Ana Serrano Esteban

The riboflavin kinase and adenylyltransferase

catalytic sites of the bifunctional FAD synthetase

from Corynebacterium ammoniagenes

Ana Serrano Esteban

Riboflavina(vitamina B2) FADFMN

ATP ADP ATP PPi

Mg2+ Mg2+

INTRODUCCIÓN

FMNAT RFKH2N COOHFAD SINTETASA (FADS)

Procariotas

COOHH2N

FMNAT

Eucariotas (levaduras y mamÍferos)

RFKH2N COOH

FMNAT

Riboflavina kinasa (RFK) Adenililtransferasa(FMNAT)

INTRODUCCIÓN

Reducción

Biodegradación

Reacciones no redox

Emisión de luz

Oxigenación

Oxidación

Producción de energía

Reparación del DNA

Desarrollo neuronal

Detoxicación

Plegamiento de proteínas

Apoptosis

Remodelado de cromatina

Biosíntesis

FADS bifuncionales son esenciales para los microorganismos

IMPORTANCIA DE LA SÍNTESIS DE FLAVINAS

Potenciales dianas terapéuticas

RESULTADOS: MODELO ESTRUCTURAL DE LA FADS DE Corynebacterium ammoniagenes

N terminal(1-186)

C terminal(186-338)

Riboflavina(vitamina B2) FMN

ATP ADP

Mg2+

DOMINIO C –TERMINAL(Módulo RFK)

FADFMN

ATP PPi

Mg2+

DOMINIO N –TERMINAL (Módulo FMNAT)

o No presenta homología estructural ni secuencial con las FMNATs monofuncionales.

o Pertenece a la familia de las NTs.

o Comparte homología estructural y secuencial con las RFKs monofuncionales.

T208

N21

0


E268

INTERACCIÓN DEL MÓDULO RFK CON RF Y ADP

E295

K296R292D310

E268

F297

F270

T208

N210V193

Y279

K202

D277

RF

ADP

1 sitio de unión a flavina

1 sitio de unión a ATP

E268

T208

N210

Frago et al. (2008) BMC Microbiol 8:160

RESULTADOS: MÓDULO RFK

INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ESPECTROSCOPIA DIFERENCIAL)

FADS:RF FADS:FMN FADS:FAD

350 400 450 500 550-0.002

0.000

0.002

0.004

Wavelength (nm)

350 400 450 500 550

-0.008

-0.004

0.000

0.004

0.008

0.012

Wavelength (nm)

350 400 450 500 550

-0.002

0.000

0.002

0.004

0.006

Wavelength (nm)

Abs

orba

nce

/ [FA

DS]

WTT208AT208DN210AN210DE268AE268D

FADS-ADP:RF FADS-ADP:FMN

350 400 450 500 550

-0.008

-0.004

0.000

0.004

0.008

0.012

Wavelength (nm)

350 400 450 500 550

-0.002

0.000

0.002

0.004

0.006

Abs

orba

nce

/ [FA

DS]

Wavelength (nm)

Módulo FMNAT

Módulo RFK

RFRF

Módulo FMNAT

Módulo RFK

FMN

Módulo FMNAT

Módulo RFK

FAD

Módulo FMNAT

Módulo RFK

ADPFMN

ADPFMN

Módulo FMNAT

Módulo RFK

ADPRF

ADPRF

Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610

El residuo T208 está implicado en la interacción de la RF en el módulo RFK.

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

Kca

l/mol

N=1 N=1 N=1 N<1 N=1 N=1 N<1

WT N210DT208DT208A E268DE268AN210A-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

Kca

l/mol

WT N210DT208DT208A E268DE268AN210A

N=1 N=1 N=1 N<1 N=1 N=1 N<1

KdFAD (µM) Kd

FMN (µM)10mM Mg2+ 10mM Mg2+

WT 0.74 7.84T208A 0.86 7.96T208D 1.19 8.74N210A 1.11 6.21N210D 17.3 3.56E268A 24.7 72.4E268D 1.12 6.88

RESULTADOS: MÓDULO RFKINTERACCIÓN CON FLAVINAS (ITC)

KdRF (µM)

10mM Mg2+

WT 24.1T208A 61.5T208D 7.8N210A 18.7N210D 12.2E268A 13.8E268D 8.3

ΔGΔH-TΔS

FADS:RF

FADS:FAD FADS:FMN

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

Kca

l/mol

N=2 N=1 N=1 N=2 N=2 N=2 N=2


Los residuos N210 y E268 parecen contribuir a la interacción de las flavinas en el otro módulo.

Módulo FMNAT

Módulo RFK

RFRF

Módulo FMNAT

Módulo RFK

RF

Módulo FMNAT

Módulo RFK

FAD

Módulo FMNAT

Módulo RFK

FMN

Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610 Frago et al. (2009) J Biol Chem 284:6610

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

Kca

l/mol


N=2 N=1 N=1 N<2 N=2 N=2 N<2


INTERACCIÓN CON ATP (ITC)

KdATP (µM)

10mM Mg2+

WT 30.2T208A 15.7T208D 12.7N210A 20.6N210D 12.1E268A 15.4E268D 25.0

ΔGΔH-TΔS

En ausencia de Mg2+ el ATP se une preferiblemente al módulo FMNAT.

El residuo T208 está implicado en la estabilización del nucleótido en el módulo RFK.

0mM Mg2+

3.882.622.487.064.284.293.49

Módulo FMNAT

Módulo RFK

ATPATP

10 mM Mg2+

Módulo FMNAT

Módulo RFK

ATP

10 mM Mg2+

Módulo FMNAT

Módulo RFK

0 mM Mg2+

ATP

Módulo FMNAT

Módulo RFK

0 mM Mg2+

ATP



-15

-10

-5

0

5

10

Kca

l/mol

WT N210DT208DT208A E268AN210A

N=2Site 1Site 2

N=1 N=1 N=1 N=2Site 1Site 2

N=2Site 1Site 2

E268D

N=2

KdFMN

(µM)WT Site 1 0.04

Site 2 0.90T208A N=1 1.46T208D N=1 0.97N210A N=1 4.53N210D Site 1 63.9

Site 2 1.29E268A Site 1 0.92

Site 2 0.11E268D N=2 6.43


INTERACCIÓN CON FMN EN PRESENCIA DE ADP (ITC)

Los residuos T208 y N210 parecen claves para alojar las flavinas en el módulo RFK.Módulo

FMNATMódulo

RFK

ADPFMN

ADPFMN


Módulo FMNAT

Módulo RFK

FMN

0 10 20 300

10

20

30

40

50

60

70

80

0

1

2

3

4

5

6

v0 /[FA

DS

] (s-1)

v 0/[WT]

(s-1)

[RF] (M)

ACTIVIDAD RFK


kcat

(min-1)Km

RF

(µM)Ki

ADP

(µM)kcat / Km

RF

(min-1 µM-1)kcat

(min-1)Km

ATP

(µM)kcat / Km

ATP

(min-1 µM-1)WT <302 <13 4.0 23.2 68 13.7 4.93N210D 5.1 2.1 10.1 2.42 2.5 45.3 0.05E268D 2.7 4.1 --- 0.65 4.2 17.6 0.23

Riboflavina(vitamina B2) FADFMN

ATP ADP ATP PPi

Mg2+ Mg2+

· WT N210D· E268D

E268N210

P207

T208

Mg2+

F270

V271

E96N47

P44

T45Mg2+

H98

E96N47

P44

T45Mg2+

H98

RFK Saccharoymices pombe (SpRFK) SpRFK:FMN:ADP

CaFADS

La interacción con el ATP debe implicar un cambio conformacional.

Herguedas et al. (2010) J Mol Biol 400:218

Bauer et al. (2010) J Mol Biol 326:1463

R161

I62

H28

R168

T165

S164D25

F24

A124

N125

L34

H31

R161

I62

H28

R168

T165

S164D25

F24

A124

N125

L34

H31

28 31

164

165

161


ATPATP

FMN

Y106

H57V59

L98

F128

P56

P58

F62

F54

1 sitio de unión a flavina

1 sitio de unión a ATP

INTERACCIÓN DEL MÓDULO FMNAT CON ATP Y FMN

R161

H28

T165

S164

H31

Frago et al. (2008) BMC Microbiol 8:160

RESULTADOS: MÓDULO FMNAT

INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ESPECTROSCOPIA DIFERENCIAL)

FADS:RF

FADS:FMN FADS:FAD

350 400 450 500 550

-0.004

0.000

0.004

Wavelength (nm)

Abs

orba

nce

/ [F

AD

S]

350 400 450 500 550-0.004

0.000

0.004

0.008

Wavelength (nm)

350 400 450 500 550

-0.004

0.000

0.004

0.008

Wavelength (nm)

WTH28AH28DR161AR161DS164AS164DT165AT165D

Módulo FMNAT

Módulo RFK

Flavinas


Kd FAD

(µM)WT 0.74H28A 3.32H28D 1.83H31A 8.08H31D 12.3R161A 0.75R161D 2.11S164A 26.2S164D 26.6T165A 11.3T165D 0.36


Kd FMN


INTERACCIÓN CON FLAVINAS (ITC)

ΔGΔH-TΔS

FADS:FMN

FADS:FAD

-60

-40

-20

0

20

40

60

Kca

l/mol

WT S164DR161AH28D T165DT165AS164A

N=1 N<1N=1N=1 N<1N=1N=1

R161D

N<<1

H31D

N=1N=1

H31AH28A

N=1

-60

-40

-20

0

20

40

60

Kca

l/mol


N=1 N<1N=1N=1 N<1N=1N=1

R161D

N<<1

H31D

N=1N=1

H31AH28A

N=1

El cambio entálpico tan grande indica una organización diferente en la interacción entre estos mutantes y la flavina.

Módulo FMNAT

Módulo RFK

Flavinas


Kd,av ATP



INTERACCIÓN CON ATP (ITC)ΔGΔH-TΔS

-60

-40

-20

0

20

40

60

Kca

l/mol


N=2 N<2N=2N=2 N=2N=2N=2

R161D

N=2

H31D

N=2N=2

H31AH28A

N=2

El sitio de unión al ATP en el módulo FMNAT queda alterado por la presencia de las mutaciones.

FADS:ATP

Módulo FMNAT

Módulo RFK

ATPATP



kcat

(min-1)

KmFMN

(µM)

KmATP

(µM)

kcat / KmFMN

(min-1 µM-1)

kcat / KmATP

(min-1 µM-1)WT 97.4 6.2 46.4 15.7 2.10R161A 18.7 6.4 27.5 2.90 0.68R161D 29.9 16.8 24.9 1.78 1.20S164A 34.3 33.5 212.7 1.02 0.16T165A 12.0 69.6 124.7 0.17 0.10T165D 7.4 113.8 15.1 0.07 0.49

0 100 200 300 400 5000

10

20

30

40

50

60

[ATP] (M)

0 40 80 1200

10

20

30

40

50

60

70

80

v 0/[FA

DS

] (s-1

)

[FMN] (M)

ACTIVIDAD FMNAT

FADFMN

ATP PPi

Mg2+

· WT· R161A· R161D· S164A· T165A· T165D

Los residuos de His son críticos para la actividad FMNAT.

PPi

N125

H31

R161

R168

H28

S164T165

ATP binding cavity Isoalloxazine binding cavity

W181

ATP binding cavity Isoalloxazine binding cavity

Herguedas et al. (2010) J Mol Biol 400:218

CONCLUSIONES

RF

ATP

T208

T208

N210

T208

E268

N210

E268

T208

N210

Mg2+

ADP

FMN

Mg2+

ATPMg2+FMN

H28

H31

PPi

FAD

DOMINIO N –TERMINAL (Módulo FMNAT)

DOMINIO C –TERMINAL (Módulo RFK)

Milagros Medina Trullenque

Adrián Velázquez-Campoy

AGRADECIMIENTOS

http://bifi.es/index.php




Ana Serrano Esteban

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