“Apoptosis inducida por Bid es inhibida por Bcl-2”

Mariano DellaroleFernanda QuinterosLaura Sifonios

JBC, Vol. 18,No 19, 2003.

La vida requiere de la muerte...

Células dañadas

Infectadas

Redundantes

Eliminación por un programa de suicidio celular : Apoptosis.

Involucrada en : Desarrollo normal

Homeostasis de tejidos

Defensa contra patogenos

Su desregulación puede producir:Cáncer

Enfermedades autoinmunes

Enfermedades degenerativas

* La familia de las proteínas Bcl2 son reguladores de la apotosis

*Presentan dominios de homología Bcl2 (BH).

*Antecedentes documentados del bloqueo de la apoptosis por Bcl2

* Bid procesamiento tBid proteoloítico (forma activa)

Traslocación

Inserciónen la membranamitocondrialLiberación

citocromo cApoptosis

(Caspasa 8)

Bcl-xl

La Familia de Bcl-2

Fuente: review de J. M. Adams, Science 1998 Vol 281

*Objetivo: Determinar los mecanismos mediante los cuales Bcl-2 inhibe la apoptosis inducida por Bid.

*Modelo de expresión:

HeLa cells

pcDNABid

pcDNABcl2

pcDNAEGFP

Figura 1:

Objetivo: Determinar si Bcl2 inhibe la apoptosis inducida por Bid.

• Observación de la morfología.

•Análisis bioquímicos.

Conclusión: Bcl2 inhibe la apoptosis inducida por Bid.

Figura 2:

Objetivo: Estudiar el rol de Bcl2 sobre la liberación del citocromo cinducida por Bid

•Inmunoblot de fracciones subcelulares

•Inmunofluorescencia

Conclusión: Bcl2 bloquea la liberación del citocromo c de la mitocondria inducida por Bid

Figura 3

Objetivo : estudiar el papel de Bcl-2 en el procesamiento proteolitico de Bid.

• Inmunoblot.

Conclusión: Bcl-2 no evita el procesamiento de Bid..

Figura 4

Objetivo: determinar si Bcl-2 inhibe la translocación de Bid a la membrana mitocondrial.

• Inmunoblot de fracciones subcelulares.

Conclusión: Bcl-2 no impide la translocación de tBid a la mitocondria.

Figura 5:

Tratamiento alcalino:

Fraccionamiento subcelular (digitonina) Organelas

Carbonatoph 11.5

Centr. a 100.000gpor 1 hora.

Pellet:proteinas resistentes(integradas a mb.)

Sn:proteinas liberadas

(debilmente unidas a mb)

Figura 5:

Objetivo: determinar si Bcl-2 inhibe la inserción de tBid a la membrana mitocondrial.

Conclusión: Bcl-2 impide la inserción de tBid a la membrana mitocondrial.

•Densitometria de las bandas p15 (S1 y S2)

•Inmunoblot

Figura 6

Objetivo: determinar si Bcl-2 interactua directamente con tBid.

•Co-inmunoprecipitación de Bcl-2 y Bid/tBid. Inmunoblot.

Conclusión: Bcl-2 no interactua con tBid.

Figura 7

tBid Bax/Bak Translocación a la mb. mitocondrial.

Oligomerización Apoptosis

Objetivo: Bcl-2 inhibe la translocación de Bak/Bax inducida por tBid?

•Inmunoblot de fraccionamiento subcelular.

Conclusión: Bcl-2 impide la translocación de Bax a membrana mitocondrial.

Figura 8

células crosslinking digitonina pellet

Fracción de organelas

inmunoblot

Objetivo: analizar el estado de oligomerización de Bak/Bax en la fracción de organelas.

Conclusión: Bcl-2 bloquea la oligomirización de Bak/Bax inducida por Bid.

Fin de la historia:

Tres eventos importantes son bloqueados por Bcl-2:

•Bcl-2 suprime la inserción de tBid a la membrana de la mitocondria.

•Bcl-2 inhibe la translocación desde el citosol a la mitocondria de Bax, inducida por Bid.

•Bcl-2 disminuye la oligomerización de Bax y Bak inducida por Bid.

Chán, chán.