Revista Mexicana de Fitopatologa Sociedad Mexicana de Fitopatologa, A.C.guillermofuentes_davila@hotmail.com ISSN (Versin impresa): 0185-3309MXICO

2006 Erick Arturo Garca Camarillo / Martha Yolanda Quezada Viay / Josefina Moreno

Lara / Gabriela Snchez Hernndez / Ernesto Moreno Martnez / Mara Cristina Julia Prez Reyes

ACTIVIDAD ANTIFNGICA DE ACEITES ESENCIALES DE CANELA (CINNAMOMUM ZEYLANICUM BLUME) Y ORGANO (ORIGANUM VULGARE L.) Y SU EFECTO SOBRE LA PRODUCCIN DE AFLATOXINAS EN NUEZ PECANERA...

Revista Mexicana de Fitopatologa, enero-junio, ao/vol. 24, nmero 001 Sociedad Mexicana de Fitopatologa, A.C.

Ciudad Obregn, Mxico pp. 8-12

Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina y el Caribe, Espaa y Portugal

Universidad Autnoma del Estado de Mxico

http://redalyc.uaemex.mx

Actividad Antifngica de Aceites Esenciales de Canela(Cinnamomum zeylanicum Blume) y Organo (Origanum vulgare

L.) y su Efecto sobre la Produccin de Aflatoxinas en NuezPecanera [Carya illinoensis (F.A. Wangenh) K. Koch]

Erick Arturo Garca-Camarillo, Universidad Nacional Autnoma de Mxico- Facultadde Estudios Superiores de Cuautitln (UNAM-FESC), Ingeniera Agrcola, Campo 4, km2.5 Carr. Cuautitln-Teoloyucan, Cuautitln Izcalli, Edo. de Mxico CP 54714; MarthaYolanda Quezada-Viay, Josefina Moreno-Lara, Gabriela Snchez-Hernndez,Ernesto Moreno-Martnez y Mara Cristina Julia Prez-Reyes, UNAM-FESC, Unidadde Investigacin en Granos y Semillas, Av. J. Jimnez Cant s/n, Col. San Juan Atlamica,Cuautitln Izcalli, Edo. de Mxico CP 54729. Correspondencia: crisp28@yahoo.com.mx

(Recibido: Enero 11, 2006 Aceptado: Marzo 24, 2006)

Garca-Camarillo, E.A., Quezada-Viay, M.Y., Moreno-Lara,J., Snchez-Hernndez, G., Moreno-Martnez, E. y Prez-Reyes, M.C.J. 2006. Actividad antifngica de aceitesesenciales de canela (Cinnamomum zeylanicum Blume) yorgano (Origanum vulgare L.) y su efecto sobre laproduccin de aflatoxinas en nuez pecanera [Carya illinoensis(F.A. Wangenh) K. Koch]. Revista Mexicana de Fitopatologa24:8-12.Resumen. Los aceites esenciales de canela (Cinnamomumzeylanicum) y organo (Origanum vulgare) fueron evaluadospara determinar su actividad antifngica contra Aspergillusflavus y la produccin de aflatoxinas en nuez pecanera. Ambosaceites presentaron actividad fungicida in vitro contra A.flavus, el aceite esencial de organo a partir de 1000 ppm yel de canela de 2000 ppm, en medio de cultivo de malta-sal-agar y un efecto fungisttico en 100 ppm. Sin embargo, alevaluar el efecto inhibitorio en la produccin de aflatoxinaspor A. flavus en almendra de nuez pecanera irradiada, el aceiteesencial de canela mostr mayor inhibicin que el aceiteesencial de organo, ya que a los 30 das de almacenamientoa 85% de humedad relativa y 25C, las nueces tratadas con100 y 2000 ppm presentaron estadsticamente la mismaconcentracin de aflatoxinas que las nueces sin inculo, y enlas nueces tratadas con aceite esencial de organo, solamenteen las que se aplic una dosis de 2000 ppm, hubo inhibicinen la produccin de aflatoxinas.

Palabras clave adicionales: Aspergillus flavus, micotoxinas,fungicida, fungisttico.

Abstract. The essential oils of cinnamon (Cinnamomumzeylanicum) and oregano (Origanum vulgare) were evaluatedto determine their antifungal activity against Aspergillus flavus

and the production of aflatoxins in pecan nuts. Both oilsshowed fungicidal activity in vitro against A. flavus, theessential oil of oregano at 1000 ppm and cinnamon at 2000ppm in malt-salt-agar medium, and a fungistatic effect at 100ppm. However, when inhibition on aflatoxin production byA. flavus was evaluated in irradiated almond of pecan nuts,the essential oil of cinnamon showed a greater effect than theessential oil of oregano, since after 30 days of storage with85% relative humidity at 25C, nuts treated with 100 and2000 ppm were statistically similar in aflatoxin concentrationto nuts without inoculum, and only in nuts treated withessential oil of oregano at 2000 ppm, there was inhibition ofaflatoxin production.

Additional keywords: Aspergillus flavus, micotoxins,fungicide, fungistatic.

En la ltima dcada la contaminacin por mohos de diversasnueces, especialmente nuez pecanera [Carya illinoensis (F.A.Wangenh) K. Koch] (Vsquez-Barrios et al., 2001), pistache(Pistasia atlantica Desf.) (Yazdanpanah et al., 2005) y castaa(Castanea sativa Mill.) (Arrus et al., 2005), representa unproblema de salud pblica. El deterioro y contaminacin delas nueces por Aspergillus flavus Link:Fr. durante sualmacenamiento es un problema importante, especialmenteen pases en desarrollo. Este hongo es productor de lasmicotoxinas ms potentes que se conocen: las aflatoxinas,metabolitos secundarios, a los cuales se les ha atribuidoactividad carcinognica, mutagnica y teratognica (Ruiqianet al., 2004; Rustom, 1997). Es urgente desarrollar medidasde control que eviten la contaminacin de las nueces conestas toxinas y minimizar los riesgos de afectar la saludhumana por el consumo de estos alimentos contaminados.

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Recientemente el uso de aceites esenciales y extractosvegetales como bactericidas y fungicidas ha cobrado mayorimportancia (Gamboa et al., 2002). Nguefack et al. (2004)demostraron las propiedades antifngicas de algunos aceitesesenciales extrados de plantas en Camern contra eldesarrollo de A. flavus. Paster et al. (1990, 1995) reportaronel efecto inhibitorio del aceite esencial de organo (Origanumvulgare L.) sobre el desarrollo de A. flavus, A. ochraceus K.Wilh. y A. niger Tiegh. in vitro, encontrando que a 2000 ppmeste aceite controla el crecimiento micelial de estos hongos ytiene una actividad fungicida. Estos mismos investigadoresdemostraron que el aceite esencial de organo control invivo eficientemente el desarrollo de hongos endgenos entrigo (Triticum sp). Yousef y Tawil (1980) y Tantaoui-Elarakiy Beraoud (1994) demostraron que el aceite esencial de canela(Cinnamomum zeylanicum Blume) presenta un efectoantifngico. Morozumi (1978) demostr que el aceite esencialde canela es altamente efectivo en el control del desarrollode A. flavus y A. parasiticus Speare. Rasooli y Razzaghi(2004) reportaron la actividad fungicida e inhibitoria de laproduccin de aflatoxinas por A. parasiticus in vitro del aceiteesencial de tomillo (Thymus vulgaris L.). Patkar et al. (1994)evitaron la contaminacin con aflatoxinas aplicando aceitesesenciales de canela y clavo (Sycygium aromaticum Merr.and Perry) a grano de arroz (Oryza sativa L.) almacenado a85 y 90% de humedad relativa. Montes-Belmont y Carvajal(1998) encontraron que los aceites esenciales obtenidos decanela, hierbabuena (Mentha piperita L.), organo, epazote(Teloxys ambrosioides (L.) Weber, clavo y tomillo causabanla inhibicin total del desarrollo de A. flavus en grano demaz (Zea mays L.). La actividad antimicrobiana de estosaceites esenciales se ha atribuido a la presencia de compuestosaromticos y grupos fenlicos como el eugenol en el aceiteesencial de canela y el carvacrol en el aceite esencial deorgano (Farag et al., 1989). El objetivo del presente estudiofue investigar la actividad antifngica in vitro de los aceitesesenciales de canela y organo y su efecto inhibitorio en laproduccin de aflatoxinas en nuez pecanera almacenada encondiciones que favorecen su deterioro.

MATERIALES Y MTODOSObtencin de la cepa de Aspergillus flavus y su cultivo. Lacepa de A. flavus productora de aflatoxinas se aisl de nuezpecanera de la variedad Wichita, procedente del municipioSan Pedro de las Colonias, Coahuila, Mxico.Aceites esenciales. Los aceites esenciales de canela y organocon pureza no especificada, grado alimenticio, fueronadquiridos en la Compaa Aceites y Esencias S.A.Estudio in vitro de las propiedades antifngicas de losaceites esenciales de canela y organo. La prueba in vitrose realiz en placas de malta-sal-agar (MSA) con cincoconcentraciones diferentes de cada aceite esencial: 100, 250,500, 1000 y 2000 ppm, los cuales se mezclaron en laconcentracin deseada con los medios de cultivo semislidospreviamente esterilizados. Los medios con los tratamientos

se vertieron en cajas de Petri esterilizadas. Posteriormente,el hongo se sembr a manera de explantes discoidales de 4mm de dimetro tomados con un sacabocado de una coloniade siete das de desarrollo, incubada a 25C y se colocaronen el centro de las cajas de Petri con los tratamientos. Elexperimento se incub a 25C durante once das, y para laevaluacin se midieron dos dimetros perpendiculares de lacolonia con un Vernier y se calcul el promedio delcrecimiento. Se realizaron tres repeticiones por cadatratamiento ms un testigo con inculo sin tratamiento paracada uno de los aceites y dosis probadas en este estudio.Evaluacin del efecto fungicida y fungisttico de losaceites esenciales. Para determinar el efecto fungicida yfungisttico de los aceites esenciales de canela y organo setransfirieron los explantes discoidales de inculo que nopresentaron crecimiento micelial en los tratamientosprobados, a medios de cultivo de MSA libres de aceitesesenciales. Estos se incubaron a 25C durante once das yposteriormente se evalu el desarrollo de las colonias,considerando un efecto fungicida en aqullos que nopresentaron crecimiento del hongo y fungisttico para los ques lo presentaron.Evaluacin de la inhibicin de la produccin deaflatoxinas en nuez pecanera tratada con aceite esencialde organo y canela. Las almendras de nuez (4 kg) fueronirradiadas con rayos gamma de 60Co en una dosis de 10 KG yen un irradiador Gamma bean 651 PT, en el Instituto deCiencias Nucleares de la Universidad Nacional Autnomade Mxico. Una vez irradiadas las nueces se tomaron muestrasde 50 g, se trataron con soluciones de cada aceite esencialpreparados en concentraciones de 100 y 2000 ppm, utilizandoTween 80 (10%) como agente emulsificante (Velluti et al.,2004) y se inocularon con un solo explante discoidal de unacolonia de A. flavus incubada durante siete das.Posteriormente se incubaron a 25C durante 30 das en unahumedad relativa de 85%, mantenida con una solucinsobresaturada de cloruro de potasio. Se realizaron muestreosa los 7, 14 y 30 das para determinar la concentracin deaflatoxinas.Determinacin de la concentracin de aflatoxinas. Sedeterminaron aflatoxinas totales en las muestras de nuezsiguiendo el mtodo 991.31 de inmunoensayo de la AOACInternacional (1995). El mtodo consisti en la extraccinde las aflatoxinas totales con metanol al 60% a partir de 50 gde nuez molida y su retencin en columnas de afinidad de lamarca Afla Test-P con anticuerpos monoclonales. Lacuantificacin se llev a cabo en un fluormetro marcaVICAM serie 4, calibrado previamente con un estndar deaflatoxinas.Anlisis estadstico. El anlisis de varianza de los datosobtenidos con la prueba de la actividad antifngica in vitrose realiz bajo un arreglo factorial completamente al azar Ax B con tres repeticiones, donde A = aceites esenciales y B =dosis. Los resultados de la evaluacin de la inhibicin de laproduccin de aflatoxinas en nuez pecanera tratada con aceite

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esencial de organo y canela se analizaron tambin bajo undiseo completamente aleatorizado A x B x C con tresrepeticiones, donde A = aceites esenciales, B = dosis y C =perodo de almacenamiento. Las medias obtenidas sesometieron a comparacin estadstica de Tukey (p < 0.05),en el paquete Instat versin 3.0 de la compaa Graph Pad.

RESULTADOS Y DISCUSINPropiedades antifngicas de los aceites esenciales decanela y organo in vitro. Los aceites esenciales de canela yorgano presentaron un efecto antifngico sobre A. flavus(Cuadro 1). A partir de la dosis mnima probada, 100 ppm,se present una inhibicin del desarrollo del hongo. Esteefecto fue mayor con el aceite esencial de organo, el cualinhibi en un 91% el dimetro de la colonia en la caja dePetri, comparado con un 83% de inhibicin en presencia delaceite esencial de canela. A partir de una concentracin de250 ppm de ambos aceites esenciales, se inhibicompletamente el crecimiento de la colonia de A. flavus. Estosresultados coinciden con lo reportado por Soliman y Badeaa(2002) quienes encontraron que la canela inhibicompletamente el desarrollo de A. flavus en una dosis de 500ppm. Los tres componentes del aceite de canela que han sidoidentificados como los agentes activos contra hongos son:aldehdo cinmico (Bullerman, 1974), O-metoxicinamaldehdo (Morozumi, 1978) y eugenol (Vellutiet al., 2003). Al transferir los explantes discoidales de inculoque no presentaron desarrollo en los medios de cultivo conaceites esenciales a medios de MSA libres de ellos, se observun efecto fungisttico para los tratamientos de 250, 500 y1000 ppm del aceite esencial de canela y en el caso del aceite

esencial de organo para las concentraciones de 250 y 500ppm (Cuadro 1). La dosis mnima fungicida para el aceiteesencial de organo fue de 1000 ppm y de 2000 ppm para elaceite esencial de canela. Estos resultados demostraron queel aceite esencial de organo present una mayor actividadantifngica sobre el desarrollo de A. flavus in vitro, comparadocon el aceite esencial de canela, contrario a los resultadospublicados por Nielsen y Rios (2000), quienes encontraronque la canela mostr mayor actividad antifngica comparadacon el organo.Inhibicin de la produccin de aflatoxinas en nuezpecanera tratada con aceite esencial de organo y canela.Los niveles de aflatoxinas determinados en las nueces tratadascon los aceites esenciales a lo largo de los 30 das que durel perodo de almacenamiento (Cuadro 2), se compararoncon las concentraciones determinadas en muestras de nuecessin inculo (testigo sin inculo) y con las de muestras denueces inoculadas con el hongo (testigo con inculo) sinhaberles aplicado aceites esenciales. A los siete das dealmacenamiento de la nuez, las dosis de 100 y 2000 ppm delos dos aceites esenciales, mantuvieron similares niveles deaflatoxinas que los cuantificados en la muestra testigo sininculo y por debajo de los niveles encontrados en el testigocon inculo. A los 14 das de almacenamiento, la dosis de100 ppm del aceite esencial de organo no present efectoinhibitorio en la produccin de aflatoxinas, aunque s mantuvoun nivel inferior al 30% del total de aflatoxinas determinadasen la muestra del testigo con inculo. A los 30 das dealmacenamiento, las muestras tratadas con 100 y 2000 ppmdel aceite esencial de canela y con 2000 ppm del aceiteesencial de organo presentaron estadsticamente los mismosniveles de aflatoxinas reportados para el testigo sin inculo.Las muestras tratadas con 100 ppm de aceite esencial deorgano no presentaron diferencias significativas con losCuadro 1. Actividad antifngica de aceites esenciales de canela

(Cinnamomum zeylanicum) y organo (Origanum vulgare) endiferentes concentraciones sobre el desarrollo de Aspergillus flavus.

Aceite Crecimiento de Grado de Actividadesencial (ppm) la colonia (cm) inhibicin (%) antifngica

Canela0 8.1 a*100 1.4 b 83 Ft**250 0 d 100 Ft500 0 d 100 Ft1000 0 d 100 Ft2000 0 d 100 Fg

Organo0 8.1 a100 0.7 c 91 Ft250 0 d 100 Ft500 0 d 100 Ft1000 0 d 100 Fg2000 0 d 100 Fg

*Letras diferentes en la columna indican diferencias significativas(Tukey, p < 0.05).**Ft = fungisttica; Fg = fungicida.

Cuadro 2. Nivel de aflatoxinas en nuez pecanera (Caryaillinoensis) inoculada con Apergillus flavus. Nivel de Aflatoxinas (ppb) Tratamiento Perodo de Almacenamiento 0 7 14 30

Testigo s/i* 5 a** 6 b 5 c 8 bTestigo c/i 5 a 97 a 530 a 2175 a

Canela100 ppm 5 a 14 b 9 c 151 b2000 ppm 5 a 12 b 5 c 38 b

Organo100 ppm 5 a 24 b 175 b 2750 a2000 ppm 5 a 16 b 14 c 161 b

*s/i = sin inculo; c/i = con inculo; d = das; ppb = partespor billn.**Letras diferentes en la columna indican diferenciassignificativas (Tukey, p < 0.05).

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niveles determinados en el testigo con inculo para estemismo perodo de almacenamiento. En la nuez tratada con elaceite esencial de organo, se observ que la concentracinde 2000 ppm inhibi la produccin de aflatoxinas y laconcentracin de 100 ppm la increment, esto puede debersea que se pierde la actividad protectora y la capacidad deinhibicin del crecimiento del hongo, y por tanto se presentala produccin de aflatoxinas. Es importante sealar que elaceite esencial de canela fue el que present el mejor efectoinhibitorio sobre la produccin de aflatoxinas en almendrasde nuez pecanera comparado con el aceite esencial deorgano. Existen trabajos realizados por variosinvestigadores, en donde se ha encontrado que el aceiteesencial de canela, adems de presentar un efecto antifngico,inhibe la produccin de aflatoxinas (Bullerman, 1974;Bullerman et al., 1977; Chalfoun et al., 2004; Hitokoto etal., 1979; Mabrouk y El-Shayeb, 1980; Sinha et al., 1993).Es importante sealar que la inhibicin del crecimiento de A.flavus fue dependiente de las concentraciones empleadas eneste estudio. Existe una relacin entre el incremento de laconcentracin del aceite esencial y la inhibicin en laproduccin de aflatoxinas, por lo que se deben aumentar lasdosis de los aceites esenciales probados, asegurando nivelesde aflatoxinas permitidos para el consumo humano. Losresultados obtenidos en este trabajo indican claramente quelos aceites esenciales son una alternativa de aplicacinprctica en la inhibicin de la produccin de aflatoxinas ennuez almacenada. Asmismo, pueden aplicarse con seguridadcomo conservadores y aditivos en algunos alimentos as comoen granos y semillas. Estos aceites esenciales pueden serusados como sustitutos de fungicidas qumicos, ya que soninocuos y biodegradables.

Agradecimientos. Este estudio se llev a cabo con el apoyofinanciero de la ctedra clave IN2-26, con nmero de acuerdo154, de la Facultad de Estudios Superiores de Cuautitln(FESC-UNAM).

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