Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo

Instituto de Ciencias Básicas e Ingeniería

Lic. de Química en Alimentos

Análisis de Alimentos

Dra. Alicia del Carmen Mondragón Portocarrero

Trabajo: “Análisis de chocolate con leche Carlos V estilo suizo”

Por: Paulina Gutiérrez Macías

Noviembre, 2008

Análisis de chocolate con leche Carlos V estilo suizo.

1. Introducción

1.1 Fabricación del chocolate

El chocolate se fabrica con los productos del cacao (puntillas, masa, cacao y manteca) junto con azúcar y otros ingredientes según el tipo. El chocolate común (oscuro) se prepara haciendo pasar una mezcla de puntillas de cacao entre rodillos de acero. El chocolate caliente y la manteca de cacao adicional y cualquier sabor que se agregue se procesa (enconchando) aproximadamente a 70°C en una concha longitudinal o circular. El enconchado mejora la viscosidad, la textura y el sabor permitiendo que se desprendan productos volátiles indeseables como los ácidos: acético, propiónico y butírico. La humedad se elimina y se lleva a cabo la oxidación de los componentes con un sabor astringente. Después del proceso de templado, el chocolate líquido se coloca en moldes precalentados y pulidos y se deja enfriar. Las características especiales del chocolate se deben a las propiedades singulares de la manteca de cacao que se derrite a temperatura ligeramente menor a la del cuerpo humano y al azúcar refinado y las partículas de cacao. Para el chocolate con leche, la leche se precondensa con azúcar y se mezcla con licor de cacao, luego se seca para formar leche en polvo. La leche en polvo se mezcla con la manteca de cacao y se lleva a cabo el proceso como se describió con anterioridad, con excepción de que el enconchamiento se lleva a cabo a temperaturas inferiores y por un tiempo más breve. La crema de leche da más suavidad al chocolate con leche y permite que se funda más fácilmente. Durante el almacenamiento, el chocolate que no se ha fabricado en forma correcta o está mal empacado o almacenado puede formar una especie de pelusa blanca de grasa o una película gris y pegajosa de azúcar, ya que ésta última absorbe humedad del medio (Egan, 1998).

1.2 Composición

Tabla 1. Requisitos de la composición del chocolate |Tipo de chocolate |Sólidos totales |Sólidos secos |Manteca de cacao |Grasa (%|Sólidos de |Grasa de |Sacarosa (% | | |de cacao seco (%|sin grasa de |(% min.) |min.) |leche (%|leche (% |máx.) | | |min.) |cacao (%| | |min.) |min.) | | | | |min.) | | | | | | |Chocolate |35 |14 |18 |------ |------ |------ |------ | |Chocolate común |30 |14 |18 |------ |------ |------ |------ | |Chocolate con leche |25 |2.5 |------ |2.5 |14 |3.5 |55 | |Chocolate con leche |25 |2.5 |------ |25 |14 |< 3.5 |55 | |semidescremada | | | | | | | | |Chocolate blanco |------ |------ |20 |------ |14 |3.5 |55 |

(Egan, 1998).

1.3 Antecedentes del producto

Carlos V es una marca de chocolates de México. Originalmente, el chocolate era elaborado por una compañía de dulces mexicana, la Fábrica de Chocolates la Azteca, que fue adquirida en 1995 por Nestlé. Tras el cambio de propiedad de la marca, el chocolate cambió de sabor, haciéndolo más dulce, lo que hizo que disminuyera la demanda. La presentación original y más conocida de este chocolate es en barra al estilo suizo en su presentación de 23 g (http://www.es.wikipedia.org/wiki/Chocolate).

1.4. Descripción y características físicas del producto

Barra de chocolate lista para comer como golosina a cualquier hora del día. Carlos V también es un ingrediente para preparar deliciosos postres y pasteles. “Carlos V, el rey del chocolate”. • Tamaño: 9 cm de longitud, 2 cm de ancho. • Peso: 23 g • Forma: barra rectangular • Sabor: chocolate dulce, agradable • Olor: cacao, agradable • Color: café-marrón 1.4.1 Ingredientes: • Azúcar • Manteca de caco • Pasta de caco • Leche descremada en polvo • Grasa butírica • Lecitina de soya • Saborizantes artificiales

2. Muestreo

Una barra de chocolate es un material bastante homogéneo; es decir su composición es la misma en todas sus partes. Si se analiza el chocolate de una barrita, el primer paso para el muestreo consiste en triturarla en un mortero y transferirla de inmediato a un frasco bien tapado que se conservará a baja temperatura. Ahora bien, el sólido es demasiado blando y pastoso para que pueda ser triturado, lo que se puede hacer es meter el mortero junto con el pistilo y los trozos de chocolate a un congelador. Una vez congelado, el chocolate se vuelve quebradizo y puede triturarse, de esta manera se obtiene una muestra con mayor superficie de contacto.

3. Análisis físico

3.1 Determinación del punto de fusión

Fundamento

El punto de fusión de un compuesto sólido cristalino es la temperatura a la cual se encuentran en equilibrio la fase sólida y la fase líquida y generalmente es informado dando el intervalo entre dos temperaturas.

Procedimiento

Para cerrar los capilares, calentar el tubo de vidrio con un mechero y estirarlo cuando se ablande; luego fundirlo el extremo delgado para cerrarlo. Para llenar el capilar, pulverizar la sustancia en un vidrio de reloj con la punta de un agitador y aplicar el extremo abierto del capilar sobre la sustancia. Enseguida, tomar un tubo de vidrio de unos 30 cm de largo, apoyar un extremo en la mesa y dejar caer por arriba el capilar (el extremo cerrado hacia abajo), hasta que la sustancia quede en el fondo del capilar con una altura de unos 2 mm. Ahora cerrar con cuidado el capilar por su otro extremo. El capilar ya preparado se une al termómetro mediante una rondana de hule (la cual nunca debe tocar el aceite). La sustancia en el capilar debe quedar pegada al bulbo del termómetro.

Llenar el tubo de Thiele con aceite mineral (Nujol) hasta cubrir la entrada superior del brazo lateral y sostenerlo en un soporte con unas pinzas. Colocar el termómetro con el capilar en el corcho horadado, cuidando que el bulbo del termómetro y la muestra queden al nivel del brazo superior del tubo lateral, sin que el aceite toque la rondana de hule (porque se afloja y se cae el capilar). Comenzar a calentar suavemente el brazo lateral del tubo de Thiele con un mechero. Para conocer aproximadamente a qué temperatura funde la muestra, regular el calentamiento del tubo de Thiele de tal manera que la temperatura aumente a una velocidad de 20ºC por min. Preparar otro capilar con la muestra pulverizada. Repetir el procedimiento y una vez que falten unos 30ºC para llegar a la temperatura de fusión, disminuir la velocidad de calentamiento a 2ºC por min. El promedio de las dos temperaturas es el punto de fusión de la muestra (http://132.248.103.112/organica/1311/1311pp2.ppt).

3.2 Análisis organoléptico

Una verdadera cata requiere siempre el cumplimiento de unos requisitos previos. En primer lugar se debe tener en cuenta la temperatura ambiental del lugar donde se lleve a cabo, ya que por encima de los 21°C el chocolate perderá su textura. Cada uno de los catadores tendrá un plato donde se colocarán en orden las onzas de chocolate, empezando por el más delicado y finalizando por el más fuerte y con mayor cantidad de cacao. Justo al lado, pan sin condimentar, manzanas verdes y agua mineral con gas, que se intercalarán entre las diferentes degustaciones; y una ficha de cata donde el degustador anotará sus impresiones. Las servilletas de papel blancas serán absolutamente necesarias para limpiarse las manos y la boca, y deberán ser sustituidas a menudo para que las distintas trazas aromáticas no se mezclen entre sí (http://www.informativos.net/Noticia.aspx?noticia=46034 - 198k).

3.2.1 Análisis del sabor

Fundamento

Se realiza el análisis del sabor del chocolate a través del sentido del gusto.

Procedimiento

Una vez el chocolate triturado en la boca, lo se presiona suavemente entre la lengua y el paladar para que coja rápidamente temperatura y empiece a fundirse. Se reparte por toda la boca para alcanzar las distintas zonas de papilas gustativas y poder examinar todas sus características. Se identifican los sabores primarios propios del cacao, dulzor, acidez y amargor, y los secundarios, fruto de los distintos tipos de cacao utilizados, los ingredientes añadidos y el proceso de elaboración. Además se encuentra toda una serie de sensaciones táctiles como el tiempo de fusión, la cremosidad, la astringencia y naturalmente el equilibrio de sabores y aromas.

3.2.2 Análisis del olor

Fundamento

Se realiza el análisis del olor del chocolate a través del sentido del olfato.

Procedimiento

Los aromas del chocolate se analizan en dos fases, de forma directa e indirecta o “retronasal”. Se toma la pastilla o tableta y se acerca a la nariz aspirando los olores que desprende. Se deben encontrar los aromas primarios, es decir los característicos del cacao, y también los secundarios, o sea los correspondientes a los distintos cacaos utilizados en la combinación y los que aportan otros ingredientes y el propio proceso de elaboración. Seguidamente se tritura el chocolate, se deja fundir en la boca y se expira el aire. Así se vuelven a examinar los aromas primarios y secundarios, pero también su persistencia e intensidad.

3.2.3 Análisis del color

Fundamento

Se analiza la apariencia del chocolate a través del sentido de la vista.

Procedimiento

Se valora la uniformidad del color; la ausencia de zonas blanquecinas que indicarían que el chocolate ha sufrido oscilaciones de temperatura durante su conservación; la tonalidad, que puede abarcar casi toda la gama de marrones e incluso algunas notas rojizas en los chocolates puro o con leche, y el brillo, que denota una perfecta elaboración y una correcta conservación. También se examinamos la presencia de hendiduras o burbujas de aire en la pastilla o tableta y si se producen migas al romperla.

3.2.4 Análisis de la textura

Fundamento

Se analiza la textura del chocolate a través del sentido del tacto.

Procedimiento

Se comprueba la ductilidad del chocolate presionándolo con los dedos pulgar e índice para apreciar su capacidad de modelarse con el calor corporal. Se rompemos el chocolate, primero con las manos y después con los labios para comprobar la granulosidad, la ligereza y la textura. Deberá tenerse en cuenta que un buen chocolate jamás debe resultar pegajoso si se consume a la temperatura adecuada (alrededor de20ºC).

4. Análisis químico

El estudio químico del producto se hace en base al análisis proximal. La calidad del chocolate se evalúa al determinar: la humedad, la grasa, los azúcares, el nitrógeno, las purinas totales, las cenizas, las cenizas solubles en agua, la fibra cruda y los metales traza (por ejemplo, As, Pb y Cu), etc. No existe un método analítico oficial para la determinación de cacao y de sus derivados, sin embargo, su contenido se determina indirectamente por la cantidad de teobromina presente en el producto. En el análisis también se incluye la determinación de compuestos especiales como cafeína y teobromina. Además para evaluar la inocuidad del alimento se realiza el análisis microbiológico. Tabla 2. Datos analíticos para el chocolate con leche (Egan, 1998). |Parámetro |Porcentaje (%) | |Humedad |0.8-1.8 | |Cenizas totales |1.8-2.4 | |Cenizas solubles en agua |--------- | |Grasa |30-40 | |Sacarosa |35-47 | |Lactosa |7-11 |

|Almidón |--------- | |Nitrógeno total |0.8-1.5 | |Teobromina |0.2-0.5 | |Fibra cruda |0.4-1.0 |

4.1 Determinación de humedad

4.1.1 Método de Karl Fisher

Fundamento Se basa en el empleo del reactivo de Karl Fisher, el cual consta de yodo, dióxido de azufre, una amina (imidazol) en alcohol. Inicialmente el dióxido de azufre reacciona con el metanol para formar le ester, posteriormente éste es neutralizado por la amina. El ester es oxidado por el yodo a sulfato en una reacción que involucra al agua. Las reacciones químicas que tienen lugar son: A) CH3OH + SO2 + RN ( [RNH](SO4)CH3 B) H2O + I2 + [RNH](SO4)CH3 + 2RN ( [RNH](SO3)CH3 + 2[RNH]I Procedimiento Se añaden a la muestra yodo y un exceso de SO2, imidazol y metanol, posteriormente se coloca en una cámara cerrada protegida contra la humedad atmosférica, el exceso de I2 que no puede reaccionar con el agua se puede determinar visualmente. Este reactivo es un poderoso deshidratante, por lo que tanto la muestra como el reactivo deben protegerse contra la humedad del aire. El punto final de la titulación se puede detectar en forma visual, sin embargo, en la mayoría de las veces se usan instrumentos electrométricos comercialmente disponibles. En su forma más simple el reactivo funciona como indicador, la disolución muestra mantiene un color amarillo canario mientras haya agua, que cambia luego a amarillo cromato y después a pardo en el momento del vire. En su forma más simple el método potenciométrico consta de una fuente de corriente directa, un reóstato, un galvanómetro o un microamperímetro y electrodos de platino, en este caso es necesario que exista una diferencia de potencial que genere una corriente y también es importante que exista contacto del titulante con el analito. El reactivo se estandariza contra una solución tipo de agua en metanol o de un hidrato salino puro tal como el dihidrato de tartrato de sodio (http://www.monografias.com/trabajos15/determinacion-humedad/determinacion-humedad.shtml).

4.2 Determinación de ceniza

4.2.1 Determinación de cenizas totales por vía húmeda

Fundamento Descomposición de la materia orgánica en medio ácido por lo que la materia inorgánica puede ser determinada por gravimetría de las sales que precipiten, y también por algún otro método analítico para las sales que permanezcan en disolución acuosa o ácida. Procedimiento Pesar 5 g de muestra en un vaso de precipitados, adicionar 10 ml de ácido nítrico concentrado, calentar durante una hora hasta la obtención de un color translúcido, enfriar, recuperar, filtrar en un matraz aforado de 100 ml, aforar con agua. Tomar una alícuota de

10 ml y colocarlo en un vaso de precipitados de 250 ml a peso constante, evaporar a sequedad, colocar en estufa a peso constante. Calcular por diferencia de peso la cantidad de minerales en la alícuota y relacionarla con el aforo total. El procedimiento de repite para un blanco de referencia.

4.2.2 Alcalinidad de la ceniza

Fundamento Determinar el balance ácido-base de los alimentos y para detectar adulteración de los alimentos con minerales. Procedimiento Añadir a la ceniza 20 ml de HCl 0.1 M, disolver calentando en balo caliente y filtrar la solución a través de papel filtro Whatman número 54, evitar salpicaduras. Lavar la cápsula de evaporación y el papel filtro con agua destilada caliente, repetir haciendo otras dos extracciones ácidas. Enfriar la solución filtrada y titular con NaOH 0.1 M usando anaranjado de metilo como indicador. La diferencia entre los volúmenes del HCl añadido y el NaOH es debida a la alcalinidad de la ceniza. Calcular la alcalinidad expresándola en carbonato potásico (K2CO3). Nota: 1 ml de HCl 0.1 M= 0.00691 g de carbonato potásico (http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/mmedina/archivos/Practica7cenizas.pdf)

4.3 Determinación de grasa

4.3.1 Método de Röse Gottlieb

Fundamento En disolución alcalina el material se trata en frío con amoniaco y alcohol, y la grasa se extrae con una mezcla de éter y petróleo ligero. El alcohol precipita las proteínas, las cuales se disuelven en al amoniaco, entonces la grasa se puede extraer con el éter, luego se agrega el petróleo ligero ya que reduce la proporción de agua y también la presencia de sustancias solubles no grasas en el extracto, como la lactosa. Procedimiento Pesar la muestra en papel satinado previamente tarado. Encerrarla parcialmente para que pueda entrar en contacto con los reactivos e introducirla hasta el fondo en una probeta de 50 ml con tapa. Agregar 5 ml de agua destilada y agitar hasta que se la muestra se disperse totalmente, calentando si es necesario a 60 °C en baño de agua. Enfriar y agregar 1 ml de NH4OH concentrado. Agitar y agregar 5 ml de etanol. Agitar y agregar con pipeta aforada 10 ml de éter etílico. Agitar durante 30 s y agregar con pipeta aforada 10 ml de éter de petróleo. Volver a agitar y leer bien el volumen total de la mezcla. Dejar reposar entre 4 y 24 h en lugar fresco de modo de evitar la evaporación de solventes. Con pipeta aforada tomar 10 ml de la fase superior etérea y evaporarlos en un pequeño cristalizador tarado. Dejar enfriar en desecador, pesar y expresar como porcentaje de grasa en la muestra.

4.3.2 Método de Mojonnier

Fundamento Método de extracción intermitente o discontinua con disolvente. Se extrae la grasa con una

mezcla de éter de petróleo y éter etílico, principalmente, pero también participan el hidróxido de amonio y etanol. Se llevan a cabo tres periodos de extracción. La grasa extraída es secada y llevada a peso constante. El resultado se expresa en % de grasa por peso. Procedimiento Pesar 10 g de muestra y colocarla en el tubo de extracción Mojonnier. Adicionar 1 ml de hidróxido de amonio 0.88 y mezclar. Adicionar 10 ml de etanol, mezclar y enfriar. Añadir 25 ml de éter etílico, tapar el tubo y agitar vigorosamente por un minuto. Enfriar, agregar 25 ml de éter de petróleo y agitar vigorosamente por 30 s. Dejar reposar por 30 min o hasta que esté completamente separada la fase orgánica. Si es necesario, agregar agua destilada para establecer una interfase entre los dos líquidos en la parte más angosta del tubo. Decantar la fase etérea en un matraz bola previamente puesto a peso constante. Repetir la extracción tres veces usando una mezcla d etanol, 25 ml de éter etílico y 25 ml de éter de petróleo. Adicionando el extracto en el matraz bola. Evaporar el disolvente en rotavapor, secar el extracto lipídico en la estufa a 100°C por 1 h y pesar. Calcular el porcentaje de grasa por diferencia de pesada (http://www.biol.unlp.edu.ar/analisisdealimentos/tp-lipidos-08.doc -).

4.3.3 Determinación del contenido graso de la leche por cromatografía de gases

Fundamento A partir de la fracción grasa aislada del alimento se obtienen los ésteres metílicos de los ácidos grasos por transesterificación se realiza en condiciones tales que se minimicen las pérdidas de los ésteres de menor peso molecular (C4, C6, C8). Seguidamente se analizan cromatográficamente con ayuda de un estándar interno (valerianato de metilo) que de una señal separada y se determine el contenido en ácido butírico, que permitirá calcular el contenido de leche en el alimento. Procedimiento |Reactivos | |Metanol |Formiato de metilo | |Cambiador de iones fuertemente ácido |Disolución de metilato sódico 1% | |Toluol |n-heptano | |Cloruro cálcico de gano fino desecado 2 h a 105 °C |Butirato de metilo | |Valerianato de metilo |Disolución patrón y disoluciones patrón |

Preparación de reactivos Cambiador de iones fuertemente ácido: se mezclan 50 g de Dowex 50 WX-8 (tamaño de grano 20/50 mesh), después de embebidos en agua con 100 ml de formiato de metilo, dejándolo caer gota a gota. Se extiende el cambiador por la capa de vidrio formando una capa fina y se deja reposar durante 24 h. El contenido acuoso se ajusta al 35% aproximadamente, se guarda en un desecador. Poco antes de utilizarlo se mezclan 5 g del cambiador. Disolución de metilato sódico 1%: se añaden 100 ml de metanol al matraz Erlenemeyer y se mezclan con 1 g de sodio metálico enfriando el matraz por fuera con agua helada. La disolución se pasa a un frasco pequeño y se refrigera. Las disoluciones con turbidez o sedimento se deben desechar. Disolución patrón: se pesa 1 g de éster metílico del ácido butírico y 1 g de ácido valeriánico con una precisión de ± 0.5 mg en un matraz de 50 ml y se enrasa con n-heptano (c= 20 mg/ml para cada éster).Disolución patrón: I: se pesa 1

g de valerianato de metilo con una precisión de ±0.5 mg en un matraz aforado de 50 ml y se completa con n-heptano (c= 20 mg/ml). II: se pasan 5 ml de disolución patrón I a un matraz de 50 ml y se enrasa con n-heptano (c= 20 mg/ml). a) Preparación de la muestra de grasa En un matraz redondo de 25 ml se pesan unos 500 mg de grasa aislada ± 0.5 mg y se disuelven en n-heptano. Dependiendo de la cantidad de ácido butírico esperado en la grasa total se añade la cantidad correspondiente de patrón externo: 1 ml de la disolución patrón I para un contenido de 1.5 a 4 % de ácido butírico (por ejemplo para mantequilla o para mezclas con más del 50% de mantequilla) y 1 ml de la disolución patrón II si el contenido de ácido butírico es inferior a 1.5%. Se mezcla con 0.4 ml de la disolución de metilato de sodio y se calienta a ebullición durante 20 min refrigerando a reflujo en ausencia de humedad. A continuación, el matraz se enfría a 15-20°C sin quitar el refrigerante, se añaden 0.3 g del cambiador iónico, se cierra el matraz con un tapón esmerilado y se agita durante 2 min. Después se añade más cambiador iónico (0.2 g), se agita el matraz y se deja reposar durante 5 min. Se decanta la solución de ésteres a un segundo matraz redondo con 0.2 g de cloruro de calcio desecado; no debe caer nada del cambiador iónico al segundo matraz. Se agita la disolución durante 2 min, se mezcla de nuevo con 0.2 g de cloruro de calcio, se vuelve a agitar y se deja reposar durante 10 min. Si el sobrenadante está turbio se centrifuga 5 min a 2000 rpm. En el cromatógrafo se inyectan de 0.2 a 0.5 µl de la disolución límpida. A continuación se realiza el cromatograma de la disolución patrón (Mattisek y col, 1998)

4.4 Determinación de proteína

4.4.1 Determinación de proteína por el método Kjeldahl

Fundamento Digestión húmeda de la materia orgánica y cuantificación del amoniaco producido a partir del amoniaco. Etapas: 1. Digestión. • Oxidación de proteína y compuestos orgánicos por H2SO4 concentrado • Fijación de nitrógeno como sulfato de amonio Durante el proceso de digestión ocurre la deshidratación y carbonización de la materia orgánica combinada con la oxidación de carbono a dióxido de carbono. El nitrógeno orgánico es transformado a amoniaco que se retiene en la disolución como sulfato de amonio. La velocidad del proceso puede ser incrementada adicionando sales que abaten la temperatura de descomposición (sulfato de potasio) o por la adición de oxidantes (peróxido de hidrógeno, tetracloruro, persulfatos o ácido crómico) 2. Destilación: Desprendimiento de amoniaco por una base fuerte. El amoniaco puede ser recuperado en: ✓ Agua ✓ Ácido fuerte ✓ Ácido bórico (anfótero) 3. Titulación: Ácido-base Si el amoniaco se retiene en agua o en ácido bórico la titulación es directa, si es recuperado en un exceso de ácido fuerte la valoración se realiza por retroceso. Procedimiento

Pesar de 0.1 a 0.2 g de muestra e introducir en un tubo de Kjeldahl, agregar 0.15 g de sulfato de cobre pentahidratado, 2.5 g de sulfato de potasio o sulfato de sodio y 10 ml de ácido sulfúrico concentrado. Encender el aparato y precalentar a la temperatura de 360°C. Colocar el tubo en el portatubos del equipo Kjeldahl y colocarlo en el bloque de calentamiento. Poner la unidad de evacuación de gases con las juntas colocadas sobre los tubos de digestión. Accionar la campana de succión de gases antes de que se produzcan éstos. Calentar hasta la total destrucción de la materia orgánica, es decir, hasta que el líquido esté transparente, con una coloración azul verdosa. Una vez finalizada la digestión, sin retirar la unidad de evacuación de gases, colgar el portatubos para enfriar. Apagar el equipo y desconectar la trampa. En un matraz de Erlenmeyer de 250 ml adicionar (según se indique) 50 ml de HCl 0.1 N y unas gotas de indicador rojo de metilo 0.1 % o bien 50 ml de ácido bórico 4% con indicadores (fenolftaleína 0.035 mg%, rojo de metilo 6.6 mg%, verde de bromocresol 3.3 mg%). Conectar el aparato de destilación y esperar unos instantes para que se genere vapor. Colocar el tubo de digestión con la muestra diluida, las sales disueltas en un volumen no mayor a 10 ml de agua destilada y 40 ml de hidróxido de sodio 0.1 N, en el aparato de destilación, cuidando de introducir la manguera (que se halla conectada al refrigerante) hasta el fondo de la disolución del matraz Erlenmeyer. Destilar hasta alcanzar un volumen de destilado en el matraz de 100-150 ml. En el caso de recibir el destilado en HCl 0.1 N titular el exceso de ácido con una solución de NaOH 0.1 N. En el caso de recibir con ácido bórico, valorar con una solución de HCl 0.1 N. El procedimiento de repite para un blanco.

4.4.2 Determinación de proteína por el método de Lowry

Fundamento Método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color de la disolución resultante proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer. Este método consta de dos etapas: • Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con tartrato.

• La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso. Procedimiento Reactivos • Reactivo A: Na2CO3 al 2%, NaOH 0.1 M • Reactivo B1: CuSO4·5H2O al 1% • Reactivo B2: tartrato sódico-potásico al 2% • Reactivo C: Se prepara en el momento de iniciar el ensayo, mezclando A, B1 y B2 en

proporciones 50:0.5:0.5 (en volumen) • Reactivo Folin Ciocalteau: reactivo comercial diluido a 1/4 • Solución patrón de albúmina de suero bovino (BSA) de concentración 2 mg/ml

Para determinar la concentración de proteínas de la muestra problema se construye una curva patrón o de calibrado a partir de una solución patrón (BSA) (2 mg/ml). La concentración que tienen las muestras problema se determina por interpolación de los valores de absorbancia en la curva patrón. El tubo 0, que sólo contiene agua destilada y los reactivos, sirve de blanco para el ajuste del colorímetro a cero de absorbancia.

Numerar del 0 al 6, tubos de plástico de 10 ml. Pipetear las cantidades de agua, solución patrón de albúmina y solución problema señaladas en la tabla (abajo). Preparar el reactivo C, a partir de A, B1 y B2. Pipetear a todos los tubos el reactivo C. Mezclar el contenido de cada tubo y dejarlo reposar 10 min en oscuridad. A continuación añadir a todos los tubos el reactivo de Folin (diluido 1/4), mezclando bien. Dejar reposar 20 min en oscuridad para que se desarrolle completamente la reacción coloreada. Leer las absorbancias en el colorímetro a 580 nm. Previamente el aparato se ajusta a A=0 con el blanco (tubo nº 0); de esa forma sólo se mide el color producido por las proteínas, puesto que se resta el color debido a los reactivos.

Preparación de la curva de calibrado y muestra:

|Tubo |Agua |Patrón |Problem|Reactivo|Folin |A580|mg | | | |(2mg/ml) |a |C |diluido | |prot/tubo| |0 |1,0 |-- |-- |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | | |1 |0,9 |0,1 ml |-- |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | | |2 |0,8 |0,2 ml |-- |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | | |3 |0,7 |0,3 ml |-- |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | | |4 |0,6 |0,4 ml |-- |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | | |5 |0,7 |-- |0,3 ml |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | | |6 |0,5 |-- |0,5 ml |5 ml |0,5 ml | | | | |ml | | | | | | |

(http://www2.uah.es/mapa/Professor%20Sample%20Site/activos/practicas/Lowry.doc –)

4.4.3 Determinación de proteína por el método de Biuret

Fundamento

Formación de un complejo colorido entre enlaces peptídicos y ión cúprico en medio alcalino. El complejo presenta un color violeta característico, que se puede observar a 310

nm o 540-560 nm, el cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se basa en al desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido.

Procedimiento

Reactivos • Reactivo del Biuret (sulfato de cobre 0.15%, tartrato de sodio y potasio 0.6% y NaOH 0.3%) • Soluciones patrón de albúmina bovina de concentración: 4.0, 6.0, 8.0 y 10 g/dl • Hidróxido de sodio al 3%

Colocar 1 ml de la solución de proteína adecuadamente diluida en tubos de ensaye perfectamente etiquetados, y adicionar 4 ml de reactivo de Biuret. Mezclar y dejar en reposo 30 min a temperatura ambiente, determinar la absorbancia del color violeta producido a 540 nm contra un blanco preparado de la misma manera con 1 ml de solución en que se encuentra diluida la muestra.

La concentración de proteína se obtiene por referencia a una curva de calibración preparada con albúmina bovina sérica con concentraciones de 1 a 10 mg/ml.

4.4.4 Determinación de proteína por el método de Bradford

Fundamento Se emplea un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en medio hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende, pues de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y líquidos orgánicos como el metanol. Procedimiento Colocar en un tubo de ensaye etiquetado 0.1 ml de muestra adecuadamente diluida. Adicionar 5 ml de reactivo de colorante (Azul Brillante de Coomasie G-250 0.1 mg/ml con ácido fosfórico al 8.5% y etanol al 4.75%). Mezclar perfectamente en vórtex o por inversión del tubo. Dejar reposar por 5 min a temperatura ambiente. Leer la absorbancia a 595 nm frente a un blanco. La concentración de proteína de calcula a partir de una curva de calibrado preparada con una solución de albúmina bovina sérica de 1 a 10 mg/ml, tratada de la misma manera que la muestra problema.

4.4.5 Determinación de proteína por espectrometría de absorción UV

Fundamento La mayoría de las proteínas muestran una absorción a 280 nm, la cual se atribuye al grupo fenólico de la tirosina y al grupo indólico del triptófano. Se toma en cuenta la absorción del disolvente ya que éste puede absorber en la misma región. Procedimiento

Colocar la disolución problema debidamente diluida en una celda del espectrofotómetro. Determinar la absorbancia a 280 nm, usando como blanco la solución en que se encuentra preparada la muestra. La concentración de proteína se obtiene por referencia a una curva de calibrado preparada con albúmina bovina sérica en concentraciones de 50 a 500 µg/ml.

4.4.6 Determinación de proteína por el método de Dumas (sistematizado)

Fundamento Destrucción de la materia orgánica a través de una combustión en una atmósfera rica en oxígeno. Todo el producto de la combustión pasa a través de un tamiz molecular conformado por perclorato de magnesio anhidro e hidróxido de sodio en base de tierras raras. Una vez que el tamiz molecular retiene los gases no deseados, el nitrógeno es arrastrado hacia la celda de detección con gas Helio o Argón y es cuantificado por conductividad térmica. Procedimiento Pesar 1 g de nuestra homogeneizada sobre un papel de estaño (tin foil) o cápsula de gel. Doblar el papel de estaño con el objeto de contener la muestra. Identificar la muestra en la computadora e ingresar también el peso. Colocar la muestra dentro del horno de combustión y presionar el botón “ANALISIS”. El resultado de proteína se mostrará automáticamente en el software del equipo (http://www.inboxsa.com/Comparaci%F3n%20entre%20los%20m%E9todos%20Kjeldahl%20y%20Dumas%20para%20el%20an%E1lisis%20de%20Prote%EDna.pdf).

4.4.7 Determinación de proteínas de la leche

Fundamento La caseína, al contrario de otras proteínas, es soluble en solución de oxalato de sodio. El método se basa en esta distinción. Procedimiento Pesar exactamente 10 g de muestra finamente triturada en un tubo para centrífuga, adicionar dos porciones de 100 ml de éter, centrifugar y decantar el líquido sobrenadante en cada adición. Secar el residuo en estufa a 100°C, el residuo se vuelve a triturar con ayuda de una varilla de vidrio. Agregar 200 ml de una solución de oxalato de sodio, se deja reposar durante 4 h, agitando frecuentemente. Centrifugar y filtrar a través de un papel filtro. Descartar los primeros 5-10 ml del filtrado y determinar nitrógeno en 50 ml de este filtrado. Transferir 100 ml del filtrado a un matraz volumétrico de 200 ml y aforar hasta la marca. Precipitar las proteínas adicionando 2 ml de ácido acético glacial, agitar filtrar y determinar el nitrógeno en 100 ml del filtrado. La diferencia del nitrógeno entre un filtrado y otro representa el nitrógeno de la caseína en 2.5 g de muestra. Este valor, multiplicado por 4 y por 6.38 es igual a la proteína contenida en 10 g de muestra utilizada en el análisis. El total de proteína de leche es igual a: caseína X 1.25 (Jacobs, 1938).

4.5 Determinación de fibra

4.5.1 Determinación de fibra bruta según Scharrer-Kürschner

Fundamento

El material a investigar una vez triturado, y en este caso, desengrasado, se trata con una mezcla ácida, se filtra, el residuo se lava con etanol y éter, se seca y se pesa. Después de incinerado, se resta el contenido en cenizas del peso que se obtuvo anteriormente.

Procedimiento

|Reactivos | |Mezcla ácida: disolver 25g de ácido tricloacético en 500 ml de |Etanol 96% (v/v) | |ácido acético 70%, mezclar con 124 ml de ácido nítrico 65% y | | |completar hasta 1 L con ácido acético 70%. | | |Éter etílico (intervalo de ebullición 34-35°C) |Éter de petróleo (intervalo de ebullición 30-60°C) |

a) Tratamiento previo

Para desengrasar la muestra ésta se lava, antes de pesarla, de dos a tres veces con éter de petróleo, el cual se elimina por decantación, y el resto del disolvente se deja evaporar.

b) Tratamiento

Cantidad de muestra: depende del contenido de fibra bruta (3-20 g).

La muestra se pesa exactamente, se pasa al matraz de fondo plano y se mezcla con 80 ml de mezcla ácida (primero se añaden sólo 60 ml, el matraz se agita enérgicamente y se lava la pared interior con los 20 ml restantes). Se calienta a reflujo durante 30 min y a continuación se enfría al aire primero y después al chorro de agua. El papel libre de cenizas se seca durante 1 h a 103 ± 2 °C, se enfría en el desecador y se pesa exactamente. El contenido del matraz se pasa por el papel filtro con ayuda de un matraz kitasato y de vacío. El matraz se enjuaga con agua caliente, con lo que deberá lavarse el papel filtro libre de ácidos (el pH se determina con las tiras indicadoras); el kitasato se vacía varias veces, debido a que el ácido acético es muy volátil y reduce el vacio retardando el lavado. Se lava el residuo tres veces con 10 ml de etanol y dos veces con 10 ml de éter etílico. El papel filtro con el residuo se pasa a un crisol previamente secado y pesado y se seca durante 1 h a 103 ± 2°C, se enfría en el desecador y se pesa exactamente.

c) Incineración

El papel filtro junto con el residuo se incineran durante 1 h aproximadamente a 700 °C. Se enfrían en un desecador y finalmente se pesan las cenizas (Matissek y col, 1998).

4.5.2 Determinación de fibra por el método de Southgate

Fundamento

El método fracciona a la fibra en polisacáridos no celulósicos insolubles y solubles;

celulosa y lignina. La lignina es determinada gravimétricamente y el contenido de polisacáridos es determinado a partir de constituyentes que son medidos colorimétricamente.

Procedimiento

Se extraen los azúcares libres de la muestra con metanol al 85% y los lípidos se extraen con éter. La muestra se incuba toda la noche con takadiastasa® para hidrolizar el almidón. Se extraen los polisacáridos solubles con agua caliente (fibra soluble) y se centrifuga la muestra para precipitar la fibra insoluble (fracción I). Luego se añaden 4 volúmenes de etanol al sobrenadante y se centrifuga la muestra para precipitar las fibras solubles (fracción II). Se hidrolizan la fracción I y la fracción II con H2SO4 durante 2.5 h a 100°C, se centrifuga la fracción I y se lava el sedimento de la fracción I con etanol al 50% y se combina este lavado con etanol con el sobrenadante de la fracción I. Se hidroliza la celulosa del sedimento de la fracción I con H2SO4 por 24 h a 0-4°C, se filtra el ácido hidrolizado. Se lava el sedimento del filtro con agua. Se seca la muestra y se pesa, posteriormente se incinera el residuo. La pérdida de peso se denomina lignina de klason. Se miden mediante colorimetría las hexosas, pentosas y ácidos urónicos de los hidrolizados ácidos 1n de las fracciones I y II así como las hexosas y pentosas de los hidrolizados de H2SO4 al 72%. La fibra es la suma de los azúcares más el peso de la lignina (http://www.docencia.izt.uam.mx/lyanez/analisis/material_adicional/fibranotas.ppt –).

4.5.3. Determinación de fibra dietaria por tratamiento con proteasas

Fundamento

Se basa en la digestión in vitro de la muestra con pepsina y pancreatina.

Procedimiento

La muestra puede ser liofilizada, o bien ser el residuo insoluble luego de una extracción con alcohol. En productos ricos en lípidos es necesario extraerlos antes del análisis con alcohol/benceno o alcohol/cloroformo. La muestra debe molerse para pasar a través de una malla de 0,5 mm.

Calentar un 1 g de muestra con 50 ml de agua a 100°C por 15 min, agregar 50 ml de HCL 0.2M e incubar con 100 mg de pepsina durante 18 h a 40°C. Neutralizar, agregar 50 ml de buffer fosfato de sodio 0,1M, pH 6,8, e incubar con 100 mg de pancreatina durante 1 h a 40°C. Acidificar a pH 4-5, centrifugar y lavar el residuo con agua.

Lavar el residuo con acetona y secar a 105°C toda la noche, pesar, el residuo obtenido es la fibra insoluble en agua.

El sobrenadante que se obtiene al centrifugar se debe precipitar con 4 volúmenes de etanol a 95%, centrifugar y lavar el sedimento con etanol al 80%. Secar en atmósfera de nitrógeno a 50-60°C durante 1 h, el residuo obtenido es la fibra soluble en agua (http://www.biol.unlp.edu.ar/analisisdealimentos/tp-fibra-08.doc -).

4.6 Determinación de carbohidratos

4.6.1 Determinación de sacarosa por polarimetría

Fundamento Una muestra de ensayo se trata con hidróxido de amonio, para llevar a la mutorrotación de la lactosa hasta el equilibrio final. Se neutraliza y luego se clarifica por adiciones sucesivas de acetato de zinc y hexacianoferrato de potasio (II), seguido de filtración. La rotación óptica se determina sobre una porción de filtrado. Sobre otra porción de filtrado se induce la inversión (basada en el principio de Clerget) por hidrólisis ácida moderada de la sacarosa, dejando lactosa y otros azúcares virtualmente no afectados. La rotación óptica de determina después de la inversión. El contenido de sacarosa se calcula a partir del cambio en la rotación óptica en la inversión. Procedimiento Se pesan, aproximadamente 20 g de muestra representativa, se desengrasa durante 4 h en un extractor Soxhlet, luego se seca en estufa a 100 ºC ± 2 ºC, repitiendo el secado hasta que dos pesadas sucesivas no difieran en más de 0.5 mg. Transferir la muestra a un vaso de precipitado de 250 ml y adicionar 50 ml de agua caliente (80-90°C) y mezclar bien. Transferir la mezcla cuantitativamente a un matraz volumétrico de 200 ml, enjuagando el vaso de precipitado con sucesivas cantidades de agua a 60°C, hasta que el volumen total esté entre 120 y 150 ml. Mezclar y enfriar a 20 ± 2 °C. Agregar 5 ml de solución de hidróxido de amonio al 3.5%, mezclar vigorosamente y mantener durante 15 min a 20 ± 2°C. Posteriormente se neutraliza el hidróxido de amonio mediante la adición de una cantidad estequiométrica equivalente al ácido acético al 12%, sin dejar de mezclar se agregan 12.5 ml de solución de acetato de zinc 1 M y de la misma manera se agregan 12.5 ml de solución de hexacianoferrato de potasio (II) 0.25 M. Llevar el contenido del matraz a 20°C y diluir hasta el aforo con agua a 20 °C. Desde esta etapa, todas las adiciones de agua o reactivos se deben hacer de tal manera de evitar la formación de burbujas de aire y, con el mismo objetivo en vista, todas las mezclas se deben llevar a cabo mediante rotación de matraz más que por agitación. Si se encuentran presente burbujas de aire antes de completar la disolución a 200 ml, se pueden remover conectando el matraz a una bomba de vacío y rotando el matraz. Cerrar el matraz con un tapón seco y mezclar minuciosa mediante agitación. Dejar decantar al precipitado por unos pocos minutos y luego filtrar la solución a través de un papel filtro seco, descartando los primeros 25 ml de filtrado. Determinar la rotación óptica del filtrado a 20 ± 2°C. Colocar mediante pipeta 40 ml de filtrado dentro del matraz volumétrico de 50 ml, agregar 6 ml de ácido clorhídrico al 22%. Colocar el matraz durante 15 min en el baño de agua regulando a 60°C, estando el matraz inmerso hasta la base del cuello. Mezclar por rotación el matraz durante los primeros 5 min, tiempo en que el contenido del matraz debería haber alcanzado la temperatura del agua del baño termorregulado. Enfriar a 20 °C y diluir hasta el aforo con agua a 20°C. Mezclar y mantener durante 1 h a esa temperatura. Determinar la rotación óptica de la solución invertida a 20 ± 2°C.

4.6.3 Determinación de azúcares por HPLC con detector de índice de refracción (IR)

Fundamento

El método se basa en determinar el contenido de azúcares: fructosa, glucosa y sacarosa mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con detector de índice de refracción (IR). La identificación se efectúa mediante los tiempos de retención, y la cuantificación se realiza según el método del estándar externo a través de las áreas de los picos o bien la altura de los mismos. Procedimiento a) Preparación de estándares Pesar 2 g de sacarosa, 0.25 g de glucosa y 0.25 g de fructosa. Disolver las cantidades indicadas en 40 ml de agua y transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml, que contiene 25 ml de metanol. Aforar con agua y agitar hasta homogeneizar completamente. Filtrar la solución obtenida a través de un filtro de membrana con tamaño de poro de 0.45 µm, con ayuda de una jeringa y guardarla en un frasco. b) Preparación de la fase móvil Mezclar 8 partes de volumen de acetonitrilo y 2 partes de volumen de agua. Esta solución se debe desgasificar antes de su uso. c) Preparación de la muestra Se sigue el mismo principio que para el punto 4.7.2 (determinación de teobromina y cafeína por HPLC). Parámetros para HPLC: • Velocidad de flujo: 3 ml/min • Temperatura de columna: 30°C ± 1°C • Volumen de inyección: 30 µl d) Poner en funcionamiento el cromatógrafo de HPLC y se inyectan volúmenes iguales de solución estándar y muestra. La comprobación cualitativa de los sacáridos a determinar, se realiza a través de la comparación de los tiempos de retención de la muestra respecto de la correspondiente solución estándar. La determinación cuantitativa se realiza mediante integración de las áreas de los picos, o de las alturas de los picos referidas al valor correspondiente de la solución estándar (http://www.tdr.cesca.es/TESIS_URV/AVAILABLE/TDX-0812102-093854//Apendices-10.pdf).

4.7 Análisis especiales

4.7.1 Determinación de teobromina (solubilidad en tetracloruro)

Fundamento Está basado en la solubilidad de la teobromina, en un disolvente adecuado, en este caso se utiliza el método de la solubilidad en tetracloruro. Procedimiento Se pesan, aproximadamente 20 g de muestra representativa, se desengrasa durante 4 h en un extractor Soxhlet, luego se seca en estufa a 100 ºC ± 2 ºC, repitiendo el secado hasta que dos pesadas sucesivas no difieran en más de 0.5 mg. Se pesa en una cápsula de porcelana, previamente tarada, 10 g de muestra desengrasada, con precisión de 0.1 mg. a) Tratamiento inicial Se añaden 2 g o 3 g de óxido de magnesio y se mezcla bien con la varilla. Se añaden, aproximadamente 14 ml de agua, agregando pausadamente a la vez que se tritura cuidadosamente, hasta que se humedezcan todas las partículas (el material será comprimido

en una torta firme). Se coloca la cápsula con la mezcla humedecida sobre el baño María durante 30 min, mezclando a intervalos para evitar que alguna parte comience a secarse; durante esta operación el material debe mantenerse granulado. Al cabo de 30 min, se saca la cápsula del baño, y se tritura el residuo con la espátula mezclando así todas las partículas húmedas. b) Extracción Se transfiere cuantitativamente a un Erlenmeyer de 250 ml, y se añaden 150 ml de tetracloroetano, se conecta el condensador de aire y se hierve 30 min. Se filtra en caliente a un segundo Erlenmeyer de 200 ml. El filtrado debe ser claro y casi incoloro. Se transfiere el residuo y el papel de filtro al primer Erlenmeyer con 120 ml de solvente y se calienta a reflujo otra vez durante 20 a 30 min. Mientras tanto se destila más líquido en el segundo Erlenmeyer, desde el primero, extraído del condensador de aire. Se filtra el líquido caliente (segunda extracción) en un segundo Erlenmeyer. Los filtrados de todas las extracciones se reciben en dos matraces Erlenmeyer, los líquidos de la última extracción se destilan hasta reducirlos a 3 ml o 5 ml. Se enfría el Erlenmeyer y el residuo, y se añade con rotación 65 ml de éter de petróleo, se mezcla bien, se tapa y se deja sedimentar por lo menos 1 h (hasta que el líquido sobrenadante esté claro). Se recoge el precipitado sobre papel filtro de poro mediano, usando varias porciones de 5 ml a 7 ml de éter de petróleo para transferir y lavar (http://www.ibnorca.org/02_norm/Normas_CP17/APNB%20326013.pdf).

4.7.2 Determinación de cafeína y teobromina por medio de HPLC

Fundamento

Los derivados xantínicos cafeína y teobromina se extraen y se determina el extracto filtrado y límpido por medio de HPLC (detección UV).

Procedimiento

|Reactivos | |Acetato de plomo (II) Pb(CH3COOH)2·3H2O (neutro) |Bicarbonato de sodio NaHCO3 | |Óxido de plomo (II) PbO |Disolución básica de subacetato de plomo: se disuelven 230 g de | | |acetato de plomo (II) en 700 ml de agua destilada hirviendo y a | | |continuación se añaden 120 g de óxido de plomo (II). se filtra la| | |mezcla en caliente y tras enfriarla se pasa la matraz aforado y se| | |completa a 1 L | |Óxido de magnesio MgO |Acetonitrilo (para el análisis del residuo) filtrado e filtro de | | |membrana | |Acetato de sodio CH3COONa |Agua bidestilada filtrada en filtro de membrana | |Disolución de acetato sódico: 0.4% |Disolución patrón I: se disuelven 0.5 g de cafeína y 0.5 g de | | |teobromina en agua destilada en un matraz aforado de 1 L y se | | |enrasa (c= 0.5 mg/ml) | |Disolución patrón II: se pipetean 10 ml de la solución I y se |Éter de petróleo | |transfieren a un matraz aforado de 50 ml, se afora (c=0.1 mg/ml) | |

a) Preparación de la disolución problema

Pesar una cantidad de chocolate y eliminar la grasa extrayéndola con un disolvente hidrocarbonado. Es preciso eliminar la grasa porque interfiere en un paso ulterior del análisis, (la cromatografía). A continuación se colocan las partículas de chocolate, en un tubo de centrífuga previamente tarado, de 15 ml y se pesa. Se añade al tubo una porción de 10 ml de disolvente orgánico (éter de petróleo), se cierra el tubo y se agita vigorosamente para disolver la grasa del chocolate. La cafeína y la teobromina son insolubles en este disolvente. Al centrifugar esta suspensión las partículas del chocolate se depositan en el fondo del tubo. El líquido clarificado se puede decantar y desecharse. La extracción con nuevas porciones de disolvente se repite dos veces más para asegurar la eliminación completa de la grasa del chocolate. Finalmente el disolvente que pueda quedar en el chocolate de elimina calentando el tubo de centrífuga en un vaso con agua hirviendo. Pesando el tubo de centrífuga más su contenido del residuo de chocolate desengrasado, se puede calcular la masa del residuo de chocolate por diferencia con la masa conocida del tubo vacío (http://www.books.google.com.mx/books?isbn=8429172246). En un matraz Erlenmeyer de 300 ml se pesa exactamente 3 g ± 0.1 mg de la muestra desengrasada. Tras añadir unas perlas de vidrio se pesa el matraz. Se añaden 96 ml de agua destilada fría y se calienta mientras se agita. Se mantiene en ebullición lenta durante 30 min, posteriormente y al mismo tiempo que se agita, se añaden 4 ml de subacetato de plomo. Se determina el peso del matraz y el líquido evaporado se completa con agua hasta que el peso sea 101.0 g (4 ml de acetato de plomo= 5 g). El contenido del matraz bien mezclado se pasa por un filtro de pliegues seco, eliminándose los primeros 10 ml del filtrado. Tras añadir bicarbonato de sodio sólido de repite la operación (desechándose los primeros 10 ml) y se somete a ultrafiltración con el filtro de membrana.

b) Parámetros para HPLC

• Columna de separación: Superspher RP-18, LiChroCART 200 X 4 mm (Fa Merck)

• Eluyente: acetonitrilo/disolución de acetato sódico 0.4% 15 + 85 (v/v)

• Flujo: 0.7 ml/min (200 bar o 20 mPa)

• Modo: isocrático

• Temperatura 20-22 °C

• Detector UV 254 nm

• Volumen de inyección: 20 µl (bucle)

Se analiza cromatrográficamente 2.0 µl de las soluciones madre I y II, respectivamente, siguiendo las condiciones especificadas en b) (patrón externo) (Matissek y col, 1998).

4.8 Adulteraciones

4.8.1 Adulteración con grasa hidrogenada

Fundamento

Los ácidos grasos metilados de las muestras son separados y cuantificados por cromatografía gaseosa con detector FID en columna capilar de fase reversa.

Procedimiento

a) Preparación de las muestras: Fundir la muestra para asegurar una buena homogeneización, a no más de 60 °C.

b) Preparación de los ésteres metílicos: • Pesar 250 mg de muestra en un tubo de vidrio con tapa rosca. • Agregar 500 µL de hidróxido de potasio en metanol 2 M. • Agregar 5 mL de éter de petróleo. • Agitar 2 min en vortex, reposar 1 h. • Trasvasijar a los viales del muestreador automático. • Inyectar.

Condiciones cromatográficas:

• T° detector: 250 °C • T° inyector: 250 °C • Programa de temperatura del horno: 120 °C por 5 min, aumentar la temperatura a razón • de 10 °C/min hasta 180 °C, mantener por 30 min. Aumentar nuevamente a razón de 10 • °C/min hasta 210 °C y mantener por 21 min (total 65 min). • Flujo gas carrier: 15 psi • Split: 1:100 • Volumen de inyección: 1 µL (http://www.ispch.cl/lab_amb/met_analitico/doc/ambiente%20pdf/Ac_grasos_transGC.pdf).

5. Análisis microbiológico

5.1 Detección de Salmonella

Fundamento

La presente técnica para la detección de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos básicos:

1. Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las células de Salmonella dañadas a una condición fisiológica estable.

2. Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra.

3. Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual de colonias sospechosas.

4. Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.

5. Serotipificación, es una técnica serológica que permite la identificación específica de un cultivo.

Procedimiento

Medio de cultivo de pre-enriquecimiento:

• Caldo lactosado

• Caldo selenito-cistina

• Medio de cultivo de enriquecimiento:

• Caldo tetrationato

• Vassiliadis-Rappaport

• Caldo de soya tripticasa

• Leche descremada reconstituida

• Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio

Medios de aislamiento:

• Agar verde brillante (VB

• Agar con sulfito de bismuto

• Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

• Agar para Salmonella y Shigella (SS)

• Agar entérico Hektoen

Medios para pruebas bioquímicas

• Agar de tres azúcares y hierro (TSI)

• Agar de hierro y lisina (LIA)

• Agar nutritivo

• Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad)

• Agar citrato de Simmons

• Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer)

• Caldo manitol

• Caldo malonato

• Caldo urea

• Caldo de urea rápido

• Caldo infusión cerebro corazón

Soluciones:

• Solución verde brillante al 0.1% (1:1000)

• Solución de yodo-yoduro

• Solución salina al 0.85%

• Solución salina formalizada

• Reactivo de Kovac

• Solución de alfa-naftol al 5%

• Solución de rojo de metilo

• Solución de hidróxido de potasio al 40%

• Solución de gelatinasa al 5%

a) Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso para licuadora o en bolsa estéril para trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher) agregando 225 ml de leche descremada reconstituida. Licuar por 2 min. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el pH

aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6.8 ± 0.2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Adicionar 0.45 ml de la solución verde brillante al 0.1% y mezclar bien. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC.

b) Aislamiento de Salmonella

1. Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport.

2. Incubar de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por el mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos.

3. Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS).

4. Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato.

5. Incubar las placas 24 ± 2 h a 35ºC.

6. Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes características:

• Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.

• Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.

• Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.

• Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras; con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.

• Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.

c) Identificación bioquímica

1. Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas.

Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo. Incubar por 24 ± 2 h a 35ºC. Almacenar en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es necesario retomar más colonias.

2. Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones:

• Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfihídrico.

• Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfihídrico en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción.

• Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas a continuación.

3. Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos medios.

4. Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente.

5. Continuar la identificación bioquímica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento.

6. Prueba de ureasa

Prueba de ureasa (convencional). Con un asa estéril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de medio para comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 h a 35ºC.

Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0.5ºC en baño de agua. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin cambio de color del medio).

d) Pruebas bioquímicas complementarias

Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuación:

1. Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. arizonae.

2. Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:

• Agar citrato Simmons:

o Inocular por estría el tubo.

o Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC.

o Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.

o Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.

• Medio SIM

o Inocular por punción.

o Incubar 24 h a 35 ± 2ºC.

o Movilidad:

▪ Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.

▪ Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.

o Producción de ácido sulfihídrico:

▪ Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el medio.

▪ Prueba negativa: ausencia de color negro.

o Producción de indol: adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0.2 a 0.3 ml de reactivo de Kovac.

▪ Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.

▪ Prueba negativa: sin cambio de color.

• Caldo RM-VP

o Inocular un tubo con el medio.

o Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM.

o Prueba de Voges-Proskauer (VP)

▪ Transferir a un tubo un ml del cultivo de 48 h.

▪ Adicionar 0.6 ml de solución de alfa naftol.

▪ Adicionar 0.2 ml de solución de hidróxido de potasio 40%.

▪ Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).

▪ Interpretar los resultados después de incubar 2 h a 35 ± 2ºC o 4 h a temperatura ambiente.

▪ Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.

▪ Prueba negativa: sin cambio de color.

▪ Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2ºC.

o Prueba de rojo de metilo (RM)

▪ Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo.

▪ Interpretar los resultados inmediatamente.

▪ Prueba positiva: desarrollo de color rojo.

▪ Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.

• Caldo malonato

o Inocular un tubo conteniendo el medio.

o Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2ºC.

▪ Prueba positiva: desarrollo de color azul.

▪ Prueba negativa: sin cambio de color.

• Caldo manitol

o Inocular un tubo conteniendo el medio.

o Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2ºC.

▪ Prueba positiva: desarrollo de color amarillo.

▪ Prueba negativa: sin cambio de color.