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A STUDY OF THE REGULATION OF

HEPATIC MICROSOMAL GLYCEROL PHOSPHATE ACYLTRANSFERASE ( GPAT )

A thesis presented in partial fulfi lment o f the

r equirements for the degree of Doctor of Phi losophy

in Biochemistry at

MASSEY UNIVERSITY

EARL VICTOR JOHN STEVENS

1 986

1. ( a )

( b )

( c )

MASSEY UNIVERSITY ·I I give permission for my thesis, entitled

A STUDY OF THE REGULATION OF HEPATIC MICROSOMAL GLYCEROL ... . . . .. ... . . . ...... .... ....... . . .. . . . . ........... .. . ... . . ..... .

PHOSPHATE ACYLTRANSFERASE (GPAT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . to be made available to readers in the Library under the conditions

determined by the Librarian.

I agree to my thesis, if asked for by another institution, being

sent away on temporary loan under conditions deterined by the

Librarian.

I also agree that my thesis may be copied for Library use.

�. I do not wish my thesis, entitled � . .......... . ............ ... . .. . . ..... .... · __ :-�-·-�--r-:-............. .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . � .. � · . � . . . . ..... . ... . . ..... .......... .

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Signed .... f..:�·:!� . Date

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The Library,

Massey University,

Palmerston North, N.Z.

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. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

i

ABSTRACT

Exper iments descr ibed in this thesis wer e conducted to examin e the

possib i l ity that hepatic microsomal GPAT activity in r ats is r egulated

by insulin .

Hepatic microsomal fractions were prepared by a procedure based on

publi shed methods and it was established by assay of cytochrome

oxidase , monoamine o x idase and NADPH cytochrome C r eductase that the r e

was less than 1 1 % mitochondrial impurity . A butanol extraction o f GPAT

assays was adopted to separate the butanol-soluble [ 1 4c J-lipid products

1 4 from the unreacted aqueous-soluble [ C ) -glycerol 3-phosphate

substrate . Methods were developed to simplify the determination o f

[ 1 4 c J-radioactivity . The kinetics of the r esponse o f the assay s ystem

to changes in the concentrations o f glycerol 3-phosphate and

palmitoyl-CoA were similar to those publ i shed for the microsomal GPAT .

The products o f the assay were identi fied as phosphatidic aci d and

lysophosphatidic acid by their chromatographic properties befo r e and

after hydrolysis with chicken liver phosphatidate phosphohydrolase .

These products are consistent with literature r eports .

Male Sprague-Dawley r ats were treated with insulin ( 4 i . u . /kg body

weight ) or saline , and extracts o f hind-limb muscle were prepared and

fractionated on Sephadex G-25 in 50 mM formic acid . Fractions whi ch

eluted subsequent to the void volume were assayed with hepatic

microsomal GPAT and the effect o f insul in-treatment fractions were

compared with the effect of saline-treatment fractions .

ii

Fractions containing mater ial o f approximately 3000 and 1 000 daltons

molecular weight enhanced GPAT activity in an insulin-dependent manner

by 0 . 46 and 0 . 64 nmol/min/mg of microsomal protein , respectively ( both

P<0 . 0 1 ) , compared to the e ffect of the saline control s . Control r ates

were approximately 3 . 5 nmol/min/mg of microsomal protein . It was

calculated that these insulin-dependent increases in hepatic microsomal

GPAT acti vity would be suffic ient to account for the difference b etween

the estimated hepatic triacylglycerol production of fed and fasted

rats . Furthermore , publ i shed studies suggest that insulin-dependent

changes in activities of enzymes , demonstrated with in vitro systems

utilising low molecular weight fractions from rat muscle , may par allel

sensiti vity o f the same enzymes to insulin in vivo . The low mol ec ular

weight stimulator or stimulators of hepatic microsomal GPAT have an

apparent molecular weight within the range 1 000-3000 daltons , appear to

be heat and acid stable , are soluble in aqueous solution , have very low

absorbance at 220nm ( or a very high specific activity ) and may be

sensitive to oxygen . These properties suggest that the low molecular

weight stimulator or stimulator s of hepati c microsomal GPAT activity

may be related to the putati ve insulin mediator substance ( IMS ) .

In initial experiments , where r ats were hepar inised pr ior to

treatment with i nsulin or salin e , it was observed that some fractions

were able to stimulate hepatic microsomal GPAT acti vity i n an

insulin-independent manner . Exper iments to r esolve this suggested that

the treatment of r ats with hepar in alone l ed to the presence of low .

mol ecular weight mater ial , in the fractions o f muscle extracts , with

the potential to enhance GPAT acti vity . It was found that low

i i i

molecular weight fractions o f the saline treatment muscle extr acts d i d

not enhance GPAT activity . Thi s supported the suggestion that hepar in

was r esponsible for the abi l ity o f low molecular weight fractions o f

muscle extracts t o stimulate GPAT activity in a n insulin-independent

manner .

Experiments were also conducted in which impure hepatic p lasma

membranes were treated with i nsulin ( 20- 1 000 �units/ml ) . However , when

hepatic microsomal GPAT was assayed with mater ial from these

incubations a stimulator of GPAT was not detected .

The r esults o f exper iments presented in thi s thes is provide

further evidence in favour of the hypothesis that hepatic microsomal

GPAT acti vity c an be modi fi ed by insul in and may contr ibute to the

overall r egulation o f glycerolipid biosynthesis in liver .

i v

ACKNOWLEDGEMENTS

I wish to thank my supervisor , Dr D. R . Husbands , for hi s advice

dur ing the course of this study and also Dr J . c. Hawke for his h e lpful

comments on aspects of the work . The help and encouragement r ec e i ved

from fr iends and colleagues was appreciated . I would also l ik e to

acknowledge the encouragement of my wi fe Debbie and the support o f my

parents , Vie & Betty Stevens .

V

TABLE OF CONTENTS

ABSTRACT • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • i

ACKNOWLEDGEMENTS • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • i v

TABLE OF CONTENTS • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • v

LIST OF FIGURES • • • • • • . • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • x i

LIST OF TABLES • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • XV

LIST OF ABBREVIATIONS • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • x i x

LIST OF APPENDICES • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • x x i

Chapter 1 . INTRODUCTION • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1

1 . 1 THE CENTRAL ROLE OF GLYCEROLIPIDS IN METABOLISM • • • • • • • • • • • • • • • • 2

1 . 2 PATHWAYS FOR THE SYNTHESIS OF GLYCEROLIPIDS • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 7

1 . 3 THE CONTROL OF GLYCEROLIPID BIOSYNTHESIS • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 5

1 . 3 . 1 REGULATION BY SUBSTRATE AVAILABILITY • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 5

1 . 3 . 2 REGULATION BY CONTROL OF PHOSPHATIDATE

PHOSPHOHYDROLASE ACTIVITY • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 23

1 . 3 . 3 REGULATION BY CONTROL OF DIACYLGLYCEROL

ACYLTRANSFERASE ACTIVITY • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 28

1 . 3 . 4 REGULATION BY CONTROL OF GLYCEROL PHOSPHATE

ACYLTRANSFERASE ACTIVITY • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • • • • • 3 1

1 . 3 . 4 . 1 Physiological effectors o f GPAT activity • • • • • • • • 3 1

1 . 3 . 4 . 2 Dietary effectors o f GPAT activity • • • • • • • • • • • • • • 34

1 . 3 . 4 . 2 . 1 Fasting • . . . . • . . . • . . . • . . . • . . • . . • . . . . . . . . . . . • 35

1 . 3 . 4 . 2 . 2 High fat , high carbohydrate and

ethanol diets • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 37

1 . 3 . 4 . 3

1 . 3 . 4 . 4

1 . 3 . 4 . 5

vi

TABLE OF CONTENTS ( continued )

Page

Pharmacological effector s of GPAT activity • • • • • • 38

Control by glucagon , catecholamines

and insulin • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 39

Control by other hormones • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 43

1 . 4 GLYCEROLPHOSPHATE ACYLTRANSFERASE - CHARACTERISTICS

AND PROPERTIES • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 45

1 . 4 . 1 Di str ibution o f GPAT between mitochondrial and

microsomal fractions • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 45

1 . 4 . 2 Location of GPAT within mitochondrial and

1 . 4 . 3

1 . 4 . 4

microsomal fractions • • • • • • • • • . • • • • • • • . . • • • • • • • • • • • • • • • • • 47

Properties o f GPAT • • . . . . • • . • • . • • • . • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • 48

GPAT pur i fi cation • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 59

1 . 5 PURPOSE AND SCOPE OF THE INVESTIGATION • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 62

Chapter 2 . MATERIALS • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 63

2 . 1 Reagents • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 64

2 . 2 Instruments & Equipment • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 64

2 . 3 Statistical package . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . • . . • . 64

2 . 4 Animals . . . . . . . . . • . . . . . . . • • • . . . . • . • . . . • . . . . • • • . . . • . • • . • . . . • • . • . 64

2 . 4 . 1

2 . 4 . 2

Rats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 64

Chickens • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 65

Chapter 3 .

vi i

TABLE OF CONTENTS ( continued )

METHOD DEVELOPMENT AND VALIDATION OF GPAT

ASSAY PROCEDURE • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 68

3 . 1 Introductio n • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 69

3 . 2 Procedure for subcellular fractionation • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 70

3 . 3 Validation o f subcellular fractionation procedure • • • • • • • • • • • • • 73

3 . 4 Method for protein d etermination • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 82

3 . 5 Determination of r ad ioactivity • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 83

3 . 6 Extraction of r ad ioactive glycerol 3-phosphate

from aqueous butanol • • . • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 85

3 . 7 Examination of microsomal ester ification assay system • • • • • • • • • 87

3 . 7 . 1 Preparation of glycerol 3-phosphate and

palmitoyl-CoA • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 87

3 . 7 . 2 Initial selection of conditions for GPAT assay • • • • • • • • • • 87

3 . 7 . 3 Response to [ palmitoyl-CoA] • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 89

3 . 7 . 4 Response to [ glycerol 3-phosphate ] • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • go

3 . 7 . 5 Response to amount o f microsomal protein • • • • • • • • • • • • • • • • 9 9

3 . 7 . 6 Dependence on time • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • 9 9

3 . 7 . 7 Response to pH • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 99

3 . 7 . 8 Identi fication o f products o f the GPAT assay • • • • • • • • • • • 1 05

3 . 7 . 8 . 1 Thin layer chromatography • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 05

3 . 7 . 8 . 2 Protocol for identi fication r adioactive

products o f the microsomal GPAT r eaction • • • • • • • 1 06

3 . 8 Summary o f methodology adopted for the assay o f GPAT • • : • • • • • • 1 1 5

viii

TABLE OF CONTENTS ( continued )

Chapter 4 . EXPERIMENTS TO EXAMINE THE EFFECT OF INSULIN

ON GPAT ACTIVITY • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 1 6

4 . 1 Introduction • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 1 7

4 • 2 Methods • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 1 9

4 . 2 . 1 Effect of insulin on blood glucose • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 1 9

4 . 2 . 2 General method for preparation o f r at

muscle extracts • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 1 9

4 . 2 . 3 Chromatography of extracts • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 2 1

4 . 2 . 4 Assay o f Sephadex G-25 fractions with

l iver microsomal GPAT • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 23

4 . 3 R esults and Discussion • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 28

4 . 3 . 1 Section 1 - Preliminary exper iments with extracts

from hepari nised r ats treated with i nsulin

( Extract A) or saline ( Extract B ) , r espectively:

the e ffect o f low molecular weight fractions o f

these extr acts on GPAT activity • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 28

4 . 3 . 2 Section 2 - Exper iments with further extracts

from hepar i nised rats treated with insulin

( Extr acts C, D , E , & G) or saline ( Extracts F & H ):

r econsideration o f the role o f l iquid air ver sus

l iquid nitrogen in the method for prepar ing extracts • • • 1 45

i x

TABLE OF CONTE NTS ( continued )

4 . 3 . 3 Section 3 - E xper iments with e xtracts from

48 h-fasted hepar inised rats treated with i nsulin

(E xtract K) or saline (E xtracts I & J ) , and with

E xtracts L and M from fed or 48 h-fasted

non-cannulated r ats , r espectively : consideration o f

the possible influence of cannulation and hepar in • • • • • • 1 63

4 . 3 . 4 Section 4 -·E xper iments with extracts from non

Chapter 5 .

hepar inised r ats treated with insulin (E xtracts N ,

P , & R ) o r saline ( 0 , Q & S ) : insulin-dependent

stimulation of hepatic microsomal GPAT activity • • • • • • • • 1 83

THE E FFE CT OF SUPE RNATANTS FROM LIVE R

?ARTICULATE FRACTIONS ON GPAT • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 89

5 . 1 Introduction • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 90

5 . 2 Methods • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 93

5 . 2 . 1 Selection of method for preparation o f l iver

particulate fraction enriched in plasma membranes • • • • • • 1 93

5 . 2 . 2 Incubation o f particulate fraction with insulin

or buffer . • . • . . . . . • • . . . . . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . • • . . . • 1 97

5 . 2 . 3 Assay to examine the effect o f particulate

fraction supernatant on GPAT activity • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 97

5 . 3 Results and Discussion - The e ffect of supernatants

from liver particulate fractions treated with insulin . � • • • • • • 1 99

Chapter 6 .

TABLE OF CONTE NTS ( continued )

DISCUSSION AND CONCLUSIONS • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 205

APPE NDICE S • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 228

BIBLIOGRAPHY • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 248

X

xi

LIST OF FIGURE S

Fig ur e Pag e

1 . 1 : E n zymes and pathways o f glycerol ipid biosynthesis • • • • • • • • • • • • 5

3 . 1 : Scheme for the subcellular fractionation of r at l iver • • • • • • • 7 1

3 . 2 : The specific activity and total activity of

cytochrome oxidase in various subcellular fractions • • • • • • • • • 75

3 . 3 : The speci fic activity and total activity o f monoamine

oxidase in v ar ious subcellular fractions • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 77

3 . 4 : The speci fic activity and total activity o f NADPH

cytochrome C r eductase in var ious subcellular fractions • • • • • 79

3 . 5 : E ffect of [ palmitoyl-CoA ] on ester i fication of

glycerol 3-phosphate with palmitoyl-CoA by a

hepatic microsomal fraction • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 9 1

3 . 6 : Hill plot transformation o f the d ata for the

r esponse of esterification of g lycerol 3-phosphate

with palmitoyl-CoA by a hepatic microsomal fraction

to v ar ying [ palmitoyl-CoA] • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 93

3 . 7 : E ffect o f [ glycerol 3-phosphate ] on esterifi cation

of glycerol 3-phosphate with palmitoyl-CoA by a

hepatic microsomal fraction • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 95

3 . 8 : E adie-Hofstee transformation o f d ata for the e ffect

of [ glycerol 3-phosphate ] on esteri fication

of glycerol 3-phosphate with palmitoyl-CoA by

a hepatic microsomal fraction • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 97

X i i

LIST OF FIGURE S ( continued )

Figure Page

3 . 9 : E ffect o f amount o f microsomal protein on

ester ific ation o f glycerol 3-phosphate with

palmitoyl-CoA by a hepatic microsomal fraction • • • • • • • • • • • • • 1 00

3 . 1 0 : E ffect o f time on ester i fi cation o f g lycerol

3-phosphate with palmitoyl-CoA by a hepatic

microsomal fraction • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 02

3 . 1 1 : Identification o f microsomal GPAT assay

products - Part 1 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 09

3 . 1 2 : Identification o f microsomal GPAT assay

products - Part 2 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 1 3

4 . 1 : The e ffect o f insulin on blood glucose concentration • • • • • • • 1 24

4 . 2 : Titration curve o f r at muscle solution acidified

with acetic acid to pH 3 . 8 • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 26

4 . 3 : Sephadex G-25 fractionation o f muscle extract from

insulin-treated , hepar inised r at and absolute

effect of fractions on microsomal GPAT from l ivers

of fed or fasted r ats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 36

4 . 4 : Sephadex G-25 fractionation o f muscle extr act

from hepar inised r ats treated with i nsulin

and saline and absolute e ffect o f fractions on

microsomal GPAT from l ivers o f fed r ats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 39

x i i i

LIST OF FIGURE S ( continued )

Figure Page

4 . 5 : Sephadex G-25 fractionation of muscle extract

( twice usual loading on column ) from heparini sed

r at treated with insulin and absolute effect of

fractions on microsomal GPAT from liver s of fed r ats • • • • • • 1 42

4 . 6 : Sephadex G-25 fr actionation o f muscle e xtract from a

heparinised r at treated with insulin and absolute

e ffect on GPAT activity : inhibition of GPAT activity

r elative to the formic acid control GPAT activity • • • • • • • • • • 1 4 8

4 . 7 : Sephadex G-25 fractionation o f muscle extract from

hepar inised r ats treated with i nsulin or saline

and absolute effect on GPAT : inhibition o f GPAT

activity r e lative to formic acid controls • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 5 1

4 . 8 : Sephadex G-25 fractionation o f muscle extr act

from heparinised r ats treated with insulin or

saline and absolute effect on GPAT : i nhibition of

GPAT activity r elative to formic acid controls • • • • • • • • • • • • • 1 53

4 . 9 : The absolute e ffect o f Sephadex G-25 fr actions

of muscle extr acts from hepar inised r ats treated

with insulin o r saline , prepared using liquid nitrogen ,

on microsomal GPAT from liver s of fed r ats • • • • • • • • • • • • • • • • 1 59

4 . 1 0 : The absolute effect o f Sephadex G-25 fractions o f

muscle extr act from 4 8 h-fasted hepar inised r at

treated with saline on microsomal GPAT from fed r at • • • • • • • • 1 68

xiv

LIST OF FIGURE S ( continued )

Figure Page

4 . 1 1 : The absolute effect of Sephadex G-25 fractions o f

muscle extract from 4 8 h-fasted hepar inised r ats

treated with saline or insulin on microsomal GPAT

GPAT from fed r ats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 70

4. 1 2 : The absolute effect of Sephadex G-25 fractions o f

muscle extract from fed , non-cannulated r at , on

microsomal GPAT from fed r at • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 78

4 . 1 3 : The absolute effect of Sephadex G-25 fr actions

o f muscle extract from 48 h-fasted , non-cannulated

r at on microsomal GPAT from fed r at • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 80

4 . 1 4 : The absolute effect of Sephadex G-25 fractions o f

muscle extract from fed non heparinised r ats treated

with either insulin or sal ine , on microsomal GPAT fr6m

liver s of fed r ats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 86

Appendix I

I . 1 : E lution o f carbohydrate , as shown by Phenol-sulphuric

reactivity , in Sephadex G-25 fractions o f muscle

extracts from hepar ini sed r ats treated with e ither

insulin or saline • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 233

XV

LIST OF TABLE S

Table Page

1 . 1 : Treatments r eported to affect glycerol 3-phosphate

concentrations in mammals • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 6

1 . 2 : Concentrations o f glycerol 3-phosphate in

ti ssues o f fed mammals • • . . • • • . • . • . • • • • . • . • . • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 8

1 . 3 : Concentrations o f glycerol 3-phosphate i n

tissues o f fasted r ats • • . • • • . • . • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 20

1 . 4 : Hepatic mitochondr ial GPAT - K values for m

1 . 5 :

glycerol 3-phosphate • • • • . . . • • • • . • . . . . • • . • • • • • • • • • • • • • . . • • • • • 54

Microsomal GPAT - K values for glycerol m

3-phosphate • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 55

2 . 1 : Reagents used and source of supply • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 66

2 . 2 : Reagents used and source o f supply • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 67

3 . 1 : Protein content and marker enzyme activities i n

subcellular fractions o f r at liver • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 8 1

3 . 2 : The e ffect o f using the Automatic Quench

Compensation faci lity of the Beckman LS 8000

scintillation counter on the e ffic iency o f

counting of E 1 4c J-hexadecane in the presence o f

varying amounts of water-saturated butanol • • • • • • • • • • • • • • • • • • 84

3 . 3 : The effect of the volume of the aqueous phase

and number of washings on the r emoval of

1 4 [ C ] glycerol 3-phosphate from aqueous butanol • • • • • • • • • • • • • • 86

3 . 4 : The effect o f pH of the reaction on ester i fication

of glycerol 3-phosphate with palmitoyl-CoA by a

hepatic microsomal fraction • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 04

xvi

LIST OF TABLE S ( continued )

Table P age

4 . 1 : The e ffect of Sephadex G-25 fractions of muscle

extract ( A ) from heparinised rat treated with

insulin on l i ver microsomal GPAT from fed r ats

or 72 h-fasted r ats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 38

4 . 2 : The e ffect o f Sephadex G-25 fractions o f muscle

extract from heparini sed r ats treated with i nsulin

(E xtract A) or saline (E xtract B ) on liver

microsomal GPAT from fed r ats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 4 1

4 . 3 : The e ffect o f Sephadex G-25 fr actions o f muscle

extract (A ) from a hepar inised r at treated with

insulin on liver microsomal GPAT from fed r ats • • • • • • • • • • • • • 1 44

4 . 4 : The effect of Sephadex G-25 fractions o f muscle

extract ( C ) from a hepar inised rat treated with

insulin , prepared using liquid air , on l iver

microsomal GPAT from fed r at (E xperiment 6 ) • • • • • • • • • • • • • • • • 1 50

4 . 5 : The effect o f Sephadex G-25 fractions o f muscle

extracts from hepar inised r ats treated with insulin

(E xtracts D & E ) or saline (E xtract F ) , prepared using

liquid air , on l iver microsomal GPAT from fed r ats • • • • • • • • • 1 55

4 . 6 : The e ffect o f Sephadex G-25 fractions of muscle

extracts from heparinised r ats treated with insulind

(means of values in Fig 4 . 5 ) or salinee , prepared

using liquid air , on microsomal GPAT from fed r ats • • • • • • • • • 1 56

xvii

LIST OF TABLE S ( continued )

Table Pag e

4 . 7 : The e ffect o f Sephadex G-25 fractions o f muscle

extracts , from heparini sed rats treated with insulin

(E xtract G) or saline (E xtract H ) , using liquid

nitrogen , on l i ver microsomal GPAT from fed r ats • • • • • • • • • • 1 6 1

4 . 8 : The absolute and percentage effect o f Sephadex

G-25 fractions of muscle extracts from hepar inised

r ats treated with i nsulin (E xtract G ) or saline

(E xtract H ) , prepared using liquid nitrogen , on

liver microsomal GPAT from fed r ats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 62

4 . 9 : The effect o f Sephadex G-25 fractions o f muscle

extr acts from 48 h-fasted hepar inised r ats treated

with saline (E xtracts I & J ) on l iver microsomal

GPAT from fed r ats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 72

4 . 1 0 : The e ffect o f Sephadex G-25 fractions o f muscle

extracts from 48 h-fasted heparini sed r ats treated

with saline (E xtr acts I & J ) or i nsulin (E xtr act K ) on

liver microsomal GPAT from fed r ats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 173

4 . 1 1 : The effect o f Sephadex G-25 fractions of muscle

extracts from fed or 4 8 h-fasted , non-cannulated r at

on liver microsomal GPAT from fed r ats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 82

4 . 1 2 : The absolute and percentage effects o f Sephadex G-25

fractions of muscle extracts from fed r ats treated

with either insulin or saline , on microsomal GPAT

from livers o f fed r ats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 1 88

5 . 1 : Results for 5 1 -nucleotidase marker study using Method

3 for preparation of l iver particulate fraction • • • • • • • • • • • • 1 95

xviii

LIST OF TABLE S ( continued )

Table Page

5 . 2 : The effect o f supernatant from liver particulate

fraction treated with 20 , 1 00 or 500 �units of

insulin/ml on GPAT • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 203

5 . 3 : The effect o f supernatant from l iver particulate

fraction treated with 500 or 1 000 �units

insulin per ml on l iver microsomal GPAT • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 204

Appendic es

I . 1 : The effect o f fructose 2 , 6-bisphosphate on

microsomal GPAT • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 236

II . 1 : The e ffect o f ATP , ADP , and AMP on hepatic

microsomal GPAT from fed r ats • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 242

II I . 1 : The effect o f oestradiol 1 7 8-dipropionate on

chicken l i ver microsomal GPAT activity • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 247

ADP

AMP

c AMP

AQC

ATP

BSA

CoA

cpm

dpm

DG

DHAP

DHAPAT

DTNB

E DTA

0! -GP or GP

GPAT

h

IMS

i . u .

LPA

m in

MG

NE M

NADH

LIST OF ABBRE VIATIONS

adenosine d iphosphate

adenosine monophosphate

adenosine 3 ' , 5 ' -cyclic monophosphate

Automatic Quench Compensation

adenosine triphosphate

bovine serum albumin

coenzyme A

counts per minute

disintegrations per minute

diacylglycerol

dihydroxyacetone phosphate

dihydroxyacetone phosphate acyltransferase

dithiobis nitrobenzoic acid

ethylene diamine tetraacetic acid

�-glycerol 3-phosphate

xi x

acyl-CoA : sn-glycerol 3-phosphate acyltr ansferase

hour ( s )

i n sulin mediator substance

international units

lysophosphatidic acid

minute ( s )

monoacylglycerol

N-ethylmaleimide

B-nicotinamide adenine dinucleotide , r educed

NOTE

NADPH

PA

PC

PL

PO POP

PPO

sec

SD

SE M

TLC

TMPD

Tr i s

VLDL

v/v

v/w

vol

X X

LIST OF ABBRE VIATIONS ( continued )

nicotinamide adenine d inucleotide phosphate , r educed

phosphatidic acid

phosphatidylcholine

phospholipid

1 , 4-bis [ 2- ( 5-phenyloxazolyl ) ] benzene

2 , 5-diphenyloxazole

seconds

standard deviation

standard error of the mean

thin-layer chromatography

tetra methyl phenylene diamine

tr is- (hydroxymethyl ) -aminomethane

very low density l ipoprotein

volume/volume

volume/weight

volume ( s )

In this thesis unless stated otherwise , < 1 00% = less than control

enzyme acti vity ; 1 00% = control enzyme activity ; > 1 00% = stimu l ation

of enzyme activity r elative to the appropriate control .

xxi

LIST OF APPE NDICIE S

P age

Appendix I . THE E FFE CT OF FRUCTOSE 2 , 6-BISPHOSPHATE ON GPAT • • • • • • 228

Appendix II . THE E FFE CT OF ADE NINE NUCLE OTIDE S ON GPAT • • • • • • • • • . • • 239

Appendix III . THE E FFE CT OF OE STROGE N ON CHICKE N LIVE R

MICROSOMAL GPAT • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 243