Aplikasi Labeling
-
Upload
randy-myken -
Category
Documents
-
view
233 -
download
0
Transcript of Aplikasi Labeling
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
1/28
PENGGUNAAN LABELING
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
2/28
Visualisasi Sel
Makhluk kecil seukuran sel :
Disaksikan pertama kali oleh Antonie van
Leeuwenhoek (Delft, Nederland, 1632 1732)
Tahun 1673, Leeuwenhoek membuat alatmikroskop sederhana
Ia menemukan Protista (1674), Bacteria
(1676), spermatozoa (1677) dan serat otot(1682)
Ia menyebut semua itu viva animalcula
(makhluk hidup kecil)
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
3/28
Sejak itu, mikroskop berkembang dan
mencapai bentuknya yang seperti sekarang
ini di abad ke 18-19 Louis Pasteur (1822-1895) memastikan di
bawah mikroskop keberadaan berbagai
mikroba yang menimbulkan penyakit. Pasteur juga membuktikan dengan
menggunakan mikroskop, bahwa pembusukan
makanan disebabkan oleh mikroba yangtumbuh dan berkembang biak di makanan
tersebut.
Pengamatan Pasteur germ theory
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
4/28
Gagasan tentang Sel
Semua itu pengamatan yang dilakukan
terutama terhadap makhluk sel tunggal
Robert Hook (1635-1703) menggunakan
mikroskop untuk melihat sayatan tipis gabus
Hook melihat satuan struktur rongga yang
seragam, mengingatkan kpd ruang-ruang kecil
di biara yang masing-masing didiami seorang
rahib & dinamai sel (cell)
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
5/28
Sejak itu istilah sel dipakai untuk gambarkansatuan terkecil, baik secara struktur mau
pun fungsi, dari makhluk hidup
Sel sebagai makhluk hidup dapat berdiri
sendiri makhluk sel tunggal (diamati
pertama kali oleh Leeuwenhoek)
Bagian dari makhluk banyak sel (pertama kali
dilaporkan Hook)
Tetapi penampilan sel makhluk sel tunggal
sel dari makhluk sel banyak
Pada yang terakhir, sel terikat satu sama lain
dg suatu cara & dg suatu bahan
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
6/28
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
7/28
Makhluk Sel Tunggal
Hidup sendiri-sendiri. Kelompok hanya
koloni : sel-sel bebas satu sama lain
Seragam hanya perlu dibedakan dengan
latar 2 cara pewarnaan :
Pewarnaan negatif : cukup mewarnai latar
belakang, sel sendiri tidak ditembus zat warna
pewarnaan dengan suspensi karbon (tinta
Cina / tinta India) atau pewarna nigrosin (zat
warna sintetis berwarna hitam)
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
8/28
Pewarnaan badan sel : pada bakteri yangterpenting pewarnaan Gram yang bertujuan
mewarnai dinding bakteri.
Dinding bakteri kaya peptidoglikan dan
berwarna biru oleh pewarna kristal ungu
sesudah bereaksi dengan I2 Gram (+):
dinding sel menahan pewarna
Bila ada dinding kedua lipopolisakarida (LPS),
larut o/ alkohol pelarut, pewarna kristal ungu+ I2 masuk sel warna merah Gram (-) :
dinding sel tidak menahan pewarna
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
9/28
Organisme Banyak Sel
Pewarnaan Haematoxylin-Eosin (HE)
Melihat struktur sel dan bagian-bagiannya
Melihat bagaimana sel dihubungkan satu dglain oleh jaringan ikat
inti dan sitoplasma harus terlihat
Jaringan ikat yang menghubungkan sel harustampak
Inti berwarna biru oleh haematoxylin
Sitoplasma & jar ikat merah oleh eosin
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
10/28
Pewarna H-E
Haematoxylin Eosin
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
11/28
Pewarnaan H-E dan yang serupa hanya
memperlihatkan inti, sitoplasma dan jaringan
ikat
Bagian lain dalam sel, apa lagi distribusi
protein tertentu seperti enzim dan berbagai
regulator tidak terlihat
Fisiologi sel yang lebih rinci tidak diketahui
Status metabolisme sel juga tidak difahami
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
12/28
Berbagai Cara untuk Mengatasi
Memperbesar daya pisah dengan mengatur
cahaya yang masuk :
- Mikroskop elektron
- Sinar elektron mudah diarahkan intensitasnya
- Mudah difokuskan dengan lensa
elektromagnetik dan elektrostatik
- Benturan elektron ke permukaan suatu
molekul akan hasilkan pendaran
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
13/28
Pendaran tersebut akan diproyeksikan ke layarmonitor yang berpendar
pembesaran dapat mencapai 1.1054.105 x
Dapat memperlihatkan berbagai struktur
subseluler lain selain inti
Dapat perlihatkan arsitektur dan anatomi
berbagai sel yang berbeda
Ada 2 jenis : transmission electron microscop
(TEM) & scanning electron microscop (SEM)
TEM : 2D, tembus ke dalam sel
SEM: 3D, terbatas permukaan
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
14/28
Perbandingan Gambar Lekosit PMN
secara TEM dan SEM
TEM SEM
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
15/28
Distribusi Senyawa dalam Sel
Apakah sel merupakan suatu kantong denganisi campur aduk tidak tertata ?
Gambaran yang diperoleh dari pewarnaan H-E
menunjukkan struktur umum yang khas bagisel
Struktur yang selalu ada dan muncul suatu
keteraturan
ada tatanan tertentu
bukansuatu campur aduk yang acak
Gambaran TEM sel menunjukkan tingkat
struktur (=organisasi) yang canggih
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
16/28
Struktur / organisasi yang canggih pastimempunyai komponen yang tersusun rapi di
tempat masing-masing
Berbagai senyawa dalam sel selalu ditemukan
sama / mirip, baik makromolekul mau pun
mikromolekul
Senyawa tersebut niscaya berada pd tmpt
tertentu dan muncul /mengalir menurut
cara-cara tertentu
Teknik mikroskopi biasa, meski pun dengan
resolusi dan pembesaran yg , tdk dapat
menentukan
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
17/28
Salah satu aplikasi awaldari penggunaan teknikialah untuk melihat,bagaimana nukleotida
digunakan dalamreplikasi DNA
gambaran garpureplikasi DNA (DNAreplication fork)
Sekaligus jelaskanmekanisme replikasi
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
18/28
Alternatif senyawa radioaktif untuk
penanda
Penggunaan senyawa radioaktif, walau pun
sangat canggih dan akurat, mempunyai
banyak masalah (T1/2, pembuangan, harga
yang mahal, peralatan, perlindungan dan SDMkhusus) harus ada alternatif lain
1. penggunaan senyawa berfluoresensi yang
diikatkan ke antibodi anti dari zat yangdipelajari
2. penggunaan enzim yang diikatkan ke
antibodi anti zat yang dipelajari
P b fl i
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
19/28
Penggunaan senyawa berfluoresensi
sebagai penanda
Fluoresensi : pemancaran cahaya oleh suatusenyawa, bila senyawa tersebut disinari oleh
suatu cahaya dengan < sinar yang
dipancarkan senyawa tsb (Stokes 1852)
Teknik pelacakan keberadaan suatu molekul
dalam sel menggunakan antibodi thd molekul
tersebut dan yang sudah ditandai dengan
suatu fluoresens dan dilihat dengan mikroskop
fluoresens dikembangkan o/ Albert Coon
(1912 1978)
Fluoresens paling umum FITC & rhodamin
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
20/28
Fluoresence Iso Thio Cyanate(FITC) Rhodamin
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
21/28
Imunofluoresensi Sel Otot PolosImunofluoresensi jaringan
glomerulus
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
22/28
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
23/28
Dikembangkan oleh Stratis Avrameas (1966),
Pierce (1967) dan Wide (1967)
Enzim yang digunakan :
Sedapat mungkin tidak ada dalam bahan yang
diperiksa
Dapat diarahkan untuk memberi reaksi warnayang langsung dapat dilihat dengan mikroskop
biasa : peroksidase dan fosfatase
Dapat diamplifikasi : sistem avidin-biotin
Menghasilkan kuantitatif ELISA dan teknik
visualiasi sel immunohistochemistry (IHC)
keduanya atas prinsip yang sama
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
24/28
Imunohistokimia (IHC) Imunoenzimatik kuantitatif (ELISA)
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
25/28
IHC untuk melacak antigen kanker
pada Ca-mammae
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
26/28
Aplikasi
RIA : Radioimmunoassay
menentukan ab at ag menggunakan reagen
bertanda zat radioaktif RAST : Radioallergosorbent test
RIA yg khusus digunkan utk menentukan
antibodi spesifik IgE
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
27/28
IRMA : Immunoradiometric assay
periksa ag dg cara menambahkan ab yg
bertanda zat radioaktif ELISA : utk menentukan ab
- antigen ikatkan zat padat
- + ab yg akan diperiksa- + ag yg bertanda enz (ex
peroksidase, fosfatase)
- substrat kromogenik yg bila brx dgenz terjadi perub warna
- perub warna sesuai dg jmlh enz yg
diikat
-
7/30/2019 Aplikasi Labeling
28/28
Tiamin
bebas
Tiamin
avidin
Biotin +
peroksidase
warna
Konsentrasi,
20, 30, 40, 50
Konsentrasi tetap
mis, 50
Intensitas warna ~ biotin-peroksidase ~ avidin