Apostila tradescantia

Bioensaios de toxicidade genética com Tradescantia

Separata preparada a partir de RODRIGUES, G. S.; MA, T. S.; PIMENTEL, D. & WEINSTEIN, L. H. 1996.

Tradescantia bioassays as monitoring systems for environmental mutagenesis. A review. Critical Reviews in Plant Sciences. 16(4):325-359.

RODRIGUES, G. S. Assessment of the Abatement of Pesticide Mutagenesis in Situ by a Corn/Soybean Integrated Pest Management Program. 1995. Tese (Ph.D.) - Cornell University. Ithaca, NY. 141 p.

RODRIGUES, G. S.; PIMENTEL, D.; WEINSTEIN, L. H. In situ assessment of pesticide mutagenicity in an integrated pest management program I - Tradescantia micronucleus assay. Mutation Research. in press, 1998.

Geraldo Stachetti Rodrigues Centro Nacional de Pesquisa de Monitoramento e Avaliação de Impacto Ambiental

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - EMBRAPA

1. Tradescantia e o bioensaio do micronúcleo na célula mãe do pólen. Desde os primórdios dos estudos da atividade genética de compostos químicos e agentes físicos,

várias espécies e clones do gênero Tradescantia têm sido utilizados como organismos experimentais, em

virtude de uma série de características genéticas favoráveis. Apresentando apenas seis pares de cromossomos

grandes e facilmente observáveis, células de quase todas as partes da planta, da ponta da raiz ao tubo polínico

em desenvolvimento, fornecem material excelente para estudos citogenéticos (Ma & Grant, 1982).

Como consequência do uso intenso de Tradescantia em estudos genéticos, encontrou-se uma série

de características que permitem a detecção de agentes que afetam a estabilidade do genoma. Pelo menos

quatro dessas características foram selecionadas como indicadores em bioensaios de avaliação de toxicidade

genética. Dois desses ensaios, o da mitose em ponta de raiz e o do tubo polínico, são ensaios de aberração

cromossômica nos quais se observa deformações morfológicas visíveis nos cromossomos (Ma, 1982). Um

terceiro, o ensaio da mutação para célula cor-de-rosa em pêlo estaminal (Trad-SHM) (Underbrink et al.,

1973b) é um teste de mutação mitótica pontual que se baseia na expressão de um gene recessivo para cor da

flor em plantas heterozigotas. O quarto ensaio é um teste citogenético que se baseia na formação de

micronúcleos (Trad-MCN) que resultam da quebra cromossômica nas células meióticas geradoras do pólen

(Ma, 1979b). Este ensaio foi aqui escolhido para uma análise completa (in situ, de estratos de solo, e de

formulações comerciais) da genotoxicidade dos pesticidas aplicados em um programa de manejo integrado de

pragas (MIP). A presente escolha deste sistema para esta análise detalhada da toxicidade genética de

pesticidas se deveu não somente à versatilidade e propriedade do ensaio para testes in situ em campo e in

vivo em laboratório, como também à sua extraordinária sensibilidade (Ma et al., 1982).

No presente texto examinam-se as características e fundamentos dos ensaios Trad-MCN e Trad-

SHM e revisam-se os resultados até hoje obtidos com estes sistemas na avaliação de genotoxicantes

ambientais. Adicionalmente, apresenta-se uma análise dos experimentos conduzidos para a avaliação dos

possíveis efeitos que um programa de MIP poderia apresentar no sentido de abater a genotoxicidade de

pesticidas visando diretamente um incremento na qualidade da agricultura atual.

1.1 Trad-MCN: Fundamentos e desenvolvimento do bioensaio Estudos sobre o genoma de Tradescantia iniciaram-se com os trabalhos pioneiros de Sax &

Edmonds (1933) sobre o gametófito masculino de T. reflexa Raf., quando foram descritas as várias fases do

desenvolvimento do micrósporo e a determinados os períodos e o ritmo dos eventos meióticos. Observações

importantes foram feitas sobre os efeitos de raios-X nos micrósporos dessa espécie (Sax & Edmonds, 1933).

Primeiramente, determinou-se que cromossomos meióticos eram mais suscetíveis a quebra (“breakage”) que

cromossomos mitóticos; e mais importante, cromossomos em divisão eram ao menos dez vezes mais

susceptíveis que aqueles em repouso. Em segundo lugar, quebras (”breaks”) não se distribuíam

aleatoriamente nos cromossomos. Loci posicionados proximamente aos centrômeros apresentavam maior

probabilidade de sofrer ruptura sob efeito da radiação. Estas observações levaram à conclusão de que a

espiralação dos cromossomos durante a replicação, devido às tensões mecânicas envolvidas, influenciaria

fortemente a suscetibilidade a eventos mutacionais. Estas inferências seriam mais tarde confirmadas em um

estudo dos efeitos da radiação gama gerada por 60Co em T. paludosa And. and Woods. (Sparrow &

Singleton, 1953). Os conceitos de temporalidade e sensibilidade que emergiram desses estudos tornaram-se

extremamente importantes na seleção de bioindicadores para mutagênese, uma vez que sincronia no

desenvolvimento celular e precisão nos períodos de recuperação após os tratamentos mostraram-se dois

fatores decisivos para a performance dos bioensaios.

A maior suscetibilidade dos cromossomos meióticos quando comparados com os mitóticos foi mais

tarde confirmada em um estudo da influência da falta de oxigênio na meiose em T. paludosa (Steinitz, 1944).

Esta pesquisa representou a primeira tentativa de observação de micronúcleos nas células mãe do pólen como

indicadores diretos de fragmentação cromossômica. Uma taxa espontânea de 0,87% de células contendo

micronúcleos foi definida para T. paludosa, aumentando para 8,0% em células expostas a anaerobiose nos

estágios iniciais da prófase.

O ritmo dos estágios da meiose foi ainda melhor caracterizado em um estudo da diferenciação das

anteras de T. paludosa (Taylor, 1950). Aproximadamente 24 h se passaram para compleição do ciclo

meiótico, permitindo a definição do período de recuperação apropriado entre a exposição das inflorescências

a agentes tóxicos, e sua fixação para análise do número de micronúcleos, consequentemente da atividade

genotóxica.

O crescente interesse nas capacidades radiomiméticas (especialmente genotóxicas) de substâncias

químicas nos anos 50 sugeriram a utilização de Tradescantia como um bioindicator. Um ensaio de mitose no

tubo polínico foi primeiramente empregado em um estudo comparativo de agentes químicos simples em T.

paludosa (Smith & Lofty, 1954). Óxido de etileno (um agente mutagênico conhecido), queteno (um

composto com resultados inconclusivos), e cloreto de metila (um agente alquilante de baixa potência) foram

comparados para indução de quebras em cromátides e erosão e contração nos cromossomos. O ensaio do tubo

polínico mostrou-se efetivo na detecção de genotoxicidade, os resultados revelando que os compostos mais

ativos (óxido de etileno e queteno) causavam mais numerosas e extensivas aberrações cromossômicas. A

propícia seleção de compostos a serem testados nesta pesquisa permitiu a demonstração da sensibilidade de

Tradescantia, e sua capacidade para diferenciar precisamente efeitos comparativamente similares.

Numa série de artigos a respeito do papel de determinados nutrientes na meiose, a produção de

micronúcleos nos micrósporos de T. paludosa foi tomada como indicativa de quebra cromossômica

(Steffensen, 1953; Steffensen, 1954; Steffensen, 1955). Estudando os efeitos da deficiência em magnésio

(Mg) na meiose, o autor notou uma maior sensibilidade dos micrósporos quando comparados com pontas

radiculares, de acordo com as evidências prévias de maior suscetibilidade de células meióticas que mitóticas.

Micronúcleos apareciam em maior número em plantas deficientes em Mg, cálcio (Ca) e enxofre (S). Note-se

que os dois primeiros nutrientes são responsáveis pela ligação de macromoléculas no núcleo, contribuindo

para a estabilidade de proteínas e DNA. Uma taxa espontânea de micronúcleos de 0,84% foi registrada,

aumentando para 3,89% em plantas cultivadas com meio deficiente em Ca (Steffensen, 1955). Estes números

vêm corroborar observações prévias de produção de micronúcleos em T. paludosa (Steinitz, 1944).

Mais de 30 anos após a observação de micronúcleos para detecção de danos à meiose feita por

Steinitz, Ma e colaboradores (Ma et al., 1978) no Laboratório Nacional Brookhaven desenvolveram o ensaio

do micronúcleo-na-tétrade (Trad-MCN) para mutagênese. Empregando o clone híbrido 4430 (T. hisutiflora

Bush x T. subacaulis Bush) eles compararam a redução de micronúcleos nas células mãe do pólen com

mutações para células cor-de-rosa nos pêlos estaminais de Tradescantia expostas ao conhecido agente

mutagênico 1,2-dibromoetano (DBE).

Já naquele tempo o ensaio da mutação em pêlos estaminais (Underbrink et al., 1973b) vinha sendo

extensivamente empregado e era um teste reconhecido para mutagênese radiobiológica e química. O ensaio

do micronúcleo, contudo, exibiu uma eficiência aproximadamente 36 vezes maior. Esta sensibilidade

extraordinária foi creditada à muito menor especificidade do dano necessário para produzir micronúcleos

quando comparada à mutação nos pêlos estaminais. De acordo, poderia assumir-se que numerosos loci em

qualquer dos 12 cromossomos de Tradescantia estaria sujeitos a danos que resultariam em quebra dos

cromossomos, e consequentemente em micronúcleos. Em contraste, somente um locus em um único

cromossomo poderia sofrer mutação para produção de células cor-de-rosa em pêlos estaminais (Ma et al.,

1978).

A enorme sensibilidade e simplicidade do ensaio Trad-MCN foi ainda demonstrada em

experimentos nos quais baixas doses de raios-X eram comparadas com dois agentes mutagênicos conhecidos,

EMS e azida sódica (NaN3) em ambas formas gasosa e líquida (Ma, 1979a). Uma dose de raios-X de apenas

20-rad induziu altas frequências de micronúcleos (23 MCN/100 tétrades), enquanto apenas 1,8 MCN/100

células foram induzidos por 50-rad de raios-X em linfócitos humanos (Countryman and Heddle, 1976 cited in

Ma, 1979a), ou 2,5 MCN/100 eritroblastos de camundongo em cultura de medula óssea expostas a 35-rad de

raios-X (Janssen and Ramel, 1976 cited in Ma, 1979a). Enquanto ocorria 0,2% mutações por rad no ensaio do

pêlo estaminal (Trad-SHM), ocorria 1,6% MCN por rad no ensaio Trad-MCN. A relação entre dose e efeito

no ensaio Trad-MCN com raios-X resultou num coeficiente de correlação de 0,99. Os resultados obtidos com

os agentes químicos confirmaram estes dados, tanto em relação a sensibilidade quanto em relação ao efeito

pela dose (Ma, 1979a).

Uma vantagem adicional do ensaio Trad-MCN é o curto período de exposição necessário para se

completar um teste - apenas 6 hrs, seguidas de uma recuperação de 24 hrs para permitir que as células

tratadas na prófase atinjam o estágio de tétrade, apropriado para contagem de micronúcleos. Esta

periodicidade da meiose foi testada em um estudo da sensibilidade por estágios usando exposição a raios-X

em T. paludosa (Ma et al., 1980). Grupos de talos contendo inflorescências receberam uma dose singular de

35 rad de raios-X, após o que inflorescências eram removidas e fixadas em intervalos de 3 hrs por 48 hrs pós-

irradiação. Um pico de sensibilidade ocorreu depois de 24 hrs, concordando com as observações de Taylor

(1950). Um segundo pico apareceu após cerca de 39 hrs, sugerindo que ao início da prófase I e/ou estágios

pré-meióticos são também muito sensíveis.

O emprego do ensaio Trad-MCN para o monitoramento de agentes clastogênicos ambientais foi

primeiramente proposto após estudos envolvendo agentes pró-mutagênicos (benzo-α-pireno) e localidades

poluídas (Ma, 1979b; Ma, 1981). Uma grande vantagem percebida nestes estudos era que nenhuma atividade

enzimática externa era necessária para ativar os agentes pró-mutagênicos, dado que o aparato enzimático

continuava totalmente funcional nos talos extraídos das plantas e expostos nos tratamentos.

Por outro lado, várias limitações do ensaio Trad-MCN têm sido apresentadas. O teste obviamente

oferece apenas um índice relativo de danos genéticos. Translocações, inversões e outros tipos de rearranjos

nos cromossomos e cromátides não são revelados como micronúcleos, consequentemente passam sem serem

detectados pelo ensaio. Não é possível também extrapolar facilmente os resultados de frequência de

micronúcleos para carcinogenicidade, e os passos metabólicos de agentes mutagênicos e promutagênicos

podem ser bastante diferentes em Tradescantia e outros organismos (especialmente mamíferos). Além disso,

a alta sensibilidade do sistema resulta em variações consideráveis na frequência espontânea de micronúcleos

em diferentes experimentos, requerendo um sempre cuidadoso controle das condições experimentais e a

utilização simultânea de amostras controle (Ma, 1981).

Uma desvantagem adicional do teste Trad-MCN são os procedimentos laboriosos e demorados para

contagem de micronúcleos nas tétrades (Ma, 1990). Para sanar esta limitação, facilitando e padronizando o

processo de contagem, um sistema de análise de imagens para micronúcleos foi desenvolvido (Ma et al.,

1992b). O sistema computadorizado é capaz de realizar contagens a uma velocidade 3,5 vezes maior que a

contagem manual, e com uma congruência de 90% nas frequências observadas.

Uma revisão relativamente recente do monitoramento in situ de agentes clastogênicos no ambiente

(Ma, 1990) revelou que até 1990 cerca de 300 testes haviam sido conduzidos com o ensaio Trad-MCN numa

ampla variedade de situações. Cerca de 50% desses testes apontaram genotoxicidade. Amostras de águas e

solos apresentaram resultados positivos em cerca de 60% das ocasiões estudadas. Na próxima seção alguns

desses resultados são apresentados e discutidos, de forma que os resultados dos experimentos a serem mais

tarde apresentados possam ser colocados em perspectiva.

1.2 O ensaio Trad-MCN como um sistema de monitoramento para genotoxicidade no ambiente - uma revisão da literatura

1.2.1 Poluição do ar Tradescantia foi exposta a vários locais poluídos no estado de Illinois (EUA) e a gases comumente

encontrados em atmosferas poluídas numa combinação de testes in situ no ambiente e in vivo em laboratório

(Ma et al., 1982). Ensaios in situ expondo as plantas por 2 a 6 hr em estacionamentos, áreas industriais,

fazendas e laboratórios apresentaram resultados positivos, especialmente quando emissões de agroquímicos

estavam envolvidas. Plantas expostas em um escritório, uma fazenda de criação animal e uma área residencial

não apresentaram aumentos na frequência de micronúcleos. Quando fumigadas com os poluentes

atmosféricos NO2, SO2, e O3, assim como ácido hidrazóico gasoso (HN3) e EMS, as plantas também

indicaram clastogênese, sugerindo serem estes gases os possíveis agentes genotóxicos da atmosfera (Ma et

al., 1982).

Como uma consequência de sua versatilidade, Tradescantia foi proposta como um biomonitor para

poluição de ambientes fechados, sendo que vários estudos têm avaliado sua proficiência para os baixos níveis

de contaminação que costumeiramente ocorrem em ambientes residenciais. Dentre os resultados positivos já

encontrados nessas situações citam-se diversos odorizantes comerciais, fumaça de tabaco, p-diclorobenzeno

(bolas de naftalina) e outros inseticidas indicados para uso doméstico, além de gases de combustão de óleo

diesel (Ma & Harris, 1987a; Ma & Harris, 1987b).

Um grupo relativamente incomum de poluentes atmosféricos estudados in situ para clastogênese

com o ensaio Trad-MCN foram as fumaças químicas empregadas pelo exército norte americano. Estes

experimentos envolveram outros ensaios incluindo aberrações cromossômicas e trocas de cromátides irmãs

(SCE) em um roedor nativo (Schaeffer et al., 1987). As fumaças eram geradas a partir de diesel para tanques,

“fogoil,” e hexacloroetano. Todos estes compostos induziram eventos genotóxicos em ao menos uma das

doses. Houve um alto grau de variabilidade (expressa como maiores desvios padrão na produção de

micronúcleos) em todos os tratamentos realizados in situ em relação aos controles de laboratório. Embora este

efeito estatístico tenha sido discutido meramente como obscurecendo a relação dose-efeito dos resultados,

isto pode ser mesmo indicativo de uma característica inerente deste bioensaio. Isso se deve ao fato de os

botões menores das inflorescências jovens de Tradescantia estarem sempre encobertos sob botões maiores e

folhas, o que pode resultar em sua proteção contra exposição direta, especialmente em experimentos com

poluentes atmosféricos, um efeito antecipado por Ma (1979b).

Em um estudo realizado no México, avaliaram-se ao longo do ano os picos de frequência de

micronúcleos em Tradescantia expostas a uma área pesadamente industrializada, uma área residencial e uma

área de ocupação mista (Ruiz et al., 1992). Plantas expostas à área industrial sempre apresentavam mais

micronúcleos que as plantas controle ao longo de todo o ano, enquanto plantas expostas à área residencial

tendia a apresentar incrementos na frequência de micronúcleos somente em meses específicos. O ensaio Trad-

MCN permitiu a detecção de riscos de genotoxicidade causados por emissões de incineradores de lixo

municipal (Ma et al., 1993b) e dos drenos de gases de aterros sanitários (Ma et al., 1993a; Ma et al., 1996).

Dos estudos acima mencionados pode-se concluir que o ensaio Trad-MCN é adequado para a

avaliação de contaminação atmosférica, seja de áreas pesadamente poluídas, industriais ou urbanas, ou sob

condições normais de ambientes residenciais. Condições atmosféricas como variações na velocidade e

direção dos ventos normalmente levam a variações estatísticas relativamente altas nos dados. Um resumo dos

resultados obtidos com Tradescantia na avaliação da poluição atmosférica e agentes gasosos está disponível

na Tabela 1.

Tabela 1 - Resumo dos resultados de avaliações de genotoxicidade no ambiente empregando o ensaio Trad-MCN de Tradescantia em atmosferas poluídas e poluentes atmosféricos.

Agente Dosagem Resultado Tempo de

exposição-max.

Concentração +/-

Significância estatística

Comentários Referência

Monitoramento In situ Poluição

do ar 4 - 6 hrs - p < .01 Estacionamento-

Chicago (IL-EUA) Ar fresco vindo de lago.

Ma et al., 1982

1-4.5 hrs - p < .01 Estacionamento- Decatur (IL-EUA).

″


exposição-max.

Concentração +/-



2 - 6 hrs + p < .01 Estacionamento- Peoria (IL-EUA).

″

2 - 4 hrs - p < .01 Parada de ônibus e caminhões.

″

2-3 hrs - p < .01 Parada de ônibus e caminhões.

″

2.5-5 hrs + p < .01 Parada de ônibus e caminhões.

″

3 mo + p < .01 Área industrial, Granite City (IL-EUA).

″

3.5 hrs + p < .01 Área industrial, Granite City (IL-EUA).

″

4.5 hrs - p < .01 Área residencial, China. ″

4 - 6 hrs + p < .01 Indústria de pesticidas, China.

″

5 hrs - p < .01 Rodoviária, China. ″

6 hrs + p < .01 Fábrica de borracha, China. ″

4 hrs - p < .01 Escritório, China. ″

3 - 6 hrs + p < .01 Herbário tratado com bolas de naftalina, China.

″

6 hrs - p < .01 Fazenda de criação animal, Exaustão de chiqueiro suíno.

″

Fumaça de diesel

23-70 min .3-4.2 ppm - p < .01 Concentração medida como hidrocarbonetos. Fumaças geradas por motor ligado.

″

23-70 min 6-13 ppm + p < .01 Concentração medida como hidrocarbonetos. Fumaças geradas por motor ligado.

″

Gases em câmaras NO2 6-24 hrs 5.0 ppm + p < .01 Positivo apenas em longas

exposições. ″

SO2 6-22 hrs 1.0 ppm + p < .01 Positivo apenas em longas exposições.

″


exposição-max.

Concentração +/-



O3 5.5 hrs 5.0 ppm - p < .01 Exposições prolongadas não

foram tentadas. ″

HN3 6 hrs 136-272 ppm + p < .01 Aplicação única do gás, sem renovação.

″

EMS 6 hrs 1000 ppm + p < .01 Idem ao anterior. ″

Benzo«α» pireno

6 hrs .05-.10 mM + p < .01 Ma, 1981

1,2-dibromo etano

6 hrs 5 - 80 ppm + Coeficiente de correlação dose-efeito 0.99

Ma et al., 1979

Distrito industrial

6-12 hrs + p < .01 Variabilidade sazonal, México.

Ruiz et al., 1992

Distrito

residencial 6-12 hrs + p < .01 Variabilidade sazonal,

México. ″

Distrito misto 6-12 hrs + p < .01 Variabilidade sazonal, México.

″

Fumaças químicas “Fogoil” 30 min 15 - 100 m da

fonte da fumaça

+ p < 0.1 Concentração de gases dada em termos relativos. Todas as distâncias produziram resultados positivos.

Schaeffer et al., 1987

Diesel para tanque

30 min 15-100 m da fonte

+ p < 0.1 Idem ao anterior. ″

Hexacloro etano

30 min 15 - 100 m da fonte

+ p < 0.1 Idem ao anterior. ″

Emissão de aterro

sanitário

4 - 6 hrs + Respostas positivas em 5 de 13 experimentos. Gases queimados no dreno.

Ma et al., 1993

Incinerador municipal

4 - 6 hrs 50 - 500 m da fonte

+ Resultados positivos obtidos com atmosfera estagnada.

Ma et al., 1993

Poluentes de interiores Lavanderia a

seco

15 hrs - p < .05 Turno noturno Ma and Harris, 1987

Casa 16 hrs + p < .05 Após lavagem em carpete. ″

Casa 17 hrs - p < .05 Ar limpo. ″

Fumaça de cachimbo

24 hrs + p < .05 Escritório. ″


exposição-max.

Concentração +/-



Sala para fumantes

10 hrs + p < .05 Escola pública. ″

Odorizantes 1-6 hrs + Várias marcas. ″

Gás formaldeido 1-6 hrs + Relação dose-efeito positiva.

″

1.2.2 Poluição aquática Praticamente todo estudo que envolva a avaliação da presença de agentes mutagênicos em águas

naturais deve incorporar um passo de concentração dos possíveis agentes tóxicos nas amostras a serem

quimicamente analisadas. Isto ocorre devido à intrínseca baixa mutagenicidade dos agentes mais

frequentemente presentes nas águas, devido à sua concentração muito baixa, ou ambos.

A necessidade de concentração das amostras foi claramente demonstrada numa avaliação da

probabilidade de se detectar um agente mutagênico em água utilizando-se o teste de Ames (Johnston &

Hopke, 1980). Neste estudo propôs-se uma variável que ponderava a potência mutagênica e a concentração

média de agentes mutagênicos orgânicos comumente encontrados em águas, e a quantidade do agente

necessária para induzir uma duplicação no número de células mutantes no teste de Ames. Considerando-se

que (a) geralmente apenas alíquotas de 1 ml são aplicadas por placa de teste, b) compostos orgânicos

tipicamente correm em águas em concentrações na faixa de μg/L, e c) 95% dos agentes testados até o

momento apresentavam uma dose de duplicação de pelo menos 1500 μg, concluiu-se que uma amostra

ambiental média que permitisse a detecção de contaminantes com uma confiança de 95% deveria conter 1500

L. Isto significa que um fator médio de concentração de seis ordens de magnitude seria necessário para

reduzir o volume de uma tal amostra para os testes. Deduziu-se que a exposição a agentes mutagênicos

presentes em água potável que ocorre no decorrer da vida de uma pessoa pode ser apreciável, mesmo que não

seja possível detectar estes agentes em amostras ambientais (Johnston & Hopke, 1980).

Talvez a qualidade mais importante do ensaio Trad-MCN, assim como de alguns outros bioensaios

vegetais, é sua capacidade de detectar baixíssimos níveis de toxicidade genética tanto em exposições de curto

termo in situ, quanto em testes in vivo com amostras não concentradas. Isto foi demonstrado em um estudo de

dois anos sobre a genotoxicidade das águas de um reservatório para coleta de água de abastecimento

municipal, e da água tratada proveniente desse reservatório (Ma et al., 1985). Amostras de água eram

coletadas semanalmente e testadas para genotoxicidade e para presença de nutrientes e metais. Os resultados

mais importantes desse estudo demonstraram uma recorrência sazonal na expressão de picos de frequência de

micronúcleos que coincidia com períodos de intensa precipitação e carreamento de solo e água dos campos de

soja e milho ao redor do reservatório. A produção de micronúcleos nas amostras de água tratada seguia a

tendência observada para as amostras do reservatório, mas os picos de frequência eram menores.

Em uma investigação complementar, os ensaios Trad-MCN foram conduzidos conjuntamente com o

teste do micronúcleo em eritrócito de camundongo, e amostras adicionais de um poço raso e um de média

profundidade existentes na mesma área do reservatório foram analisadas (Ma et al., 1987). Um padrão similar

de frequência de micronúcleos seguindo-se a precipitação pesada ou derretimento de neve na bacia do lago

foi detectado pelo ensaio Trad-MCN. Análises das amostras de água dos poços mostraram níveis detectáveis

de compostos orgânicos como cloreto de metileno, diclorebromoetano, tricloroetileno, a tetracloroetileno. Os

testes com eritrócitos de camundongo confirmaram os resultados, embora exposições por 6 meses às amostras

tivessem sido necessárias, enquanto o ensaio Trad-MCN requisesse apenas exposições de 30 hr.

Estes experimentos acima descritos de avaliação da genotoxicidade de águas não podem ser

qualificados como in situ, já que em todos os casos as amostras eram trazidas ao laboratório e ensaiadas sob

condições controladas. Avaliações propriamente in situ de mutagenicidade em ambientes aquáticos somente

tornou-se possível com a introdução do “aquatoon,” um aparato flutuante desenvolvido especificamente para

sustentar material vegetal para exposição a corpos de água. O “aquatoon” foi empregado com sucesso em um

estudo in situ da mutagenicidade dos efluentes de uma fábrica de papel e celulose na margem norte do Lago

Superior, no Canadá (Grant et al., 1992). Os ensaios do micronúcleo e do pêlo estaminal em Tradescantia, e

o ensaio de aberração cromossômica em ponta radicular em Vicia faba L. foram aplicados no córrego que

recebia os efluentes brutos e na baía do lago na qual este córrego desaguava. O ensaio Trad-MCN e o ensaio

com V. faba apresentaram resultados positivos após 24 hrs de exposição em ambos os locais, enquanto o

ensaio Trad-SHM produziu resposta inconclusiva. Além de serem mais sensíveis, os dois ensaios que

apresentaram melhores resultados melhor se adaptaram às condições de experimentação in situ. Isso se deve

ao fato de o material desses ensaios poder ser fixado imediatamente após a exposição, ao passo que o ensaio

Trad-SHM requer longos períodos de recuperação em condições controladas antes da análise, o que traz

dificuldades em condições de campo e durante o transporte das amostras.

Um estudo da genotoxicidade de efluentes industriais no México demonstrou incremento na

frequência de micronúcleos no ensaio Trad-MCN mesmo após diluição tripla dos efluentes (Ruiz et al.,

1992). Da mesma maneira, as lixívias de um aterro sanitário abandonado há 20 anos apresentavam

genotoxicidade após diluições de até 20 vezes, enquanto diluições menores que 10 vezes resultavam em

efeitos tóxicos (Ma et al., 1993a).

A genotoxicidade de águas subterrâneas contaminadas com hidrocarbonetos policlorados (PAHs)

tratadas em uma usina de purificação implantada com o objetivo de descontaminar um dos mais importantes

aquíferos da Áustria, foi avaliada numa série de experimentos com o ensaio Trad-MCN (Helma et al., 1993;

Helma et al., 1994). Os métodos de purificação consistiam de filtração em carvão ativado e irradiação com

luz ultra violeta (UV). Amostras coletadas antes de qualquer tratamento exibiam atividade clastogênica e

dependente da dose após exposições por 24 hrs. Quando tratadas no laboratório com quantidades crescentes

de UV (até 1500 J/m2) estas amostras exibiam aumento na frequência de micronúcleos de forma dose-

dependente em relação à irradiação com UV, enquanto os resultados para o controle de água limpa irradiada

com UV eram negativos. Os parâmetros químicos medidos rotineiramente na usina de purificação indicavam

que as amostras filtradas em carvão ativado apresentavam qualidade de água potável. Em muitos casos,

contudo, maiores frequências de micronúcleos foram registradas nessas amostras, tanto antes quanto após

irradiação com UV. O mecanismo responsável por esses efeitos era provavelmente a ativação pela luz UV de

poluentes da água a compostos genotóxicos. Tal conclusão se baseia no fato de a clastogenicidade das

amostras irradiadas decrescer com a estocagem das amostras, com uma meia-vida de aproximadamente 1 dia.

Os autores sugeriram que tratamentos similares com UV para águas de abastecimento poderiam produzir

compostos perigosos que pudessem passar sem serem detectados nas estações de tratamento (Helma et al.,

1993; Helma et al., 1994).

Estudos sobre poluição aquática demonstram as aptidões e vantagens do ensaio Trad-MCN para a

avaliação in situ de agentes genotóxicos no ambiente. A capacidade de detectar efeitos biológicos em

amostras consideradas puras em análises químicas e a possibilidade de se evitarem os tediosos procedimentos

de concentração de amostras, que podem resultar em perdas ou alteração nos compostos presentes, são

características especialmente convenientes do método.

A Tabela 2 apresenta um resumo dos resultados obtidos com o ensaio Trad-MCN na avaliação de

poluentes do ambiente aquático.

Tabela 2 - Resumo dos resultados de avaliações de genotoxicidade de poluentes no ambiente aquático empregando o ensaio Trad-MCN de Tradescantia.


exposição-max.

Concentração +/-



Poluição da água

Água de abastecimento

público

30 hrs + p < .05 Tanto água do reservatório quanto na torneira produziram picos de frequência seguindo-se à estação chuvosa.

Ma et al., 1985

Água de abastecimento

público

30 hrs + Águas do reservatório e de poços de média e pequena profundidades foram analisadas. A frequência de micronúcleos aumentou em seguida à estação chuvosa.

Ma et al., 1987

Exposição in situ no Lago

Superior (Canadá)

24 hrs + p < .05 Águas do Lago Superior do córrego afluente poluído por efluente de fábrica de papel e celulose.

Grant et al., 1992

Águas residuárias

30 hrs Diluição tripla + p < .01 Efluentes industriais presentes. Respostas positivas ocorreram ao longo de todo o ano.

Ruiz et al., 1992

Lixívia de aterro sanitário

Diluição de 20 vezes

+ Ma et al., 1993


exposição-max.

Concentração +/-



Águas subterrâneas

30 hrs

Diluição tripla + p < .05 Águas subterrâneas contaminadas com PAHs. Tratamento com luz UV aumentou a clastogenicidade.

Helma et al., 1993; Helma et

al., 1994

1.2.3 Contaminantes e acondicionantes do solo Vários estudos têm avaliado a mutagenicidade de solos in situ, de extratos de solos de áreas

contaminadas, antes e depois da aplicação de medidas de remediação, e de materiais acondicionantes de solos

propriamente ditos. Talvez o acondicionante edáfico produzido em maiores volumes no mundo seja o lodo de

esgoto municipal. Em geral o impacto desse material no ambiente se relaciona à sua contaminação por metais

pesados (L'Hermite & Dehandtschttler, 1980), mas compostos orgânicos complexos são muitas vezes

introduzidos nos sistemas de tratamento de esgotos. A possível mutagenicidade desses lodos foi avaliada em

Chicago (EUA), utilizando dois bioensaios vegetais (pólen ceroso em Z. mays e Trad-MCN) e duas linhagens

de Salmonella no teste de Ames (Hopke et al., 1982). Os ensaios demonstraram que diluições quádruplas de

lodo ainda eram capazes de aumentar a frequência de micronúcleos em Tradescantia. Este resultado foi

corroborado pelos outros testes, e serão discutidos em maiores detalhes na seção sobre ensaios com Z. mays.

A clastogenicidade de vários compostos químicos comumente encontrados em depósitos de resíduos

perigosos foi estudada com o ensaio Trad-MCN, numa série de experimentos cujo objetivo era elucidar as

possíveis interações sinergísticas ou antagonísticas dos compostos quando ocorrendo em misturas (Sandhu et

al., 1989). Inicialmente sete compostos selecionados da Lista de Compostos Prioritários da Environmental

Protection Agency (EPA) dos EUA (Waters et al., 1987) foram testados para determinar suas mínimas doses

efetivas (MEDs). Cinco dos compostos testados produziram resultados positivos e foram listados em ordem

decrescente de potência no ensaio Trad-MCN como segue: tetracetato de chumbo em dimetilsulfóxido

(DMSO) (0,4 ppm), heptacloro em DMSO (2,0 ppm), dieldrim em DMSO (3,8 ppm), trióxido de arsênico em

NaOH (4,0 ppm), e 1,2-benz[a,h]antraceno em etanol (12,5 ppm). Tetracloro etileno (TCE) e aldrin foram

imiscíveis em água, impedindo exposição adequada em solução. Quando expostos na forma gasosa a 30 ppm

por 2 hrs, TCE apresentou resposta positiva, mas aldrin não.

De posse desses resultados, Ma et al. (1992a) avaliaram a clastogenicidade dos compostos em

misturas. Todas as misturas de TCE (um agente não clastogênico) e dieldrin (em concentrações abaixo da

MED) resultaram positivas, sugerindo uma interação sinergística. Surpreendentemente todas as misturas de

tetracetato de chumbo e trióxido de arsênico (ambos potentes agentes clastogênicos) foram negativas,

sugerindo uma interação antagonística. As outras combinações eram em geral levemente antagonísticas,

enquanto algumas misturas eram tóxicas, impedindo o desenvolvimento normal das tétrades. Essas complexas

e frequentemente imprevisíveis respostas induzidas por misturas de compostos químicos levaram os autores a

concluir que avaliações in situ são necessárias quando vários compostos interagem, como normalmente

acontece em depósitos de resíduos perigosos.

Gill & Sandhu (1992) expandiram esses estudos testando os mesmos compostos após incorporação

no solo, o que permitiu o uso de Tradescantia intacta (inclusive raízes), não apenas dos talos. A maioria dos

resultados concordavam com os descritos acima, mas em alguns casos as interações no solo alteraram a

expressão da clastogenicidade. Por exemplo, trióxido de arsênico e tetracetato de chumbo, embora não

induzissem aumentos na frequência de micronúcleos em solução (como em Ma et al., 1992a), o fizeram no

solo. Em geral plantas enraizadas produziram maiores frequências de micronúcleos que apenas talos tratados

em solução. Possíveis razões para esse efeito são aumento de eficiência na ativação metabólica das misturas

no sistema radicular das plantas ou por microrganismos do solo . Estes resultados demonstraram novamente

que predizer as atividades genotóxicas de misturas de compostos a partir da análise de seus componentes

pode ser uma falácia, enfatizando o valor das avaliações in situ.

A importância dessas conclusões foi acentuada pela demonstração que ácidos tânicos podem agir

como sinergistas na indução de clastogenicidade em Tradescantia (Knasmuller et al., 1992). Exposição de

Tradescantia por 24 hrs a quantidades crescentes de ácidos tânicos causou um aumento dramático e

dependente da dose, nos efeitos clastogênicos de raios-X (35 rad), enquanto ácidos tânicos por si só

mostraram apenas genotoxicidade moderada. Resultados similares foram obtidos com ácidos tânicos em

combinação com outros compostos químicos. Este resultado pode se revestir de grande importância, pois

ácidos tânicos estão presentes na maioria dos alimentos e bebidas, assim como em águas e solos naturais.

Consequentemente, praticamente todo produto químico liberado no ambiente pode interagir com, e ser

potencializado por, ácidos tânicos.

O valor do ensaio Trad-MCN como uma ferramenta na avaliação ambiental foi novamente

enfatizado num estudo das medidas de bioremediação num depósito de resíduos perigosos (Baud-Grasset et

al., 1993a; Baud-Grasset et al., 1993b). Solos pesadamente contaminados com creosoto (mais de 5.000 ppm

de PAHs) foram incubados com o fungo degradador de lignina Phanerochaete chrysosporium Burdsall por 8

semanas, e os extratos aquosos desses solos foram estudados com o ensaio Trad-MCN. Extratos dos solos

pré-incubação eram altamente clastogênicos. P. chrysosporium causou uma diminuição na contaminação,

duplicando a concentração de extrato de solo necessária para induzir uma frequência de micronúcleos similar

àquela previamente à incubação (de 1 para 2%). Novamente o ensaio Trad-MCN mostrou-se

extraordinariamente sensível, permitindo a detecção de diferenças entre amostras proximamente comparáveis.

Os resultados obtidos com Tradescantia na avaliação de contaminantes do solo estão resumidos na

Tabela 3.

Tabela 3 - Resumo dos resultados de avaliações de genotoxicidade de contaminantes do solo empregando o ensaio Trad-MCN de Tradescantia.


exposição-max.

Concentração +/-



Contaminantes de solo

Lodo de esgoto 24 hrs Diluição quádrupla

+ Hopke et al., 1982

Aldrin 30 hrs 2.0-36 ppm - p < .05 Sandhu et al.,

1989

Tetracloro etileno

2 hrs 30 ppm + p < .05 Positivo somente quando exposto na forma gasosa.

″

Trióxido de arsênico

30 hrs 3.96 ppm + p < .05 Diluído em NaOH. ″

1,2-benz[a,h] antraceno

30 hrs 12.5 ppm + p < .05 Diluído em etanol. ″


exposição-max.

Concentração +/-



Dieldrin

30 hrs 3.81 ppm + p < .05 Diluído em DMSO. ″

Heptacloro 30 hrs 1.88 ppm + p < .05 Diluído em DMSO. ″

Tetracetato de chumbo

30 hrs 0.44 ppm + p < .05 Diluído em DMSO. ″

Solo de depósito de

resíduos perigosos

30 hrs 0.5% extrato aquoso

+ p < .05 Mais de 5000 ppm de PAHs.

Baud-Grasset et al., 1993a, b

1.2.4 Pesticidas e produtos de saúde Plantas são os receptores biológicos diretos dos pesticidas aplicados no campo. Consequentemente,

não surpreende a atenção devotada aos estudos de toxicologia genética de pesticidas em plantas. Uma extensa

revisão da genotoxicidade de pesticidas em plantas superiores (Sharma & Panneerselvan, 1990) listou um

total de 178 ingredientes ativos testados em pelo menos um de 31 espécies vegetais diferentes, empregando

uma variedade de órgãos e parâmetros genéticos. Aproximadamente 30% dos compostos foram considerados

genotóxicos, enquanto apenas 6% puderam ser considerados inócuos nesses termos.

Tradescantia aparece somente uma vez nessa revisão, indicando que esse ensaio não está entre os

preferidos para avaliação da toxicidade genética de pesticidas, a despeito de sua sensibilidade e propriedade

para avaliações em campo. As primeiras referências ao uso de Tradescantia para testar a genotoxicidade de

pesticidas envolveram as atividades citológicas do inseticida mevinfós e o herbicida cianazina (Ahmed &

Grant, 1972b), e o fungicida para tratamento de sementes Panogen 15® (metilmercúrio diciandiamida)

(Ahmed & Grant, 1972a). Nesses casos testou-se a aberração cromossômica em mitose de pontas radiculares.

Ahmed & Grant (1972b) mostraram que mevinfós e cianazina induziam aumentos na frequência de

aberrações, mas as doses estudadas foram muito elevadas, (200 a 600 ppm), consideradas muito extremas em

termos de contaminação ambiental. Por outro lado, doses de apenas 10 ppm de Panogen 15® causavam

citotoxicidade, enquanto genotoxicidade óbvia era notada com apenas 1 ppm (Ahmed & Grant, 1972a). Estes

resultados apontam para possíveis riscos significativos à saúde nas operações de preparo de calda e aplicação,

nos tempos em que este produto era comercialmente disponível.

Reconhecendo o mérito especial de se estudar agroquímicos in situ, Grant (1982) opinou que

nenhum outro organismo seria tão útil quanto Tradescantia e não haveria qualquer teste tão adequado quanto

o ensaio Trad-MCN para a avaliação dos riscos genéticos in situ. Estas afirmações foram verificadas em um

estudo da genotoxicidade do inseticida malation usado no controle de pragas em uma casa de vegetação (Ma

et al., 1983). Em um tratamento, vasos com plantas intactas foram pulverizadas, simulando o controle

convencionalmente usado. Tratamentos adicionais envolveram absorção de malation pelos talos (com ou sem

prévia dissolução com DMSO ou tratamento com a fração microssômica S-9 de fígado macerado de

camundongo induzido com Aroclor™), e exposição de plantas intactas a vapores de malation gerados por

aquecimento em câmaras hermeticamente fechadas. Todas as exposições a soluções de malation, seja

pulverizado ou absorvido pelo talo, foram negativas. Já os talos expostos a vapores de malation sofreram um

significativo aumento na frequência de micronúcleos, sugerindo que formas gasosas do pesticida podem ser

particularmente efetivas (Ma et al., 1983).

As clastogenicidades do Benlate® (benomil) e do tiofanato, dois fungicidas usados na conservação de

frutos para armazenagem, foram estudadas com o ensaio Trad-MCN em concentrações de 0.05 e 0.07%,

respectivamente (Huang & Chen, 1993b; Huang & Chen, 1993c). Ambos agentes induziram altos níveis de

micronúcleos.

Os resultados obtidos até o presente da genotoxicidade de pesticidas em Tradescantia são resumidos

na Tabela 4.

Tabela 4 - Resumo dos resultados de avaliações de genotoxicidade de pesticidas selecionados empregando o ensaio Trad-MCN de Tradescantia.


exposição-max.

Concentração +/-



Pesticidas Mevinfós 3-12 hrs 200-600 ppm + p<.001 Mitose em ponta radicular. Ahmed and

Grant, 1972a

Cianazina 3-12 hrs 200-600 ppm + p<.001 Mitose em ponta radicular. ″

Panogen 15® (mercurial)

1-3 hrs 1 - 5 ppm + p < .05 Mitose em ponta radicular. Ahmed and Grant, 1972b


exposição-max.

Concentração +/-



Malation 6 hrs 5.5-1650 ppm - p < .05 Absorção pelo talo e pulverização.

Ma et al., 1983

Malation 6 hrs 0.25-0.65% + p < .05 Fumaça gerada por calor. ″

Diclorvós 1-6 hrs + Inseticida Ma and Harris, 1987

Benlate 0.05% + Huang and

Chen, 1993a,b

Tiofanato 0.07% + ″

Ma et al. (1984) apresentaram os resultados de 140 ensaios Trad-MCN realizados com uma

variedade de agentes físicos e químicos. Os agentes foram classificados em 9 categorias (números entre

colchetes indicam o número de agentes testados na categoria): (a) agentes reconhecidamente

carcinogênicos/mutagênicos [15], (b) bebidas comuns [8], (c) produtos químicos comuns [30], (d) drogas

comuns [32], (e) pesticidas [18], (f) produtos químicos de uso doméstico [16], (g) radiação ionizante e

radioisótopos [3], (h) monitoramento in situ [13], e (i) misturas químicas complexas [8]. Alguns resultados

positivos nesses grupos foram: (a) benzo«α»pireno (50 μM), EMS (50mM), e azida sódica (0,2 mM); (b)

etanol (5%), café descafeinizado (25%), e cola (50%); (c) vapores de formaldeído, óxido nitroso e dióxido de

enxofre; (d) sacarina, aspirina; (e) Bladex® (cianazina), dicamba, vapores de diclorvós, hidrazida maléica, p-

diclorobenzeno, Tordon® (picloran); (f) alguns odorizantes e cosméticos; (g) todas formas de radiação; (h)

vários locais poluídos; e (i) vários tipos de gases de combustão e amostras de água não concentradas. Entre

os resultados negativos encontravam-se (a) 1,2-benzantraceno, metil metanosulfonato e dinitrotolueno; (d)

mitomicina C; e (e) atrazina, simazina e 2,4-D. De 39 agentes testados com o ensaio Trad-MCN e para os

quais haviam resultados disponíveis de testes de Ames, 26 forneceram os mesmos resultados, representando

uma congruência de 67%. Para pesticidas, 11 de 18 agentes testados resultaram positivos. De 8 pesticidas

testados tanto em Trad-MCN quanto no teste de Ames somente simazina forneceu resultados diferentes nos

dois testes (Ma et al., 1984).

Os resultados disponíveis de avaliações das propriedades clastogênicas de agentes químicos

selecionados e estresses fisiológicos em Tradescantia são apresentados na Tabela 5.

Tabela 5 - Resumo dos resultados de genotoxicidade de agentes químicos selecionados e estresses fisiológicos em Tradescantia.


exposição-max.

Concentração +/-



Agentes químicos selecionados

EMS 24 hrs 50-100 mM + Soluções aquosas absorvidas pelos talos.

Ma, 1979

9 categorias químicas

140 compostos estudados, sendo 52 positivos, 20 no limiar, e 5 tóxicos.

Ma et al., 1984

Estresses fisiológicos Anaerobiose 12-48 hrs Max. 2%

de oxigênio + Aumento em aberrações

cromossômicas, incluindo micronúcleos em micrósporos.

Steinitz, 1944

Deficiência de magnésio

contínuo < 1 ppm + p<.001 Replicação cromossômica anormal e micronúcleos na meiose.

Steffensen, 1953

Deficiência em sulfato

contínuo 4.0 ppm + Idem ao anterior. Steffensen, 1954

Deficiência

em cálcio contínuo 2.5 ppm + p<.001 Idem ao anterior. Steffensen,

1955

1.2.5 Raios cósmicos e campos eletromagnéticos T. paludosa foi utilizada para estudar os efeitos potenciais de fatores associados com vôo espacial,

como aceleração, vibração, falta de gravidade e radiação ionizante (Delone et al., 1986). As inflorescências

foram fixadas quimicamente a vários intervalos de tempo desde o lançamento da nave até após a

aterrissagem, e as figuras mitóticas dos micrósporos foram analisadas em termos de aberrações. Um tipo

especial de aberração foi observado nesse material, consistindo de translocações não-recíprocas complexas e

fragmentos esféricos. O surgimento de tais aberrações não estava associado com a duração do vôo, ou com

lançamento ou aterragem. Especulou-se que o agente causativo seria o pesado bombardeio por radiação

cósmica (Delone et al., 1986).

A sensibilidade de Tradescantia a radiação tem sido demonstrada em relação a raios-X, fontes

radioisotópicas internas e externas, e raios cósmicos. Similarmente, ondas longas de rádio e campos

magnéticos de ondas curtas presentes nas vizinhanças de antenas de transmissão têm sido constatados como

danosos a cromossomos em replicação. Em uma série de experimentos in situ (Haider et al., 1994), talos de

Tradescantia foram expostos em cinco distâncias de uma antena, e em gaiolas plásticas (não isolante) e de

Faraday (isolante eletromagnético) distribuídas ao derredor de locais que excediam os padrões para campos

elétricos da Associação Internacional de Proteção a Radiação. Todos os tratamentos resultaram em

incrementos na frequência de micronúcleos quando comparados com os controles de laboratório, e, mais

importante, comparações entre amostras de gaiolas isolantes e não isolantes resultaram em diferenças

altamente significantes (Haider et al., 1994). Este resultado é particularmente interessante, uma vez que

ambos os grupos foram expostos a exatamente as mesmas condições ambientais, exceto pela influência da

radiação eletromagnética. Uma relação dependente da dose com respeito a distância de exposição também

suporta a conclusão de que os efeitos observados eram realmente devidos ao campo eletromagnético.

As atividades clastogênicas de raios-X e outras formas de radiação ionizante em Tradescantia estão

resumidas na Tabela 6.

Tabela 6 - Resumo dos resultados de genotoxicidade em Tradescantia com especial referência a raios-X e outras formas de radiação ionizante.


exposição-max.

Concentração +/-



Radiação Raios-X 8 min 75-200 rad + Quebras (”breaks”) nos

cromossomos, principalmente em mitose.

Sax, 1938

Raios-X ~5 min 77-416 rad + p < .05 Aberrações cromossômicas nos tubos polínicos e micrósporos,

Kirby-Smith and Daniels,

1953

Raios-γ de 60Co

30 min 100-400 rad + p < .01 e significância medida por coeficientes de ajuste exponencial dos dados.

″


exposição-max.

Concentração +/-



Raios-β de 32

P 20 min 100-400 rep + p < 0.1 ″

Raios-γ de

60Co 16 d 0.41 rad + p<0.05 Micronúcleos em

micrósporos. Sparrow and

Singleton, 1953

Raios-X em células tratadas

com 5-FUdR

36 hrs 5-FUdR +

2 min raios-X

100 rad + 10-6 M 5-FUdR

+ p < .05 Atraso mitótico resultando em número reduzido de trocas e quebras nas cromátides.

Rushton, 1969

Raios-X segundos 20-40 rad + Relação dose-efeito positiva para micronúcleos.

Ma, 1979

Raios-X segundos 10-58 rad + Coeficiente de correlação para dose-efeito 0.995

Ma et al. 1980

Raios-X + ácidos tânicos

12 hrs 35 rad raios-X +

0.1-1.0 mM ácidos tânicos

+ Interação sinergística, relação dose-efeito positiva.

Knasmuller et al., 1992

Raios cósmicos

exposição in situ em

satélite espacial

+ Aberrações cromossômicas incomuns, como translocações não-recíprocas e fragmentos esféricos.

Delone and Antipov, 1986

Radiação em frequência de

rádio

30 hrs Elétrica 40-170 V/m Magnética-

.01-.11 A/m

+ p < .05 Micronúcleos em tétrades, talos em gaiolas de Faraday não diferiam dos controles laboratoriais.

Haider et al., 1994

Em um estudo recente apoiado pelo Programa Internacional de Segurança Química a utilidade do

ensaio Trad-MCN (juntamente com outros três ensaios vegetais) foi avaliada com quatro compostos

genotóxicos conhecidos (Grant & Salamone, 1994) em cinco diferentes laboratórios (Sandhu et al., 1994a;

Sandhu et al., 1994b). Embora os resultados não tenham sido idênticos, houve boa concordância entre todos

laboratórios, sugerindo que o ensaio Trad-MCN é um bioensaio confiável para agentes clastogênicos (Ma et

al., 1994b).

Os estudos revisados neste estudo demonstram que Tradescantia, e em particular o ensaio Trad-

MCN, oferece um sistema muito sensível e facilmente manuseável para avaliações de toxicidade genética,

especialmente para condições in situ indispensáveis em pesquisas ambientais. O desempenho alcançado em

tal variedade de situações e os níveis de contaminação extremamente baixos detectados com sucesso nesses

testes justificam a escolha desse sistema como o bioindicador para os estudos que se seguem.

1.3 Avaliação de um programa de MIP com o ensaio Trad-MCN A indução de mutações é apenas um dos muitos impactos ambientais de pesticidas (Durham &

Williams, 1972; Epstein & Legator, 1971; Yoder et al., 1973). A maioria dos pesticidas é capaz de induzir

mutações em pelo menos um tipo de bioensaio (Laborda et al., 1985; Sharma & Panneerselvan, 1990; Waters

et al., 1982), embora algumas vezes em doses muito acima daquelas observadas em condições de campo,

especialmente se consideradas as diluições a que os compostos são sujeitos imediatamente após a aplicação.

Os experimentos apresentados nas seções que se seguem são uma tentativa de estimar in situ e sob condições

normais da boa prática agrícola, a genotoxicidade de pesticidas e seus resíduos. Em particular, avalia-se o

possível abatimento de tais efeitos genotóxicos por meio de reduções nas doses alcançadas através de um

programa de MIP (Rodrigues et al., 1998a).

O primeiro passo dessa avaliação foi uma análise da genotoxicidade dos pesticidas aplicados no

campo (in situ), seguido de uma estimativa da atividade genotóxica remanescente no solo brevemente após a

pulverização, e um estudo das propriedades clastogênicas das formulações comerciais empregadas. Tais

avaliações requerem uma aproximação eminentemente in situ, e necessitam de alta sensibilidade para permitir

a detecção de níveis muito baixos de contaminação, como ocorre, por exemplo, em extratos de solos. Como

discutido nas seções prévias, o ensaio Trad-MCN atende estes requisitos, e então foi escolhido como o

bioindicador para este segmento do estudo. Outros ensaios empregando outras espécies vegetais foram

conduzidos para aferir in situ os resultados obtidos com o ensaio Trad-MCN, e serão apresentados e

discutidos adiante.

1.3.1 O programa de MIP em estudo O desenvolvimento de procedimentos agrícolas direcionados à redução do uso de pesticidas tem sido

um objetivo de pesquisa muito explorado (Bottrell, 1979; Pimentel, 1993; Pimentel et al., 1993; Smith et al.,

1976; Smith & van den Bosch, 1967) e uma meta algumas vezes estabelecida como política nacional em

certos países (Hurst et al., 1992). Talvez a iniciativa de maior sucesso para a redução do uso de pesticidas, em

termos de aceitabilidade pelos agricultores e consequente adoção em larga escala, seja a integração de

práticas químicas, físicas e biológicas comumente referida como manejo integrado de pragas (MIP) (Bottrell,

1979; Kuhr, 1994; Pimentel, 1991b). A efetividade do MIP para reduzir os impactos ambientais de pesticidas

não pode ser colocada em dúvida (Pimentel, 1991a; Pimentel & Andow, 1984). Em geral, medidas de MIP

efetivamente reduzem impactos ambientais através da atenuação da contaminação de solos e águas (Pimentel

& Levitan, 1986), da diminuição das perdas de inimigos naturais das pragas e de animais silvestres, e da

redução dos envenenamentos de animais domésticos (Pimentel et al., 1992), e através da minimização da

exposição de seres humanos no local de trabalho ou através de alimentos contaminados (Culliney et al.,

1992).

A pesquisa sobre MIP normalmente envolve a seleção de técnicas apropriadas de manejo da cultura

e controle de pragas, doenças e plantas invasoras, tomando em consideração características regionais e locais

de clima e solo, e a aplicação dessas técnicas em um programa integrado (Bottrell, 1979; Pimentel, 1985).

Um componente adicional crucial comumente anexado à pesquisa em MIP é a manutenção de campos de

demonstração como uma ferramenta para difusão das tecnologias implementadas para os agricultores. Um tal

campo de demonstração foi estabelecido na fazenda experimental Musgrave, da Universidade Cornell, em

Ithaca, NY, EUA, como parte do projeto de pesquisa “Programa de manejo integrado para produção de

milho” (Bergstrom et al., 1992; Bergstrom et al., 1993; Bergstrom et al., 1994). Este campo de demonstração

foi o local escolhido para a série pressente de experimentos.

1.4 Material e métodos

1.4.1 Campo experimental estudado O projeto de pesquisa e demonstração para produção de milho, no qual os presentes experimentos

foram realizados, foi idealizado e conduzido por quatro anos (1994) para testar um conjunto de práticas de

manejo que envolvia rotação de culturas (milho contínuo, soja contínua, e milho-soja alternadamente em

safras consecutivas), vários sistemas de aração e preparo do solo, e três níveis de tratamento químico

(Bergstrom et al., 1992). O projeto ocupava uma área de aproximadamente 4,500 m2 separada em três blocos,

cada qual direcionado para a incorporação de um tipo de manejo em teste. Como na presente pesquisa

somente os níveis de tratamento químico eram de interesse, a parcela experimental consistiu de três sub-

parcelas representando três áreas de amostragem independentes. Os estudos in situ e as amostragens de solo

ocorreram nos anos de 1993 e 1994, então após pelo menos dois anos de pulverizações de rotina, como

previsto no projeto.

As parcelas de milho contínuo foram escolhidas para experimentação a fim de assegurar consistência

em relação aos tratamentos químicos sendo feitos previamente e durante o estudo. Os tratamentos de

pesticidas aplicados à parcela de milho contínuo consistiam de: a) nível alto de tratamento - tratamento de

sementes (captan) + tratamento triplo de semente do agricultor (carboxin+diazinon+lindane); inseticida de

solo (clorpirifós); e controle de invasoras com aplicação convencional de herbicida (cianazina+metolaclor);

b) nível médio de tratamento - tratamento de sementes (captan) + tratamento duplo de semente do agricultor

(captan+diazinon); e controle de invasoras com aplicação de herbicidas em bandas, na linha de cultivo; c)

nível baixo de tratamento - tratamento de sementes apenas, sem qualquer aplicação de pesticidas em campo

(Tabela 7).

Tabela 7 - Níveis de tratamento com pesticidas e detalhes das formulações aplicadas nas parcelas de milho contínuo avaliadas quanto a genotoxicidade com o ensaio Trad-MCN.

Manejo Nível de tratamento com pesticida

Observações

Baixo

Médio

Alto

Nome comercial/ Produtor

Ingrediente ativo (i.a.)

Formulação / taxa de

aplicação de i.a.

Tratamento de sementes

Comercial + + + captan Agricultor - duplo + Agrox 2 vias

Agway™ captan+diazinon 37 + 25%

apr. 1.5 g/kg

Agricultor - triplo + Agrox DL-Plus Agway™

carboxin+ diazinon/lindane

14 + 15 + 25% apr. 1.4 g/kg

Inseticida de solo + Lorsban® 15G

DowElanco™ clorpirifós Granular

1.12 kg/ha

Controle de invasoras

Cultivo 2x 1x

Herbicida em bandas + Bladex® 90DF Shell™ e

Dual® Ciba™

cianazina+ metolaclor

Grânulos disp. em água

2.7 kg/ha Conc. Emul.

Manejo Nível de tratamento com pesticida

Observações

Baixo

Médio

Alto

Nome comercial/ Produtor

Ingrediente ativo (i.a.)

Formulação / taxa de

aplicação de i.a.

2.34 L/ha

Herbicida convencional + Bladex® 90DF Shell™ e Dual®

Ciba™

cianazina+ metolaclor

Grânulos disp. em água

2.7 kg/ha Conc. Emul.

2.34 L/ha O plantio ocorreu aos finais de abril sob condições favoráveis de tempo. O tratamento de sementes

foi realizado no campo, seguindo-se imediatamente o plantio e aplicação de pesticidas com equipamento

tracionado por trator. Amostras de solo foram coletadas antes e depois da pulverização e talos de

Tradescantia foram expostos ao campo tratado imediatamente após o vencimento do intervalo de entrada

restrita (REI) para os produtos, ou seja, 12 hrs.

1.4.2 Linhagem de Tradescantia, manutenção e condições gerais de experimentação O clone 4430 de Tradescantia foi obtido da cultura do Dr. Shahbeb S. Sandhu, da Genetic

Toxicolgy Division, Health Effects Research Laboratory, da US EPA em Research Triangle Park. O clone

4430 é um híbrido diplóide entre T. hirsutiflora Bush (2461C) de flor azul e T. subacaulis Bush (2441) de

flor cor de rosa (Schairer & Sautkulis, 1982). Este clone é especialmente adequado para experimentação em

laboratório e foi descrito em detalhe por (Emmerling-Thompson & Nawrocky, 1980). Devido ao fato de ser

estéril, não há risco de se perder a identidade e pureza genética do clone 4430 por recombinação, e sua

heterozigose para cor da flor permite seu emprego para ambos os testes, Trad-MCN e Trad-SHM (Ichikawa,

1992; Ma, 1988).

Uma população de aproximadamente 500 plantas maduras contendo uma média de 4 a 6 talos em

diferentes estágios de desenvolvimento foi mantida durante o período experimental. Tal população era grande

o suficiente para produzir ao menos 200 talos em excelentes condições para exposição uma vez a cada duas

semanas. As plantas foram mantidas em casas de vegetação ventiladas com ar filtrado em carvão ativado e

Purafil® numa temperatura de 27/21 ± 2oC (dia/noite), com iluminação suplementar fornecida por lâmpadas

multivapor GE™ MVT-400 a fim de garantir um ciclo de 17 hrs de iluminação diária ao longo do ano. As

plantas eram cultivadas em vasos de papelão reciclável de 12,5 cm contendo uma mistura de solo-turfa de

musgo-vermiculita (Cornell Mix, Boodley & Sheldrake, 1982) suplementada com fertilizante de liberação

controlada Osmocote® e micronutrientes. Em geral as plantas eram aguadas dia sim dia não e recebiam uma

solução diluída de nutrientes semanalmente. Em cada colheita de talos para experimentação (a cada duas

semanas) todos os vasos eram cuidadosamente inspecionados e as plantas podadas, a fim de mantê-las limpas

e livres de pragas. Nenhum pesticida foi aplicado sobre ou próximo às plantas durante o período

experimental.

Em cada experimento, 15 a 20 talos (por tratamento por réplica) de Tradescantia contendo

inflorescências jovens eram coletados 24 hrs antes do início dos tratamentos e transferidos para câmaras de

ambiente controlado. Estas câmaras eram ventiladas com ar filtrado em carvão ativado e Purafil® ajustadas

com fluxo de 6 m3 min.-1, resultando em ao menos duas trocas totais de ar por min; e equipadas com

lâmpadas de sódio de alta pressão GE™ LU-400 Lucalux e lâmpadas de multivapor de haletos metálicos

MVR-400 fornecendo 800 watts m-2 ao nível das plantas. As condições ambientais eram controladas com

temperaturas de 21/19 ± 0,2oC dia/noite, 65/70% de umidade relativa para dia/noite, e um ciclo diário de

iluminação de 17 hrs.

Previamente às exposições os talos eram mantidos em frascos tipo beaker contendo água deionizada

sob constante aeração com ar filtrado para um período de adaptação de 24 hrs. Toda planta murchando era

eliminada nesse momento, sendo que somente talos túrgidos e com inflorescências em expansão seriam

tratados. Todas as exposições foram realizadas diluindo-se os agentes a serem testados em solução nutriente

de Hoagland (Downs & Hellmers, 1975) triplamente diluída, a qual também correspondia ao controle

negativo em todos os experimentos. O controle positivo foi representado por tratamento por 30 hrs (sem

período de recuperação) com uma solução contendo 100 ppm de metanosulfonato de etila (EMS- Sigma Co.).

A menos que diferentemente mencionado, exposições de 30 hrs seguidas imediatamente por fixação das

amostras (sem período de recuperação) foram sempre realizadas. Este procedimento é recomendado quando

baixas concentrações de ingredientes ativos são testados (Ma, 1988).

Após o tratamento as inflorescências eram removidas dos talos e fixadas em solução 1:3 (v/v) de

ácido acético:etanol por 24 hrs e então preservadas em etanol 70% (v). Para contagem de micronúcleos as

inflorescências eram removidas, os botões jovens abertos, e as anteras maceradas sobre uma lâmina de

microscópio em solução de corante aceto-carmim (preparado por fervura de 0,5 g de carmim em 100 ml de

ácido acético 45% v). Após posicionar a lamínula, a lâmina era aquecida repetidamente a aproximadamente

80oC e gentilmente pressionada entre folhas de papel absorvente para remover o excesso de corante (Ma,

1988). A contagem era realizada sob magnificação de 400x, anotando-se o número de micronúcleos presentes

num grupo aleatório de 300 tétrades jovens, em 5 lâminas (Ma, 1979b; Ma, 1981), obtendo-se uma população

estatística de 1,500 tétrades por tratamento. As lâminas foram sempre codificadas e analisadas pelo mesmo

observador, com o código sendo revelado somente após todos os tratamentos serem contados.

Neste método, cada botão contendo as tétrades jovens apropriadas para contagem (uma lâmina

válida) é considerado uma população amostral, com botões dos outros talos representando as réplicas de um

grupo experimental ou tratamento. Foi realizada uma análise de variância (ANOVA) do número de

micronúcleos/100 tétrades, e as médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste t de Student assumindo

distribuição bicaudal (nenhuma tendência assumida a priori nos dados) e α=0,01.

1.4.3 Amostragem, extração e avaliação em solos Quatro amostras de cada parcela de tratamento com pesticida s foram coletadas dos 5 cm superficiais

e conservadas em sacos de papel a -20oC. Assim que possível após a coleta, porções iguais de cada amostra

foram combinadas para extração, moídas em pistilo e peneiradas em uma combinação de peneiras de 1,168

mm e 420 μm (14- e 35-mesh). A extração consistiu em agitar 1 parte de solo com 2 partes de água

deionizada (p/v) em mesa rotatória por 24 hrs. A mistura foi então centrifugada por 20 min. a 2400 rpm e o

líquido supernadante recebeu os talos de Tradescantia para tratamento imediatamente e sem diluição.

1.4.4 Ensaio com formulações comerciais As três formulações comerciais de pesticidas aplicados ao campo (Tabela 7) foram avaliadas para

genotoxicidade em condições de laboratório. Lorsban® 15G (clorpirifós) nome químico (IUPAC) O,O-dietil

O-3,5,6-tricloro-2-piridil fosforotioato, Bladex® 90DF (cianazina) nome químico (IUPAC) 2-(4-cloro-6-

etilamino-1,3,5-triazin-2-ilamino)-2-metilpropionitrilo, e Dual® (metolaclor) nome químico (IUPAC) 2-cloro-

6’-etil-N-(2-metoxi-1-metiletil)acet-o-toluidina foram testados a concentrações de ingrediente ativo de 1, 10,

e 50 ppm. Bladex® (cianazina) e Dual® (metolaclor) foram dispersos e emulsificados em solução de Hoagland

nessas concentrações, enquanto devido à natureza insolúvel dos grânulos de Lorsban® contendo clorpirifós, e

à baixa solubilidade desse produto em água (2 mg/L), somente uma concentração nominal de ingrediente

ativo pôde ser assumida para essa suspensão. Talos de Tradescantia foram expostos diretamente por imersão

nessas soluções/suspensão.

1.4.5 Ensaio com exposição in situ Talos de Tradescantia (25/réplica/tratamento) foram trazidos para o campo em frascos tipo beaker

contendo solução nutritiva de Hoagland diluída a 1/3 e em caixas hermeticamente fechadas no dia seguinte à

aplicação dos pesticidas, e foram expostos durante a noite num total de 14 hrs. A fim de aumentar a

volatilização dos pesticidas do solo, o local onde as amostras foram colocadas recebeu aproximadamente 10

L de água imediatamente antes do início da exposição (Prueger & Pfeiffer, 1994).

O tratamento consistiu em colocar os frascos tipo beaker com os talos de Tradescantia sobre a

superfície do solo úmido ao longo das linhas de plantio. Cada frasco foi então coberto com um vaso de PVC

invertido, criando uma câmara simples para proteção e que possivelmente poderia resultar num maior

acúmulo de vapores liberados do solo. Os controles consistiram no revestimento do solo a receber as

amostras com uma folha de plástico, assim isolando a amostra de vapores provenientes do solo. O controle

positivo recebeu uma alíquota de EMS na solução nutritiva produzindo uma solução com 100 ppm EMS

imediatamente antes do início da exposição.

Após o tratamento as amostras foram trazidas para o laboratório, as soluções nutrientes foram

repostas por soluções frescas, e os talos foram mantidos na câmara de ambiente controlado por um período de

recuperação de 24 hrs, a fim de permitir que as células mães dos grãos de pólen expostas em meiose

atingissem o estágio de tétrade, adequado para contagem de micronúcleos. As inflorescências foram então

fixadas e analisadas como descrito anteriormente.

1.5 Resultados A variação observada nos dados para o controle negativo (frequência espontânea de micronúcleos -

mínimo de produção de micronúcleos para uma dada condição) e para o controle positivo (EMS 100 ppm,

que resultava aproximadamente na duplicação do número de micronúcleos em relação ao controle negativo,

com diferenças estatisticamente significantes) representou aproximadamente o máximo de variação observada

nos dados para todos os tratamentos, uma vez que apenas baixas concentrações, baixos níveis de resíduos, e

campos agrícolas apenas marginalmente contaminados foram avaliados. Como as condições de exposição

foram mantidas constantes durante todos os ensaios de laboratório, estes controles podem ser usados para

aferir a sensibilidade (a capacidade do sistema para detectar baixas concentrações de um agente) e a

reproducibilidade (a habilidade de responder consistentemente a um agente) do ensaio Trad-MCN como

empregado nesse estudo.

Quando circunscritas a cada grupo controle estudado (negativo ou positivo) todas as amostras

compartilharam médias similares (com exceção do tratamento in situ que apresentou um leve incremento em

frequência de micronúcleos), enquanto amostras dos diferentes controles foram significativamente diferentes.

Em somente um caso ocorreu que uma amostra do controle negativo não diferiu significativamente de uma

amostra do controle positivo, coincidentemente no mesmo experimento. Este evento é representado pelo eixo

E na Figura 1, e corresponde ao ensaio com a formulação comercial de clorpirifós.

02468

10121416

Controle negativo

Controle positivo

Tratamento

A

B

C

D

E

F

G

H

Figura 1 - Frequências de micronúcleos para os controles positivos e negativos dos ensaios Trad-MCN. O controle negativo representa a frequência espontânea de micronúcleos para o clone 4430 de Tradescantia e consistiu de tratamento com solução nutriente de Hoagland diluída a 1/3; o controle positivo consistiu de solução aquosa de etil metanosulfonato (EMS) a 100 ppm. Os talos de Tradescantia foram expostos por 30 hrs em câmara de ambiente controlado.

O tratamento com EMS induziu um aumento consistente na frequência de micronúcleos para um

nível aproximadamente duas vezes maior que a frequência espontânea para o clone 4430 (de 4,2 ± 1,4 para

10,7 ± 1,9, para n=40). A frequência espontânea de micronúcleos foi também razoavelmente constante, com

exceção do resultado do ensaio com metolaclor (correspondente ao eixo D na Figura 1), no qual ocorreu um

decréscimo na frequência de micronúcleos.

Deve-se enfatizar que a frequência espontânea de micronúcleos observada nos experimentos aqui

descritos está em perfeita concordância com dados disponíveis na literatura, por exemplo em Grant et al.

(1992); Ma, (1981), entre vários outros.

1.5.1 Genotoxicidade de resíduos de pesticidas extraídos do solo Dois ensaios independentes foram realizados com extratos de solos, um para amostras coletadas

antes da aplicação dos pesticidas (correspondendo ao solo pulverizado somente na cultura do ano anterior) e

um para amostras coletadas brevemente após a aplicação. Cada ensaio foi acompanhado por seu próprio

grupo de controles, e todas as condições foram mantidas constantes. Os resultados desses dois ensaios estão

apresentados na Figura 2.

0

2

4

6

8

10

12

14

Controle Baixo Médio Alto EMS

MC

N /

100

tétra

des

1 2 1 2 1 2

Solo não pulverizado

Solo pulverizado

Figura 2 - Produção de micronúcleos em clone 4430 de Tradescantia após exposição a extratos aquosos de solos tratados com pesticidas. As barras representam desvios padrão das médias. Talos de Tradescantia foram expostos por 30 hrs em uma câmara de ambiente controlado. Os resultados representam dois experimentos separados, cada qual com seu próprio grupo de controles. O tratamento controle recebeu apenas solução nutriente (solução de Hoagland a 1/3) e o controle positivo (EMS) consistiu de uma solução de etil metanosulfonato a 100 ppm. Amostras de solo não pulverizado e pulverizado foram coletadas antes e 12 hrs após aplicação de pesticidas, respectivamente. O tratamento “Baixo” não recebeu aplicação, o “Médio” recebeu cianazina + metolaclor em bandas, e o “Alto” recebeu cianazina + metolaclor em aplicação convencional e clorpirifós.

Ambos os controles nos dois experimentos foram similares, atestando que as condições de exposição

e procedimentos de contagem entre os experimentos eram comparáveis. Não houve diferenças

estatisticamente significantes entre os extratos dos diferentes tratamentos para o solo não pulverizado, apenas

o tratamento EMS (controle positivo) apresentou um aumento significativo na frequência de micronúcleos em

relação ao controle nesse experimento. Essa falta de efeito nas amostras não pulverizadas indicava que não

havia agentes endógenos ou compostos antropogênicos residuais nos extratos capazes de induzir

clastogenicidade. Os extratos de solo pulverizado, entretanto, mostraram aumentos significativos na

frequência de micronúcleos para os tratamentos Médio e Alto, em relação ao controle negativo e ao Baixo

tratamento com pesticidas (nenhum pesticidas aplicado em campo, vide Tabela 7).

Embora uma das réplicas do tratamento Alto (Alto 1, Figura 2) não tenha mostrado aumento na

frequência de micronúcleos, as amostras tratadas com pesticidas mostraram diferenças significativas quando

comparadas com as amostras não pulverizadas. Estes resultados indicam que a atividade genotóxica dos

pesticidas podia ser ainda detectada pelo ensaio Trad-MCN mesmo após diluição no solo, seguindo-se ao uso

recomendado pela boa prática agrícola.

1.5.2 Ensaio com formulações comerciais Dos três pesticidas avaliados para clastogenicidade com o ensaio Trad-MCN, os dois herbicidas

(cianazina e metolaclor) apresentaram aumentos significativos na frequência de micronúcleos em relação ao

controle negativo, o que não ocorreu para o inseticida clorpirifós. Entretanto, notou-se um aumento na

frequência de micronúcleos para as doses de 10 e 50 ppm para clorpirifós (Figura 3)

0

2

4

6

8

10

12

14

Controle 1 ppm 10 ppm 50 ppm EMS

MC

N /

100

tétra

des

Figura 3 - Efeitos clastogênicos do inseticida clorpirifós no ensaio Trad-MCN. As barras representam desvios padrão da média. Talos de Tradescantia foram expostos a soluções aquosas de clorpirifós por 30 hrs em uma câmara de ambiente controlado. O tratamento controle recebeu apenas solução nutriente (solução de Hoagland a 1/3) e o controle positivo (EMS) consistiu de uma solução aquosa de 100 ppm de etil metanosulfonato.

O controle negativo nesse experimento resultou em uma frequência de micronúcleos levemente

superior aos níveis normalmente obtidos (Figura 1, eixo 5), o que certamente contribuiu para a falta de

significância estatística nesse ensaio. A comparação entre o tratamento com 1 ppm (que resultou em uma

frequência de micronúcleos similar à espontânea para o clone 4430 de Tradescantia registrada ao longo desse

estudo) e as concentrações mais altas, indicaram um aumento significativo na frequência de micronúcleos

para clorpirifós.

Cianazina mostrou-se um agente clastogênico em concentrações de apenas 10 ppm (Figura 4).

Mesmo a uma dose de apenas 1 ppm notou-se um aumento na frequência de micronúcleos (α=0,05). Já para a

dose de 50 ppm ocorreu um ligeiro decréscimo em relação 10 ppm. Esta tendência foi confirmada quando o

ensaio foi repetido, indicando que cianazina exerce um afeito tóxico para as células mães do pólen de

Tradescantia entre 10 e 50 ppm.

0

2

4

6

8

10

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14

16


MC

N /

100

tétra

des

Figura 4 - Efeitos clastogênicos do herbicida cianazina no ensaio Trad-MCN. As barras representam desvios padrão da média. Talos de Tradescantia foram expostos a soluções aquosas de cianazina por 30 hrs em uma câmara de ambiente controlado. O tratamento controle recebeu apenas solução nutriente (solução de Hoagland a 1/3) e o controle positivo (EMS) consistiu de uma solução aquosa de 100 ppm de etil metanosulfonato.

Uma clara relação dose-efeito foi observada para os efeitos clastogênicos de metolaclor no ensaio

Trad-MCN (Figura 5). Um desvio relativamente grande nas frequências de micronúcleos para amostras

tratadas com pesticidas, contudo, resultaram na ausência de significância na comparação do tratamento com

10 ppm em relação ao controle (p=0,054). Um aumento significativo na frequência de micronúcleos foi

observado para metolaclor na concentração de 50 ppm quando comparado com o controle negativo.

0

2

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MC

N /

100

tétra

des

Figura 5 - Efeitos clastogênicos do herbicida metolaclor no ensaio Trad-MCN. As barras representam desvios padrão da média. Talos de Tradescantia foram expostos a soluções aquosas de metolaclor por 30 hrs em uma câmara de ambiente controlado. O tratamento controle recebeu apenas solução nutriente (solução de Hoagland a 1/3) e o controle positivo (EMS) consistiu de uma solução aquosa de 100 ppm de etil metanosulfonato.

Em conclusão, todos os três pesticidas estudados foram capazes de causar algum grau de

clastogenicidade no ensaio Trad-MCN em concentrações entre 10 e 50 ppm. Estas concentrações estão bem

abaixo daquelas aplicadas conforme as recomendações para uso em campo, e se aproximam daquelas

supostamente encontráveis em solos logo após a aplicação.

1.5.3 Ensaio de exposição in situ Aumentos altamente significativos na frequência de micronúcleos ocorreram quando talos de

Tradescantia foram expostos in situ a campos tratados com pesticidas. Ambos os tratamentos Médio e Alto,

cada um representado por duas réplicas, diferiram do tratamento Baixo (sem aplicação de pesticidas). Com

exceção de uma réplica do tratamento Alto todas as amostras tratadas com pesticidas também apresentaram

um aumento significativo em relação ao controle negativo, que nesse experimento apresentou uma frequência

de micronúcleos relativamente alta. Estes resultados indicam que a hipótese nula de não existência de

diferenças em genotoxicidade entre campos recebendo ou não aplicação de pesticidas deve ser rejeitada

(α=0,01), sugerindo que um aumento na atividade genotóxica ocorre in situ após tratamento do solo com

pesticidas.

Não ocorreram diferenças significativas entre amostras dos tratamentos Médio e Alto (Figura 6), que

apresentaram frequências de micronúcleos maiores que o tratamento com EMS (controle positivo). Embora

esse incremento sobre o controle positivo não tenha sido estatisticamente significativo, isso implica uma

frequência de micronúcleos para as amostras expostas a campos pulverizados superior ao dobro do nível

espontâneo para Tradescantia sob as condições de experimentação.

0

5

10

15

20

25


MC

N /

100

tétra

des

1 2 1 2

Figura 6 - Produção de micronúcleos em Tradescantia (clone 4430) após exposição in situ a campos tratados com pesticidas. As barras representam desvios padrão da média. Talos de Tradescantia foram expostos por 14 hrs, colocando-se os frascos tipo beaker contendo os talos diretamente sobre a superfície do solo umedecido. O tratamento controle recebeu apenas solução nutriente (solução de Hoagland a 1/3) e foi colocado sobre solo coberto por uma folha plástica; o controle positivo (EMS) consistiu de uma solução aquosa de etil metanosulfonato a 100 ppm e também foi exposta sobre folha plástica. O tratamento Baixo não recebeu pesticidas, o Médio recebeu cianazina + metolaclor aplicados em bandas e o tratamento Alto recebeu cianazina + metolaclor em aplicação convencional e clorpirifós. Os pesticidas foram aplicados 24 hrs antes do início da exposição.

Interessantemente, os resultados desse experimento repetiram precisamente a tendência observada

no ensaio com extratos de solo (Figura 2), ou seja, uma frequência de micronúcleos ligeiramente superior nas

amostras do tratamento Médio em relação ao tratamento Alto. Este resultado significa que a hipótese nula de

não existência de diferenças entre os tratamentos Médio e Alto não deve ser rejeitada, indicando que não

ocorreu abatimento na atividade genotóxica detectada pelo ensaio Trad-MCN quando o programa de MIP foi

implementado, em relação ao uso normal de pesticidas como prescrito para a cultura de milho.

Poderia especular-se que tal tendência se deveu a uma taxa de aplicação efetivamente maior para o

tratamento Médio exatamente no local de exposição dos talos de Tradescantia, pelo menos em relação a

herbicidas (já que não houve aplicação de inseticidas nesse tratamento). Isso seria o resultado do método de

aplicação em bandas empregado nesse tratamento, no qual uma faixa mais estreita de solo recebeu o

tratamento, consequentemente concentrando os ingredientes ativos localmente. Como os talos de

Tradescantia foram colocados na parte interna da faixa pulverizada, uma dose ligeiramente maior pode ter

sido liberada para estas amostras em relação às amostras do tratamento Alto, que recebeu aplicação

convencional de herbicidas, ou seja, distribuída por toda a área.

O ensaio Trad-MCN demonstrou-se altamente sensível e, talvez mais importante, suficientemente

reprodutível para detectar atividade clastogênica em todos os pesticidas estudados, assim como em extratos

de solos pulverizados e in situ. A consistência dos resultados obtidos para os controles nos oito testes de

laboratório descritos, e especialmente nas réplicas das análises de extratos de solo e nas exposições in situ,

enfatizam a utilidade desse sistema para a avaliação da genotoxicidade no ambiente, especialmente quando

baixos níveis de contaminação são presentes.

Deve-se enfatizar ainda, que os resultados foram consistentes a despeito de (a) somente

concentrações nominais terem sido assumidas nos experimentos, devido à falta de análises químicas

comprobatórias nas amostras de solo e nas soluções de pesticidas estudadas, e (b) formulações comerciais

foram empregadas, ao invés de compostos puros, mesmo na avaliação dos produtos em si, devido ao interesse

em se aproximar o máximo possível das condições prevalecentes no campo de demonstração de MIP.

1.6 Discussão A capacidade de um agente químico oferecer riscos à biota depende das relações de partição que

determinam sua dispersão no ambiente, sua tendência para ser imobilizado no meio ou absorvido por

organismos, sua persistência e toxicidade (Gillett, 1983). A indução de clastogenicidade observada in situ em

Tradescantia exposta a campos pulverizados com pesticidas faz com que se questione como os pesticidas

alcançaram as células mães do pólen no interior das inflorescências.

Mesmo apresentando uma pressão de vapor relativamente baixa (2,5 mPa) (Tomlin, 1994),

aproximadamente metade do clorpirifós aplicado a campos agrícolas volatiliza-se para a atmosfera (Whang et

al., 1993), especialmente sob condições de solo úmido, como ocorria quando Tradescantia foi exposta. Isto

ocorre devido à baixa solubilidade de clorpirifós, o que contrabalança sua baixa pressão de vapor fazendo

com que o composto apresente uma relativamente alta constante adimensional da Lei de Henry (Hc calc.= -3,75

(Gillett, 1992; Mackay, 1981)). A constante da Lei de Henry é apropriada para avaliar a fugacidade de um

composto quando há envolvimento de água, já que a água pode competir com os composto por sítios de

sorção. Uma Hc calc. acima de -4,0 indica que o composto pode volatilizar-se espontaneamente de soluções a

superfícies úmidas (Gillett, 1992).

Volatilização foi a rota principal de perda de clorpirifós de um solo arenoso nos primeiros sete dias

após aplicação (Chapman & Chapman, 1986). Isto não ocorre, contudo, com cianazina, que não sofreu

volatilização em um estudo de laboratório (Blumhorst & Weber, 1992). Com uma pressão de vapor baixa

(200 mPa) (Tomlin, 1994) e baixa Hc calc. (-6,92) cianazina é virtualmente não volátil.

Embora metolaclor adsorva fortemente a argilas, sua isoterma de adsorção tipicamente apresenta

uma forma em S, o que significa que o composto é facilmente dessorvido do solo pela água (Chesters et al.,

1989). A despeito de sua pressão de vapor relativamente baixa (1,7 mPa) (Tomlin, 1994) a baixa Hc calc. (-

6,4), metolaclor pode volatilizar-se livremente (80% em 24 hrs) de superfícies (Prueger & Pfeiffer, 1994), e

perdas do solo por volatilização podem alcançar até 30% (Prueger, 1994). Consequentemente, é concebível

que, especialmente para clorpirifós e metolaclor, vapores suficientes poderiam ter sido liberados do solo

umedecido para causar a atividade clastogênica detectada nos ensaios in situ realizados com Tradescantia.

Os resultados da presente pesquisa corroboram os efeitos genotóxicos observados para os pesticidas

estudados em uma variedade de testes, incluindo outros bioensaios vegetais. Clorpirifós causou um aumento

na frequência de micronúcleos em eritroblastos de medula óssea se camundongo em tratamento oral e

intraperitoneal (tratamento dermal foi negativo) com doses abaixo da LD50, e antes de causar sinais de efeitos

clínicos (Amer & Fahmy, 1982). Em contraste, clorpirifós não induziu aumentos nas trocas de cromátides

irmãs (SCE) em embrião de galinha ou células de ovário de hamster chinês, assim como não foram

observadas aberrações em blastocistos bovinos, embora o desempenho reprodutivo dos animais tenha

diminuído após tratamento com clorpirifós (Muscarella et al., 1984).

Os efeitos citogenéticos em linfócitos humanos de uma mistura de 15 pesticidas comumente

encontrados em alimentos foram estudados por Dolara et al. (1994). Clorpirifós compunha 2% dessa mistura,

que era genotóxica somente quando o fungicida estava presente. Clorpirifós mostrou-se mutagênico nas

células somáticas a germinais de Drosophila, segundo o ensaio de indução de mosaico nas asas e no ensaio

de letais recessivos ligados ao seco, na concentração de apenas “5 x 10-6 %” (Patnaik & Tripathy, 1992).

Shirasu et al. (1976) avaliaram a mutagenicidade de clorpirifós empregando os testes

microbiológicos de Bacillus subtilis, Escherichia coli, e Salmonella typhimurium. Nenhum dos ensaios foi

positivo. Contrariamente, clorpirifós mostrou-se mutagênico no ensaio do dano primário ao DNA com estes

mesmos organismos e com Saccharomyces cerevisiae em outro estudo (Waters et al., 1982). Outros ensaios

utilizados, incluindo reversão em S. typhimurium e E. coli, letalidade recessiva em D. melanogaster,

recombinação mitótica em S. cerevisiae, e síntese não programada de DNA (UDS) em fibroblastos de pulmão

humano foram todos negativos (Waters et al., 1982). Também foram negativos os ensaios para mutação em S.

cerevisiae e S. typhimurium tanto antes como após ativação do composto com homogenados microssômicos

de plantas (S1) e animais (S9), assim como no teste do pólen ceroso em Z. mays (Gentile et al., 1982).

Aumentos significativos em mitoses anormais foram induzidos por clorpirifós em pontas radiculares

de V. faba, tanto quando sementes ou raízes foram tratadas (Amer & Farah, 1983). Similarmente,

genotoxicidade mitótica e meiótica foram induzidas por clorpirifós em pontas radiculares e células mães do

pólen de Hordeum vulgare L. tanto após tratamento das sementes quanto após pulverização (Kaur & Grover,

1985a; Kaur & Grover, 1985b). Estes ensaios produziram relações positivas entre dose e efeito, e adesividade

(”stickiness”) dos cromossomos foi o efeito mais aparente. Uma revisão sobre a toxicologia genética de

pesticidas (Sharma & Panneerselvan, 1990) listou vários efeitos cromossômicos causados por clorpirifós,

incluindo fragmentação, configuração de fragmento ponte (”bridges”), “vagrancy”, distúrbio de anáfase, e

indução de mutantes para clorofila em Gossypium barbadence, V. faba, e H. vulgare. O potencial de risco

genético do clorpirifós foi considerado incerto para danos no desenvolvimento e na reprodução, e positivo

para risco genético hereditário.

O aumento na frequência de micronúcleos observado em Tradescantia com uma dose pequena (10

ppm por 30 hrs) de clorpirifós, assim como a provável preponderância desse composto na indução de resposta

positiva obtida in situ, têm suporte nos resultados mencionados para Drosophila. O teste do recessivo letal

ligado ao sexo é o teste melhor validado em Drosophila, e uma resposta positiva nesse teste é uma indicação

muito forte de mutação e, mais importante, de aberração cromossômica (Patnaik & Tripathy, 1992).

Clorpirifós foi também positivo na maioria dos bioensaios vegetais já realizados, embora a doses mais

elevadas que as aqui estudadas. A adesividade (”stickiness”) dos cromossomos observada em células mães do

pólen de H. vulgare mesmo após simples tratamento das sementes (Kaur & Grover, 1985b) atestam a

capacidade clastogênica desse composto em células vegetais.

Foi demonstrado que cianazina induz danos ao cromossomo, com aumento na frequência de quebras

(”breaks”), em linfócitos humanos in vitro a concentração de apenas 1 ppm (Roloff et al., 1992). Este

resultado, contudo, é contrariado por dados de genotoxicidade de cianazina empregando-se os testes UDS e

SCE em linfócitos periferais humanos (concentrações de 12 a 100 ppm) e uma análise de aberração

cromossômica em células de medula óssea de rato ( doses variando de 56 a 224 mg/kg). Cianazina foi

inefectiva nesses casos (Hrelia et al., 1994).

A taxa de letais dominantes aparentes em D. melanogaster aumentou quando as moscas foram

alimentadas com ração contendo 0,01% de cianazina. A ausência de efeitos em testes de aberração

cromossômica , contudo, levou à conclusão que o decréscimo na eclosão dos ovos estava mais ligada a

toxicidade fisiológica ao esperma (Murnik, 1976; Murnik & Nash, 1977).

A possibilidade de cianazina ser um agente pró-mutagênico foi examinada em ensaios com S.

typhimurium e S. cerevisiae empregando-se homogenados microssômicos de plantas (1S) e animais (S9),

assim como in situ com o ensaio do pólen ceroso em Z. mays (Means et al., 1988). Cianazina foi positiva no

ensaio com Salmonella somente após ativação com 1S, e no ensaio com Z. mays. Evidência adicional da

natureza mutagênica da cianazina foi obtida quando extratos de plantas de milho tratadas com cianazina se

mostraram mutagênicos a Salmonella (Means et al., 1988).

Cianazina induziu fragmentação cromossômica, configurações de fragmento ponte (”bridges”) e

suspensão da metáfase em células meristemáticas de raiz de H. vulgare (Sharma & Panneerselvan, 1990), e

de Tradescantia e V. faba. As plantas foram expostas por até 12 hrs a concentrações de cianazina entre 200 e

600 ppm. Houve uma clara tendência para os efeitos diminuírem com o aumento da dose nessas duas

espécies, indicando toxicidade aguda do composto (Ahmed & Grant, 1972b).

Esse baixo limiar de toxicidade da cianazina foi também observado quando formulações comerciais

foram estudadas com Tradescantia na presente pesquisa. A mais alta frequência de micronúcleos foi obtida

repetidamente na concentração intermediária de 10 ppm, enquanto a solução com 50 ppm resultava em

frequências menores. Cianazina mostrou-se um agente mutagênico de ação direta assim com um agente pró-

mutagênico em todos os ensaios vegetais estudados, além de mostrar-se capaz de induzir mutações in situ no

ensaio com Z. mays em doses recomendadas pela prática agrícola normal (Means et al., 1988).

Metolaclor causou danos nos cromossomos de linfócitos humanos in vitro a uma concentração de

somente 0,1 ppm (Roloff et al., 1992). A capacidade de homogenados microssômicos animais para ativar

metolaclor em metabólitos mutagênicos foi demonstrada em S. typhimurium e S. cerevisiae (Plewa et al.,

1984). Metolaclor mostrou-se também mutagênico diretamente (sem ativação) em S. typhimurium, e uma

misture de metolaclor e cianazina induziu mutações in situ no ensaio do pólen ceroso de Z. mays (Plewa et

al., 1984).

A atividade mutagênica de metolaclor em doses tão baixas e com sistemas tão variados está de

acordo com os resultados obtidos com o ensaio Trad-MCN. Uma relação positiva entre dose e efeito foi

observada em Tradescantia tratada com soluções de metolaclor com concentrações variando entre 1 e 50

ppm. Embora metolaclor possa ser ativado por homogenados microssômicos, similarmente a cianazina,

normalmente não há necessidade de sistemas externos de ativação no ensaio Trad-MCN, já que os talos da

planta contêm seu próprio complemento enzimático (Ma, 1981).

O impacto biológico desses pesticidas no ambiente é uma função da concentração em que eles são

encontrados e de sua atividade intrínseca frente a seres vivos. Os três pesticidas estudados devem ser

considerados potencialmente genotóxicos, já que todos mostraram resultados positivos em testes que cobrem

desde organismos procarióticos até ensaios in vitro com células de mamíferos, e dois deles (cianazina e

metolaclor) foram positivos em ensaios com células humanas in vitro (Roloff et al., 1992).

Em adição aos potenciais impactos genotóxicos que esses compostos podem apresentar ao nível de

campo agrícola aqui estudado, sua distribuição no ambiente pode trazer riscos adicionais. Tanto cianazina

quanto metolaclor estavam entre os pesticidas mais frequentemente encontrados em águas de rios e em águas

de abastecimento em um estudo conduzido por seis anos no Canadá (Frank et al., 1990). Estes compostos

estavam presentes em quase 30% das amostras analisadas, e em concentrações de até 10 μg/L para cianazina

e até 28 μg/L para metolaclor. Os níveis máximos de contaminação aceitáveis (interino) para esses produtos

no Canadá são 10 e 50 μg/L para cianazina e metolaclor, respectivamente, ou igual ao nível máximo

encontrado para cianazina, e apenas menos que o dobro do nível encontrado para metolaclor (Frank et al.,

1990). Estes dois herbicidas estão também entre os mais comuns contaminantes de água de chuva (Richards

et al., 1987). Cianazina apareceu em 25% de 325 amostras de água de chuva coletadas em Iowa (EUA), em

concentrações de até 28 μg/L. Metolaclor ocorreu em 20,7% das amostras, com uma concentração máxima de

2,7 μg/L (Nations & Hallberg, 1992). Cianazina também tem sido encontrada contaminando águas

subterrâneas (Nations & Hallberg, 1992). Embora menores que as concentrações normalmente mencionadas

em estudos de mutagenicidade em condições de laboratório, a presença ubíqua desses compostos no ambiente

pode apresentar consequências adversas.

Na presente avaliação do potencial genotóxico oferecido por clorpirifós, cianazina e metolaclor em

Tradescantia, cada um dos compostos exerceu alguma clastogenicidade, mesmo nas baixas concentrações

presentes após uso agrícola normal. Também ficou aparente que, como detectado por um bioensaio muito

sensível, a redução no uso de pesticidas alcançável com a implementação de programas de MIP podem ser

insuficientes para eliminar a genotoxicidade em campos pulverizados. Isto se deve ao fato de não ter sido

possível notar qualquer redução na expressão de micronúcleos em Tradescantia nas amostras dos tratamentos

Alto para Médio, no programa de MIP estudado. Este resultado é reforçado pelo tratamento Baixo (sem

aplicação de pesticidas) não diferir do controle negativo em nenhum dos casos.

Devido a sua sensibilidade extraordinária, o ensaio Trad-MCN pode ser qualificado como um

sistema averso a risco para a avaliação de genotoxicidade no ambiente (Ennever et al., 1988; Grant &

Salamone, 1994). Entretanto, dada a importância de pragmaticamente alcançarem-se práticas de manuseio

mais seguras para pesticidas, e considerando o valor de avaliações biológicas idôneas para a análise de

qualquer programa de redução no uso de pesticidas, estudos adicionais são necessários. De especial interesse

seria a avaliação das possíveis atividades mutagênicas que os pesticidas poderiam exercer sobre as plantas

sendo cultivadas, e da possibilidade de um programa de MIP reduzir o potencial genotóxico imposto por

esses pesticidas sobre as plantas cultivadas e as invasoras presentes em campos agrícolas. Nos experimentos

descritos no próximo capítulo, ensaios de mutagenicidade empregando plantas de milho e soja foram usados

para conferir in situ os resultados apresentados para o ensaio Trad-MCN.

2. Tradescantia e o bioensaio do pêlo estaminal.

2.1 Trad-SHM: Fundamentos e desenvolvimento do bioensaio e revisão de sua utilização em avaliações de mutagênese ambiental

O ensaio da mutação em pêlo estaminal (Trad-SHM) baseia-se em mutação pontual (mitótica) na

qual é suprimida a expressão do caráter azul dominante em flores de plantas heterozigotas, resultando no

aparecimento da cor rosa recessiva (Emmerling-Thompson & Nawrocky, 1982; Mericle & Mericle, 1967;

Mericle & Mericle, 1971; Nayar & Sparrow, 1967). Os estudos iniciais com esse sistema centraram-se na

avaliação dos efeitos genotóxicos e citotóxicos de radiação ionizante e empregaram as células meristemáticas

dos pêlos estaminais do clone 02 de Tradescantia em substituição a culturas microbianas. Nesse ensaio,

crescimento normal dos pêlos era considerado equivalente a formação de colônias, e pêlos atrofiados a

eliminação celular nas culturas, devido a efeitos severos, altamente deletérios ou letais. Em adição à

utilização de mutação (alteração de cor) como indicador final das avaliações, alterações genotóxicas como

expressão de células gigantes, duplas ou triplas, bifurcação e outras anomalias de crescimento eram também

consideradas juntamente com a perda da integridade reprodutiva das células dos pêlos como indicadores de

genotoxicidade (Nayar & Sparrow, 1967).

A base genética para expressão de células cor-de-rosa nos pêlos estaminais do clone 4430 de

Tradescantia foi estabelecida por meio de cruzamentos recíprocos com a linhagem parental rosa e branca T.

subacaulis Bush (Emmerling-Thompson & Nawrocky, 1980). Determinou-se que pigmentação rosa era

dependente de um par de alelos em um único locus, sendo azul (B) dominante sobre rosa (b); e demonstrou-

se que o clone 4430 é homozigoto dominante para o locus branco. A identidade espectrofotométrica de

ambos pigmentos, rosa e azul, de quatro clones diferentes de Tradescantia está determinada (Sanda-

Kamigawara & Ichikawa, 1993).

Mutação para rosa, assim como perda de integridade reprodutiva nos pêlos estaminais de várias

espécies e híbridos de Tradescantia (Ichikawa & Sparrow, 1967a; Ichikawa & Sparrow, 1967b; Ichikawa &

Sparrow, 1968; Ichikawa & Sparrow, 1969; Ichikawa et al., 1969; Sparrow & Ichikawa, 1967) tornaram-se

importantes indicadores para o estudo da atividade genotóxica das radiações (Alvarez & Sparrow, 1965;

Kappas et al., 1972; Nauman et al., 1976; Nauman et al., 1974; Sparrow et al., 1973; Underbrink et al.,

1973a; Underbrink et al., 1971).

Sparrow e colaboradores (1972) estudaram os efeitos de neutrons e raios-X com o ensaio Trad-SHM

(clone 02), estabelecendo um relação linear entre dose-resposta para ambos os agentes, e uma dose

duplicadora da taxa de mutação de apenas 1 rad para raios-X. As frequências espontâneas de mutação de

várias espécies e híbridos de Tradescantia foram definidas com base em muitos anos de investigação no

Brookhaven National Laboratory (Sparrow & Sparrow, 1976). Híbridos (i.e., clone 4430) e híbridos putativos

(i.e., clone 02) apresentaram frequências e variação menores na mutação espontânea quando comparados com

clones de espécies puras, e foram considerados mais adequados para experimentação.

Os efeitos da radioatividade natural sobre a expressão de mutações foram estudados em vôos orbitais

(Sparrow et al., 1968) e pelo cultivo de Tradescantia em areia monazítica (Nayar et al., 1970). Notou-se que

a taxa de mutação aumentava com todas as amostras, e os radionuclídeos absorvidos pelas plantas eram muito

mais efetivos que a simples radiação externa. Estes resultados foram mais tarde confirmados pela exposição

de plantas a solos coletados no campo experimental de explosões atômicas das Ilhas Bikini (Ichikawa & Ishii,

1991a). Solos que causavam aumentos significativos nas frequências de mutação continham 137Cs e 60Co,

entre outros radionuclídeos. Outros estudos envolvendo a absorção de radionuclídeos incluem compostos de

trítio (Nauman et al., 1979; Tano et al., 1984) e 131I (Tano & Yamaguchi, 1979).

O ensaio Trad-SHM foi empregado in situ para monitorar radiação ionizante nas vizinhanças de

usinas nucleares em um estudo de larga escala realizado no Japão (Ichikawa, 1981). Aumentos significativos

nas frequências de mutação estavam correlacionados tanto com a direção preferencial dos ventos quanto com

os períodos de efetivo funcionamento das usinas. Cebulska-Wasilewska (1992) observou incremento nas

frequências de mutação em Trad-SHM correlacionadas com contaminação causada em Cracóvia pela

explosão do reator de Chernobyl (a uma distância de 700 km). Incrementos similares na taxa de mutação

foram também notificadas de maio a junho de 1986 no Japão (mais de 800 km de distância) (Ichikawa et al.,

1996). Nesse caso, variações na taxa espontânea de mutação registradas em um período de 10 anos (1982 a

1992) sempre podiam ser explicadas pelo fator temperatura, ao contrário desse incremento em 1986.

Exposições a radiação também permitiram a padronização do ensaio Trad-SHM em relação a variações de

temperatura (Nauman et al., 1977a; Nauman et al., 1977b), dose (Nauman et al., 1977c; Nauman et al.,

1975), e outras variáveis comuns das condições de experimentação (Underbrink & Sparrow, 1974;

Underbrink et al., 1975a; Underbrink et al., 1975b).

A aplicabilidade do ensaio Trad-SHM a estudos de mutagênese química foi proposta por Underbrink

et al. (1973b) e testada em comparação aos efeitos de radiação e EMS e DBE gaseificados (Nauman et al.,

1976). As respostas a agentes químicos apresentaram características similares àquelas dos raios-X

(incremento exponencial seguido de saturação na frequência de células mutantes), e o clone 4430 foi mais

sensível que o clone 02. Estes resultados foram posteriormente confirmados com uma variedade de

compostos químicos e radionuclídeos (Tano, 1987; Tano, 1990; Tano & Yamaguchi, 1985). Nesses estudos,

os agentes mutagênicos foram aplicados topicamente, diretamente sobre as inflorescências. Doses diminutas

de 5 a 20 pg de N-nitroso-N-methiluréia e N-nitroso-N-etiluréia, e 100 pg de EMS foram efetivas e

detectáveis no teste Trad-SHM. O limite de detecção para radiação externa estava abaixo de 1 rad.

Essa alta sensibilidade do ensaio Trad-SHM a agentes mutagênicos químicos foi primeiramente

demonstrada após exposição acidental das plantas (clone 02) a vapores que contaminavam o suprimento de ar

de um laboratório em Brookhaven. Um incremento súbito nas frequência espontânea de mutações levantou a

suspeita que levou à descoberta da contaminação (Sparrow & Schairer, 1971). Estudos adicionais com Trad-

SHM na avaliação de agentes químicos envolvem hidrazida maléica (Gichner et al., 1982b), MMS, EMS,

DMS (dimetil sulfato) (Ichikawa et al., 1990; Ichikawa & Takahashi, 1978; Sanda-Kamigawara et al., 1991),

compostos N-nitroso e vários solventes orgânicos, entre outros, assim como avaliações de ação sinergística

entre agentes químicos, e entre esses e radiações (Badaev et al., 1989; Gichner et al., 1994; Gichner et al.,

1982a; Gichner et al., 1988; Ichikawa, 1992; Ichikawa et al., 1990; Ichikawa et al., 1993; Kuglik et al., 1994;

Sanda-Kamigawara et al., 1991; Shima & Ichikawa, 1994; Shima & Ichikawa, 1995a; Shima & Ichikawa,

1995b; Veleminsky et al., 1987; Villalobos-Pietrini et al., 1986).

Demonstrou-se que o ensaio Trad-SHM é ainda capaz de ativar agentes promutagênicos em agentes

mutagênicos de ação direta (Gichner et al., 1980). Benzo-α-pireno, atrazina, e vários compostos N-nitroso

foram mutagênicos quando testados sem tratamento prévio com frações microssomais (Veleminsky &

Gichner, 1988). Xiao e Ichikawa (1995; 1996) relataram a ativação de hidrazida maléica (MH) em um agente

mutagênico por ação de peroxidase, e demonstraram que MH agia sinergisticamente (Cebulska-Wasilewska

et al., 1981) e antagonisticamente com raios-X quando esses eram aplicados antes e depois da MH,

respectivamente. Os rais-X suprimiam a ativação da MH quando aplicados a posteriori. Uma revisão da

mutagenicidade de radiações ionizantes e agentes químicos estudada com Trad-SHM foi oferecida por

Ichikawa (1992).

Talvez a contribuição mais importante do ensaio Trad-SHM tenha sido uma série de estudos sobre

poluição atmosférica realizado com um laboratório móvel, nos EUA (Schairer, 1979; Schairer & Sautkulis,

1982; Schairer et al., 1982; Schairer et al., 1979; Schairer et al., 1983). Ar obtido em locais poluídos

induziam maiores frequências de mutações que ar filtrado das mesmas localidades ou ar coletado em áreas

controle, como o Grand Canyon. A mutagenicidade de atmosferas poluídas (Sparrow & Schairer, 1974) tem

sido também demonstrada nas vizinhanças de refinarias de óleo e complexos petroquímicos (Lower et al.,

1983a), fundições de chumbo (Lower et al., 1978; Lower et al., 1983b), fábrica de remédios (Cebulska-

Wasilewska & Guminska, 1987), e incinerador municipal de resíduos sólidos (Ma, 1994; Ma et al., 1993b;

Ma et al., 1996).

A atividade mutagênica de fumaças químicas usadas pelo exército Norte-Americano também foi

avaliada com Trad-SHM. Respostas positivas foram obtidas com “fogoil” e diesel para tanques, bem como

para sua combinação (Schaeffer et al., 1987). Ozônio, em concentrações ocasionalmente encontradas em

áreas poluídas (300 a 800 ppb) não apresentou mutagenicidade no ensaio Trad-SHM (Gichner et al., 1992;

Rodrigues et al., 1996), embora tenha sido positivo em concentrações mais altas (Schairer, 1979). Uma

revisão do Trad-SHM como um ensaio para agentes mutagênicos gasosos foi publicada sob o Programa

Gene-Tox, da USEPA (Van't Hof & Schairer, 1982).

Em adição a estudos de agentes gasosos, Trad-SHM tem sido usado para avaliação de ambientes

aquáticos (Lower et al., 1985; Tano, 1989). Episódios de mutagenicidade nas águas de um reservatório no

estado Norte-Americano do Missouri apresentavam correlação com eventos que promoviam a transferência

dos agentes mutagênicos dos sedimentos para a coluna d’água (Lower et al., 1985). Grant e colaboradores

(1992) analisaram in situ a genotoxicidade das águas em uma área do Lago Superior nas vizinhanças de uma

fábrica de papel e celulose usando Trad-SHM, Trad-MCN, e o ensaio de aberração cromossômica com Vicia

faba. Embora Trad-SHM fosse suficientemente sensível para detectar atividade mutagênica, o ensaio foi

considerado inferior aos outros em termos de facilidade para manipulação a campo, sendo que áreas remotas

trazem dificuldade para o cultivo das plantas no longo (14 dias) período de recuperação necessário para esse

teste.

Há escassêz de informações sobre atividade mutagênica de pesticidas em Trad-SHM (Mohammad &

Ma, 1983). Tomkins e Grant (1972) estudaram os efeitos de menazon (um inseticida do grupo s-triazina),

metobromuron (herbicida do grupo das uréias substituídas), e Daconil 2787® (clorotalonil, fungicida do grupo

dos hidrocarbonetos aromáticos clorados), embrulhando inflorescências de Tradescantia com algodão

embebido em soluções dos pesticidas (1500 ppm). Nenhuma resposta positiva foi obtida. A mutagenicidade

do herbicida e regulador de crescimento hidrazida maléica já foi demonstrada (Gichner et al., 1982b; Xiao &

Ichikawa, 1995; Xiao & Ichikawa, 1996). O fungicida derivado de benzimidazol Benlate® (benomil) foi

testado em Trad-SHM (clone KU 20) em doses normalmente usadas na agricultura (0,5 a 4,0 g/l) (Sakamoto

& Takahashi, 1981). Novamente não houve resposta positiva. Em contraste com esses resultados, sete de

nove inseticidas foram positivos quando testados com Trad-SHM usando o clone 4430 (Huang & Chen,

1993a). Diclorvós (0.1%), ometoato (0.04%), metamidofós (9.05%), Meobal® (3,4-xylyl metilcarbamato)

(0.05%), mevinfós (0.006%), Amobem® (cloramben, em verdade um herbicida) (0.045%) e metil tiofanato

(0.07%) resultaram positivos, enquanto triclorfon (0.1%) e Bassa® (2-sec-butilfenil metilcarbamato) (0.02% -

efeito tóxico registrado) foram negativos. Atrazina resultou mutagênica após exposição crônica (Schairer &

Sautkulis, 1982), e cianazina também foi notificada como mutagênica em Trad-SHM (Veleminsky &

Gichner, 1988).

Um resumo dos resultados até hoje obtidos com Trad-SHM na avaliação de mutagênese ambiental

está atresentado na tabela 8.

Tabela 8 - Resumo dos resultados de avaliações de mutagênese ambiental obtidos com o ensaio do pêlo estaminal em Tradescantia (Trad-SHM).

Agente Dosagem Resultado

Tempo de Exposição –

max

Concentração +/- Significância estatística


Poluição atmosférica Monitoramento in situ

Várias localidades poluídas nos EUA

10 d + p<.05 Taxas de mutação mais altas associadas com processamento de petróleo.

Schairer, 1979; Schairer & Sautkulis,

1982; Schairer et al., 1982

Metalurgia de chumbo

Exposição crônica

0,3 - 11 km da fonte

+/- p<.001 Não ocorreu correlação entre taxa de mutação e distância da metalúrgica.

Lower et al., 1978; Lower et al., 1983b

Refinaria de petróleo


100 - 500 m da fonte

+ p<.001 Todos os testes foram estatisticamente positivos para uma localidade no Texas, em relação aos controle da casa de vegetação.

Lower et al., 1983a

Emissões gasosas de um aterro sanitário

4 - 6 hrs + Respostas positivas obtidas em 7 de 13 exposições. Gases queimados na fonte de emissão.

Ma et al., 1993a

Incinerador minicipal

4-6 hrs + Resultados positivos obtivos com atmosfera estagnada.

Ma et al., 1993b

Fumaças químicas

30 min 15 - 100 m da fonte

- p>0.9 Schaeffer et al., 1987


Exposição – max



Gases selecionados, em câmaras

NO 6 hrs 250 ppm + p<.01 Schairer & Sautkulis, 1982;

Van't Hof & Schairer, 1982

NO2 6 hrs 50 ppm + p<.05 ″ SO2 6 hrs 40 ppm + p<.01 ″

DBE 6 hrs 1 ppm + p<.01 ″ SEM 6 hrs 5 ppm + p<.01 ″

Cloreto de vinila

6 hrs 75 ppm + p<.02 ″

O3 6 hrs 5 ppm + p<.02 ″ O3 11 hrs/d 800 ppb - p=.68 Gichner et al.,

1992

O3 6 hrs/d 100 ppb - p>.05 Exposição cumulativa, três dias

Rodrigues et al., 1996

Poluição da água Monitoração In situ

Água de um lago

24 hrs - p<.05 Lago poluído com efluentes de fabricação de papel e celulose. Resultados foram inconclusivos.

Grant et al., 1992

Sedimento de fundo


+ p<.005 Taxas de mutação foram altas em todos os 91 dias do período experimental.

Lower et al., 1985

Agentes químicos selecionados, em solução

Benzo-α- pireno

24 hrs 3.9 x 10-5 M + p<.01 Schairer & Sautkulis,

1982; Van't Hof &

Schairer, 1982 Cafeina Crônico 10-3 M - p>.05 ″

NaN3 3 hrs 10-3 + p<.01 ″ Benzidina 24 hrs 5.4 x 10-7 M + p<.01 ″

SEM 6 hrs 10 ppm + Relação dose-resposta positiva de 10 a 500 ppm.

Nauman et al., 1976

DBE 6 hrs 10 ppm Idem. ″

EMS Agudo 100 ng + Soluções químicas aplicadas diretamente sobre as inflorescências.

Ichikawa et al., 1990; Ichikawa

& Takahashi, 1978; Sanda-

Kamigawara et al., 1991;

Tano, 1987; Tano, 1990;


Exposição – max



Tano & Yamaguchi,

1985 Compostos N-nitrosos

Agudo 100 ng + ″ ″

Hidrazida maleica

Agudo + Ocorreu sinergismo com raios-X aplicados antes que hidrazida, e supressão dos efeitos com raios-X aplicados a posteriori.

Xiao & Ichikawa,

1995; Xiao & Ichikawa, 1996

compostos N-nitrosos

24 hrs Vários + Gichner et al., 1982b

Pesticidas Atrazina Crônico 0.045 mg p<.01 Dose aplicada por vaso Van't Hof &

Schairer, 1982

Menazon 24 hrs 1500 ppm - p>.05 Inflorescências embrulhadas com algodão embebido no pesticida.

Tomkins & Grant, 1972

Metobromuron ″ 1500 ppm - ″ ″ ″ Tetracloro

isoftalonitrilo ″ 1500 ppm - ″ ″ ″

Benomil 2 hrs 4 g/L - p>.05 Dose equivalente à recomendada para uso.

Sakamoto & Takahashi,

1981

Nove inseticidas

Vários +/- Resposta positiva em sete de nove compostosos

Huang & Chen, 1993a

Radiação

raios-γ de 60Co

16 hrs 500 R + Frequência de mutações diminuíam acima de 300 R.

Nayar & Sparrow, 1967

Areia

monazítica Crônico 1.3 mR/hr + p<.05 Nayar et al.,

1970

Raios-X mins 160 R + Relação dose-resposta positiva entre 10 e 160 rad.

Nauman et al., 1976

Raios-X mins 100 R + p<.01 Relação dose-resposta positiva entre 0,25 e 5 rad.

Sparrow et al., 1972

Nêutrons mins 10 R + p<.01 Relação dose-resposta

positiva entre 0,01 e 8 rad.

″

Radiação endógena

Agudo 100 nCi + Compostos marcados com Trítio e 131 I. Relações dose-resposta positivas.

Tano, 1987

Exposição in situ a usinas

Crônico + p<.05 Aumentos significativos nas taxas de mutação

Ichikawa, 1981


Exposição – max



nucleares estavam relacionados com períodos de operação das usinas e direção dos ventos.

Solos das Ilhas Bikini

76 d 150 μR/hr + p<.01 Radionuclídeos principais eram 137Cs e 60Co.

Ichikawa & Ishii, 1991a

Exposição in

situ a atmosfera

contaminada

Crônico + p<.05 Logo após o acidente de Chernobyl. Plantas expostas em Cracóvia, 700 km da fonte de radiação.

Cebulska-Wasilewska,

1992

Exposição in situ a

atmosfera contaminada

Crônico + Logo após o acidente de Chernobyl. Plantas expostas no Japão, 8.000 km da fonte de radiação.

Ichikawa et al., 1996

2.2 Avaliação de um programa de MIP com o ensaio Trad-SHM Dando sequência aos estudos de genotoxicidade dos pesticidas aplicados em um programa de MIP, o

ensaio Trad-SHM foi aplicado in situ, a fim de averiguar os resultados obtidos com Trad-MCN, descritos

acima. Além desses ensaios, os testes do mosaicismo em folhas de soja, e do grão de pólen ceroso em milho

foram também realizados (Rodrigues et al., 1998b), e serão discutidos em uma outra oportunidade, quando da

realização de cursos específicos.

2.3 Material e Métodos

2.3.1 Linhagem de Tradescantia, Multiplicação e Manutenção O clone 4430 de Tradescantia foi utilizado para o ensaio Trad-SHM in situ. Clone 4430 é um

diplóide híbrido entre T. hirsutiflora Bush (2461C) de flôr azul, e T. subacaulis Bush (2441), de flôr côr-de-

rosa. Para mais informações sobre a origem, características e manutenção desse clone veja seção 1.4.2.

2.3.2 Exposição, Amostragem, e Análise Para cada experimento, 25 a 30 hastes florais (por tratamento) contendo inflorescências jovens

foram colhidas 24 hrs antes do início da exposição e transferidas para uma câmara de ambiente controlado

(para detalhes veja seção 1.4.2). As hastes florais foram mantidas em água deionizada e aeradas por 24 hrs

para adaptação. As hastes foram então transferidas para vasos tipo beaker embrulhados em papel alumínio

contendo solução de Hoagland (diluição 1/3) e trazidas para o campo de demonstração de MIP em uma caixa

hermeticamente fechada no dia seguinte à aplicação dos pesticidas. Exposição consistiu na colocação dos

vasos contendo as inflorescências sobre o solo umidecido, cobrindo-os com um vaso de PVC invertido, por

14 hrs (veja seção 1.4.5 para detalhes). Após exposição as amostras foram trazidas ao laboratório em caixa

hermeticamente fechada, as soluções nutrientes foram substituídas por outras frescas, e as hastes florais

conservadas sob aeração durante o período de recuperação.

O ensaio Trad-SHM requer um período de recuperação de ao menos 14 dias, o tempo necessário

para que os botões florais contendo pêlos estaminais primordiais ao tempo de exposição floresçam, expondo

os pêlos desenvolvidos para avaliação. Durante o período de recuperação as hastes florais foram

continuamente aeradas, as soluções nutrientes trocadas diariamente, e as folhas murchas removidas. A partir

do oitavo dia, as flores recentemente abertas foram coletadas e os estamens removidos, colocados em lâminas

de microscopia contendo uma gôta de solução etanol:glicerina (1:1 v/v) e avaliadas quanto à proporção de

células rosa sob magnificação de 40x em estereomicroscópio. O número de pêlos por estamen para cada dia

de avaliação foi estimado contando-se os pêlos em dois estamens anti-sépala e dois anti-pétala de duas flores

obtidas ao acaso (Ichikawa & Ishii, 1991b). Um evento mutagênico consistiu de uma ou uma sequência de

células rosas adjacentes, entre as células dominantes azuis, em qualquer posição no pêlo estaminal

(Underbrink et al., 1973b). Ao menos cinco flores foram avaliadas por tratamento por dia, totalizando 1800

pêlos/tratamento/dia.

O número de eventos mutagênicos por flôr foi transformado em eventos/1000 pêlos. A frequência

média de mutação de cada tratamento foi comparada para todos os dias em conjunto e para o dia que

apresentava maior frequência total de eventos mutagênicos. Análise de variância (ANOVA) foi utilizada para

a comparação das médias dos tratamentos; e Student´s t-test assumindo variâncias equivalentes (nenhuma

tendência assumida a priori nos dados) e α=0,05 foi empregado para a comparação entre o controle e os

tratamentos.

2.4 Resultados Um primeiro passo para a análise dos resultados de ensaios Trad-SHM é a determinação do dia no

qual a maioria dos pêlos estaminais em formação ao tempo da exposição se expressam nas flores em

avaliação. O dia 10 após exposição produziu a maior taxa total de mutação para todos os tratamentos

combinados, indicando ser este o dia mais apropriado para análise (Figura 7)

Figura 7 – Taxa de mutação combinada no ensaio Trad-SHM após exposição in situ a campos pulverizados com pesticidas. Hastes florais de Tradescantia foram expostas por 14 hrs colocando-se vasos tipo beaker contendo inflorescências diretamente sobre o solo umidecido. O pico na taxa de mutação no dia 10 indica compleição do período de recuperação, e o dia mais apropriado para avaliação.

Um aumento significativo (α=0,05) na frequência de mutações foi observado no ensaio Trad-SHM

entre o tratamento Baixo e Alto no dia 10 após exposição (figura 8). Contrariamente aos resultados obtidos

com Trad-MCN (seção 1.5.3), não se observou aumento na frequência de mutações no tratamento Médio.

05

1015202530354045

Dia 8 Dia 9 Dia 10 Dia 11 Dia 12

Dias após exposição

Tota

l de

célu

las r

osa

Figura 8 – Mutação em pêlos estaminais de Tradescantia no dia 10 após exposição a campo pulverizado com pesticidas. As barras representam desvios padrão das médias. O tratamento Controle consistiu de solução nutriente Hoagland, o controle positivo (EMS) consistiu de uma solução a 100-ppm de etilmetanosulfonato de etila. O tratamento Baixo não recebeu pesticidas, o Médio recebeu cianazine + metolaclor em faixas, e o Alto recebeu cianazina + metolaclor e clorpirifós em toda área. Os pesticidas foram aplicados 24 hrs antes da exposição.

O tratamento Baixo (sem aplicação de pesticidas) induziu um nível de mutações consistente com a

taxa espontânea para o clone 4430 (Sparrow & Sparrow, 1976), sugerindo que as condições de exposição

foram adequadas. O controle positivo (EMS) foi efetivo, causando um aumento na taxa de mutações em

relação à taxa espontânea (representada pelo tratamento Baixo), confirmando o dia 10 como o período no

qual os pêlos estaminais em formação ao tempo da exposição atingiram completo desenvolvimento. Ocorreu

um inexplicável alto nível de mutações para o controle negativo nesse experimento, o que confundiu os

resultados finais. Esse problema estava também presente nos resultados da soma de todos os dias de avaliação

agrupados, como aparece na Figura 9.

0

2

4

6

8

10

12

14

16


Even

tos r

osa

/ 100

0 pê

los

Figura 9 - Mutação em pêlos estaminais de Tradescantia para o conjunto de dias de avaliação, após exposição a campo pulverizado com pesticidas. As barras representam desvios padrão das médias. O tratamento Controle consistiu de solução nutriente Hoagland, o controle positivo (EMS) consistiu de uma solução a 100-ppm de etilmetanosulfonato de etila. O tratamento Baixo não recebeu pesticidas, o Médio recebeu cianazine + metolaclor em faixas, e o Alto recebeu cianazina + metolaclor e clorpirifós em toda área. Os pesticidas foram aplicados 24 hrs antes da exposição.

Novamente, a mesma tendência foi observada, com a frequência de mutações aumentando do

Tratamento Baixo para o Alto, e com o controle negativo mostrando uma taxa comparável à do controle

positivo. Embora fragilizado por essa anomalia, os resultados obtidos com Trad-SHM dão suporte, ou

corroboram aqueles obtidos com Trad-MCN, sob as mesmas condições experimentais.

3. Conclusão As abundantes informações básicas sobre a genética e o desenvolvimento de Tradescantia oferece

uma sólida estrutura de suporte para seu uso como como um bioindicador para ensaios de toxicidade genética

ambiental (Ma & Grant, 1982). Micronúcleos nas células-mães dos grãos de pólen são facilmente

0

2

4

6

8

10

12


Even

tos r

osa

/ 100

0 pê

los

observáveis, permitindo um baixo grau de incerteza nas avaliações, e diminuindo a subjetividade presente no

reconhecimento de aberrações cromossômicas; enquanto a indução de mutações para rosa em células dos

pêlos estaminais oferecem um indicador somático sensível de mutagênese. Adicionalmente, os ensaios com

Tradescantia têm se provado valiosos nos estudos de sinergismo entre agentes químicos e entre esses e outros

agentes genotóxicos como radiações, uma propriedade valiosa para a avaliação de riscos genotóxicos em

situações ambientais complexas (Shima & Ichikawa, 1995b).

Grant (1994) analisou recentemente a situação atual dos ensaios com plantas superiores

para detecção de agentes mutagênicos ambientais, indicando as vantagens desses sistemas em relação à

possibilidade de se realizarem avaliações in situ. Em um estudo recentemente patrocinado pelo Programa

Internacional de Seguridade Química a utilidade dos dois ensaios com Tradescantia aqui discutidos (bem

como outros três ensaios vegetais) foi avaliada com quatro reconhecidos agentes químicos genotóxicos

(Grant & Salamone, 1994) em cinco laboratórios diferentes (Sandhu et al., 1994a; Sandhu et al., 1994b). Os

resultados obtidos nesse estudo consubstanciaram o ensaio Trad-SHM como um sistema confiável para a

averiguação das propriedades mutagênicas de agentes químicos (Ma et al., 1994a). Em relação ao ensaio

Trad-MCN, embora os resultados obtidos para os quatro agentes não tenham sido idênticos, houve uma boa

concordância entre todos os laboratórios, sugerindo ser este um bioensaio confiável para clastogenicidade

(Ma et al., 1994b), e como tem sido indicado nesse levantamento bibliográfico (Rodrigues et al., 1997) Trad-

MCN é especialmente apropriado para a monitoração de agentes genotóxicos in situ.

Em conclusão, os estudos aqui revisados demonstram que os ensaios baseados em

Tradescantia oferecem sistemas facilmente manipuláveis e muito sensíveis para o estudo de toxicidade

genética, especialmente para as condições in situ indispensáveis em estudos ambientais.

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