A New Principle of RNA Folding Based on Pseudoknotting1985 Pleij CW

8/13/2019 A New Principle of RNA Folding Based on Pseudoknotting1985 Pleij CW

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Volume13Number51985 NucleicAcidsA new p r i n c i p l e o f RNA f o l d i n g b a s d o n p s e u d o k n o t t i n g

C o r n e l i s W . A . P l e i j , K r i j n R i e t v e l d a n d L e e n d e r t B o s c h

D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , S t a t e U n i v e r s i t y o f L e i d e n , W a s s e n a a r s e w e g 6 4 , 2 3 3 3 AL L e i d e n , T h eN e t h e r l a n d s

R e c e i v e d 3 D e c e m b e r 1 9 8 4 ; R e v i s e d a n d A c c e p t e d 5 F e b r u a r y 1 9 8 5

A B S T R A C TT e r t i a r y i n t e r a c t i o n s i n v o l v i n g h a i r p i n o r i n t e r i o r l o o p s o f R N A c a nl e a d t o e x t e n d e d q u a s i - c o n t i n u o u s d o u b l e h e l i c a l s t e m r e g i o n s , c o n s i s t i n g o fc o a x i a l l y s t a c k e d s e g m e n t s o f d u p l e x R N A , b r i d g e d b y s i n g l e - s t r a n d e dc o n n e c t i o n s . T h i s t y p e o f c o m p a c t f o l d i n g p l a y s a r o l e i n v a r i o u s s t r a t e g i cr e g i o n s o f R N A m o l e c u l e s . T h e i r r o l e i n r i b o s o m e f u n c t i o n i n g , R N A s p l i c i n ga n d r e c o g n i t i o n o f t R N A - l i k e s t r u c t u r e s i s d i s c u s s e d .

I N T R O D U C T I O NI n s i g h t i n t h e t h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f s i n g l e s t r a n d e d R N A i s

e s s e n t i a l f o r a f u l l u n d e r s t a n d i n g o f i t s f u n c t i o n s . I t i s s t r i k i n g t h e r e f o r eh o w l i t t l e w e k n o w a b o u t t h e s p e c i f i c f o l d i n g o f t h e s e b i o p o l y m e r s i n s p a c e .E x c e p t f o r a f e w t R N A s ( 1 - 5 ) n o h i g h r e s o l u t i o n s t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n i sa v a i l a b l e . E v e n o f 5 S R N A , a m o l e c u l e w h o s e s t r u c t u r e h a s b e e n s t u d i e d i ng r e a t d e t a i l ( 6 ) n o d e f i n i t i v e m o d e l f or i t s s e c o n d a r y s t r u c t u r e e x i s t s , l e ta l o n e i t s t e r t i a r y s t r u c t u r e . I n m a n y c a s e s , t h e a v a i l a b l e i n f o r m a t i o nh a s l e d t o p r o p o s a l s f o r t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e i n w h i c h s i n g l e - s t r a n d e dr e g i o n s a l t e r n a t e w i t h d o u b l e - s t r a n d e d r e g i o n s . T h e l a t t e r c o n t a i n t h ec l a s s i c a l W a t s o n - C r i c k G C a n d A M U b a s e p a i r s a n d s o m e t i m e s G U b a s e p a i r s .I t i s i n c r e a s i n g l y b e c o m i n g c l e a r t h a t a l s o o t h e r c o m b i n a t i o n s h a v e t o b ec o n s i d e r e d ( 7 ) . I n s u c h s e c o n d a r y s t r u c t u r e m o d e l s , c h a r a c t e r i s t i c f e a t u r e sl i k e h a i r p i n , b u l g e , i n t e r i o r a n d b i f u r c a t i o n l o o p s c a n b e d i s c e r n e d b e s i d et h e n o r m a l d o u b l e - s t r a n d e d s t e m r e g i o n s . F r e q u e n t l y w i t h l i t t l e e x p e r i m e n t a ld a t a a t h a n d t h e s e p r o p o s a l s a r e b a s e d o n c o m p u t e r - a i d e d n r e d i c t i o n s ( 8 , 9 )w h i c h u n f o r t u n a t e l y h a v e a l i m i t e d v al u e o n l y ( 1 0 ) .

I n g e n e r a l , t h e f o l d i n g o f R N A m o l e c u l e s w i l l r e f l e c t a d e l i c a t e b a l a n c eb e t w e e n b a s e - b a s e i n t e r a c t i o n s a n d e l e c t r o s t a t i c r e p u l s i o n o f t h e n e g a t i v e l yc h a r g e d p h o s p h at e r e s i d u e s . I n t h e s e f o l d i n g s a n i m o o r t a n t c o n t r i b u t i o n t ot h e s t a b i l i t y o f t h e R N A s t r u c t u r e i s f u r n i s h e d b y t h e s t a c k i n g i n t e r a c t i o n so f t h e b a s e r e s i d u e s ( 1 1 ) . U n d e r h i g h s a l t c o n d i t i o n s w i t h s u f f i c i e n t screen-o I RL P r e s s U m i t e d , O x f o r d , E n g l a n d . 1 7 1 7

V o l u m e 1 3 N u m b e r 5 1 9 8 5 N u c l e i c A c i ds R e s e ar c h


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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c hi n g o f t h e c h a r g e d p h os p h a t e s , t e r t i a r y i n t e r a c t i o n s l i k e t r i p l e b a s e p a i r so f n o n - W a t s o n - C r i c k t y p e w i l l l e a d t o t h e f o r m a t i o n o f c o m p a c t d o m a i n s w i t hh y d r o p h o b i c c o r e s a s f o u n d i n L - s h a p e d t R N A ( 1 - 5 ) . A l t h o u g h t h e s t u d i e s o ft R N A s t r u c t u r e h a v e c o n t r i b u t e d c o n s i d e r a b l y t o o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h et h r e e - d i m e n s i o n a l f o l d i n g o f R N A i t r e m a i n s t o b e s e e n w h e t h e r t h e s a m ep r i n c i p l e s c a n b e e x t r a p o l a t e d t o o t h e r R N A s t r u c t u r e s .

R e c e n t l y w e h a v e f o u n d e v i d e n c e f o r a n e w b u i l d i n g p r i n c i p l e t h a tc o m b i n e s a c o m p a c t f o l d i n g o f t h e R N A c h a i n w i t h a n i n c r e a s e i n b a s e s t a c k i n g .T h e p r i n c i p l e w a s b r o u g h t t o l i g h t b y s t r u c t u r e m a p p i n g o f t h e 3 ' t e r m i n i o fa n u m b e r o f p l a n t v i r a l R N A s w i t h t R N A - l i k e p r o p e r t i e s ( 1 2 - 1 4 ) . H e r e w ed e s c r i b e t h i s p r i n c i p l e i n s o m e d e t a i l a n d p r e s e n t e v i d e n c e f o r i t s o c c u r r e n c ei n t h e s t r u c t u r e o f o t h e r n a t u r a l R N A s . I t m a y p l a y a r o l e i n r i b o s o m ef u n c t i o n i n g a n d R N A s p l i c i n g .

F O L D I N G O F t R N A - L I K E S T R U C T U R E S A T T H E 3 ' T E R M I N I O F V I R A L R N A sT h e 3 ' t e r m i n i o f v ar i o u s p l a n t v i r a l R N A s l i k e t u r n i p y e l l o w m o s a i c

v i r u s ( T Y M V ) R N A , b r o m e m o s a i c v i r u s ( B M V ) R N A , a n d t o b a c c o m o s a i c v i r u s( T M V ) R N A a r e r e c o g n i z e d b y a v a r i e t y o f t R N A - s p e c i f i c e n z y m e s , e . g . t R N An u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e a n d a s p e c i f i c a m i n o a c y l t R N A s y n t h e t a s e ( 1 5 - 1 6 ) .W e r e c e n t l y d e s c r i b e d s t r u c t u r e m a p p i n g s t u d i e s o n l a b e l l e d 3 ' t e r m i n a lR N A f r a g m e n t s o f a l l t h r e e i nd i v i du a l v i r a l R N A s . M o d e l s o f t h e s e c o n d a r ys t r u c t u r e w e r e p r o p o s e d b a s e d u p o n e n z y m a t i c d i g e st i on s w i t h R N a s e T i , S ln u c l e a s e a n d t h e d o u b l e - s t r a n d s D e c i f i c R N a s e f r o m t h e v e n o m o f t h e c o b r aN a j a n a j a o x i a n a a n d c h e m i c a l m o d i f i c a t i o n o f a d e n o s i n e r e s i d u e s w i t hd i e t h y l p y r o c a r b o n at e a n d c y t i d i n e r e s i d u e s w i t h d i m e t h y l s u l f a t e . T h ec l o v e r l e a f s t r u c t u r e a s f o u n d i n c a n o n i c a l t R N A a p p e a r e d t o b e a b s e n t i nt h e t R N A - l i k e s t r u c t u r e s o f t h e v i r a l R N A s . S i m i l a r n r o p o s a l s w e r e m a d e b yF l o r e n t z e t a l . f o r T Y M V R N A ( 1 7 ) a n d b y A h l q u i s t e t a l . f o r B M V R N A ( 1 8 ) .W e h a v e s h o w n t h a t t h r e e - d i m e n s i o n a l f o l d i n g s a p p e a r e d t o h a v e e v o l v e d ,h o w e v e r , w h i c h s h o w a g r e a t r e s e m b l a n c e w i t h t h e L - s h a n e o f t h e e l o n g a t o rt R N A s . T h e s e m o d e l s p r o v i d e a b a s i s f o r o u r u n d e r s t a n d i n g h ow t h e se v i r a lR N A s h a v e m e t t h e r e q u i r e m e n t s f o r f a i t h f u l r e c o g n i t i o n b y t R N A - s p e c i f i ce n z y m e s . F o r a m o r e d e t a i l e d d i s c u s s i o n o f t h e s e m o d e l s , s e e r e f . 1 2 - 1 4 . O fg r e a t i n t e r e s t h e r e i s t h e c o n s t r u c t i o n o f t h e R N A d o m a i n w h i c h c o m p r i s e s t h ea m i n o a c y l a c c e p t o r a r m o f t h e t R N A - l i k e s t r u c t u r e s . T o i l l u s t r a t e t h i s n o i n tt h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f t h e l a s t 4 2 n u c l e o t i d e s a t t h e 3 ' t e r m i n u s o fT Y M V R N A i s s h o w n i n f i g . l a . E x p e r i m e n t a l d a t a a n d s e q u e n c e c o m p a r i s o n s w i t ho t h e r p l an t v i r a l R N A s p o i n t e d t o a b a s e p a i r i n g i n t e r a c t i o n i n v o l v i n g t h e

1 7 1 8


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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c ha b

S , A O H E IC UCA

U dJ3CdACUCCCAt UCGACCC G G G U G A A 6 G C A CC6

U C C G N m A U C C C G U AAUCGCC

42.nt SuF i g u r 1 . i T h e e d i e . N s o n a l t h f o l d i n g e o f t h e a m i n o a c y l a e p t f o r m a r m o f thsetR-l i k e s t a r u t r a n e m o f n t Y M N .h e a m i n o a c y l a c c e p t o r a r m i s f o r m e d b y theiat a s t i ninict h e t r p l eeliand t r i p l e n t C r o s e q u e i n c e I a n v o v d IInd b a s e p a i r i n g a r s i ni l l u s t r t h e db y s t h e i nd a s h e d a c l i o n e s h r e s t w e of3G1h e tRA2i5 t r C t u r e i s ) g r i v e nb y e a s o l i l i e . N o eh r e - i e n s o a b s e l d n c e o fanem i n o a c y lstempformdb b a r m s e o i np a i r i c d n g b e t w e e n cdbh eaandd5 psidf t h e structure.ait a d a r t R N A( ) L a r r a n g e m e n t ftN rmyat.nye a m i n o a c y l a c c e p t o r a r m i sre ycailsaknf r o m t h e r e b o r a s e o a r n g i n t r c t m a i s o n b e w e e nthatG a n dTYM5C 2 7 . ( c )rtistrd e t a i l s a b o u t e x p e r i m e n t a l d e t a i l s a n d a d i s c u s s i o n o f t h e s e m o d e l s , s e er e f . 1 2 - 1 4 .

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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c ht r i p l e G s equenc e G 1 3 - G 1 5 w i t h t h e t r i p l e C sequence C 2 5 - C 2 7 . T h e e x i s t e n c eo f t h e 3 G - C b a s e p a i r s a p p e a r s t o b e c r u c i a l f o r t h e c o n s t r u c t i o n o f a na m i n o a c y l a c c e p t o r a r m w h i c h h a s s t r i k i n g s i m i l a r i t i e s t o t h a t o f c a n o n i c a lt R N A . C o a x i a l s t a c k i n g o f s t e m I a n d I I w i t h t h a t f o r m e d b v t h e 3 G - C b a s ep a i r s c o m i n g f r o m t h e t e r t i a r y i n t e r a c t i o n ( f i g . l b ) y i e l d s a n a u g m e n t e da c c e p t o r a r m w i t h 1 2 b a s e p a i r s , i d e n t i c a l t o t h a t f o u n d i n t h e a u g m e n t e dh e l i x o f T p a n d a m i n o a c i d a c c e p t o r s t e m s f o u n d i n y e a s t t R N A P h e ( f i g . l d )a n d a l m o s t a l l o t h e r e l o n g a t o r t R N A s .

A n o t h e r e s s e n t i a l f e a t u r e o f t h i s D a r t o f t h e T Y M V R N A s t r u c t u r e i s t h ep r e s e n c e o f t w o s h o r t s t r e t c h e s o f s i n g l e - s t r a n d e d R N A c o m n r i s i n q 3 ( A 1 Q - U 1 2 )a n d 4 ( U 2 1 - C 2 4 ) n u c l e o t i d e s a n d s na nn i n g d i s t a n c e s o f a q u a r t e r a n d a l m o s th a l f a t u r n o f an R N A d u p l e x r e s D e c t i v e l y , t h e r e b y c r o s s i n a t h e h e l i x f r o mon e s t r a n d t o t h e o t h e r . A s c a n b e s e e n i n f i a . l b t h e s e s t r e t c h e s c o n n e c tt w o h e l i c a l s e g m e n t s o f t h e a m i n o a c y l a c c e o t o r a r m i n s u c h a w a y t h a t aq u a s i - c o n t i n u o u s d o u b l e h e l i x w i t h 8 b a s e p a i r s c a n b e f o r m e d b y t h e v i r a lR N A c h a i n s e g m e n t r u nn i n g f r o m A 1 - C 2 7 . N o t e t h a t t h e s e t w o c o n n e c t i n gs t r e t c h e s o f R N A a r e l o c a t e d a t r o u g h l y t h e s am e s i d e o f t h e a r m ( f i g . l c ) .T h i s m ay b e i m p o r t a n t f o r t h e r e c o g n i t i o n o f t h e v i r a l 3 ' t e r m i n u s b y t R N A -s p e c i f i c enzymes ( 1 2 ) .

W e h a v e f o u n d s i m i l a r t e r t i a r y f o l d i n a s i n t h e 3 ' t e r m i n i o f t h e R N A sf r o m t h e p l a n t v i r u s e s B M V a n d T M V ( 1 3 , 1 4 ) . W e t h e r e f o r e w o n d e r e d h o ww i d e s p r e a d t h i s p e c u l i a r f o l d i n a w o u l d b e i n o t h e r R N A s .

T H E N E W B U I L D I N G P R I N C I P L ET h e p r i n c i p l e u n d e r l y i n g t h e c o n s t r u c t i o n o f t h e a m i n o a c y l a c c e p t o r

a r m s o f t h e v i r a l R N A s can b e g e n e r a l i z e d as d e D i c t e d i n f i g . 2 a : a s t r e t c ho f n u c l e o t i d e s i n t h e l o o p o f a h a i r o i n a n d b o r d e r i n g t h e s t e m r e g i o n , f o r m sn o r m a l W a t s o n - C r i c k b a s e D a i r s w i t h n u c l e o t i d e s o f a c o m p l e m e n t a r v s equenc el o c a t e d e l s e w h e r e i n t h e R N A c h a i n . T h i s t y p e o f i n t e r a c t i o n f a v o u r s t h ef o r m a t i o n o f a n e l o n g a t e d d o u b l e - s t r a n d e d h e l i x b y c o a x i a l s t a c k i n n o f t h et w o s e p a r a t e d o u b l e h e l i c a l s e g m e n t s : s t e m S i a n d t h e s t e m g e n e r a t e d b y t h et e r t i a r y i n t e r a c t i o n ( s t e m S 2 ) . F o r m a l l y , i t i s a l s o D o s s i b l e t o c o n s i d e rs t e m S 1 as t h e r e s u l t o f a t e r t i a r y i n t e r a c t i o n . T h i s i s c l a r i f i e d b yo t h e r m o re s c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n s o f t h e s a m e i n t e r a c t i o n o a t t e r n ( f i g . 2 ba n d 2 c ) . I t m a y a l r e a d y b e n o t e d h e r e t h a t i n t e r s e c t i o n o f t h e c h o r d s i nf i g . 2 b , r e p r e s e n t i n g t h e t w o o v e r l a p p i n a d o u b l e h e l i c e s , i s n o t a d m i s s a b l ei n c u r r e n t m e t h o d s f o r c o m p u t e r - a i d e d p r e d i c t i o n s o f R N A s e c o n d a r y structure,b e c a u s e t h e y g i v e r i s e t o s o - c a l l e d k n o t t e d s t r u c t u r e s ( 8 , 9 ) . B a s e d on

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N u c l e i c A c i d s R e s e a r c h

a .-. - bs~~~5 2c 5 5

F i g u r e 2 . T h e f o r m a t i o n o f e x t e n d e d d o u b l e h e l i c e s i n R N A c h a i n s , b a s e do n t e r t i a r y i n t e r a c t i o n s o f a s p e c i a l k i n d , s h o w n i n f o u r p r e s e n t a t i o n s .S i a n d S 2 r e p r e s e n t s t e m r e g i o n s f o r m e d b y n o r m a l W a t s o n - C r i c k b a s e p a i r i n ga n d L i a n d L 2 t h e s i n g l e s t r a n d e d R N A r e g i o n s c o n n e c t i n g t h e d o u b l e h e l i c a ls e g m e n t s S i a n d S 2 . ( a ) C o n v e n t i o n a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r ei n w h i c h n u c l e o t i d e s f r o m t h e h a i r p i n l o o p a d j a c e n t t o s t e m r e g i o n S i b a s ep a i r w i t h a c o m p l e m e n t a r y r e g i o n a t t h e 3 ' s i d e o f t h e h a i r p i n . ( b ) S c h e m a t i ci l l u s t r a t i o n o f t h e b u i l d i n g p r i n c i p l e i n a g r a p h i c a l f o r m a t . ( c ) S c h e m a t i cf o l d i n g . ( d ) T h r e e - d i m e n s i o n a l f o l d i n g , s h o w i n g t h e q u a s i - c o n t i n u o u s d o u b l es t r a n d e d h e l i x o f 8 b a s e p a i r s a n d t h e t w o c r o s s i n g l o o p s c o n n e c t i n g t h e t w od o u b l e h e l i c a l s e g m e n t s .O u r e x p e r i e n c e w i t h t h e p l a n t v i r a l R N A s t r u c t u r e s w e h e r e m a k e t h e i m D o r t a n ta s s u m p t i o n t h a t f o r a l l i n t e r a c t i o n s o f t h i s k i n d s t e m S i a n d s t e m S 2 a r es t a c k e d o n t o p o f e a c h o t h e r i n s u c h a w a y t h a t a q u a s i - c o n t i n u o u s , r i g h t -h a n d e d d o u b l e h e l i x i s f o r m e d , c o m p a r a b l e t o A - R N A f i g . 2 d ) . T h i s a s s u m p t i o no f c o u r s e i s o n l y v a l i d i f t h e s i n g l e - s t r a n d e d c o nn e c t i ng l o o p s L i a n d L 2p o s e n o s t e r i c a l c o n t r a i n t s u p o n t h i s s t r u c t u r e . D u e t o t h e h a n d e d n e s s o ft h e d o u b l e h e l i x a n d t h e p o l a r i t y o f t h e c h a i n , l o o p L i a n d L 2 w i l l n o t b ee q u i v a l e n t : l o o p L i c r o s s e s t h e d e e p g r o o v e a n d l o o p L 2 t h e s h a l l o w g r o o v eo f t h e d o u b l e h e l i x . T h i s m u s t h a v e c o n s e q u e n c e s f o r t h e l e n g t h a n d t h ec o n f o r m a t i o n o f e a c h o f t h e t w o l O O p S . A f i r s t i n s i g h t i n t h e m i n i m a l n u m b e r o fn u c l e o t i d e s n e e d e d i n l o o p L i o r L 2 i s p r o v i d e d b y a n a n a l y s i s o f t h e d a t aw h i c h e m e r g e f r o m o u r t h r e e - d i m e n s i o n a l m o d e l s o f t h e t R N A - l i k e 3 ' t e r m i n io f t h e p l a n t v i r a l R N A s . I n t a b l e 1 w e h a v e s u m m n a r i z e d t h e s e d a t a i n t e r m so f t h e n u m b e r o f b a s e p a i r s i n s t e m S i a n d S 2 a n d t h e n u m b e r o f n u c l e o t i d e si n l o o p L i a n d L 2 . B e s i d e t h e R N A s s t u d i e d e x p e r i m e n t a l l y w e a l s o i n c l u d e dr e l a t e d v i r a l R N A s w h o s e 3 ' t e r m i n a l s e q u e n c e s a r e k no w n a n d w h i c h c a n b ef o l d e d i n s i m i l a r t e r t i a r y s t r u c t u r e s ( 1 2 - 1 4 , i 8 , 1 9 ) . T h e l o w e s t n u m b e ro f b a s e p a i r s f o u n d i n t h e s t e m r e g i o n s i s 3 , w h i c h p r e s u m a b l y i s a l s o t h e

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6/15

N u c l e i c A c i d s R e s e a r c hT a b l e 1 . F o l d i n g c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e a m i n o a c y l a c c e p t o r a r m s i n t h e t R N A -l i k e s t r u c t u r e o f s o m e p l a n t v i r a l R N A s

N u m b e r o f b a s e p a i r s N u m b e r o f n u c l e o t i d e si n s t e m r e g i o n s i n l o o p s

S i S 2 L i L 2Y M V R N A b 3 5 4 3E M V R N A 3 6 4 3B M V R N A c 6 6 2 9 4T A V R N A d 7 5 2 1 0 9M V R N A 3 4 3 2C c T M V R N A 3 5 4 3G T A M V R N A 3 4 3 2

a F o r d e f i n i t i o n s a n d s y m b o l s s e e f i g . 2 .b A b b r e v i a t i o n s u s e d a r e : T Y M V , t u r n i p y e l l o w m o s a i c v i r u s ; E M V , e g g p l a n tm os a i c v i r u s ; B M V , b r o m e m o s a i c v i r u s ; T A V , t o m a t o a s p e r m y v i r u s ; T M V ,t o b a c c o m o s a i c v i r u s ; C c T M V , c o w p e a s t r a i n o f T M V ; G T A M V , g r e e n t o m a t oa t y p i c a l m o s a i c v i r u s .c T h e B M V r e l a t e d v i r u s e s c o w p e a c h l o r o t i c m o t t l e v i r u s ( C C M V ) , b r o a d b e a nm o t t l e v i r u s ( B B M V ) a n d c u c u m be r m os a i c v i r u s ( C M V ) h a v e i d e n t i c a l s t r u c t u r e s( 1 3 9 1 9 ) .d C u c u m b e r g r e e n m o t t l e m o s a i c v i r u s ( C G M M V ) a n d t h e L a n d O M s t r a i n o f T M Vh a v e i d e n t i c a l s t r u c t u r e s ( 1 4 ) .m i n i m a l n u m b e r . T h e m a x i m u m f o u n d s o t d r i s 7 . T h e l o w e r l i m i t f o r e i t h e rl o o p s e e m s t o b e 2 n u c l e o t i d e s , t h o u g h b r i d g i n a a d i f f e r e n t n u m b e r o f b a s ep a i r s . T h e u p p e r l i m i t i s l e ss w e l l d e f i n e d a n d c a n b e h u n d r e d o r e v e n m o r et h a n o n e t h o u s a n d n u c l e o t i d e s ( s e e b e l o w ) . S u c h l a r g e l o o n s o f c o u r s e w i l lp o s s e s s s e c o n d a r y s t r u c t u r e t h e m s e l v e s a s w a s o b v i o u s i n t h e c a s e o f B M VR N A ( 1 3 ) . A n i n t r i g u i n g o u t c o m e i s t h e f i n d i n g t h a t 2 n u c l e o t i d e s a r es u f f i c i e n t t o s p a n a d i s t a n c e o f 6 b a s e p a i r s o v e r t h e d e e p g r o o v e o f t h ed o u b l e h e l i x . A n a l y s i s o f t h e k n o w n g e o m e t r y o f t h e R N A - A h e l i x s h o w s t h a tt h i s i s f e a s i b l e ( f i g . 3 a ) . B a s e d o n t h e k n o w n c o o r d i n a t e s f o r s y n t h e t i cR N A d o u b l e h e l i c e s ( 2 0 ) w e h a v e c a l c u l a t e d t h e d i st a n c e b e t w e e n o n e p h o s n h a t ea t o m P 6 ) o n o n e s t r a n d a n d o t h e r s o n t h e o p p o s i t e s t r a n d ( f i g . 3 b ) . D e p e n d i n go n t h e d i r e c t i o n c h o s e n , e i t h e r t h e d e e p g r o o v e ( P O - P _ 6 ) o r t h e s h a l l o wg r o o v e ( P - P 6 ) i s c r o s s e d . ( S e e a l s o l e g e n d t o f i g . 3 ) . F i q u r e 3 c s h o w st h a t t h e d i s t a n c e b e t w e e n t w o p h o s p h a t e s i s m i n i m a l w h e n 7 b a s e p a i r s o v e rt h e d e e p g r o o v e a r e b r i d g e d ( 1 0 . 1 R ) . T h i s d i s t a n c e i s a l m o s t h a l f o f t h a tb e t w e e n P O a n d P O ( 1 7 . 4 i ) a n d s i m i l a r t o t h a t b e t w e e n P 0 a n d P 2 o n o n e s t r a n d( 1 1 . 0 R ) . B r i d g i n g t h e d e e n g r o o v e w i t h 2 n u c l e o t i d e s t h e r e f o r e s e e m s p o s s i b l e .C o n n e c t i n g t h e t w o s t r a n d s o v e r t h e s h a l l o w g r oo v e t a k e s a t l e a s t 1 6 . 9 R ,w h i l e t h e d i s t a n c e s c r o s s i n g 2 , 3 a n d 4 b a s e p a i r s d o n o t d i f f e r v e r y m u c ha n d a r e a c t u a l l y o f t h e s a m e o r d e r o f m a g n i t u d e a s f o r P O - P O . B e c a u s e t h e1 7 2 2


7/15

N u c l e i c A c i d s R e s e a r c hb D E E P GROOVE SHALLOW G R O O V E

a 3 P O 5|P - ~ ~ ~ 0 0- 0 D_DEEPGROOVE

; N P1 .fi SHALLOWr * G R O O V E- 1 0 - 8 - 6 - 4 - 2 6 2 4 6 8 10

p h o s p h a t e number

F i g u r e 3 . D i s t a n c e s b e t w e e n D h o s p h a t e a t o m s i n a r e g u l a r R N A d o u b l e h e l i x o ft h e A - t y p e . T h e s h o r t e s t d i s t a n c e b e t w e e n a f i x e d p h o s p h a t e r e s i d u e on on es t r a n d ( P 6 ) a n d t h e p h o s p h a t e s on t h e o t h e r s t r a n d i s g i v e n t h o u o h i t s h o u l db e r e a l i z e d t h a t i n some c a s e s e l e m e n t s o f t h e d o u b l e h e l i x l i k e b a s e D a i r sa r e p e n e t r a t e d . ( a ) T h r e e - d i m e n s i o n a l r e p r e s e n t a t i o n s h o w i n g t h e d e e o a n ds h a l l o w groove o f t h e d o u b l e h e l i x . G oi n g u p w a r d s f r o m p h o s p h a t e P O w h i c h i sl o c a t e d o p p o s i t e t o P 6 on t h e o t h e r s t r a n d , t h e p h o s p h a t e s a r e i n d i c a t e d w i t ha p o s i t i v e s u b s c r i n t , w h e r e a s n e g a t i v e ones a r e u s e d g o i n g d o w n w a r d s . ( b )T w o - d i m e n s i o n a l s c h e m e . V e r t i c a l b a r s r e p r e s e n t b a s e D a i r s , t h e a r r o w s t h es h o r t e s t d i s t a n c e s b e t w e e n t h e p h o s p h a t e r e s i d u e s i n v o l v e d . ( c ) G r a p h i c a lr e p r e s e n t a t i o n . D i s t a n c e s w e r e c a l c u l a t e d b a s e d on D u b l i s h e d c o o r d i n a t e s o f ar e g u l a r R N A - A d o u b l e h e l i x ( 2 0 ) .m i n i m a l n u m b e r o f n u c l e o t i d e s r e q u i r e d f o r c l o s i n g a h a i r D i n l o o p i s a c c e p t e dt o b e t h r e e ( 2 1 ) , we as s um e t h a t t h i s n u m b e r i s a l s o t h r e e f o r 1 0 0 D L 2 . T h i si s a c t u a l l y o b s e r v e d i n t h e c a s e o f T Y M V R N A ( s e e t a b l e 1 ) . B r i d g i n g t h es h a l l o w groove w i t h 2 n u c l e o t i d e s ( s e e T M V R N A ) m a y t h e r e f o r e r e q u i r e e i t h e ra d i s t o r t i o n o f t h e d o u b l e h e l i x a n d / o r a c h a n g e i n t h e r e g u l a r n u c l e o t i d ec o n f o r m a t i o n ( s ) i n t h e c r o s s i n g l o o p . S t r e t c h i n g o f t h e r i b o s e o h o s p h a t eb a c k b o n e , h o w e v e r , b y c h a n g e s i n t h e r i b o s e o u c k e r i n g ( C 3 e n d o t o C 2 e n d o )a n d t o r s i o n a n g l e y ( C 4 C 5 ) w i l l D r o b a b l y b e n o t s u f f i c i e n t ( 2 2 ) . I f t w on u c l e o t i d e s c a n c ro s s t h e s h a l l o w gr oove , one h a s t o e n v i s i o n t h a t e v e n onen u c l e o t i d e m i g h t s u f f i c e f o r t h e d e e p groove. I n t h e l a t t e r c a s e i t i s con-c e i v a b l e t h a t t h e t w o p h o s D h a t e s c o n c e r n e d ( P O a n d P or P7, f i g . 3 ) m i a h tcome i n t o c l o s e r p r o x i m i t y b y a b e n d i n g o f t h e d o u b l e h e l i x over t h i s grooveas f o u n d t o b e p o s s i b l e f o r D N A ( 2 3 ) . D u o l e x R N A , h o w e v e r , i s r e n o r t e d t o b el e s s f l e x i b l e t h a n t h e D N A d o u b l e h e l i x ( 2 4 , 2 5 ) . O n t h e o t h e r h a n d , an

1 7 2 3

: 6 : 4 r i 2 _ 0 2 l 60

A New Principle of RNA Folding Based on Pseudoknotting1985 Pleij CW

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