo específico para el tipo de

experimento.• Ofrece directrices de diseño para cada tipo de

ensayo.

Capítulo 4, Experimentos de genotipado

Capítulo 5, Experimentos de presencia/ausencia



Selección del tipo de experimentoEn el sistema StepOne, se pueden realizar los siguientes tipos de experimentos:

• Cuantificación, incluidos:– Curva estándar– Curva estándar relativa– CT comparativos (∆∆CT)

• Genotipado• Presencia/ausencia

Nota: También se puede realizar un análisis de curva de disociación en el sistema StepOne.

Experimentos depunto final y

experimentos entiempo real

Los tres tipos de experimentos se pueden clasificar como experimentos en tiempo real y experimentos de punto final, tal y como se explica a continuación.

Categoría Propiedades Tipo de experimento

Tiempo real • El instrumento supervisa el progreso de la PCR a medida que se produce.‡

• Se recogen datos durante el proceso de PCR.

• Las reacciones se caracterizan por el punto temporal del ciclo en el que se detecta por primera vez la amplificación de una diana.§

‡ Kwok y Higuchi, 1989.§ Saiki et al., 1985.

Cuantificación

Punto final • Los datos se recogen al final del proceso de PCR.

• Las reacciones se caracterizan por la cantidad de diana acumulada al final de la PCR.§

• El punto de datos es la intensidad normalizada del fluorocromo notificador, o Rn.

Nota: Algunos experimentos de punto final también incluyen puntos de datos anteriores a la PCR. Si es así, el sistema calcula el valor delta Rn (∆Rn) de acuerdo con la siguiente fórmula:

Rn posterior a PCR – Rn anterior a PCR = ∆Rn

Genotipado

Presencia/ausencia



Selección del tipo de reactivoEn el sistema StepOne, se pueden utilizar los siguientes tipos de reactivos (químicos):

• Reactivos TaqMan®

• Reactivos SYBR® Green• Otros reactivos basados en fluorescencia

ReactivosTaqMan

Los reactivos TaqMan incluyen ensayos TaqMan® (mezclas preformuladas que contienen conjuntos de sondas y cebadores) y mezclas de reacción TaqMan®. Los reactivos TaqMan se pueden utilizar para los siguientes tipos de experimentos:

• Cuantificación, incluidos:– Curva estándar– Curva estándar relativa– CT comparativos (∆∆CT)


¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne.

Reactivos SYBRGreen

Los reactivos SYBR Green incluyen cebadores y mezclas de reacción que contienen fluorocromo SYBR® Green. Los reactivos SYBR Green se pueden utilizar para los experimentos de cuantificación de:

• Curva estándar• Curva estándar relativa• CT comparativos (∆∆CT)

Nota: No se puede realizar una PCR en multiplex con reactivos SYBR Green. Para obtener más información, consulte “Selección de PCR en singleplex o en multiplex” en la página 3-10.

Otros reactivos Se pueden utilizar otros reactivos basados en fluorescencia en el sistema StepOne, pero se debe tener en cuenta lo siguiente:

• El software StepOne calcula automáticamente los volúmenes de reacción de los reactivos TaqMan y SYBR Green, pero no de otros reactivos.

• Se debe diseñar el experimento con el flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada), en lugar de con el flujo de trabajo del asistente de diseño.



Selección del tipo de ensayoEn el software StepOne, se pueden seleccionar los siguientes tipos de ensayos para los experimentos de cuantificación, presencia/ ausencia y genotipado:

Experimentos decuantificación y

de presencia/ausencia

Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido (Made to Order)

Para los experimentos de cuantificación o de presencia/ausencia, seleccione el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne si utiliza:

• TaqMan® Gene Expression Assays, en inventario: conjuntos de cebadores y sondas MGB (ligando de unión al surco menor) TaqMan® prediseñados con el marcaje FAM, como fluorocromo™ que se pueden adquirir ya preparados. La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20✕ preformulado.

• TaqMan® Gene Expression Assays, fabricados bajo pedido (Made to Order): conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB prediseñados con el marcaje fam, como fluorocromo que se fabrican en el momento de realizar el pedido. La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20✕ preformulado.

• Custom TaqMan® Gene Expression Assays: conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB con el marcaje del fluorocromo FAM que están diseñados, sintetizados y formulados por el servicio Custom TaqMan® Genomic Assays de acuerdo con la información de secuencia remitida. La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20✕ o 60✕ preformulado.

Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo en el software StepOne, vaya a la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) en el flujo de trabajo del asistente de diseño o Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a continuación, seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo).

Tipo de experimento Tipo de ensayo Véase...

Cuantificación‡

‡ Los experimentos de cuantificación incluyen experimentos de curva estándar, cuantificación relativa.

• En inventario y fabricado bajo pedido

• Personalizado

más abajo

Presencia/ausencia

Genotipado • Prediseñado/validado• Personalizado• Diseñado por el usuario

página 1-8



Ensayos personalizados (Custom Assays)

Para los experimentos de cuantificación y de presencia/ausencia, seleccione el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software StepOne si va a diseñar sus propios ensayos (cebadores o sondas) con el software Primer Express® y reactivos TaqMan o SYBR Green. Cuando diseñe sus propios ensayos, siga las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems para optimizar los resultados.


Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo en el software StepOne, vaya a la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) en el flujo de trabajo del asistente de diseño o Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a continuación, seleccione Custom (Personalizado) en el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo).

Experimentos degenotipado

Ensayos prediseñados/validados

En los experimentos de genotipado, el tipo de ensayo Pre-Designed/Validated (Prediseñado/validado) incluye:

• TaqMan® SNP Genotyping Assays: conjuntos de cebadores y sondas MGB (ligando de unión al surco menor) TaqMan® prediseñados con el marcaje de los fluorocromos FAM™ y VIC® que están disponibles en dos categorías:– TaqMan® Validated & Coding SNP Genotyping Assays, que se pueden

adquirir ya preparados (en inventario). La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20✕ preformulado.

– TaqMan® Pre-Designed SNP Genotyping Assays, que se fabrican en el momento de realizar el pedido (fabricados bajo pedido [Made to Order]). La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20✕ preformulado.

• TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays: conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB prediseñados con el marcaje de los fluorocromos FAM y VIC que se pueden adquirir ya preparados (en inventario). La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 20✕ preformulado.

• Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination (TaqMan® PDARs for AD): conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB prediseñados con el marcaje de los fluorocromos FAM y VIC que se pueden adquirir ya preparados (en inventario). La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 10✕ preformulado.

Nota: Cuando seleccione un ensayo de SNP en el software StepOne, vaya a la pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) del flujo de trabajo del asistente de diseño o a la pantalla Plate Setup (Configuración de placa) del flujo de trabajo Advanced Setup (Configuración avanzada). En la pantalla SNP Assays (Ensayos de SNP) o Plate Setup (Configuración de placa), se puede seleccionar un ensayo en la biblioteca o crear uno nuevo.



Ensayos personalizados (Custom Assays)

Para los experimentos de genotipado, el tipo de ensayo Custom (Personalizado) incluye Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays. Custom TaqMan SNP Genotyping Assays son conjuntos de cebadores y sondas TaqMan MGB con el marcaje de los fluorocromos FAM y VIC que están diseñados, sintetizados y formulados por el servicio Custom TaqMan® Genomic Assays de acuerdo con la información de secuencia remitida. La mezcla del ensayo está disponible en un solo tubo de 40✕ o 80✕ preformulado.


Ensayos diseñados por el usuario

Si desea diseñar sus propios cebadores y sondas para los ensayos de SNP, consulte Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide.



2Introducción a los reactivos 2


Introducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

Reactivos TaqMan® . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2

Reactivos SYBR® Green . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4

Selección del tipo de reactivo apropiado. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-5

Reducción al mínimo de los contaminantes del DNA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7


Capítulo 2 Introducción a los reactivos

IntroducciónApplied Biosystems ha desarrollado dos tipos de reactivos (químicos) que se pueden utilizar para detectar productos de PCR en Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System:

• Reactivos TaqMan® (más abajo)• Reactivos SYBR® Green (página 2-4)

Reactivos TaqMan®

Tipos deexperimentos

Los reactivos TaqMan® incluyen ensayos TaqMan® (mezclas preformuladas que contienen conjuntos de sondas y cebadores) y mezclas de reacción TaqMan®. Los ensayos son específicos de la diana de interés. Las mezclas de reacción contienen los demás componentes que son necesarios para la reacción de PCR. Los reactivos TaqMan se pueden utilizar para los siguientes tipos de experimentos:

• Cuantificación, incluidos:

– Curva estándar– Curva estándar relativa– CT comparativos (∆∆CT)



Desarrollo dereactivos TaqMan

Al principio, se utilizaban fluorocromos intercalantes para medir los productos de PCR en tiempo real. El principal inconveniente de este método de detección es que detecta la acumulación de productos de PCR tanto específicos como no específicos.

Los sistemas en tiempo real para PCR mejoraron gracias a la introducción de sondas con marcajes de fluorocromos que utilizan la actividad 5′ nucleasa de la Taq polimerasa de DNA. La existencia de estas sondas fluorogénicas permitió desarrollar un método en tiempo real para detectar únicamente productos de amplificación específicos.

Funcionamientode los reactivos

TaqMan

Los reactivos TaqMan utilizan una sonda fluorogénica para detectar un producto de PCR específico a medida que se acumula durante la PCR. Así es cómo funciona:

1. Se construye una sonda oligonucleótida con un fluorocromo notificador unido al extremo 5′ y un apantallador en el extremo 3′. Mientras la sonda está intacta, la proximidad del apantallador reduce enormemente la fluorescencia que emite el fluorocromo notificador por medio de la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET; resonancia de Förster, Förster, V. T. 1948) a través del espacio.

2. Si la diana está presente, la sonda anilla entre las localizaciones de los cebadores y se rompe por la actividad de la 5' nucleasa de la Taq Polimerasa, durante la extensión.



3. Esta ruptura de la sonda:– Separa el fluorocromo notificador del apantallador, lo que aumenta la señal

del fluorocromo notificador.– Quita la sonda de la cadena de la diana, lo que permite que la extensión del

cebador continúe hasta el final de la cadena del molde. De esta forma, la inclusión de la sonda no inhibe el proceso global de PCR.

4. En cada ciclo, se separan más moléculas de fluorocromo notificador de sus respectivas sondas, lo que produce un aumento de la intensidad de la fluorescencia que es proporcional a la cantidad de amplicón producido. Cuanto más alto sea el número inicial de copias de la diana de ácido nucleico, antes se observará un aumento significativo de la fluorescencia.

La Figura 2-1 ilustra este proceso.

Figura 2-1 Funcionamiento de los reactivos TaqMan

Sondas TaqManMGB

Applied Biosystems recomienda el uso general de sondas TaqMan MGB®, sobre todo si las sondas TaqMan® convencionales superan los 30 nucleótidos. Las sondas TaqMan MGB contienen:

• Un fluorocromo notificador en el extremo 5′: genera una señal cuando se rompe a causa de la actividad 5′ nucleasa de la Taq polimerasa de DNA.

• Un apantallador no fluorescente (NFQ) en el extremo 3′: permite a los sistemas de PCR en tiempo real medir con más precisión las contribuciones de fluorocromo notificador, dado que el apantallador no emite fluorescencia.

• Un ligando de unión al surco menor (MGB) en el extremo 3′: aumenta la temperatura de desnaturalización (Tm) de las sondas sin aumentar la longitud de la sonda (Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997), por lo que permite diseñar sondas más cortas. Por consiguiente, las sondas TaqMan MGB tienen mayores diferencias en los valores de Tm entre sondas complementarias y no perfectamente complementarias con la diana. Estas mayores diferencias en los valores de Tm permiten realizar el genotipado con precisión.

RQ

DESPLAZAMIENTO DE CADENA

3'3'5'

5'5'

5'

3'

QR

PARTICIÓN

3'3'5'

5'5'

5'

3'

RR = NOTIFICADOR

Q Q = APANTALLADOR

POLIMERIZACIÓN

SONDA3'

3'5'

5'5'

5'

3'

CEBADOR REVERSO

CEBADOR DIRECTO

QR

POLIMERIZACIÓN COMPLETADA

3'

3'5'

5'5'

5'

3'

Paso 1: un notificador (R) y un apantallador (Q) se unen a los extremos 5′ y 3′ de una sonda TaqMan®.

Paso 3: durante cada ciclo de extensión, la polimerasa Taq DNA separa el fluorocromo notificador de la sonda.

Paso 4: una vez separado del apantallador, el fluorocromo notificador emite su fluorescencia característica.

Paso 2: cuando ambos marcajes están unidos a la sonda, se inhibe la emisión del fluorocromo notificador.



Applied Biosystems ofrece las siguientes sondas TaqMan MGB con NFQ para el sistema StepOne™:


Reactivos SYBR® Green

Tipos deexperimentos

Los reactivos SYBR® Green incluyen cebadores y mezclas de reacción que contienen fluorocromo SYBR® Green. Los reactivos SYBR Green se pueden utilizar para los experimentos de cuantificación de:

• Curva estándar• Curva estándar relativa• CT comparativos (∆∆CT)

Nota: No se puede realizar una PCR en multiplex con reactivos SYBR Green. Para obtener más información, consulte “Selección de PCR en singleplex o en multiplex” en la página 3-10.

Desarrollo dereactivos SYBR

Green

Las pequeñas moléculas que se unen al DNA de doble cadena se pueden dividir en dos clases: las que se intercalan en el DNA y las que se unen al surco menor del DNA. Higuchi (Higuchi et al., 1992) utilizaba el agente intercalante bromuro de etidio para la detección de la PCR en tiempo real. Hoechst 33258 es un ejemplo de un fluorocromo de ligando de unión al surco menor cuya fluorescencia aumenta cuando se une a DNA de doble cadena (Higuchi et al., 1993).

Con independencia del método de unión, al menos hay dos requisitos para que un fluorocromo de unión a DNA detecte productos de PCR en tiempo real:

• Aumento de fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena• Sin inhibición de la PCR

Applied Biosystems ha desarrollado condiciones que permiten el uso del fluorocromo SYBR® Green I en la PCR sin que haya inhibición de la PCR y con mayor sensibilidad de detección en comparación con el bromuro de etidio.

Fluorocromo con marcaje en 5′

Fluorocromo con marcaje en 3′

Otras funciones

Ensayos TaqMan® (sonda TaqMan MGB®)

Expresión de genes Fluorocromo FAM™ NFQ MGB

Genotipado SNP Fluorocromos FAM™ y VIC® NFQ MGB

Ensayos TaqMan® personalizados (sonda TaqMan MGB® )

Expresión de genes Fluorocromo FAM™ NFQ MGB

Genotipado SNP Fluorocromos FAM™ y VIC® NFQ MGB

Sondas personalizadas Sonda TaqMan MGB® personalizada

Fluorocromo FAM™, TET™, NED™ o VIC®

NFQ MGB



Funcionamientode los reactivos

SYBR Green

Los reactivos SYBR Green utilizan el fluorocromo SYBR Green I para detectar productos de PCR uniéndose al DNA de doble cadena que se forma durante la PCR. Así es cómo funciona:

1. Cuando se añade SYBR® Green PCR Master Mix a la muestra, el fluorocromo SYBR Green I se une inmediatamente a todo el DNA de doble cadena.

2. Durante la PCR, AmpliTaq Gold® DNA Polymerase amplifica la diana, lo que crea el producto de PCR, o “amplicón”.

3. A continuación, el fluorocromo SYBR Green I se une a cada copia nueva del DNA de doble cadena.

4. A medida que se produce la PCR, se crea más amplicón.Dado que el fluorocromo SYBR Green I se une a todo el DNA de doble cadena, el resultado es un aumento de la intensidad de la fluorescencia que es proporcional a la cantidad de producto de PCR de doble cadena producido.

Las Figuras 2-2 más abajo ilustran este proceso.

Figura 2-2 Funcionamiento de los reactivos SYBR Green

Selección del tipo de reactivo apropiadoLos reactivos TaqMan y SYBR Green se pueden utilizar para los tipos de experimentos que se indican a continuación.

CEBADOR DIRECTO

CEBADOR REVERSO

Paso 1: Configuración de la reacciónEl fluorocromo SYBR Green I emite una fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena.

Paso 2: DesnaturalizaciónCuando el DNA se desnaturaliza, se libera el fluorocromo SYBR Green I y la fluorescencia disminuye considerablemente.

Paso 3: PolimerizaciónDurante la extensión, los cebadores se hibridan y se genera el producto de PCR.

Paso 4: Polimerización completadaEl fluorocromo SYBR Green I se une al producto de doble cadena, lo que produce un aumento neto de la fluorescencia que detecta el instrumento.

®

®

®

Tipo de experimento

Tipo de reactivo Cuantificación‡ (Capítulo 3)

‡ Incluye experimentos de curva estándar, cuantificación relativa.

Genotipado (Capítulo 4)

Presencia/ausencia

(Capítulo 5)

Reactivos SYBR® Green Sí No recomendado No recomendadoReactivos TaqMan® Sí Sí Sí



Consideracionessobre los

experimentos decuantificación

Los experimentos de cuantificación se pueden realizar con reactivos TaqMan o SYBR Green. Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre dos tipos de reactivos:


Tipo de reactivo Proceso

Reactivos o kits TaqMan®

Descripción

Los reactivos TaqMan utilizan una sonda fluorogénica para permitir la detección de un producto de PCR específico cuando se acumula durante los ciclos de PCR.

Ventajas

• Aumenta la especificidad con una sonda. La hibridación específica entre la sonda y la diana genera una señal de fluorescencia.

• Proporciona capacidades de multiplex.• Hay disponibles ensayos

preformulados que están optimizados para funcionar en condiciones de ciclos térmicos universales.

• Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o 2 pasos.

Limitaciones

Requiere la síntesis de una única sonda


Descripción

Los reactivos SYBR Green utilizan el fluorocromo SYBR® Green I, que es un fluorocromo de unión a DNA de doble cadena que sirve para detectar productos de PCR cuando se acumulan durante los ciclos de PCR.

Ventajas

• Económico (no se necesita una sonda).• Permite que los análisis de curvas de

disociación midan la Tm de todos los productos de PCR.

• Se puede utilizar para la RT-PCR de 1 o 2 pasos.

Limitaciones

Se une de manera no específica a todas las secuencias de DNA de doble cadena. Para evitar señales positivas falsas, compruebe la formación de un producto no específico utilizando un análisis de gel o de curva de disociación.

b. Plantilla desnaturalizada e hibridada de los componentes del ensayo

Cebador directo

Cebador reverso

Q

MGB

F

Leyenda

Cebador aleatorio

FluorocromoFAM™

Apantallador

Ligando de unión al surco menor

AmpliTaq Gold®DNA Polymerase

Sonda

Cebador

Molde

Cebador extendido

RP

5' 3'

a. Componentes del ensayo

Molde de cDNA

Cebador directo

Cebador reversoSonda

Q

MGB

F

Sonda

Q

MGB

F

5' 3'

PCR y detección de cDNA

cDNA

5' 3'

5' 3'

c. Generación de señal

Cebador reverso

F Cebador directo

5' 3'

3' 5'

5' 3'

MGB

Q

CEBADOR DIRECTO

CEBADOR REVERSO

Paso 1: Configuración de la reacciónEl fluorocromo SYBR Green I emite una fluorescencia cuando se une a DNA de doble cadena.

Paso 2: DesnaturalizaciónCuando el DNA se desnaturaliza, se libera el fluorocromo SYBR Green I y la fluorescencia disminuye considerablemente.

Paso 3: PolimerizaciónDurante la extensión, los cebadores se hibridan y se genera el producto de PCR.

Paso 4: Polimerización completadaEl fluorocromo SYBR Green I se une al producto de doble cadena, lo que produce un aumento neto de la fluorescencia que detecta el instrumento.

®

®

®



Reducción al mínimo de los contaminantes del DNA La capacidad de amplificación de DNA del proceso de PCR hace necesario el uso de prácticas especiales de laboratorio para realizar experimentos en los que se utilizan reactivos TaqMan o SYBR Green. Las muestras que tienen altas concentraciones de DNA podrían introducir contaminación, ya sea por los controles de moldes de DNA o por la contaminación por arrastre de PCR.

Asimismo, debido a la naturaleza no específica del fluorocromo SYBR Green I, se detecta cualquier DNA de doble cadena. Cuando utilice reactivos SYBR Green, compruebe si se forman productos no específicos mediante un análisis de curva de disociación o de gel. Procure evitar la contaminación con el DNA diana. Los ensayos de expresión de genes que abarcan uniones exón-exón minimizan el efecto de los contaminantes de gDNA (DNA genómico).

Uso de UNG parareducir al mínimola reamplificaciónde los productos

de contaminaciónpor arrastre

La uracil-N-glicosilasa, Amperase® (UNG) es una enzima recombinante de 26-kDa codificada por el gen de uracil-N-glicosilasa de Escherichia coli. Este gen se ha introducido en un huésped de E. coli para dirigir la expresión de la forma nativa de la enzima (Kwok y Higuchi, 1989).

La UNG actúa en DNA de cadena sencilla y de doble cadena que contiene dU. Hidroliza las uniones uracil-glicosídicas en emplazamientos de DNA que contienen dU. La enzima causa la liberación de uracilo, por lo que se crea un emplazamiento apiridímico sensible al álcali en el DNA. La enzima no tiene ninguna actividad en el RNA o en el DNA que contiene dT (Longo et al., 1990).

Ensayos TaqMan

Para los ensayos TaqMan®, el tratamiento de AmpErase® UNG puede evitar la reamplificación de los productos de PCR de contaminación por arrastre a partir de reacciones de PCR anteriores. Si dUTP sustituye a dTTP en la reacción de amplificación, el tratamiento de AmpErase UNG puede eliminar hasta 200.000 copias de amplicón por reacción de 50µL.

Nota: TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix está disponible con o sin AmpErase UNG. Si utiliza TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG, debe adquirir AmpErase UNG por separado.

Ensayos de fluorocromo SYBR Green I

Para los ensayos de fluorocromo SYBR Green I , el tratamiento de AmpErase UNG puede evitar la reamplificación de los productos de PCR de contaminación por arrastre a partir de reacciones de PCR anteriores. Aunque Power SYBR® Green PCR Master Mix y SYBR® Green PCR Master Mix no contienen AmpErase UNG, sí contienen dUTP y, por lo tanto, son compatibles con AmpErase UNG. Si se sospecha que hay contaminación por arrastre de PCR, utilice AmpErase UNG para solucionar el problema.

Nota: AmpErase UNG se puede adquirir de manera individual o como parte de SYBR® Green PCR Core Reagents Kit.



Prácticasgenerales de

PCR

Utilice las siguientes precauciones para reducir al mínimo la contaminación de las muestras y la contaminación por arrastre de productos de PCR:

• Lleve una bata de laboratorio limpia (que no llevara puesta mientras manejaba productos de PCR amplificados o durante la preparación de las muestras) y guantes limpios cuando prepare las muestras para la reacción de amplificación. Cámbiese de guantes siempre que sospeche que están contaminados.

• Mantenga áreas separadas, equipo especial y suministros para:– Preparación de las muestras. – Configuración de la PCR. Nunca lleve productos de PCR amplificados al

área de configuración de la PCR.– Amplificación de PCR. – Análisis de productos de PCR.

• Abra y cierre todos los tubos de muestras con cuidado. Procure no pulverizar ni salpicar con muestras de PCR.

• Utilice pipetas de desplazamiento de aire o desplazamiento positivo con puntas con filtro. Cambie las puntas después de cada uso.

• Mantenga las reacciones y los componentes tapados todo el tiempo posible.• Limpie las mesas del laboratorio y el equipo periódicamente con una solución

de lejía al 10% o 70% de etanol.


3Experimentos de cuantificación 3


Sección 3.1 Acerca de los experimentos de cuantificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3

Sección 3.2 Directrices de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-17



Sección 3.1 Acerca de los experimentos de cuantificación

Esta sección cubre los siguientes temas:

Introducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4

Selección de un método de cuantificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5

Selección de una RT-PCR de 1 o 2 pasos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8

Selección de PCR en singleplex o en multiplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10

Selección del tipo de reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13

Selección del tipo de ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-13



Introducción

¿Qué es unexperimento decuantificación?

Un experimento de cuantificación es un experimento en tiempo real en el que se mide la cantidad de una secuencia de ácido nucleico de una diana (diana) durante cada ciclo de amplificación de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). La diana puede ser DNA, cDNA o RNA.

En esta guía, se explican tres tipos de experimentos de cuantificación:

• Curva estándar (página 3-5)• Curva estándar relativa (página 3-5)• CT comparativos (∆∆CT) (página 3-6)

Funcionamientode los

experimentos decuantificación

En los experimentos de cuantificación en tiempo real, las reacciones se caracterizan por el punto temporal del ciclo en el que la amplificación de un producto de PCR logra un nivel fijo de fluorescencia, en lugar de la cantidad final de producto de PCR acumulado después de un número de ciclos fijo. Las gráficas de amplificación muestran la fluorescencia detectada en el número de ciclos que se han realizado.

En los primeros ciclos de la PCR, no hay ningún cambio significativo en la señal de fluorescencia. Este rango predefinido de ciclos de PCR se denomina línea basal. En primer lugar, el software genera una gráfica de amplificación en la que se ha sustraído la línea basal. Para ello, calcula una tendencia matemática de la señal del notificador fluorescente normalizado (valores Rn correspondientes a los ciclos de la línea basal). A continuación, un algoritmo busca el punto de la gráfica de amplificación en el que la señal del notificador fluorescente normalizado con la línea basal corregida (valor delta Rn [∆Rn]) cruza el umbral. El ciclo fraccional en el que el valor ∆Rn cruza el umbral se define como CT.

Flujo de trabajo Antes de realizar experimentos de cuantificación en Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System, prepare el experimento de la siguiente forma:

1. Seleccione un método de cuantificación (página 3-5).

2. Seleccione una RT-PCR de 1 o 2 pasos (página 3-8)

3. Seleccione reacciones de PCR en singleplex o en multiplex (página 3-10).

4. Seleccione el tipo de reactivo (página 3-13).

5. Seleccione el tipo de ensayo (página 3-13).

6. Revise las directrices de diseño del tipo de ensayo que ha seleccionado (Sección 3.2 en la página 3-17).



Selección de un método de cuantificación

Acerca de losexperimentos de

curva estándar

Los experimentos de curva estándar determinan la cantidad absoluta de una diana en una muestra. Para conseguir los resultados, se utiliza una curva estándar construida a partir de una dilución seriada de una cantidad conocida.

Componentes

Las reacciones de PCR de los experimentos de curva estándar incluyen los siguientes componentes:

• Muestra: la muestra en la que la cantidad de la diana es desconocida.

• Estándar: una muestra de una cantidad conocida.

• Dilución seriada de estándar: un conjunto de diluciones del estándar (por ejemplo, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) que se utilizan para construir una curva estándar.

• Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes idénticos.

• Controles negativos: muestras que contienen agua o tampón en lugar de molde; también se denominan NTC (sin ácido nucleico molde). Los controles negativos no se deberían amplificar.

Acerca de losexperimentos de

curva estándarrelativa

Los experimentos de curva estándar relativa determinan el cambio de expresión de una diana en una muestra en relación con la misma diana de una muestra de referencia. Para conseguir los resultados, se utiliza una curva estándar construida a partir de una dilución seriada de una cantidad conocida.

Los experimentos de curva estándar relativa se suelen utilizar para:

• Comparar niveles de expresión de un gen en diferentes tejidos.

• Comparar los niveles de expresión de un gen en una muestra tratada y en una muestra no tratada.

• Comparar los niveles de expresión de alelos de tipo salvaje y alelos mutados.

Componentes

Las reacciones de PCR de los experimentos de curva estándar relativa incluyen los siguientes componentes:


• Muestra de referencia: la muestra utilizada como base para los resultados de la comparación. Por ejemplo, en un estudio sobre los efectos de las drogas en la expresión de genes, un control no tratado sería una muestra de referencia apropiada.

• Estándar: una muestra de una cantidad conocida.

• Dilución seriada de estándar: un conjunto de diluciones del estándar (por ejemplo, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) que se utilizan para construir una curva estándar. En todas las muestras, la cantidad de diana se determina realizando una interpolación a partir de la curva estándar y luego dividiendo por la cantidad de diana de la muestra de referencia. Dado que la muestra de referencia es la



muestra 1✕, todas las demás cantidades se expresan como una diferencia multiplicada por n relativa a ella. Asimismo, la unidad de la curva estándar desaparece porque la cantidad de muestra se divide por la cantidad de muestra de referencia. Por consiguiente, lo único que se necesita de los estándares es conocer sus diluciones relativas. Se puede utilizar cualquier cDNA, RNA o DNA de solución de partida que contenga la diana apropiada para preparar los estándares.

• Control endógeno: un gen presente en un nivel de expresión uniforme en todas las muestras. El control endógeno sirve para normalizar posibles variaciones de la cantidad de cDNA que se añade a cada reacción producidas como consecuencia de imprecisiones en el pipeteo.



Acerca de losexperimentos deCT comparativos

Los experimentos de CT comparativos (∆∆CT) determinan el cambio de expresión de una diana en una muestra en relación con la misma diana en una muestra de referencia. Se utiliza una fórmula aritmética para conseguir los resultados (consulte “Fórmula para experimentos de CT comparativos (∆∆CT)” en la página A-1).

Los experimentos de CT comparativos se suelen utilizar para:

• Comparar niveles de expresión de un gen en diferentes tejidos.

• Comparar los niveles de expresión de un gen en una muestra tratada y en una muestra no tratada.

• Comparar los niveles de expresión de alelos de tipo salvaje y alelos mutados.

Componentes

Las reacciones de PCR de los experimentos de CT comparativos incluyen los siguientes componentes:


• Muestra de referencia: la muestra utilizada como base para los resultados de la comparación. Por ejemplo, en un estudio sobre los efectos de las drogas en la expresión de los genes, un control no tratado sería una muestra de referencia apropiada.

• Control endógeno: un gen presente en un nivel de expresión uniforme en todas las muestras. El control endógeno sirve para normalizar posibles variaciones de la cantidad de cDNA que se añade a cada reacción producidas como consecuencia de imprecisiones en el pipeteo.





Comparación demétodos de

cuantificación

Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre experimentos de curva estándar, experimentos de curva estándar relativa y experimentos de CT comparativos:


Para obtener más información acerca de los métodos de cuantificación, consulte User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression.

Tipo de experimento Descripción Ventaja Limitación

Curva estándar Se utiliza una curva estándar para determinar la cantidad absoluta de una diana en una muestra. Se suele utilizar para cuantificar la carga viral.

Permite realizar comparaciones con cantidades estándar conocidas.

Se debe crear una curva estándar para cada diana, lo que exige más reactivos y más espacio en la placa de reacción.

Curva estándar relativa

Se utiliza una curva estándar para determinar el cambio de expresión de una diana en una muestra en relación con la misma diana en una muestra de referencia. Es ideal para los ensayos que tienen una eficiencia de PCR por debajo de la óptima.

Es el experimento que requiere menos validación, porque las eficiencias de PCR de la diana y el control endógeno no tienen que ser equivalentes.

Se debe crear una curva estándar para cada diana, lo que exige más reactivos y más espacio en la placa de reacción.

CT comparativos (∆∆CT)

Se utilizan fórmulas aritméticas para determinar el cambio de expresión de una diana en una muestra en relación con la misma diana en una muestra de referencia. Es ideal para realizar mediciones de alto rendimiento de una expresión de gen relativa en muchos genes de muchas muestras.

• Los niveles relativos de diana en las muestras se pueden determinar sin utilizar una curva estándar, siempre que las eficiencias de PCR de la diana y el control endógeno sean relativamente equivalentes.

• Menor uso de reactivos.• Más espacio disponible en

la placa de reacción.

• Los ensayos que no son óptimos (con una eficiencia de PCR baja) pueden producir resultados imprecisos.

• Antes de utilizar el método de CT comparativos, Applied Biosystems recomienda determinar si las eficiencias de PCR del ensayo diana y el ensayo de control endógeno son aproximadamente iguales.



Selección de una RT-PCR de 1 o 2 pasosLa transcripción reversa-reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) se utiliza para cuantificar el RNA. La RT-PCR se puede realizar en un procedimiento de 1 o 2 pasos.

Acerca de la RT-PCR de 1 paso

En las RT-PCR de 1 paso, se puede realizar la transcripción reversa y la PCR en un solo sistema de tampón (Figura 3-1). La reacción se realiza sin necesidad de añadir reactivos entre los pasos de RT y PCR. La RT-PCR de 1 paso es cómoda porque sólo se necesita una preparación de un tubo para la amplificación de RT y PCR. Sin embargo, con la RT-PCR de 1 paso no se puede utilizar la enzima de prevención de contaminación por arrastre, AmpErase® uracil-N-glicosylasa (UNG). En la RT-PCR de 1 paso, la presencia de UNG destruiría el cDNA a medida que se fuera creando. Para obtener información acerca de UNG, consulte “Uso de UNG para reducir al mínimo la reamplificación de los productos de contaminación por arrastre” en la página 2-7.

Figura 3-1 Representación esquemática de la RT-PCR de 1 paso

Acerca de la RT-PCR de 2 pasos

La RT-PCR de 2 pasos se realiza en dos reacciones distintas: una para la RT y otra para la PCR (Figura 3-2). La RT-PCR de 2 pasos es útil para detectar múltiples transcripciones a partir de una sola reacción de cDNA, o para guardar una parte del cDNA para utilizarlo más adelante. Si la PCR se realiza utilizando dUTP como una de las bases, se puede utilizar la enzima AmpErase® UNG para evitar la contaminación por arrastre. Para obtener información acerca de UNG, consulte “Uso de UNG para reducir al mínimo la reamplificación de los productos de contaminación por arrastre” en la página 2-7.

Un solo tubo



Figura 3-2 Representación esquemática de la RT-PCR de 2 pasos

Cebadoresutilizados para lasíntesis de cDNA

Para la RT-PCR de 1 paso, se pueden utilizar cebadores reversos específicos de la secuencia para la síntesis del cDNA.

Para la RT-PCR de 2 pasos, se pueden utilizar los siguientes cebadores para la síntesis del cDNA:

• Oligo d(T)16

• Cebadores aleatorios• Cebadores reversos específicos de la secuencia

Es mejor realizar la elección de cebadores para la transcripción reversa después de evaluar experimentalmente los tres sistemas de cebadores. Para secuencias de RNA cortas que no contengan estructuras en horquilla, cualquiera de los tres sistemas funciona bien. Para transcripciones o secuencias de RNA más largas que contengan estructuras en horquilla, siga estas directrices:

Tubo 1

Tubo 2 Paso de PCR

Oligo d(T) o hexámero aleatorio

Cebadores Directrices de selección

Oligo d(T)16 • Se utiliza para realizar transcripciones reversas sólo de mRNA eurocariota y retrovirus con colas de poli-A.

• Evita amplicones o transcripciones de mRNA largas mayores de 2 kilobases en sentido ascendente desde el emplazamiento del poli-A.

Cebadores aleatorios • Intente utilizarlos primero con transcripciones reversas largas o transcripciones reversas que contengan estructuras en horquilla.

• Se utiliza para transcribir todo el RNA (rRNA, mRNA y tRNA).

Cebadores reversos específicos de la secuencia

• Se utilizan para realizar transcripciones reversas sólo de secuencias complementarias que contengan RNA.

• Se utiliza en la RT-PCR de 1 paso.



Comparación demétodos de RT-

PCR

Selección de PCR en singleplex o en multiplexSe puede realizar una reacción de PCR utilizando:

• PCR en singleplex: Para experimentos de curva estándar, cuantificación relativa. En la PCR en singleplex, hay un solo conjunto de cebadores en el tubo de reacción o el pocillo. Sólo se puede amplificar una diana o un control endógeno por reacción.

o

• PCR en multiplex: Para experimentos de CT comparativos. En la PCR en multiplex, hay dos o más conjuntos de cebadores en el tubo de reacción o pocillo. Cada conjunto amplifica una diana o un control endógeno específicos. Normalmente, una sonda marcada con fluorocromo FAM™ detecta la diana y una sonda marcada con fluorocromo VIC® detecta el control endógeno.¡IMPORTANTE! No se pueden utilizar reactivos SYBR®Green para la PCR en multiplex.


PCR en mulitplexpara

experimentos deCT comparativos

Para realizar una PCR en multiplex para los experimentos de CT comparativos, debe:

• Asegurarse de que el control endógeno que ha seleccionado es más abundante (menor CT) que todas las dianas que está intentando cuantificar en todas las condiciones.

• Realice el ensayo del control endógeno como un ensayo con limitación de concentración de cebadores. El ensayo del control endógeno (para el molde más abundante) en cada reacción debe tener el cebador limitante para evitar la competencia en la PCR y altere el CT del molde menos abundante.

Método Cebadores para la síntesis de cDNA Comentarios

RT-PCR de 1 paso

Cebador reverso específico de la secuencia

Requiere una sola mezcla de reacción.

No se puede utilizar AmpErase® UNG.

RT-PCR de 2 pasos

Hexámeros aleatorios El cDNA se puede guardar para utilizarlo posteriormente.

Se puede utilizar AmpErase® UNG.

Requiere dos mezclas de reacción.

Oligo d(T)16

Cebadores reversos específicos de la secuencia

GR2331

Conjunto de cebadores de gen diana

Conjunto de cebadores de control endógeno

cDNAPCR en singleplex PCR en multiplex



Limitación del cebador en la PCR en multiplex

Para generar un ensayo en multiplex preciso, es importante que la amplificación de una especie no domine a la otra. De lo contrario, la amplificación de una especie muy abundante puede impedir que la especie menos abundante se amplifique eficientemente.

Si la especie menos abundante no se amplifica eficientemente, los resultados del experimento podrían ser imprecisos o, en los casos más graves, se podría inhibir por completo la detección de la especie menos abundante. Para evitar este problema, limite las concentraciones de los cebadores que se utilizan para amplificar la especie más abundante, de manera que la amplificación se “desactive” poco después de establecer el CT. Sin embargo, los ensayos con cebadores limitantes son más susceptibles a sufrir fluctuaciones en las condiciones de la reacción que los ensayos de dianas con cebadores no limitados que se normalizan. Para obtener más información, consulte el Apéndice B, “Limitación del cebador en la PCR en multiplex.”.

PCR en singleplex y PCR en multiplex

La limitación de cebadores en la PCR en multiplex es cada vez más compleja a medida que aumenta el número de dianas que se desea cuantificar. Para analizar un gran número de dianas, quizá sea más eficiente utilizar la PCR en singleplex por las siguientes razones:

• En la PCR en multiplex, puede resultar difícil encontrar un control endógeno adecuado, es decir, uno que:– Sea más abundante que todas las dianas que se están cuantificando.– No cambie los niveles de expresión con condiciones experimentales o entre

diferentes muestras.En primer lugar, tendría que realizar todos los ensayos diana y todos los ensayos de control endógeno en los formatos en multiplex y en singleplex, y luego comparar los valores de CT de ambos formatos para determinar si la multiplexación ha afectado a los valores de CT.

• En la PCR en singleplex, cualquier diana que no cambie los niveles de expresión con condiciones experimentales o entre muestras puede servir de control endógeno. Por lo tanto, cuantas más dianas se tengan en un formato en singleplex, más probabilidades hay de que haya uno o varios controles endógenos adecuados con los que normalizar las demás dianas.



Tenga en cuenta lo siguiente a la hora de elegir entre la PCR en singleplex y la PCR en multiplex para los experimentos de CT comparativos:

PCR Descripción Ventaja Limitación

En singleplex Reacción en la que se amplifica una sola diana o control endógeno en el tubo de reacción o pocillo.

• No es necesario optimizar los ensayos TaqMan®.

• Cualquier diana que no cambie los niveles de expresión con condiciones experimentales o entre muestras puede servir de control endógeno.

• Flexibilidad para utilizar reactivos TaqMan® o SYBR® Green.

• Se requiere una muestra para la diana y para el control endógeno.

En multiplex Reacción en la que se amplifica más de una diana o control endógeno en el tubo de reacción o pocillo.

• Reduce los costes del proceso y la dependencia de la precisión del pipeteo al separar una muestra en dos tubos diferentes.

• El ensayo del control endógeno se debe realizar como un ensayo con cebador limitante.

• Requiere validación y optimización.

• Podría no ser tan efectiva como la PCR en singleplex para analizar un gran número de dianas.

• No se pueden utilizar reactivos SYBR® Green.



Selección del tipo de reactivo

ReactivosTaqMan y

reactivos SYBRGreen

En el sistema StepOne, se pueden realizar experimentos de cuantificación con:


• Reactivos SYBR® Green

Para obtener información acerca de la elección de reactivos TaqMan o reactivos SYBR Green, consulte “Consideraciones sobre los experimentos de cuantificación” en la página 2-6.

Selección del tipo de ensayoPara diseñar experimentos con el software StepOne, puede seleccionar los siguientes tipos de ensayos para los experimentos de cuantificación:

• En inventario/fabricados bajo pedido (página 3-14)• Personalizados (página 3-15)

En esta sección, se enumeran los productos disponibles para cada tipo de ensayo.

Nota: Los ensayos son específicos de la diana de interés. Las mezclas de reacción contienen los demás componentes que son necesarios para la reacción de PCR.



Ensayos eninventario/

fabricados bajopedido


Para conocer las directrices de diseño de experimentos con ensayos en inventario o fabricados bajo pedido, consulte la página 3-18.

Producto Atributos

TaqMan® Gene Expression Assays

• Conjuntos de sondas y cebadores prediseñados y específicos de un gen para genes humanos, de ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (perro) y Rhesus.

• Cómodo formato de un solo tubo disponible en ensayos en inventario o fabricados bajo pedido.

TaqMan® Endogenous Control Assays

Nota: Los TaqMan Endogenous Control Assays están incluidos en los TaqMan Gene Expression Assays en inventario.

• Ensayos de control endógeno optimizados, preformulados y listos para ser usados.

• Cuantificación rentable para la expresión de genes para humanos, ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila y cualquier especie eurocariota.

• Posibilidad de elección de marcaje con fluorocromo FAM™ o VIC® (con cebador limitante).

Custom TaqMan® Gene Expression Assays

• Cualquier especie u organismo.• Elección de la diana.• Cómodo formato de un solo tubo.

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase® UNG)

• Proporciona un rendimiento óptimo para los ensayos TaqMan® que utilizan cDNA o DNA como molde.

• Contiene componentes que garantizan un rendimiento excelente del ensayo.

• El uso de un reactivo para todos los ensayos simplifica el proceso de implementación de los ensayos.

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG

• Proporciona los mismos atributos que se han indicado anteriormente para TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix.

• Permite realizar experimentos de cuantificación en el sistema StepOne™ en aproximadamente 35 minutos.



Ensayospersonalizados


Para conocer las directrices de diseño de experimentos con ensayos personalizados, consulte la página 3-22.

Producto Atributos

Sondas y cebadores TaqMan® personalizados

• Cualquier especie u organismo.• Posibilidad de elección de marcajes de fluorocromos,

apantalladores y escalas de síntesis.• Para uso con el software Primer Express® y las directrices

de diseño de ensayos de Applied Biosystems.

Software Primer Express®

Software que diseña cebadores y sondas para PCR en tiempo real.






• Proporciona los mismos atributos que se han indicado anteriormente para TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix.

• Permite realizar experimentos de cuantificación en el sistema StepOne™ en aproximadamente 35 minutos.

Power SYBR® Green PCR Master Mix

• La gran sensibilidad de la cuantificación permite detectar pocos números de copias (hasta dos copias de un gen diana).

• Detecta DNA de doble cadena, por lo que no se necesitan sondas específicas.

• Contiene AmpliTaq Gold® DNA Polymerase LD altamente purificado para reducir al mínimo la formación de productos no específicos (incluido dímero de cebador).

• Para uso con el software Primer Express® y las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems.

SYBR® Green PCR Master Mix

• Detecta DNA de doble cadena, por lo que no se necesitan sondas específicas.

• Para aplicaciones estándar cuando no se requiere una gran sensibilidad.

• Contiene AmpliTaq Gold® DNA Polymerase para reducir al mínimo la formación de productos no específicos (incluido dímero de cebador).

• Para uso con el software Primer Express® y las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems.



Sección 3.2 Directrices de diseño


Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18

TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20Selección de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21Diseño del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22

Ensayos personalizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-22

Diseño de cebadores y sondas con el software Primer Express® . . . . . . . . 3-23Selección de reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-26Uso de las condiciones de termociclado recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . 3-28Optimización de concentraciones de cebador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-31Optimización de la concentración de sonda . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-35Para obtener más información . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-37



Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido

Flujo de trabajo Si se selecciona el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne™, Applied Biosystems recomienda seguir el flujo de trabajo que se indica a continuación:

1. Seleccione el ensayo:• TaqMan® Gene Expression Assays (más abajo).• Custom TaqMan® Gene Expression Assays (página 3-20).

2. Seleccione la mezcla de reacción (página 3-21).

3. Diseñe el experimento utilizando el software StepOne (página 3-22).


Descripción delproducto

TaqMan® Gene Expression Assays son una colección completa de conjuntos de sondas y cebadores en inventario y fabricados bajo pedido que sirven para realizar experimentos de cuantificación en genes humanos, de ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (perro) y Rhesus.

Cada ensayo está diseñado con un procedimiento de diseño automatizado en el que se ha controlado la calidad. Los ensayos en inventario ya están fabricados y en inventario, mientras que los ensayos fabricados bajo pedido están prediseñados y se fabrican cuando se realiza el pedido.

Propiedades delproducto

Todos los TaqMan Gene Expression Assays:

• Requieren tres componentes:– 1 a 100 ng de muestra de cDNA (obtenido a partir de RNA) por pocillo,

teniendo todos los pocillos la misma cantidad de DNA.– 20✕ de Gene Expression Assay Mix (específica para cada diana). Cada

mezcla de ensayo consta de dos cebadores de PCR no marcados y una sonda MGB (ligando de unión al surco menor) TaqMan® marcada con fluorocromo FAM™ en una mezcla preformulada de 20✕. Las concentraciones finales de 1✕ son de 250 nM para la sonda y de 900 nM para cada cebador.

– TaqMan® Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase® UNG) o TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG.

• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con una mezcla de reacción TaqMan® utilizando condiciones de ciclos térmicos universales.

• Para obtener resultados, sólo se requiere un paso de amplificación de la PCR y una lectura simultánea en tiempo real.

• Cuando sea posible, amplifique el cDNA diana sin amplificar el DNA genómico (sufijo m en el identificador de ensayo) diseñando sondas diseñadas sobre la unión exón-exón.



Ensayosdisponibles

Los TaqMan Gene Expression Assays están disponibles para los genes humanos, de ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (perros) y Rhesus. Los números de referencia son:

• PN 4331182 para los ensayos en inventario• PN 4351372 para los ensayos fabricados bajo pedido

El prefijo del nombre del ensayo indica la especie para la que se ha diseñado el ensayo: Hs para Homo sapiens (humano), Mm para Mus musculus (ratón), Rn para Rattus norvegicus (rata), At para Arabidopsis thaliana, Dm para Drosophila melanogaster, Ce para C. elegans, Cf para C. familiares (perro) y Rh para Rhesus.

El sufijo del nombre del ensayo indica la colocación del ensayo, tal y como se describe en la siguiente tabla.


Los TaqMan® Endogenous Control Assays están incluidos en los TaqMan Gene Expression Assays (PN 4331182) en inventario. Los TaqMan Endogenous Control Assays:

• Están disponibles como un TaqMan Gene Expression Assay con una sonda TaqMan MGB con marcaje con fluorocromo FAM™ en un solo tubo preformulado de 20✕.

• Están disponibles para todas las especies de humano, ratón, y rata, con sondas TaqMan MGB con marcaje con fluorocromo VIC® o FAM™. Los controles endógenos TaqMan con marcajes de fluorocromo VIC tienen los cebadores limitantes.


Sufijo Descripción

_m La sonda del ensayo está diseñada sobre la unión de dos exones; el ensayo no detecta DNA genómico.

_s Los cebadores y las sondas del ensayo están diseñados en un solo exón; el ensayo detecta DNA genómico.

_g Los cebadores y las sondas del ensayo pueden estar en un solo exón; el ensayo puede detectar DNA genómico.

_mH El ensayo se ha diseñado para una transcripción que pertenece a una familia de genes con una homología de secuencias alta. El ensayo ofrece una diferencia de entre 10 CT y 15 CT entre el gen diana y el gen con la homología de secuencias más próxima. Por lo tanto, el ensayo detecta la transcripción de la diana con una discriminación (sensibilidad) entre 1000 y 3000 veces mayor que la transcripción homóloga más próxima, si está presente en el mismo número de copias de una muestra.

_sH

_gH

_u El amplicón del ensayo está diseñada sobre la unión de dos exones y la sonda se asienta por completo en uno de los exones expandidos.




• Para obtener más información acerca de los últimos productos disponibles y los usos específicos de los productos, consulte el sitio web de Applied Biosystems:

http://www.appliedbiosystems.com/

a. En la página de inicio, bajo TaqMan® Products (Productos TaqMan), seleccione TaqMan® Gene Expression Assays.

b. En la página Gene Expression Assays & Arrays (Matrices y ensayos de expresión de genes), bajo Individual Assays (Ensayos individuales), seleccione TaqMan® Gene Expression Assays.

• Para obtener información acerca de Custom TaqMan Endogenous Control Assays, consulte Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note.

• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con TaqMan Gene Expression Assays, consulte TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.



Custom TaqMan® Gene Expression Assays son conjuntos de sondas y cebadores de TaqMan que ha diseñado, sintetizado y formulado el servicio Custom TaqMan® Genomic Assays de acuerdo con la información de secuencia remitida. Los Custom TaqMan Gene Expression Assays le permiten realizar experimentos de cuantificación en cualquier gen o variante de splicing de cualquier organismo.

Los ensayos emplean reactivos TaqMan para amplificar y detectar la diana en muestras de cDNA. Todos los ensayos se han desarrollado utilizando software de diseño de ensayos propio.


Todos los Custom TaqMan Gene Expression Assays:

• Requieren que se cree un archivo de envío (con el software gratuito File Builder) con la secuencia de diana y que dicho archivo se envíe al servicio Custom TaqMan Genomic Assays.


teniendo todos los pocillos la misma cantidad de DNA.– 20✕ de Gene Expression Assay o 60✕ de Gene Expression Assay (específico

para cada diana). Cada ensayo consta de dos cebadores específicos de la diana y una sonda TaqMan MGB con marcaje del fluorocromo FAM™ en una mezcla preformulada de 20✕ o 60✕. Las concentraciones finales de 1✕ son de 250 nM para la sonda y de 900 nM para cada cebador.

– TaqMan® Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase® UNG) o TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG.

• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con una mezcla de reacción TaqMan utilizando condiciones de ciclos térmicos universales.

• Para obtener resultados, sólo se requiere un paso de amplificación de la PCR y una lectura simultánea en tiempo real.








b. En la página Gene Expression Assays & Arrays (Matrices y ensayos de expresión de genes), bajo Individual Assays (Ensayos individuales), seleccione Custom TaqMan® Gene Expression Assays.

• Para obtener información acerca de cómo pedir Custom TaqMan Gene Expression Assays, consulte Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines.

• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con Custom TaqMan Gene Expression Assays, consulte Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.

Selección de la mezcla de reacción

Mezclas dereacción

disponibles

Los ensayos en inventario/fabricados bajo pedido de Applied Biosystems para los experimentos de cuantificación están diseñados para las siguientes mezclas de reacción TaqMan®:


Para obtener más información acerca del uso de reactivos TaqMan, consulte:

• TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol

• TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol

Mezcla de reacción Número de referencia

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG, 250 reacciones

4352042

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 200 reacciones 4304437


Pack de 10, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix 4305719

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG, 200 reacciones

4324018


4326614

Pack de 10, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG

4324020




Diseño del experimento

Uso del softwareStepOne

Para los ensayos en inventario/fabricados bajo pedido de Applied Biosystems, utilice el software StepOne para diseñar sus experimentos de cuantificación. El software StepOne calcula automáticamente volúmenes para:

• Componentes de la mezcla de la reacción• Diluciones de muestras• (Sólo experimentos de curva estándar y curva estándar relativa) Series de

dilución estándar

Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne, vaya a la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) en el flujo de trabajo del asistente de diseño o Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a continuación, seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo).


Para obtener más información acerca del diseño y la realización de experimentos de cuantificación en el sistema StepOne, consulte:

• Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de curva estándar

• Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa

Ensayos personalizados

Flujo de trabajo Si selecciona el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software StepOne™ para realizar un experimento de cuantificación (es decir, si va diseñar sus propios cebadores y sondas), Applied Biosystems recomienda seguir el flujo de trabajo de las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems:

1. Diseñe los cebadores y las sondas con el software Primer Express® (más abajo).

2. Seleccione los reactivos adecuados (página 3-26).


3. Utilice las condiciones de ciclos térmicos recomendadas (página 3-28).



4. Comience con las concentraciones de cebadores y sondas predeterminadas. Si es preciso, optimice las concentraciones de cebador (página 3-31) y las concentraciones de sonda (página 3-35).

¡IMPORTANTE! Estos pasos son un sistema rápido y fiable para diseñar y optimizar los ensayos únicamente si se siguen de principio a fin. Utilice el sistema en su totalidad para lograr los mejores resultados. Para leer una descripción más detallada de las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems, consulte el Apéndice C.

Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software StepOne, vaya a la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) en el flujo de trabajo del asistente de diseño o Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a continuación, seleccione Custom (Personalizado) en el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo).

Diseño de cebadores y sondas con el software Primer Express®

El software Primer Express® utiliza los parámetros recomendados cuando seleccione cebadores y sondas basándose en la secuencia de DNA que se proporciona.

Si va a diseñar su propio ensayo, utilice el resumen de las directrices de diseño de cebadores y sondas para experimentos de cuantificación en la página 3-25. Para leer una explicación más detallada de estas directrices, consulte “Acerca de las directrices de diseño de cebadores y sondas” en la página 3-24.


Nota: Aunque no se necesita una sonda para detectar el fluorocromo SYBR® Green I, sigue siendo conveniente utilizar el software Primer Express cuando seleccione un conjunto de cebadores y sondas a la hora de diseñar un ensayo para reactivos SYBR® Green. Aunque no se utilice ninguna sonda, los cebadores cumplen todos los criterios necesarios; si necesita convertir el ensayo en reactivos TaqMan para obtener una especifidad mayor, encontrará la sonda inmediatamente en el documento original del software Primer Express.

Selección de unemplazamientode amplicones

para los ensayosde cuantificación

La selección de un buen emplazamiento de amplicones garantiza la amplificación de la diana mRNA/cDNA sin coamplificar la secuencia genómica, los pseudogenes y otros genes relacionados. Los reactivos SYBR Green pueden ser útiles para cribar los emplazamientos de amplicones para la expresión de genes.

Directrices

• El amplicón debería expandir uno o varios intrones para evitar la amplificación del gen diana en el DNA genómico.

• La pareja de cebadores debería ser específica al gen diana para evitar la amplificación de los pseudogenes u otros genes relacionados.

• Para diseñar cebadores, utilice las directrices del software Primer Express.• Si no se encuentra ninguna secuencia buena, puede que sea necesario examinar

la secuencia y volver a diseñar el amplicón o simplemente realizar un cribado para encontrar más emplazamientos.



Si el gen que está estudiando no tiene intrones, no es posible diseñar un amplicón que amplifique la secuencia de mRNA sin amplificar la secuencia genómica. En este caso, realice un control de la muestra de RNA en la que no se haya realizado una transcripción reversa (controles RT menos).

Acerca de lasdirectrices de

diseño decebadores y

sondas

Selección de pequeños amplicones

Uno de los parámetros predeterminados más importantes del software Primer Express es la selección de amplicones en el rango de 50 a 150 parejas base. Es preferible utilizar amplicones pequeños porque permiten que la amplificación sea muy eficiente.

Asimismo, los ensayos de alta eficiencia permiten realizar una cuantificación relativa utilizando el método de CT comparativos (∆∆CT) (Livak y Schmittgen, 2001). Este método aumenta el rendimiento de las muestras al eliminar la necesidad de utilizar curvas estándar para observar los niveles de expresión de una diana en relación con una muestra de referencia.

Contenido de G/C

Siempre que sea posible, elija cebadores y sondas de una región que tenga un contenido de G/C del 30 al 80%. Las regiones con un contenido de G/C >80% podrían no desnaturalizarse bien durante el termociclado, lo que se deriva en una reacción menos eficiente. Las secuencias ricas en G/C son susceptibles a sufrir interacciones no específicas que pueden reducir la eficiencia de la reacción y producir señales no específicas en ensayos en los que se utilizan reactivos SYBR Green. Evite las secuencias de cebadores y sondas que contengan procesos de cuatro o más bases G.

Temperatura de desnaturalización

Cuando seleccione cebadores y sondas con la temperatura de desnaturalización (Tm) recomendada, puede utilizar condiciones de ciclos térmicos universales. Applied Biosystems recomienda que la Tm de la sonda sea 10 °C superior a la de los cebadores.

Extremo 5′ de sondas

El software Primer Express no selecciona sondas con una G en el extremo 5′. El efecto apantallador de una base G en esta posición estará presente aún después de la ruptura de la sonda, lo que puede reducir los valores de la fluorescencia (∆Rn) e influir en el rendimiento del ensayo. No se ha demostrado que, el hecho de tener bases G en posiciones próximas al extremo 5′, pero no en él, afecte al rendimiento de los ensayos.



Extremo 3′ de cebadores

Para reducir la posibilidad de que se formen productos no específicos, asegúrese de que las últimas cinco bases del extremo 3′ de los cebadores no contenga más de dos bases C y/o G. En determinadas circunstancias (por ejemplo, en una secuencia de molde rica en G/C), podría ser necesario saltarse esta recomendación para mantener el amplicón a una longitud inferior a 150 pares base. En general, evite que los extremos 3′ de los cebadores sean muy ricos en bases G y/o C.

Resumen de lasdirectrices de

diseño decebadores y

sondas MGB

Directrices de sondas Directrices de cebadores

Primero, seleccione la sonda y, a continuación, diseñe los cebadores de la manera más parecida posible a la sonda sin superponerse a la sonda (se recomiendan encarecidamente amplicones de 50 a 150 pares base).

Mantenga el contenido de G/C en un rango del 30 al 80%.

Evite repeticiones de un nucleótido idéntico, especialmente de guanina, en los que se deberían evitar repeticiones de cuatro o más G.

Si se utiliza el software Primer Express®, la Tm debería ser de 68 a 70 °C.

Si se utiliza el software Primer Express®, la Tm debería ser de 58 a 60 °C.

Sin G en el extremo 5′. Los cinco nucleótidos del extremo 3′ no deberían tener más de 2 bases G y/o C.

Las sondas TaqMan MGB® deberían ser lo más cortas posible, sin llegar a tener menos de 13 nucleótidos.



Selección de reactivos

Hay disponibles muchos reactivos TaqMan y SYBR Green para los experimentos de cuantificación. Los reactivos que se utilicen dependen de la diana:

• DNA o cDNA (más abajo).• RNA con RT-PCR de 1 paso (página 3-27).• RNA con RT-PCR de 2 pasos (página 3-27).

Nota: Si utiliza reactivos SYBR Green, Applied Biosystems recomienda encarecidamente los reactivos Power SYBR Green.

Cuantificación deDNA o cDNA Reactivo Kit Número de

referencia

Reactivos TaqMan®

TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase® UNG, 250 reacciones

4352042

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 200 reacciones

4304437

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, 2000 reacciones

4326708

Pack de 10, TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix

4305719


4324018


4326614


4324020

TaqMan® PCR Core Reagents Kit, 200 reacciones N808-0228


Power SYBR® Green PCR Master Mix (1 mL), 40 reacciones

4368577

Power SYBR® Green PCR Master Mix (5-mL), 200 reacciones

4367659

Power SYBR® Green PCR Master Mix (10 × 5-mL), 2000 reacciones

4368708

Power SYBR® Green PCR Master Mix (50 mL), 2000 reacciones

4367660

SYBR® Green PCR Master Mix (1-mL), 40 reacciones

4344463


4309155


4334973

SYBR® Green PCR Core Reagents, 200 reacciones

4304886



Cuantificación deRNA con RT-PCR

en 1 paso


en 2 pasos

Reactivo Kit Número de referencia

Reactivos TaqMan®

TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit

4309169

TaqMan® EZ RT-PCR Core Reagents

Nota: Utilice TaqMan® EZ RT-PCR Core Reagents cuando se necesite un paso de RT a alta temperatura.

N808-0236


Power SYBR® Green RT-PCR Reagents Kit 4368711

SYBR® Green RT-PCR Reagents 4310179

Reactivo Paso Kit Número de referencia

Reactivos TaqMan®

Sólo paso de PCR

TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix

4304437


4352042

Sólo paso de RT

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

4374966

TaqMan® Reverse Transcription Reagents

N808-234

Pasos RT y PCR

Kit TaqMan® Gold RT PCR N808-232


Sólo paso de PCR

Power SYBR® Green PCR Master Mix

4367659

SYBR® Green PCR Master Mix 4309155

Sólo paso de RT

High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

4374966

TaqMan® Reverse Transcription Reagents

N808-234

Pasos RT y PCR

Power SYBR® Green RT-PCR Reagents Kit

4368711

SYBR® Green RT-PCR Reagents 4310179



Acerca deAmpliTaq Gold

DNA Polymerase

El uso de la enzima activada por calor AmpliTaq Gold® DNA Polymerase es una parte integral de las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems para reactivos TaqMan y SYBR Green. AmpliTaq Gold DNA Polymerase garantiza una reacción robusta y puede reducir enormemente la cantidad de formación de productos no específicos. Otro beneficio adicional es que simplifica la configuración del ensayo, el cual se puede realizar a temperatura ambiental.

Nota: La polimerasa de DNA que se incluye en TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase UNG es activada por calor de modo muy rápido. El rendimiento es similar al de AmpliTaq Gold DNA Polymerase.

Acerca deMultiScribe

ReverseTranscriptase

MultiScribe™ Reverse Transcriptase es una transcriptasa reversa del virus de la leucemia murina de Moloney (MuLV) recombinante que realiza la transcripción reversa del RNA en DNA complementario (cDNA).

Uso de las condiciones de termociclado recomendadas

Utilice las condiciones del termociclado que se recomiendan para la muestra:

• DNA o cDNA (más abajo).• RNA con RT-PCR de 1 paso (página 3-29).• RNA con RT-PCR de 2 pasos (página 3-30).

Nota: Las condiciones del termociclado de los reactivos rápidos son diferentes a las condiciones del termociclado de los reactivos estándar.



Cuantificación deDNA o cDNA

Para TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase UNG, utilice estas condiciones:

Para TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix y Power SYBR Green PCR Master Mix, utilice estas condiciones:


de 1 paso

Para TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit o Power SYBR Green RT-PCR Reagents Kit, utilice estas condiciones:

Nota: Estas condiciones no se aplican a TaqMan EZ RT-PCR Kit. Consulte TaqMan® EZ RT-PCR Kit Protocol para conocer las condiciones adecuadas.

Tiempos y temperaturas

Pasos iniciales PCR (40 ciclos)

Activación de AmpErase® UNG‡

‡ Sólo es necesario si se añade AmpErase® UNG a las reacciones.

Activación Desnaturalización Hibridación/extensión

HOLD (en espera) HOLD (en espera) CICLADO

2 min a 50 °C 20 seg a 95 °C 3 seg a 95 °C 30 seg a 60 °C



Activación de AmpErase® UNG‡

‡ Sólo necesario si se añade AmpErase® UNG a las reacciones o está incluida en la mezcla de reacción.

Activación de AmpliTaq Gold®

DNA PolymeraseDesnaturalización Hibridación/

extensión

HOLD (en espera) HOLD (en espera) CICLADO

2 min a 50 °C 10 min a 95 °C 15 seg a 95 °C 1 min a 60 °C



Transcripción reversa

Activación de AmpliTaq Gold®

DNA PolymeraseDesnaturalización Hibridación/

extensión

HOLD (en espera) HOLD (en espera) 40 CICLOS





de 2 pasos

Para High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, utilice estas condiciones:

¡IMPORTANTE! Para la mayoría de las aplicaciones y cuando se necesitan grandes cantidades de cDNA, Applied Biosystems recomienda 120 minutos a 37 °C para que la transcripción reversa logre la conversión óptima.

Para TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix (con AmpErase UNG) o Power SYBR Green PCR Master Mix, utilice estas condiciones:

Para TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2✕), No AmpErase UNG, utilice estas condiciones:

Paso Tiempos y temperaturas

1. Paso de RT

Paso 1 Paso 2

HOLD (en espera) HOLD (en espera)

10 min a 25 °C 120 min a 37 °C

Después de realizar la transcripción reversa del RNA en cDNA (paso de RT), se pueden guardar muestras o se pueden utilizar para el siguiente paso de la PCR que se describe a continuación.


2. Paso de PCR


Activación de AmpErase®

UNG

Activación de AmpliTaq

Gold® DNA Polymerase

Desnaturali-zación

Hibridación/extensión

HOLD (en espera)

HOLD (en espera)

CICLADO



2. Paso de PCR


Activación de AmpErase®

UNG‡

‡ Sólo es necesario si se añade AmpErase® UNG a las reacciones.

Activación de AmpliTaq

Gold® DNA Polymerase

Desnaturali-zación

Hibridación/extensión

HOLD (en espera)

HOLD (en espera)

CICLADO

2 min a 50 °C 20 seg a 95 °C 3 seg a 95 °C 30 seg a 60 °C



Optimización de concentraciones de cebador

Al cambiar de manera independiente las concentraciones de cebador directo y reverso, se pueden identificar las concentraciones con las que se obtiene el rendimiento óptimo del ensayo. Los cebadores siempre tienen un gran exceso molar durante la fase exponencial de la reacción de amplificación.

A la hora de utilizar TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems recomienda las concentraciones de cebadores que se indican en “Concentraciones de cebador predeterminadas” más abajo. A continuación, se ofrece una explicación detallada de:

• Matriz de optimización del cebador (más abajo)• Reactivos TaqMan (más abajo)• Reactivos SYBR Green (página 3-33)

Concentracionesde cebador

predeterminadas

Las concentraciones de cebador recomendadas que se enumeran en la siguiente tabla son para ensayos de cuantificación de DNA y cDNA.

Matriz deoptimización de

cebadores

La matriz de optimización de cebadores le permite determinar si la concentración mínima de cebador produce el CT mínimo y el ∆Rn máximo.

La matriz de optimización de cebadores puede ayudarle a compensar la unión no específica del cebador, lo que puede reducir la cantidad de cebador disponible para unirse en su emplazamiento específico.

ReactivosTaqMan

Para obtener el rendimiento óptimo en los ensayos de cuantificación en los que se utilizan reactivos TaqMan, hay que seleccionar concentraciones de cebador que proporcionen el CT menor y el ∆Rn mayor para una cantidad fija de molde diana.

Nota: Aunque los valores CT son el parámetro por el cual se asignan valores cuantitativos en los ensayos de cuantificación en tiempo real, los valores ∆Rn también pueden ser importantes para intentar obtener la máxima sensibilidad y reproducibilidad.

Los resultados de un experimento típico de matriz de optimización de cebadores de reactivos TaqMan se muestran en la Figura 3-3 en la página 3-32:

• La Figura 3-3a muestra las gráficas de amplificación de todas las combinaciones de concentraciones de cebadores en una visión lineal.

• La Figura 3-3b muestra los mismos datos en el formato de vista de logaritmos.

ReactivoConcentraciones (nM)

Cebador directo Cebador reverso

Reactivos TaqMan® 900 900

Reactivos SYBR® Green 50 50



La combinación de cebador directo y reverso de 50-nM (grupo C) produce el ∆Rn menor y el CT mayor. Todas las demás concentraciones de cebador que contienen una concentración de 150-nM de cebador directo o reverso (grupo B) producen un ∆Rn reducido. Todas las concentraciones de cebador que contienen al menos 300-nM de cebador directo y reverso (grupo A) producen el ∆Rn mayor y el CT menor; como resultado, cualquier combinación del grupo A o B proporciona un rendimiento óptimo.

Figura 3-3 Resultados del experimento de optimización de cebadores en los que se muestran gráficas de amplificación (visión lineal y algorítmica) de combinaciones de cebadores Clave de grupos:A: Combinaciones que contienen al menos 300 nM de cebador directo y reversoB: Combinaciones que contienen al menos 150 nM de cebador directo y reversoC: Combinaciones que contienen al menos 50 nM de cebador directo y reverso

a) Visión lineal∆R

n

Cycle

} Plot Group A

} Plot Group B

} Plot Group C

b) Visión algorítmica

∆Rn

Cycle

} Plot Group B} Plot Group A

} Plot Group C

Ciclo

Ciclo

Grupo A

Grupo B

Grupo C

Grupo AGrupo B

Grupo C



Reactivos SYBRGreen

La optimización de las concentraciones de cebador es ligeramente más compleja en los ensayos de cuantificación en los que se utilizan reactivos SYBR Green. Se debería utilizar la misma matriz de optimización de cebador que para los reactivos TaqMan; sin embargo, para los reactivos SYBR Green, se deben incluir controles negativos. Las concentraciones de cebador que seleccione deberían producir un CT bajo y un ∆Rn alto cuando se procesan en el molde diana, pero no deberían producir una formación de productos no específicos con controles negativos.

Los análisis de curvas de disociación o gel pueden resultar enormemente útiles cuando seleccione concentraciones de cebador óptimas para los ensayos de cuantificación en los que se utilizan reactivos SYBR Green. La Figura 3-4 en la página 3-34 muestra los resultados de una matriz de optimización de cebadores en concentraciones de cebador directo y reverso de 900-nM:

• La Figura 3-4a muestra una fuerte amplificación de los pocillos de control negativo, lo que indica que se está produciendo una amplificación no específica significativa.

• La Figura 3-4b muestra que la temperatura de desnaturalización del producto generado en ausencia de molde es menor que la temperatura de desnaturalización del producto específico generado con molde, lo que indica que se está produciendo una amplificación no específica importante.

Los resultados que se muestran en la Figura 3-4 son típicos de la formación de un dímero de cebadores. Estos resultados indican que unas concentraciones menores de cebador pueden producir mejores resultados. Asimismo, puede volver a diseñar otro conjunto de cebadores para la diana de interés.



Figura 3-4 Datos de amplificación con reactivos SYBR® Green (a) Gráfica de amplificación (visión lineal) que demuestra una amplificación no específica sospechosa en los pocillos de control negativo (NC). (b) Análisis de curva de disociación que confirma que el producto de los pocillos NC tiene una temperatura de desnaturalización diferente a la del producto específico.

Diana de

Amplificación de diana

NC (amplificación no específica)

NC (amplificación no específica)

a) Gráfica de amplificación, visión lineal

b) Análisis de curva de disociación

Número de ciclo

Temperatura (°C)

Der

ivad

o (f

luor

esce

ncia

br

uta)

amplificación



Optimización de la concentración de sonda

Para la detección por medio de sondas TaqMan®, la concentración de sonda recomendada de 250 nM garantiza un rendimiento excelente del ensayo. Sin embargo, dependiendo de los requisitos del ensayo, podría resultar útil realizar un experimento de optimización de sondas.

Nota: No se requiere ninguna sonda para la detección del fluorocromo SYBR Green I.

Concentracionesde sonda

recomendadas

Las concentraciones de sonda recomendadas para los ensayos de cuantificación de DNA y cDNA en los que se utilizan reactivos TaqMan es de 250 nM. La Figura 3-5 muestra los resultados de un experimento de optimización de sondas en donde la concentración de sonda se cambia de 50 a 250 nM:

• La Figura 3-5a muestra un aumento de ∆Rn a medida que se aumenta la concentración de sonda.

• La Figura 3-5b muestra que el valor CT cambia con la concentración de sonda suficiente.

Para garantizar la mejor reproducibilidad, especialmente si se desean detectar pocas copias de una diana, evite concentraciones de sonda limitantes. Realice el ensayo con una concentración de sonda de 250 nM. Con una concentración de 250-nM, se evita la limitación de sonda y se garantizan valores de ∆Rn altos. Los valores de ∆Rn altos indican que el ensayo es robusto y se está realizando con una gran eficiencia, lo que se deriva en una buena producción de producto y permite medir con precisión los picos.



Figura 3-5 Gráfica de amplificación (visiones lineal y algorítmica) con concentraciones de sonda de 50 a 250 nM

250 nM Probe

150 nM Probe

100 nM Probe

50 nM Probe

∆Rn

Cycle

250 nM Probe150 nM Probe100 nM Probe50 nM Probe

∆Rn

Cycle

a) Visión lineal

b) Visión algorítmica

Número de ciclos

Número de ciclos

Sonda de 250 nM

Sonda de 150 nM

Sonda de 100 nM

Sonda de 50 nM

Sonda de 250 nMSonda de 150 nMSonda de 100 nMSonda de 50 nM



Para obtener más información

Para obtener más información acerca de:

• El uso de reactivos TaqMan, consulte:– TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol

– TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol

• El uso de reactivos SYBR Green, consulte:– Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol

– SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol

– SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol

• La realización de experimentos de cuantificación en el sistema StepOne, consulte:– Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR

System para experimentos de curva estándar

– Guía de introducción a Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de cuantificación relativa

• La realización de experimentos de presencia/ausencia en el sistema StepOne, consulte Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments.


4Experimentos de genotipado 4


Sección 4.1 Acerca de los experimentos de genotipado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-3

Sección 4.2 Directrices de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9



Sección 4.1 Acerca de los experimentos de genotipado


Introducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4




Introducción

¿Qué es unexperimento de

genotipado?

Los experimentos de genotipado son experimentos de punto final que se utilizan para determinar el genotipo de muestras desconocidas. Con este tipo de experimento, se puede diferenciar un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP).

Los experimentos de genotipado determinan si las muestras desconocidas son:

• Homocigotos (muestras que sólo tienen el alelo 1)• Homocigotos (muestras que sólo tienen el alelo 2)• Heterocigotos (muestras que tienen el alelo 1 y el alelo 2)

Componentes

Las reacciones de PCR de los experimentos de genotipado incluyen los siguientes componentes:

• Muestra: la muestra en la que el genotipo es desconocido.

• (Opcional) Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes idénticos.


• (Opcional) Controles positivos: muestras que contienen genotipos conocidos (homocigotos para el alelo 1, homocigotos para el alelo 2 y heterocigotos para los alelos 1 y 2).

Instrumentos Los experimentos de genotipado requieren dos pasos: una reacción de termociclado (amplificación de PCR) seguido por la detección del punto final de las señales fluorescentes resultantes. La reacción de termociclado (amplificación de PCR) se puede realizar en Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System o en un termociclador autónomo.

Si utiliza el sistema StepOne™:

• Puede analizar la PCR, lo que resulta útil para solucionar problemas.• Realice la lectura de la placa de punto final por separado.


experimentos degenotipado

En los experimentos de genotipado, la PCR incluye una sonda marcada con fluorocromo específico para cada alelo. Las sondas contienen diferentes fluorocromos notificadores para diferenciar cada alelo.

En el sistema StepOne, se pueden utilizar sondas de ligando de unión al surco menor (MGB) TaqMan®. Cada sonda TaqMan MGB® contiene:

• Un fluorocromo notificador en el extremo 5′ de cada sonda– Fluorocromo VIC® que está unido al extremo 5′ de la sonda del alelo 1– Fluorocromo FAM™ que está unido al extremo 5′ de la sonda del alelo 2



• Un ligando de unión al surco menor (MGB)Esta modificación aumenta la temperatura de desnaturalización (Tm) de las sondas sin aumentar la longitud de la sonda (Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997), por lo que permite diseñar sondas más cortas. Por consiguiente, las sondas TaqMan MGB tienen mayores diferencias en los valores de Tm entre sondas complementarias y no perfectamente complementarias con la diana. Estas mayores diferencias en los valores de Tm permiten realizar el genotipado con precisión.

• Un apantallador no fluorescente (NFQ) en el extremo 3′ de la sondaDado que el apantallador no emite fluorescencia, los sistemas de PCR en tiempo real pueden medir con más precisión las contribuciones del fluorocromo notificador.

Durante la PCR, cada sonda se hibrida de manera específica para su secuencia complementaria situada entre el cebador directo y reverso. AmpliTaq Gold® DNA Polymerase sólo puede romper sondas que se hibridan con la secuencia del alelo (complementariedad). De esta forma, el fluorocromo notificador se separa del fluorocromo del apantallador, lo que aumenta la fluorescencia del fluorocromo notificador. Por eso, las señales de fluorescencia generadas durante la reacción de amplificación indican qué alelos hay en la muestra.

Faltas de complementariedad entre la sonda y las secuencias de alelos

La falta de complementariedad entre una sonda y un alelo (Figura 4-1) reduce la eficiencia de la hibridación de la sonda. Asimismo, es probable que AmpliTaq Gold DNA Polymerase desplace a la sonda no complementaria en lugar de romperla para liberar el fluorocromo notificador.

Figura 4-1 Resultados de complementariedad y no complementariedad entre secuencias de alelos y sondas en los experimentos de genotipado

Alelo1

Complementariedad

V

Q

No complementariedad

No complementariedad

QV

FQ

Alelo2

Complementariedad

Q

F

Leyenda

AmpliTaqGold DNAPolymerase

Fluorocromo VIC

Fluorocromo FAM

ApantalladorQ

F

V

GR1556



La Tabla 4-1 resume los posibles resultados del experimento de genotipado de ejemplo que se ha mostrado anteriormente.

Flujo de trabajo Antes de realizar experimentos de genotipado en el sistema StepOne, prepare el experimento de la siguiente forma:

1. Seleccione el tipo de ensayo (más abajo).


Selección del tipo de ensayoPara diseñar experimentos con el software StepOne, puede seleccionar los siguientes tipos de ensayos para los experimentos de genotipado:

• Prediseñados/validados (más abajo)• Personalizados (página 4-7)



Nota: Los reactivos rápidos TaqMan® y los reactivos SYBR® Green no se admiten en los experimentos de genotipado.

Tabla 4-1 Resultados del experimento de genotipado

Aumento sustancial de… Indica…

sólo fluorescencia del fluorocromo VIC® homocigosidad del alelo 1.

sólo fluorescencia del fluorocromo FAM™ homocigosidad del alelo 2.

ambas señales fluorescentes heterocigosidad.



Ensayosprediseñados/

validados

Para conocer las directrices de diseño de experimentos con ensayos prediseñados/validados, consulte la página 4-10.



Producto Atributos

TaqMan® SNP Genotyping Assays

• Ensayos prediseñados para una alta densidad elevada de avisos a lo largo de todo el genoma

• Para estudios de cribado, asociación, región candidata, gen candidato y refinamiento.

• Cómodo formato de un solo tubo.

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays

• Detecta polimorfismos en 220 genes que codifican diversas enzimas del metabolismo de fármacos y transportadores de fármacos.

• Para estudiar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), inserciones/eliminaciones (in/dels) y polimorfismos de varios nucleótidos (MNP).

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination

• Genotipado de muestras de DNA purificado para mutaciones específicas; la mayoría de los ensayos discriminan entre dos alelos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP).

• Se añade un ligando de unión al surco menor (MGB) para que el genotipado sea mejor.

• Se ha incluido DNA de control de los alelos 1 y 2 para poder generar cada señal de homocigoto en cada proceso.

• El sistema de tubos cerrados no requiere ninguna manipulación posterior a la PCR ni geles.





Producto Atributos

Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays

• Cualquier polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) posible en cualquier organismo.

• Detecta inserciones/eliminaciones (in/dels) de hasta seis bases.

• Detecta polimorfismos de varios nucleótidos (MNP) de hasta seis bases.

• Cómodo formato de un solo tubo.









Ensayos prediseñados/validados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10

TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-11Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination . . . . 4-12Selección de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-13Diseño del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14


Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-15Selección de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-17Diseño del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-17



Ensayos prediseñados/validados

Flujo de trabajo Si va a diseñar un experimento de genotipado utilizando ensayos prediseñados/validados de Applied Biosystems, Applied Biosystems recomienda seguir el flujo de trabajo que se indica a continuación:

1. Seleccione el ensayo:• TaqMan® SNP Genotyping Assays (más abajo).• TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays (página 4-11).• TaqMan® Pre-Developed Assays Reagents for Allelic Discrimination

(página 4-12).


3. Diseñe el experimento utilizando el software StepOne™ (página 4-14).

TaqMan® SNP Genotyping Assays


TaqMan® SNP Genotyping Assays son una colección completa de conjuntos de cebadores y sondas para realizar el genotipado de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en estudios de humanos.

Los ensayos emplean reactivos TaqMan® para amplificar y detectar alelos de SNP específicos en muestras de DNA genómico purificado. Todos los ensayos se han diseñado con software y procesos bioinformáticos de Applied Biosystems, así como con información genómica de Celera Genomics y bases de datos públicas.


Todos los TaqMan SNP Genotyping Assays:

• Requieren tres componentes:– 1 a 20 ng de muestra de DNA genómico purificado– 20✕, 40✕, o 80 de✕ SNP Genotyping Assay Mix (específica para cada

polimorfismo). Cada ensayo consta de cebadores reversos o directos específicos de la secuencia para amplificar el SNP de interés y dos sondas TaqMan MGB: Una sonda marcada con fluorocromo VIC® detecta la secuencia del alelo 1 y una sonda marcada con el fluorocromo FAM™ detecta la secuencia del alelo 2.

– TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase® UNG)• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con TaqMan 2✕ Universal PCR

Master Mix (con o sin AmpErase UNG), utilizando condiciones de termociclado universales.

• Para obtener resultados, se necesita la reacción de amplificación y una lectura de punto final.



Ensayosdisponibles

Existen dos categorías de TaqMan SNP Genotyping Assays:




a. En la página de inicio, bajo TaqMan® Products (Productos TaqMan), seleccione TaqMan® SNP Genotyping Assays.

b. En la página SNP Genotyping Assays (Ensayos de genotipado SNP), bajo Pre-Designed/Validated Assays (Ensayos prediseñados/validados), seleccione TaqMan® SNP Genotyping Assays.

• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con TaqMan SNP Genotyping Assays, consulte TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol.

TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays


TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays son una colección completa de conjuntos de cebadores y sondas en inventario para el genotipado de SNP, inserciones y eliminaciones (in/dels) y polimorfismos de varios nucleótidos (MNP) en genes relacionados con el metabolismo de fármacos.

Los ensayos emplean reactivos TaqMan para amplificar y detectar polimorfismos específicos en muestras de DNA genómico purificado. Todos los ensayos se han diseñado con software y procesos bioinformáticos de Applied Biosystems, así como con información genómica de bases de datos de SNP públicas y ensamblajes de genomas públicos.


Todos los TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays:

• Requieren tres componentes:– 3 a 30 ng de muestra de DNA genómico purificado

Categoría Descripción

TaqMan® Validated & Coding SNP Genotyping Assays

• Aproximadamente 5000 ensayos de SNP a pequeña escala, de los cuales, unos 2000 son ensayos de SNP codificantes.

• En inventario (es decir, se guardan en inventario para poderlos adquirir ya preparados).

TaqMan® Pre-Designed SNP Genotyping Assays

• Más de 4,5 millones de ensayos SNP prediseñados, incluidos 3,5 millones de ensayos HapMap y unos 68.000 ensayos de SNP codificantes.

• Disponibles a pequeña, media y larga escala.• Fabricados bajo pedido (es decir, fabricados en el

momento de realizar el pedido).




– 20✕ de Drug Metabolism Genotyping Assay Mix (específico para cada polimorfismo). Cada ensayo consta de cebadores reversos o directos específicos de la secuencia para amplificar la secuencia polimórfica de interés y dos sondas TaqMan MGB: Una sonda marcada con fluorocromo VIC detecta la secuencia del alelo 1 y una sonda marcada con el fluorocromo FAM detecta la secuencia del alelo 2.

– TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase® UNG)• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con TaqMan 2✕ Universal PCR







b. En la página SNP Genotyping Assays (Ensayos de genotipado SNP), bajo Pre-Designed/Validated Assays (Ensayos prediseñados/validados), seleccione TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays.

• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con TaqMan SNP Genotyping Assays, consulte TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol.

Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination


Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination (TaqMan® PDARs for AD) son ensayos en inventario optimizados para la discriminación alélica específica.


TaqMan PDARs for AD requieren tres componentes:

• 2 a 20 ng de muestra de DNA genómico purificado.• 10✕ de Allelic Discrimination Assay Mix (específica para cada polimorfismo).

Cada ensayo consta de cebadores reversos o directos específicos de la secuencia para amplificar la secuencia polimórfica de interés y dos sondas TaqMan MGB: Una sonda marcada con fluorocromo VIC detecta la secuencia del alelo 1 y una sonda marcada con el fluorocromo FAM detecta la secuencia del alelo 2.

• TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (con AmpErase® UNG).

Nota: Se ha incluido DNA de control de los alelos 1 y 2 con cada ensayo para poder generar cada señal de homocigoto en cada proceso.








b. En la página SNP Genotyping Assays (Ensayos de genotipado SNP), bajo Pre-Designed/Validated Assays (Ensayos prediseñados/validados), seleccione TaqMan® Pre-Developed Assay Reagents for Allelic Discrimination (TaqMan® PDARs for AD).

• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR utilizando TaqMan PDARs for Allelic Discrimination, consulte Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol.


Mezclas dereacción

disponibles

Los ensayos prediseñados/validados de Applied Biosystems para experimentos de genotipado están diseñados para las siguientes mezclas de reacción TaqMan®:

• TaqMan PDARs for AD contienen TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (con AmpErase® UNG).

• Se pueden utilizar TaqMan SNP Genotyping Assays y Custom TaqMan SNP Genotyping Assays con:

Nota: No se pueden realizar experimentos de genotipado con TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix.


Para obtener información acerca del uso de mezclas de reacción TaqMan, consulte TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol.






4324018


4326614


4324020






Para los ensayos prediseñados/validados de Applied Biosystems, utilice el software StepOne para diseñar sus experimentos de genotipado. El software StepOne calcula automáticamente volúmenes para:

• Componentes de la mezcla de la reacción• Diluciones de muestras



Para obtener información acerca del diseño y la realización de experimentos de genotipado en el sistema StepOne, consulte la Guía de introducción de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de genotipado.




Flujo de trabajo Si va a diseñar un experimento de genotipado utilizando ensayos personalizados de Applied Biosystems, Applied Biosystems recomienda seguir el flujo de trabajo que se indica a continuación:

1. Solicite el ensayo: Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays (más abajo).



Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays


Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays son conjuntos de sondas y cebadores TaqMan que ha diseñado, sintetizado y formulado el servicio Custom TaqMan® Genomic Assays en función de la información de secuencia remitida. Los Custom TaqMan SNP Genotyping Assays le permiten:

Los ensayos emplean reactivos TaqMan para amplificar y detectar polimorfismos específicos en muestras de DNA genómico purificado (gDNA). Todos los ensayos se han desarrollado utilizando software de diseño de ensayos propio.


Todos los Custom TaqMan SNP Genotyping Assays:

• Requieren que se cree un archivo de envío (con el software gratuito File Builder) con la secuencia de SNP de diana y que dicho archivo se envíe al servicio Custom TaqMan® Genomic Assays.

• Requieren tres componentes:– 1 a 20 ng de muestra de gDNA purificado por pocillo.

Nota: Puede utilizar muestras de cDNA, sin embargo, actualmente Applied Biosystems no ofrece recomendaciones para utilizar cDNA con Custom TaqMan SNP Genotyping Assays.

Acción Ejemplo

Realizar estudios de genotipado con cualquier polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) posible en cualquier organismo

AGTTCATCCATGGTCA --> AGTTCATACATGGTCA

Anotado como: AGTTCAT[C/A]CATGGTCA

Detectar inserciones/eliminaciones (in/dels) de hasta seis bases para los estudios de genotipado.

AGTTCATCCATGGTCA --> AGTTCATGGTCA

Anotado como: AGTTCAT[CCAT/*]GGTCA

Detectar polimorfismos de varios nucleótidos (MNP) de hasta seis bases para los estudios de genotipado.

AGTTCATCCGGTCA --> AGTTCATATGGTCA

Anotado como: AGTTCAT[CC/AT]GGTCA



– 40✕ de SNP Genotyping Assay o 80✕ de SNP Genotyping Assay (específicos para cada polimorfismo). Cada ensayo consta de cebadores reversos o directos específicos de la secuencia para amplificar el SNP de interés y dos sondas TaqMan MGB: Una sonda marcada con fluorocromo VIC detecta la secuencia del alelo 1 y una sonda marcada con el fluorocromo FAM detecta la secuencia del alelo 2.

– TaqMan® Universal PCR Master Mix (con o sin AmpErase® UNG).• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con TaqMan Universal PCR







b. En la página SNP Genotyping Assays (Ensayos de genotipado SNP), bajo Custom Assays (Ensayos personalizados), seleccione TaqMan® SNP Genotyping Assays.

• Para obtener información acerca de cómo pedir Custom TaqMan SNP Genotyping Assays, consulte Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines.

• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con Custom TaqMan SNP Genotyping Assays, consulte Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol.





Mezclas dereacción

disponibles

Los ensayos fabricados bajo pedido de Applied Biosystems para experimentos de genotipado están diseñados para las siguientes mezclas de reacción TaqMan:

Nota: No se pueden realizar experimentos de genotipado con TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix.


Para obtener información acerca del uso de mezclas de reacción TaqMan, consulte TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol.



Para los ensayos personalizados de Applied Biosystems, utilice el software StepOne para diseñar los experimentos de genotipado. El software StepOne calcula automáticamente volúmenes para:

• Componentes de la mezcla de la reacción• Diluciones de muestras



Para obtener información acerca del diseño y la realización de experimentos de genotipado en el sistema StepOne, consulte la Guía de introducción de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para experimentos de genotipado.






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5Experimentos de presencia/ausencia5


Sección 5.1 Acerca de los experimentos de presencia/ausencia . . . . . . . . . . . . . . . 5-3

Sección 5.2 Directrices de diseño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9



Sección 5.1 Acerca de los experimentos de presencia/ausencia


Introducción. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4




Introducción

¿Qué esun experimento

de presencia/ausencia?

Un experimento de presencia/ausencia es un experimento de punto final que indica la presencia o la ausencia de una secuencia de ácido nucléico específica (diana) en una muestra. No se determina la cantidad real de diana.

Los experimentos de presencia/ausencia se suelen utilizar para detectar la presencia o la ausencia de un patógeno (por ejemplo, un patógeno vírico o bacteriano). Por ejemplo, un experimento de presencia/ausencia puede servir para determinar si la bacteria Salmonella está presente en la carne de una hamburguesa. Los resultados muestran si la bacteria Salmonella está presente o no; no se determina la cantidad de bacterias.

Componentes

Las reacciones de PCR de los experimentos de presencia/ausencia incluyen los siguientes componentes:

• Muestra: la muestra en la que la presencia de una diana es desconocida.• Réplicas: reacciones idénticas que contienen componentes y volúmenes

idénticos. • Control positivo interno (IPC): molde de DNA sintético corto que se añade a

las reacciones de PCR. Se puede utilizar el IPC para distinguir los resultados falsos negativos en las reacciones afectadas por los apantalladores de PCR, una configuración incorrecta del ensayo o un fallo del reactivo o del instrumento.

• Pocillos de control negativo-IPC bloqueado: pocillos que contienen un inhibidor de IPC en lugar de muestra en la reacción de PCR. No se debería producir ninguna amplificación en los pocillos de control negativo-IPC bloqueado, porque la reacción no contiene ninguna muestra y la amplificación del IPC está bloqueada.

• Pocillos de control negativo-IPC: pocillos que contienen un molde de IPC y tampón o agua en lugar de muestra en la reacción de PCR. El molde de IPC es lo único que se debería amplificar en los pocillos de control negativo- IPC, porque la reacción no contiene ninguna muestra.

Nota: Los experimentos de presencia/ausencia se pueden realizar sin IPC; sin embargo, el IPC garantiza que una PCR fallida no se tome por error por un resultado negativo en la prueba.

Detección delpunto final y

lectura de placasposterior a la

PCR

Los experimentos de presencia/ausencia son experimentos de punto final, en los que se recogen datos de fluorescencia después de completarse la PCR.

Para ayudar a solucionar los problemas de los experimentos de presencia/ausencia, puede utilizar Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System para realizar una PCR en tiempo real. Si utiliza el sistema StepOne™ para la reacción de amplificación, realice los procesos de lectura previa y posterior a la PCR por separado.




experimentos depresencia/

ausencia

Durante la PCR, las sondas fluorogénicas se hibridan de manera específica con la diana complementaria entre los emplazamientos de ambos iniciadores en el DNA molde. Luego, durante la extensión, AmpliTaq Gold® DNA Polymerase separa las sondas hibridadas de cada muestra que contiene la diana. La ruptura de cada sonda complementaria separa el fluorocromo notificador del fluorocromo del apantallador, lo que aumenta la fluorescencia del notificador.

Después la reacción de termociclado, el instrumento StepOne™ lee la fluorescencia generada durante la reacción de amplificación. Las señales fluorescentes se utilizan para determinar la presencia o la ausencia de la diana en cada muestra. Las señales del notificador se normalizan con respecto a la emisión de una referencia pasiva, de la siguiente manera:

Incorporación de un IPC

Un IPC es un segundo conjunto de sondas y cebadores TaqMan® que se añade a la placa de reacción para detectar un ácido nucléico presente constitutivamente con bajo número de copias. El IPC y la diana se amplifican simultáneamente en el mismo pocillo de reacción. Si un pocillo no tiene amplificación, el software StepOne™ utiliza la señal positiva del IPC para confirmar que el pocillo no se ha amplificado por falta de un molde diana, y no por un error de pipeteo o inhibición.


Flujo de trabajo Antes de realizar experimentos de presencia/ausencia en el sistema StepOne, prepare el experimento de la siguiente forma:

1. Seleccione el tipo de ensayo (más abajo).


Rn (TT) = Intensidad de emisión de secuencia de molde diana

Intensidad de emisión de referencia pasiva

Rn (IPC) = Intensidad de emisión de control positivo interno

Intensidad de emisión de referencia pasiva



Selección del tipo de ensayoPara diseñar experimentos con el software StepOne, puede seleccionar los siguientes tipos de ensayos para los experimentos de presencia/ausencia:

• En inventario/fabricados bajo pedido (página 5-6)• Personalizados (página 5-7)



Nota: Los reactivos rápidos TaqMan® y los reactivos SYBR® Green no se admiten en los experimentos de presencia/ausencia.

Ensayos eninventario/fabrica

dos bajo pedido


Para conocer las directrices de diseño de experimentos con ensayos en inventario o fabricados bajo pedido, consulte la página 5-10.

Producto Atributos


• Conjuntos de sondas y cebadores prediseñados y específicos de un gen para genes humanos, de ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (perro) y Rhesus.

• Cómodo formato de un solo tubo disponible en ensayos en inventario o fabricados bajo pedido.


Nota: Los TaqMan Endogenous Control Assays están incluidos en los TaqMan Gene Expression Assays en inventario.

• Ensayos de control endógeno optimizados, preformulados y listos para ser usados.

• Cuantificación de expresión de genes económica para humanos, ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila y cualquier especie eurocariota.

• Posibilidad de elección de marcaje con fluorocromo FAM™ o VIC® (con cebador limitante).


• Cualquier especie u organismo.• Elección de la diana.• Cómodo formato de un solo tubo.










Producto Atributos

Sondas y cebadores TaqMan® personalizados

• Cualquier especie u organismo.• Posibilidad de elección de marcajes de fluorocromos,

apantalladores y escalas de síntesis.• Para uso con el software Primer Express® y las directrices

de diseño de ensayos de Applied Biosystems.

Software Primer Express®

Software que diseña cebadores y sondas para PCR en tiempo real.









Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10

TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents . . . . . . . . . . . . . . 5-13Selección de la mezcla de reacción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-14Diseño del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15




Ensayos en inventario/fabricados bajo pedido

Flujo de trabajo Si se selecciona el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne™, Applied Biosystems recomienda seguir el flujo de trabajo que se indica a continuación:

1. Seleccione el ensayo:• TaqMan® Gene Expression Assays (más abajo).• Custom TaqMan® Gene Expression Assays (página 5-12).

2. Utilice TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents (página 5-13).






TaqMan® Gene Expression Assays son una colección completa de conjuntos de sondas y cebadores en inventario y fabricados bajo pedido que sirven para realizar experimentos de presencia/ausencia en genes humanos, de ratón, rata, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (perro) y Rhesus.

Cada ensayo está diseñado con un procedimiento de diseño automatizado en el que se ha controlado la calidad. Los ensayos en inventario ya están fabricados y en inventario, mientras que los ensayos fabricados bajo pedido están prediseñados y se fabrican cuando se realiza el pedido.


Todos los TaqMan Gene Expression Assays:


teniendo todos los pocillos la misma cantidad de DNA.– 20✕ de Gene Expression Assay Mix (específica para cada diana). Cada

mezcla de ensayo consta de dos cebadores de PCR no marcados y una sonda MGB (ligando de unión al surco menor) TaqMan® marcada con fluorocromo FAM™ en una mezcla preformulada de 20✕. Las concentraciones finales de 1✕ son de 250 nM para la sonda y de 900 nM para cada cebador.



• Cuando sea posible, amplifique el cDNA diana sin amplificar el DNA genómico (sufijo m en el identificador de ensayo) diseñando sondas diseñadas sobre la unión exón-exón.



Ensayosdisponibles

Los TaqMan Gene Expression Assays están disponibles para los genes humanos, de ratones, ratas, Arabidopsis, Drosophila, C. elegans, C. familiares (perros) y Rhesus. Los números de referencia son:

• PN 4331182 para los ensayos en inventario• PN 4351372 para los ensayos fabricados bajo pedido

El prefijo del nombre del ensayo indica la especie para la que se ha diseñado el ensayo: Hs para Homo sapiens (humano), Mm para Mus musculus (ratón), Rn para Rattus norvegicus (rata), At para Arabidopsis thaliana, Dm para Drosophila melanogaster, Ce para C. elegans, Cf para C. familiares (perro) y Rh para Rhesus.

El sufijo del nombre del ensayo indica la colocación del ensayo, tal y como se describe en la siguiente tabla.


Los TaqMan® Endogenous Control Assays están incluidos en los TaqMan Gene Expression Assays (PN 4331182) en inventario. Los TaqMan Endogenous Control Assays:

• Están disponibles como un TaqMan Gene Expression Assay con una sonda TaqMan MGB con marcaje con fluorocromo FAM™ en un solo tubo preformulado de 20✕.

• Están disponibles para todas las especies de humano, ratón, y rata, con sondas TaqMan MGB con marcaje con fluorocromo VIC® o FAM™. Los controles endógenos TaqMan con marcajes de fluorocromo VIC tienen los cebadores limitantes.


Sufijo Descripción

_m La sonda del ensayo está diseñada sobre la unión de dos exones; el ensayo no detecta DNA genómico.

_s Los cebadores y las sondas del ensayo están diseñados en un solo exón; el ensayo detecta DNA genómico.

_g Los cebadores y las sondas del ensayo pueden estar en un solo exón; el ensayo puede detectar DNA genómico.

_mH El ensayo se ha diseñado para una transcripción que pertenece a una familia de genes con una homología de secuencias alta. El ensayo ofrece una diferencia de entre 10 CT y 15 CT entre el gen diana y el gen con la homología de secuencias más próxima. Por lo tanto, el ensayo detecta la transcripción de la diana con una discriminación (sensibilidad) entre 1000 y 3000 veces mayor que la transcripción homóloga más próxima, si está presente en el mismo número de copias de una muestra.

_sH

_gH

_u El amplicón del ensayo está diseñada sobre la unión de dos exones y la sonda se asienta por completo en uno de los exones expandidos.







b. En la página Gene Expression Assays & Arrays (Matrices y ensayos de expresión de genes), bajo Individual Assays (Ensayos individuales), seleccione TaqMan® Gene Expression Assays.

• Para obtener información acerca de Custom TaqMan Endogenous Control Assays, consulte Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental Studies Application Note.

• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con TaqMan Gene Expression Assays, consulte TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.



Custom TaqMan® Gene Expression Assays son conjuntos de sondas y cebadores de TaqMan que ha diseñado, sintetizado y formulado el servicio Custom TaqMan® Genomic Assays de acuerdo con la información de secuencia remitida. Los Custom TaqMan Gene Expression Assays le permiten realizar experimentos de presencia/ausencia en cualquier gen o variante de splicing de cualquier organismo.

Los ensayos emplean reactivos TaqMan para amplificar y detectar la diana en muestras de cDNA. Todos los ensayos se han desarrollado utilizando software de diseño de ensayos propio.


Todos los Custom TaqMan Gene Expression Assays:

• Requieren que se cree un archivo de envío (con el software gratuito File Builder) con la secuencia de diana y que dicho archivo se envíe al servicio Custom TaqMan Genomic Assays.


teniendo todos los pocillos la misma cantidad de DNA.– 20✕ de Gene Expression Assay o 60✕ de Gene Expression Assay (específico

para cada diana). Cada ensayo consta de dos cebadores específicos de la diana y una sonda TaqMan MGB con marcaje del fluorocromo FAM™ en una mezcla preformulada de 20✕ o 60✕. Las concentraciones finales de 1✕ son de 250 nM para la sonda y de 900 nM para cada cebador.










b. En la página Gene Expression Assays & Arrays (Matrices y ensayos de expresión de genes), bajo Individual Assays (Ensayos individuales), seleccione Custom TaqMan® Gene Expression Assays.

• Para obtener información acerca de cómo pedir Custom TaqMan Gene Expression Assays, consulte Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines.

• Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con Custom TaqMan Gene Expression Assays, consulte Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol.

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents


Los Applied Biosystems TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents contienen:

• Un control positivo interno (IPC) con cebadores y sonda prediseñados• Molde de DNA de IPC• Control de bloqueo del IPC

Los reactivos están diseñados para:

• Distinguir tipos de resultados negativos:– Una llamada negativa para la diana y una positiva para el IPC indica que no

hay ninguna diana.– Una llamada negativa para la diana y una llamada negativa para el IPC

sugieren una inhibición de la PCR.• Evitar la amplificación de los controles endógenos.• Permitir la coamplificación del IPC y la diana sin comprometer la amplificación

de la diana.• Detectar el IPC con una sonda marcada con fluorocromo VIC®.• Detectar la diana con una sonda marcada con fluorocromo FAM™.


Los kits TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents:

• Requieren los siguientes componentes:– Muestra de DNA– Ensayo TaqMan para la diana de interés– TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix

• Están diseñadas y optimizadas para funcionar con TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix utilizando condiciones de termociclado universales.




Kits disponibles Applied Biosystems dispone de los siguientes kits de TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents:


Para obtener información acerca de la preparación de reacciones de PCR con TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents, consulte TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol.


Mezclas dereacción

disponibles

Los ensayos en inventario/fabricados bajo pedido de Applied Biosystems para experimentos de presencia/ausencia están diseñados para las siguientes mezclas de reacción TaqMan®:

Nota: Si adquiere TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents con el kit TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (PN 4308320), no es necesario que adquiera la mezcla de reacción por separado.

Nota: No se pueden realizar experimentos de presencia/ausencia con TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix.

Kits Número de referencia

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents con TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (con fluorocromo VIC®)

4308320

TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents

Nota: Si utiliza este kit, deberá adquirir uno de los siguientes reactivos TaqMan® por separado:

• TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (PN 4304437)• TaqMan® PCR Core Reagents Kit (PN N808-0228)

4308323






4324018


4326614


4324020

TaqMan® PCR Core Reagents Kit N808-0228




Para obtener información acerca del uso de reactivos TaqMan, consulte TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol.



Para los ensayos en inventario/fabricados bajo pedido de Applied Biosystems, utilice el software StepOne para diseñar sus experimentos de presencia/ausencia. El software StepOne calcula automáticamente volúmenes para:

• Componentes de la mezcla de la reacción• Controles y muestras• Diluciones de muestras

Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el software StepOne, vaya a la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) en el flujo de trabajo del asistente de diseño o Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a continuación, seleccione Inventoried/Made to Order (En inventario/fabricado bajo pedido) en el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo).


Para obtener información acerca del diseño y la realización de experimentos de presencia/ausencia en el sistema StepOne, consulte Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Getting Started Guide for Presence/Absence Experiments.


Flujo de trabajo Si selecciona el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software StepOne™ para realizar un experimento de presencia/ausencia (es decir, si va diseñar sus propios cebadores y sondas), Applied Biosystems recomienda seguir el flujo de trabajo de las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems:

1. Diseñe los cebadores y las sondas con el software Primer Express® (página 3-23).

2. Seleccione los reactivos adecuados (página 3-26).


Nota: Los reactivos rápidos TaqMan® y los reactivos SYBR® Green no se admiten en los experimentos de presencia/ausencia.

3. Utilice las condiciones de ciclos térmicos recomendadas (página 3-28).



4. Comience con las concentraciones de cebadores y sondas predeterminadas. Si es preciso, optimice las concentraciones de cebador (página 3-31) y las concentraciones de sonda (página 3-35).

¡IMPORTANTE! Estos pasos son un sistema rápido y fiable para diseñar y optimizar los ensayos únicamente si se siguen de principio a fin. Utilice el sistema en su totalidad para lograr los mejores resultados. Para leer una descripción más detallada de las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems, consulte el Apéndice C.

Nota: Cuando seleccione el tipo de ensayo Custom (Personalizado) en el software StepOne, vaya a la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción) en el flujo de trabajo del asistente de diseño o Advanced Setup (Configuración avanzada) y, a continuación, seleccione Custom (Personalizado) en el menú desplegable Assay Type (Tipo de ensayo).

A-1Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

AFórmula A

Fórmula para experimentos de CT comparativos (∆∆CT)

Fórmula La cantidad de diana, normalizada para un control endógeno y relativa a una muestra de referencia, se calcula mediante:

2–∆∆CT

Derivación de lafórmula

La ecuación que describe la amplificación exponencial de la PCR es:

donde:

• xn = número de moléculas de diana en el ciclo n• xo = número inicial de moléculas de diana• Ex = eficiencia de la amplificación de la diana• n = número de ciclos• Xo =número inicial de moléculas de diana

El ciclo umbral (CT) indica el número de ciclo fraccional en el cual la cantidad de diana amplificada alcanza un umbral específico. De esta forma,

donde:

• xT = número umbral de moléculas de diana• CT, X = ciclo umbral para la amplificación de diana• KX = constante

Una ecuación similar para la reacción del control endógeno es:

donde:

• RT = número umbral de moléculas de referencia• Ro = número inicial de moléculas de referencia• ER = eficiencia de la amplificación de la referencia• CT, R = ciclo umbral para la amplificación de la referencia• KR = constante

Xn Xo 1( EX )+× n=

XT Xo 1( EX )+× CT X, KX= =

RT Ro 1( ER )+× CT R, KR= =

A-2 Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Apéndice A Fórmula

Si se divide XT entre RT, se obtiene la siguiente expresión:

Los valores exactos de XT y RT dependen de una serie de factores, incluidos:

• Fluorocromo notificador utilizado en la sonda• Efectos del contexto de la secuencia en las propiedades de fluorescencia de la

sonda• Eficiencia de la ruptura de la sonda• Pureza de la sonda• Ajuste del umbral de fluorescencia

Por lo tanto, la constante K no tiene que ser igual a 1.

Suponiendo que las eficiencias de la diana y la referencia sean las mismas:

EX = ER = E

O

donde:

• XN = XO/RO, la cantidad normalizada de diana• ∆CT = CT, X – CT, R, la diferencia en ciclos umbral de la diana y la referencia

Al reorganizar, se obtiene la siguiente expresión:

El último paso es dividir XN de cualquier muestra (q) por XN de la muestra de referencia (cb):

XTRT------

Xo 1( EX )CT X,+×

Ro 1( ER )CT R,+×

---------------------------------------- KXKR------ K===

XoRo----- 1( E ) K=

CT X, C– T R,+×

XN 1( E )CT∆

+× K=

XN K 1 E+( )CT∆–

×=

XN q,

XN cb,------------ K 1( E )

CT q,∆–+×

K 1( E )CT cb,∆–

+×------------------------------------------ 1(= E )

CT∆∆–+= =

A-3Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System


donde:

• ∆∆CT = ∆CT, q – ∆CT, cb

Para los amplicones diseñados y optimizados de acuerdo con las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems (tamaño de amplicón <150 bp), la eficiencia se aproxima a 1. Por lo tanto, la cantidad de diana, normalizada para un control endógeno y relativa a una muestra de referencia, se obtiene mediante:

2–∆∆CT

A-4 Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System


B-1Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

BLimitación del cebador en la PCR en multiplex B

Para generar un ensayo en multiplex preciso, es importante que la amplificación de una especie no domine a la otra. De lo contrario, la amplificación de una especie muy abundante puede impedir que la especie menos abundante se amplifique eficientemente. Si la especie menos abundante no se amplifica eficientemente, el experimento puede dar lugar a resultados imprecisos. O, en los casos más graves, se puede inhibir por completo la detección de la especie menos abundante. Para evitar este problema, limite las concentraciones de los cebadores que se utilizan para amplificar la especie más abundante, de manera que la amplificación se “desactive” poco después de establecer el CT.

La limitación del cebador hace que los componentes de la reacción comunes a ambos ensayos no se agoten, lo que permite que la amplificación de la especie menos abundante se realice con una gran eficiencia. Si no se conoce cuál es la especie más abundante, debería determinarla antes de realizar la PCR en multiplex procesando ambas dianas en tubos separados. Las dos amplificaciones deberían tener el cebador limitante si ninguna de las especies abunda más que la otra.

Consideración dela abundancia

relativa de ladiana y lareferencia

Hay que tener en cuenta la abundancia relativa del gen diana y del control endógeno al limitar la cantidad de cebadores de estas dos especies a amplificar, hay que tener en cuenta la abundancia relativa de las dos especies. Para los experimentos de cuantificación, es posible utilizar rRNA como control endógeno. La concentración de rRNA en el RNA total siempre es mayor que la concentración de cualquier mRNA de diana. Por lo tanto, en las reacciones en multiplex en las que se amplifica la diana y el rRNA, sólo hay que limitar las concentraciones de los cebadores del rRNA.

B-2 Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System


Limitación de lamatriz de los

cebadores

Para definir concentraciones de cebador limitante, procese una matriz de concentraciones de cebador reverso y directo utilizando el valor de molde mínimo. El objetivo es identificar las concentraciones de cebador que reducen el valor ∆Rn del ensayo sin afectar al valor CT. La siguiente tabla ilustra una matriz recomendada de cebadores directos y reversos cuya concentración varía entre 20 y 100 nM.

Nota: Aunque si se siguen todos los criterios de diseño, es más fácil identificar concentraciones de cebador limitante, puede que no sea posible para todos los ensayos. Si un experimento de matriz de cebador limitante no permite identificar las concentraciones de cebador limitante, será necesario volver a diseñar al menos un cebador o procesar las reacciones en tubos diferentes.

Ejemplo Los resultados de un experimento de matriz de cebador limitante se muestran en la Figura B-1 en la página B-3:

• La Figura B-1a muestra que sólo cuando las concentraciones de cebador se reducen por debajo de aproximadamente 50 nM, el valor CT sufre efectos importantes. El área llana muestra la región en la que se encuentran las concentraciones de cebador limitante adecuadas. En esta área, el CT (y, por lo tanto, el valor de cuantificación correspondiente) no cambia, mientras que el valor ∆Rn y el producto resultante correspondiente se reducen significativamente.

• La Figura B-1b muestra la relación correspondiente entre las concentraciones de cebador y ∆Rn. La figura demuestra que se puede lograr menos producto disminuyendo las concentraciones de cebador directo y reverso.

En este ejemplo, la selección apropiada de concentraciones de cebador limitante serían al menos de 50 nM de cebador directo y reverso. La concentración de sonda se debería mantener a un nivel óptimo cuando el cebador esté en cantidades limitantes para garantizar que la señal producida sea lo suficientemente grande para que el software realice un análisis preciso de multicomponente.

Directo:Reverso:

100 nM100 nM

100 nM80 nM

100 nM60 nM

100 nM40 nM

100 nM20 nM

Directo:Reverso:

80 nM100 nM

80 nM80 nM

80 nM60 nM

80 nM40 nM

80 nM20 nM

Directo:Reverso:

60 nM100 nM

60 nM80 nM

60 nM60 nM

60 nM40 nM

60 nM20 nM

Directo:Reverso:

40 nM100 nM

40 nM80 nM

40 nM60 nM

40 nM40 nM

40 nM20 nM

Directo:Reverso:

20 nM100 nM

20 nM80 nM

20 nM60 nM

20 nM40 nM

20 nM20 nM

B-3Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System


Figura B-1 Resultados del experimento de la matriz de cebador limitante (a) Muestra cómo al valor CT le afecta la variación de concentraciones de cebador directo y reverso. La región llana indicada muestra el área en la que el valor CT permanece constante. (b) Muestra una reducción de los valores a medida que la concentración de cebador disminuye.

∆Rn

B-4 Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System


C-1Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

CDirectrices de diseño de ensayos C

Acerca de lasdirectrices de

diseño deensayos

Si va diseñar sus propios ensayos (cebadores y sondas), Applied Biosystems recomienda seguir las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems. Las directrices de diseño de ensayos especifican que:

1. Los cebadores y las sondas se deben diseñar con el software Primer Express®: el software Primer Express utiliza un conjunto de parámetros predeterminados cuando seleccione automáticamente conjuntos de cebadores y sondas.

2. Se deben seleccionar los reactivos apropiados: hay disponibles muchos reactivos TaqMan® y SYBR® Green. Los reactivos que se utilizan dependen del tipo de ensayo.

3. Se deben utilizar las condiciones de termociclado recomendadas: utilice las condiciones de termociclado recomendadas para la muestra (DNA/cDNA, RNA para PCR de 1 paso y RNA para PCR de 2 pasos).

Nota: Las condiciones del termociclado de los reactivos rápidos son diferentes a las condiciones del termociclado de los reactivos estándar.

4. Se deben utilizar las concentraciones de cebadores y sondas predeterminadas u optimizar dichas concentraciones: si sigue las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems, puede utilizar las concentraciones de cebadores y sondas predeterminadas para ensayos no en multiplex y optimizados, o bien puede optimizar dichas concentraciones.

¡IMPORTANTE! Estos pasos son un sistema rápido y fiable para diseñar y optimizar los ensayos únicamente si se siguen de principio a fin. Utilice el sistema en su totalidad para lograr los mejores resultados.

Nota: Las directrices de diseño de ensayos de Applied Biosystems no garantizan el mismo nivel de rendimiento y sensibilidad en todos los ensayos. Incluso los parámetros de diseño más escrupulosos son incapaces de tener en cuenta todas las variaciones posibles entre dos sistemas de ensayo diferentes.

Conclusiones delos experimentosde cuantificación

En general, se pueden extraer las siguientes conclusiones a la hora de utilizar las directrices de diseño de ensayos para los experimentos de cuantificación:

• Para la mayoría de los ensayos TaqMan, una concentración de cebadores de 900-nM y de sondas de 250-nM produce un ensayo altamente reproducible y sensible si se utiliza DNA o cDNA como molde.

• Dada la naturaleza no específica de su detección, la optimización del cebador de fluorocromo SYBR® Green I sólo se debería omitir con precaución. Sin embargo, si se siguen todas las directrices, las concentraciones de 50-nM de cebadores directos y reversos suelen proporcionar una amplificación robusta con un buen nivel de especifidad cuando se utiliza DNA o cDNA como molde. Para verificar esta afirmación, compruebe si se forma un producto no específico con un análisis de curva de disociación o de gel.

C-2 Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Apéndice C Directrices de diseño de ensayos

• La mayoría de los ensayos TaqMan deberían permitir detectar y cuantificar con precisión hasta <50 copias de una diana, con la mayor sensibilidad posible.

• Los ensayos SYBR Green son capaces de ofrecer un rendimiento similar; sin embargo, la formación de productos no específicos puede aumentar el límite de detección mínimo.

Conclusionesde los

experimentos degenotipado

En general, se pueden extraer las siguientes conclusiones a la hora de utilizar las directrices de diseño de ensayos para los experimentos de genotipado:

Se puede utilizar 900-nM de cebadores, una sonda de 200-nM y entre 1 y 20 ng de DNA genómico para lograr unos resultados reproducibles y sensibles en el ensayo.

Bibliography-1Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Bibliografía

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Förster, V. T. 1948. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann. Physics (Leipzig) 2:55–75.

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Kutyavin, I.V., Lukhtanov, E.A., Gamper, H.B., and Meyer, R.B. 1997. Oligonucleotides with conjugated dihydropyrroloindole tripeptides: base composition and backbone effects on hybridization. Nucleic Acids Res. 25:3718–3723.

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Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2–∆∆CT Method. Methods 25:402–408.

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Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230:1350–1354.

Bibliography-2 Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Bibliografía

Glosario-1Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Glosario

AIF Abreviatura de archivo de información de ensayo (Assay Information File).

alelo Para una diana determinada, cualquiera de las variantes de secuencias que se encuentran en la población.

amplicón Segmento de DNA amplificado durante la PCR.

amplificación Etapa del protocolo de termociclado, durante el cual se produce la generación del amplicón. En los experimentos de cuantificación, los datos de fluorescencia recogidos durante la amplificación se muestran en una gráfica de amplificación y se utilizan para calcular los resultados. Si la amplificación está incluida en el proceso del instrumento StepOne™ para experimentos de genotipado o presencia/ausencia, los datos de fluorescencia recogidos durante la amplificación se muestran en una gráfica de amplificación y se pueden utilizar para solucionar problemas.

apantallador Molécula unida al extremo 3′ de las sondas TaqMan® que evita que el notificador emita fluorescencia mientras la sonda está intacta. Con los reactivos TaqMan®, se puede utilizar un apantallador no fluorescente ligando de surco menor (NFQ-MGB) como apantallador. Con reactivos SYBR® Green, no se utiliza ningún apantallador.

¡IMPORTANTE! Applied Biosystems no recomienda el uso del fluorocromo TAMRA™ como notificador o apantallador con el sistema StepOne™.

apantallador no fluorescente-ligando de unión al surco menor (NFQ-MGB)

Moléculas que están unidas al extremo 3′ de las sondas TaqMan®. Si la sonda está intacta, el apantallador no fluorescente (NFQ) evita que el fluorocromo notificador emita fluorescencia. Dado que el NFQ no emite ninguna fluorescencia, produce señales de fondo más bajas, lo que se deriva en una mayor precisión en la cuantificación. El ligando de unión al surco menor (MGB) aumenta la temperatura de desnaturalización (Tm) sin aumentar la longitud de la sonda. También permite el diseño de sondas más cortas.

archivo de información de ensayo (AIF)

Archivo de datos del CD que se incluye con cada pedido de ensayo. El nombre de archivo incluye el número del código de barras de la placa de reacción. La información del AIF se incluye en un formato de texto delimitado por tabuladores.

asistente de diseño Función del software StepOne™ que le ayuda a configurar el experimento guiándole a través de los procedimientos óptimos para comenzar el diseño del experimento.

Auto∆ Opción para aumentar o reducir la temperatura y/o el tiempo en los ciclos subsiguientes de la reacción de PCR. Cuando Auto∆ está habilitado, las opciones se indican por medio de un icono en el perfil térmico:

• Auto∆ activado:

• Auto∆ desactivado:

Glosario-2 Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Glosario

biblioteca de dianas

Recogida de dianas en el software StepOne™.

biblioteca de ensayos SNP

Recogida de ensayos SNP en el software StepOne™.

biblioteca de muestras

Recogida de muestras en el software StepOne™. La biblioteca de muestras contiene el nombre de la muestra y el color de la muestra.

calibración espacial

Tipo de calibración del sistema StepOne™ en el que el sistema asigna las posiciones de los pocillos en el bloque de muestras. Los datos de la calibración espacial se utilizan para que el software pueda asociar aumentos de la fluorescencia durante un proceso con pocillos específicos de la placa de reacción.

calibrador Véase muestra de referencia.

cantidad En los experimentos de cuantificación, la cantidad de diana en las muestras. La cantidad absoluta puede referirse al número de copias, la masa, la molaridad o la carga viral. La cantidad relativa se refiere a la diferencia entre la cantidad de diana normalizada en la muestra y la cantidad de diana normalizada en la muestra de referencia.

cantidad estándar Cantidad conocida de la reacción de PCR.

• En los experimentos de curva estándar, la cantidad conocida de diana. Las unidades de la cantidad estándar pueden ser la masa, el número de copias, la carga viral u otras unidades para medir la cantidad de la diana.

• En los experimentos de curvas estándar relativas, cantidad conocida en el estándar. Por ejemplo, la cantidad estándar puede referirse a la cantidad de cDNA o la cantidad mayor o menor de solución de partida. Las unidades no son relevantes en los experimentos de curvas estándar relativas, porque se compensan en los cálculos.

cantidad inicial Cuando se define una curva estándar o una dilución seriada de estándar, se corresponde con la cantidad mayor o menor.

cantidad normalizada

Cantidad de diana dividida por la cantidad de control endógeno.

cebador directo Oligonucleótido que flanquea el extremo 5′ de la diana. El cebador reverso y el cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar la diana.

cebador reverso Oligonucleótido que flanquea el extremo 3′ de la diana. El cebador reverso y el cebador directo se utilizan juntos en las reacciones de PCR para amplificar la diana.

ciclo umbral (CT) Número del ciclo de la PCR en el que ∆Rn corta el umbral en la gráfica de amplificación.


Glosario

coeficientes de regresión

Valores calculados a partir de la línea de regresión de las curvas estándar, incluido el valor R2, la pendiente y el punto de intersección y. Los valores del coeficiente de regresión se pueden utilizar para evaluar la calidad de los resultados a partir de los estándares. Véase también curva estándar.

color de diana Color asignado a una diana para identificarla en la disposición de la placa y las gráficas de análisis.

Concentración de muestra diluida (10X para la mezcla de reacción)

Campo del software que aparece en la ficha Sample Dilution Calculations (Cálculos de dilución de muestras) de la pantalla Reaction Setup (Configuración de reacción). En este campo, escriba la concentración de la muestra que desea utilizar para añadirla a la mezcla de reacción de todas las muestras del experimento. "10✕for Reaction Mix" (10X para la mezcla de reacción) significa que el software asume que la muestra o el componente estándar de la mezcla de reacción tiene una concentración del 10✕. Por ejemplo, si la concentración de las muestras diluidas es 50,0 ng/µL (10✕), la concentración de la muestra final de la reacción es 5 ng/µL (1✕).

configuración avanzada

Función del software StepOne™ que permite configurar el experimento de acuerdo con el diseño de dicho experimento.

control endógeno Diana que debería existir a niveles similares en todas las muestras que se están probando. Se utiliza en experimentos de cuantificación relativa (∆∆CT) para normalizar las señales de fluorescencia de la diana que se está cuantificando. También se conoce como gen de mantenimiento.

control interno positivo (IPC)

En los experimentos de presencia/ausencia, un molde de DNA sintético corto que se añade a las reacciones de PCR. Se puede utilizar el IPC para distinguir los resultados falsos negativos en las reacciones afectadas por los apantalladores de PCR, una configuración incorrecta del ensayo o un fallo del reactivo o el instrumento.

control negativo (NC)

En los experimentos del sistema StepOne™, tarea asignada a las dianas o los ensayos de SNP en los pocillos que contienen agua o tampones en lugar de una muestra. En los pocillos de control negativo, no se debería producir ninguna amplificación de la diana.

control positivo En los experimentos de genotipado, la tarea del ensayo de SNP en pocillos que contienen una muestra con un genotipo conocido.

control sin amplificación (NAC)

Véase también pocillos de IPC de control negativo bloqueado.

CT Abreviatura de ciclo umbral (Threshold Cycle).

CT automático Opción de análisis en la que el software calcula de manera automática el umbral y la línea basal de la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral para calcular el ciclo umbral (CT).

CT manual Opción de análisis en la que se introduce el valor del umbral y se selecciona si se desean utilizar cálculos de línea basal automáticos o manuales. El software utiliza el valor del umbral que se introduce y la línea basal para calcular el ciclo umbral (CT).


Glosario

curva de disociación

Visualización de los datos recogidos durante la fase de la curva de disociación. Los picos de la curva de disociación pueden indicar la temperatura de desnaturalización (Tm) de la diana o pueden identificar la presencia de amplificaciones no específicas. La curva de disociación se puede ver como fluorescencia del notificador normalizado (Rn) frente a la temperatura o como la derivada de la fluorescencia del notificador normalizada (−Rn′) frente a la temperatura.

curva estándar En los experimentos de curva estándar y curva estándar relativa:

• La línea con un ajuste óptimo que resulta al representar los valores CT a partir de las reacciones estándar frente a las cantidades conocidas del estándar. Véase también línea de regresión.

• Conjunto de estándares que contiene una serie de cantidades conocidas. Los datos de las reacciones de la curva estándar se utilizan para generar la curva estándar. La curva estándar se define por el número de puntos de la serie, el número de réplicas de estándar, la cantidad inicial y el factor de dilución. Véase también dilución seriada de estándar.

delta Rn (∆Rn) Abreviatura de notificador normalizado con línea basal corregida (baseline-corrected normalized reporter).

desconocidos En los experimentos de cuantificación, la tarea de la diana en pocillos que contienen una muestra con cantidades de diana desconocidas.

En los experimentos de genotipado, la tarea del ensayo de SNP en pocillos que contienen una muestra con un genotipo desconocido.

En los experimentos de presencia/ausencia, la tarea de la diana en pocillos que contienen una muestra en la que no se conoce la presencia de la diana.

diana La secuencia de ácido nucleico que se desea amplificar y detectar.

dilución seriada de estándar

En los experimentos de curvas estándar y curvas estándar relativas, conjunto de normas que contienen una serie de cantidades conocidas. La dilución seriada de estándar se prepara por medio de estándares de dilución de dilución. Por ejemplo, la solución de partida de estándar se utiliza para preparar el primer punto de dilución, el primer punto de dilución se utiliza para preparar el segundo punto de dilución, etc. Los volúmenes necesarios para preparar una dilución seriada de estándar se calculan mediante el número de puntos de dilución, el número de réplicas de estándar, la cantidad inicial, el factor de dilución y la concentración estándar en la solución de partida. Véase también curva estándar.

diluyente Reactivo utilizado para diluir una muestra o estándar antes de añadirlo a la reacción de PCR. El diluyente puede ser agua o un tampón.

disposición autónoma

Disposición del sistema en la que el instrumento StepOne™no está conectado a un ordenador por medio del cable amarillo del sistema StepOne ™. En su lugar, se utiliza una unidad USB ( ) para transferir datos entre los componentes del sistema StepOne™. En esta disposición, el instrumento StepOne™ se controla por medio de la pantalla táctil del instrumento.


Glosario

disposición conectada

Disposición del sistema en la que el instrumento StepOne™ está conectado directamente a un ordenador conectado por medio del cable del sistema StepOne™ amarillo. En esta disposición, el instrumento StepOne™ está controlado por medio del software StepOne™ del ordenador conectado.

disposición de placa

Ilustración de la rejilla de 6 × 8 pocillos y contenido asignado a la placa de reacción. En el software, puede utilizar la disposición de la placa como una herramienta de selección para asignar el contenido de los pocillos, ver las asignaciones de los pocillos y ver los resultados. La disposición de la placa se muestra en las pantallas Design Wizard (Asistente de diseño), Advanced Setup (Configuración avanzada), de proceso y de análisis. La disposición de la placa se puede imprimir, incluir en un informe, exportar y guardar como una diapositiva para una presentación.

DNA de la muestra (10✕)

Componente de reacción que se muestra en la pantalla Reaction Setup (Configuración de la reacción). El software asume que el DNA de la muestra que se añade a la mezcla de la reacción está en una concentración del 10✕. Por ejemplo, si el volumen de la reacción es de 20 µL, el volumen calculado de la muestra de la reacción 1 es 2 µL.

EFF% Véase eficiencia de amplificación (EFF%).

eficiencia de amplificación (EFF%)

Cálculo de la eficiencia de la amplificación de la PCR. La eficiencia de la amplificación se calcula utilizando la pendiente de la línea de regresión en la curva estándar. Una pendiente próxima a −3,3 indica una eficiencia de amplificación de la PCR óptima del 100%. Factores que afectan a la eficiencia de la amplificación:

• Rango de cantidades estándar: para obtener medidas de la eficiencia más exactas y precisas, utilice un amplio rango de cantidades estándar, de 5 a 6 registros (multiplicado por 105 a 106).

• Número de réplicas de estándar: para obtener mediciones de la eficiencia más precisas, incluya réplicas para reducir los efectos de las imprecisiones del pipeteo.

• Apantalladores de la PCR: los apantalladores de la PCR en la reacción pueden reducir la eficiencia de la amplificación.

ensayo En el sistema StepOne™, reacción de PCR que contiene cebadores para amplificar una diana y una sonda para detectar la diana amplificada.

ensayo SNP Se utiliza en los experimentos de genotipado. Es una reacción de PCR que contiene cebadores para amplificar el SNP y dos sondas para detectar diferentes alelos.

ensayos bajo pedido

Los ensayos TaqMan® que se fabrican cuando se solicitan. Sólo se envían los ensayos que cumplen las especificaciones de control de calidad tras la fabricación.

ensayos inventoriados

Ensayos TaqMan® fabricados previamente, que cumplen las especificaciones de control de calidad y que se guardan en inventario.

estándar Muestra que contiene cantidades estándar conocidas. Las reacciones estándar se utilizan en experimentos de cuantificación para generar curvas estándar. Véase también curva estándar y dilución seriada de estándar.


Glosario

experimento Se refiere al proceso completo de realización de un proceso con el sistema StepOne™, incluida la configuración, el proceso y el análisis. Tipos de experimentos que se pueden realizar con el sistema StepOne™ :

• Cuantificación : curva estándar

• Cuantificación : curva estándar relativa

• Cuantificación: CT comparativos (∆∆CT)

• Curva de disociación

• Genotipado

• Presencia/ausencia

experimento de punto final

Experimento en el que los datos de fluorescencia que se recogen en una lectura posterior a la PCR se utilizan para calcular resultados para experimentos de genotipado o presencia/ausencia.

factor de dilución Valor numérico que define la secuencia de cantidades en la curva estándar. El factor de dilución y la cantidad inicial sirven para calcular la cantidad estándar de cada punto de la curva estándar. Por ejemplo, si la curva estándar se define con un factor de dilución de 1:10 o 10, la diferencia entre 2 puntos adyacentes cualquiera en la curva se multiplica por 10.

fase Componente del perfil térmico. Una fase consta de uno o varios pasos.

fase cíclica Fase del perfil térmico que se repite. Si la fase cíclica se utiliza para realizar la PCR, se denomina fase de amplificación.

fase de curva de disociación

Fase del perfil térmico con un incremento de temperatura para generar una curva de disociación.

fase de espera Fase del perfil térmico que incluye uno o varios pasos. Por ejemplo, puede añadir una fase de espera al perfil térmico para activar enzimas, para desactivar enzimas o para incubar una reacción.

fluorocromo del sistema

Fluorocromo fabricado por Applied Biosystems y precalibrado en el sistema StepOne™. Fluorocromos del sistema:

• Fluorocromo FAM™

• Fluorocromo JOE™

• Fluorocromo ROX™

• Fluorocromo SYBR® Green

• Fluorocromo VIC®



Glosario

fluorocromo personalizado

Fluorocromo que no fabrica Applied Biosystems. Puede utilizar fluorocromos personalizados para realizar experimentos de PCR en tiempo real en el sistema StepOne™. Antes de utilizar fluorocromos personalizados, realice una calibración espectral de los mismos.


fluorocromo puro Reactivo que contiene el fluorocromo. Los fluorocromos puros se utilizan para realizar una calibración espectral en el sistema StepOne™. Véase también fluorocromo del sistema.

gen de mantenimiento

Véase control endógeno.

gráfica de amplificación

Visualización de los datos recogidos durante la fase cíclica de la amplificación de la PCR. Se puede ver como:

• Notificador normalizado con línea basal corregida (∆Rn) frente al ciclo

• Notificador normalizado (Rn) frente al ciclo

• Ciclo umbral (CT) frente al pocillo

gráfica de datos brutos

Visualización del incremento de la fluorescencia de los pocillos seleccionados de todos los filtros. Muestra el incremento de la fluorescencia de todos los puntos de recogida de datos del proceso.

gráfica de discriminación alélica

Visualización de los datos recogidos durante la lectura posterior a la PCR. La gráfica de discriminación alélica es una gráfica de la fluorescencia normalizada del notificador de la sonda del alelo 1 frente a la fluorescencia normalizada del notificador de la sonda del alelo 2.

gráfica de temperatura

Visualización de temperaturas de la muestra, la cubierta del instrumento y el bloque de instrumento durante el proceso del instrumento.

gráfica multicomponente

Visualización de los datos recogidos durante la fase cíclica de la PCR en tiempo real. La gráfica multicomponente muestra la fluorescencia de todos los ciclos del proceso.

grupo de réplicas Conjunto de reacciones idénticas de un experimento.

identificador de ensayo

Valor asignado por Applied Biosystems a los TaqMan® Gene Expression Assays y los TaqMan® SNP Genotyping Assays.

identificador refSNP

Número de identifiación del SNP (refSNP). Lo genera dbSNP (Single Nucleotide Polymorphism Database of Nucleotide Sequence Variation o Base de datos de polimorfismos nucleótidos únicos de variación de secuencia nucleótida). Se puede utilizar para buscar en el almacén de Applied Biosystems un Applied Biosystems SNP Genotyping Assay. También se denomina número rs.

inhibidor del IPC Reactivo añadido a las reacciones de PCR para bloquear la amplificación del control positivo interno (IPC).


Glosario

intersección y Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión en la curva estándar. La intersección y de esta línea es el valor de y en el punto en el que la línea cruza el eje y.

IPC Abreviatura de control positivo interno (Internal Positive Control). Además, en los experimentos de presencia/ausencia, es la tarea de la diana de IPC en pocillos que contienen el molde del IPC.

IPC bloqueado En los experimentos de presencia/ausencia, tarea asignada a la diana de IPC en los pocillos que contienen un inhibidor de IPC en lugar de una muestra. Véase también pocillos de IPC bloqueados por control negativo.

IPC+ Llamada de presencia/ausencia cuando el control interno positivo (IPC) es correcto.

lectura de punto final

Véase lectura posterior a la PCR.

lectura posterior a la PCR

Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia/ausencia. Es la parte del proceso del instrumento que se produce después de la amplificación. En los experimentos de genotipado, los datos de fluorescencia que se recogen durante la lectura posterior a la PCR se muestran en la gráfica de discriminación alélica y se utilizan para asignación de alelos. En los experimentos de presencia/ausencia, los datos de fluorescencia que se recogen durante la lectura posterior a la PCR se muestran en la gráfica de presencia/ausencia, y se utilizan para la detección. También se denomina lectura de punto final.

lectura previa a la PCR

Se utiliza en los experimentos de genotipado y presencia/ausencia. Es la parte del proceso del instrumento que se produce antes de la amplificación. Los datos de fluorescencia que se recogen durante la lectura previa a la PCR se utilizan para normalizar los datos de fluorescencia posteriores a la lectura.

línea basal En la gráfica de amplificación, línea ajustada a los niveles de fluorescencia de un rango de ciclos definido. Si se utiliza una opción de análisis de línea basal manual, Applied Biosystems recomienda seleccionar los primeros ciclos de la PCR para determinar la línea basal.

línea basal automática

Opción de análisis en la que el software calcula los valores de inicio y fin de la línea basal para la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral para calcular el ciclo umbral (CT).

línea basal manual Opción de análisis en la que se introducen los valores de inicio y fin de la línea basal para la gráfica de amplificación. El software utiliza la línea basal y el umbral para calcular valores CT.

línea de regresión En los experimentos de curva estándar y curva estándar relativa, la línea que mejor se ajusta a partir de la curva estándar. Fórmula de la línea de regresión:

CT = m [registro (Cant)] + b

donde m es la pendiente, b es el punto de intersección y, y Cant es la cantidad estándar.

Véase también coeficientes de regresión.


Glosario

método CT comparativos (∆∆CT)

Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método CT comparativos (∆∆CT), se utilizan los resultados de una muestra de referencia y un control endógeno para determinar cantidades relativas de una diana en las muestras.

método de cuantificación

En los experimentos de cuantificación, el método que se utiliza para determinar la cantidad de diana en las muestras. En los experimentos de cuantificación, hay tres tipos de métodos de cuantificación disponibles: curva estándar, CT comparativos (∆∆CT) y curva estándar relativa.

método de curva estándar

Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método de curva estándar, los resultados de los estándares se utilizan para determinar cantidades absolutas de una diana en las muestras.

método de la curva estándar relativa

Método de cuantificación para experimentos de cuantificación. Con el método de la curva estándar relativa, se utilizan los resultados de los estándares, una muestra de referencia y un control endógeno para determinar las cantidades relativas de una diana en las muestras.

método de proceso Definición del volumen de reacción y el perfil térmico del proceso del instrumento.

mezcla de cebador Componente de reacción de PCR que contiene el cebador directo y el cebador reverso diseñados para amplificar la diana.

mezcla de cebador/sonda

Componente de reacción de PCR que consta de cebadores diseñados para amplificar la diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación de la diana.

mezcla de ensayos Componente de reacción de PCR de los Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays y los TaqMan® SNP Genotyping Assays que consta de cebadores diseñados para amplificar una diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación de la diana.

mezcla de la sonda Componente de reacción de PCR que contiene una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación de la diana.

mezcla de reacción Solución que contiene todos los componentes necesarios para procesar la reacción de PCR, excepto el molde (de muestra, de estándar o de control).

molde Tipo de ácido nucleico que se añade a la reacción de PCR. El tipo de molde recomendado varía en función del tipo de experimento.

monitorización remota

Función del software que permite ver el estado de un instrumento en red, enviar experimentos al instrumento y descargar experimentos de procesos en el ordenador.

muestra El molde a ensayar.

muestra de referencia

En experimentos de cuantificación relativa (∆∆CT), la muestra que se utiliza como base de los resultados cuantitativos relativos. También se denomina calibrador.


Glosario

Muestra o estándar (10✕)

Componente de reacción que se muestra en la ficha Reaction Mix Calculations (Cálculos de la muestra de reacción) de la pantalla Reaction Setup (Configuración de la reacción). El software asume que la muestra o el estándar que se añade a la mezcla de la reacción está en una concentración del 10✕. Por ejemplo, si el volumen de la reacción es de 20 µL, el volumen calculado de la muestra o estándar de la reacción 1 es 2 µL.

nombre de experimento

Introducido durante la configuración del experimento, es el nombre que se utiliza para identificarlo. Los nombres de los experimentos no pueden superar los 100 caracteres y no pueden incluir ninguno de los siguientes caracteres: barra inclinada hacia delante (/), barra inclinada hacia atrás (\), signo mayor que (>), signo menor que (<), asterisco (*), signo de interrogación (?), comillas ("), línea vertical (|), dos puntos (:) o punto y coma (;).

notificador Fluorocromo que se utiliza para detectar la amplificación. Si se utilizan reactivos TaqMan®, el notificador se une al extremo 5′. Si se utilizan reactivos SYBR® Green, el notificador es SYBR® Green.

notificador derivado (−Rn′)

Se muestra en el eje y de la curva de disociación. La señal del notificador derivado es el opuesto de la primera derivada de la fluorescencia normalizada del notificador.

notificador normalizado (Rn)

Señal de fluorescencia que emite el notificador normalizado con la señal de fluorescencia de la referencia pasiva.

notificador normalizado con línea basal corregida (∆Rn)

La magnitud de la señal de fluorescencia normalizada que genera el notificador durante la amplificación de la PCR.

∆Rn = Rn (punto final) − Rn (línea basal), donde Rn = notificador normalizado.

número rs Véase identificador refSNP.

omitir pocillo Acción que se realiza después del análisis para omitir uno o varios pocillos de todos los análisis antes de volver a analizar los datos.

pantalla táctil Visor del instrumento que se toca para controlarlo.

paso Componente del perfil térmico. Los pasos se definen por la temperatura, el tiempo, la rampa y el estado de recogida de datos. En las fases cíclicas, los pasos también se definen por medio del estado Auto∆.

PCR en tiempo real Proceso de recogida de datos de fluorescencia durante la amplificación de la PCR. Los datos de la PCR en tiempo real sirven para calcular los resultados de los experimentos de cuantificación o para solucionar los problemas de los resultados de los experimentos de genotipado o presencia/ausencia.

pendiente Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión en la curva estándar. La pendiente indica la eficiencia de la amplificación de la PCR para el ensayo. Una pendiente de −3,3 indica una eficiencia de amplificación del 100%. Véase también eficiencia de amplificación (EFF%).


Glosario

perfil térmico Parte de un método de proceso que especifica la temperatura, el tiempo, la rampa y los puntos de recogida de datos de todos los pasos y fases del proceso del instrumento.

pocillos de IPC de control negativo

En los experimentos de presencia/ausencia, pocillos que contienen un molde de IPC y un tampón o agua en lugar de una muestra en la reacción de PCR. El molde IPC es lo único que se debería amplificar en los pocillos de IPC de control negativo, porque la reacción no contiene ninguna muestra. Véase también IPC+.

pocillos de IPC de control negativo bloqueado

En los experimentos de presencia/ausencia, pocillos que contienen un inhibidor del IPC en lugar de una muestra en la reacción DE PCR. No se debería producir ninguna amplificación en los pocillos de IPC de control negativo bloqueado, porque la reacción no contiene ninguna muestra y la amplificación del IPC está bloqueada. También se denomina "control sin amplificación” (NAC).

punto Un estándar en una curva estándar. La cantidad estándar de cada punto de la curva estándar se calcula en base a la cantidad inicial y el factor de dilución.

QuickStart (Inicio rápido)

Función del sistema StepOne™ que permite realizar el experimento sin introducir la información de configuración de la placa.

química Véase reactivos.

rampa La velocidad a la que cambia la temperatura durante el proceso del instrumento. Excepto en el el caso de la curva de disociación, la rampa se define como un porcentaje. En el caso del paso de la curva de disociación, la rampa se define como un incremento de la temperatura. En el gráfico del perfil térmico, la rampa se indica por medio de una línea diagonal.

reacción de la muestra/diana

Combinación de la muestra y el ensayo diana en una reacción de PCR. En el asistente de diseño, cada reacción de PCR sólo puede contener una muestra y un ensayo diana.

reacción del ensayo SNP/muestra

Combinación de la muestra y el ensayo SNP en una reacción de PCR. Cada reacción de PCR sólo puede contener una muestra y un ensayo SNP.

reactivos Los componentes de la reacción de PCR que se está utilizando para amplificar la diana y detectar la amplificación. Tipos de reactivos utilizados en el sistema StepOne™:


• Reactivos SYBR® Green

• Otros reactivos

reactivos SYBR® Green

Componente de reacción de PCR que consta de dos cebadores que están diseñados para amplificar la diana y el SYBR® Green para detectar DNA de doble cadena.

reactivos TaqMan® Componentes de reacción de PCR que constan de cebadores diseñados para amplificar la diana y una sonda TaqMan® diseñada para detectar la amplificación de la diana.

rechazar pocillo Acción que realiza el software durante el análisis para quitar uno o varios pocillos de un análisis posterior si se aplica un aviso específico al pocillo.


Glosario

recogida de datos Proceso durante la utilización del instrumento en el que un componente del instrumento detecta datos de fluorescencia en cada pocillo de la placa de reacción. El instrumento transforma la señal en datos electrónicos y los datos se guardan en el archivo del experimento. Los puntos de recogida de datos se indican por medio de un icono en el perfil térmico:

• Recogida de datos activada:

• Recogida de datos desactivada:

referencia pasiva Fluorocromo que produce una señal de fluorescencia. Dado que la señal de referencia pasiva debería ser uniforme en todos los posillos, se utiliza para normalizar la señal del fluorocromo notificador para justificar las fluctuaciones de fluorescencia causadas por diferencias menores entre pocillos en concentraciones o en volumen. La normalización de la señal de referencia pasiva permite obtener datos de gran precisión.

réplicas Número total de reacciones idénticas que contienen componentes idénticos y volúmenes idénticos.

Rn Abreviatura de notificador normalizado (Normalized Reporter).

serie Véase dilución seriada de estándar.

sin ácido nucleico molde (NTC)

Véase control negativo (NC).

SNP Abreviatura de polimorfismo nucleótido único (Single Nucleotide Polymorphism). El SNP puede constar de una diferencia de una base o una indel (inserción/deleción).

tarea Tipo de reacción realizada en el pocillo para la diana o el ensayo SNP. Tareas disponibles en los experimentos del sistema StepOne™:

• Desconocida

• Control negativo

• Estándar (experimentos de curvas estándar y curvas estándar relativas)

• Control positivo (experimentos de genotipado)

• IPC (experimentos de presencia/ausencia)

• IPC bloqueado (experimentos de presencia/ausencia)

temperatura de desnaturalización (Tm)

Punto en la curva de disociación en el que se produce un pico en los niveles de fluorescencia que sirve para indicar que el DNA de doble cadena amplificado se disocia en DNA de cadena sencilla.


Glosario

tipo de experimento

El tipo de experimento que se realiza con el sistema StepOne™:

• Curva estándar

• CT comparativos (∆∆CT)

• Curva estándar relativa

• Curva de disociación (no disponible en el asistente de diseño)

• Genotipado

• Presencia/ausencia

El tipo de experimento que seleccione afecta a las pantallas de configuración, proceso y análisis.

Tm Abreviatura de temperatura de desnaturalización (Tm o Melting Temperature).

transcriptasa reversa

Componente de reacción de PCR que convierte el RNA en cDNA. La transcriptasa reversa se añade a la reacción de PCR para realizar un RT-PCR de 1 paso.

umbral Nivel de fluorescencia por encima de la línea basal y dentro de la región de crecimiento exponencial de la gráfica de amplificación. El umbral se puede determinar automáticamente (véase CT automático) o se puede ajustar manualmente (véase CT manual).

umbral del ciclo Véase ciclo umbral (CT).

valor atípico Para un conjunto de datos, un punto que es significativamente más pequeño o grande que los demás.

valor R2 Coeficiente de regresión calculado a partir de la línea de regresión en la curva estándar. El valor R2 indica la proximidad del ajuste entre la línea de regresión de la curva estándar y los datos de CT individuales de las reacciones estándar. El valor 1,00 indica un ajuste perfecto entre la línea de regresión y los puntos de datos.

velocidad de la rampa

Velocidad a la que se produce la rampa de temperatura durante el proceso del instrumento. Las velocidades de rampa disponibles son rápida y estándar.


Glosario

Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System Índice-1

Índice

Aamplicones, seleccionar pequeños 3-24arrastre, UNG para reducir al mínimo 2-7

Ccebadores

concentraciones predeterminadas 3-31estructuras en horquilla 3-9resumen de directrices de diseño 3-25RT-PCR de 1 paso 3-9RT-PCR de 2 pasos 3-9

condiciones de ciclo térmicocuantificación de DNA/cDNA 3-29cuantificación de RNA 3-29RT-PCR de 1 pasos 3-29RT-PCR de 2 pasos 3-30

consumibles, admitidos 1-3contaminación de DNA, reducción al mínimo 2-7contenido de G/C, y emplazamientos de amplicones 3-24control endógeno 3-6controles negativos 3-5, 3-6, 4-4, 5-4controles positivos 4-4cuantificación de DNA/cDNA, condiciones de ciclo

térmico 3-29cuantificación de RNA

condiciones de ciclo térmico 3-29, 3-30RT-PCR de 1 paso 3-27RT-PCR de 2 pasos 3-27

Custom TaqMan Gene Expression Assays 3-20, 5-12Custom TaqMan SNP Genotyping Assays 4-15

Ddilución seriada de estándar 3-5Directrices de diseño de ensayos

acerca de C-1experimentos de cuantificación C-1experimentos de genotipificación C-2experimentos de presencia/ausencia 5-15optimizar concentración de sonda 3-35

directrices de diseño de ensayoscebador y sonda 3-23, 3-25condiciones de ciclo térmico 3-28experimentos de cuantificación 3-22optimizar concentraciones de cebador 3-31

seleccionar reactivos 3-26diseñar experimentos

cuantificación 3-22genotipificación 4-14, 4-17presencia/ausencia 5-15

Eemplazamientos de amplicones

contenido de G/C 3-24cribar 3-23entremo de 3’ de cebadores 3-25entremo de 5’ de sondas 3-24selección 3-23temperatura de fusión 3-24

estándares 3-5estructuras en horquilla, y elección de cebador 3-9experimentos de CT comparativo

acerca de 3-6componentes 3-6Véase también experimentos de cuantificación 3-6

experimentos de cuantificacióncomparar 3-7conclusiones para las directrices de diseño de

ensayos C-1CT comparativo 3-6curva estándar 3-5curva estándar relativa 3-5directrices de diseño de ensayos para tipos de ensayos

personalizados 3-22diseñar 3-22explicados 3-4PCR en tiempo real 3-4reactivos SYBR Green 2-4, 3-33reactivos TaqMan 2-2seleccionar mezcla maestra 3-21seleccionar reactivos para tipo de ensayo

personalizado 3-26seleccionar tipo de reactivo 3-13seleccionar un método de cuantificación 3-5tipos de ensayos 3-13

experimentos de curva estándaracerca de 3-5componentes 3-5Véase también experimentos de cuantificación 3-5

experimentos de curva estándar relativaacerca de 3-5componentes 3-5

Índice-2 Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Índice

Véase también experimentos de cuantificación 3-5experimentos de genotipificación

componentes 4-4conclusiones para las directrices de diseño de

ensayos C-2descritos 4-4diseñar 4-14, 4-17funcionamiento 4-4instrumentos 4-4no coincidencias 4-5reactivos TaqMan 2-2seleccionar mezcla maestra 4-13, 4-17tipos de ensayos 4-6

experimentos de presencia/ausenciacomponentes 5-4definidos 5-4Directrices de diseño de ensayos para tipos de ensayos

personalizados 5-15diseñar 5-15funcionamiento 5-5incorporar un IPC 5-5reactivos TaqMan 2-2realización sin un IPC 5-4seleccionar mezcla maestra 5-14seleccionar reactivos para tipo de ensayo

personalizado 3-26tipos de ensayos 5-6

experimentos de punto finalgenotipificación 4-4presencia/ausencia 5-4

Fflujo de trabajo Advanced Setup (Configuración

avanzada) 1-6, 1-7, 1-8flujo de trabajo del asistente de diseño 1-6, 1-7, 1-8

IIPC 5-4, 5-5

Llimitación de cebador, ensayos multiplexados 3-10

Mmatriz de cebadores

cómo utilizar 3-31definir límites B-2ejemplo de limitador B-2

mezcla maestraseleccionar para experimentos de cuantificación 3-21seleccionar para experimentos de

genotipificación 4-13, 4-17seleccionar para experimentos de

presencia/ausencia 5-14muestra 3-5, 3-6, 4-4, 5-4

muestra de referencia 3-5, 3-6MultiScribe reverse transcriptase, definición 3-28

Nno coincidencia, en experimentos de genotipificación 4-5

Ooptimización 3-35otros reactivos basados en fluorescencia 1-6

PPCR en tiempo real

experimentos de cuantificación 3-4proceso de detección de TaqMan 2-2

PCR multiplexadacebadores de rRNA B-1comparación con uniplexada 3-10descrita 3-10limitación de cebador 3-10

PCR, prácticas generales 2-8pequeños amplicones, seleccionar 3-24producto no específico, contaminación con colorante

SYBR Green 2-7

Rreactivos

consideraciones 2-6otros basados en fluorescencia 1-6reactivos SYBR Green 1-6reactivos TaqMan 1-6, 2-2seleccionar 1-6, 2-5seleccionar para tipo de ensayo personalizado 3-26

reactivos SYBR Greenconsideraciones para seleccionar 2-6desarrollo 2-4funcionamiento 2-5optimizar experimentos de cuantificación 3-33

reactivos TaqManconsideraciones para seleccionar 2-6desarrollo 2-2funcionamiento 2-2tipos de experimentos 2-2

reactivos Universal Master Mixventaja de la polimerasa 3-28

recopilación de datos 1-2réplicas 3-5, 3-6, 4-4, 5-4RT-PCR

1 paso 3-82 pasos 3-8comparación de métodos 3-7, 3-10

RT-PCR de 1 pasoacerca de 3-8cebadores utilizados 3-9

Índice-3Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Índice

cuantificación de RNA 3-27RT-PCR de 2 pasos

acerca de 3-8cebadores utilizados 3-9cuantificación de RNA 3-27

Ssistema StepOne

consumibles 1-3recopilación de datos 1-2tipos de ensayos 1-7tipos de experimentos 1-5tipos de reactivos 1-6

software Primer Expressamplicones pequeños 3-24ensayos de SNP 1-9experimentos de cuantificación 3-22experimentos de presencia/ausencia 5-15

sondasoptimizar concentración de sonda 3-35resumen de directrices de diseño 3-25sondas MGB TaqMan disponibles 2-4

Sondas MGB TaqMan 2-3

TTaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays 4-11TaqMan Endogenous Control Assays 3-19TaqMan Exogenous Internal Positive Control

Reagents 5-13TaqMan Gene Expression Assays 3-18, 5-10TaqMan PDARs for AD 4-12TaqMan SNP Genotyping Assays 4-10temperatura de fusión, y emplazamientos de

amplicones 3-24tipo de ensayo en inventario 1-7tipo de ensayo fabricado bajo pedido 1-7tipo de ensayo personalizado 1-8, 1-9

experimentos de cuantificación 3-22experimentos de presencia/ausencia 5-15

tipo de ensayo prediseñado/validado 1-8tipos de ensayos

ensayos en inventario/fabricados bajo pedido 1-7ensayos personalizados 1-8, 1-9ensayos prediseñados/validados 1-8experimentos de cuantificación 3-13experimentos de genotipificación 4-6experimentos de presencia/ausencia 5-6seleccionar 1-7

UUNG, y reducción al mínimo de arrastre 2-7unión de colorante, métodos de 2-4

Índice-4 Guía de reactivos de Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System

Índice

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06/2010

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