วิธีมาตรฐาน ส...

วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร

Standard Methodsfor Food Analysis

เลมท 3

Volume III

กรมวทยาศาสตรการแพทยDepartment of Medical Sciences

กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสขwww.dmsc.moph.go.th

วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3 Standard Methods for Food Analysis Volum

e III

วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3Standard Methods for Food Analysis, Volume IIIรหส : DMScBQSF-201502-A

พมพครงท 1 : สงหาคม 2558 จานวน 1,000 เลม

ISBN: 978-616-11-2608-7

สงวนลขสทธ

จดพมพเผยแพรโดย

กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข อ.เมอง จ.นนทบร

http://www.dmsc.moph.go.th/dmsc/home.php

โทรศพท/โทรสาร 0 2951 1021

http://dmsc2.dmsc.moph.go.th/webroot/BQSF/Index_Main.htm

พมพท

โรงพมพสานกงานพระพทธศาสนาแหงชาต

ทอย 314-316 ถนนบารงเมอง ปอมปราบฯ กรงเทพมหานคร 10100

โทรศพท 0-2223-3351, 0-2223-5548

โทรสาร 0-2621-2910, 0-2621-2911

คาปรารภ

การพฒนาวธวเคราะหใหเปนวธมาตรฐานสาหรบการตรวจวเคราะหของประเทศ มความ

สาคญตอการกากบดแลคณภาพตามกฎหมาย ซงเปนบทบาทหนงของการเปนหองปฏบตการอางอง

ของชาต และเปนการแสดงความโปรงใสในการดาเนนงาน สามารถสรางความเขมแขงในการ

ควบคมคณภาพมาตรฐานของผลตภณฑสขภาพ ในกรณทเกดปญหาดานคณภาพและความปลอดภย

ของผลตภณฑดงกลาว จะตองใชผลการตรวจวเคราะหซงใชวธมาตรฐานของประเทศในการตดสน

ทงน เพอลดปญหาการโตแยงทางกฎหมายเรองผลการตรวจวเคราะห

สานกคณภาพและความปลอดภยอาหาร เปนหนวยงานในสงกดกรมวทยาศาสตรการแพทย

กระทรวงสาธารณสข มอานาจหนาทในการกาหนดและพฒนาคณภาพ มาตรฐาน และวธการตรวจ

วเคราะหและเปนหองปฏบตการอางองดานอาหาร ผลการตรวจวเคราะหทางหองปฏบตการสามารถ

นาไปใชในการควบคมคณภาพ และความปลอดภยใหเปนไปตามกฎหมายและเปนหลกฐานทางคด

รวมทงมความนาเชอถอ ตลอดจนการยอมรบทงในระดบประเทศและนานาชาต และเมอมการเขาส

ประชาคมอาเซยน ในปลายป 2558 จะมการนาเขาและสงออกอาหารมากขน จงจาเปนตองมมาตรฐาน

ดานการตรวจวเคราะหทดไวรองรบ ดงนน สานกคณภาพและความปลอดภยอาหาร จงไดจดทาหนงสอ

วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหารขน โดยดาเนนการจดทาตอเนองมาแลวจานวน 2 เลม เลมน

เปนเลมท 3 มการเพมเตมวธวเคราะหทงดานเคม จลชววทยา และชวโมเลกล และพฒนาใหเปนผลงาน

เชงนวตกรรมของกรมวทยาศาสตรการแพทย เพอใหหนวยงานในสงกดกรมวทยาศาสตรการแพทย

หองปฏบตการภาครฐ สถาบนการศกษา ตลอดจนผประกอบการและบรษทเอกชน สามารถนาไปใช

ในการอางอง ควบคมคณภาพและความปลอดภยของอาหาร เปนประโยชนในการสงเสรมเศรษฐกจ

ดานอาหาร การคมครองผบรโภค การแกไขปญหาสาธารณสขของประเทศ และการสรางเสรมสขภาพ

ทดแกประชาชนตอไป

(นายแพทยอภชย มงคล)

อธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย

7 กรกฎาคม 2558

สารบญ

หนา

วธมาตรฐานทางเคมสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย 9

นยามและคายอ 11

รหสวธ 13

DMSc F 1042: การวดคาความเปนกรด-ดางของนา 15

DMSc F 1043: การวเคราะหปรมาณฟลออไรด คลอไรด 21

ไนเตรท และซลเฟตในนา

DMSc F 1044: การวเคราะหปรมาณตะกวในนา 27

DMSc F 1045: การวเคราะหปรมาณเหลก แคดเมยม โครเมยม 31

ทองแดง แมงกานส นกเกล สงกะส และเงนในนา

DMSc F 1046: การวเคราะหปรมาณสารหนในนา 35

DMSc F 1047: การวเคราะหปรมาณใยอาหารทงหมดในอาหาร 39

โดย Enzymatic-Gravimetric Method

DMSc F 1048: การตรวจวเคราะหปรมาณกรดนาสมในนาสมสายช 45

โดยวธ Titration

DMSc F 1049: การตรวจวเคราะหความเปนกรดในซอสบางชนด 49

โดยวธ Titration

DMSc F 1050: การวเคราะหคาของกรดในนามนและไขมน 53

DMSc F 1051: การวเคราะห Phenolic Antioxidants ในนามน, 57

ไขมน และเนย

DMSc F 1052: การวเคราะหสารโพลารในนามนและไขมน, 63

โดยวธคอลมนโครมาโทกราฟ

DMSc F 1053: การวเคราะหปรมาณสารเคมปองกนกาจดศตรพช 69

กลมคารบาเมตในผกผลไม

DMSc F 1054: การวเคราะหปรมาณ 3-chloro-1, 2- propanediol 77

(3-MCPD) ในอาหารและสวนผสมอาหาร

วธมาตรฐานทางจลชววทยาสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย 85

นยามและคายอ 87

รหสวธ 87

DMSc F 2015: วธตรวจวเคราะห Coliforms, Fecal coliforms 89

และ E. coli ในนา และนาแขงโดยวธ MPN

DMSc F 2016: วธตรวจวเคราะห Coliforms, Fecal coliforms 119

และ E. coli ในอาหาร

DMSc F 2017: วธตรวจวเคราะห Clostridium botulinum ในอาหาร 151

DMSc F 2018: วธตรวจวเคราะหอาหารในภาชนะบรรจทปดสนท 161

ชนดทมความเปนกรดตา

DMSc F 2019: วธตรวจวเคราะหอาหารในภาชนะบรรจทปดสนท 177

ชนดทมความเปนกรด

วธมาตรฐานทางชวโมเลกลสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย 191

รหสวธ 193

DMSc F 4001: การสกดดเอนเอจากตวอยางในอาหารทมสวนประกอบ 195

ของพชดดแปรพนธกรรมดวยวธ CTAB พนฐาน

DMSc F 4002: การสกดดเอนเอจากตวอยางในอาหารทมสวนประกอบ 201

ของพชดดแปรพนธกรรมดวยวธ Basic silica method

DMSc F 4003: Qualitative endogenous gene testing: lectin 207

(by means of Polymerase Chain Reaction)

DMSc F 4004: Qualitative endogenous gene testing: the chloroplast 215

trnL intron(by means of Polymerase Chain Reaction)

DMSc F 4005: Qualitative endogenous gene testing: Invertase 223


DMSc F 4006: Qualitative endogenous gene testing: hmgA 231

(by means of real-time Polymerase Chain Reaction)

หนา

หนา

DMSc F4007: Screening method for the detection of genetically 239

modified plant DNA: CaMV-35S promoter


DMSc F 4008: Screening method for the detection of genetically 247

modified plant DNA : NOS-terminator


DMSc F 4009: Screening method for the detection of genetically 255

modified plant DNA: nptII


ภาคผนวก

รายชอวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 1 263

รายชอวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 2 265

วธมาตรฐานทางเคมสาหรบการวเคราะหอาหาร

ของกรมวทยาศาสตรการแพทย

คณะผจดทา

1. นางสาวจารวรรณลมสจจะสกล ผอานวยการสานกคณภาพและความปลอดภยอาหาร

2. นางกนกพรอธสข ผเชยวชาญเฉพาะดานมาตรฐานของอาหาร

(นกวทยาศาสตรการแพทย)

3. นางนภาภรณลกษณสมยา นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

4. นางสาวสวรรณธรภาพธรรมกล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

5. นางกญญาพกสน นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

6. นางสาวปษยาแสงวรฬห นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

7. นางสาวจตผกาสนทดรบ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

8. นางสาวอรณดนดล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

9. นางสาวกรรณกาจตตยศรา นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

11

วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย

Abbreviation Word/คาเตม

AAS Atomic absorption spectrometer

Ac acetyl, CH3CO-

diam. diameter

FAAS Flame atomic absorption spectrophotometer

g gram

g gravity in centrifuging

GC Gas Chromatograph

GFAAS Graphite furnace atomic absorption spectrophotometer

HPLC High performance liquid chromatograph

hr hour

id inner diameter or dimension

นยามและคายอ(DefinitionandAbbreviation)

1. “H2O”หมายถงนากลน(distilledwater)ยกเวนทกาหนดไวเฉพาะในวธนนๆ

2. สารเคม(reagents)ทงหมดเปนreagentgradeยกเวนทกาหนดไวเฉพาะในวธนนๆ

3. กรดและดางหมายถงกรดและดางทมความเขมขนดงในตารางยกเวนทกาหนดไวเฉพาะ

ในวธนนๆ

ความเขมขน

Sulfuric acid 95.0-98.0% H2SO4

Hydrochloric acid 36.5-38.0% HCl

Nitric acid 69.0-71.0% HNO3

Fuming nitric acid ≥ 90% HNO3

Acetic acid ≥ 99.7% CH3COOH

Hydrobromic acid 47.0-49.0% HBr

Ammonium hydroxide 28-30% NH3

Phosphoric acid ≥ 85% H3PO4

4. การใชสญลกษณ(ตวเลข+ตวเลข)หลงชอของสารเคมเชนHCl(1+2)หมายถงสารผสม

ระหวางHCl1หนวยปรมาตรกบH2O2หนวยปรมาตร

5. คายอทใชและคาเตมแสดงในตาราง

12



kg kilogramL literLC Liquid Chromatographm Meter, milli – as prefixM MolarMe Methyl, CH3-

MeOH Methanol, CH3OHmg milligrammin minuteml millilitermm millimeterMS Mass spectrometerMW molecularweightMΩ megaohmN Normalng nanogram-OAc acetate-OCN cyanateod outer diameter or dimensionppm part per millionppb part per billionv/v Volumeper volumew/v Weightpervolumew/w Weightperweightwt Weightµg Microgram (10-6g)µL Microliter (10-6L)µm Micron, micrometer (10-6m)/ per% percent> more than< less than≥ equal to and more than

≤ equal to and less than

13


วธมาตรฐานทางเคมสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย

DMScF1042 นาดม คาความเปนกรด-ดาง I 15

นาแขง

นาใชในการผลตอาหาร

นาประปา

นาบาดาล

นาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสย

DMScF1043 นาดม ฟลออไรดคลอไรดไนเตรท I 21

นาแขง และซลเฟต





DMScF1044 นาดม ตะกว I 27

นาแขง





DMScF1045 นาดม เหลกแคดเมยมโครเมยม I 31

นาแขง ทองแดงแมงกานสนกเกล

นาใชในการผลตอาหาร สงกะสและเงน




Method รหสวธ ชนดอาหาร สารทตองการวด หนา Type

14


DMScF1046 นาดม สารหน I 35

นาแขง





DMScF1047 อาหาร ใยอาหารทงหมด I 39

DMScF1048 นาสมสายช กรดนาสม I 45

DMScF1049 ซอส ความเปนกรด I 49

DMScF1050 นามนและไขมน คาของกรด I 53

DMScF1051 นามนไขมนและเนย PhenolicAntioxidants I 57

DMScF1052 นามนและไขมน สารโพลาร I 63

DMScF1053 ผกผลไม สารเคมปองกนกาจดศตรพช II 69

กลมคารบาเมต

DMScF1054 อาหาร 3-chloro-1,2-propanediol II 77

(3-MCPD)

Method รหสวธ ชนดอาหาร สารทตองการวด หนา Type

15


1. ขอบขาย(Scope)

ใชวดคาความเปนกรด-ดาง(pHvalue)ของนาหรอสารละลายทเปนaqueoussolution

2. เอกสารอางอง(Reference)

Rice EW, Baird RB, Eaton AD, Clesceri LS, editors. Standard methods for the examination

ofwater andwastewater. 22nd ed. Washington DC: American Public Health Association;

2012. p. 4-91 to 4-96.

3. หลกการ(Principle)

การวด pHคอการวดสภาพความเปนกรดหรอเปนดางของสารละลายทมนาเปนตวทาละลาย

(aqueous solution) โดยการวดความตางศกยทเกดขน (potential) ระหวางอเลกโทรดอางอง

(reference electrode) กบอเลกโทรดตรวจวด (sensing electrode) อเลกโทรดจะเปลยน

ความตางศกยท เกดจากไฮโดรเจนอออน (ion potential) ใหเปนความตางศกยไฟฟา

(electronicpotential)แลวขยายใหสงขน

4. เครองมอและอปกรณ(Apparatus)

4.1 pH meter

4.2 Combination pH electrode

4.3 ขวดพลาสตก

5. สารเคม(Reagent)

5.1 สารละลายมาตรฐานบฟเฟอรpH4.00,7.00และ10.00

5.2 สารละลาย3MKCl

DMScF1042: การวดคาความเปนกรด-ดางของนา

pHvalueofwater

16


6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)

6.1 ตวอยางนา:สมตวอยางและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน

6.2 ตวอยางนาแขง:สมตวอยางปลอยใหละลายทอณหภมหองและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน

6.3 บรรจนาทผสมเปนเนอเดยวกนลงในขวดพลาสตกตวอยางละ 2 ขวด วด pH ไดทนท

เมออณหภมเทากบ25± 1C

7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure)

7.1 สรางcalibrationcurveทpH4.0,7.0และpH7.0,10.0บนทกคาslope

7.2 จมelectrodeในขวดท1กวนเบาๆทงไวประมาณ1นาทยกelectrodeขนซบใหแหง

7.3 จมelectrodeในขวดท2อานคาpHโดยกดreadรอจนเครองอานคา(หยดนง)

7.4 ลางelectrodeดวยนากลนซบใหแหงดวยกระดาษเนอนม

7.5 ในกรณทคาไมหยดนงใหเตรยมตวอยางใหม 4 ขวด จม electrode ในขวดท 1, 2, 3

และ4และอานคาของขวดท4

8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults)

รายงานคาความเปนกรด-ดางทศนยม1ตาแหนง

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults)

9.1 ตรวจสอบaccuracyโดยวดสารละลายบฟเฟอรจากdifference sourceความแตกตางจาก

คาจรงไมเกน0.1pHunit

9.2 วด 2ซา (duplicate)ทก 10ตวอยาง (กรณนอยกวา 10ตวอยาง ใหวด duplicate 1ชด)

โดยวดแบบrandomเพอตรวจสอบคาprecisionโดยคาprecisionไมเกน0.1pHunit

9.3 ตวอยางทผลการวดไมอยในเกณฑมาตรฐานตองทาการวดซาโดยนาตวอยางใหมมาวด

(new portion) เพอยนยนผลโดยคา precisionตองไมเกน 0.1 pH unit รายงานคาแรก

ถาเกน0.1ใหcalibrateเครองใหมและใชตวอยางใหม

17


10. รายละเอยดอน

อ างองจากแนวทางการตรวจสอบและสอบเทยบเครองมอวทยาศาสตรเพอการรบรอง

หองปฏบตการทดสอบตามมาตรฐาน ISO/IEC17025: 2005สานกมาตรฐานหองปฏบตการ

กรมวทยาศาสตรการแพทยมกราคม2557หนา56-58

10.1 การตรวจสอบทกครงทใชงาน–การตรวจสภาพของ electrode เกณฑยอมรบ relative

slope ≥95%โดย 10.1.1 ปรบเครองใหพรอมทางานดวยworkingstandardbuffer7.0และ4.0

10.1.2 วดคา Potential และอณหภมของสารละลายworking standard buffer 4.0

และ7.0

10.1.3 คานวณคาmeasuresslopeและrelativeslope

potential difference Measured slope = pH difference

Measured slope × 100 Relative slope = Theoretical slope

Theoreticalslopeท25C=59.13mV/pH

ตวอยางการคานวณ

Workingstandardbuffer(value) Readvalue

Temperature(C) mV

Relativeslope=[(175-5)/3]× 100 = 95.18%

59.6

4.01 25 175.00

7.00 25 5.00

18


10.2 การบารงรกษา

10.2.1 เลอกชนดelectrodeใหเหมาะสมกบตวอยาง

10.2.2 วธลางelectrodeใหแชในสารละลาย0.1MHClหรอ0.1MHNO3 นาน30min

และเกบโดยแชในสารละลาย3MKCl

10.2.3 กรณใชelectrodeใหมทไมเคยใชงานใหปฏบตดงน

10.2.3.1 แชelectrodeในH2Oทงไว24hr

10.2.3.2 เปดเครองทงไวประมาณ5-10minหรอตามทกาหนดในคมอ

10.2.3.3 ตดตง electrode ลางใหสะอาดดวย H2O และซบใหแหงดวย

กระดาษนม ตงอณหภมตามทกาหนดบนขวดสารละลาย buffer

ทเลอกใช

10.2.3.4 จมelectrodeในสารละลายมาตรฐานบฟเฟอรpH7.0กรณใชเครอง

ทมprobeวดอณหภมใหจมprobeนนในสารละลายมาตรฐานบฟเฟอรดวย

10.2.3.5 ปรบปมปรบเทยบ(calibrate)ใหไดคาpH7.0

10.2.3.6 ลาง electrode ใหสะอาดดวยH2Oและซบใหแหงดวยกระดาษนม

จมelectrodeในสารละลายมาตรฐานบฟเฟอรpH4.0หรอpH9.0

ปรบปมslopeใหไดคาpHตามคาของสารละลายมาตรฐานบฟเฟอร

ทเลอกใช

10.2.3.7 ตรวจซาอกครงโดยเปลยนสารละลายมาตรฐานบฟเฟอรใหม

10.2.4 ขอควรระวงในการใชelectrodeเพอยดอายการใชงาน

10.2.4.1 กรณหยดใชงานชวคราวในระยะสนสามารถแชelectrodeในH2O

หรอสารละลายมาตรฐานบฟเฟอรpH4.0ใหกดปมstandbyและ

รกษาระดบสารละลายเกลอภายในใหสงกวาระดบนาขางนอกสวน

การเกบ electrode ในระยะยาวควรเกบโดยแชในสารละลายชนด

เดยวกบทบรรจในelectrode

10.2.4.2 ระวงไมใหมฟองอากาศในelectrodeถาพบฟองอากาศใหเขยาแรงๆ

ตามแนวดงของ electrode เพอไลฟองอากาศนนออกทางดานบน

หรอเปลยนสารละลายทบรรจในelectrodeใหม

10.2.4.3 คา pH แกวงตลอดเวลา แสดงวาอาจมคราบไขมนหรอโปรตน

เคลอบทผว electrode ใหเชดออกเบา ๆ ดวยสลหรอผาน มชบ

acetoneหรอalcoholและแชelectrodeในH2Oทงไวสกคร

19


10.2.4.4 หามทาความสะอาดelectrodeในอางนาความถสง(ultrasonicbath)

เพราะแรงสนสะเทอนจะทาลายโครงสรางภายในของelectrode

10.2.4.5 ควรเปลยนสารละลายKClบอยๆ เพอปองกนผลจากการรบกวน

ดวยสารปนอน ๆ จงควรเลอกใช KCl ทมความบรสทธสงมาก

ในกรณทพบวามสารอนเจอปนมากควรใชลางH2Oภายในelectrode

หลายๆครง

10.2.4.6 เปดชองระบายอากาศตอนบนelectrode เมอวด pHและปดชองน

เมอเลกใชงาน

10.2.4.7 ขวดสารละลายมาตรฐานบฟเฟอรเมอเลกใชแลวควรปดขวดใหแนน

เพอปองกนไมใหสมผสกบกาซคารบอนไดออกไซด และปองกน

เชอรา หากพบวามราขนหามใชเดดขาด นอกจากนสารละลาย

มาตรฐานบฟเฟอรทใชแลวหรอเทออกจากขวดแลวหามเทกลบ

ลงในขวดอก

21



ใชวเคราะหปรมาณฟลออไรด (Fluoride;F-) คลอไรด (Chloride;Cl-)ไนเตรท (Nitrate;NO3-)

และซลเฟต(Sulfate;SO42-)ในนาดมนาแขงนาแรนาใชในการผลตอาหารนาประปานาบาดาล

และนาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสยโดยIonChromatograph(IC)



ofwater andwastewater. 22nd ed. Washington DC: American Public Health Association;

2012. p. 4-5 to 4-7.


ตวอยางนาซงผานการกรองอนภาคทใหญกวา0.45µmเมอนามาฉดเขาไปในเครองICสารละลาย

eluentจะพาตวอยางเขาไปในcolumnเกดการแลกเปลยนไอออนภายในcolumnไอออนแตละ

ชนดจะถกแยกจากกนตามความสามารถในการแลกเปลยนไอออนจากนนจะออกจาก column

เขาส suppressor เพอลดคา background เปนการชวยปรบใหสามารถตรวจวดคาการนาไฟฟาท

เกดจากไอออนทสนใจไดดขนขณะทคาการนาไฟฟาทเกดจากeluentจะลดลงใน suppressor

ไอออนทแยกออกมาจะมสภาพเปนกรดเมอผานเขาไปในเครองตรวจวดคาการนาไฟฟาจะเกด

สญญาณซงจะถกเปลยนเปนchromatogramคานวณหาปรมาณของไอออนแตละชนดโดยเทยบ

กบกราฟมาตรฐาน


4.1 เครองชงละเอยด(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g

4.2 Ionchromatograph-conductivitydetector

4.3 Ultrasonic bath

4.4 Beaker

DMScF1043: การวเคราะหปรมาณฟลออไรดคลอไรดไนเตรทและซลเฟต

ในนา

Determination of fluoride, chloride, nitrate and sulfate

inwater

22


4.5 Micropipetteขนาด50,100,200,500และ1,000µl

4.6 Membranefilterขนาด0.45µm

4.7 Volumetricflaskขนาด10,50mlและ1L

4.8 Syringeพลาสตกขนาด10ml


สารเคมทกชนดไมตากวาระดบ AR grade และนา (H2O) ทใชเปนนาปราศจากไอออน

(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity ≥ 18 MΩ-cm

5.1 สารมาตรฐาน(Standards)

5.1.1 สารละลายมาตรฐานF- 1,000 mg/L

5.1.2 สารละลายมาตรฐานCl- 1,000 mg/L

5.1.3 สารละลายมาตรฐานNO3- 1,000 mg/L

5.1.4 สารละลายมาตรฐานSO42- 1,000 mg/L

5.1.5 intermediate standard solution F- 100 mg/L: ปเปตสารละลายมาตรฐาน

F- ตงตนปรมาตร1mlลงในvolumetricflaskขนาด10mlเจอจางและปรบปรมาตร

ดวยH2O

5.1.6 workingstandardsolution:

5.1.6.1 workingstandardsolutionF- ความเขมขน0.4,0.8,1.2และ1.6mg/L:

ปเปตintermediatestandardsolutionF- 100mg/Lปรมาตร200,400,600

และ800µlตามลาดบลงในvolumetric flaskขนาด50ml เจอจางและ

ปรบปรมาตรดวยH2O

5.1.6.2 working standard solutionCl-ความเขมขน 1.0, 10, 20และ 40mg/L:

ปเปต intermediate standard solutionCl- 1,000mg/Lปรมาตร50, 500,

1,000และ2,000µlตามลาดบลงในvolumetricflaskขนาด50mlเจอจาง

และปรบปรมาตรดวยH2O

5.1.6.3 workingstandardsolutionNO3- ความเขมขน0.23,0.9,1.8และ2.7mg/

L:ปเปตintermediatestandardsolutionNO3-1,000mg/Lปรมาตร50,200,

400และ600µlตามลาดบลงในvolumetricflaskขนาด50mlเจอจาง


23


5.1.6.4 workingstandardsolutionSO42- ความเขมขน1.0,10,20และ40mg/L:

ปเปตintermediatestandardsolutionSO42- 1,000mg/Lปรมาตร50,500,

1,000และ2,000µlตามลาดบลงในvolumetricflaskขนาด50mlเจอจาง


สามารถปเปตปรมาตรสารละลายมาตรฐานลงในvolumetric flask ใหไดชวงความเขมขนอน

ทครอบคลมความเขมขนทตองการวเคราะห

5.2 eluent 12 mM NaOH: ปเปต 50% w/w NaOH 630 µl ลงใน volumetric flask

ขนาด1 L เจอจางดวยH2Oปรบปรมาตรและdegasในultrasonicbathกอนนาไปใช

(เตรยมใหมทกครงทใชงาน)สามารถเลอกeluentชนดอนๆใหเหมาะสมกบชนดcolumn

ทเลอกใชเชนสารละลายผสมsodiumbicarbonate-sodiumcarbonate




6.3 เทตวอยางทเปนเนอเดยวกนใส beaker ดดดวย syringe กรองผานmembrane filter

ขนาด0.45µmลงในหลอดพลาสตกของเครองฉดตวอยางอตโนมตแลวฉดเขาเครองIC


7.1 สภาวะเครองIC

detector:totalconductivity<10µS

column: anion-exchange (analytical 4 ×250mm,guard450mm)

eluent: 12 mM NaOH

injectionvolume:50µl

flowrate:1ml/min

เตรยมความพรอมของเครอง ICให eluent ไหลผาน columnรอเครองทางานตามสภาวะ

กาหนดbaselineคงทประมาณ30นาท

24


7.2 ทดสอบsystemsuitabilityของเครองกอนใชงาน

ฉดสารละลายมาตรฐาน(mixedsolution)5ซาทความเขมขน1ระดบของF-, Cl- , NO3-

(คานวณเปนN)และSO42- เทากบ2,20,1.8และ20mg/Lตามลาดบหรอความเขมขน

ท เหมาะสมกบการใชงาน ตรวจวดคาการนาไฟฟาของแตละไอออน แสดงเปน

chromatogram คานวณ%RSD ของ retention time และ peak area เกณฑยอมรบ

<1.0และ<2.5%ตามลาดบ

7.3 สรางกราฟมาตรฐาน(calibrationcurve)

7.3.1 ฉดblank(นา)ตรวจวดคาการนาไฟฟาของblankเพอตรวจสอบการปนเปอน

7.3.2 ฉดworking standard solutionตรวจวดคาการนาไฟฟาของสารละลายมาตรฐาน

แตละไอออนแสดงเปนchromatogram

7.3.3 สรางกราฟมาตรฐานของแตละไอออนให peak area อยบนแกน yความเขมขน

ของสารละลายมาตรฐานอยบนแกน x คานวณคาสมประสทธการตดสนใจ

(correlationofdetermination;R2)เกณฑยอมรบ>0.995

8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults) 8.1 ปรมาณแตละไอออนจากสตร

C(mg/L) = A× RF × D

เมอ A = peakarea

RF(responsefactor) = ความเขมขนสารมาตรฐาน/peakareaสารมาตรฐาน

D = dilution factor

8.2 รายงานปรมาณแตละไอออนในหนวยมลลกรมตอลตร(mg/L)เลขนยสาคญ2ตาแหนง

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresults) 9.1 วเคราะหcontrolsampleและplotลงในqualitycontrolchart

9.2 ทกชดตวอยาง(ชดละไมเกน10ตวอยาง)วเคราะห2ซา(duplicate)คาRPDตองไมเกน5%

25


ไอออน ปรมาณไอออน(mg/L) %recovery %RSD

F- 0.20 - 1.6 91 - 102 1.1 - 4.2

Cl- 1.0 - 40 94 - 102 0.4 - 2.6

NO3-คานวณเปนN 0.23-2.3 96-107 0.7-3.1

SO42- 1.0 - 40 98 - 103 0.4 - 3.5

10. รายละเอยดอน ขอมลRecoveryและrepeatability

27



ใชวเคราะหปรมาณตะกว(Lead;Pb)ในนาดมนาแขงนาแรนาใชในการผลตอาหารนาประปา

นาบาดาล และนาจากแหลงตาง ๆ ยกเวนนาเสย โดย graphite furnace atomic absorption

spectrometer(GFAAS)



ofwaterandwastewater22nd ed. Washington DC: American Public Health Association; 2012.

p. 3-28 to 3-33


เทคนคGFAAS เปนการวดแรธาตทมปรมาณนอยมาก (ระดบ ppb) โดยการใหความรอน

จากกระแสไฟฟา (electrothermal) แก graphite furnaceซงทนความรอนไดสงมาก การให

ความรอนม3ระดบ(หรอมากกวา)ระดบแรกเปนการทาใหตวอยางนาบนgraphiteระเหยแหง

ระดบท2ความรอนทสงขนจะทาลายorganicmatterและสารอนๆระดบท3ความรอนทสงกวา

ระดบท2จะทาใหธาตกลายเปนอะตอมไดอยางสมบรณและการabsorbแสงจะดขน


4.1 GFAAS

4.2 Hotplateชนดปรบความรอนได

4.3 Beakerขนาด10,25และ50ml

4.4 Measuringpipetteขนาด1ml

4.5 Micropipetteขนาด2-50µLพรอมtip

4.6 Volumetricflaskขนาด10และ100ml

4.7 Volumetricpipetteขนาด10ml

DMScF1044: การวเคราะหปรมาณตะกวในนา

Determinationofleadinwater

28



สารเคมทกชนดไมตากวาระดบAR grade และนา (H2O) ทใชเปนนาทปราศจากไอออน

(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity ≥ 18 MΩ - cm


5.1.1 สารละลายมาตรฐานPb1,000mg/L

5.1.2 Intermediate standard solution 5mg/L: เตรยมโดยเจอจางสารละลายมาตรฐาน

Pb1,000mg/L200เทาดวยH2O

5.1.3 Working standard solution: ใหไดชวงความเขมขน 5, 10, 12, 15และ20µg/L

(เตรยมstandard1จดโดยใชIntermediatestandardsolutionเครองจะautomix)

5.2 HNO365%(w/w)

5.3 HNO30.5%:เจอจางHNO365%(w/w)0.5mlดวยH2Oปรบปรมาตรเปน100ml





7.1 ปเปตตวอยาง10mlใสในbeakerขนาด25ml

7.2 เตม 0.05mlHNO3 65% (w/w) (ประมาณ2หยด) digestบน hot plate ในตดดควน

(ระวงอยาใหเดอด)จนปรมาตรลดลงเหลอประมาณ5mlทงใหเยนถายสารละลายตวอยาง

ลงในvolumetricflaskขนาด10mlลางbeakerดวยH2Oรวมนาลางในvolumetricflask

ทาเชนนหลายๆครงปรบปรมาตรดวยH2Oและเขยาผสมใหเปนเนอเดยวกน

7.3 วเคราะหblankและspikedsampleควบคกบการวเคราะหตวอยาง

7.4 วดปรมาณPbดวยGFAAS

8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults) คานวณปรมาณPbจากสตร

C = (C0 – CB)× F

เมอ C = ความเขมขนPbในตวอยาง(mg/L)

C0 = ความเขมขนPbในสารละลายตวอยาง(mg/L)

CB = ความเขมขนPbในสารละลายmethodblank(mg/L)

F = dilution factor

29



9.1 กอนสรางกราฟมาตรฐานตองทา sensitivity checkของเครอง โดยใชworking standard

solutionตามทคมอของเครองกาหนด

9.2 ตรวจสอบการdriftของเครอง โดยการวดworking standard solution 1จดหลงการวด

ตวอยางทก10-12ตวอยาง

9.3 วเคราะหblankทกครงททาการวเคราะห

9.4 วเคราะหblankspikedเพอประเมน%recoveryทกครงททาการวเคราะหเกณฑการยอมรบ

(ตามตาราง)

QCชนดตางๆ เกณฑการยอมรบ

check standard 90 - 110%

spikedsample ใชcontrolchartในการควบคมคณภาพ

duplicate analysis % RPD ≤ 28


เกบรกษาตวอยางใชHNO3 ใหpH<2

31



ใชวเคราะหปรมาณโลหะเหลก(Iron;Fe)แคดเมยม(Cadmium;Cd)โครเมยม(Chromium;Cr)

ทองแดง (Copper;Cu)แมงกานส (Manganese;Mn)นกเกล (Nickel;Ni)สงกะส (Zinc;Zn)

และเงน (Silver;Ag) ในนาดมนาแขงนาแรนาใชในการผลตอาหารนาประปานาบาดาล

และนาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสยโดยflameatomicabsorptionspectrometer(FAAS)

2. เอกสารอางอง(References)

Rice EW, Baird RB, Eaton AD, Clesceri LS, editors. Standard methods for the examination of

waterandwastewater22nd ed. Washington DC: American Public Health Association; 2012.

p. 3-25 to 3-28.


เทคนคAASในการหาปรมาณโลหะและแรธาตอาศยหลกการใชความรอนไปทาใหสารประกอบ

โลหะและแรธาตเปลยนเปนอะตอม (atomization) อะตอมเหลานจะดดกลนแสง (absorb)

ทความยาวคลนทเหมาะสมโดยคาabsorbanceจะเปนสดสวนโดยตรงกบจานวนอะตอม


4.1 Flame Atomic Absorption Spectrometer


4.3 Beakerขนาด50,250ml

4.4 Measuringpipetteขนาด2,10ml

4.5 Micropipetteขนาด5-50,50,100,200,500µlพรอมtip

DMScF1045: การวเคราะหปรมาณเหลกแคดเมยมโครเมยมทองแดง

แมงกานสนกเกลสงกะสและเงนในนา

Determinationofiron,cadmium,chromium,copper,

manganese,nickel,zincandsilverinwater

32


4.6 Volumetricflaskขนาด25,50,100และ1,000ml


4.8 กระดาษกรองNo.1ขนาด70mm


สารเคมทกชนดเปนAR gradeหรอเทยบเทาและนา (H2O)ทใชเปนนาทปราศจากไอออน


5.1 HNO365%(w/w)

5.2 HNO31%:เจอจางHNO365%(w/w)10mlดวยH2Oปรบปรมาตรเปน1L


5.3.1 สารละลายมาตรฐานFe1,000mg/L

5.3.2 สารละลายมาตรฐานCd1,000mg/L

5.3.3 สารละลายมาตรฐานCr1,000mg/L

5.3.4 สารละลายมาตรฐานCu1,000mg/L

5.3.5 สารละลายมาตรฐานMn1,000mg/L

5.3.6 สารละลายมาตรฐานNi1,000mg/L

5.3.7 สารละลายมาตรฐานZn1,000mg/L

5.3.8 สารละลายมาตรฐานAg1,000mg/L

5.3.9 Intermediate standardsolution100mg/L: เตรยมโดยเจอจางสารละลายมาตรฐาน

แตละชนด10เทาดวยH2O

5.3.10Working standard solution (mg/L) เจอจาง intermediate standard solution Fe,

Cd,Cr,Cu,Mn,Ni,ZnและAgดวยHNO31%ปรบปรมาตรเปน50mlใหไดชวง

ความเขมขนทครอบคลมความเขมขนทตองการวด(ตามตาราง)

standardsolution ความเขมขนของ ปรมาตรของ workingstandardsolution(mg/L) intermediatestandardsolution(µl)

Fe 0.05,0.1,0.2,0.4และ0.8 25,50,100,200และ400

Cd,Mn 0.02,0.05,0.1,0.2และ0.4 25,50,100,150และ200

Cr,Cu,Ni,Zn,Ag 0.05,0.1,0.2,0.3และ0.4 25,50,100,150และ200

33






7.1 ปเปตตวอยางมา200mlใสในbeakerขนาด250ml

7.2 เตม 2.0mlHNO3 65% (w/w) digest บน hot plate ในตดดควน (ระวงอยาใหเดอด)

จนปรมาตรลดลงเหลอประมาณ10ml

7.3 ทงใหเยน ถายสารละลายตวอยาง ลงใน volumetric flask ขนาด 25ml ลาง beaker

ดวยH2Oหลายๆครงรวมนาลางในvolumetricflaskปรบปรมาตรและเขยาผสมใหเปน

เนอเดยวกน(ถาตวอยางมตะกอนตองกรองกอน)


7.5 วดปรมาณFe,Cd,Cr,Cu,Mn,Ni,ZnและAgดวยFAAS


คานวณปรมาณโลหะจากสตร

C = (C0 – CB)× F

เมอ C = ความเขมขนของโลหะในตวอยาง(mg/L)

C0 = ความเขมขนของโลหะในสารละลายตวอยาง(mg/L)

CB = ความเขมขนของโลหะในสารละลายmethodblank(mg/L)

F = dilution factor

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftheresults)





9.3 วเคราะหblankทกครงททาการวเคราะห



34



เกบรกษาตวอยางใชHNO3ใหpH<2


checkstandard within+20%spikedsample ใชcontrolchartในการควบคมคณภาพduplicate analysis % RPD ≤ 20

35



ใชวเคราะหปรมาณสารหน (Arsenic;As) ในนาดมนาแขงนาแร นาใชในการผลตอาหาร

นาประปานาบาดาลและนาจากแหลงตางๆ ยกเวนนาเสย โดย hydride generation atomic

absorptionspectrometer(HGAAS)



ofwaterandwastewater22nd ed. Washington DC: American Public Health Association; 2012.

p. 3-38 to 3-39.


สารหนทอยในรปAs3+ในนาเมอทาปฏกรยากบsodiumborohydride(NaBH4)ในสภาวะทเปน

กรดออนจะเปลยนเปนสารประกอบไฮไดรดซงอยในรปของแกส (AsH3) แกสนจะถกแกส

อารกอนพาไปยงquartzcellทรอนเกดการแตกตวจนไดอะตอมอสระอะตอมเหลานจะดดกลน

แสงและถกวดปรมาณโดยเครองAASสารหนทอยในรปAs5+ตองเปลยนใหเปนAs3+ดวยKI

และascorbicacidกอนทาปฏกรยากบNaBH4


4.1 HGAAS


4.3 Beakerขนาด10,50,250ml

4.4 Micropipetteขนาด2-50,20-100µlพรอมtip

4.5 Volumetricflaskขนาด25,50,100,1000ml


4.7 ขวดแกวสชาหรอvolumetricflaskสชา

DMScF1046: การวเคราะหปรมาณสารหนในนา

Determinationofarsenicinwater

36



สารเคมทกชนดเปน AR grade หรอเทยบเทา และ H2O ทใชเปนนาทปราศจากไอออน


5.1 HCl37%(w/w)

5.2 1.5%HCl:เจอจางHCl37%(w/w)15mlปรบปรมาตรเปน1L

5.3 3% sodium borohydride solution (NaBH4):ละลาย3gใน1%NaOH100ml

5.4 สารละลายผสมของ5%KIและ5%ascorbicacid:ละลายKI2.5gและascorbicacid

2.5 g ใน volumetric flaskขนาด 50ml เกบใสขวดสชาหรอทมด (เตรยมใหมทกครง

กอนใช)

5.5 สารมาตรฐาน(standards)

5.5.1 สารละลายมาตรฐานAs1,000mg/L

5.5.2 Intermediate standard solution 5mg/L: เตรยมโดยเจอจางสารละลายมาตรฐาน

As1,000mg/L200เทาดวยH2O

5.5.3 Working standard solution: 0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0และ4.0mg/L เตรยมโดยปเปต

intermediate standard solution 5mg/Lปรมาตร 0, 10, 20, 40, 60 และ 80 µl

ตามลาดบใสvolumetricflaskขนาด100mlปรบปรมาตรดวย1.5%HCl





7.1 ปเปตตวอยาง25mlใสbeakerขนาด50mlระเหยบนhotplateในตดดควน(ระวงอยา

ใหเดอด)ใหเหลอประมาณ10mlถายใสในvolumertricflaskขนาด25ml

7.2 เตมHCl37%(w/w)1ml

7.3 เตมสารละลายผสมของ5%KIและ5%ascorbicacid1ml เกบไวในทมดหรอขวดสชา

อยางนอย30minเพอรดวซAs5+เปนAs3+ปรบปรมาตรดวยH2O


7.5 วดปรมาณสารหนดวยHGAAS

37



คานวณปรมาณAsจากสตร

C = (C0 – CB)× F

เมอ C = ความเขมขนAsในตวอยาง(mg/L)

C0 = ความเขมขนAsในสารละลายตวอยาง(mg/L)

CB = ความเขมขนของAsในสารละลายmethodblank(mg/L)

F = dilution factor

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftheresults)





9.3 วเคราะห blankทกครงททาการวเคราะห กรณตวอยางมมาก วเคราะห 5%ของจานวน

ตวอยาง




check standard 90 - 110 %

spikesample ใชcontrolchartในการควบคมคณภาพ

duplicate analysis % RPD ≤ 28

10.รายละเอยดอน

เกบรกษาตวอยางใชHNO3ใหไดpH<2

39



ใชวเคราะหปรมาณใยอาหารทงหมดในอาหารโดยenzymatic–gravimetricmethod


AOAC Official Method 985.29 Total Dietary Fiber in Foods. Codex-Adopted-AOAC Method


ตวอยางอาหารแหง 2ชด (portion) ถามปรมาณไขมนมากกวา 10% ใหสกดไขมนออกกอน

นามา gelatinizeดวยTermamyl (heat stableα-amylase)หลงจากนนนามายอยดวยเอนไซม

protease และ amyloglucosidase เพอกาจดโปรตนและแปง เตม ethanol เพอตกตะกอน

solubledietaryfiberกรองและลางตะกอนทไดหลงจากทาตะกอนใหแหงชงนาหนกนาตวอยาง

ชดท1มาวเคราะหปรมาณโปรตนตวอยางชดท2นามาวเคราะหปรมาณเถาปรมาณใยอาหาร

ทงหมดคอนาหนกตะกอนทเหลอหลงจากทหกนาหนกโปรตนและเถาออก



4.2 ตอบสญญากาศ(vacuumoven)

4.3 ตอบรอน(hotairoven)

4.4 ระบบสญญากาศ(vacuumsource)พรอมชดกรองสารละลายตวอยางและภาชนะสาหรบ

ใสและยอยตวอยาง(digestionflask)

4.5 เครองบดหรอปนตวอยาง

4.6 อางนารอนชนดนาเดอด (boilingwater bath)และชนดควบคมอณหภมแบบมระบบเขยา

(thermostatshakingwaterbath)ซงสามารถปรบตงอณหภมไดท60C

DMScF1047: การวเคราะหปรมาณใยอาหารทงหมดในอาหาร

โดยEnzymatic-GravimetricMethod

Determinationoftotaldietaryfiberinfoods

byEnzymatic-GravimetricMethod

40


4.7 pH meter

4.8 เตาเผา(mufflefurnace)

4.9 FrittedCrucibleขนาด30mlทาดวย borosilicate glass ทฐานม filter PorosityNo. 2

(Pyrex No. 32940, coarse, ASTM 40-60 µmหรอTecatorpartNo.1000-1001standard

crucibleหรอเทยบเทา) กอนใชงานใหทาความสะอาด และเผาท 525 C เปนเวลา 1 hr

ทงใหเยนลงประมาณ 130 Cหรอตากวา แช crucible ในนา และฉดลางดวยนากลน

ทงใหแหง

4.10 โถดดความชนพรอมสารดดความชน(desiccatorwithdesiccant)


สารเคมทกชนดไมตากวาระดบARgradeและนา(H2O)ทใชเปนนาปราศจากไอออน(deionized

water)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity ≥ 18 MΩ-cm

5.1 Acetone

5.2 98%Ethanol(v/v)(technicalgrade)

5.3 8%Ethanol:เตมH2O207mlลงในvolumetricflaskขนาด1Lปรบปรมาตรดวย95%

ethanol ผสมใหเขากน (อาจเตรยมโดยผสมH2Oและ 95% ethanol ในอตราสวน 1:4

โดยปรมาตร)

5.4 Phosphatebuffer0.08M,pH6.0:ชงsodiumphosphatedibasic,anhydrous(Na2HPO4)

1.400 g (หรอ dihydrate 1.753 g) และ sodium phosphatemonobasicmonohydrate

(NaH2PO4.H2O)9.68g(หรอdihydrate10.94g)ละลายดวยH2O700mlแลวปรบปรมาตร

เปน1LตรวจสอบคาpHดวยpHmeterเกบในขวดสชาและไวในตเยน

5.6 HCl0.325M:เจอจาง1MHCl325mlดวยH2Oปรบปรมาตรเปน1L

5.7 NaOH0.275M:ชงNaOH11gละลายดวยH2Oปรบปรมาตรเปน1L

5.8 Celite,acid-washed

5.9 เอนไซม3ชนดไดแก

5.9.1 Termamyl solution (heat stable α-amylase)เกบในตเยน

5.9.2 Proteaseเกบในตเยน

5.9.3 Amyloglucosidaseเกบในตเยน

หรออาจใชชดเอนไซมทง3ชนด(SigmaChemicalCo.,KitNo.TDF-100หรอเทยบเทา)

เกบในตเยน

41



6.1 เตรยมตวอยางใหเปนเนอเดยวกนโดยการบดตวอยางโดยใช cyclonemillหรอmotar

(ครกบด)แรงผานตะแกรงขนาด0.3-0.5mm

6.2 ชงตวอยาง 30 gอบในตอบสญญากาศทอณหภม 70 C เวลา 18 ± 2 hr เกบในภาชนะ

ทมฝาปดและเกบในdesiccatorจนกวาจะนามาวเคราะหหาปรมาณใยอาหาร

6.3 ชงตวอยางทอบแลวมา0.5-1gจานวน2ชดในภาชนะยอยตวอยาง(digestionflask)แตละ

ชดควรมนาหนกตางกนไมเกน20mg(ตวอยางทมไขมนมากกวา10%และตวอยางอาหาร

ผสม(mixeddiet)ใหสกดไขมนออกโดยใชpetroleumetherสกด3ครงครงละ25ml)


ทกครงทวเคราะหตวอยางใหทา blank2 ชดควบคไปดวยทกครงเพอตรวจวดปรมาณ residue

ในreagentซงมผลตอคาdietaryfiberในตวอยาง

7.1 ชง celite ประมาณ 0.5 g จดบนทกนาหนกทแนนอน (ทศนยม 4 ตาแหนง) ใสใน

frittedcrucibleทเตรยมไวอบในตอบรอนทอณหภม130 Cจนไดนาหนกคงท(ประมาณ

2hr)ทงใหเยนในdesiccatorชงและบนทกนาหนก

7.2 เตมphosphatebufferpH6.0(ทงไวทอณหภมหองกอนนามาใช)50mlลงในdigestion

flaskปรบpHของสารละลายตวอยางเปน6.0±0.2เขยาเบาๆใหตวอยางกระจายสมาเสมอ

7.3 เตมTermamyl solution (heat stable α - amylase) 0.1ml (100µl)แลวปด flaskดวย

aluminium foil

7.4 บมตวอยางโดยนา digestion flaskตงในอางนาเดอดเปนเวลา 15min โดยเรมจบเวลา

เมออณหภมของสารละลายในdigestionflaskถง95-100C(โดยปกตจะใชเวลาในการบม

ทงหมดไมเกน30minในระหวางการบมใหเปดระบบเขยา digestion flask เบาๆทกๆ

5 min

7.5 ทงให digestion flask เยนลงจนถงอณหภมหอง และนามาปรบ pH ใหเปน 7.5± 0.2

โดยเตมสารละลาย0.275NNaOH10ml

7.6 เตมprotease5mgแตเนองจากproteaseทใชมลกษณะเปนผงและมกจะตดอยท spatula

ดงนนจงเตรยมเปนสารละลายโดยชงprotease50mgใสในphosphatebuffer1mlแลว

จงปเปตมา 0.1ml ใสในdigestion flaskฉดลางตวอยางทตดอยขางภาชนะดวยนากลน

ปดflaskดวยaluminiumfoil

42


7.7 บมตวอยางในอางนารอนควบคมอณหภมแบบมระบบเขยาตอเนอง ทอณหภม 60 C

เปนเวลา30min(เรมจบเวลาเมออณหภมของสารละลายขางในdigestionflaskถง60 C)

เปดระบบเขยาตอเนองตลอดระยะเวลาในการบม

7.8 ทงใหสารละลายตวอยางใน digestion flask เยนลงถงอณหภมหอง ปรบ pH ใหอย

ระหวาง4-4.6โดยเตม0.325MHClประมาณ10ml

7.9 เตมสารละลาย amyloglucosidase 0.3mlฉดลางตวอยางทตดอยขางภาชนะดวยนากลน

แลวปดflaskดวยaluminiumfoil

7.10 บมตวอยางในอางนารอนควบคมอณหภมแบบมระบบเขยาตอเนองทอณหภม 60 C เปน

เวลา30min(เรมจบเวลาเมออณหภมของสารละลายในdigestionflaskถงอณหภม60C)

เปดระบบเขยาตอเนองตลอดระยะเวลาในการบม

7.11 เตม95%ethanolซงอนไวแลวท60Cปรมาตร280mlหรอประมาณ4เทาของปรมาตร

ของสารละลายตวอยาง (วดปรมาตรกอนนาไปอนท 60 C) ใสในdigestion flaskทงให

ตกตะกอนทอณหภมหอง1hr

7.12 นาcrucibleและceliteทชงไวแลวในขอ7.1มาทาใหceliteเรยบตดกบฐานของcrucible

ดวย78%ethanol10mlโดยใชขวดฉด(washbottle)ลงบนceliteเปดระบบกรองสญญากาศ

7.13 กรองสารละลายตวอยางใน digestion flaskทผานการตกตะกอนแลวในขอ 7.11ลงใน

crucibleทเตรยมไวในขอ7.12ลางตะกอนดวย78%ethanol3ครงครงละ20ml,95%

ethanol2ครงครงละ10mlและacetone2ครงครงละ10mlครงแรกของการลางใหฉด

ลางดานขางของdigestionflaskเพอใหresidueทตดอยลงไปในcrucibleใหหมด

7.14 อบ crucibleทม celite และresidueทไดจากขอ 7.13 ในตอบรอนอณหภม 105 Cหรอ

ในตอบสญญากาศอณหภม 70 Cคางคน (ประมาณ18hr)แลวทงใหเยนในdesiccator

ชงและบนทกนาหนก

7.15 นา residueชดทหนงมาหาปรมาณโปรตนทเหลอจากการยอยดวยเอนไซม (indigestible

protein)โดยขดทงceliteและresidueใสลงในหลอดยอยตวอยางขนาด250mlแลววเคราะห

หาปรมาณโปรตนในresidueโดยวธKjeldahl

7.16 นา residueชดทสองหาปรมาณเถาโดยนามาเผาในเตาเผา (muffle furnace)ทอณหภม

525 C เปนเวลา5hrแลวทงให crucible เยนลงตากวา 250 Cแลวจงนาออกจากเตาเผา

ทงใหเยนในdesiccatorชงนาหนก(ทศนยม4ตาแหนง)

43


8. การคานวณและรายงานผล(Calculationandexpressionofresults) การหาคาBlank

B = Blank(g)=RB-PB-AB

เมอ RB = คาเฉลยของนาหนกresidueของblank2ชด(g)

PB = นาหนกของโปรตนในresidueของblankชดทนามาหาโปรตน(g)

AB = นาหนกของเถาในresidueของblankชดทนามาหาเถา(g)

TotalDietaryFiber,%=[(R-P-A–B)×100]/W เมอ R = คาเฉลยของนาหนกresidueของตวอยาง2ชด(g)

P = นาหนกโปรตนในresidueของตวอยางชดทนามาหาโปรตน(g)

A = นาหนกเถาในresidueของตวอยางชดทนามาหาเถา(g)

B = นาหนกblank(g)

W = คาเฉลยของนาหนกตวอยาง 2 ชด (คานวณเปนนาหนกตวอยางทยง

ไมอบแหง)(g)

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(AssuringtheQualityofTestResults) 9.1 วเคราะห2ซา(duplicate)ทกตวอยาง

9.2 ทดสอบความบรสทธของเอนไซม(enzymepurity)โดยทดสอบประสทธภาพของเอนไซม

ทกlotของเอนไซมหรอทก6เดอนโดยใชตวอยางดงแสดงในตาราง

Test samples for enzyme purity

Citrus pectin Pectinase 0.1 95-100Stractan(larchgum) Hemicellulase 0.1 95-100Wheat starch Amylase 1.0 0-1Corn starch Amylase 1.0 0-2Casein Protease 0.3 0-2β-Glucan(barleygum)a β-Glucanase 0.1 95-100

aSigmaChemicalCo.orMegazymeInternationalIreland,Ltd.

Testsample Activitytested Testportionweight,g Expectedrecovery,%


ไมฉดลาง acetoneลงในdigestion flask ซงทาดวยพลาสตก เพราะ acetoneมฤทธกดกรอน

พลาสตกจะทาใหภาชนะเสยหายได

45



ใชเปนวธตรวจวเคราะหปรมาณกรดนาสมในนาสมสายช


AOACOfficialMethod930.35Vinegars(1)J.TotalAcidsandK.NonvolatileAcids


ปรมาณกรดนาสม หาไดโดยไทเทรตโดยตรงกบสารละลายมาตรฐาน NaOH โดยใช

phenolphthaleinเปนindicator


4.1 เครองPotentiometer

4.1.1 Compact titrator: 716 DMS titrino

4.1.2 Magneticswing-outstirrer:728Stirrer

4.1.3 Electrode: combined pH glass electrode

4.1.4 Exchange unit

4.2 เครองชง(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g

4.3 อางนารอน(waterbath)

4.4 Beakerขนาด10และ100ml

4.5 Buretteขนาด50ml

4.6 Cylinderขนาด100ml

4.7 Erlenmeyerflaskขนาด125และ250ml

4.8 ถวยระเหย(evaporatingdish)ขนาดความจประมาณ200ml

4.9 Pipetteขนาด10,25และ50ml

4.10 Volumetricflaskขนาด100,250และ1,000ml

DMScF1048: การตรวจวเคราะหปรมาณกรดนาสมในนาสมสายช

โดยวธTitration

Determinationofaceticacidinvinegarbytitration

46



สารเคมทกชนดเปนARgradeหรอเทยบเทาหรอดกวาและนา(H2O)ทใชเปนนากลนปราศจาก

กาซคารบอนไดออกไซด

5.1 1MNaOH:ชงNaOH40gลงในbeakerขนาด100mlละลายดวยH2Oแลวถายลงใน

volumetricflaskขนาด1000mlและปรบปรมาตรดวยH2O

5.2 0.5MNaOH:ปเปต1MNaOH50mlลงในvolumetricflaskขนาด100mlแลวปรบ

ปรมาตรดวยH2O



5.4 Potassiumhydrogenphthalate(KHC8H4O4),KHP:primarystandard(ทาใหแหงทอณหภม

105Cนาน2hr)

5.5 95% Ethanol

5.6 PhenolphthaleinTS:ชงphenolphthalein1gลงในbeakerขนาด10mlละลายดวย95%

ethanolแลวถายลงในvolumetricflaskขนาด100mlและปรบปรมาตรดวย95%ethanol

5.7 สารละลายมาตรฐาน1MNaOH

Standardization: ชง KHP 5 g (ทราบนาหนกแนนอน,W) ลงใน Erlenmeyer flask

ขนาด125mlเตมH2O75mlเขยาใหละลายแลวไทเทรตดวย1MNaOHโดยใชเครอง

potentiometerหรอหยดphenolphthaleinTS1-2หยดแลวไทเทรตโดยใชburetteขนาด

50mlจนถงจดยตจะไดสารละลายสชมพออนบนทกปรมาตรทใช(V)

W × 1000 NaOH(M)= V × 204.223

เมอ W = นาหนกของKHP(g)

V = ปรมาตรของNaOHทใช(ml)

5.8 StandardbufferpH4,7และ10

6. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample) สมตวอยางประมาณ2 - 3หนวยบรรจ เทผสมลงในภาชนะทสะอาดใหไดตวอยางประมาณ

200mlเขยาใหเปนเนอเดยวกน

47


7. ขนตอนการทดสอบ(Procedures) 7.1 ตรวจสอบเครองpotentiometerกอนใชงาน

7.1.1 ทาการตรวจสอบelectrodeโดยใชstandardbuffer4,7และ10

7.1.2 ลางelectrodeประมาณ2-3ครงดวยนากลน

7.1.3 จมelectrodeลงในนากลนใหอานคาไดประมาณpH6

7.2 Total acids

7.2.1 ปเปตตวอยาง10mlลงในErlenmeyerflaskขนาด125ml

7.2.2 เตมH2O40mlหยดphenolphthaleinTSประมาณ2 - 3หยดแลวไทเทรตดวย

0.5MNaOHโดยใชburetteขนาด50mlจนถงจดยต(บนทกปรมาตรทใชเปนV1)

7.3 Nonvolatile acids

7.3.1 ปเปตตวอยาง10mlลงในevaporateddishขนาด200ml

7.3.2 ตงทงไวใหแหงบนwaterbath

7.3.3 เตมH2Oประมาณ5-10ml แลวตงทงไวใหแหงบนwaterbathดาเนนการซาอก

อยางนอย5ครง

7.3.4 ละลาย residue ดวยH2Oประมาณ 200ml แลวถายลงใน Erlenmeyer flask

ขนาด250mlหยดphenolphthaleinTSประมาณ2-3หยด

7.3.5 ไทเทรตดวย0.1MNaOH(บนทกปรมาตรทใชเปนV2)

8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresults) 8.1 กรณนาสมสายชเทยม

ปรมาณกรดนาสม(g/100ml)คานวณไดจากTotalacids=V1xmolarityofNaOHx0.6

8.2 กรณนาสมสายชหมกหรอกลน

ปรมาณกรดนาสม(g/100ml)คานวณไดจากTotalacids–Nonvolatileacids

Nonvolatileacids(g/100ml)=V2× molarity of NaOH × 0.6

8.3 การรายงานผล

รายงานผลปรมาณกรดนาสมในหนวยg/100mlทศนยม1ตาแหนง


ทาการวเคราะห2ซา(duplicate)ทกตวอยาง

49



ใชเปนวธตรวจวเคราะหความเปนกรดในซอสบางชนด(ซอสพรกซอสมะเขอเทศซอสมะละกอ

หรอซอสแปง)


AOACOfficialMethod 942.15Acidity (Titratable) of Fruit ProductsB.GlassElectrode

Method


ความเปนกรดหาไดโดยไทเทรตโดยตรงกบสารละลายมาตรฐาน NaOH โดยใชเครอง

potentiometer


4.1 เครองPotentiometer

4.1.1 Compact titrator: 716 DMS titrino

4.1.2 Magneticswing-outstirrer:728Stirrer

4.1.3 Electrode: combined pH glass electrode

4.1.4 Exchange unit



4.4 Buretteขนาด50ml

4.5 Cylinderขนาด100ml

4.6 Erlenmeyerflaskขนาด125ml

4.7 Pipetteขนาด10,25และ50ml

4.8 Volumetricflaskขนาด100,250และ1,000ml

DMScF1049: การตรวจวเคราะหความเปนกรดในซอสบางชนด

โดยวธTitration

Determinationofacidityinsaucebytitration

50



สารเคมทกชนดเปนARgradeหรอเทยบเทาหรอดกวาและนา(H2O)ทใชเปนนากลนปราศจาก

กาซคารบอนไดออกไซด

5.1 1MNaOH:ชงNaOH40gลงในbeakerขนาด100mlละลายดวยH2Oแลวถายลงใน

volumetricflaskขนาด1000mlและปรบปรมาตรดวยH2O



5.3 Potassiumhydrogenphthalate(KHC8H4O4)KHP:primarystandard(ทาใหแหงทอณหภม

105Cนาน2hr)

5.4 95% Ethanol

5.5 PhenolphthaleinTS:ชงphenolphthalein1gลงในbeakerขนาด10mlละลายดวย95%

95% ethanol แลวถายลงใน volumetric flask ขนาด 100ml และปรบปรมาตรดวย

ethanol 95%

5.6 สารละลายมาตรฐาน1Msodiumhydroxide

Standardization:ชงKHP5g (ทราบนาหนกแนนอน,W)ลงในerlenmeyer flaskขนาด

125ml เตมH2O 75ml เขยาใหละลาย แลวไทเทรตดวย 1MNaOH โดยใชเครอง

potentiometerหรอหยด phenolphthalein TS 1 - 2หยดแลวไทเทรตโดยใช burette

ขนาด50mlจนถงจดยตจะไดสารละลายสชมพออนบนทกปรมาตรทใช(V)

W × 1000 NaOH(M)= V × 204.223

เมอ W = นาหนกของKHP(g)

V = ปรมาตรของNaOHทใช(ml)

5.7 StandardbufferpH4,7และ10


สมตวอยางประมาณ2 - 3หนวยบรรจ เทผสมลงในภาชนะทสะอาดใหไดตวอยางประมาณ

200mlคนหรอกวนจนตวอยางเปนเนอเดยวกน

51


7. ขนตอนการทดสอบ(Procedures)

7.1 ตรวจสอบเครองpotentiometerกอนใชงาน

7.1.1 ทาการตรวจสอบelectrodeโดยใชstandardbuffer4,7และ10

7.1.2 ลางelectrodeประมาณ2-3ครงดวยH2O

7.1.3 จมelectrodeลงในH2OใหอานคาไดประมาณpH6

7.2 ชงตวอยางประมาณ5-20gลงในerlenmeyerflaskขนาด125ml

7.3 เตมH2O50mlพรอมเปดเครองmagneticswing-outstirrer เพอทาการกวนตวอยางดวย

ความเรวปานกลาง

7.4 จมelectrode(4.1.3)ลงในตวอยาง

7.5 ทาการไทเทรตอยางเรวโดยการสงใหเครองปลอย0.1MNaOHเพอใหอานคาไดประมาณ

pH6

7.6 คอยๆปลอย0.1MNaOHอยางชาๆจนไดประมาณpH7

7.7 ทาการไทเทรตตอจนถงจดยตไดpHประมาณ8.1±0.2

7.8 บนทกปรมาตรทใช(V1)


V1 × molarity of NaOH × 0.006 × 100 8.1 ความเปนกรดคานวณเปนกรดอะซตก(%)= Weightofsample(g)× 0.1


รายงานผลความเปนกรดคานวณเปนกรดอะซตก หนวยรอยละโดยนาหนกทศนยม

1ตาแหนง


9.1 ทาการตรวจสอบ electrodeทกครงทใชงาน โดยวดคาmeasured slope แลวคานวณ

หาคาrelativeslopeซงคาrelativeslopeทคานวณไดตองไมนอยกวา95%

9.2 ทาการวเคราะห2ซา(duplicate)ทกตวอยาง

53



ใชเปนวธวเคราะหคาของกรดในนามนและไขมนทมาจากพชและสตวและผลตภณฑจากนามน

และไขมนแตไมรวมถงไข(waxes)


AOCSOfficialMethodCd 3d-63 (Reapproved 2009),Acid value,OfficialMethods and

RecommendedPractices of theAmericanOilChemist Society (AOCS), 6th Edition 2009,

Commercial Fats and Oils: Section C.


คาของกรด(acidvalue)หมายถงจานวนมลลกรมของpotassiumhydroxide(KOH)ททาปฏกรยา

เปนกลางพอดกบกรดอสระ (free acids) ในตวอยางนาหนก1กรมโดยจะตองไมมกรดอสระ

อนๆนอกเหนอจากกรดไขมน (fatty acids) คาของกรดอาจจะแสดงใหอยในรปของรอยละ

กรดไขมนอสระ(%freefattyacids)ดวยการแปลงดวยแฟคเตอรทเหมาะสม



4.2 Buretteขนาด10mlความละเอยดของสเกล0.02ml

4.3 Cylinderขนาด250,500และ1,000ml

4.4 Erlenmeyerflaskขนาด250ml

4.5 Pipetteขนาด5ml

4.6 Volumetricflaskขนาด100และ1L

4.7 ขวดใสสารสชาขนาด2.5และ4L

DMScF1050: การวเคราะหคาของกรดในนามนและไขมน

DeterminationofAcidValueinOilsandFats

54



สารเคมทกชนดเปนARgrade หรอเทยบเทาหรอดกวา และนา (H2O)ทใชเปนนาปราศจาก

ไอออน(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity ≥ 18 MΩ-cm

5.1 สารละลายผสมtoluene:isopropylalcoholอตราสวน1:1(v/v)

5.2 1% phenolphthalein indicator: ละลาย phenolphthalein 1 g ดวย isopropyl alcohol

ปรบปรมาตรเปน100ml

5.3 สารละลายมาตรฐาน0.1MalcoholicKOH:ละลายKOHนาหนกประมาณ7gดวยH2O

20mlคนใหละลายถายลงvolumetricflaskปรบปรมาตรครบ1Lดวย95%ethanol


สมตวอยางนามนโดยควาภาชนะบรรจนามนขน-ลงหลายครงจนเปนเนอเดยวกนตวอยางไขมน

สมตวอยางแลวนาไปอนรอนอณหภมประมาณ40-50 Cในเวลาสนๆทาใหเปนเนอเดยวกน

รอใหเยนทอณหภมหองจงทาการวเคราะห


7.1 เตม phenolphthalein indicator 2mlลงในสารละลายผสม toluene: isopropyl alcohol

125mlทาใหเปนกลางดวย0.1MalcoholicKOHจนสารละลายเปนสชมพออน

7.2 ชงตวอยางใหไดนาหนกทแนนอน(ตามตารางขางลาง)ลงในflaskโดยเรมตนชงนาหนก

ท 20g เนองจากโดยปกตนามนและไขมนจะมคาของกรดทนอยคอมคาในชวง 0 - 1.0

แตถาหากมคาทเกนใหเลอกชงนาหนกตวอยางตามชวงคาของกรดนนๆ

0-1.0 20 0.05

1.1-4.0 10 0.02

4.1-15.0 2.5 0.01

15.1-75.0 0.5 0.001

>75 0.1 0.0002

Acidvalue นาหนกตวอยาง(±10%),g ความแมนของนาหนก,±g

7.3 เทสารผสม(7.1)ทงหมดลงในflaskตวอยาง(7.2)แกวงจนสารละลายเปนเนอเดยวกน

7.4 ไตเตรทดวย0.1MalcoholicKOHจนสารละลายเปลยนเปนสชมพออน ≥ 30secบนทก

ปรมาตร0.1MalcoholicKOHทใช

55


7.5 blankใชสารผสม(7.1)125ml

7.6 วเคราะหตวอยางละ2ซาหากมขอสงสยในผลการตรวจวเคราะหใหทาการตรวจวเคราะห

ซาทนทเพอการยนยนผล

8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresult)

8.1 การคานวณ

(A-B)× M × 56.1 คาของกรด(มลลกรมโพแทสเซยมไฮดรอกไซดตอกรม)= W

M = ความเขมขนทแนนอนของสารละลายมาตรฐาน0.1MalcoholicKOH(M)

A = ปรมาตรของ0.1MalcoholicKOHทใชในการไตเตรทสารละลายตวอยาง(ml)

B = ปรมาตรของ0.1MalcoholicKOHทใชในการไตเตรทblank(ml)

W = นาหนกของตวอยาง(g)

56.1 = กรมตอโมลของKOH

8.2 รายงานปรมาณคาของกรดดวยคาเฉลยของการวเคราะห2ซาในหนวยมลลกรมโพแทสเซยม

ไฮดรอกไซดตอกรมทศนยม2ตาแหนง

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ(Assuringthequalityoftestresult)

วเคราะห2ซา(duplicate)ทกตวอยาง


การรายงานคาในรปของกรดไขมนอสระ(freefattyacids)ในรปของ%lauric,%oleicหรอ

%palmitic acid ใหคานวณโดยการหารคาของกรดทไดดวยแฟคเตอร 2.81, 1.99หรอ 2.19

ตามลาดบ

57



ใชเปนวธตรวจวเคราะหปรมาณphenolic antioxidants ไดแก propyl gallate (PG), butylated

hydroxyanisol(BHA),butylatedhydroxytoluene(BHT),tert-butylhydroquinone(TBHQ),2,4,

5-trihydroxybutyrophenone (THBP), nordihydroguaiaretic acid (NDGA), 2,6-di-tert-butyl-

4-hydromethylphenol,(Ionox-100),octylgallate(OG)และdodecylgallate(DG)ในนามนไข

มนและเนยโดยเครองHPLC


AOAC Official Method 983.15 Phenolic Antioxidants in Oils, Fats, and Butter Oil Liquid

Chromatographic Method.


Phenolicantioxidantsถกสกดจากนามนหรอไขมนดวยacetonitrileจากนนระเหยสารทสกดได

ใหเกอบแหงแลวปรบปรมาตรดวยสารผสมของacetonitrileและ2-propanolตรวจวดปรมาณ

โดยเครองHPLC


4.1 HPLC-UVdetectorหรอdiodearraydetector

4.2 เครองชงละเอยด(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.001กรมและ0.0001กรม

4.3 Rotary evaporator

4.4 Shaker

4.5 ชดกรองสารละลาย(solventclarificationkit)และชดกรองตวอยาง(sampleclarificationkit):

membranefilter(Nylon,0.45µm,dia.47mm),syringefilter(Nylon,0.45µm,dia.13mm)


DMScF1051: การวเคราะหPhenolicAntioxidantsในนามน,ไขมนและเนย

DeterminationofPhenolicAntioxidantsinOils,Fatsand

ButterOil

58


4.7 Cylinderขนาด50,250และ500ml

4.8 Graduatedtubeขนาด10ml

4.9 Glass dropper

4.10Micropipetteขนาด10–100µl,100–1000µlและ1-5ml

4.11 Luer-locksyringeขนาด10ml

4.12 Roundbottomflaskขนาด500ml

4.13 Separatoryfunnelขนาด125,250,500และ1L

4.14 Volumetricflaskขนาด5,10,20และ1L


(rinseเครองแกวดวยchloroform,acetoneและmethanolตามลาดบ)


สารเคมทกชนดเปนAR grade ยกเวนทระบไว และนา (H2O)ทใชเปนนาปราศจากไอออน


5.1 Acetone

5.2 Acetonitrile

5.3 Acetonitrile HPLC grade

5.4 Chloroform

5.5 Glacial acetic acid HPLC grade

5.6 n-Hexane

5.7 Methanol

5.8 Methanol HPLC grade

5.9 2-Propanol HPLC grade

5.10 H2O HPLC grade

5.11 Saturated acetonitrile: เตม n-hexane 100mlลงใน separatory funnel ขนาด 1Lทม

acetonitrile600mlเขยาอยางแรง2minตงทงไวใหแยกชนใชชนลาง(saturatedacetonitrile)

5.12 Saturated n-hexane: เตม acetonitrileARgrade 25mlลงใน separatory funnelขนาด

250mlทมn-hexane150mlเขยาอยางแรง2minตงทงไวใหแยกชนใชชนบน(saturated

n-hexane)

5.13 สารละลายผสมacetonitrile+2-propanol(1+1):ปเปตacetonitrileHPLCgrade50ml

ลงในvolumetricflaskขนาด100mlปรบปรมาตรดวย2-propanolHPLCgrade

59


5.14 5% acetic acid (mobile phase):ปเปต glacial acetic acidHPLCgrade 50mlลงใน

volumetric flask ขนาด 1 L ปรบปรมาตรดวย H2OHPLC grade แลวกรองผาน

membrane filter

5.15 สารมาตรฐาน:purity≥ 95%

5.15.1 Stock standard solution (1,000 µg/ml): ชงสารมาตรฐานแตละชนด 0.1000 g

แยกใส beaker ขนาด10ml ถายใส volumetric flask ขนาด 10ml ละลายและ

ปรบปรมาตรดวยacetonitrile+2-propanol(1+1)

5.15.2 Intermediatemixstandardsolution(100µg/ml):ปเปต2mlของstockstandard

solution ใส volumetric flaskขนาด 20mlปรบปรมาตรดวย acetonitrile + 2

-propanol(1+1)

5.15.3 Working standard solution (0.5, 1, 5, 30และ 50µg/ml):ปเปต 25, 50, 250,

1,500และ2,500µlของintermediatemixstandardsolutionแยกใสvolumetric

flaskขนาด5mlปรบปรมาตรดวยacetonitrile+2-propanol(1+1)


-


7.1 ชงตวอยาง5.000±0.005gในbeakerขนาด50mlถายใสseparatoryfunnelขนาด125ml

โดยลางbeakerดวยsaturatedn-hexaneปรมาตร20ml(ไขมนหรอเนยใหละลายทอณหภม

ประมาณ40Cกอนนาไปชง)สกดดวยsaturatedacetonitrile50ml(เขยาอยางแรง2min)

ตงทงไวใหแยกชนไขชนacetonitrile(ชนลาง)ลงในseparatoryfunnelขนาด250ml

7.2 สกดซาดวย saturated acetonitrile 50mlอก 2ครง เกบ acetonitrile รวมใน separatory

funnelเดมตงทงไวใหแยกชนไขชนนามนทอาจจะมเหลอ(ชนลาง)ทงแลวถายacetonitrile

ลงในroundbottomflask

7.3 ระเหยลดปรมาตร acetonitrile ดวยเครอง rotary evaporator ทอณหภมไมเกน 40 C

จนเหลอประมาณ2-3ml(ไมควรใชเวลาเกน15minและกรณวเคราะหTBHQตองระวง

ไมระเหยจนแหง)

7.4 ใช glass dropper ถาย acetonitrile ทเหลอลงใน graduated tube ขนาด 10ml ลาง

roundbottomflaskดวยacetonitrileถายลงรวมในtubeจนได5mlลางซาดวย2-propanol

จนครบปรมาตร10mlผสมใหเขากนแลวกรองดวยsyringefilter

60


7.5 ฉดworking standard solution เขาเครองHPLCสรางกราฟมาตรฐานระหวางpeakarea

และความเขมขนของสารมาตรฐาน

7.6 นาสารละลายตวอยางจากขอ 7.4 ฉดเขาเครอง HPLC แลวหาปรมาณโดยอานจาก

กราฟมาตรฐาน

7.7 สภาวะเครองHPLC

Column:reversephaseC18(5µm,4.6× 250mm)หรอเทยบเทา Detector: UV 280 nm

Flowrate:1.50ml/min

Injectionvolume:20µl

MobilephaseแบบGradient

0 15 15 70 10 50 50 0 15 50 50 0 17 15 15 70 24 15 15 70

Time Acetonitrile Methanol 5% acetic acid (min) (%) (%) (%)


8.1 การคานวณปรมาณphenolic antioxidants (PG,BHA,BHT, TBHQTHBP,NDGA,

Ionox-100,OGและDG)

Co × 10 × D Cs(mg/kg) = Wt

เมอ Co = ความเขมขนของphenolicantioxidantsทอานจากกราฟมาตรฐาน(µg/ml)

Wt = นาหนกตวอยาง(g)

D = dilution factor

8.2 รายงานปรมาณphenolicantioxidants(PG,BHA,BHT,TBHQTHBP,NDGA,Ionox-100,

OGและDG)ทพบในหนวยมลลกรมตอกโลกรม(mg/kg)ทศนยม2ตาแหนง

61



9.1 ตรวจสอบความพรอมของเครองHPLC (system suitability) โดยฉดสารมาตรฐานความ

เขมขน 5 µg/ml อยางนอย 5ซา คานวณคา% relative standard deviation (%RSD)

ของRetentiontime(RT)ไมเกน2และ%RSDของpeakareaไมเกน2.5

9.2 ฉดสารมาตรฐานอยางนอย3ระดบความเขมขนเพอเตรยมกราฟมาตรฐานคาr2 ≥ 0.995

9.3 ฉดสารมาตรฐานความเขมขน5µg/mlคนทก10ตวอยางความเขมขนทอานไดไมควรเกน

5%จากความเขมขนของสารมาตรฐานขอ9.1

9.4 วเคราะหตวอยาง 2ซา และblank sample ทเตมสารมาตรฐาน10mg/kg2ซาคานวณ

คา%recoveryอยในชวง80–110%และ%RPDไมเกน15%

63



ใชวเคราะหปรมาณสารโพลารในนามนและไขมนทมาจากพชและสตวรวมทงนามนและไขมน

ปรงอาหารทผานการทอด


AOCSOfficialMethodCd20-91 (Reapproved 2009):DeterminationofPolarCompounds

in Frying Fats. Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemist

Society(AOCS),6th Edition 2009, Commercial Fats and Oils: Section C.


นามนและไขมนปรงอาหารทผานการทอดเมอนามาวเคราะหดวยเทคนคคอลมนโครมาโทกราฟ

จะถกแยกออกเปนสารโพลาร(polarcompounds)และสารนอนโพลาร(non-polarcompounds)

และสารนอนโพลารจะถกชะออกจากคอลมนปรมาณสารโพลารคานวณไดจากนาหนกทแตกตาง

กนระหวางนาหนกตวอยางเรมตนลบดวยนาหนกสารนอนโพลารทถกชะออกจากคอลมน

4. เครองมอและอปกรณ(Apparatus) 4.1 เครองชง(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g

4.2 เครองชงทมความละเอยด0.1หรอ0.01g

4.3 ตอบรอน(hotairoven)

4.4 อางนารอน(waterbath)

4.5 เครองระเหยสญญากาศ(vacuumrotaryevaporator)

4.6 Beakerขนาด10,100และ500ml

4.7 Chromatographic glasscolumnขนาด 21mm id, ความยาวประมาณ450mmพรอม

teflonstopcockและground-glassjoint

DMScF1052: การวเคราะหสารโพลารในนามนและไขมนโดยวธคอลมน

โครมาโทกราฟ

DeterminationofPolarCompoundsinOilsandFatsby

ColumnChromatography

64


4.8 Cylinderขนาด100,500และ1L

4.9 Desiccatorwithsilicagel

4.10Dropping funnel ขนาด 100หรอ 250ml, ground-glass joint ขนาดทสามารถตอกบ

columnได

4.11Flatbottomflaskขนาด250ml,groundneck

4.12Glassfunnelขนาด3.5cmdiam.และ8cmdiam.

4.13Glassrodความยาวประมาณ60cm

4.14 Porcelaindishขนาด20cmdiam.

4.15Roundbottomflaskขนาด250ml,groundjointหรอflaskอนใชในการเตรยมsilicagel

4.16Separatingfunnelขนาด250ml

4.17Volumetricpipetteขนาด20และ50ml


สารเคมทกชนดเปนAR grade ยกเวนทระบไว และนา (H2O)ทใชเปนนาปราศจากไอออน

(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity≥ 18 MΩ-cm

5.1 Lightpetroleumether(bp40-60C)

5.2 Diethyl ether

5.3 Elutionsolvent:ผสมpetroleumetherและdiethyletherอตราสวน87/13(v/v)

5.4 Seasand(purifiedbyacidandcalcined)

5.5 Silicagel 60ขนาดparticle size 0.063 - 0.200mm (70 - 230meshASTM),MerckN

7734หรอเทยบเทา

5.6 Nitrogen(99.0-99.8%)หรอดกวา

5.7 Cottonwoolหรอสาลบรสทธ

5.8 Hydrophobic filter paper


ตวอยางนามนหลงการสมและผสมใหเขากนหากพบสงเจอปนใหกรองออกกอนตวอยางทม

นาเจอปนอยใหกรองโดยใช hydrophobic filter paper และตวอยางทอยในรปของแขงหรอ

กงแขงกงเหลวใหอนรอนพอหลอมเปนเนอเดยวกนทอณหภมประมาณ40 - 50 C รอใหเยนท

อณหภมหองกอนชงนาหนก

65


7. ขนตอนการทดสอบ(Procedures)

7.1 การเตรยมsilicagel(5%H2O):นาsilicagelใสลงในporcelaindishนาไปอบในตอบรอน

ทอณหภมประมาณ160 C เปนเวลาไมนอยกวา4hr เพอ activate silicagelกอนใชงาน

จากนนรอsilicagelใหเยนลงทอณหภมหองในdesiccatorแลวปรบsilicagelใหมความชน

รอยละ5โดยชงsilicagel152gลงในflaskเตมH2O8gแลวเขยาใหเขากนอยางทวถง

เปนเวลาประมาณ30min

7.2 การเตรยมคอลมน

7.2.1 เตม elution solventประมาณ30mlลงในคอลมนทเตรยมไว โดยปด stopcock

แลวนาสาลอดปลายคอลมนโดยใชแทงแกวยาวชวยดนสาลและไลฟองอากาศ

7.2.2 ชง silica gel (5%H2O)25 gลงในbeakerขนาด100 ml เตม elution solvent

ประมาณ80mlเตรยมใหเปนslurry

7.2.3 เปด stopcockของคอลมนคอยๆ เท silica gel slurryลงในคอลมน ให elution

solventออกมาใหเหลอระดบเหนอsilicagelประมาณ10cm

7.2.4 เตม sea sandประมาณ 4 g ลงในคอลมนแลวเปดให elution solvent ออกมา

จนเหลออยเหนอชนของseasandเลกนอย

7.3 การวเคราะห

7.3.1 ชงตวอยางนาหนก2.4-2.6±0.001gลงในvolumetricflaskขนาด50mlละลาย

ดวยelutionsolvent20mlแลวปรบปรมาตรใหครบเขยาใหเปนเนอเดยวกน

7.3.2 ปเปตสารละลายตวอยาง ปรมาตร 20ml ลงในคอลมน โดยระวงผวหนาของ

คอลมนไมใหเกดการฟงกระจาย

7.3.3 นาFlatbottomflaskขนาด250mlทอบแหงท103 ± 2Cเปนเวลา1hrทาใหเยน

ในdesiccatorและชงนาหนกแลววางรองรบปลายคอลมน

7.3.4 เปดstopcockมอตราการไหลประมาณ2.1-2.5ml/minใหเหลอสารละลายตวอยาง

อยเหนอผวหนาคอลมนเลกนอยและไมใหsilicagelแหง

7.3.5 เทelutionsolventปรมาตร150mlลงในdroppingfunnelแลวตอเขากบground

jointดานบนของคอลมนแลวคอยๆเปดstopcockใหelutionsolventหยดลงใน

คอลมนเพอเปนตวชะสารนอนโพลารใหไหลออกจากคอลมนลงไปรวมอยใน

flaskโดยใหอตราการไหลออกจากคอลมนอยในชวงประมาณ2.1-2.5ml/minหรอ

ใชเวลาในการชะรวมประมาณ60-70min

7.3.6 หลงการชะเสรจใหลางสารทตดอยภายนอกปลายคอลมนดวย elution solvent

อกประมาณ 20ml เกบรวมใน flask เดม (ถาตองการวเคราะหสารโพลารทถก

66


ดดซบบน silica gel ในคอลมนสามารถชะออกดวย diethyl etherดวยปรมาตร

150mlลงในflaskอกใบหนงแลวดาเนนการเชนเดยวกบการทาในสารนอนโพลาร

ขนตอนนเปนการทดสอบประสทธภาพการแยกสวนของคอลมน)

7.3.7 นาflaskไประเหยelutionsolventออกดวยvacuumrotaryevaporatorทอณหภม

ของอางนาประมาณ 45 C หรอระเหยในอางนารอนทอณหภมประมาณ 60 C

ในตดดควนจากนนเปาไลตวทาละลายทเหลออยดวยแกสไนโตรเจนเชดภายนอก

flaskใหแหงแลวนาไปอบในตอบรอนทอณหภม103 ± 2Cเปนเวลา2hrทงใหเยน

ในdesiccatorแลวชงนาหนกอบซาเปนเวลา1hrจนนาหนกคงท(ไมเกน0.001g)

นาคาทนอยกวาไปคานวณหาปรมาณสารโพลาร

7.3.8 วเคราะหตวอยางละ1ซาถาผลการตรวจวเคราะหนาสงสยใหวเคราะหอก1ซา

7.3.9 วเคราะห blank ดาเนนการวเคราะหเชนเดยวกบตวอยาง โดยไมมตวอยาง

คาความแตกตางระหวาง flask เปลากบ flask+ residuesตองมคาตางกนไมเกน

+0.0005gหากเกนจะตองทบทวนสารเคมทใชในการวเคราะหทงหมด(คาblank

ทไดไมตองนาไปใชในการคานวณ)



m - m1 × 100 สารโพลาร(g/100g) = m

m = นาหนกตวอยางในสารละลายตวอยาง20mlทloadลงในคอลมน(g)

m1 =สารnon-polarทชะออกจากคอลมน(g)


รายงานผลปรมาณสารโพลารในหนวยกรมตอ100กรม(g/100g)ดวยทศนยม1ตาแหนง


-

67



ขอมลPrecisionปรากฏในตารางท1และ2

ตารางท1ResultsofanIUPACcollaborativestudyonthedeterminationofpolarcompounds.

Number of laboratories accepted 9 9 8 8Number of results accepted 18 18 16 16Meanofthelaboratoryvalues(%m/m) 8.00 7.30 11.50 25.90

RepeatabilityStandard deviation, sr 0.36 0.33 0.23 0.52Relative standard deviation, RSDr % 4.5 4.5 2.0 2.0Repeatability value, 2.8 × sr 1.02 0.94 0.66 1.47

ReproducibilityStandard deviation, sR 0.37 0.39 0.48 0.77Relative standard deviation, RSDR % 4.6 5.3 4.2 3.0Reproducibility value, 2.8 × sR 1.04 1.09 1.35 2.17

TestSample 1 2 3 4

TestSample 1 2 3 4 5

Number of laboratories accepted 13 13 11 14 10 Number of results accepted 26 26 22 28 20Meanofthelaboratoryvalues(%m/m) 16.01 22.28 11.74 32.06 20.80

RepeatabilityStandard deviation, sr 0.27 0.29 0.34 0.33 0.14 Relative standard deviation, RSDr % 1.7 1.3 2.9 1.0 0.7Repeatability value, 2.8 × sr 0.74 0.81 0.95 0.92 0.38

Reproducibility Standard deviation, sR 1.04 1.29 0.56 1.66 0.61Relative standard deviation, RSDR % 6.5 5.8 4.8 5.2 3.0Reproducibility value, 2.8 × sR 2.92 3.61 1.58 1.64 1.72

ตารางท2Resultsofa2,000collaborativestudyonthedeterminationofpolarcompounds.

69



ใชในการวเคราะหสารเคมปองกนกาจดศตรพชกลมคารบาเมตตกคางในผกและผลไมทมปรมาณ

นาในตวอยางมากกวารอยละ75และครอบคลมสารกลมคารบาเมตไดแกaldicarb,bufencarb,

carbaryl,carbofuran,methiocarb,methomyl,oxamylและอนพนธของสารเหลาน(metabolites)


AOACOfficialMethod985.23N-MethylcarbamateInsecticideandMetaboliteResidues


สารเคมปองกนกาจดศตรพชกลมคารบาเมตทตกคางในผกและผลไมถกสกดออกจากตวอยาง

โดยปนกบsolventทเหมาะสมแลวทาใหสารบรสทธโดยใชเทคนคliquid–liquidpartitionและ

Nuchar-CelitecolumnchromatographyหลงจากนนตรวจวดชนดและปรมาณดวยHPLC,in-line

post-columnderivatizationและfluorescencedetector

4. เครองมอ(Apparatus)

4.1 เครองชงทมความละเอยด0.01gหรอ0.001g

4.2 เครองชง(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001gหรอ0.00001g

4.3 เครองบดปนความเรวสง(homogenizer)

4.4 ชดเครองระเหยสญญากาศ(vacuumrotaryevaporator)

4.5 Hot air oven

4.6 Hotplatewithmagneticstirrer

4.7 Muffle furnace

4.8 HPLC-fluorescence detector

DMScF1053: การวเคราะหปรมาณสารเคมปองกนกาจดศตรพช

กลมคารบาเมตในผกผลไม

Determinationofcarbamatepesticideresiduesinvegetables

andfruits

70


4.9 Post-column derivatization instrument

4.10 อปกรณ

4.10.1 Beakerขนาด2L

4.10.2 Büchner funnel, porcelain, 13 cm diameter

4.10.3 Chromatographic column 22 mm. id. × 300 mm., teflon stopcock, coarse

porosity fritted disc

4.10.4 Cylinderขนาด100,250,500ml

4.10.5 Filterflaskขนาด1L

4.10.6 Filter membrane PTFE 13 mm, 0.20 µm

4.10.7 Glassfunnelขนาด75mmid

4.10.8 GlassstopperedErlenmeyerflaskขนาด250ml

4.10.9 Glasssyringeขนาด10ml

4.10.10 Round-bottomflask500ml,1Lและ2L

4.10.11 Separatory funnel 250, 500 ml

4.10.12Vialทมscrewcapขนาด8ml

4.10.13 กระดาษกรองWhatmanNo.1เสนผานศนยกลาง125mmหรอเทยบเทา


สารเคมทกชนดไมตากวาระดบARgradeยกเวนทระบไวและนา(H2O)ทใชเปนนาปราศจาก

ไอออน(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity≥ 18 MΩ-cm

5.1 Acetonitrile (CH3CN)HPLCgrade

5.2 Dichlorodimethylsilane

5.3 Hydrochloricacid(HCl)

5.4 Isopropanol

5.5 Methanol(MeOH)HPLCgrade

5.6 Methylene chloride (CH2Cl2)HPLCgrade

5.7 Petroleum ether HPLC grade

5.8 Sodiumchloride(NaCl)

5.9 Toluene HPLC grade

5.10 Sodium sulfate (Na2SO4)anhydrous,granularเผาทอณหภม600 Cอยางนอย3hrแลว

เกบในภาชนะแกวสชาปดสนท

71


5.11 Charcoal:ชงcharcoal100gใสในbeakerขนาด2L เตมHCl700mlปดดวยกระจก

นาฬกาตมนาน1hr(ขณะตมใชmagneticbarกวนสารตลอดเวลา)เตมนากลนอก700ml

ตมตอไปอก 30minปลอยทงใหเยน ลางตะกอนดวยนากลนจนเปนกลางลางตอดวย

MeOH500mlตามดวยCH2Cl2500mlปลอยทงไวจนแหงในhood เกบใสในขวดแกว

แลวนาไปอบทอณหภม 120 C นาน 4 hr หลงจากนนปลอยใหเยนใน desiccator

เมอนาออกจากdesiccatorปดฝาใหสนทไวใชงานตอไป

5.12 Silanizedcelite:ชงcelite545นาหนก150gใสในbeakerขนาด2LเตมHCl:H2O(1:1)

ปรมาตร 1 L ปดดวยกระจกนาฬกา ตมจนกระทงเดอด (ขณะตมใช magnetic bar

กวนสารตลอดเวลา)หลงจากเดอดแลวตมตออก10minปลอยทงใหเยนลางตะกอนดวย

H2Oจนเปนกลาง ลางตอดวยMeOH 500ml ตามดวยCH2Cl2 500mlปลอยทงไว

จนแหงในhoodเกบใสในขวดแกวอบทอณหภม120Cคางคน(มากกวา12hr)แลวปลอย

ใหเยนในdesiccatorนาไปเตมdichloromethylsilane 3ml ในhood เขยาใหเขากนนาน

15min(ในขณะเขยาใหเปดฝาเปนชวงเพอลดแรงดนภายในขวด)ตงทงไวทอณหภมนาน

4 hr แลวเตมMeOH 500ml คนใหเขากน ตงทงไว 15min นาตะกอนไปลางดวย

isopropanolจนเปนกลางปลอยทงไวจนแหงในhoodเกบใสขวดแกวอบทอณหภม105C

นาน 2 hrหลงจากนนปลอยใหเยนในdesiccator เมอนาออกจากdesiccatorปดฝาให

สนทไวใชงานตอไป

5.13 Sodiumhydroxide (NaOH) solution 0.05N: เตรยม supernateNaOHโดยใชNaOH

1สวนละลายดวยH2Oทตมไล carbondioxideแลว 1สวน เกบในขวดแกวทมฝาปด

ตงทงไวประมาณ10 วน เพอให sodium carbonateตกตะกอนจนหมดจากนนเตรยม

5NNaOHโดยปเปตสวนใส27mlใสในvolumetric flask100ml เตมH2O จนครบ

ปรมาตรแลวผสมใหเขากนแลวเตรยม0.05NNaOHโดยปเปตของ5NNaOH10ml

ใสในvolumetricflask1LเตมH2Oจนครบปรมาตรแลวผสมใหเขากน

5.14 Sodiumboratebuffersolution0.05M:ชงsodiumtetraboratedecahydrate19.1gละลาย

ดวยH2O500mlใสในvolumetricflask1Lใชultrasonicbathชวยในการละลายแลวเตม

H2Oจนครบปรมาตรผสมใหเขากน

5.15 Reaction solution: ชง o-phthalaldehyde 100mg ละลายดวยMeOH 10ml ใสใน

volumetric flask 1 Lทม 0.05M sodium borate buffer solutionประมาณ 500ml

เตม 2-mercaptoethanol 1mlปรบปรมาตรใหครบดวย 0.05M sodium borate buffer

solutionผสมใหเขากน

72



6.1 นาตวอยางผก-ผลไม1kgมาบดปนใหละเอยดดวยเครองบดปนทเหมาะสมเชนblender,

rotary cutter

6.2 เกบตวอยางทบดปนแลวทอณหภมตากวา-15Cเมอไมไดวเคราะหทนท

6.3 นาตวอยางมาวางไวจนถงอณหภมหองกอนทาการวเคราะห


7.1 การสกด : ชงตวอยางผกและผลไมทบดละเอยดแลว 150 g ใสใน beaker ขนาด 1 L

เตมMeOH300mlนาไปปนดวยเครองบดปนความเรวสงนาน2minกรอง(vacuumfilter)

ผานBüchnerfunnelทมกระดาษกรองNo.1เกบfiltrateในsuctionflaskขนาด1Lคานวณ

ปรมาตรสารละลายจากตวอยางผกและผลไมดงน

ปรมาตรของตวอยาง100g

= H2O(ml)ในตวอยาง100g+200mlMeOH–10mlcontractionfactor

ตวงสารละลายทกรองไดปรมาตรเทากบตวอยาง 100 g (ตามทคานวณได) ใสลงใน

round-bottom flask ขนาด 2 L เตม H2O จนครบ 100ml นาไประเหยดวยเครอง

ระเหยสญญากาศจนปรมาตรของสารละลายเหลอประมาณ75ml

7.2 liquid – liquid partition

7.2.1 นาสารละลายทไดจากการระเหยใสในseparatoryfunnelขนาด500mlเตมNaCl

15gเขยาจนละลายหมดเตมCH3CN75mlเขยา30secแลวตงทงไวจนแยกชน

7.2.2 ถายชนนา (ชนลาง) ใสใน separatory funnelขนาด250ml เตมCH3CN 50 ml

เขยา20secตงทงไวจนแยกชนแลวทงชนนา(ชนลาง)

7.2.3 เตม20%NaClsolution25mlในseparatory funnelขนาด500ml (7.2.1) เขยา

20 sec แลวตงทงไวจนแยกชน ถายชนนา (ชนลาง) ลงใน separatory funnel

ขนาด250ml(7.2.2)เขยา20secแลวตงทงไวจนแยกชนแลวทงชนนาไป

7.2.4 เตมpetroleumether100mlลงในseparatoryfunnelขนาด500ml(7.2.3) เขยา

20secแลวตงทงไวจนแยกชนแยกชนลาง(ชนCH3CN)ใสในseparatoryfunnel

ขนาด500mlใบท2

7.2.5 นาชนCH3CNในseparatoryfunnelขนาด250ml(7.2.3)สกดซากบpetroleum

ether(7.2.4)เขยา20secแลวตงทงไวจนแยกชนแยกชนลาง(ชนของacetonitrile)

รวมใสใน separatory funnel ขนาด 500ml ใบท 2 สวนชน petroleum ether

เตม CH3CN 10ml เขยา 20 sec ตงทงไวใหแยกชน แยกชนลางซงเปนชน

CH3CNรวมใสในseparatoryfunnelขนาด500mlใบท2

73


7.2.6 เตม 2%NaCl solution 50ml และCH2Cl2 100ml ลงใน separatory funnel

ขนาด500mlใบท2เขยา20secตงทงไวจนแยกชน

7.2.7 ไขชน solvent (ชนลาง) ลงในErlenmeyer flask ขนาด 500ml เตมNa2SO4

anhydrous ทละนอย ๆ แกวงเบา ๆ จนเหนวา Na2SO4 เปนผงรวนไมจบกน

เปนกอนแลวกรองสารละลายผานกระดาษกรองทม Na2SO4 อยเลกนอยลงใน

round-bottomflaskขนาด1L

7.2.8 ลางชนนา (ชนบน)จาก 7.2.7ดวยCH2Cl2 25ml 2ครง โดยแกวงเบาๆ ระวง

อยาใหเกด emulsion ระหวางการลาง แลวไขชนลางลงใน Erlenmeyer flask

ขนาด500mlทาเชนเดยวกบ7.2.7

7.2.9 นาสารละลายทกรองได ซงรวมอยใน round-bottom flaskขนาด 1L ไประเหย

ดวยเครองระเหยสญญากาศจนเกอบแหง เตมCH2Cl2 10ml เพอดาเนนการตอ

ในขอ7.3การทาใหบรสทธ

7.3 การทาใหบรสทธ

7.3.1 เตรยม chromatographic columnทม round-bottom flaskขนาด500ml รองรบ

ตอกบvacuumaspirator

7.3.2 ใส silanized celite 0.5 g ใน chromatographic column เคาะขาง column เบาๆ

ให packingmaterialมผวหนาเรยบแลวใส charcoal-celitemixture (1+ 4) 5 g

เคาะขาง column เบา ๆ ใหมผวหนาเรยบ เปด stopcock แรงดดจาก vacuum

aspiratorจะทาใหpackingmaterialแนนสมาเสมอ

7.3.3 ลาง(prewash)columnดวยtoluene–CH3CN(1+3)50mlเมอprewashsolution

เหลออยเหนอ packingmaterialประมาณ 0.5 cmปด stopcockปลด vacuum

aspiratorออกทงeluateแลวตอvacuumaspiratorและเปลยนround-bottomflask

500mlรองรบeluateใบใหม

7.3.4 ผานสารสกดทไดจากขอ 7.2.9ปรบอตราการไหลประมาณ5ml/min ใชCH2Cl2

10mlrinseลางround-bottomflaskทใสสารละลายตวอยางแลวถายลงในcolumn

รอจนsolutionอยเหนอผวหนาpackingmaterialเลกนอยจงเตมtoluene–aceto

nitrile(1+3)25mlและ100mlตามลาดบ

7.3.5 นา eluate ไประเหยดวยเครองระเหยสญญากาศจนเกอบแหง เตมMeOH10ml

ระเหยตอไปจนแหงแลวเตมMeOHอก5ml เพอละลายสารทเหลอทงหมดทนท

แลวกรองผาน syringe filter PTFE, 13mm, 0.20µm ใสใน vial ขนาด 8ml

สาหรบการตรวจวดชนดและปรมาณตอไป

74


7.4 การหาปรมาณดวยHPLC

สภาวะของเครอง HPLC, post-column derivatization และ fluorescence detector

(สภาวะของเครองมอสามารถเปลยนแปลงไดตามความเหมาะสม)

Mobile phase: programmable HPLC gradient system

เวลา(min) H2O(%) CH3CN(%)

0 88 12

30 30 70

35-45 88 12

Flowrate:mobilephase1.0ml/min,reactionsolution0.3ml/min

Analyticalcolumn:ZorbaxC8 5 µm, size 25 cm × 4.6mmidหรอเทยบเทา Guard column: C8 5 µm

Columnoventemperature:35C

Reactortemperature:100C

Injectionvolume:10µl

Fluorescencedetector:Excitationwavelength345nmและEmissionwavelength455nm

ปรบความไว(sensitivity)ของการตรวจวเคราะหโดยฉดสารมาตรฐานcarbofuran10ngใหได

ความสง50× 5% full scale deflection



ในการคานวณใชวธเทยบกบสารมาตรฐานซงพนทของสารมาตรฐานและพนทของสาร

ทพบในตวอยางตองมความแตกตางกนไมเกน ± 25% และคานวณปรมาณทพบ

โดยใชสตรดงน

พนทใตpeakสารทพบในตวอยาง× ความเขมขนของสารมาตรฐาน(µg/ml)ปรมาณทพบ(mg/kg)= พนทใตpeakของสารมาตรฐาน× ความเขมขนของตวอยาง(g/ml)

8.2 การรายงานผล(Testreport)

รายงานปรมาณทตรวจพบหนวยเปนมลลกรมตอกโลกรม(mg/kg)ทศนยม2ตาแหนง

75



9.1 วเคราะหspikedsampleอยางนอย10%ของตวอยางทระดบ5เทาLOQ

9.2 วเคราะห2ซา(duplicate)อยางนอย10%ของตวอยาง


10.1 %recoveryของการวเคราะหspikedsampleตองอยในเกณฑยอมรบ70-120%

10.2 ในการวเคราะห2ซา(duplicate)คาRPDตองไมเกน20%

77



ใชเปนวธวเคราะหปรมาณ3-chloro-1,2-propanediol(3-monochloropropane-1,2-diol;3-MCPD)

ในผลตภณฑอาหาร hydrolyzed vegetable protein (HVP) ซอสถวเหลองซปกอนซปผง

มอลตสกดไสกรอกปลาเนยแขงแปงธญพชขนมปงและผลตภณฑอนๆ


AOAC Official Methods of Analysis 2000.01 Determination of 3-chloro-1, 2-propanediol

(3-MCPD)infoodsandfoodingredients


เตม 3-Chloro-1, 2-propanediol-d5 (3-MCPD-d5) ทใชเปน internal standardลงในตวอยาง

แลวเตมสารละลายเกลอ ปนผสมใหเปนเนอเดยวกนแลวเตมExtrelutTM20ml refill pack

ลงในสารละลายตวอยางคลกใหเขากนแลวบรรจลงในคอลมนแกวชะสารnonpolarออกจาก

ตวอยางดวยสารละลายผสม hexane-diethyl ether และชะสาร 3-MCPDและ 3-MCPD-d5

ในตวอยางดวย diethyl ether ลดปรมาณสารละลายในสารสกดทได แลวนามา derivatize

และวเคราะหหาปรมาณ3-MCPDดวยGaschromatograph–massspectrometer(GC/MS)

4. เครองมอ(Apparatus)

4.1 เครองชงทมความละเอยด0.01g


4.3 GC/MS

4.4 เครองใหความรอน(aluminumblockheater)

4.5 เครองหมนเหวยง(centrifuge)

DMScF1054: การวเคราะหปรมาณ3-chloro-1,2-propanediol(3-MCPD)

ในอาหารและสวนผสมอาหาร

Determination of 3-chloro-1, 2-propanediol (3-MCPD)

infoodsandfoodingredients

78


4.6 เครองระเหย(rotaryevaporator)

4.7 เครองผสมสาร(vortexshaker)

4.8 Ultrasonic bath

4.9 อปกรณ

4.9.1 Beakerขนาด250ml

4.9.2 Glass chromatography tube: 40 ×2cmidwithsinteredglassdiskandtap

4.9.3 Gas-tightsyringeขนาด1ml

4.9.4 กระดาษกรองWhatmanNo.4หรอเทยบเทา

4.9.5 Volumetricflaskขนาด10,25และ100ml

5. สารเคม(Reagents)

สารเคมทกชนดไมตากวาระดบARgradeยกเวนทระบไวและนา(H2O)ทใชเปนนาปราศจาก

ไอออน(deionizedwater)หรอนากลน3ครงทมคาresistivity≥ 18 MΩ-cm

5.1 สารมาตรฐาน3-chloro-1,2-propanediol(3-MCPD)

5.2 สารมาตรฐาน3-chloro-1, 2-propanediol-d5 (3-MCPD-d5) –Minimum98% isotopic

purity

5.3 Diethylether,Glass-distilledgradeหรอเทยบเทา

5.4 Hexane,Glass-distilledgradeหรอเทยบเทา

5.5 สารละลายผสมdiethyl ether- hexane (1+9) –ผสมdiethyl ether 100mlกบ hexane

900mlเขยาใหเขากน

5.6 ExtrelutTM 20 mL refill packs

5.7 Ethyl acetate

5.8 Heptafluorobutyrylimidazole

5.9 Sodium sulfate (Na2SO4)

5.10 สารละลาย5Msodiumchloride(NaCl)-ชงNaCl290gละลายในH2Oแลวถายลงใน

volumetricflaskขนาด1LปรบปรมาตรดวยH2O

5.11 2, 2, 4-trimethylpentane

79



6.1 ตวอยางทเปนของเหลว เทผสมลงในภาชนะทสะอาดคนหรอกวนจนตวอยางเปน

เนอเดยวกน

6.2 ตวอยางทเปนของแหงเชนซปกอนธญพชขนมปงเนยแขงเนอสตวและผลตภณฑอนๆ

บดใหละเอยดเปนเนอเดยวกน


7.1 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน3-MCPD

7.1.1 Stock standard solution 1000 µg/ml- ชงสารมาตรฐาน25mgลงในvolumetric

flaskขนาด25mlละลายและปรบปรมาตรดวยethylacetate

7.1.2 Intermediate standard solution 100µg/ml -ปเปต stock standard solution 1ml

ลงในvolumetricflaskขนาด10mlปรบปรมาตรดวยethylacetate

7.1.3 Spiking standard solution 2 µg/ml–ปเปตintermediatestandardsolution0.2ml


7.2 การเตรยมสารละลายมาตรฐานinternalstandard3-MCPD-d5

7.2.1 Stock standard solution 1,000 µg/ml- ชง 3-MCPD-d525mgลงในvolumetric

flaskขนาด25mlละลายและปรบปรมาตรดวยethylacetate

7.2.2 Working standard solution 10 µg/ml - ปเปต stock standard solution 1ml


7.3 การเตรยมcalibrationstandard3-MCPDความเขมขน0.00,0.05,0.10,0.50,1.00และ

2.00 µg/mL -ปเปต intermediate standard solution 0, 12.5, 25, 125, 250และ500µl

ลงในvolumetricflaskขนาด25mlปรบปรมาตรดวย2,2,4trimethylpentane

7.4 การเตรยมตวอยางทดสอบ

7.4.1 Hydrolyzed vegetable protein (HVP)และซอสปรงรส -ชงตวอยาง 8± 0.01 g

เตม 3-MCPD-d5 ความเขมขน 10µg/mlปรมาตร 100µl และเตม 5MNaCl

ลงในตวอยางจนไดนาหนก20gนาไปเขยาในเครองultrasonicbathนาน10min

80


7.4.2 ซปกอน ซปผง มอลตสกด - ชงตวอยางซปกอน ซปผง 5 ± 0.01 g ตวอยาง

มอลตสกด10±0.01g)เตม3-MCPD-d5 ความเขมขน10µg/mlปรมาตร100µl

และเตม 5MNaC l ลงในตวอยางจนไดนาหนก 20 g นาไปเขยาในเครอง

ultrasonicbathนาน10min

7.4.3 เนอสตวและผลตภณฑเนยแขง - ชงตวอยาง 20 ± 0.01g เตม 3-MCPD-d5

ความเขมขน10µg/mlปรมาตร100µl และเตม 5MNaClลงในตวอยางจนได

นาหนก 70 gปนตวอยางใหเปนเนอเดยวกน แลว centrifuge ท 3,500 rpmนาน

20minแลวชงสารละลายตวอยางสวนใส20gใสในbeakerขนาด250ml

7.4.4 แปงธญพชและขนมปง-ชงตวอยาง10±0.01gเตม3-MCPD-d5 ความเขมขน

10 µg/mlปรมาตร 100µl และเตม 5MNaClลงในตวอยางจนไดนาหนก 40 g

คนตวอยางใหเปนเนอเดยวกนแลวนาไปเขยาในเครองultrasonicbathนาน15min

ปดฝาและแชทงไวนาน12-15hr

7.5 การเตรยมblanksolution–ชงสารละลาย5MNaCl20gเตม3-MCPD-d5ความเขมขน

10µg/mlปรมาตร100µlแลวนาไปเขยาในเครองultrasonicbathนาน10นาท

7.6 สารสกด(testextract)-นาสารละลายตวอยาง20gทเตรยมไว(7.4)และblanksolution

(7.5) เตมExtrelutTM refill packs ใชชอนคนใหเขากนแลวบรรจลงในคอลมนแกวท

เตรยมไว และปดทบชนบนดวยNa2SO4สงประมาณ1 cmตงทงไว 15-20minแลวชะ

nonpolarcomponentออกจากตวอยางดวยสารละลายผสมdiethylether-hexane80mlทง

สารละลายทไดแลวชะ3-MCPDดวยdiethylether250mlโดยปลอยใหสารไหลออกจาก

คอลมนดวยอตราเรวประมาณ8ml/minลงในvolumetric flaskขนาด250mlแลวเตม

Na2SO4 ประมาณ15gเขยาและตงทงไว10-15minกรองผานกระดาษกรองลงในขวดระเหย

นาตวอยางไประเหยทอณหภม35Cจนปรมาณสารสกดเหลอประมาณ5mlดดสารละลาย

ตวอยางใส volumetric flaskขนาด10mlปรบปรมาตรดวยdiethyl ether เตมNa2SO4

ปรมาณเลกนอยลงในสารละลายตวอยางตงทงไว 5-10 min ใช gas-tight syringe

ดดสารละลายตวอยาง 1ml ใสใน vial ขนาด 4ml ระเหยใหแหงดวยแกสไนโตรเจน

ทอณหภมไมเกน30C

81


7.7 Derivatization(สารตวอยาง)-ทนททสารละลายตวอยางแหงเตม2,2,4-trimethylpentane

1mlและheptafluorobutyrylimidazole50µlปดฝาvialแลวเขยาดวยvortexshakerแลว

นาไปใหความรอนทอณหภม70Cนาน20minโดยใชheatingblockแลวตงทงไวใหเยน

ทอณหภมหองจากนนเตมH2Oลงในสารละลายตวอยาง1mlเขยาดวยvortexshakerและ

ตงทงไว30secเพอใหเกดการแยกชนดดชนH2OทงเตมH2Oอก1mlทาซาในขนตอน

เดมอกครง ดดชน 2, 2, 4-trimethylpentane ลงใน vial ขนาด 2ml และเตมNa2SO4

ปรมาณเลกนอยเขยาแลวตงทงไว2-5minดดสารละลายใสvialขนาด2mlนาไปฉดเขา

เครองมอGC/MS

7.8 Derivatization (calibration standard solution)–ปเปต calibration standard 3-MCPD

ความเขมขน 0.00, 0.05, 0.10, 0.50, 1.00 และ 2.00µg/mLความเขมขนละ 100µl

ใสใน vial ขนาด 4ml เตม 2, 2, 4 trimethylpentane 900µl เตม internal standard

3-MCPD-d5 (10 µg/ml)ปรมาตร10µlจะไดสารละลายทมความเขมขน0,5,10,50,100

และ200ng/mlตามลาดบทาปฏกรยาderivatizationเชนเดยวกบสารตวอยาง(7.7)

7.9 สภาวะเครองมอGC/MS

GC parameter

GC column: DB 5 MS, 30 m × 0.25 mm id, 0.25 µmfilmthicknessหรอเทยบเทา

Carriergas:He1.0ml/minconstantflow

Temperatureprogram:50Chold1min,2C/min-90Cand270Chold10min

Inlettemperature:270C

Injectionvolume:1µl/ splitless

MS parameters

GCInterfacetemperature:270C

Operationmode:selectedionmonitoring(SIM)

Ion(m/z):257(3-MCPD-d5),453,291,289,275และ253(3-MCPD)

82


8. การคานวณและการรายงานผล(Calculationandexpressionofresult)


(A × 10)/(A' ×C) 3-MCPD(mg/kg)= นาหนกตวอยาง(g)

A = พนทใตพค3-MCPDderivative,

A' = พนทใตพค3-MCPD-d5derivative

C = slopeของcalibrationline

8.2 รายงานผลทดสอบ(Testreport)

รายงานปรมาณ3-MCPDทพบในหนวยมลลกรมตอกโลกรม(mg/kg)ทศนยม2ตาแหนง


9.1 วเคราะหblankควบคกบตวอยางทกครงททาการวเคราะห

9.2 วเคราะหspikedmatrixเพอประเมน%recoveryทระดบความเขมขน0.04mg/kgทกครง

ททาการวเคราะหโดย% recovery ตองอยในเกณฑยอมรบ 80 – 110%หรอวเคราะห

duplicate sampleโดยวเคราะหcontrol sampleทมความเขมขนของ3-MCPDอยในชวง

0.03-0.05mg/kg เปอรเซนตความแตกตางสมพทธ (%RPD) ของผลวเคราะหมเกณฑ

การยอมรบคานวณจากสตร

Repeatability Limit, r = t∞ *√n * σr, t ∞ = 1.96, n = 2, σr=SDทระดบLOQ

100 % RPD = r , χ=คาLOQ χ

83


A,HVP 0.029 10(2) 0.002 7.5 0.004 12.8 0.5

B,Maltextract 0.055 11(1) 0.003 4.9 0.007 13.3 0.5

C1&C2, 0.043 11(1) 0.004 8.9 0.008 18.6 0.7

Souppowder

D,Breadcrumbs 0.030 12(0) 0.003 8.4 0.006 20.8 0.8

E,Salami 0.016 12(0) 0.002 11.6 0.006 38.6 1.3

F,Cheesealternative 0.043 11(1) 0.005 10.6 0.010 22.3 0.9

a Each value is the number of laboratories retained after elimination of outliers; each value in parentheses is the number of laboratories removed as outliers.

χ, No.of Sr, mg/ RSDr, SR, RSDR, SampleID HORRAT mg/kg labsa kg % mg/kg %


ขอมลInterlaboratorystudyresultsปรากฏในตาราง

ตารางแสดงInterlaboratorystudyresultsforthedeterminationof3-chloro-1,2-propanediol

in foods and food ingredients

วธมาตรฐานทางจลชววทยาสาหรบการวเคราะหอาหาร


วธมาตรฐานทางจลชววทยาสาหรบการวเคราะหอาหาร




2. นายทนงพนธสจจปาละ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

3. นางลดาพรรณแสงคลาย นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

4. นางดวงดาววงศสมมาตร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

5. นางสาวอรารตนวฒกรภณฑ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

6. นางอชฌาสจจปาละ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

7. นางลดาวลยจงสมานกล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

8. นางสาวอารณศรพรหม นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

9. นางสาวมณฑนาพนธบวหลวง นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

10. นายสมภพวฒนมณ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

11. นางสาวกรณาตรสมทธ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

12. นางสาวณฐกานตตยศวาพร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

13. นางปยมาศแจมศร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

87


นยามและคายอ(DefinitionandAbbreviation)

1. อาหารหมายถงอาหารทคนสามารถบรโภคไดและใหหมายความรวมถงเครองดมยกเวน

ทกาหนดไวเฉพาะในวธนนๆ

2. นาหมายถงนาสาหรบอปโภคและบรโภครวมทงนาในสงแวดลอมแตไมรวมนาเสย

3. Dilutionหมายถงการเจอจางของตวอยาง

4. นากรองหมายถงนาทมคณสมบตเทยบเทานากลนหรอdeionizedwater

5. คายอทใชและคาเตมแสดงในตาราง


CFU colony forming unit

MPN most probable number

AnO2 anaerobic condition

O2 aerobic condition

วธมาตรฐานทางจลชววทยาสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย

Method รหสวธ ชนดอาหาร รายการ หนา Type

DMScF2015 นาและนาแขง Coliforms,FecalcoliformsและE. coli I 89

DMScF2016 อาหาร Coliforms,FecalcoliformsและE. coli I 119

DMScF2017 อาหาร Clostridium botulinum I 151

DMScF2018 อาหาร จลนทรยเจรญท35Cและ5C I 161

ทมความเปนกรดตา รวมทงClostridium botulinum

DMScF2019 อาหาร จลนทรยเจรญท30Cและ55C I 177

ทมความเปนกรด รวมทงยสตและรา

89



วธนใชในการตรวจวเคราะหแบคทเรยกลมcoliformsกลมfecalcoliformsและE. coli ในนา

และนาแขงครอบคลมการตรวจหา(detection)และการตรวจปรมาณ(enumeration)


American PublicHealthAssociation (APHA). StandardMethod for the Examination of

WaterandWastewater.22nd ed. Washington DC; 2012. p. 9-65 – 9-74, 9-76, 9-105 – 9-109.

3. นยามศพทและคายอ(Termsandabbreviation)

E. coli = Escherichia coli


แบคทเรยในกลม coliforms เปนแบคทเรยแกรมลบรปทอน ไมสรางสปอร เจรญไดในทม

ออกซเจนและไมมออกซเจน(facultativeanaerobe)สามารถใชนาตาลแลคโตส(lactose)เกดกรด

และสรางกาซทอณหภม35Cภายใน48ชวโมงพบทวไปในสงแวดลอมและในระบบทางเดน

อาหารของคนและสตวสวนfecalcoliformsหรอ thermotolerantcoliforms เปนกลมยอยของ

แบคทเรยกลม coliformsพบมากในระบบทางเดนอาหารของคนและสตว สามารถใชนาตาล

แลคโตส (lactose) เกดกรดและสรางกาซทอณหภม 44.5 ถง 45.5 Cภายใน 24-48 ชวโมง

สาหรบE. coli เปนแบคทเรยชนดหนงในกลม fecal coliformsนยมใชเปนจลนทรยบงช

สขลกษณะการผลตอาหารและนาดม

การตรวจดวยวธMPNหรอmultipletubefermentationtechniqueเปนการวเคราะหปรมาณของ

เชอcoliformsโดยอาศยความสามารถในการยอยสารอาหารใหเกดกรดและกาซในหลอดทดลอง

จากนนนาจานวนหลอดทใหผลบวกไปอานคาในตารางMPN (MPN index)ซงแสดงปรมาณ

DMScF2015: วธตรวจวเคราะหColiforms,FecalcoliformsและE. coli

ในนาและนาแขงโดยวธMPN

Analyticalmethod ofColiforms, Fecal coliforms and

E. coli inwaterandicebyMPNtechnique

90


coliformsทตรวจพบในตวอยางคาในตารางMPNเปนคาจากการทดลองและคานวณผลดวยวธ

ทางสถตบงบอกปรมาณcoliformsทมโอกาสตรวจพบไดในนา

4.1 การตรวจcoliformsและfecalcoliformsแบงเปน3ขนตอนดงน

4.1.1 การตรวจสอบเบองตน (presumptive phase) เปนขนตอนเพอแยก coliforms

ออกจากแบคทเรยชนดอนทไมสามารถใชนาตาลแลคโตสได โดยนาตวอยางใส

ในหลอดทดลองพรอมหลอดดกกาซซงบรรจอาหารเลยงเชอชนดเหลวทมนาตาล

แลคโตสเปนองคประกอบบมเพาะเชอตามวธทกาหนดแลวนาหลอดทเกดกาซ

ไปตรวจยนยน

4.1.2 การตรวจสอบยนยน (confirmed phase) เปนการยนยนการตรวจพบ coliforms

และ fecal coliforms โดยถายเชอจากหลอดทเกดกาซลงในอาหารเลยงเชอเฉพาะ

ชนดเหลวบมเพาะเชอตามวธทกาหนดแลวอานผลตามจานวนหลอดทเกดกาซ

ในตารางMPN

4.1.3 การตรวจขนสมบรณ (completed phase)ทดสอบขนตอนนในกรณผลในขนการ

ตรวจสอบยนยนไมชดเจนหรอสาหรบการควบคมคณภาพผลวเคราะห (quality

control)หรอกรณอนๆตามทกาหนด

4.2 การตรวจหา E. coliในทนตรวจได2วธคอ

4.2.1 การใชFluorogenicsubstrateเปนการตรวจหาE. coli ทมเอนไซมβ-glucuronidase

ซงสามารถยอย substrate 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)ทาให

เกดการเรองแสงสฟา(brightbluefluorescence)ภายใน24± 2ชวโมงเมอสอง

ภายใตแสงUVความยาวคลน365-366นาโนเมตร

4.2.2 การตรวจยนยนทางชวเคม

5. อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents):ภาคผนวก1

5.1 อาหารเลยงเชอ

5.1.1 Basal medium for lysine and ornithine decarboxylase tests

5.1.2 Brilliantgreenlactosebile(BGLB)broth

5.1.3 Buffered glucose broth

5.1.4 Carbohydrateutilizationbroth(lactose,sorbitol,cellobiose)

5.1.5 EC medium

91


5.1.6 EC-MUG medium

5.1.7 Lauryltryptosebrothความเขมขน1เทาและ2เทา

5.1.8 LES Endo agar

5.1.9 MacConkey agar

5.1.10Nutrientagar(NA)

5.1.11 Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)broth 5.1.12 Semi-solid medium for motility test

5.1.13 Simmons’ citrate agar

5.1.14Trypticsoyagar(TSA)

5.1.15 Tryptophan broth

5.1.16สารละลายสาหรบเจอจาง(diluent)ไดแกBufferedwaterหรอ0.1%peptonewater

5.2 สารเคม

5.2.1 Gram stain reagents

5.2.2 Kovac’sreagent

5.2.3 Methyl red indicator solution

5.2.4 Mineral oil

5.2.5 Naphtholsolution(5%)

5.2.6 Oxidase reagent

5.2.7 Potassium hydroxide solution, 7N


6.1 เครองมอ

6.1.1 เครองนงทาลายเชอ(autoclave)121±3C

6.1.2 เครองชง(balance)

6.1.3 ตอบเพาะเชอ(incubator)35±0.5Cและ25±0.5C

6.1.4 กลองจลทรรศน(microscope)

6.1.5 เครองวดความเปนกรด-เบส(pH-meter)

6.1.6 อางนาแบบควบคมอณหภม(waterbath)44.5±0.2C

6.1.7 UVlampความยาวคลน365-366นาโนเมตร

92


6.2 อปกรณ

6.2.1 หลอดดกกาซ(Durhamtube)

6.2.2 ขวดรปชมพ(flask)หรอขวดแกวฝาเกลยว

6.2.3 แผนกระจก(glassslide)

6.2.4 หวง(เสนผานศนยกลาง3.0-3.5มลลเมตร)และเขมเขยเชอ(loopandneedle)

6.2.5 จานเพาะเชอ(petridish)

6.2.6 ปเปต(pipette)

6.2.7 หลอดทดลอง(testtube)

6.2.8 ตะแกรงหลอดทดลอง(testtuberack)

6.2.9 กระดาษกรองWhatmanNo.1


7.1 การสมตวอยาง(Sampling)

7.1.1 ในกรณทตวอยางเปนนา เขยาตวอยางในแตละภาชนะบรรจใหเขากน เทตวอยาง

จากแตละภาชนะปรมาตรเทา ๆกน ใสในภาชนะปราศจากเชอไมนอยกวา 100

มลลลตรหรอปรมาตรอนทตองการทดสอบ(ตวอยางเรมตน)

7.1.2 ในกรณทตวอยางเปนนาแขงสมตวอยางจากแตละภาชนะบรรจใสรวมกนในภาชนะ

ปราศจากเชอทาตวอยางใหละลายจนหมดสมใหไดตวอยางไมนอยกวา100มลลลตร

หรอปรมาตรอนทตองการทดสอบ(ตวอยางเรมตน)

7.2 การตรวจปรมาณcoliforms(enumeration)หรอtotalcoliformsโดยวธMPN(ภาคผนวก2)

7.2.1 การตรวจสอบเบองตน(presumptivephase)

7.2.1.1 ตวอยางทมการปนเปอนจลนทรยตา:ภาคผนวก3ตารางท1

เขยาขวดตวอยางใหเขากนอยางนอย 25 ครง แลวปเปตตวอยางเรมตน

ลงใน lauryl tryptose brothความเขมขน 2 เทาหลอดละ10มลลลตร

จานวน10หลอด

7.2.1.2 ตวอยางทมการปนเปอนจลนทรยสง:ภาคผนวก3ตารางท2

เขยาขวดตวอยางใหเขากนอยางนอย 25 ครง แลวปเปตตวอยางเรมตน

ลงใน lauryl tryptose broth ความเขมขน2 เทาหลอดละ10มลลลตร

93


จานวน 5หลอดและปเปตตวอยางเรมตน 1 และ 0.1มลลลตร ลงใน

lauryltryptosebrothความเขมขน1เทาปรมาตรละ5หลอดอาจเจอจาง

ความเขมขนของตวอยางมากขนตามตองการ ขนอยกบชนดของตวอยาง

และวตถประสงคของการวเคราะห

7.2.1.3 นา lauryl tryptose broth จากขอ 7.2.1.1 หรอ 7.2.1.2 บมท 35 C

24±2ชวโมง

ผลบวก : มการเจรญของเชอและเกดกาซในหลอดดกกาซ

ผลลบ : ไมเกดกาซในหลอดดกกาซ

coliformsใหผลบวก

หลอดทใหผลบวกนาไปทดสอบตอตามขอ 7.2.2สวนหลอดทใหผลลบ

บมตออกจนครบ48±3ชวโมงแลวอานผลอกครง

สาหรบตวอยางนาดม (drinkingwater) เมอบมจนครบ 48 ± 3ชวโมง

ถาพบวาหลอด lauryl tryptose brothมการเจรญของเชอ และไมเกดกาซ

ในหลอดดกกาซใหทดสอบยนยนตอตามขอ7.2.2

7.2.2 การตรวจสอบยนยน(confirmedphase)

7.2.2.1 เขยาหลอดlauryltryptosebrothทใหผลบวกถายเชอ1loopหรอมากกวา

จากแตละหลอดลงในBGLBbrothหลอดตอหลอด

7.2.2.2 บมท35C48±3ชวโมง

ผลบวก : เกดกาซในหลอดดกกาซ


coliformsใหผลบวก

บนทกผลและคานวณตามขอ8

การตรวจวเคราะห coliforms โดยทวไปตรวจสอบถงขนยนยนกเพยงพอยกเวน

ในกรณทสงสยหรอดาเนนการควบคมคณภาพจงจะตรวจสอบถงขนสมบรณ

7.2.3 การตรวจขนสมบรณ(completedphase)

7.2.3.1 ถายเชอ 1 loop จากขอ 7.2.2.2 ทใหผลบวก ขดบนMacConkey agar

หรอLESEndoagar

94


7.2.3.2 บมท35C24±2ชวโมง

โคโลนทมลกษณะเฉพาะคอ

MacConkeyagarโคโลนมสแดงอาจมโซนขนลอมรอบ

LESEndoagarโคโลนมสชมพจนถงแดงเขมและมmetallicsheen

7.2.3.3 เลอกโคโลนทมลกษณะเฉพาะ 1 โคโลนหรอมากกวาจากแตละจาน

เพาะเชอ ถาไมมโคโลนทมลกษณะเฉพาะ ใหเลอกโคโลนทมลกษณะ

ใกลเคยงโคโลนทมลกษณะเฉพาะมากทสด(mostlikely)จานวน2โคโลน

หรอมากกวาใสในlauryltryptosebrothความเขมขน1เทาและNAslant

7.2.3.4 นาlauryltryptosebrothบมท35C24±2ชวโมงถาไมเกดกาซในหลอด

ดกกาซใหบมตอจนครบ48±3ชวโมงสาหรบNAslantบมท35C18-24

ชวโมงนาไปยอมสแกรมถาเปนตวอยางนาดมไมตองยอมสแกรมเพราะ

แบคทเรยแกรมบวกและแบคทเรยสรางสปอรมกไมเจรญในขนตอนตรวจ

คดแยกเบองตน

สรปผลพบ coliforms เมอหลอด lauryl tryptose broth เกดกาซในหลอดดกกาซ

ภายใน48±3ชวโมงและพบวาเปนแบคทเรยแกรมลบรปทอนไมสรางสปอร

7.3 การตรวจปรมาณ (enumeration) fecal coliforms โดยวธ MPN: ภาคผนวก 2

เขยาหลอด lauryl tryptose brothทใหผลบวกจากขอ 7.2.1.3หรอหลอดBGLBbroth

ทใหผลบวกจากขอ 7.2.2.2 ถายเชอจากแตละหลอด 1 loopลงในECmediumหลอด

ตอหลอดนาไปบมท44.5C24±2ชวโมงภายใน30นาทหลงจากการถายเชอ

ผลบวก : เกดกาซในหลอดดกกาซและมการเจรญของเชอ

ผลลบ : ไมเกดกาซในหลอดดกกาซและไมมการเจรญของ

เชอหรอเจรญนอยถามการเจรญมากแตไมเกดกาซ

ใหใชอาหารเลยงเชออนสาหรบการหาfecalcoliforms

อกหนงชนด

fecalcoliformsใหผลบวก


95


7.4 การตรวจ E. coli ตรวจได2วธคอ

7.4.1 วธท1การใชfluorogenicsubstrate

7.4.1.1 เขยาหลอดlauryl tryptosebrothทใหผลบวกจากขอ7.2.1.3ถายเชอจาก

แตละหลอด1loopหรอมากกวาลงในEC-MUGmediumหลอดตอหลอด

7.4.1.2 บมท 44.5 C 24± 2ชวโมงภายใน30นาทหลงจากการถายเชอสองด

การเรองแสงของอาหารเลยงเชอภายใตแสงUV

ผลบวก : พบการเรองแสงสฟา(brightbluefluorescence)

ผลลบ : ไมพบการเรองแสงสฟา

E. coliใหผลบวก


7.4.2 วธท2การตรวจยนยนทางชวเคม

7.4.2.1 ถายเชอ 1 loopจากหลอดECmedium ในขอ 7.3ทใหผลบวกขดบน

จานเพาะเชอMacConkeyagarหรอLESEndoagar

7.4.2.2 บมท35C24±2ชวโมง

โคโลนทมลกษณะเฉพาะคอ

MacConkeyagarโคโลนมสแดงอาจมโซนขนลอมรอบ

LESEndoagarโคโลนมสชมพจนถงแดงเขมและมmetallicsheen

7.4.2.3 เลอกโคโลนทมลกษณะเฉพาะขดบนNAslantบมท35C18-24ชวโมง

เพอใชทดสอบปฏกรยาทางชวเคมดงตอไปน

การใชนาตาลlactose,sorbitolและcellobiose

เขยเชอ1loopลงในcarbohydrateutilizationbroth(lactose,sorbitol

และcellobiose)บมท35C24-48ชวโมง

ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนจากสสมแดงเปนสเหลอง

ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมเปลยนส

E. coliใหผลlactoseและsorbitolเปนบวกcellobioseเปนลบ

96


การทดสอบ ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) hydrolysis

เขยเชอ1loopลงในONPGbrothบมท35C24ชวโมงเปรยบเทยบ

ผลกบONPGbrothทไมเตมเชอหรอเตมเชอทใหผลลบ

ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนเปนสเหลอง


E. coli ใหผลบวก

กรณใชชดทดสอบและแผนONPGdiscสาเรจรปใหทาตามคาแนะนา

ของผผลต

การทดสอบindole

เขยเชอลงใน tryptophan broth บมท 35 C 24 ± 2 ชวโมงเตม

Kovac’sreagent0.2–0.3มลลลตรเขยาเบาๆตงทงไวประมาณ10นาท

แลวอานผล

ผลบวก : เกดชนสแดงเขมบนผวหนาของอาหารเลยงเชอ

ผลลบ : เกดสเหลองหรอสสมบนผวหนาของอาหารเลยงเชอ


การทดสอบmethylred

เขยเชอลงในbufferedglucosebroth10มลลลตรบมท35C5วน

นา culture 5มลลลตรหยดmethyl red indicator solutionจานวน

5หยดอานผลทนท

ผลบวก : อาหารเลยงเชอมสแดง

ผลลบ : อาหารเลยงเชอมสเหลอง

เชอสวนใหญอานผลไดเมอบมครบ 48 ชวโมง (ตองไมนอยกวา

48ชวโมง)ถาผลเปนลบใหบมcultureสวนทเหลอตอจนครบ5วน

ทดสอบปฏกรยาและอานผลถาผลทดสอบท 48ชวโมงหรอท 5 วน

ใหผลเปนทนาสงสย(mixedshade)ใหเตรยมสารละลายเชออก2ชด

และบมท22-25Cแบงทดสอบปฏกรยาเมอบมครบ2,3,4และ5วน


97


การทดสอบVoges-Proskauer

เขยเชอลงใน tryptophan brothบมท 35 C 48 ชวโมงนา culture

1มลลลตรใสในหลอดทดลอง เตม naphthol solution0.6มลลลตร

และKOH0.2มลลลตรเขยาใหเขากนหลงเตมสารละลายแตละชนด

อานผลภายใน5นาทอยาอานผลภายหลง10นาท

ผลบวก : เกดสชมพถงสแดงบนผวหนาอาหารเลยงเชอ

ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมเปลยนส หรอเกดสนาตาลแดง

(coppercolor)

E. coli ใหผลลบ

การทดสอบSimmons’citrate

ขดเชอปรมาณนอย (light inoculum)ลงบนผวหนาของ Simmons’

citrateagarบมท35C48ชวโมง

ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนจากสเขยวเปนสนาเงน



การทดสอบmotility

ใช needle เขยเชอแลว stab ลงตรงกลางหลอดของ semi-solid

mediumformotilitytestลก5มลลเมตรบมท35C1-2วน

ผลบวก : เชอเจรญกระจายออกจากinoculationpoint

ผลลบ : เชอเจรญเฉพาะแนว stabและอาหารเลยงเชอบรเวณ

โดยรอบยงคงมลกษณะใส

ถาผลเปนลบใหบมตออก5วนท22-25C


การทดสอบlysineและornithinedecarboxylase

เขยเชอลงใน basal medium for decarboxylasetest ทม lysine

หรอornithineเทmineraloilสงประมาณ10มลลเมตรปดฝาใหแนน

บมท35-37 C4วนอานผลทกวน(เปรยบเทยบผลกบหลอดควบคม

ทไมเตมเชอ)

98


ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนจากสเหลองเปนสมวงหรอ

สมวงแดงถาเปลยนเปนสเทาอมฟาใหหยดสารละลาย

bromocresol purple จานวน 1หยดถาสไมเปลยน

ใหแปลผลเปนลบ



การทดสอบoxidase

นาเชอทมอายนอยกวา24ชวโมงขด(smear)บนกระดาษกรองทหยด

oxidase reagent (ไมใชหวงเขยเชอนเกล-โครเมยมหรอลวดโลหะ

เพราะจะทาใหเกดผลบวกปลอม) ใชกระดาษกรองWhatmanNo. 1

หรอกระดาษกรองทมคณสมบตเทยบเทา

ผลบวก : กระดาษกรองเปลยนเปนสมวงเขมภายใน10วนาท

ผลลบ : กระดาษกรองไมเปลยนส

E. coliใหผลลบ

การทดสอบyellowpigment

ขดเชอบนผวหนาของTSAplateหรอslant(สามารถใชNAแทนได)

บมท25C48ชวโมง

ผลบวก : โคโลนสเหลองสจะเขมขนตามระยะเวลาการบม

ผลลบ : โคโลนไมเปนสเหลอง



8. การคานวณ(Calculationofresults)

8.1 นาจานวนหลอดทใหผลบวกเปรยบเทยบกบตารางMPN(ตารางท1และ2:ภาคผนวก3)

ไดผลเปนคาMPN/100มลลลตรพรอมขดความเชอมนทระดบ 95% (95% confidence

limits)

99


8.2 กรณอานผลตามตารางท 2 (ภาคผนวก3)ถาระดบการเจอจางของตวอยางใน3dilutions

แตกตางจากทกาหนดไวใหนาผลบวกทไดไปอานคาMPNจากตารางแลวคานวณโดยใชสตร

MPN/100มลลลตร = (คาMPNจากตาราง)× 10/V

เมอ V = ปรมาตรของตวอยางทdilutionตาสดทเลอก

8.3 กรณอานผลตามตารางท 2 (ภาคผนวก3)ถาเจอจางตวอยางมากกวา3dilutionsใหเลอก

3 dilutions ทเหมาะสม แลวอานคาMPN จากตารางท 2 ตามผลบวกของ dilutions

ทเลอกโดยใชเกณฑการเลอก3dilutionsดงน(ตวอยางตามตารางท3)

8.3.1 ใหตด dilutionสงสด (มปรมาณตวอยางนอยทสด)ทใหผลลบทง 5หลอดโดย

ใหอยางนอย1dilutionทเหลออยมหลอดทใหผลลบจากนนใหตดdilutionตาสด

(มปรมาณตวอยางมากทสด)ทมผลบวกทง5หลอดและอยางนอย1dilutionทเหลอ

อยมหลอดทใหผลบวกดงตวอยางAเลอก3dilutionsโดยตดdilutionสงสดคอ

0.001มลลลตรและตดdilutionตาสดคอ10มลลลตรจะได5-1-0

8.3.2 ถาdilutionตาสดมผลบวกไมครบทง5หลอดและมหลายdilutionsทสงขนไปให

ผลลบทงหมด ใหตด dilutions สงสดทใหผลลบทงหมดออก ดงตวอยาง B

จะได4-5-1

8.3.3 ถาทาตามขอ 8.3.1 และ 8.3.2 แลวพบวา dilutionทเหลออยมจานวนมากกวา 3

dilutionsใหเลอกดงน

8.3.3.1 ถา dilutionสงสดทเหลออยมผลบวกครบทง 5หลอดและอยในกลม

อกสอง dilutionsสงสดทมผลบวกไมครบ ใหเลอก dilutionสงสดทม

ผลบวกไมครบและอก2dilutionsทตากวาถดขนมา

- ตามตวอยางCพบวาdilutionสงสดทใหผลบวกครบทง5หลอดคอ

0.1มลลลตรซงอยในกลมสองdilutionsสงสดทมผลบวกไมครบคอ

0.01มลลลตรและ0.001มลลลตรจงเลอกdilutionสงสดทมผลบวก

ไมครบคอ0.001มลลลตรและอก2dilutionsทตากวาถดขนมาคอ

0.01มลลลตรและ0.1มลลลตรจะได5-2-1

100


- ตามตวอยางDพบวาdilutionสงสดทใหผลบวกครบทง5หลอดคอ

0.01มลลลตรซงอยในกลมสองdilutionsสงสดทมผลบวกไมครบคอ

0.1และ0.001มลลลตรจงเลอกdilutionสงสดทมผลบวกไมครบคอ

0.001มลลลตรและอก2dilutionsทตากวาถดไปคอ0.01มลลลตร

และ0.1มลลลตรจะได4-5-1

8.3.3.2 หลงจากตดdilutionตาสดทมผลบวกครบทง5หลอดและไมมdilution

ทใหผลบวกครบเหลออยอก ใหเลอก 2 dilutionsตาสดทมผลบวกและ

รวมจานวนหลอดบวกของ dilutions สงขนถดไปเปน dilution ทสาม

ดงตวอยางEนนคอเมอตดdilution10มลลลตรออกแลวใหเลอกdilution

1มลลลตรและ0.1มลลลตรและรวมdilutionทเหลอคอ0.01มลลลตร

และ0.001มลลลตรเปนdilutionท3จะได4-4-1

8.3.3.3 ถาไมม dilution ใดเลยทใหผลบวกครบทง 5หลอดใหเลอก2 dilutions

ตาสดและรวมจานวนหลอดบวกของdilutionsทเหลออยใหเปนdilution

ท3ตามตวอยางFพบวาไมมdilutionsใดมผลบวกครบทกหลอดจงเลอก

2dilutionsตาสดคอ10และ1มลลลตรและdilutionท3 เปนผลรวม

ของจานวนหลอดทเหลอทใหผลบวกคอ 0.1, 0.01และ0.001มลลลตร

จะได4-3-2

8.3.3.4 ถาทาตามขอ 8.3.3.3 แลวพบวา dilutionทสามมจานวนเกน 5หลอด

ซงไมสามารถอานคาในตารางท 2 ได ถอวากรณนไมปกต ควรทดสอบ

ตวอยางซา แตถาไมมตวอยางใหตรวจซา ใหเลอก 3 dilutions ใหม

โดยเลอกdilutionสงสดทมหลอดบวกและอก2dilutionsทตากวาถดไป

ตามตวอยางGนนคอถาทาตามขอ8.3.3.3จะเลอกdilutions10,1มลลลตร

เปน2dilutionsแรกและรวมหลอดบวกของdilutions 0.1, 0.01, 0.001

มลลลตรเปนdilutionท3จะได4-3-6จงตองเลอกใหมโดยเลอกdilution

สงสดทมผลบวกคอ 0.001มลลลตรและอก 2 dilutionsทตากวาถดไป

คอ 0.01และ 0.1มลลลตร จะได 3-2-1 จากนนนาผลไปอานคาMPN

ในตารางท2ถาปรมาตรของตวอยางใน3dilutionsทเลอกใหมนแตกตาง

จากทกาหนดไวในตาราง ใหนาคาMPNจากตารางไปคานวณตามสตร

ในขอ8.4

101


8.4 กรณอานผลตามตารางท 2 (ภาคผนวก3)ถา3dilutionsทเลอกไมมคาMPNในตาราง

ใหใชสตรคานวณดงน

230.3 MPN/100มลลลตร=- log10 zs

เมอ j = แตละdilutionทเลอก

s = dilutionสงสดทมผลบวกอยางนอย1หลอด

Xs = จานวนหลอดทใหผลบวกของdilutions

nj = จานวนหลอดของdilution j

Zj = ปรมาณตวอยางในแตละหลอดของdilution j

Zs = ปรมาณตวอยางในแตละหลอดของdilutions

K = จานวนdilutionทเลอก

ตวอยาง ปรมาตรของตวอยาง 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 มลลลตรตามลาดบ

ผลทดสอบx–x–3–0–0

ในทนdilutions คอdilutionทมปรมาณตวอยางในแตละหลอด=0.1มลลลตร

คาทใชคานวณคอ

Zs = 0.1, Xs = 3, XsZs = 0.1 × 3 = 0.3

∑njZj = (0.1 ×5)+(0.01×5)+(0.001×5)

= 0.555

ดงนนMPN/100มลลลตร = -230.3log10 1 – 0.3 = 780

0.1 0.555

xszsl - ∑ k

j = snjzj( (

( (

102


8.5กรณทจานวนหลอดในแตละdilutionและ/หรอระดบเจอจาง(dilutions)ไมตรงตามตาราง

MPNในตารางท2สามารถประมาณคาMPNไดโดยปฏบตดงน

8.5.1 เลอกdilutionตาสดทใหผลบวกไมครบทกหลอด

8.5.2 เลอกdilutionสงสดทใหผลบวกอยางนอย1หลอด

8.5.3 เลอกทกdilutionsทอยระหวางขอ8.5.1และขอ8.5.2

8.5.4 คานวณคาMPN โดยใชสตรของ “Thomas” คาMPNทไดเปนคาประมาณ

(approximatevalue)

สตรMPN/100มลลลตร(approx.)=100× P/(N ×T)1/2

เมอ P = จานวนหลอดทใหผลบวก

N = ปรมาตรของตวอยาง(มลลลตร)ทใหผลลบทกหลอด

T = ปรมาตรรวมของตวอยาง(มลลลตร)ในdilutionsทเลอก

ตวอยางท1

ปรมาตรของตวอยาง(มลลลตร/หลอด) 10 1 0.1 0.01 0.001

มผลบวก 10/10, 10/10,4/10, 1/10, 0/5

Dilutionsทเลอก - - 4/101/10 -

ดงนนMPN/100มลลลตร(approx.) = 100× P/(N ×T)1/2

= 100 × 5/(0.69 ×1.1)1/2

= 500/0.87 = 570

ตวอยางท2

ปรมาตรของตวอยาง(มลลลตร/หลอด) 10 1 0.1 0.01 0.001

มผลบวก 10/10, 10/10, 10/10, 0/10, 0/10

Dilutionsทเลอก - - 10/10 0/10 -

ดงนนMPN/100มลลลตร(approx.) = 100× P/(N ×T)1/2

= 100 × 10/(0.1 ×1.1)1/2

= 1,000/0.332 = 3,000

103


9. การรายงานผล(Expressionofresults)

9.1 การตรวจหา(detection)รายงานเปน

E. coli/100มลลลตรพบหรอไมพบ

9.2 การตรวจปรมาณ(enumeration)รายงานเปน

9.2.1 ColiformsMPN/100มลลลตรหรอTotalcoliformsMPN/100มลลลตร

9.2.2 FecalcoliformsMPN/100มลลลตร

9.2.3 E. coli MPN/100มลลลตร


10.1 ภาคผนวก1: อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)

10.2 ภาคผนวก2: แผนภม การตรวจปรมาณ (enumeration) coliforms, fecal coliforms

และE. coli ในตวอยางนาและนาแขง

10.3 ภาคผนวก3: ตารางท1คาMPNและขดความเชอมนท95%สาหรบผลบวกและผลลบ

เมอใชตวอยาง10มลลลตรจานวน10หลอด

ตารางท2คาMPNและขดความเชอมนท95%สาหรบผลบวกและผลลบ

เมอใชตวอยาง10,1.0,0.1มลลลตรจานวน5หลอดตอระดบการเจอจาง

10.4 ภาคผนวก4: ตารางท 3 ตวอยางการเลอกผลบวก 3 ระดบความเจอจางจากการเจอจาง

5ระดบเพอรายงานคาMPN

104


ภาคผนวก1

อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)

อาหารเลยงเชอ(กรณใชอาหารเลยงเชอสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ)

1. Basal medium for lysine and ornithine decarboxylase tests

1.1 Basal medium according to the Moeller method

Peptone 5 กรม

Beefextract 5 กรม

Bromcresolpurple(1.6%) 0.625 มลลลตร

Cresolred(0.2%) 2.5 มลลลตร

Glucose 0.5 กรม

Pyridoxal 5 มลลกรม

นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร

ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรpH6.0-6.5

1.2 BasalmediumaccordingtotheFalkowmethod

Peptone 5 กรม

Yeastextract 3 กรม

Bromcresolpurple(1.6%) 1 มลลลตร

Glucose 1 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรpH6.7-6.8

การใชงาน

เลอกใชBasalmediumในขอ 1.1หรอ 1.2อยางใดอยางหนงแบงอาหารเลยงเชอ

เปน3สวนสวนแรกแบงใสหลอดเกลยวตามปรมาตรทตองการ(หลอดควบคม)สวนทสอง

เตมL-lysine dihydrochloride ใหไดความเขมขน1%สวนทสามเตมL-ornithine dihydro

chloride ใหไดความเขมขน 1% (สาหรบ Falkowmethod ใหเตม L-amino acid 0.5%)

หลงจากเตมL-ornithinedihydrochlorideปรบpH6.0± 0.2แบงใสหลอดเกลยว3-4มลลลตร

ฆาเชอท121oC10นาท

105


2. Brilliantgreenlactosebile(BGLB)broth

Peptone 10 กรม

Lactose 10 กรม

Oxgall 20 กรม

Brilliantgreen 0.0133 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร แบงใสหลอดตามปรมาตร

ทตองการแลวใสหลอดดกกาซลงในหลอดโดยใหอาหารเลยงเชออยทระดบ1/2หรอ2/3

ของหลอดดกกาซหลงการฆาเชอฆาเชอท121C12-15นาทpH7.2± 0.2

3. Buffered glucose broth

Proteosepeptoneorequivalentpeptone 7 กรม

Glucose 5 กรม

Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 5 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร แบงใสหลอด 5 มลลลตร

ฆาเชอท121C12-15นาท

4. Carbohydrateutilizationbroth(lactose,sorbitol,cellobiose)

Phenolredbrothbase 16 กรม

Carbohydrate(lactose,sorbitol,cellobiose) 5 กรม



ทตองการโดยใหอาหารเลยงเชออยทระดบ 1/3ของความยาวหลอดแลวใสหลอดดกกาซ

ลงในหลอดฆาเชอท121C12-15นาท

106


5. EC medium

Tryptoseหรอtrypticase 20 กรม

Lactose 5 กรม

BilesaltsmixtureorbilesaltsNo.3 1.5 กรม


Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 1.5 กรม

Sodiumchloride(NaCl) 5 กรม



ทตองการแลวใสหลอดdurhamในหลอดโดยใหอาหารเลยงเชออยทระดบ 1/2หรอ 2/3

ของหลอดดกกาซหลงการฆาเชอฆาเชอท121C12-15นาทpH6.9± 0.2

6. EC-MUG medium


Lactose 5 กรม





4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide(MUG) 0.05 กรม



ทตองการ(หลอดทใชตองไมเรองแสงภายใตแสงยวทความยาวคลน366นาโนเมตร)ฆาเชอ

ท121C15นาทpH6.9± 0.2

107


7. Lauryltryptose(LST)brothความเขมขน1เทาและ2เทา

Tryptose 20หรอ(2×20) กรม

Lactose 5หรอ(2×5) กรม

Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 2.75หรอ กรม

(2 ×2.75)

Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 2.75หรอ กรม

(2 ×2.75)

Sodiumchloride(NaCl) 5หรอ(2×5) กรม

Sodiumlaurylsulfate 0.1หรอ(2×0.1) กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรสาหรบความเขมขนสองเทา

ชงสวนประกอบแตละชนดเปนสองเทา ละลายในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร

แบงใสหลอด10มลลลตรแลวใสหลอดดกกาซในหลอดโดยใหอาหารเลยงเชออยทระดบ

1/2หรอ2/3ของหลอดดกกาซหลงการฆาเชอฆาเชอท121C12-15นาทpH6.8± 0.2

8. LES Endo agar

Yeastextract 1.2 กรม

Casitoneortrypticase 3.7 กรม

Thiopeptoneorthiotone 3.7 กรม

Tryptose 7.5 กรม

Lactose 9.4 กรม

Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 3.3 กรม

Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 1 กรม

Sodiumchloride(NaCl) 3.7 กรม

Sodiumdesoxycholate 0.1 กรม

Sodiumlaurylsulfate 0.05 กรม

Sodium sulfite (Na2SO3) 1.6 กรม

Basicfuchsin 0.8 กรม

Agar 15 กรม


108


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรทม95%ethanol20มลลลตร

ตอลตรใหความรอนจนagarละลายใกลเดอด(หามนาไปAutoclave)pH7.2± 0.2ทาให

เยนจนมอณหภม 45 C – 50 C ทนท เทใสจานเพาะเชอใหมความหนา 4-5 มลลเมตร

เกบในตเยนระวงแสงหามใชagarหลงจากเตรยมแลว2สปดาห

9. MacConkey agar


Proteosepeptone 3 กรม


Bilesalts 1.5 กรม


Agar 13.5 กรม

Neutralred 0.03 กรม

Crystalviolet 0.001 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ใหความรอนจน agar

ละลายฆาเชอท121C15นาทpH7.1± 0.2

10.Nutrientagar(NA)

Peptone 5 กรม


Agar 15 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตร ใหความรอนจนagarละลาย

แบงใสหลอดตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121 C15นาทpH6.8± 0.2เอยงหลอดและ

ปลอยใหวนแขง

109


11. Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)brothใชชนดสาเรจรป

12. Semi-solid medium for motility test




Agar 4 กรม



แบงใสหลอด 3มลลลตร (หลอดขนาด 13× 100mm)หรอ 8มลลลตร (หลอดขนาด

16 ×125mm)ฆาเชอท121C15นาทpH7.4

13. Simmons’ citrate agar

Ammonium dihydrogen phosphate (NH4H2PO4) 1 กรม



Sodiumcitratedihydrate 2 กรม

Magnesium sulfate (MgSO4.7H2O) 0.2 กรม

Agar 15 กรม

Bromthymolblue 0.08 กรม



แบงใสหลอดตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121 C12-15นาทpH6.8± 0.2เอยงหลอด

และปลอยใหวนแขง

110


14.Trypticsoyagar(TSA)

Tryptone 15 กรม

Soytone 5 กรม


Agar 15 กรม



ฆาเชอท121C15นาทpH7.3±0.2

15. Tryptophan broth

Tryptoneortrypticase 10 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร แบงใสหลอด 5มลลลตร

ฆาเชอท121C15นาท

16.Bufferedwater

16.1 stock phosphate buffer solution


นากลน 1,000 มลลลตร

ชงKH2PO434กรมละลายในนากลน500มลลลตรปรบpH7.2±0.5โดยใช1NNaOH

และปรบปรมาตรเปน1ลตรฆาเชอท121C15นาทหรอใชการกรอง

16.2 magnesium chloride stock solution

magnesium chloride

(MgCl2 หรอMgCl2 . 6H2O) 38หรอ81.1 กรม


ชงmagnesiumchlorideละลายในนากลน1ลตรฆาเชอท121C15นาท

111


16.3 workingsolution

ปเปตstockphosphatebuffersolution1.25มลลลตรและmagnesiumchloridestocksolution

0.5มลลลตรลงในนากลน1ลตรปรบpH7.2±0.1แบงใสหลอดหรอขวดตามปรมาตร

ทตองการฆาเชอท121C15นาท

17.0.1%peptonewater

peptone 1 กรม


ละลาย peptone ในนากลนหรอนากรองปรบ pH7.0 ± 0.2แบงใสหลอดหรอขวดตาม

ปรมาตรทตองการฆาเชอท121C15นาท

สารเคม(กรณใชสารเคมสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ)

1. Gramstainreagentsใชชนดสาเรจรป

2. Kovac’sreagent

p-Dimethylaminobenzaldehyde 5 กรม

Hydrochloricacidเขมขน 25 มลลลตร

Isoamyl(oramyl)alcohol 75 มลลลตร

ผสมสวนประกอบใหเขากน

3. Methyl red indicator solution

Methylred 0.1 กรม

95%Ethylalcohol 300 มลลลตร

นากลนหรอนากรอง 500 มลลลตร

(ปรมาณเพยงพอเพอใหไดปรมาตรสดทาย)

ละลายmethyl red ใน 95% ethyl alcoholปรบปรมาตรเปน 500มลลลตรดวยนากลน

หรอนากรอง

112


4. Mineraloilใชชนดสาเรจรปฆาเชอท121C30-60นาทขนกบขนาดภาชนะทใชบรรจ

5. Naphtholsolution(5%)

Purified α-naphthol 5 กรม

(meltingpoint92.5Cหรอสงกวา)

Absoluteethylalcohol 100 มลลลตร

ละลายα-naphthol ใน absolute ethyl alcohol เกบสารละลายทเตรยมแลวทอณหภม

5-10Cไดนาน2สปดาห

6. Oxidase reagent

N, N, N', N' -tetramethyl-p-phenylenediamine 1 กรม

dihydrochloride(C10H16N2.2HCl)

นากลน 100 มลลลตร

เตรยมใหมกอนใชหรอเกบในอณหภมแชเยนไดนานไมเกน1สปดาห

7. Potassium hydroxide, 7N

Potassiumhydroxide(KOH) 40 กรม


ละลายPotassiumhydroxideในนากลนหรอนากรอง

113



แผนภมการตรวจปรมาณ(enumeration)coliforms,fecalcoliformsและ E. coli ในตวอยางนาและนาแขง

suspected detection of E. coli or quality control

completed Test EC-MUG or biochemical test MacConkey agar E. coli detected/not detected or LES Endo agar LST broth/Gram stain

35 ± 0.5C,24 ± 2hและ48 ± 3 h

growth/gasproduced growth/nogasproduced nogrowthorgrowth/nogasproduced (drinkingwateronly)

BGLB broth EC broth coliforms group absentdetectionofcoliforms (detectionoffecalcoliforms) (confirmedtest)

35±0.5C 44.5±0.2C48±3h 24±2h

negative positive coliforms negative positive fecal coliforms see MPN table see MPN table (MPN/100ml) (MPN/100ml)

coliforms group Fecal coliforms group absent absent

Coliforms detected Coliforms not detected(typicalresults:LSTbroth-positive (resultsnottypical) Gram stain: gram negative, rodshape,nospore)

Inoculatesampleinlauryltryptosebroth(presumptivetest)

114



ตารางMPN

ตารางท1 คาMPNและขดความเชอมนท95%สาหรบผลบวกและผลลบเมอใชตวอยาง10มลลลตร

จานวน10หลอด

ขดความเชอมนทระดบ95% จานวนหลอดทใหผลบวก MPN/100มลลลตร ตาสด สงสด

0 <1.1 - 3.4

1 1.1 0.051 5.9

2 2.2 0.37 8.2

3 3.6 0.91 9.7

4 5.1 1.6 13

5 6.9 2.5 15

6 9.2 3.3 19

7 12 4.8 24

8 16 5.8 34

9 23 8.1 53

10 >23 13 -

115


ตารางMPN

ตารางท2 คาMPNและขดความเชอมนท95%สาหรบผลบวกและผลลบเมอใชตวอยาง10,1.0,0.1

มลลลตรจานวน5หลอดตอระดบการเจอจาง

จานวนหลอด MPN/100 ขดความเชอมนท จานวน MPN/100 ขดความเชอมน ทใหผลบวก มลลลตร ระดบ95% หลอด มลลลตร ทระดบ95%

ตาสด สงสด ทใหผลบวก ตาสด สงสด

0-0-0 <1.8 - 6.8 2-1-1 9.2 3.4 22

0-0-1 1.8 0.090 6.8 2-1-2 12 4.1 26

0-1-0 1.8 0.090 6.9 2-2-0 9.3 3.4 22

0-1-1 3.6 0.70 10 2-2-1 12 4.1 26

0-2-0 3.7 0.70 10 2-2-2 14 5.9 36

0-2-1 5.5 1.8 15 2-3-0 12 4.1 26

0-3-0 5.6 1.8 15 2-3-1 14 5.9 36

1-0-0 2.0 0.10 10 2-4-0 15 5.9 36

1-0-1 4.0 0.70 10 3-0-0 7.8 2.1 22

1-0-2 6.0 1.8 15 3-0-1 11 3.5 23

1-1-0 4.0 0.71 12 3-0-2 13 5.6 35

1-1-1 6.1 1.8 15 3-1-0 11 3.5 26

1-1-2 8.1 3.4 22 3-1-1 14 5.6 36

1-2-0 6.1 1.8 15 3-1-2 17 6.0 36

1-2-1 8.2 3.4 22 3-2-0 14 5.7 36

1-3-0 8.3 3.4 22 3-2-1 17 6.8 40

1-3-1 10 3.5 22 3-2-2 20 6.8 40

1-4-0 10 3.5 22 3-3-0 17 6.8 40

2-0-0 4.5 0.79 15 3-3-1 21 6.8 40

2-0-1 6.8 1.8 15 3-3-2 24 9.8 70

2-0-2 9.1 3.4 22 3-4-0 21 6.8 40

2-1-0 6.8 1.8 17 3-4-1 24 9.8 70

116




3-5-0 25 9.8 70 4-5-1 48 15 120

4-0-0 13 4.1 35 5-0-0 23 6.8 70

4-0-1 17 5.9 36 5-0-1 31 10 70

4-0-2 21 6.8 40 5-0-2 43 14 100

4-0-3 25 9.8 70 5-0-3 58 22 150

4-1-0 17 6.0 40 5-1-0 33 10 100

4-1-1 21 6.8 42 5-1-1 46 14 120

4-1-2 26 9.8 70 5-1-2 63 22 150

4-1-3 31 10 70 5-1-3 84 34 220

4-2-0 22 6.8 50 5-2-0 49 15 150

4-2-1 26 9.8 70 5-2-1 70 22 170

4-2-2 32 10 70 5-2-2 94 34 230

4-2-3 38 14 100 5-2-3 120 36 250

4-3-0 27 9.9 70 5-2-4 150 58 400

4-3-1 33 10 70 5-3-0 79 22 220

4-3-2 39 14 100 5-3-1 110 34 250

4-4-0 34 14 100 5-3-2 140 52 400

4-4-1 40 14 100 5-3-3 170 70 400

4-4-2 47 15 120 5-3-4 210 70 400

4-5-0 41 14 100 5-4-0 130 36 400

ตารางMPN(ตอ)

117





5-4-1 170 58 400 5-5-1 350 100 1100

5-4-2 220 70 440 5-5-2 540 150 1700

5-4-3 280 100 710 5-5-3 920 220 2600

5-4-4 350 100 710 5-5-4 1600 400 4600

5-4-5 430 150 1100 5-5-5 >1600 700 -

5-5-0 240 70 710

118



ตารางท3 ตวอยางการเลอกผลบวก3ระดบความเจอจางจากการเจอจาง5ระดบเพอรายงานคาMPN

ปรมาตร มลลลตร(mL) Combination MPNIndexตวอยาง 10 1 0.1 0.01 0.001 ofpositives No./100mL

A 5 5 1 0 0 5-1-0 33 × 10 /1 = 330

B 4 5 1 0 0 4-5-1 48 × 10 /10 = 48

C 5 2 5 2 1 5-2-1 70 × 10 /0.1 = 7000

D 4 5 4 5 1 4-5-1 48 × 10 /0.1 = 4800

E 5 4 4 0 1 4-4-1 40 × 10 /1 = 400

F 4 3 0 1 1 4-3-2 39 × 10 /10 = 39

G 4 3 3 2 1 3-2-1 17 × 10 /0.1 = 1700

119



วธนใชในการตรวจวเคราะหแบคทเรยกลมcoliformsกลมfecalcoliformsและE. coliในอาหาร

ครอบคลมการตรวจหา(detection)และการตรวจปรมาณ(enumeration)


2.1 U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2002; updated

2013, Chapter 4 “Enumeration of Escherichia coli andtheColiformBacteria”.[ออนไลน].

2002; [สบคน 22ธนวาคม 2557]. เขาถงไดท http://www.fda.gov/Food/FoodScience

Research/LaboratoryMethods/ucm064948.htm.

2.2 U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2010;

Appendix: 2MostProbableNumber fromSerialDilutions. [ออนไลน]. 2010; [สบคน

20 กมภาพนธ 2558]. เขาถงไดท http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/

Laboratory Methods/ ucm109656.htm.


E. coli = Escherichia coli

IMViC = indole,methylred,Voges-Proskauer,citrate

Shellfish = สตวทะเลมเปลอกทบรโภคเปนอาหารไดเชนกงหอยป


แบคทเรยในกลม coliforms เปนแบคทเรยแกรมลบรปทอนไมสรางสปอร เจรญไดในททม

ออกซเจนและไมมออกซเจน(facultativeanaerobe)สามารถใชนาตาลแลคโตส(lactose)เกดกรด

และสรางกาซทอณหภม 35 C ภายใน 48 ชวโมง พบทวไปในสงแวดลอม และในระบบ

DMScF2016: วธตรวจวเคราะห Coliforms, Fecal coliforms และ

E. coliในอาหาร

Analytical method of Coliforms, Fecal coliforms

and E. coliinfood

120


ทางเดนอาหารของคนและสตวใชเปนตวบงชสขลกษณะของนาและสงแวดลอมในกระบวนการ

ผลตอาหารสวนfecalcoliformsหรอthermotolerantcoliformsเปนกลมยอยของแบคทเรยกลม

coliformsพบมากในระบบทางเดนอาหารของคนและสตวสามารถใชนาตาลแลคโตส(lactose)

เกดกรดและสรางกาซทอณหภม44.5ถง45.5Cภายใน24-48ชวโมงอาจใชเปนตวบงชมาตรฐาน

สาหรบ shellfish และนาเพาะเลยง shellfishสาหรบ E. coli เปนแบคทเรยชนดหนงในกลม

fecal coliformsนยมใชเปนจลนทรยบงชสขลกษณะการผลตอาหารการจาแนกE. coli อาศย

หลกการทางชวเคมของปฏกรยาIMViCตามปกตการตรวจวเคราะหcoliforms,fecalcoliforms

และE. coli ในอาหารมกใชวธมาตรฐาน (conventionalmethod) แตเนองดวยคณสมบตท

E. coli มากกวา 95%สามารถสรางเอนไซมβ-glucuronidase (GUD) ซงยอย fluorogenic substrate เชน 4-methylumbelliferyl-β-D- glucuronide (MUG) และใหสารเรองแสง

4-methylumbelliferon(MU)ซงเหนเปนสนาเงนภายใตแสงอลตราไวโอเลต(UV)ความยาวคลน

ประมาณ 365 นาโนเมตร ในทมด ดงนนจงอาจใชหลกการทางานของเอนไซมดงกลาว

ในการตรวจสอบเบองตนและการตรวจยนยน เพอจาแนกE. coli จากกลม coliforms เชน

การใชอาหารเลยงเชอ LST-MUG broth, EC-MUG broth,VRBA-MUGนอกจากนอาจใช

chromogenic substrates อนแทน MUGสาหรบการตรวจวเคราะห coliforms และ E. coli

ไดเชนกน

การตรวจcoliforms,fecalcoliformsและ E. coli ในอาหารแบงออกเปน

4.1 การตรวจปรมาณ(enumeration)ม2วธคอ

4.1.1 วธMPNแบงเปน3ขนตอนดงน

4.1.1.1 การตรวจสอบเบองตน (presumptive phase) นาตวอยางเรมตนหรอ

ทเจอจางตามความเหมาะสมอยางนอย3ระดบตดตอกนระดบละ3หรอ

5 หลอด ใสในอาหารเลยงเชอชนดเหลวทมนาตาลแลคโตสเปน

องคประกอบ เพอแยกcoliformsออกจากแบคทเรยชนดอนทไมสามารถ

ใชนาตาลแลคโตสได

4.1.1.2 การตรวจยนยน (confirmed phase) นาหลอดทใหกาซไปตรวจยนยน

coliformsและ fecal coliformsโดยถายเชอลงในอาหารเลยงเชอจาเพาะ

ชนดเหลว(selectivebroth)

4.1.1.3 การตรวจขนสมบรณ (completed phase) แยกเชอและนาไปตรวจยนยน

E. coli โดยทดสอบทางชวเคม

121


4.1.2 วธpourplate:coliformsและE. coli

นาตวอยางเรมตนหรอทเจอจางตามความเหมาะสมปเปตลงบนจานเพาะเชอเทดวย

อาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขงนาไปบมนบจานวนโคโลนทมลกษณะเฉพาะ

และนาไปตรวจยนยนโดยทดสอบทางชวเคม

4.2 การตรวจหา(detection):coliformsและE. coli

ตรวจสอบเบองตนโดยนาตวอยางเรมตนหรอทเจอจางตามความเหมาะสมใสลงในอาหาร

เลยงเชอชนดเหลวทมนาตาลแลคโตสเปนองคประกอบ จานวน 2 หลอดตอระดบ

การเจอจางและดาเนนการตามขนตอนการตรวจยนยนและการตรวจขนสมบรณ

5. อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents): ภาคผนวก1


5.1.1 2%Brilliantgreenlactosebile(BGLB)broth

5.1.2 EC broth

5.1.3 EC-MUG broth

5.1.4 Koser’scitratebrothหรอSimmonscitrateagar

5.1.5 Lactose broth

5.1.6 Lauryltryptose(LST)broth

5.1.7 LauryltryptoseMUG(LST-MUG)broth

5.1.8 Levine’seosin-methyleneblue(L-EMB)agar

5.1.9 Methylred-VogesProskauer(MR-VP)broth

5.1.10Platecountagar(PCA)

5.1.11Tryptone(tryptophane)broth

5.1.12Violetredbileagar(VRBA)

5.1.13Violetredbileagar-MUGagar(VRBA-MUG)

5.2 สารละลายสาหรบเจอจาง (diluent) ไดแก Butterfield’s phosphate-bufferedwater

(BPB)หรอ equivalent diluent เชน 0.1%peptonewater (กรณ shellfish ใชBPBหรอ

0.5%peptonewater)



5.3.2 Kovacs’reagent

5.3.3 Methyl red indicator

5.3.4 Voges-Proskauer(VP)reagents

122






6.1.3 เครองบดปน(blender)หรอเครองตผสมอาหาร(stomacher)

6.1.4 เครองนบโคโลน(colonycounter)

6.1.5 ตอบเพาะเชอ(incubator)32±1C,35±1Cและ35±0.5C(สาหรบshellfish)



6.1.8 เครองผสม(vortexmixer)

6.1.9 อางนาแบบควบคมอณหภม(waterbath)44.5±0.2C,45.5±0.2Cและ47±2C

6.1.10UVlampความยาวคลนประมาณ365นาโนเมตรไมเกน6วตต

6.2 อปกรณ

6.2.1 โถปน(blender)หรอถงตผสมอาหาร(stomacherbag)



6.2.4 หวงและเขมเขยเชอ(loopandneedle)



6.2.7 หลอดทดลอง(testtube)พรอมหลอดดกกาซ(Durhamtube)




7.1.1 กรณทตวอยางเปนของแขงตดตวอยางจากหลายๆตาแหนงใหเปนชนเลกๆผสม

ใหเขากนกรณทตวอยางเปนของเหลวขนหนดเขยาใหทวสมตวอยาง 50 กรม

(กรณมตวอยางนอยกวา50กรมใหใชตวอยางครงหนง)ใสในภาชนะปราศจากเชอ

7.1.2 กรณทตวอยางเปนของเหลว เขยาตวอยางในแตละภาชนะบรรจใหเขากน เทหรอ

ปเปตตวอยางจากแตละภาชนะปรมาตรเทาๆกนใสในภาชนะปราศจากเชอ ใหได

ปรมาตรรวมไมนอยกวา100มลลลตรเขยาใหเขากน(ตวอยางเรมตน)

123


7.1.3 กรณทตวอยางเปนหอยสองฝา (bivalvemolluscan shellfish) สดและแชแขง

[ไมรวม crustaceans (crabs, lobsters, and shrimp) และเนอหอยแปรรป

เชนชบเกลดขนมปง(breaded)แกะเปลอก(shucked)และปรงสก(pre-cookedand

heat-processed)]สมตวอยางหอย 10-12ตว (ทงเนอและสวนของเหลวนาหนก

รวม200กรม)ใสในภาชนะปราศจากเชอเทสารละลายสาหรบเจอจาง200มลลลตร

ผสมใหเขากนโดยใชเครองบดปนนาน2นาทจะไดตวอยางเจอจาง1:2

7.2 การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)

เจอจางตวอยางตามลาดบลาดบละ10เทา(serialten-folddilutions)ดวยสารละลายสาหรบ

เจอจางดงน

7.2.1 กรณ 7.1.1 เทสารละลายสาหรบเจอจาง 450มลลลตรหรอปรมาตร 9 เทาลงใน

ตวอยางผสมใหเขากนโดยใชเครองบดปน 30-60วนาทหรอเครองตผสมอาหาร

2นาท จะไดตวอยางทเจอจาง 1:10 (initial suspensionหรอ primary dilution)

กรณ 7.1.3หลงจากเตรยมตวอยางเจอจาง 1:2 ใหเรมทาการตรวจวเคราะหภายใน

2นาท โดยนบจากทาการเจอจางเปน 1:10ดวยสารละลายสาหรบเจอจาง (BPB

หรอ 0.5% peptonewater) ปรมาตร 4 เทา (เชน ตวอยางเจอจาง 1:2 ปรมาณ

20กรมใสสารละลายสาหรบเจอจาง80มลลลตร)เขยาใหเขากน

7.2.2 กรณ7.1.2ปเปตตวอยาง10มลลลตรใสในสารละลายสาหรบเจอจาง90มลลลตร

เขยาใหเขากนจะไดตวอยางเจอจาง1:10

7.2.3 ปเปตตวอยางทเจอจาง 1:10 มา 10 มลลลตร ใสในสารละลายสาหรบเจอจาง

90มลลลตรเขยาใหเขากนจะไดตวอยางเจอจาง1:100ทาเชนนตอไปจนไดตวอยาง

ทเจอจางตามตองการ

7.3 การตรวจปรมาณ(enumeration)coliforms,fecalcoliformsและE. coli ในอาหารโดยวธ

MPN:ภาคผนวก2แผนภมท1

7.3.1 การตรวจสอบเบองตน(presumptivephase)

7.3.1.1 ปเปตตวอยางเรมตนหรอตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม1มลลลตร

ใสในLSTbroth(หรอlactosebroth)อยางนอย3ระดบตดตอกนระดบ

ความเจอจางละ3หลอด

กรณตวอยางshellfishปเปตตวอยางใสในLSTbrothระดบความเจอจาง

ละ 5หลอดโดยใสตวอยางทเจอจาง 1:2ปรมาตร2มลลลตร (เทยบเทา

นาหนกตวอยาง1กรม)และตวอยางทเจอจาง10เทาตามลาดบ1มลลลตร

124


อยางนอย3ระดบ(1:10,1:100และ1:1,000ซงเทยบเทานาหนกตวอยาง

0.1,0.01และ0.001กรมตามลาดบ)

7.3.1.2 บมท35C24±2ชวโมง

7.3.1.3 อานและบนทกผลหลอดLSTbroth

ผลบวก : เกดกาซในหลอดดกกาซหรอเกดฟองกาซเมอเขยาหลอดเบาๆ


ถาใหผลลบบมเพม24ชวโมงอานและบนทกผลท48±3ชวโมง

หมายเหต: กรณตรวจปรมาณE. coli ในอาหารอาจใชLST-MUGbroth

แทนLST broth ได (ยกเวนในหอยสองฝา เนองจากเนอหอย

มnaturalGUDactivityซงจะเกดการเรองแสงหรอผลบวกปลอม)

บมท35C24ถง48±2ชวโมงอานผลเชนเดยวกบLSTbroth

พรอมทงสงเกตการเรองแสงสนาเงนภายใตแสงUVความยาว

คลนประมาณ 365นาโนเมตรหลอดทใหผลบวก (เกดกาซ

ในหลอดดกกาซและเรองแสงสนาเงน)ใหดาเนนการตรวจยนยน

ตอตามขอ7.3.4

7.3.2 การตรวจยนยน(confirmedphase)สาหรบcoliforms

7.3.2.1 นา1loopของแตละหลอดLSTbrothทใหผลบวกถายลงในBGLBbroth

หลอดตอหลอด (อาจถายเชอโดยใชแทงไมปราศจากเชอแทน loopและ

กรณทพบฝาใหหลกเลยงสวนของฝา)

7.3.2.2 บมท35C48±3ชวโมง



7.3.2.3 อานและบนทกผลจานวนหลอดBGLBbrothทใหผลบวก

7.3.2.4 นาคาไปเปรยบเทยบกบตารางMPN

7.3.3 การตรวจยนยน(confirmedphase)สาหรบfecalcoliforms

7.3.3.1 นา 1 loopจากLSTbroth ทใหผลบวกแตละหลอดถายลงในECbroth

หลอดตอหลอด

7.3.3.2 บมท45.5C24±2ชวโมง(กรณตวอยางshellfishบมท44.5C)



125


ถาใหผลลบบมเพม24ชวโมงอานและบนทกผลท48±2ชวโมง

7.3.3.3 อานและบนทกผลจานวนหลอดECbrothทใหผลบวก


หมายเหต กรณตรวจปรมาณE. coliในเนอหอยเชนหอยนางรมอาจใชEC-MUGbroth

แทนการใชECbrothในขนตอนconfirmedphaseบมและอานผลเชนเดยว

กบECbrothพรอมทงสงเกตการเรองแสงสนาเงนภายใตแสงUVความยาว

คลน365นาโนเมตรในทมดนาหลอดทใหผลบวก(เกดกาซในหลอดดกกาซ

และเรองแสงสนาเงน)ดาเนนการตรวจขนสมบรณตามขอ7.3.4

7.3.4 การตรวจขนสมบรณ(completedphase):E. coli

7.3.4.1 นาหลอดECbroth (หรอEC-MUGbrothหรอLST-MUGbroth)ทให

ผลบวกขดบนL-EMBagar

7.3.4.2 บมท35C18-24ชวโมง

7.3.4.3 เลอกโคโลนลกษณะแบนและมสดาตรงกลางมหรอไมมmetallic sheen

1-5โคโลนจากแตละจานเพาะเชอขดบนPCAslant

7.3.4.4 บมท35C18-24ชวโมง

7.3.4.5 นาเชอจากPCAslantมายอมสแกรมกรณทพบเชอแกรมลบรปทอนสน

ใหนาไปทดสอบตอดงน

7.3.4.5.1ปฏกรยาIMViC

การทดสอบindole

เขยเชอลงในtryptonebrothบมท35C24±2ชวโมงหยด

Kovacs’reagent0.2-0.3มลลลตรอานผล

ผลบวก : เกดวงแหวนสแดงดานบน

ผลลบ : เกดวงแหวนสเหลอง

E. coli(biotype1)ใหผลบวก

สาหรบE. coli(biotype2)ใหผลลบ

การทดสอบMR-VPreactivecompounds

เขยเชอลงในMR-VPbrothบมท35C48±2ชวโมง

ถายbroth1มลลลตรลงในหลอดปราศจากเชอ

หยด VP reagents (α-naphthol solution 0.6 มลลลตร

และ40%KOHsolution0.2มลลลตร)เขยาจากนนเตมเกลด

126


creatineเลกนอยเขยาอกครงแลวตงไวทอณหภมหองประมาณ

2ชวโมงอานผล

VP ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนเปนสชมพ-แดง



สาหรบMRใหบมMR-VPbrothตออก48±2ชวโมง

หยดmethylredIndicator5หยดเขยาอานผล

MR ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนจากสเหลองเปนสแดง

ผลลบ : อาหารเลยงเชอเปนสเหลอง


การทดสอบcitrate

เขยเชอปรมาณเลกนอยลงในKoser’scitratebroth*

หรอนาเชอขดบนผวหนาและ stabลงในSimmons citrate

agar**บมท35C96ชวโมงอานผล

ผลบวก : อาหารเลยงเชอขนชดเจน*หรอเชอเจรญ

และอาหารเลยงเชอเปลยนจากสเขยวเปน

สนาเงน**

ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมขน*หรอเชอไมเจรญ/

เจรญเลกนอยและอาหารเลยงเชอไมเปลยนส**


7.3.4.5.2 การสรางกาซจากนาตาลแลคโตส

เขยเชอลงใน LST broth อกครง เพอยนยนการสรางกาซ

บมท35C48±2ชวโมงอานผลในหลอดดกกาซ

ผลบวก : เกดกาซในหลอดดกกาซหรอเกดฟองกาซ

เมอเขยาหลอดเบาๆ

ผลลบ : ไมเกดกาซ


การสรปผลวาพบE. coli ตองพบเชอทมคณสมบตดงน

1) ใชนาตาลแลคโตสและสรางกาซภายใน48ชวโมงท35C

2)พบเชอแกรมลบรปทอนไมสรางสปอร

127


3) ใหผลปฏกรยา IMViCรปแบบ++-- (biotype1)หรอ -+--

(biotype2)

หมายเหต อาจใชชดทดสอบทางชวเคมสาเรจรป เชนAPI20Eหรอ

VITEK เพอตรวจจาแนก E. coli แทนการทดสอบปฏกรยา

IMViC

7.3.4.6 บนทกจานวนหลอด EC broth ทไดผลการตรวจยนยนขนสมบรณวา

เปนE. coli


7.4 การตรวจปรมาณ(enumeration)coliformsและE. coli ในอาหารโดยวธpourplate:

7.4.1 coliforms:ภาคผนวก3แผนภมท2

7.4.1.1 ปเปตตวอยางเรมตนหรอตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม1มลลลตร

ใสลงบนจานเพาะเชอระดบความเจอจางละ2จาน

7.4.1.1.1 กรณทวไป

เทVRBA10มลลลตรผสมใหเขากนตงทงไวใหวนแขง

เททบหนาดวยVRBA 5 มลลลตร (เพอปองกนเชอเจรญ

แผบนผวหนาวน)ตงทงไวใหวนแขง

7.4.1.1.2 กรณทคาดวาตวอยางมinjuredหรอstressedcell

เท TSA 8-10 มลลลตร ลงในแตละจานเพาะเชอ ผสมให

เขากนบมทอณหภมหอง2±0.5ชวโมง

เททบหนาดวยVRBA8-10มลลลตรตงทงไวใหวนแขง

7.4.1.2 บมท35C18-24ชวโมง(กรณตวอยางผลตภณฑนมบมท32C)

7.4.1.3 เลอกจานเพาะเชอทมเชอเจรญ 25-250 โคโลน นบโคโลนสแดง-มวง

ทมโซนลอมรอบ (โซนเกดจาก precipitated bile acids) ขนาดเสน

ผานศนยกลางของโคโลน±0.5มลลเมตร

7.4.1.4 ตรวจยนยนโดยสมโคโลนลกษณะเฉพาะอยางนอย10โคโลนใสในหลอด

BGLBbroth(1โคโลนตอหลอด)

7.4.1.5 บมท35Cอานผลการเกดกาซท24และ48ชวโมง

7.4.1.6 บนทกจานวนหลอดทใหผลบวก

(กรณหลอดBGLBbroth ทใหผลบวกพบฝา ใหยอมสแกรมจากbroth

เพอใหแนใจวากาชทเกดขน มไดเกดจากแบคทเรยแกรมบวก รปทอน

ทสามารถใชนาตาลแลคโตสได)

128


7.4.2 E. coli:ภาคผนวก4แผนภมท3

7.4.2.1 เหมอนขอ7.4.1.1–7.4.1.2เวนแตเททบหนาดวยVRBA-MUGแทนVRBA

7.4.2.2 นาจานเพาะเชอทมเชอเจรญ 25-250 โคโลน ไปสองภายใตแสง UV

ความยาวคลนประมาณ365นาโนเมตรในทมด และนบจานวนโคโลน

ทมการเรองแสงสนาเงนรอบโคโลน

7.4.2.3 สมโคโลนทใหผลบวกจากขอ 7.4.2.2อยางนอย 10โคโลน ไปทดสอบ

ทางชวเคมตามวธการตรวจขนสมบรณในขอ7.3.4.5

7.5 การตรวจหา(detection)coliformsและ E. coli ในอาหาร:ภาคผนวก5แผนภมท4

7.5.1 นาตวอยางเรมตนหรอตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม(เชน1:10และ1:100)

ใสลงLSTbroth(หรอlactosebroth)จานวน2หลอดตอระดบความเจอจาง

7.5.2 เหมอนขอ 7.3.1.2-7.3.1.3 และตอดวยขอ 7.3.2.1-7.3.2.3 สาหรบการตรวจหา

coliforms

7.5.3 เหมอนขอ 7.3.1.2-7.3.1.3 ตอดวยขอ 7.3.3.1-7.3.3.3 และขอ 7.3.4.1-7.3.4.6

สาหรบการตรวจหาE. coli

8. การคานวณผล(Calculationofresults)

8.1 การคานวณกรณตรวจวเคราะหปรมาณโดยวธMPN

8.1.1 นาจานวนหลอดทใหผลบวก เปรยบเทยบกบตารางMPN (ภาคผนวก 6) จะได

คาMPN/กรมและชวงความเชอมนทระดบ95%(95%confidenceintervals)

8.1.2 กรณจานวนหลอดบวกไมเปนไปตามตารางMPNใหใชสตรคานวณ(Thomas,1942)

ดงน

MPN/กรม = (∑gj)/(∑tjmj∑ (tj- gj)mj)(1/2)

∑gj = จานวนหลอดทงหมดทใหผลบวก

∑(tj - gj)mj = นาหนกรวมเปนกรมของตวอยางในหลอดทใหผลลบ

∑tjmj = นาหนกรวมเปนกรมของตวอยางในหลอดทงหมด

ใหเลอกระดบความเจอจางสาหรบการคานวณโดยเลอกระดบความเจอจางตาสด

ทใหผลบวกไมครบทกหลอด แลวเลอกระดบความเจอจางสงสดทมผลบวก

อยางนอย 1หลอด จากนนเลอกทกระดบความเจอจางทอยระหวางสองระดบ

ทเลอกไวแลวดงตวอยางตอไปน

129


ตวอยางท1 ระดบความเจอจาง 1:1 1:10 1:100 1:1,000 1:10,000

จานวนหลอดทใหผลบวก 5/5 10/10 4/10 2/10 0/5

ในทนเลอกสองระดบความเจอจาง1:100และ1:1,000จะได

∑gj = 6

∑(tj - gj)mj = (6 ×0.01)+(8×0.001)

= 0.068

∑tjmj = (10 ×0.01)+(10×0.001)

= 0.11

แทนคาในสตร

MPN/กรม = 6/√(0.068)(0.011)

= 6/0.086

= 70

ตวอยางท2 ระดบความเจอจาง 1:10 1:100 1:1,000

จานวนหลอดทใหผลบวก 2/3 0/3 3/3

ในทนเลอกทงสามระดบความเจอจางจะได

∑gj = 5

∑(tj - gj)mj = (1 ×0.1)+(3×0.01)+(0×0.001)

= 0.13

∑ tjmj = (3 ×0.1)+(3×0.01)+(3×0.001)

= 0.333

แทนคาในสตร

MPN/กรม = 5/√(0.13)(0.333)

= 5/0.208

= 24

8.1.3 การประมาณคาขดความเชอมน (95% confidence limits) ของผลMPNคานวณ

จากคาstandarderrorของlog10(MPN)ดวยวธของHaldaneโดยใชสตรคานวณ

ดงน

130


95%confidenceintervals=LogMPN/กรม± (1.96)(standarderror)

standarderrorคานวณไดจากExcelspreadsheetตามเอกสารอางองขอ2.2

ตวอยาง ระดบความเจอจาง 1:10 1:100 1:1,000


∴MPN/กรม = 5/√(0.1+0.03+0.000)(0.3+0.03+0.003)

= 5 /√(0.13)(0.333)

= 24

95% confidence intervals = log 24 ± (1.96)(0.1973)

= 1.3802 ± 0.3867

= 0.9935ถง1.7669

Lowerlimit =antilog0.9935=9.9

Upper limit = antilog 1.7669 = 58.5

8.1.4 ในกรณทระดบความเจอจางเรมตนไมใช 1:10 (เทากบนาหนกตวอยาง 0.1กรม)

สามารถหาคาMPNไดดงน

MPN/กรม=คาทอานไดจากตาราง×ระดบความเจอจางกลาง(middledilution)

100

ตวอยาง ระดบความเจอจาง 1:1,000 1:10,000 1:100,000


ดงนนคาทอานไดจากตาราง = 150

ระดบความเจอจางกลาง = 10,000

∴ MPN/กรม=

150 × 10,000

100

= 15,000

131


8.2 การคานวณกรณตรวจวเคราะหปรมาณโดยวธpourplate

กรณนบโคโลนทมลกษณะเฉพาะและนาไปตรวจยนยนปรากฏวาเปน coliformsหรอ

E. coli บางโคโลนใหนาสดสวนทยนยนแลววาเปนcoliformsหรอE. coli ไปคณจานวน

ทนบไดและคณดวยdilutionfactor

ตวอยาง คาเฉลยจานวนโคโลนทนบได = 65 โคโลน ทระดบการเจอจาง 1:10,000

ตรวจยนยนพบวาเปนcoliforms4จาก5โคโลนดงนน

coliformsCFU/กรมหรอมลลลตร = 65×(4/5)× 10,000

= 520,000


9.1 การตรวจหา(detection)รายงานเปน

พบ/ไมพบตอนาหนกหรอปรมาตรของตวอยาง(เชนกรมหรอมลลลตร)

9.2 การตรวจปรมาณ(enumeration)โดยวธMPNรายงานเปน

ColiformsหรอFecalcoliformsหรอE. coli MPN/กรมหรอมลลลตร

ยกเวนshellfishรายงานMPN/100กรม

9.2.1 การตรวจปรมาณ(enumeration)โดยวธpourplateรายงานเปน

จานวนColiformsหรอE. coli CFU/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)

9.2.2 กรณตรวจวเคราะหปรมาณ โดยวธ pour plate ถาไมพบโคโลนลกษณะเฉพาะ

ของcoliformsหรอ E. coli หรอกรณทยนยนแลวพบวาไมใชcoliformsใหรายงาน

ดงน

ตวอยางของแขงหรอของเหลวขนหนดทระดบความเจอจางแรก ใหรายงาน

นอยกวา10

ตวอยางของเหลวทตวอยางเรมตนใหรายงานนอยกวา1หรอไมพบ

132



10.1 ภาคผนวก1 : อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)

10.2 ภาคผนวก2 : แผนภมท 1การตรวจปรมาณ (enumeration) coliforms, fecal coliforms

และE. coli ในอาหารโดยวธMPN

10.3 ภาคผนวก3 : แผนภมท2การตรวจปรมาณ(enumeration)coliformsในอาหารโดยวธ

pour plate

10.4 ภาคผนวก4 : แผนภมท3การตรวจปรมาณ(enumeration)E. coli ในอาหาร

โดยวธpourplate

10.5 ภาคผนวก5 : แผนภมท4การตรวจหา(detection)coliformsและE. coli ในอาหาร

10.6 ภาคผนวก6 : ตารางท 1 คาMPNและConfidence limitsสาหรบผลบวกและผลลบ

เมอใชตวอยาง0.1,0.01,0.001กรมจานวน3หลอดตอระดบการเจอจาง

ตารางท 2 คาMPNและConfidence limitsสาหรบผลบวกและผลลบ

เมอใชตวอยาง0.1,0.01,0.001กรมจานวน5หลอดตอระดบการเจอจาง

133




อาหารเลยงเชอกรณใชอาหารเลยงเชอสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ

1. 2%Brilliantgreenlactosebile(BGLB)broth



Oxgall 20 กรม

Brilliantgreen 0.0133 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรแบง 10มลลลตรใสหลอด

ทดลองทมหลอดดกกาซควาอยฆาเชอท121C12-15นาทpH7.2± 0.2

2. EC broth


Lactose 5 กรม






ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรแบง10มลลลตรใสหลอด


134


3. EC-MUG broth


Lactose 5 กรม








ทดลองทมหลอดดกกาซควาอย(หลอดทใชตองไมเรองแสงภายใตแสงUVทความยาวคลน

ประมาณ365นาโนเมตร)ฆาเชอท121C15นาทpH6.9± 0.2อาหารเลยงเชอทเตรยมแลว

เกบทอณหภมหองไดนาน1สปดาหหรอเกบในตเยนไดนาน1เดอน

4. Koser’scitratebroth

Sodiumammoniumhydrogenphosphate 1.5 กรม

(NaNH4HPO4 4H2O)


(monobasic)

Magnesium sulfate (MgSO4 7H2O) 0.2 กรม

Sodium citrate 2H2O 3 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรแบงใสหลอดตามปรมาตร

ทตองการฆาเชอท121C15นาทpH6.7± 0.2

135


5. Lactose broth


Peptone 5 กรม

Lactose 5 กรม



ฆาเชอท121C15นาทpH6.9± 0.2

6. Laurylsulphatetryptosebroth(LSTbroth)

Tryptose 20 กรม

Lactose 5 กรม








136


7. LauryltryptoseMUG(LST-MUG)broth

Tryptose 20 กรม

Lactose 5 กรม







ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรใหความรอนออนๆ (ถาจาเปน)

แบง 10 มลลลตรใสหลอดทดลองทมหลอดดกกาซควาอย ฆาเชอท 121 C 15 นาท

pH 6.8 ± 0.2

8. Levineeosinmethyleneblue(L-EMB)agar




Agar 15 กรม

EosinY 0.4 กรม

Methyleneblue 0.065 กรม



ละลายแบงใสขวดตามปรมาตรทตองการฆาเชอท 121 C 15นาท pH7.1± 0.2 เทใส

จานเพาะเชอตามปรมาตรทตองการ

137


9. Methylred-VogesProskauer(MR-VP)broth

สตร1

Bufferedpeptone-waterpowder 7 กรม

(DifcoorBBL)

Glucose 5 กรม



ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรใหความรอนออนๆ(ถาจาเปน)

แบง10มลลลตรใสหลอดฆาเชอท118-121C15นาทpH6.9± 0.2

สตร2

Pancreaticdigestofcasein 3.5 กรม

Pepticdigestofanimaltissue 3.5 กรม

Dextrose 5 กรม

Potassiumphosphate(K3PO4) 5 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรใหความรอนออนๆ(ถาจาเปน)

แบง10มลลลตรใสหลอดฆาเชอท118-121C15นาทpH6.9± 0.2

สตร3

Peptone 5 กรม

Glucose 5 กรม

Phosphatebuffer 5 กรม




138


10. Plate count agar




Agar 15 กรม



ละลายฆาเชอท121C15นาทpH7.0± 0.2

11. Simmons citrate agar

Ammonium dihydrogen phosphate (NH4H2PO4) 1 กรม



Sodiumcitratedihydrate 2 กรม

Magnesium sulfate (MgSO4 7H2O) 0.2 กรม

Agar 15 กรม

Bromthymolblue 0.08 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรใหความรอนออนๆพรอมเขยา

เปนครงคราวตมเดอดนาน1-2นาทจนagarละลายแบงใสหลอดตามปรมาตรทตองการ

ฆาเชอท121C15นาทเอยงหลอดและปลอยใหวนแขงpH6.8±0.2

139


12. Tryptone broth

Tryptoneortrypticase 10 กรม


ละลายTryptoneor trypticase ในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรแบง 5มลลลตร

ใสหลอดฆาเชอท121C15นาทpH6.9± 0.2

13. Violetredbileagar(VRBA)

Peptoneorgelysate 7 กรม



BilesaltsorbilesaltsNo.3 1.5 กรม




Agar 15 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรตงทงไว 2-3นาทผสมให

เขากนปรบpH7.4± 0.2ตมใหเดอดนาน2นาททาใหเยนลงท45Cกอนนาไปใช

140


14. Violetredbile-MUG(VRBA-MUG)agar

Peptoneorgelysate 7 กรม



BilesaltsorbilesaltsNo.3 1.5 กรม




4-methylumbelliferyl-b-D-glucuronide(MUG) 0.1 กรม

Agar 15 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรตงทงไว 2-3นาท ผสมให

เขากนปรบpH7.4± 0.2ตมใหเดอดนาน2นาททาใหเยนลงท45Cกอนนาไปใช

15. Butterfield’sphosphate-buffereddilutionwater(BPB)

15.1 stock solution



ชงKH2PO4 34กรมละลายในนากลน 500มลลลตรปรบpH7.2 โดยใช 1NNaOH

และปรบปรมาตรเปน1ลตรฆาเชอท121C15นาท

15.2 dilution blanks

ปเปตstocksolution1.25มลลลตรนามาปรบปรมาตรเปน1ลตรดวยนากลนแบงใสหลอด

หรอขวดตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121C15นาท

141


16. 0.1%peptonewater

peptone 1 กรม


ละลาย peptone ในนากลนหรอนากรอง ปรบ pH 7.0 ± 0.2 แบงใสหลอดหรอขวด

ตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121C15นาท

17. 0.5%peptonewater

peptone 5 กรม


ละลาย peptone ในนากลนหรอนากรองปรบ pH 7.0 ± 0.2 แบงใสหลอดหรอขวด

ตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121C15นาท

สารเคมกรณใชสารเคมสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ

1. Gram stain reagents

ใชชนดสาเรจรป

2. Kovacs’reagent

p-Dimethylaminobenzaldehyde 5 กรม

Amylalcohol(normalonly) 75 มลลลตร

Hydrochloricacid(HCl) 25 มลลลตร

ละลาย p-dimethylaminobenzaldehyde ใน normal amyl alcohol คอยๆ เตม HCl

เกบทอณหภม4C

142


3. Methyl red solution

Methylred 0.1 กรม

Ethylalcohol95% 300 มลลลตร

นากลน(ปรมาณเพยงพอเพอใหไดปรมาตรสดทาย) 500 มลลลตร

ละลายmethyl red ใน95% ethyl alcoholปรบปรมาตรเปน 500มลลลตรดวยนากลน

หรอนากรอง

4. VP reagents

Solution1

α-Naphthol 5 กรม

Alcohol(absolute) 100 มลลลตร

ละลายα-Naphtholในalcohol

Solution2

Potassiumhydroxide(KOH) 40 กรม

นากลน(ปรมาณเพยงพอเพอใหไดปรมาตรสดทาย) 100 มลลลตร

ละลายPotassiumhydroxideในนากลนและปรบปรมาตรเปน100มลลลตร

143



แผนภมท1 การตรวจปรมาณ (enumeration) coliforms, fecal coliformsและ E. coli ในอาหาร

โดยวธMPN

วธมาตรฐานสาหรบการตรวจวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย

ภาคผนวก 2

ตวอยางเจอจางอยางนอย 3 ระดบตดตอกน (เชน 1:10, 1:100 และ 1:1,000)

presumptive phase

LST broth* ระดบความเจอจางละ 3 หลอดๆ ละ 1 มลลลตร [กรณ shellfish ใช LST broth ระดบความเจอจางละ 5 หลอด และเพมระดบความเจอจาง 1:2 หลอดละ 2 มลลลตร]

35oC 24 ± 2 ถง 48 ± 3 ชวโมง

ผลลบ ผลบวก

confirmed phase

BGLB EC broth** 35oC48 ± 3 ชวโมง 45.5oC 24 ถง 48 ± 2 ชวโมง

อานผล (44.5oC: shellfish)


completed phase

คานวณ คานวณ L-EMB agar 35oC 18-2 ชวโมง รายงานผล รายงานผล ยอมสแกรม (MPN coliforms) (MPN fecal coliforms) (แกรมลบรปทอนสน)

IMViC /LST broth

(E. coli : ++-- หรอ -+--/+) คานวณ

รายงานผล (MPN E. coli)

* กรณตรวจ E. coli ในอาหาร (ไมรวมหอยสองฝา) อาจใช LST-MUG broth แทน LST-broth ** กรณตรวจ E. coli ในเนอหอย อาจใช EC-MUG broth แทน EC broth

144

เปรยบเทยบผลกบ ตาราง MPN

รายงานผล (MPN coliforms, fecal coliforms

หรอ E.coli)



144


แผนภมท2การตรวจปรมาณ(enumeration)coliformsในอาหารโดยวธpourplate




ตวอยางเจอจาง 1:10 หรอ 1:100 หรอตามความเหมาะสม

ปเปตตวอยางแตละระดบความเจอจาง 1 มลลลตร ใสลงในจานเพาะเชอ 2 จาน (duplicate)

กรณทวไป กรณทคาดวาตวอยางม injured cell หรอ stressed cell

เท VRBA 10 มลลลตร เท TSA 8-10 มลลลตร ผสมใหเขากน ตงทงใหวนแขง ผสมใหเขากน

อณหภมหอง 2 0.5 ชวโมง

เททบหนาดวย VRBA 5 มลลลตร เททบหนาดวย VRBA 8-10 มลลลตร

ตงทงไวใหวนแขง ตงทงไวใหวนแขง

35oC 18-24 ชวโมง (32oC : นมและผลตภณฑนม) นบโคโลนทมลกษณะเฉพาะ (25-250 โคโลน)

สมอยางนอย 10 โคโลนเพอตรวจยนยน

BGLB broth (1 โคโลน/หลอด) 35oC 24-48 ชวโมง

ผลบวก

คานวณ

รายงานผล (จานวน coliforms)

145

145



แผนภมท3การตรวจปรมาณ(enumeration)E. coli ในอาหารโดยวธpourplate


ตวอยางทเจอจาง 1:10 หรอ 1:100 หรอตามความเหมาะสม

ปเปตตวอยางแตละระดบความเจอจาง 1 มลลลตร ใสลงในจานเพาะเชอ 2 จาน (duplicate)

กรณทวไป กรณทคาดวาตวอยางม Injured หรอ stressed cell

เท VRBA 10 มลลลตร เท TSA 8-10 มลลลตร ผสมใหเขากน ตงทงใหวนแขง ผสมใหเขากน

อณหภมหอง 2 0.5 ชวโมง

เททบหนาดวย VRBA-MUG 5 มลลลตร เททบหนาดวย VRBA 8-10 มลลลตร ตงทงไวใหวนแขง ตงทงไวใหวนแขง

35oC 18-24 ชวโมง (32oC : นมและผลตภณฑนม)

นบโคโลนทมลกษณะเฉพาะ (25-250 โคโลน)

สมอยางนอย 10 โคโลน เพอตรวจยนยน

ยอมสแกรม (แกรมลบ รปทอนสน)

IMViC /LST broth (E. coli:++-- หรอ -+--/+)

คานวณ

รายงานผล (จานวน E. coli)

146

146



แผนภมท4การตรวจหา(detection)coliformsและE. coli ในอาหาร



ตวอยางเจอจางอยางนอย 3 ระดบตดตอกน (เชน 1:10, 1:100 และ 1:1,000)

LST broth* ระดบความเจอจางละ 3 หลอดๆ ละ 1 มลลลตร 35oC 24 ± 2 ถง 48 ± 3 ชวโมง

อานผลการเกดกาซ


รายงานผล (ไมพบ coliforms หรอ E. coli) BGLB broth EC broth**

35oC 48 3 ชวโมง 45.5oC 24-48 ชวโมง (44.5oC :shellfish) อานผลการเกดกาซ ผลบวก รายงานผล L-EMB agar (พบหรอไมพบ coliforms) 35oC 18-24 ชวโมง

ยอมสแกรม (แกรมลบ รปทอนสน)

IMViC/ LST broth (E. coli : ++-- หรอ -+-- / +)

รายงานผล (พบหรอไมพบ E. coli)

* กรณตรวจ E. coli ในอาหารแชเยน/แชแขง (ไมรวมหอย 2 ฝา) ใช LST - MUG broth ได ** กรณตรวจ E. coli ในเนอหอย เรมตนวเคราะห โดยใช EC-MUG broth ได ทง 2 กรณตองตรวจขนสมบรณ (completed phase)

147



ตารางMPN

ตารางท1 ค า MPN และ Confidence limits สาหรบผลบวกและผลลบ เมอใช ตวอย าง

0.1,0.01,0.001กรมจานวน3หลอดตอระดบการเจอจาง

Positivetubes

MPN/g

Confidence Positivetubes

MPN/g

Confidence limits limits

0.1 0.01 0.001 Low High 0.1 0.01 0.001 Low High

0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42

0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94

0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94

0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94

0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94

0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94

1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110

1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180

1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180

1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200

1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420

1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420

1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420

1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420

2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430

2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000

2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000

2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000

2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100

2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 --

148


ตารางMPN

ตารางท2 คาMPNและConfidencelimitsสาหรบผลบวกและผลลบเมอใชตวอยาง0.1,0.01,0.001

กรมจานวน5หลอดตอระดบการเจอจาง

Positivetubes

MPN/g


MPN/g


0.1 0.01 0.001 Low High 0.1 0.01 0.001 Low High

0 0 0 <1.8 -- 6.8 2 3 0 12 4.1 26

0 0 1 1.8 0.09 6.8 2 3 1 14 5.9 36

0 1 0 1.8 0.09 6.9 2 4 0 15 5.9 36

0 1 1 3.6 0.7 10 3 0 0 7.8 2.1 22

0 2 0 3.7 0.7 10 3 0 1 11 3.5 23

0 2 1 5.5 1.8 15 3 0 2 13 5.6 35

0 3 0 5.6 1.8 15 3 1 0 11 3.5 26

1 0 0 2 0.1 10 3 1 1 14 5.6 36

1 0 1 4 0.7 10 3 1 2 17 6 36

1 0 2 6 1.8 15 3 2 0 14 5.7 36

1 1 0 4 0.7 12 3 2 1 17 6.8 40

1 1 1 6.1 1.8 15 3 2 2 220 6.8 40

1 1 2 8.1 3.4 22 3 3 0 17 6.8 40

1 2 0 6.1 1.8 15 3 3 1 21 6.8 40

1 2 1 8.2 3.4 22 3 3 2 24 9.8 70

1 3 0 8.3 3.4 22 3 4 0 21 6.8 40

1 3 1 10 3.5 22 3 4 1 24 9.8 70

1 4 0 11 3.5 22 3 5 0 25 9.8 70

2 0 0 4.5 0.79 15 4 0 0 13 4.1 35

2 0 1 6.8 1.8 15 4 0 1 17 5.9 36

2 0 2 9.1 3.4 22 4 0 2 21 6.8 40

2 1 0 6.8 1.8 17 4 0 3 25 9.8 70

2 1 1 9.2 3.4 22 4 1 0 17 6 40

2 1 2 12 4.1 26 4 1 1 21 6.8 42

149



Positivetubes

MPN/g


MPN/g


0.1 0.01 0.001 Low High 0.1 0.01 0.001 Low High

4 2 0 22 6.8 50 5 2 1 70 22 170

4 2 1 26 9.8 70 5 2 2 94 34 230

4 2 2 32 10 70 5 2 3 120 36 250

4 2 3 38 14 100 5 2 4 150 58 400

4 3 0 27 9.9 70 5 3 0 79 22 220

4 3 1 33 10 70 5 3 1 110 34 250

4 3 2 39 14 100 5 3 2 140 52 400

4 4 0 34 14 100 5 3 3 180 70 400

4 4 1 40 14 100 5 3 4 210 70 400

4 4 2 47 15 120 5 4 0 130 36 400

4 5 0 41 14 100 5 4 1 170 58 400

4 5 1 48 15 120 5 4 2 220 70 440

5 0 0 23 6.8 70 5 4 3 280 100 710

5 0 1 31 10 70 5 4 4 350 100 710

5 0 2 43 14 100 5 4 5 430 150 1100

5 0 3 58 22 150 5 5 0 240 70 710

5 1 0 33 10 100 5 5 1 350 100 1100

5 1 1 46 14 120 5 5 2 540 150 1700

5 1 2 63 22 150 5 5 3 920 220 2600

5 1 3 84 34 220 5 5 4 1600 400 4600

5 2 0 49 15 150 5 5 5 >1600 700 --

151



วธนใชในการตรวจวเคราะหClostridium botulinum ในอาหารครอบคลมการตรวจหา(detection)


U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2001; Chapter 17

“Clostridium botulinum”. [ออนไลน]. 2001 [สบคน 20 กมภาพนธ 2558] เขาถงไดท

http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-17.html


3.1 C. botulinum = Clostridium botulinum

3.2 Proteolyticbacteria = แบคทเรยทสามารถยอยโปรตนใหเปนกรดอะมโน

3.3 Nonproteolyticbacteria = แบคทเรยทไมสามารถยอยโปรตน


C. botulinum เปนแบคทเรยทไมตองการออกซเจนในการเจรญ(strictanaerobe)ตดสแกรมบวก

รปทอนสรางสปอรคอนไปทางปลายเซลลพบไดในดนนาและสงแวดลอมทวไปสปอรสามารถ

ทนตอความรอนทาใหสปอรยงคงหลงเหลออยในอาหารทผลตโดยใชความรอนไมเพยงพอ

เมอมสภาวะทเหมาะสม สปอรจะงอกเจรญเปน vegetative cell และสรางสารพษทเรยก

botulinal toxinAntigenic typeของ C. botulinum แบงเปน typeA,B,C,D,E, FและG

การตรวจหา(detection)แบงเปน3ขนตอนดงน

4.1 การเพมปรมาณเชอ(enrichment)ใชอาหารเลยงเชอcookedmeatmediumหรอchopped

liver broth สาหรบ C. botulinum สายพนธ proteolytic และใช trypticase-peptone-

glucose-yeastextractbrothสาหรบสายพนธnonproteolytic

4.2 การแยกเชอ(isolation)บนอาหารเลยงเชอชนดแขง

4.3 การตรวจยนยน(confirmation)นาโคโลนทมลกษณะเฉพาะตรวจยนยน

DMScF2017: วธตรวจวเคราะหClostridium botulinum ในอาหาร

AnalyticalmethodofClostridium botulinum infood

152


5. อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents): ภาคผนวก1


5.1.1 Anaerobic egg yolk agar

5.1.2 Chopped liver broth

5.1.3 Cookedmeatmedium(CMM)

5.1.4 Gel-phosphate buffer, pH 6.2

5.1.5 Liver-veal-egg yolk agar

5.1.6 Trypticase-peptone-glucose-yeastextractbroth(TPGY)

5.1.7 Trypticase-peptone-glucose-yeastextractbrothwithtrypsin(TPGYT)


5.2.1 Absolute ethanol


5.2.3 Trypsin(เตรยมจากDifco1:250)



6.1.1 ตอบเพาะเชอแบบไรอากาศ(anaerobicincubator)35C



6.1.4 ตอบเพาะเชอ(incubator)28Cและ35C



6.2 อปกรณ

6.2.1 แผนกระจกทบหนา(coverslip)




6.2.5 โกรงและทบด(mortarandpestle)



153


6.2.8 หลอดฝาเกลยว(screw-captube)

6.2.9 ถงตผสมอาหาร(stomacherbag)

6.2.10ตะแกรงหลอดทดลอง(testtuberack)



7.1.1 กรณทตวอยางเปนของแขงตดตวอยางจากหลายๆตาแหนงใหเปนชนเลกๆผสม

ใหเขากนกรณทตวอยางเปนของเหลวขนหนดเขยาใหทว สมตวอยางตามปรมาณ

ทตองการใสในภาชนะปราศจากเชอ

7.1.2 กรณทตวอยางเปนของเหลว เขยาตวอยางในแตละภาชนะบรรจใหเขากน เทหรอ

ปเปตตวอยางจากแตละภาชนะปรมาตรเทาๆ กน ใสในภาชนะปราศจากเชอ

ตามปรมาตรทตองการและเขยาใหเขากน

7.2 การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)

นาตวอยางอาหารจากขอ 7.1.1 โดยไมใหมสวนของของเหลวหรอมนอยทสดใสในโกรง

ปราศจากเชอเตม gel-phosphate buffer ในปรมาตรทเทากนบดดวยทบดปราศจากเชอ

หรอใสตวอยางในถงตผสมอาหารเตม gel-phosphate buffer ในปรมาตรทเทากนผสม

ใหเปนเนอเดยวกนโดยการตถงผสมอาหารดวยมอ หรออาจใชปากคบปราศจากเชอ

คบตวอยางชนเลกๆ จากขอ 7.1.1หรอปเปตตวอยางจากขอ 7.1.2 ใสในหลอดอาหาร

เลยงเชอโดยตรง

7.3 ขนตอนการเพมปรมาณเชอ(Enrichment)

อาหารเลยงเชอในขนตอนนตองตมไลอากาศ 10-15นาท แลวทาใหเยนลงอยางรวดเรว

กอนใชงานหามเขยา

7.3.1 เตมตวอยางอาหารแขง 1-2 กรมหรอปเปตตวอยางอาหารเหลว 1-2 มลลลตร

หรอตวอยางจากขอ7.2ใสในCMMปรมาตร15มลลลตร2หลอดและTPGY

2หลอดปลอยตวอยางชาๆใตผวหนาอาหารเลยงเชอใหตวอยางอยบรเวณกนหลอด

ถาสงสยวาเปนเชอสายพนธ nonproteolyticชนดB, Eหรอ Fอาจใช TPGYT

แทนTPGY

7.3.2 บมCMMท35C5วนและTPGYหรอTPGYTท28C5วน

7.3.3 นาหลอดจากขอ 7.3.2 มาตรวจสอบความขนกาซกลนการยอยของเนออาหาร

เลยงเชอและยอมสแกรมหรอทาwetmountถาเปนC. botulinumตดสแกรมบวก

154


รปทอนสรางสปอรคอนไปทางปลายเซลลทาใหเซลลมรปรางคลายไมเทนนส

ถาไมพบการเจรญของเชอใหบมเพมอก10วน

7.4 ขนตอนการแยกเชอ(isolation)ม2ขนตอน

7.4.1 Pre-treatmentofspecimensforstreakingทาได2วธ

7.4.1.1 ใช absolute ethanol ททาใหปราศจากเชอ (โดยการกรอง)ปเปต1หรอ

2มลลลตรจากenrichmentcultureขอ7.3.3ใสในหลอดฝาเกลยวปราศจาก

เชอหรอกรณตองการแยกเชอจากตวอยางอาหารโดยตรงใหนาตวอยาง

1หรอ2มลลลตรหรอกรมจากขอ7.1.1หรอ7.1.2ใสในหลอดฝาเกลยว

ปราศจากเชอ เตม absolute ethanol ในปรมาตรทเทากนผสมใหเขากน

บมทอณหภมหอง1ชวโมง

7.4.1.2 ใชความรอน(เปนวธทางเลอก)โดยปเปต1หรอ2มลลลตรจากenrichment

culture ขอ 7.3.3หรอกรณตองการแยกเชอจากตวอยางอาหารโดยตรง

ใหนาตวอยาง 1หรอ 2มลลลตรหรอกรมจากขอ 7.1.1หรอ 7.1.2 ให

ความรอน 80 C 10-15นาท เพอทาลาย vegetative cell (ไมใชวธนกบ

C. botulinum สายพนธnonproteolytic)

7.4.2 Plating of treated cultures นาเชอ (จากขอ 7.4.1.1 หรอ 7.4.1.2) ขดบน

liver-veal-eggyolkagarหรอanaerobiceggyolkagarหรอทงสองชนดหากจาเปน

ใหเจอจางปรมาณเชอเพอแยกใหไดโคโลนเดยว

7.4.3 บมท35C48ชวโมงในสภาวะไรออกซเจน

7.4.4 เลอกโคโลนทสงสยประมาณ 10 โคโลนทมสเหลองออนเหลอบเหมอนไขมก

(pearlylayer)นนหรอแบนผวเรยบหรอหยาบโดยทวไปโคโลนแผกระจายลกษณะ

ขอบไมเรยบนอกจากpearlyzoneแลวโคโลนของ C. botulinum typeC,Dและ

E จะลอมรอบดวยโซนสเหลองขนขนาด 2-4 มลลเมตรสวน typeA และB

จะมโซนขนาดเลกกวา

7.5 ขนตอนการตรวจยนยน(Confirmation)

เมอพบลกษณะโคโลนทสงสยใหสงตรวจยนยนทสถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข

กรมวทยาศาสตรการแพทยกระทรวงสาธารณสขหรอสถาบนอนทเชอถอได

155



C. botulinum/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)พบหรอไมพบ


9.1 ภาคผนวก1:อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)

9.2 ภาคผนวก2:แผนภมการตรวจหา(detection)C. botulinum ในอาหาร

156



อาหารเลยงเชอและสารเคม

(Culturemediaandreagents)


1. Anaerobic egg yolk agar

1.1 Base medium





Agar 20 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรฆาเชอท 121 C 15นาท

pH 7.0 ± 0.2

1.2 50% Egg yolk emulsion

ลางเปลอกไขใหสะอาดแชใน70%ethanol 1 ชวโมงตอกไขดวยวธ aseptic technique

นาสวนของไขแดงใสในภาชนะปราศจากเชอ ผสม sterile 0.85% saline ในปรมาตร

ทเทากน


เตม50%Eggyolkemulsion(ขอ1.2)80มลลลตรลงในbasemedium(ขอ1.1)1,000

มลลลตรผสมใหเขากนเทลงจานเพาะเชอตามปรมาตรทตองการ

2. Chopped Liver Broth

Freshbeefliver 500 กรม



Solublestarch 1 กรม


157


นาตบบดใสนาตมจนเดอดและเคยวนาน1ชวโมงทาใหเยนแลวปรบpH7.0และตมเดอด

อก 10นาท กรองผานผา (cheesecloth) บบเอานาออก และเตมสวนประกอบอนปรบ

pH7.0เตมนากลนหรอนากรองจนปรมาตรครบ1,000มลลลตรกรองผานกระดาษกรอง

ชนดหยาบแยกเกบสวนนา (broth) และเนอในตแชแขง เมอตองการใชนาสวนเนอใส

ในหลอดขนาด18× 150หรอ 20× 150มลลเมตรใหสง 1.2-2.5 เซนตเมตร เตมสวน

นา(broth)10-12มลลลตรฆาเชอท121C15นาท

3. Cookedmeatmedium(CMM)

Beefheart 454 กรม



NaCl 5 กรม


ใส CMM 1.8 กรมในหลอดทดลองฝาเกลยว เตมนากลนหรอนากรอง 15 มลลลตร


4. Gel-phosphate buffer, pH 6.2

Gelatin 2 กรม

Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) 4 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรองโดยคอยๆ ใชความรอนฆาเชอท 121 C

20นาทpH6.2

158


5. Liver-veal-egg-yolk agar

5.1 Base medium

Fresheggs,yolksonly 2หรอ3 กรม

Livervealagar 48.5 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง500มลลลตรดวยความรอนฆาเชอท121 C

15นาททาใหไดอณหภม50C

5.2 50% Egg yolk emulsion

ลางเปลอกไขใหสะอาดแชใน70%ethanol 1 ชวโมงตอกไขดวยวธ aseptic technique

นาสวนของไขแดงใสในภาชนะปราศจากเชอ ผสม sterile 0.85% saline ในปรมาตร

ทเทากน


เตม 50%Egg yolk emulsion (ขอ 5.2) 40 มลลลตร ลงใน basemedium (ขอ 5.1)

500 มลลลตร ผสมใหเขากน เทลงจานเพาะเชอตามปรมาตรทตองการ ทาผวหนา

อาหารเลยงเชอใหแหงทอณหภมหอง2วนหรอทอณหภม35C24ชวโมง

6. Trypticase-peptone-glucose-yeastextractbroth(TPGY)

Trypticase 50 กรม

Peptone 5 กรม



Sodiumthioglycollate 1 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรแบงใสหลอด15มลลลตร

ฆาเชอท121C10นาทpH7.0± 0.2เกบท5C

159


7. Trypticase-peptone-glucose-yeastextractbrothwithtrypsin(TPGYT)

7.1 Base medium

Trypticase 50 กรม

Peptone 5 กรม



Sodiumthioglycollate 1 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตรแบงใสหลอด15มลลลตร

ฆาเชอท121C10นาทpH7.0± 0.2เกบท5Cเตมtrypsinกอนใชงาน

7.2 Trypsin solution

Trypsin(1:250) 1.5 กรม


คน trypsin ในนากลนหรอนากรองปลอยใหนอนกน กรองสวนใสผานแผนกรอง

(membranefilter)ทมร(poresize)ขนาด0.45µm


กอนใชงานตมไลอากาศBasemedium 10 นาท เตม trypsin 1 มลลลตรใน broth

15มลลลตรหรอ6.7มลลลตรในbroth100มลลลตร


1. Absoluteethanol ใชชนดสาเรจรป

2. Gramstainreagents ใชชนดสาเรจรป

3. Trypsin(1:250) ใชชนดสาเรจรป

160



แผนภมการตรวจหา(detection)C. botulinum ในอาหาร



ตวอยางอาหารแขง + gel phosphate buffer ในปรมาตรทเทากน ตวอยางอาหารเหลว 1-2 มลลลตร 1-2 มลลลตร

CMM TPGY CMM TPGY 35oC 5 วน 28oC 5 วน 35oC 5 วน 28oC 5 วน

บม 5 วน หรอเพมอก 10 วนตรวจสอบความขน การเกดกาซ กลน

การยอยสลายของเนออาหารและยอมสแกรม (C. botulinum ตดสแกรมบวก รปทอน สรางสปอรคอนไปทางปลายเซลลทาใหเซลลมรปรางคลายไมเทนนส)

Treat ดวย absolute ethanol หรอใชความรอน

ขดบน liver-veal-egg-yolk agar หรอ anaerobic egg yolk agar

Ano2 35oC 48 ชวโมง โคโลนทสงสย [สเหลองออนเหลอบเหมอนไขมก (pearly layer) นนหรอแบน ผวเรยบหรอหยาบโดยทวไปโคโลนแผกระจาย ลกษณะขอบไมเรยบ นอกจาก pearly zone แลวโคโลนของ C. botulinum type C, D และ E จะลอมรอบดวยโซนสเหลองขนขนาด 2-4 มลลเมตร สวน type A และ B จะมโซนขนาดเลกกวา]

สงตรวจยนยนทสถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทยหรอสถาบนอนทเชอถอได

160

161



วธนใชในการตรวจวเคราะหจลนทรยเจรญท 35 Cและ55 CรวมทงClostridium botulinum

ในอาหารชนดทมความเปนกรดตาครอบคลมการตรวจหา(detection)

2. เอกสารอางอง(Normativereference)

U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2001, Chapter 21A

“ExaminationofCannedFoods”.[ออนไลน].2001[สบคน20กมภาพนธ2558]. เขาถงไดท

http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109398.htm


อาหารในภาชนะบรรจทปดสนท = อาหารทผานกรรมวธทใชทาลายหรอยบยงการขยายพนธ

ของจลนทรยดวยความรอนภายหลงหรอกอนการบรรจ

หรอปดผนกซงเกบรกษาไวในภาชนะบรรจทปดสนท

ทเปนโลหะหรอวตถอนทคงรปทสามารถปองกนมให

อากาศภายนอกเขาไปในภาชนะบรรจไดและสามารถ

เกบรกษาไวไดในอณหภมปกต เชนกระปอง (can)

รทอรทเพาซ(retortpouch)ขวดแกวฯลฯ

อาหารชนดทมความเปนกรดตา = อาหารทมคาความเปนกรด-เบสมากกวา 4.6และคา

ปรมาณนาอสระ(wateractivity,aw)มากกวา0.85

Thermophilicanaerobes = จลนทรยเจรญไดทอณหภมสงในสภาพไมมออกซเจน

Flat =ลกษณะปกตของกระปองทฝาทงสองดานเวาเขาขางใน

เมอกดฝากระปองบนพนแขงและเรยบยงคงสภาพเดม

DMScF2018: วธตรวจวเคราะหอาหารในภาชนะบรรจทปดสนทชนดทม

ความเปนกรดตา

Analyticalmethodoflow-acidcannedfoods

162


Flipper = ลกษณะการบวมของกระปองทมสภาพปกต (flat)

เมอกดฝาดานใดดานหนงอกดานจะโปงออก เมอกด

ดานทโปงกระปองจะกลบคนสภาพปกต

Springer = ลกษณะการบวมของกระปองทฝาดานหนงบวมแบบ

ถาวรเมอกดฝาดานนจะยบเขา แตดานตรงขามจะ

โปงออก

Softswell = ลกษณะการบวมของกระปองทฝาบวมทงสองดาน

แตไมแนนมาก เมอกดฝาจะยบตวลงพอปลอยมอฝา

จะบวมเชนเดม

Hardswell = ลกษณะการบวมของกระปองทฝาบวมทงสองดาน

และแนนมากเมอกดฝาจะไมยบตวลงตะเขบกระปอง

อาจแตกและกระปองอาจระเบดได

C. botulinum = Clostridium botulinum

C. thermobutylicum = Clostridium thermobutylicum

C. sporogenes = Clostridium sporogenes

C. perfringens = Clostridium perfringens

C. thermosaccolyticum = Clostridium thermosaccolyticum

B. coagulans = Bacillus coagulans

B. stearothermophilus = Bacillus stearothermophilus

B. thermoacidurans = Bacillus thermoacidurans


อาหารในภาชนะบรรจทปดสนทหมายถงอาหารซงสามารถเกบรกษาทอณหภมปกตไดนาน

โดยไมเนาเสย (shelf stable food) แตถากระบวนการฆาเชอดวยความรอนหรอการเกบรกษา

ไมถกตองหรอภาชนะบรรจเกดการรว (leakage)ทาใหจลนทรยทเหลออยหรอปนเปอนเขามา

ภายหลงเจรญเตบโตและทาใหอาหารเนาเสยได การเนาเสยอาจเกดจากจลนทรยหลายชนด

ทงชนดทตองการออกซเจน(aerobe)หรอไมตองการออกซเจน(anaerobe)ซงสามารถเจรญไดท

อณหภม35Cและ/หรอ55C

การตรวจหาม3ขนตอนดงน

163


4.1 อาหารกระปองทมสภาพปกตใหบมท35C14วนถากระปองบวมไมตองบมหรอระหวาง

บมพบกระปองบวมขนใหนาออกจากตบมและวางไวทอณหภมหอง

4.2 สมอาหารจากขอ 4.1 ใสในอาหารเลยงเชอชนดเหลวนาไปบมท 35 Cและ 55 Cตาม

ระยะเวลาทกาหนด

4.3 กรณทพบการเจรญของเชอใหตรวจยนยน

หมายเหตใชอาหารกระปองเปนตวแทนอาหารในภาชนะบรรจทปดสนท



5.1.1 Bromcresolpurpledextrosebroth(BCP)

5.1.2 Choppedliverbrothหรอcookedmeatmedium(CMM)

5.1.3 Liver-vealagar(withouteggyolk)(LVA)

5.1.4 Nutrientagar(NA)


5.2.1 4%Iodinein70%ethanol

5.2.2 Methylenebluestain,crystalvioletหรอGramstainreagents

5.2.3 นาปนใส(limewater)



6.1.1 ตอบเพาะเชอแบบไรอากาศ(anaerobicincubator)35Cและ55C



6.1.4 ตปราศจากเชอ(biosafetycabinet)

6.1.5 ตดดควน(fumehood)

6.1.6 ตอบเพาะเชอ(incubator)35Cและ55C



164


6.2 อปกรณ

6.2.1 ทเปดกระปอง(canopener)

6.2.2 ทเจาะรกระปอง(canpunch)

6.2.3 ผาสะอาดปราศจากเชอ(cleansteriletowel)


6.2.5 หลอดหยดสารละลาย(dropper)


6.2.7 ปากคบ(forceps)


6.2.9 ปากกากนนา(Indelibleinkmarkingpen)




6.2.13 กรรไกร(scissors)

6.2.14 สบหรอนายาทาความสะอาด(soapordetergent)

6.2.15 ชอน(spoon)

6.2.16 กรวยปราศจากเชอ(sterilefunnel)

6.2.17 หลอดทดลอง(testtube)


7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure):ภาคผนวก2

7.1 การเตรยมภาชนะบรรจ(Preparationofcontainer)

7.1.1 ดงฉลากออกเขยนรหสตวอยาง(labcode)ทดานขางภาชนะบรรจ

7.1.2 ตรวจสอบลกษณะภาชนะบรรจ(ปกตหรอผดปกตเชนบวมบบรวซมเปนสนม)

และแบงตามรหส(codenumber)

7.2 การชกตวอยาง(Samplingcancontents)

7.2.1 กรณทพบกระปองบวมแบบ springers, swells และอาจมแบบ flatหรอ flipper

รวมอยดวยใหตรวจวเคราะหทนทพรอมกบกระปองทมลกษณะ flat และ flipper

อกอยางนอย 6 กระปอง (ถาม) และแบงเกบตวอยางกระปองแตละลกษณะ

สารองไว (ถาม) แลวนากระปอง flat และ flipper ทเหลอไปบมท 35 C 14 วน

165


ระหวางบมตองตรวจสอบกระปองเปนระยะๆ ถาพบกระปองผดปกตหรอบวม

มากขนใหจดบนทก เมอบวมจนเปน hard swellหรอไมบวมมากขนสมตวอยาง

ไปเพาะเชอ

7.2.2 กรณทพบกระปองแบบ flat และ flipperแบงเกบตวอยางกระปองสารองไวแลว

นาสวนทเหลอไปบมท35C14วนระหวางบมตองตรวจสอบกระปองเปนระยะๆ

ถาพบกระปองบวมใหทาตามขอ7.2.1กรณไมพบกระปองบวมเมอบมครบกาหนด

นากระปองแบบ flat และ flipper ออกจากตบมนาไปตรวจวเคราะหอยางนอย

6กระปอง(ถาม)อาหารกระปองทปกต(normalcan)ไมจาเปนตองตรวจวเคราะห

ทงหมดหามบมกระปองทอณหภมสงกวา35C

7.3 การเปดกระปอง(Openingthecan)

7.3.1 กรณกระปองบวมแบบhardswells,softswellsและspringers(ถาเปนhardswells

นาไปแชเยนในตเยนกอนเปดกระปอง)

ลางกระปองใหสะอาดดวยสบหรอนายาทาความสะอาดและนา เชดใหแหงดวย

ผาสะอาดปราศจากเชอ

ฆาเชอทฝากระปองดานทจะเปด (ดานทไมมรหส) โดยใช 4% iodine in 70%

ethanol เทราดบนฝาปลอยทงไว 30นาท เชดออกดวยผาสะอาดปราศจาก

เชอหามลนไฟควรหาอปกรณคลมกระปองทบวมมากเชนผาสะอาดปราศจาก

เชอหรอควากรวยปราศจากเชอครอบไวเพราะอาหารในกระปองทอาจมสารพษ

ปนเปอนอยพนกระจายออกมา

ตรวจหาชนดของกาซทเกดขนโดยใชทเจาะรกระปองปราศจากเชอเจาะบรเวณ

ฝา เมอเจาะแลวใหกดทเจาะรคางไวกอนนาหลอดแกวปราศจากเชอมาเกบ

กาซจากบรเวณรทเจาะ จากนนรบจอปากหลอดใกลเปลวไฟถาไดยนเสยง

ระเบดเบาๆ(slightexplosion)แสดงวาพบกาซไฮโดรเจน(H2)แลวหงายหลอด

ตงตรงทนทและเทนาปนใสปรมาณเลกนอยลงไปถาเกดตะกอนสขาวแสดงวา

พบกาซคารบอนไดออกไซด(CO2)

เปดฝากระปองดวยทเปดกระปองปราศจากเชอ แยกใชหนงอนตอกระปอง

(ทาในตปราศจากเชอ)

7.3.2 กรณกระปองแบบflatและflipper

ลางกระปองใหสะอาดดวยสบหรอนายาทาความสะอาดและนา เชดใหแหง

ดวยผาสะอาดปราศจากเชอ

166


เขยากระปองเบาๆเพอใหสวนประกอบอาหารผสมกน

ฆาเชอทฝากระปองดานทจะเปด (ดานทไมมรหส) โดยใช 4% iodine in 70%

ethanol เทราดบนฝาปลอยทงไวอยางนอย 15นาท เชดออกดวยผาสะอาด

ปราศจากเชอและลนไฟทฝากระปองจนสารละลายไอโอดน-เอทานอล

เผาไหมหมด(ทาในตดดควนระวงอยาสดดมควนไอโอดน)



7.4 การสมตวอยาง(Removalofmaterialfortesting)

7.4.1 ปเปตของเหลวหรอใชปากคบ ชอน ทปราศจากเชอนาอาหารทเปนของแขง

จากบรเวณจดกงกลางของกระปองใสหลอดอาหารเลยงเชอ เพอนาไปวเคราะห

ตามขอ7.5.2หลงจากนนนาอาหารอยางนอย30มลลลตร(กรม)หรอถามปรมาณ

นอยใหเกบทเหลอทงหมด ใสขวดแกวปราศจากเชอไวทต เยนประมาณ 4 C

เพอนามาวเคราะหซา

7.4.2 บนทกลกษณะทวไปความคงตว (consistency) ส กลนของอาหาร และลกษณะ

พนผวภายในกระปองเชนกดกรอนเปนตน

7.5 การตรวจวเคราะหเชอ(Culturalexamination)

7.5.1 ถาสงสยคาความเปนกรด-เบสของตวอยางอาหาร ใหวดคาความเปนกรด-เบส

จากกระปองปกตทเปนตวแทนจานวนหนงกอนดาเนนการตอไป

7.5.2 ส มตวอยางจากแตละกระปองใสในหลอด chopped liver broth หรอ CMM

(กอนใชนาไปตมเดอด 100 C แลวทาใหเยนลงทอณหภมหองทนทเพอไลกาซ

ออกซเจน) และBCPอยางละ 4หลอดๆละ 1-2มลลลตร (ตวอยางของเหลว

หรอตวอยางทมนาเปนสวนประกอบ)หรอ1-2กรม (ตวอยางของแขง)นาไปบม

ตามตารางแลวอานผลตามขอ7.6

167


ตาราง แสดงอาหารเลยงเชอ อณหภม และเวลาบมทใชวเคราะหอาหารทมความเปนกรดตา

(คาความเปนกรด-เบส>4.6)

อาหารเลยงเชอ จานวน อณหภม เวลา

(หลอด) (C) (ชวโมง)

Choppedliverbroth(CMM) 2 35 96-120

Choppedliverbroth(CMM) 2 55 24-72

BCP 2 55 24 - 48

BCP 2 35 96 - 120

7.5.3 การตรวจสอบภายใตกลองจลทรรศนโดยนาตวอยางอาหารทเหลอจากแตละกระปอง

มาปายบนแผนกระจก (direct smear) ปลอยใหแหง (dry) ตรงเซลลโดยผาน

เปลวไฟ (fix) ยอมดวยสmethylene blue, crystal violetหรอGram stain เพอ

ดรปรางและลกษณะของเซลลและนบจานวนเซลลทงหมด/fieldของกลองจลทรรศน

(โดยประมาณ)ถาตวอยางมสวนผสมของนามนใหหยดสารละลายxyleneลงบน

warm-fixed filmแลวนาไปผานนาไหล(rinse)และยอมสระหวางเตรยมการยอม

ถาตวอยางถกลางออกไปจากแผนกระจก ใหตรวจสอบตวอยางอาหารดวยวธ

wetmountหรอ hanging dropหรอหยด chopped liver brothทปราศจากเชอ

บนแผนกระจกผสมตวอยางอาหารแลวปลอยใหแหง

7.6 การอานผลการเจรญของเชอ(Culturalfindings)ในCMMและBCP

7.6.1 ตรวจสอบการเจรญของเชอเปนระยะๆจนครบเวลาบมตามตาราง

7.6.2 กรณไมพบการเจรญของเชอ (CMMและBCP ไมเปลยนแปลง) ใหรายงานผล

กรณพบการเจรญของเชอนาเชอมาขดบนLVA (ไมผสมไขแดง)หรอNAagar

2จานเพาะเชอแยกบมทสภาวะAnO2 และO2ตามอณหภมทพบการเจรญของเชอ

ดงแผนภมท1(การถายเชอ)

168


7.6.3 กรณไมพบการเจรญของเชอบนLVAหรอNAagarใหรายงานผล

กรณพบการเจรญของเชอบน LVAหรอ NA agar ใหเลอกโคโลนทแตกตาง

ทกลกษณะทาตามแผนภมท1(เชอบรสทธและการแสดงลกษณะ)

แผนภมท1 ขนตอนการเพาะเชอของอาหารทมความเปนกรดตา

169


7.6.4 ถาพบเชอหลายชนด(mixedmicroflora)

เฉพาะในBCPใหรายงานลกษณะรปรางของเชอ

ในCMMพบชนดรปทอนรวมอยดวยใหทดสอบหาสารพษ (botulinal toxin)

ถาพบเฉพาะเชอรปทอน ยอมตดสแกรมบวกหรอGram-variable มลกษณะ

เฉพาะของเชอ Bacillus spp.หรอClostridium spp.ตองตรวจสอบการสราง

สปอรบางกรณ เซลล(vegetativecell)ทแกอาจยอมตดเปนสแกรมลบดงนน

ควรทาการทดสอบหาสารพษเชนเดยวกน

7.7 การแปลผล(Interpretationofresults)

7.7.1 ถาพบเฉพาะแบคทเรยชนดสรางสปอรเจรญท35Cในอาหารกระปองทตะเขบปกต

ไมรวแสดงวาอาหารกระปองผานกรรมวธฆาเชอดวยความรอนไมเพยงพอ

(underprocessing) ในกรณทแบคทเรยทพบนทนความรอนไดเทากบหรอนอยกวา

C. botulinum

7.7.2 การเนาเสยทเกดจากthermophilicanaerobesเชนC. thermobutylicumอาจบงชได

จากการเกดกาซในCMM(55C)และมกลนเนยแขง(cheesyodor)

7.7.3 การเกดกาซและมกลนเหมนเนา(putridodor)ในCMM(35C)และพบเชอรปทอน

สรางสปอรยอมตดสแกรมบวกอาจบงชไดวาเกดการเนาเสยจากเชอC. botulinum,

C. sporogenesหรอC. perfringens ตองทดสอบสารละลายทเพาะเลยงเชอเพอหา

สารพษ (botulinal toxin) ถงแมวาตรวจไมพบสารพษในผลตภณฑอาหาร เพราะ

การตรวจพบสปอร ของC. botulinum แสดงวาอาหารนนอาจเปนอนตรายตอ

ผบรโภค

7.7.4 การเกดกรดในBCP (35 C และ/หรอ 55 C) อาจบงชไดวาเกดการเนาเสยแบบ

flat-sourจากเชอเจรญไดทอณหภมปานกลาง(mesophiles)เชนB. thermoacidurans

หรอB. coagulans และ/หรอทอณหภมสง (thermophiles) เชนB. stearother-

mophilus

7.7.5 ถาอาหารทใสลงไปทาใหอาหารเลยงเชอขนตงแตเรมตนของการเพาะเลยงเชอ

ตองทดสอบหาเชอดวยการถายเชอ(subculture)

170


7.7.6 อาหารกระปองหลายชนดทมเชอเจรญไดทอณหภมสง(thermophiles)และไมเจรญ

ภายใตการเกบรกษาปกตแตเมออณหภมสงขน(50-55C)เชอจะเจรญและทาใหเกด

การเนาเสยเชน B. stearothermophilus ซงทาใหเกดการเนาเสยแบบ flat-sour

การบมท 55 C ไมทาใหสภาพกระปองเปลยนแปลง แตทาใหผลตภณฑมกลน

ผดปกตและคาความเปนกรด-เบสอาจลดลงหรอไมลดลงสาหรบ C. thermosacco-

lyticum เปน thermophilic anaerobesททาใหกระปองบวมและผลตภณฑมกลน

เนยแขง(cheesyodor)

7.7.7 กระปองทไมผานกระบวนการใหความรอนมกปนเปอนดวยเชอทไมสรางสปอร

และเชอสรางสปอรลกษณะการเนาเสยจะเหมอนกรณกระปองรว

7.7.8 ถาพบกลมแบคทเรยมชวตรปทอน (rod) และรปกลม (cocci) บงชวาเกดจาก

กระปองรวหรออาจเกดจากอาหารกระปองไมผานกระบวนการฆาเชอซงกรณน

คาดวาจะพบกระปองบวมในอตราสง

7.7.9 ถาพบกลมแบคทเรยปรมาณมากในอาหารจากการทา direct smear แตไมพบ

การเจรญของเชอ(nogrowth)ในขนตอนการเพาะเชออาจบงชไดวาเกดการเนาเสย

จากแบคทเรยในอาหารกอนการบรรจกระปอง (precanning) อาหารอาจมคา

ความเปนกรด-เบสกลนและลกษณะผดปกต

7.7.10ถาตรวจไมพบการเจรญของเชอในกระปองบวมแสดงวากระปองบวมเนองจาก

กาซไฮโดรเจน(H2)ทเกดขนจากปฏกรยาเคมของอาหารกบผวดานในภาชนะบรรจ

แตถากระปองบวมทเกดจาก thermophilic anaerobes ซงสรางกาซและเซลล

แตกสลายอยางรวดเรวหลงจากเจรญกรณนอาจทาใหสบสนวากระปองบวม

เนองจากกาซไฮโดรเจนนอกจากนการแตกตวทางเคมของอาหารอาจทาใหเกด

กาซคารบอนไดออกไซด(CO2)โดยเฉพาะอาหารทมนาตาลและกรดและปฏกรยา

นถกเรงดวยอณหภมทสงขน

171



8.1 จลนทรยเจรญท 35 C/นาหนกหรอปรมาตร (เชนกรมหรอมลลลตร) พบหรอไมพบ

(รายงานการยอมตดสแกรมรปรางและลกษณะของเชอ)

8.2 จลนทรยเจรญท 55 C/นาหนกหรอปรมาตร (เชนกรมหรอมลลลตร)พบหรอไมพบ

(รายงานการยอมตดสแกรมรปรางและลกษณะของเชอ)

8.3 C. botulinum/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)พบหรอไมพบ

8.4 กาซ(กรณภาชนะบรรจบวมถาพบกาซใหระบชนด)



9.2 ภาคผนวก2: แผนภมท 2 การตรวจหา (detection) จลนทรยเจรญท 35 C และ 55 C

ในอาหารชนดทมความเปนกรดตา

172





1. Bromcresolpurpledextrosebroth(BCP)



Peptone 5 กรม

Bromcresolpurple(1.6%inethanol) 2 มลลลตร


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรแบงใสหลอด12-15มลลลตร

ฆาเชอท121C15นาทpH7.0±0.2

2. Chopped liver broth

Freshbeefliver 500 กรม



Solublestarch 1 กรม


นาตบบดใสนาตมจนเดอดและเคยวนาน1ชวโมงทาใหเยนแลวปรบpH7.0และตมเดอด

อก 10นาท กรองผานผา (cheesecloth) บบเอานาออก และเตมสวนประกอบอนปรบ

pH7.0เตมนากลนหรอนากรองจนปรมาตรครบ1,000มลลลตรกรองผานกระดาษกรอง

ชนดหยาบแยกเกบสวนนา (broth) และเนอในตแชแขงเมอตองการใชนาสวนเนอใส

ในหลอดขนาด18× 150มลลเมตรหรอ20× 150มลลเมตรใหสง1.2-2.5เซนตเมตร

เตมสวนนา(broth)10-12มลลลตรฆาเชอท121C15นาท

173


3. Cookedmeatmedium(CMM)

Beefheart 454 กรม



NaCl 5 กรม


ใสCMM1.25กรมในหลอดขนาด20× 150มลลเมตรเตมนากลนหรอนากรอง10มลลลตร

เขยาผสมใหชนเนอเปยกนาฆาเชอท121 C15นาทpH7.2±0.2กอนใชนาไปตมเดอด

100Cแลวทาใหเยนลงทอณหภมหองทนท(หามเขยาหลอด)

4. Nutrientagar(NA)


Peptone 5 กรม

Agar 15 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร ใหความรอนจนวนละลาย

แบงใสขวดฆาเชอ121C15นาทpH6.8±0.2

5. Liver-vealagar(withouteggyolk)(LVA)

Liver,infusionfrom 50 กรม

Veal,infusionfrom 500 กรม


Neopeptone 1.3 กรม

Tryptone 1.3 กรม


Starch,soluble 10 กรม

174


Casein,isoelectric 2 กรม

NaCl 5 กรม

Sodiumnitrate 2 กรม

Gelatin 20 กรม

Agar 15 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรใหความรอนและ

คนจนวนละลายฆาเชอท121C15นาทpH7.3±0.2


1. 4%Iodinein70%ethanol

Potassiumiodide 10 กรม

Iodine 10 กรม

Ethanol(70%) 500 มลลลตร

2. นาปนใส(limewater)

ปนแดงผสมนา กวนใหเขากนตงทงไว 1 ชวโมงเพอใหตกตะกอนนานาสวนใสดานบน

มาใชนาปนใสหรอสารละลายแคลเซยมไฮดรอกไซดมคณสมบตเปนดาง

3. Crystal violet stain

Crystalviolet(90%dyecontent) 2 กรม



175


4. Methylenebluestain(Loeffler’s)

Solution A

Methyleneblue(90%dyecontent) 0.3 กรม


Solution B

Dilutedpotassiumhydroxide(0.01%) 100 มลลลตร

ผสมsolutionAและB


176



แผนภมท2การตรวจหา(detection)จลนทรยเจรญท35Cและ55Cในอาหารชนดทมความเปนกรดตา

วธมาตรฐานสาหรบการตรวจวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย ตวอยาง กระปองบวม กระปองปกต

Springers Flat Soft swells Flipper Hard swells กระปองบวม กระปองปกต ลางภาชนะบรรจ ลางภาชนะบรรจ และทาใหแหง และทาใหแหง ฆาเชอบรเวณฝากระปอง ฆาเชอบรเวณฝากระปอง ตรวจหากาซ นาตวอยาง 1-2 มลลลตร/กรม ใสอาหารเลยงเชอ บมทอณหภมและเวลาตามตาราง direct smear ไมพบการเจรญของเชอ พบหรอสงสยวามการเจรญของเชอ

รายงานผล ทาตามแผนภมท 1 ขนตอนการเพาะเชอ ของอาหารทมความเปนกรดตา

รายงานผล

บม 35oC 14 วน

177



วธนใชในการตรวจวเคราะหจลนทรยเจรญท 30 C และ 55 C รวมทงยสตและราในอาหาร

ชนดทมความเปนกรดครอบคลมการตรวจหา(detection)


U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2001, Chapter 21A

“ExaminationofCannedFoods”.[ออนไลน].2001[สบคน20กมภาพนธ2558]. เขาถงไดท

http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109398.htm


อาหารในภาชนะบรรจทปดสนท = อาหารทผานกรรมวธทใชทาลายหรอยบยงการขยาย

พนธของจลนทรยดวยความรอนภายหลงหรอกอน

การบรรจหรอปดผนกซงเกบรกษาไวในภาชนะบรรจ

ทปดสนททเปนโลหะหรอวตถอนทคงรปทสามารถ

ปองกนมใหอากาศภายนอกเขาไปในภาชนะบรรจได

และสามารถเกบรกษาไวไดในอณหภมปกต เชน

กระปอง (can) รทอรทเพาซ (retort pouch)ขวดแกว

ฯลฯ

อาหารชนดทมความเปนกรด = อาหารทมคาความเปนกรด-เบสตงแต4.6ลงมา

Flat = ลกษณะปกตของกระปองทฝาทงสองดานเวาเขาขางใน

เมอกดฝากระปองบนพนแขงและเรยบยงคงสภาพเดม

DMScF2019: วธตรวจวเคราะหอาหารในภาชนะบรรจทปดสนทชนดทม

ความเปนกรด

Analyticalmethodofacidcannedfoods

178


Flipper = ลกษณะการบวมของกระปองทมสภาพปกต (flat)

เมอกดฝาดานใดดานหนงอกดานจะโปงออก เมอกด

ดานทโปงกระปองจะกลบคนสภาพปกต

Springer = ลกษณะการบวมของกระปองทฝาดานหนงบวม

แบบถาวรเมอกดฝาดานนจะยบเขา แตดานตรงขาม

จะโปงออก

Softswell = ลกษณะการบวมของกระปองทฝาบวมทงสองดาน

แตไมแนนมาก เมอกดฝาจะยบตวลงพอปลอยมอฝา

จะบวมเชนเดม

Hardswell = ลกษณะการบวมของกระปองทฝาบวมทงสองดาน

และแนนมากเมอกดฝาจะไมยบตวลงตะเขบกระปอง

อาจแตกและกระปองอาจระเบดได

B. thermoacidurans = Bacillus thermoacidurans

C. thermosaccolyticum = Clostridium thermosaccolyticum

C. pasteurianum = Clostridium pasteurianum


อาหารในภาชนะบรรจทปดสนทหมายถง อาหารซงสามารถเกบรกษาทอณหภมปกตไดนาน

โดยไมเนาเสย (shelf stable food) แตถากระบวนการฆาเชอดวยความรอนหรอการเกบรกษา

ไมถกตองหรอภาชนะบรรจเกดการรว (leakage)ทาใหจลนทรยทเหลออยหรอปนเปอนเขามา

ภายหลงเจรญเตบโตและทาใหอาหารเนาเสยได การเนาเสยอาจเกดจากจลนทรยหลายชนด

ทงชนดทตองการออกซเจน(aerobe)หรอไมตองการออกซเจน(anaerobe)ซงสามารถเจรญไดท

อณหภม30Cและ/หรอ55C

การตรวจหาม3ขนตอนดงน

4.1 อาหารกระปองทมสภาพปกตใหบมท 35 C 14 วน ถากระปองบวมไมตองบมหรอ

ระหวางบมพบกระปองบวมขนใหนาออกจากตบมและวางไวทอณหภมหอง

4.2 ส มอาหารจากขอ 4.1 ใสในอาหารเลยงเชอชนดเหลว นาไปบมท 30 C และ 55 C

ตามระยะเวลาทกาหนด

4.3 กรณทพบการเจรญของเชอใหตรวจยนยน

หมายเหตใชอาหารกระปองเปนตวแทนอาหารในภาชนะบรรจทปดสนท

179




5.1.1 Acid broth

5.1.2 Malt extract broth

5.1.3 Nutrientagar(NA)

5.1.4 Sabouraud’sdextroseagar(SAB)


5.2.1 4%Iodinein70%ethanol(สารละลายไอโอดน-เอทานอล)

5.2.2 Methylenebluestain,crystalvioletหรอGramstainreagents

5.2.3 นาปนใส(limewater)





6.1.3 ตปราศจากเชอ(biosafetycabinet)

6.1.4 ตดดควน(fumehood)

6.1.5 ตอบเพาะเชอ(incubator)30C,35Cและ55C



6.2 อปกรณ

6.2.1 ทเปดกระปอง(canopener)

6.2.2 ทเจาะรกระปอง(canpunch)

6.2.3 ผาสะอาดปราศจากเชอ(cleansteriletowel)


6.2.5 หลอดหยดสารละลาย(dropper)


180


6.2.7 ปากคบ(forceps)


6.2.9 ปากกากนนา(Indelibleinkmarkingpen)

6.2.10หวงและเขมเขยเชอ(loopandneedle)

6.2.11จานเพาะเชอ(petridish)

6.2.12ปเปต(pipette)

6.2.13กรรไกร(scissors)

6.2.14สบหรอนายาทาความสะอาด(soapordetergent)

6.2.15ชอน(spoon)

6.2.16กรวยปราศจากเชอ(sterilefunnel)

6.2.17หลอดทดลอง(testtube)

6.2.18ตะแกรงหลอดทดลอง(testtuberack)

7. ขนตอนการทดสอบ(Procedure):ภาคผนวก2

7.1 การเตรยมภาชนะบรรจ(Preparationofcontainer)

7.1.1 ดงฉลากออกเขยนรหสตวอยาง(labcode)ทดานขางภาชนะบรรจ

7.1.2 ตรวจสอบลกษณะภาชนะบรรจ(ปกตหรอผดปกตเชนบวมบบรวซมเปนสนม)

และแบงตามรหส(codenumber)

7.2 การชกตวอยาง(Samplingcancontents)

7.2.1 กรณทพบกระปองบวมแบบ springers, swells และอาจมแบบ flatหรอ flipper

รวมอยดวย ใหตรวจวเคราะหทนทพรอมกบกระปองทมลกษณะ flatและ flipper

อกอยางนอย 6 กระปอง (ถาม) และแบงเกบตวอยางกระปองแตละลกษณะ

สารองไว (ถาม) แลวนากระปอง flatและ flipperทเหลอไปบมท 35 C 14วน

ระหวางบมตองตรวจสอบกระปองเปนระยะๆ ถาพบกระปองผดปกตหรอบวม

มากขนใหจดบนทกเมอบวมจนเปนhardswellหรอไมบวมมากขนสมตวอยางไป

เพาะเชอ

181


7.2.2 กรณทพบกระปองแบบ flat และ flipperแบงเกบตวอยางกระปองสารองไวแลว

นาสวนทเหลอไปบมท35C14วนระหวางบมตองตรวจสอบกระปองเปนระยะๆ

ถาพบกระปองบวมใหทาตามขอ7.2.1กรณไมพบกระปองบวมเมอบมครบกาหนด

นากระปองแบบ flat และ flipper ออกจากตบมนาไปตรวจวเคราะหอยางนอย

6กระปอง(ถาม)อาหารกระปองทปกต(normalcan)ไมจาเปนตองตรวจวเคราะห

ทงหมดหามบมกระปองทอณหภมสงกวา35C

7.3 การเปดกระปอง(Openingthecan)

7.3.1 กรณกระปองบวมแบบhardswells,softswellsและspringers(ถาเปนhardswells

นาไปแชเยนในตเยนกอนเปดกระปอง)

ลางกระปองใหสะอาดดวยสบหรอนายาทาความสะอาดและนาเชดใหแหงดวย


ฆาเชอทฝากระปองดานทจะเปด(ดานทไมมรหส)โดยใชสารละลายไอโอดน-

เอทานอลเทราดบนฝาปลอยทงไว30นาทเชดออกดวยผาสะอาดปราศจากเชอ

หามลนไฟควรหาอปกรณคลมกระปองทบวมมากเชนผาสะอาดปราศจากเชอ

หรอควากรวยปราศจากเชอครอบไวเพราะอาหารในกระปองทอาจมสารพษ

ปนเปอนอยพนกระจายออกมา

ตรวจหาชนดของกาซทเกดขนโดยใชทเจาะรกระปองปราศจากเชอเจาะ

บรเวณฝา เมอเจาะแลวใหกดทเจาะรคางไวกอนนาหลอดแกวปราศจากเชอ

มาเกบกาซจากบรเวณรทเจาะจากนนรบจอปากหลอดใกลเปลวไฟถาไดยนเสยง

ระเบดเบาๆ(slightexplosion)แสดงวาพบกาซไฮโดรเจน(H2)แลวหงายหลอด

ตงตรงทนทและเทนาปนใสปรมาณเลกนอยลงไปถาเกดตะกอนสขาวแสดงวา

พบกาซคารบอนไดออกไซด(CO2)



182


7.3.2 กรณกระปองแบบflatและflipper

ลางกระปองใหสะอาดดวยสบหรอนายาทาความสะอาดและนาเชดใหแหงดวย


เขยากระปองเบาๆเพอใหสวนประกอบอาหารผสมกน

ฆาเชอทฝากระปองดานทจะเปด(ดานทไมมรหส)โดยใชสารละลายไอโอดน-

เอทานอล เทราดบนฝาปลอยทงไวอยางนอย 15นาท เชดออกดวยผาสะอาด

ปราศจากเชอและลนไฟทฝากระปองสารละลายไอโอดน-เอทานอลเผาไหมหมด

(ทาในตดดควนระวงอยาสดดมควนไอโอดน)



7.4 การสมตวอยาง(Removalofmaterialfortesting)

7.4.1 ปเปตของเหลวหรอใชปากคบ ชอน ทปราศจากเชอนาอาหารทเปนของแขง

จากบรเวณจดกงกลางของกระปองใสหลอดอาหารเลยงเชอ เพอนาไปวเคราะห

ตามขอ 7.5.2 หลงจากนนนาอาหารอยางนอย 30 มลลลตร (กรม) หรอถาม

ปรมาณนอยใหเกบทเหลอทงหมด ใสขวดแกวปราศจากเชอไวทตเยนประมาณ

4Cเพอนามาวเคราะหซา

7.4.2 บนทกลกษณะทวไปความคงตว (consistency) ส กลนของอาหาร และลกษณะ

พนผวภายในกระปองเชนกดกรอนเปนตน

7.5 การตรวจวเคราะหเชอ(Culturalexamination)

7.5.1 ถาสงสยคาความเปนกรด-เบสของตวอยางอาหาร ใหวดคาความเปนกรด-เบส

จากกระปองปกตทเปนตวแทนจานวนหนงกอนดาเนนการตอไป

7.5.2 สมตวอยางจากแตละกระปองใสในหลอดacidbroth4หลอดและmaltextractbroth

2หลอดๆ ละ1-2มลลลตร(ตวอยางของเหลวหรอตวอยางทมนาเปนสวนประกอบ)

หรอ1-2กรม(ตวอยางของแขง)นาไปบมตามตารางแลวอานผลตามขอ7.6

183


ตาราง แสดงอาหารเลยงเชอ อณหภม และเวลาบมทใชวเคราะหอาหารทมความเปนกรด

(คาความเปนกรด-เบส ≤ 4.6)

Acid broth 2 55 48

Acid broth 2 30 96

Malt extract broth 2 30 96

จานวน อณหภม เวลา อาหารเลยงเชอ (หลอด) (C) (ชวโมง)

7.5.3 การตรวจสอบภายใตกลองจลทรรศนโดยนาตวอยางอาหารทเหลอจากแตละกระปอง

มาปายบนแผนกระจก (direct smear) ปลอยใหแหง (dry) ตรงเซลลโดยผาน

เปลวไฟ (fix) ยอมดวยสmethylene blue, crystal violetหรอGram stain เพอ

ดรปรางและลกษณะของเซลลและนบจานวนเซลลทงหมด/fieldของกลองจลทรรศน

(โดยประมาณ)ถาตวอยางมสวนผสมของนามนใหหยดสารละลายxyleneลงบน

warm-fixed filmแลวนาไปผานนาไหล(rinse)และยอมสระหวางเตรยมการยอม

ถาตวอยางถกลางออกไปจากแผนกระจก ใหตรวจสอบตวอยางอาหารดวยวธ

wetmountหรอ hanging dropหรอหยด chopped liver broth ทปราศจากเชอ

บนแผนกระจกผสมตวอยางอาหารแลวปลอยใหแหง

7.6 การอานผลการเจรญของเชอ(Culturalfindings)ในacidbrothและmaltextractbroth

7.6.1 กรณไมพบการเจรญของเชอ(อาหารเลยงเชอไมเปลยนแปลง)ใหรายงานผล

7.6.2 กรณพบหรอสงสยวามการเจรญของเชอ(acidbrothขน,maltextractbrothขน/มฝา

หรอพบเชอรา)นามายอมสแบบแกรม บนทกลกษณะรปรางและการตดสของเชอ

กรณตองการแยกเชอบรสทธ ให streakบนNAplateหรอSABplateแยกบมท

สภาวะAnO2 และO2ตามอณหภมทพบการเจรญของเชอดงแผนภมท1(การถายเชอ)

184


แผนภมท1ขนตอนการเพาะเชอของอาหารทมความเปนกรด

185


7.7 การแปลผล(Interpretationofresults)

7.7.1 การเนาเสยของอาหารกระปองทมความเปนกรดโดยทวไปเกดจากแบคทเรยกลม

lactobacilli ซงไมสรางสปอร และยสต มะเขอเทศและนามะเขอเทศกระปอง

ทมลกษณะกระปองปกต (flat) แตผลตภณฑมกลนผดปกต โดยทคาความเปน

กรด-เบสอาจจะลดลงหรอไมลดลงกได เนองจากกลมแบคทเรยทสรางสปอร

ทงaerobicmesophilicและaerobicthermophilicซงการเนาเสยแบบนเปนขอยกเวน

ของผลตภณฑทมคาความเปนกรด-เบสตากวา 4.6ทมความตานทานการเนาเสย

จากกลมแบคทเรยทสรางสปอร

7.7.2 อาหารกระปองหลายชนดทมเชอเจรญไดทอณหภมสง(thermophiles)และไมเจรญ

ภายใตการเกบรกษาปกต แตเมออณหภมสงขน (50-55 C) เชอจะเจรญและทาให

เกดการเนาเสย เชนB. thermoacidurans ซงทาใหเกดการเนาเสยแบบ flat- sour

การบมท 55 C ไมทาใหสภาพกระปองเปลยนแปลง แตทาใหผลตภณฑมกลน

ผดปกตและคาความเปนกรด-เบสอาจจะลดลงหรอไมลดลง การเนาเสยของ

มะเขอเทศแพรมะเดอสบปะรดบางครงเกดจากC. pasteurianum ทสรางกาซ

และกลนกรดบวทรก (butyric odor) สาหรบ C. thermosaccolyticum เปน

thermophilic anaerobes ททาใหกระปองบวม และผลตภณฑมกลนเนยแขง

(cheesyodor)

7.7.3 กระปองทไมผานกระบวนการใหความรอนมกปนเปอนดวยเชอทไมสรางสปอร

และเชอสรางสปอรลกษณะการเนาเสยจะเหมอนกรณกระปองรว

7.7.4 ถาพบกลมแบคทเรยมชวตรปทอน (rod) และรปกลม (cocci) บงชวาเกดจาก

กระปองรวหรออาจเกดจากอาหารกระปองไมผานกระบวนการฆาเชอซงกรณน

คาดวาจะพบกระปองบวมในอตราสง

7.7.5 ถาพบกลมแบคทเรยปรมาณมากในอาหารจากการทา direct smear แตไมพบ

การเจรญของเชอ(nogrowth)ในขนตอนการเพาะเชออาจบงชไดวาเกดการเนาเสย

จากแบคทเรยในอาหารกอนการบรรจกระปอง (precanning) อาหารอาจมคา

ความเปนกรด-เบสกลนและลกษณะผดปกต

186


7.7.6 ถาตรวจไมพบการเจรญของเชอในกระปองบวมแสดงวากระปองบวมเนองจาก

กาซไฮโดรเจน(H2)ทเกดขนจากปฏกรยาเคมของอาหารกบผวดานในภาชนะบรรจ

แตถากระปองบวมทเกดจาก thermophilic anaerobes ซงสรางกาซและเซลล

แตกสลายอยางรวดเรวหลงจากเจรญกรณนอาจทาใหสบสนวากระปองบวมเนองจาก

กาซไฮโดรเจน นอกจากนการแตกตวทางเคมของอาหารอาจทาใหเกดกาซ

คารบอนไดออกไซด (CO2) โดยเฉพาะอาหารทมนาตาลและกรดและปฏกรยาน

ถกเรงดวยอณหภมทสงขน


8.1 แบคทเรยชนดชอบหรอทนกรดเจรญท30C/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)

พบหรอไมพบ

8.2 แบคทเรยชนดชอบหรอทนกรดเจรญท55C/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)

พบหรอไมพบ

8.3 ยสตและรา/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)พบหรอไมพบ



9.2 ภาคผนวก2: แผนภมท 2 การตรวจหา (detection) จลนทรยเจรญท 30 C และ 55 C

ในอาหารชนดทมความเปนกรด

187



อาหารเลยงเชอและสารเคม

(Culturemediaandreagents)


1. Acid broth






ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสหลอดทดลอง

ตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121C15นาทpH5.0±0.2

2. Malt extract broth

Maltextractbase 6 กรม

Maltose,technical 1.8 กรม




ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสหลอดทดลอง

ตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121C15นาทpH4.7±0.2

188


3. Nutrientagar(NA)


Peptone 5 กรม

Agar 15 กรม



แบงใสขวดฆาเชอท121C15นาทpH6.8±0.2

4. Sabouraud’sdextroseagar(SAB)

Polypeptoneorneopeptone 10 กรม


Agar 15-20 กรม



แบงใสขวดฆาเชอท118–121C15นาทpH5.6±0.2


1. 4%Iodinein70%ethanol

Potassiumiodide 10 กรม

Iodine 10 กรม


2. นาปนใส(limewater)

ปนแดงผสมนากวนใหเขากนตงทงไว 1ชวโมงเพอใหตกตะกอนนานาสวนใสดานบนมาใช

นาปนใสหรอสารละลายแคลเซยมไฮดรอกไซดมคณสมบตเปนดาง

189


3. Crystal violet stain

Crystalviolet(90%dyecontent) 2 กรม



4. Methylenebluestain(Loeffler’s)

SolutionA

Methyleneblue(90%dyecontent) 0.3 กรม


SolutionB

Dilutedpotassiumhydroxide(0.01%) 100 มลลลตร

ผสมsolutionAและB


190



แผนภมท2การตรวจหา(detection)จลนทรยเจรญท30Cและ55Cในอาหารชนดทมความเปนกรด

วธมาตรฐานสาหรบการตรวจวเคราะหอาหาร เลมท 3กรมวทยาศาสตรการแพทย ตวอยาง กระปองบวม กระปองปกต

Springers Flat Soft swells Flipper Hard swells กระปองบวม กระปองปกต ลางภาชนะบรรจ ลางภาชนะบรรจ และทาใหแหง และทาใหแหง ฆาเชอบรเวณฝากระปอง ฆาเชอบรเวณฝากระปอง ตรวจหากาซ นาตวอยาง 1-2 มลลลตร/กรม ใสอาหารเลยงเชอ บมทอณหภมและเวลาตามตาราง direct smear ไมพบการเจรญของเชอ พบหรอสงสยวามการเจรญของเชอ

รายงานผล ทาตามแผนภมท 1 ขนตอนการเพาะเชอ ของอาหารทมความเปนกรด

รายงานผล

บม 35oC 14 วน วธมาตรฐานทางชวโมเลกลสาหรบการวเคราะหอาหาร




2. นางนตยาพนธบว นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

3.นางปวณาพานชกล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

4.นางสาวสแพรชชวา นกวทยาศาสตรการแพทยปฏบตการ

บรรณาธการ

5.นางปยมาศแจมศร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

วธมาตรฐานทางชวโมเลกลสาหรบการวเคราะหอาหาร


193


วธมาตรฐานทางชวโมเลกลสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย

Method รหสวธ ชนดอาหาร รายการ หนา Type

DMScF4001 อาหารทมสวนประกอบ การสกดดเอนเอดวยวธCTAB - 195 ของพชดดแปรพนธกรรม พนฐาน

DMScF4002 อาหารทมสวนประกอบ การสกดดเอนเอดวยวธ - 201 ของพชดดแปรพนธกรรม Basicsilicamethod

DMScF4003 อาหารทมสวนประกอบ Qualitativeendogenousgene - 207 ของพชดดแปรพนธกรรม testing:lectin(bymeansof PolymeraseChainReaction)

DMScF4004 อาหารทมสวนประกอบ Qualitativeendogenousgene - 215 ของพชดดแปรพนธกรรม testing:thechloroplasttrnL intron (by means of Polymerase ChainReaction)

DMScF4005 อาหารทมสวนประกอบ Qualitativeendogenousgene - 223 ของพชดดแปรพนธกรรม testing:Invertase(bymeansof PolymeraseChainReaction)

DMScF4006 อาหารทมสวนประกอบ Qualitativeendogenousgene - 231 ของพชดดแปรพนธกรรม testing:hmgA(bymeansof real-time Polymerase ChainReaction)

DMScF4007 อาหารทมสวนประกอบ Screeningmethodforthedetection - 239 ของพชดดแปรพนธกรรม ofgeneticallymodifiedplant DNA: CaMV-35S promoter (by means of Polymerase ChainReaction)

DMScF4008 อาหารทมสวนประกอบ Screeningmethodforthe - 247 ของพชดดแปรพนธกรรม detectionofgeneticallymodified plant DNA: NOS-terminator (by means of Polymerase ChainReaction)

DMScF4009 อาหารทมสวนประกอบ Screeningmethodforthe - 255 ของพชดดแปรพนธกรรม detectionofgeneticallymodified plantDNA:nptII(bymeansof PolymeraseChainReaction)

195



ใชในการสกดดเอนเอดวยวธ CTAB extraction ในตวอยางขาวโพดถวเหลอง และอาหาร

ทมสวนประกอบจากขาวโพดและถวเหลองเหมาะกบตวอยางทเปนmediumถงhighprocessed

food


2.1 ISO24276:2006(E):Foodstuffs–Methodsofanalysisforthedetectionofgenetically

modified organisms and derived products – General requirements and definitions


modified organisms and derived products – Nucleic acid extraction

3. นยามศพทและคายอ(Terminologyandabbreviation)

CTABชอเตมคอHexadecyltrimethylammoniumbromide(cethyltrimethylammoniumbromide)

PCR: Polymerase Chain Reaction


4.1 ทวไป

เปนวธสกดดเอนเอใหไดดเอนเอทมปรมาณและคณภาพดเพยงพอในการนาไปทดสอบ

ในขนตอนตอไป (คณภาพในทนหมายถงปรมาณและความยาวของดเอนเอเปาหมายทม

มากพอสาหรบการวเคราะหหาขนตอไปโดยไมกลาวถงดเอนเอทงจโนม)

4.2 การสกดดเอนเอ

เปนวธการเฉพาะในการสกดดเอนเอจากพชหรออาหารทมสวนประกอบของพชและ

สามารถลดหรอกาจดสารจาพวกโพลแซคคาไรดและสารประกอบโพลฟนอลทมผลกระทบ

ตอคณภาพของดเอนเอซงตองนาไปใชทดสอบในขนตอไปวธนมขนตอนการทาลายผนง

เซลลดวยCTABรวมกบความรอนตามดวยขนตอนการกาจดสารทยบยงปฏกรยาPCR

DMScF4001: การสกดดเอนเอจากตวอยางในอาหารทมสวนประกอบของพช

ดดแปรพนธกรรมดวยวธCTABพนฐาน

196


อกหลายขนตอนการเตมα-amylaseในการสกดอาหารหลายๆชนดจะสามารถชวยยอย

สลายสารจาพวกแปงไดหรอการใสProteinase-Kจะชวยลดปรมาณโปรตนไดนอกจาก

นนแนะนาใหใชRNAse-AในการกาจดRNAออกไปดวยเพราะอาจรบกวนการวเคราะห

ไดความเขมขนเกลอและคลอโรฟอรมมสวนสาคญอยางมากเนองจากDNAจะตกตะกอน

ไดตองมความเขมขนของเกลอตาๆประมาณ 0.5Mและ/หรอทอณหภมตากวา 16ºC

ปรมาณความเขมขนของเกลอทเพมขนจะทาใหโปรตนและpolysaccharidesตกตะกอน

ในขณะท DNA ยงคงละลายอยในนา สวนคลอโรฟอรมจะชวยแยกดเอนเอออกจาก

CTABและสารประกอบโพลแซคคาไรดกบโปรตน

4.3 การวดคาดเอนเอทสกดได

เปนขนตอนทมประโยชนสาหรบการทาPCR เพอทดสอบหายนเปาหมายสามารถทาได

หลายเทคนค คอเทคนคทางฟสกส (เชน วดการดดกลนแสงทความยาวคลนทจาเพาะ)

เทคนคเคม-ฟสกส(เชนใชการแทรกหรอจบกนของดเอนเอกบสารฟลออเรสเซนตทาให

เกดการเรองแสง)การใชเอนไซม (เชนการตรวจวดแสงทางชวภาพ)หรอการวดปรมาณ

โดยวธ PCR เปนวธทเหมาะสมสาหรบตวอยางทมความซบซอนขององคประกอบของ

อาหารตวอยางทมปรมาณดเอนเอนอยๆหรอตวอยางทดเอนเอถกทาลาย


5.1 α-amylase (ในกรณทตองใช) เตรยมเปนสารละลายความเขมขน10mg/ml (โดยละลาย

ในนาทฆาเชอแลวโดยไมตองนงฆาเชอหลงการเตรยมแบงเปนหลอดเลกๆ เกบท –20 C

หลกเลยงการละลายหลายรอบ)

5.2 Chloroform

5.3 Ethanol absolute

5.4 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (Na2EDTA)

5.5 Hexadecyltrimethylammoniumbromide(CTAB)

5.6 Hydrochloric acid 37%

5.7 Isopropanol

5.8 Proteinase-K(ในกรณทตองใช)เตรยมเปนสารละลายความเขมขน20mg/ml(โดยละลาย

ในนาทฆาเชอแลวโดยไมตองนงฆาเชอหลงการเตรยม แบงเปนหลอดเลกๆ เกบท

–20Cหลกเลยงการละลายหลายรอบ)

197


5.9 RNaseA (DNase free),สารละลายความเขมขน10mg/ml (แบงเปนหลอดเลกๆ เกบ

ท–20C)

5.10 Sodium chloride

5.11 Sodium hydroxide

5.12 Tris(hydroxymethyl)-aminomethane(Tris)

5.13 CTAB extraction buffer (CTAB 20 g/l, NaCl 1.4 M, Tris 0.1 M, Na2EDTA0.02M)

ปรบpHใหได8.0ดวยHClหรอNaOH

5.14 CTAB-precipitationbuffer(CTAB5g/l,NaCl0.04M)

5.15Sodiumchloridesolutionความเขมขน1.2M

5.16Ethanolsolutionเตรยมเปน70%

5.17 TE buffer (Tris 0.01 M, Na2EDTA0.0001M)ปรบpHใหได8.0ดวยHClหรอNaOH


6.1 Incubatorควรใชชนดทเขยาได

6.2 Centrifuge(ปนเหวยงไดสงสด12,000g)

6.3 Mixer



7.1.1 ใชตวอยางทดสอบ (test portion) ทเปนตวแทนทเหมาะสมจากตวอยางของ

หองปฏบตการ (Lab sample)ซงในกรณทตองการLOD0.1% ตองใชตวอยาง

ปรมาณไมนอยกวา3,000particles

7.1.2 นาตวอยางของหองปฏบตการทงหมดมาบดปนและคนใหเขากนกอนสมตวอยาง

ทดสอบไปสกดระวงการปนเปอนขณะทาการบดปนหรอเตรยมตวอยาง

7.1.3 ตวอยางทเปนของเหลวใหผสมใหเขากนใหดกอนหรอในกรณทเปนผลตภณฑ

ทตกตะกอนไดใหทาการผสมจนมนใจวาไมมตะกอนตดอยทกนภาชนะ

7.1.4 ตวอยางทเปนของเหนยวขนหรออยในสภาพทบดไดยาก อาจเพมขนตอนชวง

กอนบดหรอกาลงบดไดคอการใหความรอนท 40ºCการละลายนาเพมขนการ

แชแขงท-20ºCหรอตากวา

198


7.1.5 กรณตวอยางมสวนประกอบหลายอยางทสามารถแยกสวนเปาหมายการทดสอบได

เชนขนมปงไสปลาอาจใชการสมแยกเฉพาะสวนทตองการนาไปสกดดเอนเอเทานน

7.2. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)

การเตรยมตวอยางเพอใหไดดเอนเอทมคณภาพดตองมการกาจดหรอลดปรมาณ

การปะปนของสารทมผลตอการสกดดเอนเอดงน

Polysaccharides สามารถกาจดโดยใชเอนไซมทเหมาะสม (เชน pectinase,

α-amylase)หรอการสกดดวยสารอนทรย(เชนCTAB/chloroform)

RNA และ/หรอโปรตน ใชวธทเหมาะสมเชนการใชเอนไซม RNase -A และ

proteinase-Kตามลาดบไขมนใชตวทาละลายเชนn-hexane

เกลอทมในตวอยางสารสกดหรอขนตอนการตกตะกอนมผลตอการทาการวเคราะห

ในขนตอไป จงตองระวงการเหลอตกคาง โดยการปรบ pH ใหไดประมาณ 7.0 กอน

การสกด

7.3 ขนตอนการสกด

7.3.1 ชงตวอยางทดสอบ200–300มลลกรมใสหลอดขนาด2-ml (แตในอาหารทอาจ

มปรมาณดเอนเอนอยหรอเปนดเอนเอทเสยสภาพตองมการใชปรมาณตวอยางมาก

ขนเพอใหมปรมาณดเอนเอทเพยงพอ และมคณภาพเพอทาการวเคราะหตอไป

แตไมแนะนาใหใชปรมาณตวอยางทดสอบมากกวา 2กรมและตองมการคานวณ

ปรมาตรสารตางๆใหเหมาะสมกบปรมาณตวอยางทดสอบทเพมขนดวย)

7.3.2 เตมCTABextraction(5.13)ทใหความรอนไวทอณหภม65Cจานวน1.5มลลลตร

ผสมใหเขากน (ในตวอยางบางชนดอาจตองใช CTAB extraction ในปรมาตร

ทมากกวานเพอใหสามารถผสมกบตวอยางไดทงหมด)

7.3.3 เตมα-amylase 10 ไมโครลตร (5.1) ผสมใหเขากน (กรณทในตวอยางม

polysaccharides)

7.3.4 บมท65Cเปนเวลา30นาทเขยาเปนระยะๆ

7.3.5 เตมproteinase-K10ไมโครลตร(5.8)ผสมใหเขากน(กรณทในตวอยางมโปรตน)

7.3.6 บมท65Cเปนเวลา30นาทเขยาเปนระยะ

7.3.7 เหวยงท 12,000 g เปนเวลา 10 นาท แลวดดสวนใสใสในหลอดขนาด 2-ml

หลอดใหม

199


7.3.8 เตมคลอโรฟอรมในปรมาณ0.7–1เทาของสวนใสทดดออกมา

7.3.9 เขยาใหเขากนนาไปเหวยงท12,000gเปนเวลา15นาท

7.3.10 ดดสวนบน(aqueousphase)ใสหลอดขนาด2-mlหลอดใหม

7.3.11 เตมCTABprecipitate(5.14)ในปรมาณ2เทาของสวนใสทดดออกมา

7.3.12 บมท 65 C เปนเวลา 60นาทโดยไมเขยานาไปปนเหวยงท 12,000 g เปนเวลา

15นาท

7.3.13 เทสวนใสทง

7.3.14ละลายตะกอนดวยสารละลายNaCl(5.15)ปรมาตร350ไมโครลตร

7.3.15เตมคลอโรฟอรม 350 ไมโครลตร เขยาใหเขากนนาไปปนเหวยงท 12,000 g

เปนเวลา10นาท

7.3.16 ดดสวนทเปนaqueousใสหลอดขนาด1.5-mlหลอดใหม

7.3.17 เตม isopropanol (5.7) ในอตราสวน 0.6 เทาของสวนใสทงหมด ผสมโดยการ

พลกหลอด

7.3.18 ตงไวทอณหภมหอง20นาทนาไปปนเหวยงท12,000gเปนเวลา15นาท

7.3.19 เทสวนใสทง

7.3.20 เตมEtOH(5.16)ปรมาตร500ไมโครลตรผสมโดยการพลกหลอด(เปนขนตอน

ทสาคญมากเพอทจะกาจดCTABออกใหหมด)

7.3.21นาไปปนเหวยงท12,000gเปนเวลา10นาทเทสวนใสทง

7.3.22 ละลายตะกอนในนาหรอ buffer ทเหมาะสม เชน TE buffer (5.17) ปรมาตร

100ไมโครลตร

7.3.23เกบดเอนเอนเปนmasterstock


วดปรมาณของดเอนเอทสกดโดยใชSpectrophotometer วดการดดแสงในชวงความยาวคลน

ท 260และ 320 nmคาOD (optical density) วดท 260 nmนามาคานวณคาปรมาณดเอนเอ

โดย 1ODของดเอนเอเสนคและดเอนเอเสนเดยว (ทถกทาใหเสยสภาพโดย 0.2MNaOH)

จะมปรมาณ50ng/µlและ37ng/µlตามลาดบ

200


DNA = F × (OD260 - OD320 )×50

เมอ Fเปนคาdilutionfactor

OD260 คอคาabsorbanceเมอวดทความยาวคลน260nm


50เปนคาconversionfactorของดเอนเอเสนคมหนวยเปนไมโครกรม/มลลลตร

บนทกผลคาความเขมขนทไดเปนng/µl


9.1 สกดตวอยางทดสอบเปนจานวนอยางนอย2sub-sample

9.2 ตองมการควบคมคณภาพในการสกด โดยอยางนอยตองประกอบดวย extraction blank

controlและpositiveextractioncontrolหรอมการทดสอบสภาวะแวดลอมเพมเตมดวย

201


DMScF4002: การสกดดเอนเอจากตวอยางในอาหารทมสวนประกอบของพช

ดดแปรพนธกรรมดวยวธBasicsilicamethod


ใชในการสกดดเอนเอดวยวธ Basic silicamethod ในตวอยางขาวโพด ถวเหลองและอาหาร

ทมสวนประกอบจากขาวโพดและถวเหลองทไมใช high-process food แตไมแนะนาใหใช

กบตวอยางทมไขมนปรมาณมาก


2.1 ISO24276:2006(E):Foodstuffs–Methodsofanalysis for thedetectionofgenetically





PCR:Polymerase Chain Reaction


4.1 ทวไป

เปนขนตอนการสกดเพอใหไดดเอนเอทมปรมาณและคณภาพดเพยงพอในการนาไปทดสอบ

ในขนตอนตอไป (คณภาพในทนหมายถงปรมาณและความยาวของดเอนเอเปาหมายทม

มากพอสาหรบการวเคราะหหาขนตอไปโดยไมกลาวถงดเอนเอทงจโนม)

4.2 การสกดดเอนเอ

เปนการแยกดเอนเอออกจากสวนประกอบอนๆของตวอยางจากพชหรอมสวนประกอบ

ของพช และสามารถใชเปนขนตอนกาจดหรอลดปรมาณสารยบยงปฏกรยา PCR

จากการสกดดเอนเอดวยวธอน

วธนจะมขนตอนการทาลายผนงเซลลโดยใชความรอนรวมกบ Sodium dodecyl

sulfate ในสารละลายบฟเฟอร และทาใหบรสทธโดยใช silica resin ในสารละลายทม

202


guanidine-hydrochlorideดเอนเอจะจบกบsilicaในสภาวะทมwateractivityตาจากนน

จะลางสงอนๆทปะปนอยออกไปโดยใช iso-propanol โดยดเอนเอยงคงตดอยกบ silica

ขนตอนสดทายใชสารละลายทมปรมาณเกลอตาๆละลายดเอนเอออกมา

4.3 การวดคาดเอนเอทสกดได

เปนขนตอนทมประโยชนสาหรบการทาPCR เพอทดสอบหายนเปาหมายสามารถทาได

หลายเทคนค คอเทคนคทางฟสกส (เชน วดการดดกลนแสงทความยาวคลนทจาเพาะ)

เทคนคเคม-ฟสกส (เชน ใชการแทรกหรอจบกนของดเอนเอกบสารฟลออเรสเซนตทาให

เกดการเรองแสง)การใชเอนไซม (เชนการตรวจวดแสงทางชวภาพ)หรอการวดปรมาณ

โดยวธ PCR เปนวธทเหมาะสมสาหรบตวอยางทมความซบซอนขององคประกอบ

ของอาหารตวอยางทมปรมาณดเอนเอนอยๆหรอตวอยางทดเอนเอถกทาลาย


5.1 Sodiumchloride(NaCl)

5.2 Tris(hydroxymethyl)-aminomethane(Tris)(C4H11NO3)

5.3 Ethylenediaminetetraacetic acid-disodium salt (Na2EDTA)(C10H14N2O8Na2)

5.4 Hydrochloricacid,(HCl)37%

5.5 Sodiumhydroxide(NaOH)

5.6 Sodiumdodecylsulfate(SDS)(C12H25O4SNa)

5.7 Proteinase-K~20U/mgชนดlyophilised

5.8 Guanidine hydrochloride (CH5N3-HCl)

5.9 Potassiumchloride(KCl)

5.10 Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)

5.11Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4)

5.12 Isopropanol[CH3CH(OH)CH3]

5.13 Silica (SiO2),silicondioxideทมขนาดระหวาง0.5และ10ไมโครเมตร(โดยปรมาณ80%

จะเปนขนาดระหวาง1ถง5ไมโครเมตร)Silicasuspension:ชงsilica5g(5.13)ใสหลอด

50-ml เตมPBS-buffer (5.18)50มลลลตร เขยาใหเขากนตงทงไว 2ชวโมงใช pipette

ดดสวนใสออกแลวเตมPBS-buffer(5.18)อก50มลลลตรเขยาใหเขากนตงทงไว2ชวโมง

ใช pipetteดดสวนใสออกหลงจากนนนาไปเหวยงท 2000g เปนเวลา2นาททงสวนใส

203


ทเหลอทงหมดแลวเตมguanidine-HClsolutionII(5.17)50มลลลตรSilicaทเตรยมมอาย

การใชงาน2–5เดอน

5.14 RNase-A,DNase-freeสารละลายความเขมขน 10mg/ml (แบงเปนหลอดเลกๆ

เกบท–20C)

5.15 Proteinase-K เตรยมเปนสารละลายความเขมขน 20mg/ml (โดยละลายในนา

ทฆาเชอแลวโดยไมตองนงฆาเชอหลงการเตรยมแบงเปนหลอดเลกๆเกบท–20C

หลกเลยงการละลายหลายรอบ)

5.16 GuanidinehydrochloridesolutionI, (CH5N3-HCl)=5mol/l (นงฆาเชอท121 C

15นาท)

5.17 Guanidine-HClsolutionII,(CH5N3-HCl)=6mol/l(นงฆาเชอท121C15นาท)

5.18 PBS-buffersolution(NaCl=0.157mol/l,KCl=0.0027mol/l,Na2HPO4 = 0.010

mol/l,KH2PO4=0.0018mol/l)

5.19 TNE-SDS extraction buffer (NaCl = 0.150 mol/l, Tris = 0.002 mol/l, Na2EDTA

=0.002mol/l,SDS=10g/l)ปรบpH8.0ดวยHClหรอNaOHและนงฆาเชอดวย

autoclaveกอนเตมSDS

5.20 Isopropanolsolution,CH3CH(OH)CH3 = 80%

5.21 TE-buffer solution (Tris = 0,010 mol/l and Na2EDTA=0.001mol/l)ปรบpH

8.0ดวยHClหรอNaOH


6.1 Centrifugeทมความเรวรอบอยางนอย2,000gบางขนตอนตองใชแบบทมการใหความเยน

ขณะปนเหวยง

6.2 Ovenหรอincubatorโดยมอณหภมใชงานท60C

6.3 Shaker

6.4 Mixer

6.5 Centrifugationvialsขนาด50mlสาหรบเตรยมsilicasuspension.

6.6 UV Spectrophotometer

204




7.1.1 ใชตวอยางทดสอบ (test portion) ทเปนตวแทนทเหมาะสมจากตวอยางของ

หองปฏบตการ(Labsample)ซงในกรณทตองการLOD0.1%ตองใชตวอยางปรมาณ

ไมนอยกวา3,000particles

7.1.2 นาตวอยางของหองปฏบตการทงหมดมาบดปนและคนใหเขากนกอนสมตวอยาง

ทดสอบนาไปสกดระวงการปนเปอนขณะทาการบดปนหรอเตรยมตวอยาง

7.1.3 ตวอยางทเปนของเหลวใหผสมใหเขากนใหดกอนหรอในกรณทเปนผลตภณฑ

ทตกตะกอนไดใหทาการผสมจนมนใจวาไมมตะกอนตดอยทกนภาชนะ

7.1.4 ตวอยางทเปนของเหนยวขนหรออยในสภาพทบดไดยาก อาจเพมขนตอนชวง

กอนบดหรอกาลงบดไดคอ การใหความรอนท 40 C การละลายนาเพมขน

การแชแขงท-20Cหรอตากวา

7.1.5 กรณตวอยางมสวนประกอบหลายอยางทสามารถแยกสวนเปาหมายการทดสอบได

เชนขนมปงไสปลาอาจใชการสมแยกเฉพาะสวนทตองการนาไปสกดดเอนเอเทานน

7.2. การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)

การเตรยมตวอยางเพอใหไดดเอนเอทมคณภาพดตองมการกาจดหรอลดปรมาณการปะปน

ของสารทมผลตอการสกดดเอนเอดงน

การสกดPolysaccharidesสามารถกาจดโดยใชเอนไซมทเหมาะสมกอนขนตอนการสกด

(เชนpectinase,α-amylase)หรอใชการสกดดวยสารอนทรยกอนการตกตะกอนดเอนเอ

(เชนchloroform)

RNA และ/หรอโปรตน ใชวธทเหมาะสมเชนการใชเอนไซม RNase-A และ

proteinase-Kตามลาดบ

ไขมนใชตวทาละลายเชนn-hexaneเตมพรอมextractionbuffer

เกลอทมในตวอยางสารสกดหรอขนตอนการตกตะกอนมผลตอการทาการวเคราะห

ในขนตอไป จงตองระวงการเหลอตกคาง โดยการปรบ pH ใหได ประมาณ 7.0 กอน

การสกด

7.3 ขนตอนการสกด

7.3.1 ชงตวอยางทบดแลว200–300มลลกรม(แตในอาหารทอาจมปรมาณดเอนเอนอย

หรอ เปนดเอนเอทเสยสภาพตองมการใชปรมาณตวอยางมากขนเพอใหมปรมาณ

ดเอนเอทเพยงพอและมคณภาพเพอทาการวเคราะหตอไปแตไมแนะนาใหใชปรมาณ

205


ตวอยางทดสอบมากกวา 2 กรม และตองมการคานวณปรมาตรสารตางๆ ให

เหมาะสมกบปรมาณตวอยางทดสอบทเพมขนดวย)

7.3.2 เตมextractionbuffer(5.19)2มลลลตรและProteinase-K(5.15)20ไมโครลตร

7.3.3 บมท60Cเปนเวลา1–5ชวโมงพรอมเขยาอยางรนแรง(ประมาณ250รอบ/นาท)

7.3.4 ปนเหวยงท 2,000 g เปนเวลา 15นาท แลวดดสวนใสใสในหลอดขนาด 2-ml

หลอดใหม

7.3.5 เตมRNase-A(5.14)ปรมาณ2ไมโครลตรลงในสวนใสบม5นาทท37C(ขนตอน

การกาจดอารเอนเอน ตองทากอนขนตอนผสมกบ silica เพอใหการวดคาดวย

UV-spectrophotometerมความถกตองมากขน)

7.3.6 เตมGuanidine-HCl (5.16)ปรมาณ55ไมโครลตรและ silica suspension (5.17

ปรมาณ100ไมโครลตรตงทงไว1นาท

7.3.7 ปนเหวยงท800gเปนเวลา2นาท

7.3.8 ทงสวนใสแลวเตม isopropanol (5.20)ปรมาณ 500 ไมโครลตร เขยาใหเขากน

(อาจใชmixerในการผสม)

7.3.9 ปนเหวยงท1,500gเปนเวลา2นาททงสวนใส

7.3.10ทงใหแหง

7.3.11ละลายตะกอนในTEbuffer(5.21)ปรมาณ100ไมโครลตรผสมอยางระมดระวง

7.3.12บมท60Cเปนเวลา5นาท

7.3.13ปนเหวยงท2,000gเปนเวลา5นาท

7.3.14ดด 80%ของสวนใสใสหลอดใหม (ระวงอยาใหม silicaตดมาดวย เพราะ silica

มคณสมบตยบยงการทางานของเอนไซมเชนDNApolymerase)

7.3.15เตมRNase-A(5.14)ปรมาณ2ไมโครลตรบมท37Cเปนเวลา1ชวโมงวดคาความ

เขมขน

โดยใชUVspectrophotometerเกบดเอนเอนเปนmasterstock


วดปรมาณของดเอนเอทสกดโดยใช spectrophotometer วดการดดแสงในชวงความยาวคลนท

260 และ 320 nmคาOD (optical density) วดท 260 nmนามาคานวณคาปรมาณดเอนเอ

โดย 1 ODของดเอนเอเสนคและดเอนเอเสนเดยว (ทถกทาใหเสยสภาพโดย 0.2MNaOH)

จะมปรมาณ50ng/µlและ37ng/µlตามลาดบ

206


DNA = F × (OD260−OD320)×50

เมอ Fเปนคาdilutionfactor



50เปนคาconversionfactorของดเอนเอเสนคมหนวยเปนไมโครกรม/มลลลตร

บนทกผลคาความเขมขนทไดเปนng/µl


9.1 สกดตวอยางทดสอบเปนจานวนอยางนอย2sub-sample

9.2 ตองมการควบคมคณภาพในการสกด โดยอยางนอยตองประกอบดวย extraction blank

controlและpositiveextractioncontrolหรอมการทดสอบสภาวะแวดลอมเพมเตมดวย

207



ใชทดสอบหาดเอนเอของถวเหลอง (Glycinemax) โดยตรวจหายน lectin (เปนยนทพบใน

ถวเหลองทงจากธรรมชาตและถวเหลองดดแปรพนธกรรม) ในอาหารทมสวนประกอบหรอ

มการปะปนของถวเหลองและเพอทดสอบคณภาพและปรมาณของดเอนเอทสกดไดจากตวอยาง

ทดสอบทมสวนประกอบหรอมการปะปนของถวเหลอง โดยใชวธ Polymerase Chain

Reaction(PCR)





modified organisms and derived products – Qualitative Nucleic Acid based methods




-


4.1 ทวไป:การตรวจเชงคณภาพประกอบดวยการตรวจลาดบกรดนวคลอคเปาหมายทจาเพาะ

ในตวอยาง ซงแตละวธจะมความจาเพาะกบดเอนเอเปาหมาย ผลวเคราะหเชงคณภาพ

จะแสดงใหเหนวาพบหรอไมพบสารพนธกรรมภายใตการทดสอบทมความสมพนธกบ

การควบคมการทดสอบทเหมาะสมรวมกบ detection limitของวธทใชและสดสวนของ

ตวอยางทใชทดสอบ

DMScF4003: Qualitativeendogenousgenetesting:lectin

(bymeansofPolymeraseChainReaction)

208


4.2 PCR amplification เปนการทาปฏกรยาการเพมจานวนสายของดเอนเอเปาหมายโดยใช

เอนไซมDNApolymeraseรวมกบprimerและdeoxyribonucleotidetriphosphates(dNTP)

ในbufferเปนการทาซาในหลอดทดสอบและมสงทเปนเงอนไขทตองทากอนคอในสวน

ผสมของปฏกรยาPCRตองไมมinhibitorsขนตอนการเพมปรมาณม3ขนตอนคอ

4.2.1 การแยกสายดเอนเอสายคเปนสายเดยวโดยใชความรอน

4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primersสามารถจบเขาคไดกบดเอนเอสายเดยวทเปน

เปาหมาย

4.2.3 จาลองสายของ primers ทจบกบดเอนเอสายเดยวทแยกออก แลวทาใหยาวขน

โดยใชDNApolymeraseทอณหภมทเหมาะสม

4.3 การตรวจสอบและยนยนผล

สายดเอนเอทไดทงหมดจากปฏกรยาถกเรยกวา PCR products สามารถตรวจสอบได

โดยใชเทคนคการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา (gel electrophoresis) เพอการแยกและ

จาแนกขนาด และอานผลโดยการยอมดวย Ethidium bromideทจะเขาจบกบดเอนเอ

และสามารถกระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลตเทยบกบดเอนเอทรขนาดและ/

หรอปรมาณ เมอตรวจสอบ PCR products ดวยเทคนคการแยกผานเจลดวยไฟฟา

อาจทาการยนยนตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยนลาดบเบสของ

PCR products สวนในกรณของ real-time PCRการเพมจานวนดเอนเอเปาหมายและ

การตรวจสอบผลจะเกดขนพรอมๆกน


5.1 WaterชนดPCRgrade

5.2 PCRbuffer(อาจมหรอไมมMgCl2 ผสมอย)ความเขมขน10เทา

5.3 MgCl2solutionความเขมขน25mmol/l

5.4 dNTPsolutionความเขมขนของแตละnucleotideเทากบ5mM

5.5 Oligonucleotidesความเขมขนของแตละเสนเทากบ10µM

5.5.1 Forwardprimer:Soyabeanlectingene(GenBank®accessionNo.K00821)Primer-1

GM03:5'-gCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3'

5.5.2 Reverse primer: Soya bean lectin gene (GenBank®accessionNo.K00821)Primer-2

GM04:5'-gCCCATCTgCAAgCCTTTTTgTg-3'

209


5.6 ThermostableDNApolymerase(สาหรบhot-startPCR),5U/µl

5.7 AgaroseทเหมาะสมสาหรบการแยกขนาดดเอนเอของPCRproductsเปาหมาย

5.8 Boric acid (H3BO3)สาหรบเตรยมTBEbuffer

5.9 Bromophenol blue (C19H9Br4O5SNa)และ/หรอxylenecyanoleFF(C25H27N2O6S2Na)

5.10 ดเอนเอทมขนาดนาหนกโมเลกลทเหมาะสมกบขนาดของPCRproducts(เชนrestriction-

digested λ-PhageDNAสาหรบDNAทมนาหนกโมเลกลตาหรอ100bpladder)

5.11 Glacial acetic acid (CH3COOH)สาหรบเตรยมTAEbuffer

5.12 Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (Na2-EDTA)(C10H14N2O8Na2)

5.13 Ethidiumbromide(EtBr)(C21H20N3Br)=0.5mg/l

5.14 Glycerol

5.15 Sodium acetate (C2H3O2Na)สาหรบเตรยมTAEbufferเทานน

5.16 Hydrochloricacid(HCl)=37%



5.19 TAEbuffersolution(1x)(Tris=0.050mol/l,Sodiumacetate=20mmol/l,Na2-EDTA

= 0.001mol/l)ปรบpHใหได 8.0โดยใช glacial acetic acidหรอNaOH (ควรเตรยม

เปน50xแลวเจอจางเปน1xกอนใชงานโดยใชนาmono-distilledหรอdeionisedwater

ทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)

5.20 Tris/borate(TBE)buffersolution(0.5x)(Tris=0.055mol/l,boricacid=0.055mol/l,

Na2EDTA=0.001mol/l)ปรบpHใหได 8.0โดยใชHClหรอNaOH(ควรเตรยมเปน

10x แลวเจอจางเปน 1x กอนใชงานโดยใชนาmono-distilledหรอ deionisedwater


5.21 Sample loading buffer solution (5x) (glycerol = 50%, bromophenol blue = 2.5 g/l

และ/หรอ xylene cyanol = 2.5 g/l) ละลายใน buffer ชนดเดยวกบทตองการใชงาน

(TAEorTBE)

5.22 Ethidiumbromidesolution(EtBr)=0.5mg/l

210


ขอแนะนา:

5.22.1 หลกเลยงการเตรยมโดยการชง EtBr ออกมาใสภาชนะอนแลวละลายนา แตให

เตรยมโดยเทนาลงไปในภาชนะบรรจของ EtBr หรอใช EtBr ทเปนเมดเพอ

ละลายนา

5.22.2 ควรเตรยมเปน ethidiumbromide solution ทความเขมขน 10mg/ml เกบใหพน

จากแสงท5C


6.1 Thermal cycler

6.2 Electrophoresis chamber พรอม power supply โดยทวไปใชแรงดนไฟฟาท 5V/cm

(ระยะหางระหวางขวบวกและขวลบขนกบขนาดgeltray)

6.3 Ultraviolet(UV)trans-illuminatorทสามารถใหความยาวคลนท312nm.

6.4 Recordinginstrumentเชนphoto-documentหรอกลองCCD


7.1 การเตรยมปฏกรยาPCR(PCRsetup)

เตรยมสารเคมในหลอดสาหรบปฏกรยาPCRโดยเฉพาะใหมปรมาตรทงหมด25ไมโครลตร

เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางทLectin_1

ตารางLectin_1

De-ionizedwater(µl) ปรบใหไดปรมาตรรวม25

10xbuffer+15mMMgCl2 1x

25 mM MgCl2 1.5 mM

5 mM dNTP 0.8 mM

10µMprimer-1 0.2µM


5U/µlDNAtaqpolymerase 0.5U

Total(µl) 25

DNAtemplate(µl) 10–50ng

Reagent Final concentration

211


7.2 สารควบคม(PCRcontrols)

7.2.1 positive extraction control

7.2.2 extraction blank control

7.2.3 positiveDNAtargetcontrolจากถวเหลองGTS40-3-2

7.2.4 negative DNA target control

7.2.5 amplification reagent control

7.3 อณหภมและเวลาทใช(Temperature-timeprogramme)

อณหภมและเวลาทใชตามระบในตาราง Lectin_2 เปนการทดสอบความใชไดของ

วธวเคราะหกบเครอง GeneAmp® 2400 หรอ GeneAmp® 9600 และใชเอนไซม

AmpliTaq Gold®DNApolymeraseถาใชเครองนอกเหนอจากนอาจตองมการปรบเพอ

ใหไดผลการวเคราะหตามตองการ

ตารางLectin_2

Step Time/temp

Activation/Initialdenature 10min/95C

Amplification 30s/95C

30s/60ºC

60s/72ºC

Number of cycles 35

Finalextension 3min/72ºC

เวลาและอณหภมทใชในการกระตนการทางานของ heat-activatedDNA polymerase

อาจแตกตางไปตามแตละผผลตใหปรบเวลาและอณหภมในขนตอนดงกลาวตามคาแนะนา

จากผผลต

7.4 ตรวจสอบPCRproducts

โดยการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟาและยอมสดวยEtBr

7.4.1 ชงagaroseในปรมาณทเหมาะสม(0.8–1.0%ในดเอนเอทมขนาดใหญแตPCR

products ทมขนาดไมยาวมากควรใชปรมาณ agarose สงกวาน และอาจสง

ไดถง4.0%)ละลายในbuffer(TAEหรอTBEตามชนดทใชในขณะทแยกดเอนเอ

จากกระแสไฟฟา)

212


7.4.2 ละลายในmicrowaveหรอwaterbathเขยาใหเขากนโดยไมใหเกดฟอง

7.4.3 ตงทงไวจนอณหภมลดลงประมาณ60 Cแลวเทลงgel trayโดยใช samplecomb

ทเหมาะสมกบปรมาณตวอยางททดสอบตงทงไวใหเยน(ใชเวลาประมาณ1ชวโมง)

เจลทเตรยมไมควรมความหนาเกน1เซนตเมตร

7.4.4 แกะcombออกและยกเจลไปวางในelectrophoresischamber

7.4.5 เทbuffer(ชนดเดยวกบทใชเตรยมเจลและloadingbuffer)ลงไปใหทวมเหนอเจล

2มลลเมตร

7.4.6 ผสมPCRproducts(5µlหรอ10µl)กบloadingbufferประมาณ20%ของปรมาตร

รวมทงหมด (เชน ใช loading buffer 2.5 µl + PCR products 10µl)หยอดลง

ในหลมเทยบกบ100bpladder

7.4.7 เปดเครองelectrophoresischamber

7.4.8 ปดเครองเมอครบเวลาแลวนาเจลออกไปแชในสารละลายEtBr15–50นาทแลว

ลางสสวนเกนออกโดยการแชในนา10–30นาท

7.4.9 บนทกภาพเจลภายใตแสงUV


8.1 ตวอยางทดสอบหลอดจะถอวาใหผลบวกถาใหขนาดของ PCRproducts เทากบ positive

controlคอเทากบ118bpและผลของPCRcontrolsทงหมดใหผลตามระบในขอ9

8.2 การสรปผล:

8.2.1 สรปผลวาผลการทดสอบใหผลเปนบวก กรณทผลการทดสอบใหผลบวกทง

2sub-sampleและผลของชดควบคมเปนไปตามระบในขอ9

8.2.2 ถาผลวเคราะหทง 2 sub-sample ตางกนใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะหยง

เหมอนเดมใหสรปผลเปนลบ

8.3 การรายงาน

8.3.1 ผลการวเคราะหทเปนบวกใหรายงาน

ยนจาเพาะของถวเหลอง(lectin) พบ/detected

8.3.2 ผลการวเคราะหทเปนลบใหรายงาน

ยนจาเพาะของถวเหลอง(lectin) ไมพบ/notdetected

213



ทกครงททา PCRตองมการใชสารควบคมโดยทเมอทา PCR เรยบรอยแลวผลของสารควบคม

ทถอวาใชไดและผลการวเคราะหสามารถแปลผลไดคอ

9.1 positiveextractioncontrol ตองใหผลบวก

9.2 extractionblankcontrol ตองใหผลเปนลบ

9.3 positiveDNAtargetcontrol ตองใหผลบวก

9.4 negativeDNAtargetcontrol ตองใหผลลบ

9.5 amplificationreagentcontrol ตองใหผลลบ

215



การทดสอบหาดเอนเอของยน trnL intron ทมใน chloroplast ของพชทกชนด โดยใชวธ

PolymeraseChainReaction(PCR)และเปนวธทใชควบคมวาวธทสกดดเอนเอจากตวอยางอาหาร

มความเหมาะสมและมดเอนเอของพชในอาหารนนๆ ในกรณอาหารทผานกระบวนการผลตจะ

ใชวธนตรวจไดหรอไมขนกบอตราการสญเสยสภาพดเอนเอเนองจากPCRproductsทเกดจาก

การทดสอบนจะใหดเอนเอทมขนาดยาวกวาลาดบเบสทใชทดสอบหาพชดดแปรพนธกรรมอนๆ

ในตวอยางทดสอบวธนไมควรใชเปนวธควบคมในการตรวจเชงปรมาณ









-





การควบคมการทดสอบทเหมาะสม รวมกบ detection limit ของวธทใชและสดสวน

ของตวอยางทใชทดสอบ

DMScF4004: Qualitativeendogenousgenetesting:thechloroplast trnL

intron(bymeansofPolymeraseChainReaction)

216







4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primers สามารถจบเขาค ไดกบดเอนเอสายเดยว

ทเปนเปาหมาย





โดยใชเทคนคการแยกผานเจลโดยใชกระแสไฟฟา (gel electrophoresis) เพอการแยก

และจาแนกขนาด และอานผลโดยการยอมดวย Ethidium bromide ทจะเขาจบกบ

ดเอนเอและสามารถกระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลต เทยบกบดเอนเอท

ร ขนาดและ/หรอปรมาณ เมอตรวจสอบ PCR products ดวยเทคนคการแยกผานเจล

ดวยไฟฟาอาจทาการยนยนตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยน

ลาดบเบสของ PCR productsสวนในกรณของ real-time PCRการเพมจานวนดเอนเอ

เปาหมายและการตรวจสอบผลจะเกดขนพรอมๆกน



5.2 PCRbuffer(อาจมหรอไมมMgCl2ผสมอย)ความเขมขน10เทา



217



5.5.1 Forward primer:Chloroplast tRNAgene (GenBank® accessionNo. Z00044,

X15901)Primer-1c[14]:5'–CgAAATCggTAgACgCTACg-3'

5.5.2 Reverse primer: Chloroplast tRNA gene (GenBank®accessionNo.Z00044,X15901)

Primer-2d[14]:5'–ggggATAgAgggACTTgAAC-3'

5.6 ThermostableDNApolymerase(สาหรบhot-startPCR)5U/µl




5.10ดเอนเอทมขนาดนาหนกโมเลกลทเหมาะสมกบขนาดของPCRproducts

(เชน restriction-digestedλ-PhageDNAสาหรบDNAทมนาหนกโมเลกลตาหรอ

100bpladder)



5.13Ethidiumbromide(EtBr)(C21H20N3Br)=0.5mg/l

5.14 Glycerol


5.16Hydrochloricacid(HCl)=37%

5.17Sodiumhydroxide(NaOH)

5.18Tris(hydroxymethyl)-aminomethane(Tris)(C4H11NO3)

5.19TAE buffer solution (1x) (Tris = 0.050 mol/l, Sodium acetate = 20 mmol/l,

Na2EDTA = 0.001 mol/l) ปรบ pH ใหได 8.0 โดยใช glacial acetic acid หรอ

NaOH (ควรเตรยมเปน 50x แลวเจอจางเปน 1xกอนใชงานโดยใชนาmono-distilled

หรอdeionisedwaterทไมจาเปนตองฆาเชอกอนใช)

218


5.20 Tris/borate (TBE) buffer solution (0.5x) (Tris = 0.055mol/l, boric acid = 0.055

mol/l, Na2EDTA=0.001mol/l)ปรบpHใหได8.0โดยใชHClหรอNaOH(ควรเตรยม





(TAEorTBE)

5.22Ethidiumbromidesolution(EtBr)=0.5mg/l


5.22.1หลกเลยงการเตรยมโดยการชงEtBrออกมาใสภาชนะอนแลวละลายนาแตใหเตรยม

โดยเทนาลงไปในภาชนะบรรจของEtBrหรอใชEtBrทเปนเมดเพอละลายนา

5.22.2ควรเตรยมเปนethidiumbromidesolutionทความเขมขน10mg/mlเกบใหพนจาก

แสงท5C


6.1 Thermal cycler








เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางทCT_1

219


7.2. สารควบคม(PCRcontrols)



7.2.3 positiveDNAtargetcontrolเชนถวเหลองGT40-3-2




อณหภมและเวลาทใชตามระบในตารางCT_2เปนการทดสอบความใชไดของวธวเคราะห

กบเครองGeneAmp® 2400หรอGeneAmp® 9600 และใชเอนไซมAmpliTaqGold®

DNApolymeraseถาใชเครองนอกเหนอจากนอาจตองมการปรบเพอใหไดผลการวเคราะห

ตามตองการ



25 mM MgCl2 1.5 mM

5 mM dNTP 0.8 mM




Total(µl) 25


Reagent Final concentration

ตาราง CT_1

220


ตาราง CT_2



30s/55C

120s/72C

Number of cycles 35

Finalextension 5min/72C

Step Time/temp






7.4.1 ชง agarose ในปรมาณทเหมาะสม (0.8 – 1.0% ในดเอนเอทมขนาดใหญ แต

PCRproductsทมขนาดไมยาวมากควรใชปรมาณagaroseสงกวาน และอาจสง








7.4.5 เท buffer (ชนดเดยวกบทใชเตรยมเจลและ loading buffer) ลงไปใหทวมเหนอ

เจล2มลลเมตร

221



รวมทงหมด(เชนใชloadingbuffer2.5µl+PCRproducts10µl)หยอดลงในหลม

เทยบกบ100bpladder


7.4.8 ปดเครองเมอครบเวลา แลวนาเจลออกไปแชในสารละลาย EtBr 15 – 50นาท

แลวลางสสวนเกนออกโดยการแชในนา10–30นาท



8.1 ตวอยางทดสอบจะถอวาใหผลบวกถาใหขนาดของPCRproducts ใกลเคยงกบ positive

control คออยในชวง 500 - 600 bp และผลของ PCR controlsทงหมดใหผลตามระบ

ในขอ9


8.2.1 สรปผลวาผลการทดสอบใหผลเปนบวก กรณทผลการทดสอบใหผลบวกทง 2

sub-sampleและผลของชดควบคมเปนไปตามระบในขอ9

8.2.2 ถาผลวเคราะหทง 2 sub-sampleตางกนใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะหยง




ยนจาเพาะของพช(chloroplastt-RNA) พบ/detected


ยนจาเพาะของพช(chloroplastt-RNA) ไมพบ/notdetected

222



ทกครงททาPCRตองมการใชสารควบคมโดยทเมอทาPCRเรยบรอยแลวผลของสารควบคมท

ถอวาใชไดและผลการวเคราะหสามารถแปลผลไดคอ






223



ใชทดสอบหาดเอนเอของขาวโพด(Zea mays)ในอาหารทมสวนประกอบหรอมการปะปนของ

ขาวโพดและเพอทดสอบคณภาพและปรมาณของดเอนเอทสกดไดจากตวอยางทดสอบทมสวน

ประกอบหรอมการปะปนของขาวโพดโดยใชวธPolymeraseChainReaction(PCR)









-





การควบคมการทดสอบทเหมาะสมรวมกบ detection limitของวธทใชและสดสวนของ

ตวอยางทใชทดสอบ

DMScF4005: Qualitativeendogenousgenetesting:Invertase

(bymeansofPolymeraseChainReaction)

224


4.2 PCR amplification เปนการทาปฏกรยาการเพมจานวนสายของดเอนเอเปาหมายโดย

ใชเอนไซม DNApolymeraseรวมกบprimerและdeoxyribonucleotide triphosphates

(dNTP) ในbuffer เปนการทาซาในหลอดทดสอบและมสงทเปนเงอนไขทตองทากอน

คอในสวนผสมของปฏกรยาPCRตองไมมinhibitorsขนตอนการเพมปรมาณม3ขนตอนคอ


4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primers สามารถจบเขาคไดกบดเอนเอสายเดยวท

เปนเปาหมาย






และจาแนกขนาดและอานผลโดยการยอมดวยEthidiumbromide ทจะเขาจบกบดเอนเอ



อาจทาการยนยนตอดวยการใชเทคนคการยอยดวยเอนไซมทใชในการยนยนลาดบเบส

ของ PCR productsสวนในกรณของ real-time PCRการเพมจานวนดเอนเอเปาหมาย

และการตรวจสอบผลจะเกดขนพรอมๆกน






225



5.5.1 Forward primer:Maize invertase gene (GenBank® accessionNo.U16123)

Primer-1IVR1-F:5'-CCgCTgTATCACAAgggCTggTACC-3'

5.5.2 Reverse primer: Maize invertase gene (GenBank® accessionNo. U16123)

Primer-2IVR1-R:5'-ggAgCCCgTgTAgAgCATgACgATC-3'





5.10ดเอนเอทมขนาดนาหนกโมเลกล ท เหมาะสมกบขนาดของ PCR products (เชน

restriction-digested λ -PhageDNAสาหรบDNAทมนาหนกโมเลกลตาหรอ100bpladder) 5.11 Glacial acetic acid (CH3COOH)สาหรบเตรยมTAEbuffer



5.14 Glycerol


5.16Hydrochloricacid,(HCl)=37%




= 0.001mol/l)ปรบpHใหได 8.0 โดยใช glacial acetic acidหรอNaOH (ควรเตรยม



226






5.21 Sampleloadingbuffersolution(5x)(glycerol=50%,bromophenolblue=2.5g/lและ

/หรอxylenecyanol=2.5g/l)ละลายในbufferชนดเดยวกบทตองการใชงาน(TAEorTBE)





5.22.2ควรเตรยมเปน ethidiumbromide solution ทความเขมขน 10mg/ml เกบใหพน



6.1 Thermal cycler








เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางทInvertase_1

227



10 ×buffer+15mMMgCl2 1x

25 mM MgCl2 1.5 mM

5 mM dNTP 0.4 mM




Total(µl) 25


Reagent Final Concentration




7.2.3 positiveDNAtargetcontrolเชนCRMของBt11maize



7.3 อณหภมและเวลาทใช (Temperature-time programme)อณหภมและเวลาทใชตามระบ

ในตาราง Invertase_2 เปนการทดสอบความใชไดของวธวเคราะหกบเครองGeneAmp®

2400หรอGeneAmp® 9600และใชเอนไซมAmpliTaqGold®DNApolymeraseถาใช

เครองนอกเหนอจากนอาจตองมการปรบเพอใหไดผลการวเคราะหตามตองการ

ตารางInvertase_1

228


Step Time/temp



30s/64C

60s/72C

Number of cycles 35


ตาราง Invertase_2







PCRproductsทมขนาดไมยาวมากควรใชปรมาณagaroseสงกวานและอาจสงได

ถง 4.0%)ละลายในbuffer (TAEหรอTBEตามชนดทใชในขณะทแยกดเอนเอ



7.4.3 ตงทงไวจนอณหภมลดลงประมาณ60ºCแลวเทลงgel trayโดยใช samplecomb



229













8.1 ตวอยางทดสอบจะถอวาใหผลบวกถาใหขนาดของPCRproducts ใกลเคยงกบ positive

controlคออยในชวง226bpและผลของPCRcontrolsทงหมดใหผลตามระบในขอ9








ยนจาเพาะของขาวโพด(Invertase) พบ/detected


ยนจาเพาะของขาวโพด(Invertase) ไมพบ/notdetected

230










231



การทดสอบหาดเอนเอของยนhighmobilitygroupA(hmgA)ของขาวโพด(Zea mays)ในอาหาร

ทมสวนประกอบหรอมการปะปนของขาวโพดและเพอทดสอบคณภาพและปรมาณของดเอนเอ

ทสกดไดจากตวอยางทดสอบทมสวนประกอบหรอมการปะปนของขาวโพดโดยใชวธReal-time

PolymeraseChainReaction(real-timePCR)






2.3 ISO21570:2005(E):Foodstuffs—Methodsofanalysisforthedetectionofgenetically

modifiedorganismsandderivedproducts—Quantitativenucleicacidbasedmethods


-







DMScF4006: Qualitativeendogenousgenetesting:hmgA

(bymeansofreal-timePolymeraseChainReaction)

232







4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primersสามารถจบเขาคไดกบดเอนเอสายเดยวทเปน


4.2.3 จาลองสายของprimersทจบกบดเอนเอสายเดยวทแยกออกแลวทาใหยาวขนโดย

ใชDNApolymeraseทอณหภมทเหมาะสม

4.3 การทาปฏกรยาของTaqManProbeTaqManprobeเปนการใชOligonucleotideเสนเดยว

ตดฉลากFluorescent dyeซงเปน reporter dyeทตาแหนงปลาย5'ขณะทปลาย3'ของ

OligonucleotideถกตดฉลากดวยFluorescencequencherซงเปนตวยบยงการใหสญญาณ

ของFluorescencedyeทปลาย5'เมอทาปฏกรยาPCRถาTaqManprobeนนมความจาเพาะ

กบดเอนเอเปาหมายกจะจบทตาแหนงจาเพาะนนเมอTaqpolymeraseสรางสายใหมของ

ดเอนเอจาก primer ในแตละรอบของPCRและสายใหมของดเอนเอถกสรางเขามาถง

ตาแหนงท Taqman Probe จบอย เอนไซม Taq polymeraseทมคณสมบตของสวน 5'

nuclease activityจะยอยสายของTaqManprobeทจบอยตรงตาแหนงดงกลาวออกทาให

สวนของquencherหลดออกแยกหางจากFluoresecencereporterและเมอไมมquencher

มาดดกลนแสงจงทาให Fluoresecence ทปลาย 5' สามารถสงสญญาณออกมาใหเครอง

สามารถตรวจจบและวดไดในสภาพจรง(real-time)


4.4.1 วธทดสอบนใชตรวจยนhmg(highmobilitygroupofproteingene)ซงเปนยนจาเพาะ

ของขาวโพดมขนาด79bpโดยใชprimerและprobeสาหรบprobeใหตดฉลากส

ฟลออเรสเซนทคอFAMและTAMRAเปนrepoterdyeและQuencherตามลาดบ

233


4.4.2 วธนไดทาการปรบความเหมาะสมของวธวเคราะห (Optimized)พรอมทงทดสอบ

ความใชไดในการทาซาและความแมนยาโดยใชขาวโพดดดแปรพนธกรรมBt176

ชนดIRMM-411ทเปนวสดอางอง(Certifiedreferencematerial)โดยมการทดสอบ

เปรยบเทยบกนในระหวางหองปฏบตการ17แหงและใชเครองreal-timePCRของ

ABI7700SDSและABI5700SDS

4.4.3 วธวเคราะหนทดสอบกบดเอนเอของขาวโพดดดแปรพนธกรรม20ชนดและไมเกด

ปฏกรยาขามกบดเอนเอพชอนคอถวเหลองขาวไรนขาวสาลขาวบารเลยมลเลต

เลนทลถวขาวถวเขยวมะเขอเทศมนฝรงขาวฟาง เรพซดขาวโอต speltแฟลก

งามนษยปลาแซลมอนววยกเวนteosinte(Zeamays,spp.Mexicana)ซงมความ

ใกลชดกบขาวโพดมาก


5.1 PCRbuffer(ไมมMgCl2)ทความเขมขน10เทา(10x)

5.2 สารละลายMgCl2ทความเขมขน25mmol/l

5.3 สารละลายdNTPทความเขมขนแตละnucleotideเปน25mmol/l

5.4 Oligonucleotides เปน probe และ primer ความเขมขนปรบเปน 10 µMและ 20 µM

ตามลาดบดงน

5.4.1 primer

ZM1-F5'-TTggACTAgAAATCTCgTgCTgA-3'

ZM1-R5'-gCTACATAgggAgCCTTgTCCT-3‘

5.4.2 Probe

ZM1-P5'-FAM—CAATCCACACAAACgCACgCgTA-TAMRA-3'

234


5.5 Thermostable DNA polymerase

AmplTaq Gold® DNA polymerase*

(*เปนตวอยางผลตภณฑทางการคาทใชไดซงใหขอมลไวเพอความสะดวกในการใชงาน

วธวเคราะหนเทานนผลตภณฑของบรษทอนทใกลเคยงกนสามารถใชไดและใหผลเหมอนกน)

5.6 UracilN-glycolysate(ในกรณทตองการใช)

5.7 Amplificationreactionmixtureตามตารางhmg_1


6.1 Thermal cycler

การทดสอบเรมตนครงแรกดวยเครองABI 7700 เครอง real-time PCRของบรษทอน

สามารถใชไดโดยตองปรบสภาวะการทางานและสวนผสมของปฏกรยานายา PCR ให

เหมาะสมกบเครองกอนใชงาน

6.2 Reaction vials

หลอดทใชกบการทาปฏกรยา PCR เลอกใหเหมาะสมกบการใชงาน เชน ชนดหลอด

หรอplateทเหมาะสาหรบแตละเครอง



เตรยมสารเคมสาหรบการทาปฏกรยา PCR ใหมปรมาตร 25 ไมโครลตร/1 ปฏกรยา

เพอใหสารตางๆมความเขมขนสดทายตามตารางhmg_1

235


ตาราง hmg_1แสดงสวนผสมของสารละลายในการทาปฏกรยาPCRตอ1reaction

PCRreactionbuffer TaqManbufferA(มสROXa) 1fold

MgCl2 6.5 mol/l

DNA polymerase AmplTaq Gold® 1.25 U

Decontaminantsystem dUTP 400µmol/l

(ในกรณทตองการใช) AmpEraseuracilN-glycosylase 0.5U

Primer ตามขอ5.4.1 300nmol/l

dNTP dATP,dCTP,dGTP 200µmol/l

Probe ตามขอ5.4.2 160nmol/l

TemplateDNA 5µl

2.3ngถง150ngmaizeDNA

ปรมาตรทงหมด 25µl

*ทดสอบจากการปรบสภาวะทเหมาะสมครงแรกสามารถปรบเปลยนไดโดยตองปรบคาให

เหมาะสมสาหรบแตละผลตภณฑ

ROXa = carboxyl-X-Rhodamine

สารเคม ผลตภณฑ* ความเขมขนสดทาย

236


7.2 อณหภมและเวลาทใช(Temperature-TimeProgram)

รปแบบของอณหภมและเวลาทใช(Temperature-TimeProgram)เปนการทดสอบเรมตน

ครงแรกดวยเครองABI7700และGeneAmp5700 เวลาทกระตนการทางานเรมตนของ

เอนไซมDNApolymeraseขนกบผลตภณฑทใชสามารถใชเครองreal-timePCRของบรษท

อนไดโดยตองปรบสภาวะการทางานและสวนผสมของปฏกรยานายา PCRใหเหมาะสม

กบเครองกอนใชงานเวลาทกระตนการทางานเรมตนของเอนไซม DNA polymerase

ขนกบผลตภณฑทใช

ตาราง hmg_2 แสดงโปรแกรมทใช

Pre-PCR: decontamination 120 50

(ในกรณทตองการใช)

Pre-PCR: activation of DNA polymerase 600 95

and denaturation of template DNA

PCR(45cycles)

Step1 Denaturation 15 95

Step 2 Annealing elongation 60 60

ขนตอน เวลา(วนาท) อณหภม(ºC)

237



8.1 คาCrossingthresholdvalue(Ct)หรอQuantificationcycle(Cq)เปนคาทแสดงถงปรมาณ

ดเอนเอทมณรอบการทางานPCRทสามารถวดไดซงเปนชวงทตดกบthresholdbaseline

ทกาหนดของปฏกรยานนๆ โดยซอฟทแวรของเครองจะทาการคานวณใหตามสตร คอ

ปรมาณดเอนเอ(Quantity)=2Ct

8.2 Limitofdetection(LOD)

ผพฒนาวธไดกาหนดคา absolute LODของวธทดสอบนท 5 copies ของชนสวนยน


หมายเหต ถาดเอนเอของขาวโพดถกกาจดออกหรอขนตอนในการผลตอาหารไดทาลาย

คณภาพดเอนเอไปแลว (เชนนามนทผานกรรมวธ) หรอมขาวโพดเปนสวนประกอบ

ในตวอยางอาหารนนนอยมากอาจทาใหตรวจไมพบยนจาเพาะของขาวโพดจงไมสามารถ

ใชวธตรวจวเคราะหนได)

8.3 การแปลผล

ผลวเคราะหPCRแปลผลไดดงน

8.3.1 ตวอยางทดสอบใหผลบวกเมอตรวจพบยนจาเพาะของขาวโพดทตรวจทง 2

sub-sampleและชดควบคมการทดสอบตองไดผลตามกาหนดในขอ9

8.3.2 ตวอยางทดสอบใหผลลบเมอตรวจไมพบยนจาเพาะของขาวโพดทตรวจทง 2

sub-sampleและชดควบคมการทดสอบตองไดผลตามกาหนดในขอ9

8.3.3 ถาผลวเคราะห 2 sub-sample ตางกน ใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะหยง


8.4 รายงานผลการทดสอบ(TestReport)

8.4.1 การรายงานผลกรณทไดผลบวก

ยนจาเพาะของขาวโพด(hmg) พบ/detected

8.4.2 การรายงานผลกรณทไดผลลบ

ยนจาเพาะของขาวโพด(hmg) ไมพบ/notdetected

238










หากผลของชดควบคม PCR ไมเปนไปตามนจะตองสกดตวอยางซาเพอตรวจวเคราะหใหม

หรอกรณทสงสยวาจะมinhibitorใหเพมขนการทาDNAใหบรสทธเพอยบยงinhibitorกอนนา

ไปทาPCRตอไป

239



ใชทดสอบหาดเอนเอของยนจาก cauliflowermosaic virus (CaMV)35Spromoter ในอาหาร

โดยวธPolymeraseChainReaction(PCR)เนองจากยนนมในพชดดแปรพนธกรรมมากมายหลาย

ชนด วธทดสอบนจงใชตรวจสอบเบองตนในอาหารวามการปะปนของพชดดแปรพนธกรรม

ในอาหาร









-

DMScF4007: Screeningmethodforthedetectionofgeneticallymodified

plantDNA:CaMV-35Spromoter(bymeansofPolymerase

ChainReaction)

240





















และสามารถกระตนใหเรองแสงภายใตรงสอลตราไวโอเลต เทยบกบดเอนเอทรขนาด

และ/หรอปรมาณ เมอตรวจสอบPCR products ดวยเทคนคการแยกผานเจลดวยไฟฟา


ของ PCRproducts สวนในกรณของ real-time PCRการเพมจานวนดเอนเอเปาหมาย


241


4.4 ผลวเคราะหทเปนผลบวกปลอมอาจเกดขนไดเนองจากชนสวนทนามาเพมจานวนนมาจาก

CauliflowerMosaicVirus ทพบไดในพชตระกลกะหลาทตดเชอนและพบในพชวงศ

Brassicaceae(Cruciferae)รวมทงResedaceaeและSolanacaeดงนนถาตรวจพบผลบวก

จากพชดงกลาว จะตองระมดระวง ผลบวกของการตรวจอาจแสดงวามชนสวนของพช

ดดแปรพนธกรรมแตไมสามารถแปลผลหรอใชเปนขอพสจนวามพชดดแปรพนธกรรม

จนกวาจะมการตรวจสอบยนยนเพมเตม และเพอทจะแยกความแตกตางระหวางไวรส

กบพชดดแปรพนธกรรมอาจตองใชวธการตรวจไวรสCauliflowermosaicvirusดวย







5.5.1 Forward primer: CaMV 35S promoter,Designed to amplify theCaMV 35S

promoter, e.g. accession No. V00141

Primer-135s-cf3:5'-CCACgTCTTCAAAgCAAgTgg-3'

5.5.2 Reverse primer: CaMV 35S promoter, Designed to amplify the CaMV 35S

promoter, e.g. accession No. V00141

Primer-235s-cr4:5'-TCCTCTCCAAATgAAATgAACTTCC-3'





5.10 ดเอนเอทมขนาดนาหนกโมเลกลทเหมาะสมกบขนาดของ PCR products (เช น

restriction-digested λ-phageDNAสาหรบDNAทมนาหนกโมเลกลตาหรอ100bpladder)

242




5.13 Ethidiumbromide(EtBr)(C21H20N3Br)=0.5mg/l

5.14 Glycerol


5.16 Hydrochloricacid,(HCl)=37%



5.19TAEbuffersolution(1x)(Tris=0.050mol/l,Sodiumacetate=20mmol/l,Na2-EDTA








5.21 Sampleloadingbuffersolution(5x)(glycerol=50%,bromophenolblue=2.5g/lและ

/หรอxylenecyanol=2.5g/l)ละลายในbufferชนดเดยวกบทตองการใชงาน(TAEorTBE)







243



6.1 Thermal cycler








เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางทCaMV-35S_1

ตาราง CaMV-35S_1



25 mM MgCl2 1.5 mM

5 mM dNTP 0.64 mM




Total(µl) 25



244





7.2.3 positiveDNAtargetcontrolเชน0.1%ถวเหลองGTS40-3-2




อณหภมและเวลาทใชตามระบในตารางCaMV-35S_2 เปนการทดสอบความใชไดของ

วธวเคราะหกบเครองGeneAmp®2400หรอGeneAmp®9600และใชเอนไซมAmpliTaq

Gold® DNA polymerase ถาใชเครองนอกเหนอจากนอาจตองมการปรบเพอใหไดผล

การวเคราะหตามตองการ

ตาราง CaMV-35S_2



30s/62C

45s/72C

Number of cycles 50


Step Time/temp








245












รวมทงหมด (เชน ใช loading buffer 2.5 µl + PCRproducts 10µl)หยอดลง

ในหลมเทยบกบ100bpladder











8.2.2 ถาผลวเคราะหทง 2 sub-sample ตางกนใหทาการวเคราะหซา ถาผลวเคราะห

ยงเหมอนเดมใหสรปผลเปนลบ

246




CaMV-35Spromoter พบ/detected


CaMV-35Spromoter ไมพบ/notdetected





9.2 extractionblankcontrolตอง ใหผลเปนลบ




247



ใชทดสอบหาดเอนเอของยนจากAgrobacterium tumefaciens nopaline synthase (NOS)

terminatorในอาหารโดยวธPolymeraseChainReaction(PCR) เนองจากยนนมในพชดดแปร

พนธกรรมมากมายหลายชนดวธทดสอบนจงใชเพอตรวจสอบเบองตนการปะปนของพชดดแปร

พนธกรรมในอาหาร









-








plantDNA:NOS-terminator (bymeans of Polymerase

ChainReaction)

248



เอนไซมDNApolymeraseรวมกบprimerและdeoxyribonucletidetriphosphates(dNTP)

ใน buffer เปนการทาซาในหลอดทดสอบ และมสงทเปนเงอนไขทตองทากอน คอ

ในสวนผสมของปฏกรยาPCRตองไมมinhibitorsขนตอนการเพมปรมาณม3ขนตอนคอ


4.2.2 ใชอณหภมทเหมาะสมทให primers สามารถจบเขาค ไดกบดเอนเอสายเดยว

ทเปนเปาหมาย












4.4 ผลบวกปลอมอาจเกดขนได เนองจากดเอนเอทเพมจานวนนมาจากAgrobacterium ซง

เปนแบคทเรยทพบไดในดนผลบวกอาจแสดงวามพชดดแปรพนธกรรมในผลตภณฑอาหาร

ทตรวจสอบแตไมสามารถใชเปนขอพสจนวามพชดดแปรพนธกรรมจนกวาจะมการตรวจ

สอบยนยนผลเพมเตม จะตองมความระมดระวงเพราะมโอกาสในการปนเป อนเชอ

Agrobacteriumหรอแบคทเรยอนทมสายพนธใกลชด

249








5.5.1 Forward primer:Agrobacterium tumefaciens NOS-terminator, designed to

amplify a sequence described in accession No. V0087

Primer-1HA-nos118f:5'-gCATgACqTTATTTATgAgATggg-3'

5.5.2 Reverse primer: Agrobacterium tumefaciens NOS-terminator, designed to

amplify a sequence described in accession No. V0087

Primer-2HA-nos118r:5'-gACACCgCgCgCgATAATTTATCC-3'










5.14 Glycerol


5.16Hydrochloricacid(HCl)=37%


250













(TAEorTBE)





5.22.2ควรเตรยมเปน ethidium bromide solution ทความเขมขน 10mg/ml เกบใหพน



6.1 Thermal cycler





251




25 mM MgCl2 1.5 mM

5 mM dNTP 0.64 mM




Total(µl) 25






เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางทNOS_1

ตาราง NOS_1

7.2 สารควบคม(PCRcontrols)



7.2.3 positiveDNAtargetcontrolเชน0.1%ถวเหลองGTS40-3-2



252



อณหภมและเวลาทใชตามระบในตารางNOS_2เปนการทดสอบความใชไดของวธวเคราะห

กบเครองGeneAmp® 2400หรอGeneAmp®9600และใชเอนไซมAmpliTaqGold® DNA

polymerase ถาใชเครองนอกเหนอจากนอาจตองมการปรบเพอใหไดผลการวเคราะห


ตาราง NOS_2



30s/62C

45s/72C

Number of cycles 50


Step Time/temp







PCRproductsทมขนาดไมยาวมากควรใชปรมาณagaroseสงกวานและอาจสงได

ถง 4.0%)ละลายในbuffer (TAEหรอTBEตามชนดทใชในขณะทแยกดเอนเอ



253

























NOS-terminator พบ/detected


NOS-terminator ไมพบ/notdetected

254










255



plant DNA :nptII (bymeans of Polymerase Chain

Reaction)


ใชทดสอบหาดเอนเอของยนneomycinphosphotransferase(npt ll)ทมาจากE. coliK12

ซงสอดแทรกอยในชดของยนพชดดแปรพนธกรรมบางชนด วธทดสอบยน npt ll โดยใช

PolymeraseChainReaction(PCR)นสามารถใชตรวจสอบเบองตนวามการปะปนของพชดดแปร

พนธกรรมในอาหาร









-







256

























257



5.5.1 Forwardprimer:nptIIgene(GenBank®accessionNo.AF269238)

Primer-1APH2short:5'-CTCACCTTgCTCCTgCCgAgA-3'

5.5.2 Reverse primer:

Primer-2APH2reverse:5'-CgCCTTgAgCCTggCgAACAg-3'










5.14 Glycerol


5.16 Hydrochloricacid(HCl)=37%







258








(TAEorTBE)



5.22.1หลกเลยงการเตรยมโดยการชง EtBr ออกมาใสภาชนะอนแลวละลายนา แตให

เตรยมโดยเทนาลงไปในภาชนะบรรจของEtBrหรอใชEtBrทเปนเมดเพอละลายนา




6.1 Thermal cycler








เพอใหสารแตละชนดมความเขมขนสดทายดงตารางทnpt ll_1

259



10 ×buffer+15mMMgCl2 1x

25 mM MgCl2 1.5 mM

5 mM dNTP 0.2 mM



5U/µlDNAtaqpolymerase 2U

Total(µl) 25



ตาราง npt ll_1




7.2.3 positiveDNAtargetcontrol(สามารถใชMON863maize)




อณหภมและเวลาทใชตามระบในตารางnpt ll_2เปนการทดสอบความใชไดของวธวเคราะห

กบเครองGeneAmp® 2400หรอGeneAmp® 9600และใชเอนไซมAmpliTaqGold®

DNApolymeraseถาใชเครองนอกเหนอจากนอาจตองมการปรบเพอใหไดผลการวเคราะห


260


















30s/62C

45s/72C

Number of cycles 35


Step Time/temp

ตาราง npt ll_2

261













controlคอเทากบ215bp(เมอใชเอนไซมตดจาเพาะชนดRsalตดชนสวนPCRproducts

จะไดชนสวนดเอนเอ2ขนาดคอ122และ93bp)และผลของPCRcontrolsทงหมดให

ผลตามระบในขอ9








npt II พบ/detected

8.3.2ผลการวเคราะหทเปนลบใหรายงาน

npt II ไมพบ/notdetected

262



ทกครงททา PCRตองมการใชสารควบคมโดยทเมอทา PCR เรยบรอยแลวผลของสารควบคม

ทถอวาใชไดและผลการวเคราะหสามารถแปลผลไดคอ






263


ภาคผนวก

รายชอวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหารเลมท1

วธมาตรฐานทางเคม

ท รหสวธ วธ

1 DMScF1001 การวเคราะหไนโตรเจนโดยKjeldahlmethod

2 DMScF1002 การวเคราะหปรมาณไขมนในนม

3 DMScF1003 การวเคราะหปรมาณไขมนในนมผงและผลตภณฑนมชนดผง

4 DMScF1004 การวเคราะหปรมาณไขมนในนมขนจดและนมขนหวาน

5 DMScF1005 การวเคราะหปรมาณไขมนในเนยแขง

6 DMScF1006 การวเคราะหปรมาณของแขงทงหมดในนมและผลตภณฑนม

7 DMScF1007 การวเคราะหของแขงทงหมดในนมขนหวาน

8 DMScF1008 การวเคราะหของแขงทงหมดในเนยแขง

9 DMScF1009 การวเคราะหเนอนมไมรวมไขมนในนมพรอมดมแลนมแปลงไขมน

10 DMScF1010 การวเคราะหเนอนมไมรวมไขมนในนมขนไมหวานและนมขนแปลง

ไขมนไมหวาน

11 DMScF1011 การวเคราะหปรมาณความชนในชา

12 DMScF1012 การวเคราะหปรมาณความชนในกาแฟ

13 DMScF1013 การวเคราะหปรมาณความชนในโกโกผง

14 DMScF1014 การวเคราะหปรมาณความชนในชาสมนไพร

15 DMScF1015 การวเคราะหปรมาณเถาทงหมดและเถาทละลายนาไดในชา

16 DMScF1016 การวเคราะหปรมาณเถาและเถาทละลายนาไดในกาแฟคว

17 DMScF1017 การวเคราะหปรมาณสารทสกดไดดวยนารอนในชา

18 DMScF1018 การวเคราะหปรมาณเอทานอลในเครองดมพรอมบรโภคจากพชผกผลไม

19 DMScF1019 การวเคราะหปรมาณอะซซลเฟม-เค,แอสพาแทมและซคคารนในอาหาร

20 DMScF1020 การวเคราะหปรมาณโซเดยมซยคลาเมตในอาหาร

21 DMScF1021 การวเคราะหปรมาณตะกวแคดเมยมทองแดงเหลกและสงกะสในอาหาร

22 DMScF1022 การวเคราะหปรมาณดบกในอาหารกระปอง

23 DMScF1023 การวเคราะหปรมาณอะฟลาทอกซนในขาวโพดและถวลสง

24 DMScF1024 การวเคราะหปรมาณอะฟลาทอกซนในขาวโพดและถวลสง

264


วธมาตรฐานทางจลชววทยา

1 DMScF2001 วธตรวจวเคราะหBacillus cereusในอาหาร

2 DMScF2002 วธตรวจวเคราะห Clostridium perfringensในอาหาร

3 DMScF2003 วธตรวจวเคราะหListeriaspp.และ Listeria monocytogenes ในอาหาร

4 DMScF2004 วธตรวจวเคราะห Salmonellaspp.ในอาหาร

5 DMScF2005 วธตรวจวเคราะห Salmonellaspp.ในนาและนาแขง

6 DMScF2006 วธตรวจวเคราะหStaphylococcus aureus ในอาหาร

7 DMScF2007 วธตรวจวเคราะหStaphylococcus aureusในนาและนาแขง

8 DMScF2008 วธตรวจวเคราะหCronobacter sakazakii ในนมและผลตภณฑนม


265


รายชอวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหารเลมท2

วธมาตรฐานทางเคม


1 DMScF1025 การวเคราะหปรมาณสารทงหมดในนา

2 DMScF1026 การวเคราะหปรมาณความกระดางทงหมดในนา

3 DMScF1027 การวเคราะหปรมาณไขมนในไอศกรม

4 DMScF1028 การวเคราะหปรมาณไนโตรเจนในไอศกรมโดยKjeldahlmethod

5 DMScF1029 การวเคราะหปรมาณของแขงทงหมดในไอศกรม

6 DMScF1030 การวเคราะหปรมาณกรดซตรกในเครองดม

7 DMScF1031 การวเคราะหปรมาณไนไตรตและไนเตรตในผลตภณฑเนอสตว

8 DMScF1032 การวเคราะหปรมาณสารตกคางทเหลอจากการระเหยอาหารจาลอง

9 DMScF1033 การวเคราะหปรมาณบสฟนอลเอ(BisphenolA;2,2-bis(4-hydroxy

phenylpropane)ทแพรลงสอาหารจาลอง

10 DMScF1034 การวเคราะหปรมาณ4,4'-Dichlorodiphenylsulfoneทแพรลงสอาหาร

จาลอง

11 DMScF1035 การวเคราะหปรมาณ4,4'-Dihydroxydiphenylsulfoneทแพรลงส

อาหารจาลอง

12 DMScF1036 การวเคราะหปรมาณฟอรมาลดไฮด (Formaldehyde) ทแพรจาก

ผลตภณฑยาง

13 DMScF1037 การวเคราะหปรมาณสงกะสทแพรจากผลตภณฑยาง

14 DMScF1038 การวเคราะหปรมาณN-NitrosaminesและN-Nitrosatablesubstances

ทแพรจากหวนมยาง

15 DMScF1039 การวเคราะหปรมาณสารทระเหยไดในหวนมยางสงเคราะห

16 DMScF1040 การวเคราะหปรมาณ2-Mercaptobenzothiazole(MBT)ทแพรออกมา

จากผลตภณฑvalcanisedrubber

17 DMScF1041 การวเคราะหปรมาณ 2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-phenol

(AntioxidantBHT)และ2,2'-Methylethylenebis(6-(1,1-dimethyl

ethyl)-4-methyl-phenol) (Antioxidant 2246) ทแพรออกมาจาก

ผลตภณฑvalcanisedrubber

266


1 DMScF2009 วธตรวจวเคราะหยสตและราในอาหารโดยวธpourplateและspread

plate

2 DMScF2010 วธตรวจวเคราะหVibriocholeraeในอาหาร

3 DMScF2011 วธตรวจวเคราะหVibrioparahaemolyticusในอาหาร

4 DMScF2012 วธตรวจวเคราะหVibrioparahaemolyticusในอาหารโดยวธMPN

5 DMScF2013 วธตรวจวเคราะหจานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมดในอาหาร

โดยวธpourplate

6 DMScF2014 วธตรวจวเคราะหจานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมดในนาและ

นาแขงโดยวธpourplateและspreadplate

วธมาตรฐานทางกายภาพ


วธมาตรฐานทางจลชววทยา


1 DMScF3001 การวเคราะหนาหนกสทธและนาหนกเนอในผกกระปอง

2 DMScF3002 การวเคราะหปรมาณนาอสระในผกกระปอง

วิธีมาตรฐาน ส...

Documents

Transcript of วิธีมาตรฐาน ส...