Análisis ultraestructural del músculo levator auris longus...

Análisis ultraestructural del músculo levatorauris longus de ratón intoxicado in vivopor la neurotoxina botulínica tipo A.

Elena Velasco1, Teresa Gledhill1, Cristhian Linares2 y Antonio Roschman-González3.

1Laboratorio de Microscopía Electrónica, Escuela de Medicina “José María Vargas”Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela,

2Postgrado de Toxicología, Hospital Leopoldo Manrique Terrero y3Postgrado de Zoología Tropical, Facultad de Ciencias, Universidad Central deVenezuela. Caracas. Venezuela.

Palabras clave: Toxina botulínica, ultraestructura, placa motora, célula muscular.

Resumen. En este estudio investigamos los cambios ultraestructurales acorto y largo plazo provocados por la toxina botulínica tipo A inyectada a do-sis sub-letales in vivo en el levator auris longus de ratones. La neurotoxina ac-tuó temporalmente sobre los terminales nerviosos e indujo una parálisis gene-ralizada que afectó la morfología de la preparación neuromuscular estudiadainfluyendo sobre: tamaño y complejidad de la terminación nerviosa, poblaciónvesicular, apariencia de las mitocondrias, fisonomía de las células deSchwann, desarrollo y distribución de los pliegues de la membrana postsináp-tica, y morfología de los núcleos de los diferentes elementos de la placa moto-ra. Además, la cantidad de tejido conectivo endomisial aumentó significativa-mente con relación a los casos control, siendo estos cambios marcados en lasprimeras semanas. Entre los 20 y 25 días, período correspondiente al procesode recuperación observamos terminales nerviosos de apariencia variable, unoscompletamente degenerados rodeados por restos de prolongaciones de célu-las de Schwann y otros nuevos contactos caracterizados ultraestructuralmen-te por su pequeño calibre y población vesicular escasa, rodeadas parcialmentepor la célula de Schwann, axones tempranamente mielinizados, pliegues si-nápticos escasamente desarrollados. Sesenta días posteriores a la inyección, elaxón terminal recobró su apariencia normal: las vesículas sinápticas llenabanel axoplasma, las mitocondrias exhibían crestas y densidades electrónicas deapariencia habitual. Se puede concluir que la toxina botulínica tipo A provocafenómenos de desnervación en el nervio terminal y en los componentes de laplaca motora. Las células de Schwann juegan un papel importante en la recu-peración morfofuncional de los terminales nerviosos y en su degradación.

Invest Clin 49(4): 469 - 486, 2008

Autor de correspondencia: Elena Velasco. Apartado Postal 6750 Carmelitas, Caracas 1010, Venezuela. Correoelectrónico: [email protected]

Ultrastructural analysis of mouse levator auris longus muscleintoxicated in vivo by botulinum neurotoxin type A.Invest Clin 2008; 49(4): 469 - 486

Key words: Botulinum toxin, ultrastructure, motor end plate, muscle cell.

Abstract. We studied the short and long term ultrastructural changesproduced by botulinum neurotoxin type A injected in vivo, at a sublethaldose, in mouse levator auris longus muscle. The neurotoxin had a temporaryeffect on nerve terminals which consisted in a generalized paralysis, that af-fected the following features of the neuromuscular sample’s morphology: sizeof the nerve terminals, vesicle population, mitochondrial appearance,Schwann cell’s morphology, development and distribution of post-synapticmembrane folds, and nuclear morphology of the different elements of the mo-tor end plate. Besides, the amount of endomysial connective tissue was signifi-cantly greater compared to non-intoxicated cases, and these changes weremore notorious during the first couple of weeks. 20 to 25 days after the injec-tion, during the recovery phase, we observed nerve terminals with a variableappearance: some completely degenerated, enveloped by Schwann cell pro-cesses, and new contacts characterized ultrastructurally for their small size,scarce vesicles, partially enveloped by Schwann cells, early myelinized axonsand barely developed synaptic folds. Sixty days after the injection, the axonterminal recovered its normal appearance: synaptic vesicles filled the axon’scytoplasm, and the mitochondria showed normal appearing cristae and elec-tronic densities. We conclude that botulinum neurotoxin type A produceschanges related to denervation of the nerve terminals and affects the motorend plate components. Schwann cells play an important role both in themorphofuntional recovery of nerve terminals and in their degradation

Recibido: 07-09-2007. Aceptado: 27-03-2008.

INTRODUCCIÓN

El estudio de las sustancias neurotóxi-cas representa una valiosa herramienta enel campo de la investigación morfofisiológi-ca, sobre todo, para el análisis de los meca-nismos de transmisión sináptica (1,2). Mu-chos de los progresos en la neurobiologíason el resultado de la utilización de neuro-toxinas, las cuales interactúan en forma es-pecífica con macromoléculas funcionales,canales de Na+ y K+ presentes en la mem-brana plasmática (3-5). Durante las últimasdécadas, numerosos avances en este campo

han surgido de experimentos realizados conneurotoxinas producidas por animales mari-nos, serpientes, abejas, escorpiones, entreotros (6-10).

El análisis de las neurotoxinas no seha limitado solamente a la investigaciónbásica, sino que ha sido asiento de nume-rosas aplicaciones terapéuticas, tal es elcaso de la toxina botulínica, y de otras sus-tancias curarizantes, que han sido utiliza-das en el tratamiento de diferentes desór-denes neurológicos (11-14). Un estudio re-ciente de las conotoxinas evidencia quepueden actuar como agente terapéutico

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para la isquemia cerebral y como analgési-cos eficaces (6, 7).

Las toxinas botulínicas son los agentesresponsables de una enfermedad poco fre-cuente conocida como botulismo. Estasproteínas bicatenarias, producidas por bac-terias anaeróbicas gram positivas del géne-ro Clostridium, se agrupan en siete seroti-pos diferentes (A-G), según sus propiedadesantigénicas. Se describen tres variantes epi-demiológicas de botulismo en el hombre:botulismo alimentario (serotipos A, B, Eproducidos por C. botulinum y C. butyri-

cum, y excepcionalmente, el serotipo F),botulismo infantil, toxi-infección producidapor la colonización del intestino principal-mente por el serotipo B, y el botulismo de

inoculación, en el que prevalecen los seroti-pos A y B (15, 16). Las toxinas botulínicasactúan esencialmente sobre el sistema ner-vioso periférico, afectando la transmisióncolinérgica entre: las neuronas pre y post-ganglionares, las neuronas post-gangliona-res del sistema nervioso parasimpático y susefectores, las terminaciones motoras coli-nérgicas y las fibras musculares. El meca-nismo de acción celular de las neurotoxinasbotulínicas, según el trabajo pionero deLance Simpson realizado en la década delos 80, comprende tres etapas: unión, inter-nalización y acción intraneuronal (15-20).La cadena pesada de la neurotoxina permi-te la unión a receptores específicos (gan-gliósidos y proteínas asociadas a vesículassinápticas conocidas como sinaptotagmi-nas) seguido de la internalización por endo-citosis del complejo toxina botulínica / re-ceptor. El reciclaje vesicular induce la in-ternalización de las toxinas. Posteriormen-te, la cadena liviana de la neurotoxina (me-taloproteinasa dependiente de Zn2+) experi-menta translocación hacia el citosol, dondese une a una o más de las proteínas SNARE(SNAP-25, VAMP-sinaptobrevina y sintaxi-na), que participan en la fusión de las vesí-culas sinápticas en los sitios de liberación,

inhibiendo así, la exocitosis dependiente deCa2+ de los neurotransmisores.(15-20). Laduración del efecto neuroparalizante de lasneurotoxinas está determinado por el re-cambio de las proteínas sinápticas, la vidamedia de la cadena liviana de la toxina en elcitosol, y el crecimiento de nuevos termina-les nerviosos. En este sentido, la toxina bo-tulínica tipo A no sólo induce parálisis delos músculos esqueléticos de mamíferos,sino que además, dispara in vivo un creci-miento de los terminales nerviosos, contri-buyendo así, a la recuperación funcional delmúsculo; estos hallazgos han sido utilizadospara interpretar las interrelaciones tróficasexistentes entre el terminal nervioso y lascélulas musculares (15, 16, 19, 21-24).

Ciertas preparaciones neuromuscula-res aisladas de mamíferos (diafragma, leva-

tor auris longus, soleus) han sido amplia-mente utilizadas en estudios morfológicos,bioquímicos y electrofisiológicos. El múscu-lo levator auris longus (LAL) en murinos,descrito por Angaut-Petit en 1989, repre-senta un modelo ideal para estudios morfo-lógicos sustentados sobre efectos a corto ya largo plazo de drogas y/o toxinas (25).Esta preparación neuromuscular tiene laventaja de poseer las terminaciones y rami-ficaciones nerviosas perfectamente visiblesdebido a sus características anatómicas.

En este trabajo, nos proponemos evaluarel grado de respuesta del nervio terminal delmúsculo LAL de ratón tras suministrar unadosis sub-letal de toxina botulínica tipo A,para así, caracterizar los daños a nivel ul-traestructural de los elementos constituyen-tes de la sinapsis y de la célula muscular.

MATERIALES Y MÉTODOS

Los experimentos se llevaron a cabo enratones machos suizos de pesos comprendi-dos entre 20 y 25 g, quienes fueron inyecta-dos localmente in vivo a razón de 0,45 pgde Clostridium botulinum tipo-A, y poste-

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Toxina botulínica tipo A en la ultraestructura del levator auris longus 471

riormente, sacrificados por dislocación cer-vical durante períodos comprendidos entre5 y 60 días. El músculo LAL de localizacióncervical fue utilizado para los estudios ul-traestructurales, siendo aislada la prepara-ción neuromuscular en una solución Rin-ger- Krebs burbujeada con oxígeno a fin demantener su integridad fisiológica. Losmúsculos aislados y desprovistos de tejidoconectivo fueron fijados en glutaraldehidoal 2,5% en una solución Buffer fosfato (pH7,4) y post-fijados con tetróxido de osmio al2% disuelto en el mismo buffer. Las prepa-raciones fueron deshidratadas en etanol enconcentraciones crecientes y embebidas enEpon 812. Pequeñas regiones del tejidoconteniendo minúsculas ramas nerviosasterminales fueron seleccionadas para elabo-rar los bloques de inclusión a los que poste-riormente, se les realizaron cortes semi-fi-nos coloreados con azul de toluidina (1%) yexaminados al microscopio de luz a fin delocalizar las placas motoras. Se realizaroncortes ultrafinos de las placas selecciona-das, se contrastaron con soluciones de ace-tato de uranilo y citrato de plomo, respecti-vamente, y finalmente fueron examinadasen un microscopio de transmisión Jeol1011 con una cámara marca Gatan incorpo-rada lo cual permitió digitalizar en formadirecta las imágenes ultraestructurales.Con el uso del programa Image Tool versión2.0 se cuantificaron los perímetros de losterminales axónicos, población vesicular,número de mitocondrias, número y profun-didad de los pliegues sinápticos. Con el pro-grama Statistica versión 7.0 se realizarónpruebas de análisis de la varianza (ANOVA),y pruebas a posteriori de Duncan, con unasignificancia de 5%.

RESULTADOS

El análisis cito-arquitectural de los ele-mentos pre y post-sinápticos de los sistemasmuscular y nervioso reveló la presencia de

terminales nerviosos degenerados y neofor-mados, además de células musculares conrasgos degenerativos.

Al aplicar la neurotoxina localmentein vivo a nivel del músculo LAL, (localiza-do en la región superficial entre la líneamedia del cuello y la base de la oreja) seprodujo dentro de las 24 horas siguientes,una postración completa de los animalesde experimentación aunado a la pérdida deapetito, condición que podía durar entredos a tres semanas. La parálisis parcial ototal de los animales de experimentaciónse debió al bloqueo producido en la regiónpresináptica, al inhibir la liberación dequantum de acetilcolina responsables detransmitir el estímulo nervioso a la célulamuscular. Esta interrupción provocó unaserie de cambios en los componentes de laplaca motora.

El análisis ultraestructural de la placamotora –zona diferenciada de contacto en-tre el axón desprovisto de mielina y la célu-la muscular– evidenció en los animales con-trol, tres componentes celulares: A nivelpre-sináptico, terminales nerviosos amielí-nicos estrechamente asociados a la célulade Schwann, caracterizados por la presen-cia de numerosas vesículas sinápticas pe-queñas (140 ± 20/µm2) de centro elec-trón-lúcido y diámetros cercanos a los 50nm cargadas en su interior con el neuro-transmisor (acetilcolina), y abundantes mi-tocondrias de diámetros de 0,39 ± 0,03µm. A nivel post-sináptico, se observaron in-vaginaciones subsarcolémicas de la célulamuscular (pliegues sinápticos), sitios de an-claje de numerosos receptores nicotínicos ala acetilcolina. Estos pliegues subsarcolémi-cos se encontraron en un número promediode 21 ± 3, con una profundidad de 1,64 ±0,16 µm y un perímetro total de 68,02 ±5,02 µm Entre ambas regiones se delimitóun espacio denominado frente sináptico deaproximadamente 60 nm de espesor, quecontenía la lámina basal (Fig. 1).


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Al comparar los elementos constitu-yentes de las terminaciones nerviosas delmúsculo levator auris longus control conlos tratados con la toxina botulínica se ob-servó que existían diferencias ultraestructu-rales apreciables en cuanto a: complejidad

de la terminación nerviosa, población vesi-cular, apariencia y número de las mitocon-drias, fisonomía de las células de Schwann,grado de desarrollo y distribución de lospliegues de la membrana postsináptica, asícomo la morfología de los núcleos de los di-ferentes elementos constituyentes de la pla-ca motora, además, la cantidad de fibras co-lágenas del tejido conectivo endomisial au-mentó con relación a los casos control.

Cinco días después de inyectar la toxi-na botulínica, los terminales nerviosos estu-diados mostraron variación significativa dela población vesicular (Tabla I), constatán-dose disminución en un 85% de las vesícu-las pequeñas electron-lúcidas (densidad ve-sicular de 66 ± 12 vesículas/µm2) y apari-ción de grandes vesículas de centro denso(dense-core vesicles), con un diámetro va-riable entre 80 y 150 nm, dispuestas aisla-das y/o en pequeños acúmulos de dos o másvesículas. Los organelos mitocondrialesmostraron variaciones en su diámetro queosciló entre 0,40 y 0,80 µm, así como en sunúmero y densidad electrónica

Las células de Schwann mostraronabundantes ribosomas aislados o formandoparte del RER, núcleos de gran tamaño conirregularidades profundas en sus membra-nas y cromatina densa formando grumosdispersos en el nucleoplasma, además denumerosas prolongaciones circundando alterminal nervioso. Algunas células muscula-res evidenciaron pérdida de la organizaciónde los pliegues subsarcolémicos y sus nú-cleos mostraron las mismas característicasultraestructurales descritas para las célulasde Schwann, no obstante el sistema con-tráctil lució un aspecto normal (Figs. 2-4).El número de pliegues subsarcolémicos dis-minuyó a 9 ± 1, correspondiente a un 54%;su profundidad y perímetro también se vie-ron afectados disminuyendo a 1,0 ± 0,1µmy 22,68 ± 5,83 µm, respectivamente. Todasestas variaciones morfométricas fueron es-tadísticamente significativas (Tabla I).

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Fig. 1. Micrografía electrónica de seccióntransversa de terminales nerviosos delmúsculo LAL control. Se observan pro-longaciones de la célula de Schwann(flechas) rodeando a los terminales axó-nicos que se caracterizan por presentarabundantes mitocondrias (m) y organe-los secretorios pequeños y claros las de-nominadas vesículas sinápticas (asteris-co). La región postsináptica se caracte-riza por mostrar abundantes y profun-das invaginaciones (pliegues sinápticos)(cabeza de flecha) Bar: 0.89 µm. Fig. 1-aCon mayor detalle se evidencian los ele-mentos descritos en la figura anterior.Bar: 1.93 µm.

Estos mismos rasgos de desorganiza-ción se manifestaron doce días después dela inyección. Algunos terminales nerviososmostraron una población vesicular adecua-da entremezclada con mitocondrias quepresentaban densidades electrónicas dife-rentes; otros, por el contrario, reflejaronsignos de pérdida completa de su poblaciónvesicular, los pliegues sinápticos sobresalie-ron por su gran tamaño y con numerosasirregularidades debido a la atrofia de la cé-lula muscular. El sistema contráctil teníauna apariencia normal con algunos focos dehinchamiento de los elementos del sistemamembranoso y de los organelos mitocon-driales, estos últimos con tendencia a for-

mar figuras mielínicas y glucogenosomas(Figs. 5 y 6).

Entre los 20 y 25 días, período corres-pondiente al proceso de recuperación de losanimales de experimentación, se observa-ron imágenes de terminales nerviosos deapariencia variable. Unos terminales com-pletamente degenerados rodeados por res-tos de prolongaciones pertenecientes a pro-cesos de células de Schwann (Figs. 7 y 8), yotros nuevos contactos caracterizados ul-traestructuralmente por ser de menor com-plejidad, con población vesicular escasa(72,50 ± 7,50 vesiculas/µm2), mitocondriascon un diámetro promedio de 0,27 ± 0,03µm rodeadas parcialmente por la célula de


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TABLA IANÁLISIS DE LA VARIANZA*

Análisis de la Varianza (ANOVA) Valores de P de las pruebas a posteriori de Duncan

Perímetro de los pliegues (µm)F = 5,63P= 0,003*n = 48

5 Días12 Días20 Días60 Días

12 Días0,817

20 Días0,3020,321

60 Días0,080*0,033*0,008*

Control0,008*0,003*0,001*0,199

Profundidad de los pliegues (µm)F = 6,82P= 0,000*n = 150


12 Días0,676

20 Días0,5500,307

60 Días0,0038*0,060*0,014*

Control0,004*0,005*0,001*0,771

Numero de plieguesF = 3,61P= 0,012*n = 48


12 Días0,981

20 Días0,5470,506

60 Días0,035*0,029*0,014*

Control0,024*0,001*0,000*0,832

#Ves/µm2

F = 2,71P= 0,032*n = 162


12 Días0,785

20 Días0,8380,650

60 Días0,024*0,014*0,039*

Control0,040*0,002*0,007*0,227

Diámetro de las mitocondriasF = 7,63P= 0,00*n = 168


12 Días0,569

20 Días0,2370,3564

60 Días0,005*0,002*0,002*

Control0,003*0,005*0,001*0,256

*Las P< 0,05 indican diferencias estadísticamente significativas.

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Fig. 2. Micrografía electrónica de sección transversa de terminales nerviosos del músculo LAL, 5 díasposteriores a la inyección de toxina botulínica tipo A. Se observa complejidad de los procesosde la célula de Schwann que entornan a los terminales axónicos (flechas). La población mito-condrial se observa disminuida y con pérdida de su densidad electrónica (m). Una disminuciónde la población de vesículas electrón transparentes (asterisco) y la aparición de grandes organe-los con centro electrón denso (flecha curva). La región postsináptica se caracteriza por mostrarinvaginaciones (pliegues sinápticos) menos profundas (cabeza de flecha). Bar: 1.6 µm.

Fig. 3. Micrografía electrónica de detalle de una terminación nerviosa del músculo LAL, 5 días posterio-res a la inyección de toxina botulínica tipo A. Se observan la aparición de vesículas de centro den-so (asterisco), mitocondrias con densidades electrónicas diferentes (m) y pérdida de la organiza-ción de los elementos constituyentes de la unión neuromuscular (cabeza de flecha). Bar: 2 µm.

Schwann, axones tempranamente mieliniza-dos, pliegues sinápticos escasos (7 ± 2),poco desarrollados con un perímetro pro-medio de 9,88 ± 1,74µm y una profundidadde 0,86 ± 0,19µm, o incluso ausentes(Figs. 9-10).

Por otro lado, algunas células muscula-res expuestas a la neurotoxina en este pe-riodo mostraron signos evidentes de dege-neración que se manifestaron por atrofia se-vera, pérdida de su organización, organelosmitocondriales con tendencia a formar figu-ras mielínicas y abundantes glucogenoso-mas (Fig. 11); otras presentaron alteracio-

nes a nivel del retículo endoplásmico lisocon sistema contráctil indemne donde sedestacan los núcleos pleomórficos de grantamaño y nucleolos evidentes (Fig. 12).

Sesenta días posteriores a la inyecciónde la toxina botulínica el axón terminal re-cobró su apariencia normal: las vesículas si-


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Fig. 4. Micrografía electrónica de detalle decélulas musculares LAL, 5 días poste-riores a la inyección de toxina botulíni-ca tipo A. En la parte superior la célulamuscular muestra pérdida de la organi-zación del sistema contráctil (flecha) yel retículo sarcoplásmico visiblementehinchado (cabeza de flecha), y la pre-sencia de estructuras lamelares (aste-risco). En contraste la célula muscularinferior, no se ve visiblemente afectada.Bar: 0,78 µm.

Fig. 5. Micrografía electrónica de seccióntransversa de terminales nerviosos delmúsculo LAL, 12 días posteriores a lainyección de toxina botulínica tipo A. Semuestra un terminal axónico visible-mente desprovisto de población vesicu-lar (asterisco), con escasas mitocon-drias alteradas (m). La región postsi-náptica muestra pliegues complejos de-bido a la orientación del corte (flecha),los elementos de la célula muscularmuestran retículo sarcoplásmico hin-chado (cabeza de flecha) y núcleosconspicuos (Nu) Bar: 0.85 µm.

nápticas llenaron el axoplasma con unadensidad de 100 ± 12 vesículas/µm2, lasmitocondrias exhibieron crestas y densida-des electrónicas de apariencia habitual condiámetros promedios de 0,48 a 0,36 µm; laregión postsináptica evidenció pliegues si-milares a los analizados para el control (Ta-bla I), con un perímetro de 49,31 ± 2,69µm y una profundidad promedio de 1,57 ±0,06µm (Figs. 13 y 14).

DISCUSIÓN

El conocimiento del mecanismo de ac-ción de las sustancias curarizantes y lasneurotoxinas botulínicas sobre la uniónneuromuscular ha permitido no sólo definirsus particularidades estructurales, sinocomprender los procesos de neurotransmi-sión y las interrelaciones que se establecenentre el sistema nervioso y el músculo es-triado (1, 20).

Las toxinas botulínicas ocasionan alte-raciones funcionales a nivel del sistema ner-vioso y en particular en la unión neuromus-cular. Esta unión, equivalente a la que seestablece en las sinapsis inter-neuronales,resulta de la aproximación de dos membra-nas plasmáticas, una presináptica axonal, yuna post-sináptica perteneciente a la célulamuscular, separadas por un espacio deno-minado frente sináptico. La lámina basal,extracelular, interpuesta entre ambas mem-branas, se extiende a la lámina basal de lacélula muscular acompañando a la membra-na postsináptica. Por otra parte, un conjun-to de especializaciones del sarcoplasma y delos núcleos de la célula muscular situadosen la vecindad inmediata de la unión, con-fiere particularidades especiales a esta zonabien diferenciada de cada célula muscular.Es a nivel de esta especialización que estáasegurada la transmisión del nervio almúsculo y la síntesis de las proteínas queintervienen directa o indirectamente en losmecanismos de transmisión nerviosa. Gra-cias a las técnicas de purificación y de ca-racterización, numerosas proteínas pre-si-nápticas, post-sinápticas o ligadas a la lámi-na basal sináptica han sido identificadas enla unión neuromuscular, e incluso han podi-do ser localizadas ultraestructuralmentecon métodos inmunocitoquímicos (1, 20).

Nuestros resultados muestran que loscomponentes que conforman la placa moto-ra de las preparaciones neuromuscularesestudiadas son afectados al ser tratados con

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Fig. 6. Micrografía electrónica de seccióntransversa de terminales nerviosos delmúsculo LAL, 12 días posteriores a lainyección de toxina botulínica tipo A.En el terminal nervioso superior (fle-cha) se observan mitocondrias con den-sidades electrónicas variables (m) yabundantes vesículas sinápticas (vs). Enel terminal axónico inferior y en la célu-la muscular (cabeza de flecha) se obser-van figuras mielínicas (asterisco) y mi-tocondrias con diferentes grados dedegeneración (M). Bar: 1.74 µm.


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Figs. 7y 8.

Micrografía electrónica de sección transversa de terminales nerviosos del músculo LAL, 20días posteriores a la inyección de toxina botulínica tipo A. Numerosos restos pertenecientes aprocesos de células de Schwann (flecha) se observan en el entorno de terminales axónicos(asterisco) parcialmente fagocitados, con abundancia de fibras colágenas del tejido conectivoendomisial (cabeza de fecha). Bar: 0.65 µm. Bar: 1.6 µm.

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Fig. 9. Micrografía electrónica de sección transversa de terminales nerviosos del músculo LAL, 20 díasposteriores a la inyección de toxina botulínica tipo A. Se observan terminales axónicos peque-ños neoformados (asterisco) carentes de pliegues sinápticos visibles (flecha), parcialmente ro-deados por restos de prolongaciones de células de Schwann (cuadrado). Bar: 0,95 µm.

Fig. 10. Micrografía electrónica de sección transversa de terminales nerviosos del músculo LAL, 20días posteriores a la inyección de toxina botulínica tipo A. Se observan terminales axónicospequeños neoformados (asterisco) con pliegues sinápticos incipientes (flecha) en contactocon células musculares de núcleos irregulares y nucleolo prominente (Nu). Bar: 1.18 µm.

la toxina botulínica tipo A. La toxina inyec-tada localmente in vivo en la región dondese localiza el músculo LAL del ratón, provo-ca una parálisis generalizada del modelo ex-perimental recuperándose gradualmentedespués de un período de dos semanas. Laparálisis se produce al haber un bloqueo dela liberación quántica de acetilcolina en elnervio motor afectado (26-30).

Los hallazgos ultraestructurales obser-vados en el presente trabajo semejan aaquellos descritos en lesiones secundarias auna axotomía caracterizadas por la destruc-ción de los terminales nerviosos y por alte-raciones de los componentes contráctiles ymembranosos de la célula muscular. Estaslesiones son debidas a la pérdida de la in-fluencia trófica del nervio motor sobre lacélula muscular, al suscitarse eventos queimpiden la generación del potencial de ac-

ción al bloquear la liberación de los neuro-transmisores (31, 32) Las neurotoxinas bo-tulínicas tipo A producidas por la bacteriaClostridium botulinum se unen a los termi-nales nerviosos periféricos, principalmentede tipo colinérgico, inhibiendo la liberaciónde acetilcolina al bloquear la transmisiónnerviosa, provocando fenómenos transito-rios similares a lo que ocurre al desnervarel músculo (31, 32). Las neurotoxinas hansido ampliamente utilizadas para entenderlos procesos propios de la degeneración y


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Fig. 11. Micrografía electrónica de seccióntransversa de célula muscular del LAL,20 días posteriores a la inyección de to-xina botulínica tipo A. Se muestra pér-dida del patrón de la célula, quedandorestos de organelos mitocondriales (m),algunas con tendencia a formar figurasmielínicas (fm), abundantes glucogeno-sómas (g), hinchamiento del retículosarcoplásmico (fecha) y núcleos deapariencia normal (N). Bar: 2µm.

Fig. 12. Micrografía electrónica de seccióntransversa de células musculares delLAL, 20 días posteriores a la inyecciónde toxina botulínica tipo A. Los núcleospertenecientes a las células muscularesposeen contornos irregulares, abundan-te heterocromatina y nucleolos conspi-cuos (Nu). Se observa un terminal axó-nico pequeño (flecha) con población ve-sicular escasa (asterisco) y mitocon-drias electrón transparente (m), caren-tes de pliegues sinápticos visibles(cabeza de flecha). Bar: 0.95 µm.

de la re-inervación de los componentes dela placa motora.

La actividad fisiológica neuronal semantiene gracias al equilibrio dinámicoexistente entre los mecanismos de exo y en-docitosis que regulan la población vesicularpresente en el nervio terminal (19). El ha-llazgo de terminales axónicos desprovistosde su población vesicular habitual sugiereuna afectación importante del reciclaje ve-sicular, lo cual se traduce en una reducción-transitoria- de la formación de las vesículassinápticas; resultados que coinciden con losdescritos para terminales nerviosos envene-nados con toxinas aisladas de Synancela

trachynis (33). Por otra parte, evidencia-mos que existe una correlación entre el nú-mero y el tipo de vesículas sinápticas pre-sentes en los terminales nerviosos de la pre-paración neuromuscular utilizada, similar alo observado en preparaciones de peces, an-fibios y mamíferos (33-35).

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Fig. 13. Micrografía electrónica de sección transversa de terminales nerviosos del músculo LAL, 60días posteriores a la inyección de toxina botulínica tipo A. Se observa prolongación de la célu-la de Schwann (cabeza de flecha) entornando al terminal axónico, caracterizado por presentarabundantes mitocondrias (m) y numerosas vesículas sinápticas (vs). Se evidencia abundantespliegues en la región postsináptica (flecha). Bar: 0,9 µm.

CONTROL 5 12 20 60

Tiempo (días)

4

6

8

10

12

14

16

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Media

Media ± ES

Fig. 14. Gráficas de Media y Errores estándar,que indican el valor promedio del perí-metro de los pliegues sinápticos, a lolargo de los días y en comparación conel control, con un asterisco se indicanlos puntos que según análisis de la va-rianza son estadísticamente diferentesal control.

La toxina botulínica tipo A, una vezque se internaliza en el terminal nervioso,afecta la población vesicular, ya que actúasobre el mecanismo exocitótico de libera-ción cúantica de la acetilcolina e interactúacon las proteínas SNARE que participan enla fusión de las vesículas sinápticas en elfrente sináptico. A diferencia de la toxinatetánica, la neurotoxina botulínica tipo Asólo afecta la exocitosis de las vesículas si-nápticas, más no la endocitosis a nivel delnervio terminal (17-19, 21-24).

Una importante población de vesículasgrandes de centro denso, con diámetroscomprendidos entre 80-150 nm se observa-ron en los primeros cinco días posteriores ala administración de la toxina botulínica.Estas vesículas de centro denso poseen unelevado contenido de péptidos neurotrans-misores (36), y se ha descrito que se dispa-ran cuando se provoca una intensa estimu-lación nerviosa (35-37). Las vesículas decentro denso contienen sustancias activasque podrían estar involucradas en la dife-renciación de la placa motora (38). La pre-sencia de estructuras que semejan en su ta-maño y apariencia a las vesículas de centrodenso han sido descritas dentro de las hen-diduras sinápticas, y la observación de di-chas estructuras en el sarcoplasma de la cé-lula muscular por debajo de la terminaciónnerviosa sugiere la posibilidad que los cen-tros densos pudieran ser liberados y toma-dos en la unión neuromuscular por un pro-ceso de exo y endocitosis (38).

Ultraestructuralmente y morfométrica-mente demostramos que la toxina botulíni-ca tipo A origina placas motoras de aparien-cia inmadura caracterizadas por escasacomplejidad y desarrollo de la hendidura si-náptica primaria, al igual que en el número,tamaño y profundidad de sus pliegues si-nápticos, resultados que coinciden con ladescripción de pequeños brotes nerviososterminales o nodales que participan activa-mente tanto en la remodelación sináptica

del LAL de mamíferos (39, 40) como en ba-tracios (41, 42). Esta simplificación propiade los elementos mesurables de la placamotora pudiera relacionarse con los even-tos descritos durante el desarrollo, regene-ración (43) o degeneración de la unión neu-romuscular (31, 32).

Al cabo de un período de tres semanasse evidenció una recuperación morfológicatotal de la sinapsis neuromuscular, que secaracterizó por la presencia de terminalesaxónicos con una población vesicular repre-sentativa, mitocondrias de aspecto normal ypliegues sinápticos desarrollados, con ca-racterísticas morfométricas similares a loscontroles. Este reestablecimiento morfoló-gico al parecer coincide con la recupera-ción funcional de la transmisión neuromus-cular que conlleva a la normalización delpatrón de actividad de la sinapsis que se lle-va a cabo en forma más rápida en losmúsculos lentos que en los rápidos (44).Una vez que la neurotoxina botulínica eseliminada, las terminaciones originales re-cuperan su funcionalidad y simultáneamen-te comienza la retracción de las terminacio-nes neoformadas (20).

Las células de Schwann estrechamenteasociadas a los terminales estudiados mos-traron un gran desarrollo del RER, lo cualse traduce en una intensa síntesis proteica.Estas células son sensibles al daño por suestrecha relación interdependiente con losterminales nerviosos, y precisamente estaactivación funcional podría ser un factorclave en la recuperación morfofuncional dela terminación nerviosa (45, 46). Al parecerlas células de Schwann reciben señales mito-génicas de la neurona (47) y los terminalesneoformados podrían estimular su división(48). Durante el período correspondiente alproceso de recuperación de los animales deexperimentación, se observaron imágenes determinales nerviosos completamente dege-nerados rodeados por restos de prolongacio-nes de células de Schwann. Estos hallazgos


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apoyan la hipótesis de la actividad fagocíti-ca desempeñada por las células de Schwanndurante el proceso de degeneración y rege-neración del terminal nervioso (49). Ade-más, las células de Schwann experimentanun proceso de regulación autocrina por elfactor de crecimiento fibroblástico 5, pro-teína descrita en macrófagos, células endo-teliales y musculatura lisa de las paredesvasculares (50).

El hallazgo de gran cantidad de fibrascolágenas en las inmediaciones de los ter-minales axónicos sugiere que los fibroblas-tos están relacionados con la secreción dediversos factores de crecimiento que contri-buirían a la formación de pequeños axonescarentes de pliegues de la membrana mus-cular. Además, los fibroblastos podrían su-frir un proceso de desdiferenciación haciacélulas de Schwann, evento que contribuiríacon los fenómenos de remodelación morfo-lógica y funcional anteriormente descritos(50).

Los cambios morfológicos que observa-mos en las células musculares están direc-tamente relacionados con la degeneraciónde los terminales nerviosos, tal como seconstató en la musculatura esquelética deratones con deficiencia de tenascin-C (51).En todos los casos, la degeneración del ter-minal axónico precede la degeneración dela célula muscular que se manifiesta porpérdida de la organización del sistema con-tráctil, hinchamiento de los elementos delretículo sarcoplásmico, aparición de figurasmielínicas y en casos avanzados, atrofiamarcada de la célula muscular (31).

El mecanismo de recuperación funcio-nal del terminal nervioso se ha relacionadocon las interrelaciones tróficas que se pro-ducen a nivel de la unión neuromuscular yque han sido evidenciadas con la aplicaciónespecífica de la toxina botulínica tipo A.Cuando se secciona el axón se destruyen losterminales nerviosos y se forman productosde degeneración del nervio terminal que se

sabe afectan la ultraestructura tanto de lacélula muscular como del nervio terminal(52) La hipótesis de que el músculo parali-zado secreta factores esenciales para el cre-cimiento y sobrevida de las motoneuronaspudiera estar relacionado con la presenciade células mioblásticas cercanas a los ter-minales afectados, hallazgos semejantes alos observados en otras afecciones neuro-musculares de etiología diversa (53, 54).

Podemos concluir que la toxina botulí-nica tipo A provoca fenómenos de desnerva-ción a nivel del nervio terminal y por ende,afecta los componentes de la placa motora.Las células de Schwann juegan un papel im-portante no sólo en la regeneración de losterminales nerviosos, sino también en la de-gradación de los mismos. La pérdida de laorganización de la célula muscular se rela-ciona estrechamente con los cambios dege-nerativos observados en los terminales ner-viosos. La persistencia de la atrofia de la cé-lula muscular, la disminución de la libera-ción quántica de acetilcolina y las fallas enla formación de nuevas placas motoras sonprobablemente efectos secundarios de lapresencia de axones funcionalmente defec-tuosos. La adecuada interacción entre la cé-lula de Schwann y el axón resulta funda-mental para la maduración y la inducciónde nuevas placas motoras (54).

AGRADECIMIENTO

Al TSU Edgar Mejía por su asistenciacon el microscopio electrónico y el procesa-miento de microfotografías.

Trabajo financiado por el CDCH-U.C.V.(Nº PI-09-12-5305-2003).

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